Análise de expressão gênica€¦ · A quantidade de expressão de um gene em uma célula pode...

Fernanda Bravim

Análise de expressão gênica

Universidade Federal do Espírito Santo Laboratório de Biotecnologia Aplicado ao Agronegócio

EXPRESSÃO GÊNICA

• Processo pelo qual a informação contida em um gene é traduzido em estruturas presentes em um determinado tipo celular (mRNA ou proteínas).

CONTROLE DA EXPRESSÃO GÊNICA

• Nos microrganismos o controle da expressão gênica serve principalmente para permitir que as células se ajustem às mudanças nutricionais no ambiente, de forma que o seu crescimento e divisão sejam otimizados; •Em organismos multicelulares a expressão gênica controlada regula um programa genético fundamental para o desenvolvimento embrionário e a diferenciação.

ERA “ÔMICA”

A metabolômica é o estudo que visa

identificar e quantificar o conjunto de metabólitos

produzidos e/ou modificados por um

organismo

Coleção de RNAs (transcritos) presentes em uma célula/tecido

em um dado momento

Estuda o conjunto de proteínas e suas

isoformas contidas em uma célula/tecido que são determinadas pelo

genoma da mesma

• O acumulo exponencial de sequencias gênicas e genomas depositados em bancos de dados públicos mundiais têm aumentado consideravelmente a demanda por metodologias que permitam sua identificação funcional ou confirmação de homologia, além da elucidação dos padrões de expressão

• Identificação de todos os RNAs expressos em um dado organismo ou tecido; • Comparação do perfil de expressão gênica em diferentes condições ambientais, estados patológicos, fisiológicos ou de desenvolvimento; • Caracterização de polimorfismos associados aos genes transcritos: formas alternativas de splicing e SNPs (- Variações na sequencia de DNA dos humanos pode afetar como eles desenvolvem as doenças e respondem aos patógenos, as drogas e as vacinas – medicina personalizada).

ANÁLISE DE TRANSCRIPTOMA EM LARGA ESCALA

• Identificação de genes e vias moleculares envolvidas em processos biológicos: genes com perfil de expressão semelhante podem estar funcionalmente relacionados ou sob o mesmo mecanismo e controle; - Manipulação de drogas; - Melhoramento de plantas; • Fornecer pistas sobre as funções de genes ainda não caracterizados a partir do estudo do padrão espacial (localização sub-celular) e temporal de expressão; • Identificar marcadores para diagnóstico molecular de doenças; •Podem ainda indicar alterações no proteoma e/ou metaboloma.

QUAIS INFORMAÇÕES PODEM SER OBTIDAS ATRAVÉS DA ANÁLISE DE TRANSCRIPTOMA?

• Expressão do conjunto de genes em um tecido tumoral X os genes encontrados em amostras controle de tecido normal; • Traçar o perfil de expressão gênica em uma determinada anomalia, fazendo a investigação em um determinado nº de indivíduos (ou organismos) portadores dessa anomalia;

• Identificação de genes envolvidos em numerosos processos biológicos;

- Identificação de genes expressos durante diferentes etapas do desenvolvimento; - Identificação e comparação de genes expressos diferencialmente em tecidos normais e malignos; - Diagnóstico, avaliação, prognóstico.

ANÁLISE FEITA DE MODO COMPARATIVO

É usado para a quantificação do transcriptoma e análise

estutural . Next-generation sequencing

technology.

A quantidade de expressão de um gene em uma célula pode ser medida pelo número de cópias de um transcrito de mRNA de um determinado gene presente em uma amostra. Para detectar e quantificar a expressão gênica de pequenas quantidades de RNA, a amplificação dos genes transcrito é necessária. Permitem a quantificação do nível de expressão gênica • Northem Blot • RT-PCR – qRT-PCR; • SAGE (Serial Analysis of Gene Expression); • Microarrays de DNA; • RNA-seq

MÉTODOS PARA ESTUDO DE TRANSCRITOMA

Uma técnica usada para produzir um rápida população de mRNA em uma amostra de

interesse na forma de pequenas etiquetas que corresponde a

fragmentos desses transcritos

• Organismo-modelo

1- Ascomiceto unicelular; 2- São muito utilizadas nas indústrias de fermentação, para a produção de bebidas, biocombustível e massas; 3- Linhagens laboratoriais são haploide; 4- São a E. coli do eucariotos:

A levedura Saccharomyces cerevisiae

Espécies diferentes Processos similares

Respostas no organismo modelo parcialmente aplicadas a outras

- São pequenas; - Completam seu ciclo de vida em 90 min; - Podem ser cultivadas em meios de cultura muito facilmente; - Produzem colônias quando plaqueadas (mutações e “replica-plate”); - Ciclo de divisão mitótico. 5- Não são patogênicas; 6- Genoma sequenciado desde 1996.

A levedura Saccharomyces cerevisiae

• Principais contribuições:

1- Ciclo celular: - Etapas específicas na progressão do ciclo celular; - Controles anormais da divisão celular que levam ao câncer humano.

2- Recombinação: - Crossing over. 3- Genética mitocondrial: - Estrutura do genoma mitocondrial.

4- Genética do tipo reprodutivo: - Transdução de sinal durante a detecção e resposta aos hormônios reprodutivos do tipo oposto. 5- Genética da senescência

A levedura Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae AND cell cycle AND cancer

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=saccharomyces+cerevisiae+AND+cell+cy

cle+AND+cancer

Genoma sequenciado desde 1996.

GENOMA

GENOMA

1- RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)

• Um dos variantes da PCR;

• Utilizada em biologia molecular para detectar os níveis de expressão de RNA;

• Para a reação o RNA é primeiro convertido em cDNA usando a transcriptase reversa;

• O cDNA será usado como template para a amplificação exponencial usando PCR; • Qualquer gene pode ser detectado por esta técnica??

RT-PCR semiquantitativo ou relativo: • Envolve a amplificação de um controle interno simultaneamente com o gene de interesse;

Controle interno Normalizar as amostras

• Depois de normalizado: comparação dos transcritos;

• Comparar os níveis dos transcritos em diferentes amostras. Aplicações:

- Pesquisa; - Diagnóstico de doenças genéticas; - Detecção de câncer.

Controle 50 MPa 15 30 60

qRT-PCR: Real-time RT-PCR / Real-time PCR • É usada para amplificar e simultaneamente quantificar uma molécula de DNA alvo; • Detecção e quantificação;

• Quantificação: absoluta ou relativa;

• Técnica EFICIENTE, SENSÍVEL e RÁPIDA;

• Segue o mesmo principio da PCR – Porém a detecção acontece em tempo real (na fase exponencial da ciclagem); • A quantidade de DNA é medida depois de cada ciclo pelas sondas fluorescentes;

• Equipamento: capacidade de ciclagem termal e de capturar a fluorescência das sondas;

• Plot de amplificação: representa o acumulo de produto pela duração da reação

• Sondas fluorescentes: Não-específicas: se ligam a qualquer fita dupla de DNA

• Um aumento na quantidade de DNA/RNA conduz a um aumento na intensidade de fluorescência e é medido a cada ciclo;

• SYBR Green;

• Produtos de PCR não específicos: dímeros

• 1 Par de primers: redução do custo.

• Sondas fluorescentes: Sequencias-específicas: detecta apenas o DNA contido na sequencia da sonda

• 2 primer e a sonda TaqMan; • Especificidade maior.

Barras brancas: 50 MPa Barras pretas: 50 MPa + 15 min

2- Microarray ou DNA chip

• Medir o nível de expressão de vários genes simultaneamente;

• Os arranjos pré-definidos de moléculas de DNA são quimicamente ligadas à uma superfície sólida (lâminas de microscópio);

• As amostras são postas para hibridar com o DNA fixado no array (complementariedade de bases). A detecção é possível pois as amostras são "marcadas" com fluorocromos cianina 3 (Cy3) ou cianina 5 (Cy5)

Vermelho: expressos Verde: reprimidos

Preto: não há diferença na expressão

Vermelho: expressos Verde: reprimidos

Preto: não há diferença na expressão

Análise dos dados por análise de bioinformática • Quantidade grande de dados geradas

Genes classificados em diferentes categoria do MIPS-CYGD

• Poucas variações na expressão imediatamente após o tratamento e aumento após o tratamento;

• Classe 4: Defesa celular (estresse oxidativo e osmótico)

• Classe 9: energia – Ácido cítrico, fermentação e fosforilação oxidativa, genes relacionados a síntese de metionina e glutamato.

Este artigo identificou os fatores de transcrição ativados durante um tratamento sub-letal de pressão hidrostática, utilizando diferentes ferramentas de bioinformática.

• Foram identificados os fatores de transcrição e seu correspondentes motivos de DNA e RNA em resposta a alta pressão hidrostática.

• Além disso, foi observado que diferentes motivos estão presentes na promoção de genes induzidos ou reprimidos durante o tratamento de pressão hidrostática.

• Os genes ativados imediatamente após a pressão estão relacionados com a

adaptação e ao crescimento, enquanto genes envolvidos na parada do ciclo celular e metabolismo energético continuam expressos 15 min após o

tratamento.

• Os genes que fazem parte de um módulo altamente conectado normalmente fazem parte de

importantes processos biológicos;

• Motivos relacionados a genes associados com metabolismo de energia

e resposta a estresse;

• Estes genes normalmente estão superexpressos

• Cor do círculo: maior abundância de conexões

• Msn2/4 pode estar relacionados na transcrição de genes envolvidos na

degradação de proteínas via proteossomo.

• Genes relacionados ao complexo proteossomico compartilham o mesmo

motivo em ambos os módulos.

• O módulo B:

• Motivos relacionados a genes requeridos para a síntese de

RNA , DNA e proteínas.

• Maioria está reprimida.

Rgm1p: envolvido na repressão de processos necessários para o crescimento celular normal;

Cin5: resposta a estresses; Abf1p: controle do crescimento celular; Oaf1p: beta-oxidação de ácido graxo.

AGRADECIMENTOS

OBRIGADA!

Fernanda Bravim bravimf@gmail.com