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IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS
Importância:
- Diagnóstico de microrganismos patogênicos
- Estudos ecológicos
- Desenvolvimento de produtos biotecnológicos.
Diferentes espécies podem apresentar morfologia e metabolismo idênticos. Assim, a identificação
requer a observação de um conjunto complexo de características:
1. Morfologia celular: dimensões, forma, arranjos, comportamento tintorial, estruturas e
mobilidade.
2. Características culturais: formas de crescimento das colônias em diferentes meios (meio
em placas, meio inclinado, meio líquido, gelatina), odor.
3. Ecologia: hábitat, proveniência, condições ambientais, patogenicidade, hospedeiros,
resistência.
4. Genética: seqüência de genes específicos, variações transitórias e permanentes.
5. Fisiologia: exigências nutritivas, fontes de carbono e nitrogênio, fatores de crescimento.
As informações devem ser associadas umas às outras e comparadas com as informações do
Manual de Bergey – obra referência oficial da taxonomia de bactérias.
Procedimentos para observar expressões fenotípicas:
1. Meio líquido: observar o aspecto das culturas antes de utilizar nas demais inoculações.
2. Preparar lâmina a fresco: observar motilidade.
3. Preparar lâmina corada: observar reação de Gram, forma, arranjos e estruturas.
4. Inocular placas com ágar-nutriente em estrias cruzadas: observar morfologia das colônias
5. Inocular meio com ágar-amido: observar a hidrólise do amido com algumas gotas de
solução de iodo
6. Inocular meio inclinado em linha reta: observar formas de crescimento
7. Inocular meio com gelatina: verificar atividade proteolítica
Preencher a ficha da página 67 do livro Microbiologia Manual de Aulas Práticas
Culture Reaction Description Culture Reaction Description
Escherichia coli
Esta bactéria forma colônias de tamanho médio com margens regulares e elevação convexa
Klebsiella pneumoniae
Esta bactéria forma colônias ligeiramente úmidas e viscosas, circulares. convexas, com margens lisas.
Serratia marcescens
Colônias são vermelhar e circulares coom margem inteira
Pseudomonas fluorescens
Colônias circulares, convexas e com margens lisas.
Chromobacterium violaceum
Colônias circulares, convexas com margem inteira, e apresentam-se roxas na maioria dos meios
Micrococcus luteus
Colônias puntiformes, convexas com margens lisas, com cor amarelada na maioria dos meios.
Enterococcus faecalis
Colônias puntiformes, convexas, com margens lisas. O tamanho muito reduzido é devido ao metabolismo ineficiente dessa bactéria. Ela pode levar 3-4 dias para alcançar um tamanho apreciável.
Lactobacillus plantarum
Colônias puntiformes, convexas, com margens lisas. . O tamanho reduzido é devido ao metabolismo ineficiente, que pode levar 3-4 dias para atingir um tamanho apreciável.
Bacillus subtilis
Colônias são largas, porém menos que as de B. cereus. As margens são onduladas, com forma circular e uma elevação achatada.
Bacillus cereus
Colônias, largas, irregulares e achatadas com margens onduladas.
Bacillus polymyxa
Colônias largas, irregulares e achatadas com margens onduladas.
Staphyloccocus epidermidis
Colônias, largas, irregulares e achatadas com margens onduladas.
Exemplos de vários tipos de morfologia das colônias
Descrições das diferentes formas das colônias em placas
- Uma das placas ou tubos poderá ser utilizada para fazer a reação da catalase.
Culture Reaction Description Culture Reaction Description
Escherichia coli
Observe a formação de bolhas. Catalase positiva
Klebsiella pneumoniae
Observe a formação de bolhas. Catalase positiva
Serratia marcescens
Observe a formação de bolhas. Catalase positiva
Pseudomonas fluorescens
Observe a formação de bolhas. Catalase positiva
Chromobacterium violaceum
Observe a formação de bolhas. Catalase positiva
Micrococcus luteus
Observe a formação de bolhas. Catalase positiva
Enterococcus faecalis
Observe a ausência de bolhas. Esta bactéria usa peroxidase para eliminar H2O2, uma enzima que não libera oxigênio.
Lactobacillus plantarum
Observe a ausência de bolhas. Esta bactéria usa peroxidase para eliminar H2O2, uma enzima que não libera oxigênio.
Bacillus subtilis
Observe a formação de bolhas. Catalase positiva
Bacillus cereus
Observe a formação de bolhas. Catalase positiva
Bacillus polymxya
Observe a formação de bolhas. Catalase positiva
Staphylococcus epidermidis
Observe a formação de bolhas. Catalase positiva
Teste para presença de catalase
Características fisiológicas – Provas bioquímicas
Os microrganismos realizam variadas atividades bioquímicas utilizando nutrientes do ambiente que
os rodeia Essas reações que ocorrem dentro ou fora das células são catalisadas por enzimas.
Geralmente, o metabolismo origina produtos finais cuja detecção pode auxiliar na identificação.
Utilização de fontes de carbono:
Provas fermentativas (Glicose, lactose, sacarose, manose, xilose, sorbitol etc.)
Um determinado carboidrato pode ser fermentado originando diferentes produtos finais, o que
depende do microrganismo envolvido. Isso pode gerar gás (que pode ser detectado pela presença
de bolhas no tubo de Durham) e ácidos orgânicos (que pode ser detectado pela mudança de cor do
indicador).
Mesmo com uma reação negativa, o microrganismo pode ter utilizado outros nutrientes do meio de
cultura do teste, como a peptona. As leituras devem ser feitas em no máximo 24 h, pois podem
ocorrer reações alcalinas sobre outros substratos.
Utilizam-se meios básicos (pH 7,2) e o indicador Andrade para ácidos.
VM (Vermelho de Metila)
Teste que avalia se as bactérias fermentam a glicose pela via ácida mista, com a produção de
vários ácidos (ácido fórmico, lático, acético), o que prova o abaixamento do pH a menos 4,4, que é
o limite de viragem do indicador de pH. Embora todas as enterobactérias fermentem glicose, alguns
microrganismos, durante a fase final de incubação, convertem esses ácidos a produtos não ácidos
como o etanol e a acetoína, resultando num pH mais elevado (pH 6). O indicador de pH é o
vermelho de metila que em pH abaixo de 4,4 é vermelho e acima de 6 é amarelo. Adicionar 4 gotas
e rolar gentilmente entre a palma das mãos.
VP (Voges Proskauer)
Há bactérias que utilizam a fermentação butilenoglicólica. Fermentam a glicose produzindo acetil-
metil-carbinol (acetoína), butilenoglicol e pequenas quantidades de ácidos. Quando KOH (4 gotas
do Barrit II) é adicionado, e na presença de O2 atmosférico, a acetoína é oxidada a diacetil. A adição
de alfa-naftol (10 gotas do Barrit I) nesta reação catalisa a produção de um anel vermelho tijolo,
após 10-15 minutos. Adicionar primeiro o Barrit I, depois o Barrit II e agitar o tubo para expor ao
oxigênio.
Hidrólise do amido
O amido é um polissacarídeo de elevado peso molecular. Para ser transportado para o interior da
célula e ser utilizado, é necessário, primeiro, que ele seja quebrado em unidades menores. A
habilidade para hidrolisar esse polímero depende da produção e secreção de várias amilases. A
quebra do amido é detectada utilizando-se culturas em ágar amido que são cobertas com uma
solução de iodo (3 a 4 mL por placa). O iodo reage com o amido para formar um complexo azul
escuro. As colônias que podem hidrolisar o amido apresentarão uma zona clara a seu redor.
Citrato
Este teste determina se a bactéria é capaz de utilizar o citrato de sódio como única fonte de
carbono para o metabolismo e crescimento. Deve ser utilizado o meio Citrato de Simmons,
contendo citrato de sódio, fosfato de amônia e azul de bromotimol. Com a facilidade do transporte
de citrato pela citrato-permease há a sua utilização pela citrase, com produção de hidróxido de
amônia que eleva o pH, fazendo com que a reação se torne azul. Nesse teste, utilizam-se tubos
com meio inclinado para a cultura ter mais acesso ao oxigênio, que é necessário para utilização do
citrato. O CO2 produzido reage com o sódio do citrato formando carbonatos de reação alcalina.
Malonato (teste FM)
Essa prova determina a capacidade de uma bactéria de utilizar malonato como única fonte de
carbono, alcalinizando o meio. O malonato liga-se competitivamente à desidrogenase succínica,
impedindo sua ação catalítica sobre o ácido succínico com interrupção do Ciclo de Krebs, tirando da
bactéria sua principal fonte de energia e impedindo a formação de outros intermediários
necessários ao metabolismo.
Incuba-se a 35-37OC durante 24-48 horas. Indicador azul de bromotimol.
Utilização de fontes de nitrogênio:
Fenilalanina - desaminação (teste FM)
Há bactérias que produzem enzimas que removem o grupo amina da fenilalanina presente no meio,
originando o ácido fenilpirúvico, que reage com o cloreto férrico (10%) adicionado ao meio,
formando uma cor verde.
Obs: Como se utiliza o mesmo ensaio para o malonato, é necessário acidificar o meio com HCl, que
passa para amarelo, antes de adicionar o cloreto férrico.
Lisina - descarboxilação
Algumas bactérias possuem a lisina descarboxilase (LDC) que atua sobre a porção carboxila dos
aminoácidos, com formação de aminas, de reação alcalina (por ex. cadaverina), e CO2. A reação
ocorre preferencialmente em condições anaeróbias e ligeiramente ácidas, mas inicialmente ocorre a
utilização da glicose do meio para enriquecimento da cultura e acidificação do meio.
O meio contém o indicador bromocresol púrpura. Nas etapas iniciais de incubação, o tubo torna-se
amarelo devido à fermentação da glicose. Se o aminoácido é descarboxilado o meio retorna à cor
(-) (+)
púrpura. A reação se processa em anaerobiose, podendo-se cobrir o meio com óleo mineral para
agilizar o processo.
Indol
O indol é produzido pela ação da triptofanase sobre o triptofano existente no meio de cultura,
ocorrendo, também, a produção de ácido pirúvico e amônia. O indol pode ser detectado pela
formação de um anel rosa (pink) na parte superior do tubo, após a adição de p-
dimetilaminobenzaldeído (reativo de Erlich).
Produção de H2S (meio SIM)
Algumas bactérias são capazes de degradar compostos contendo enxofre (como o tiossulfato de
sódio e a cisteína das peptonas), através da tiossulfato redutase, produzindo H2S que é incolor.
Este reage com o ferro (indicador) formando um precipitado preto (sulfeto ferroso). Para que esta
reação ocorra é necessário que o meio esteja ácido.
Uréia
Há bactérias que possuem a enzima urease que garante a capacidade de degradar a uréia
presente no meio liberando amônia, CO2 e H2O. A amônia reage formando carbonato de amônia
que alcaliniza o meio. O indicador de pH é o vermelho de fenol que em meio alcalino toma a
coloração magenta. Uma coloração meio rosa é suficiente para considerar a reação positiva.
Redução de Nitratos
Muitas bactérias são capazes de reduzir nitratos a nitritos, ocorrendo mais rapidamente em
condições anaeróbias (condição em que o nitrato substitui o oxigênio como aceptor final de
elétrons). Adicionando-se algumas gotas dos reativos de Griess-Ilosva, o nitrito é evidenciado
através da formação de um composto avermelhado.
Motilidade
A motilidade é observada através do aspecto do meio, isso decorre pelo do fato de o meio ser semi-
sólido o que permite o crescimento bacteriano no interior do meio, por todo o tubo. Se a motilidade
é positiva o aspecto do meio será turvo enquanto que motilidade negativa o crescimento só será
observado na zona da picada. Fica mais fácil de observar a motilidade pondo os tubos contra uma
folha de papel pautado, se conseguir observar as linhas através do tubo é motilidade negativa.
Escherichia coliEsta bactéria é altamente móvel e provocará turbidez no meio.
Klebsiella pneumoniae
Esta bactéria não é móvel e formará somente uma linha de crescimento.
Provas IMViC (Indol, Vermelho de Metila, Voges-Proskauer, Citrato)
Esta série de quatro provas já vistas anteriormente permite diferenciar os principais grupos de
Enterobacteriaceae:
Grupo I: Escherichia, Edwardsiella, Citrobacter, Salmonella, Shigella
Grupo II: Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Serratia
Grupo III: Proteus
Grupo IV: Yersinia
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