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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA DO SOLO
SEMINÁRIO II
Atividade biológica associada à Atriplex nummularia em solo salino-sódico no Agreste de Pernambucosalino-sódico no Agreste de Pernambuco
Discente: Karen Cristina Fialho dos Santos
Novembro, 2009
Orientadora: Maria Betânia Galvão dos Santos Freire
Co-orientadores: Júlia Kuklinsky SobralMario de Andrade Lira Junior
Introdução
A salinidade em solos
• Acúmulo de sais
• Lençol freático
CE ≥ 4 dS/m• CE ≥ 4 dS/m
(Oliveira et al., 1992; Ribeiro et al., 2009)
Introdução
A salinidade em solos
• Fator limitante para agricultura
• Aumento considerado nas últimas décadas
• Fatores:
• Material de origem (gênese do solo)
• Uso indiscriminado de água
• Qualidade da água
(Liang et al., 2005)
Introdução
A salinidade em solos
• No Brasil, acontece principalmente em regiões de clima árido esemi-árido
• Teor de sais que permite apenas o desenvolvimento de plantashalófitashalófitas
• Utilização para fitoextração
(Oliveira et al., 1992; Leal et al., 2008; Ribeiro et al., 2009)
Introdução
A cultura da Atriplex e sua utilização na recuperação de solos salinos
• Família Chenopodiacea (Austrália)
• Abundante fitomassa
• Precipitação de 100 a 250 mm/ano
• Planta arbustiva, perene
• Altura 1,5 – 3,0 m e raízes de até 3,5 m
• Toleram solos pouco profundos, secos e pobres em nutrientes
• Precisam de sais para completar seu ciclo de vida (Halófilasautênticas)
(Flower et al., 1977; Kelley et al., 1982; O’Leary, 1990; Porto et al, 2000; )
Introdução
A cultura da Atriplex e sua utilização na recuperação de solos salinos
• Folhas verde acinzentadas
• Vesículas esbranquiçadas acumuladoras de sais – mecanismo detolerância
• Por isso, usadas na fitoextração• Por isso, usadas na fitoextração
(Kelley et al., 1982; Porto et al., 2000, Santana & Silva, 2000; Zhu, 2001).
Introdução
Microorganismos em ambientes salinos
• Maioria presentes no Domínio Archea - halófilas
• Cocos e bacilos
• Requerem no mínimo 9% de NaCl no solo chegando a até 23%(4mol/L)(4mol/L)
• Halotolerantes 2 a 5% de salinidade
•Para adaptação – principalmente acúmulo de íons orgânicos paraequilibrar a tensão osmótica
(Santos et al., 2001, Kyaw, 2009; Oetterer, 2009). http://www.scielo.br/img/revistas/qn/v30n1/24f1.gif
Introdução
Microorganismos em associação à Atriplex
• Adubação nitrogenada para desenvolvimento da cultura
• Conhecimento e isolamento de bactérias nativas que fixem N2
• Aumento da capacidade do desenvolvimento em solos pobres –promoção da fitorremediaçãopromoção da fitorremediação
• Produção do AIA
• Estudos escassos sobre o tema
(Silva et al., 2008).
Objetivos
Geral
• Avaliar o desenvolvimento de mudas de Atriplex nummularia sobassociação com microorganismos em condições de salinidade.
Específicos
• Avaliar a comunidade bacteriana associada a plantas de Atriplex pormeio de isolamento em meio de cultura com alta concentração de sal
• Identificar e analisar filogeneticamente os isolados bacterianos peloestudo do gene 16S rRNA;
• Identificar e analisar a variabilidade genética de populações bacterianasnão-cultiváveis por meio da técnica de DGGE (Denaturing Gradient Gel
Objetivos
não-cultiváveis por meio da técnica de DGGE (Denaturing Gradient Gel
Electrophoresis).
• Selecionar bactérias fixadoras de N2 e produtoras de ácido indol acético(auxina), um regulador de crescimento vegetal;
• Avaliar isolados bacterianos quanto a tolerância a diferentesconcentrações de salinidade in vitro;
• Avaliar, em casa de vegetação, os efeitos da reinoculação de bactériasselecionadas sobre o desenvolvimento inicial de plantas de Atriplex.
Material de estudo e amostragem
• Bactérias associadas à ambientes com e sem plantas de Atriplex
nummularia
• Experimento de campo, 2008, Neossolo Flúvico salino-sódico noMunicípio de Pesqueira (PE).
• Período seco (dezembro) e chuvoso (agosto)
O solo - textura média, pH 9,1, CE de 21,49 dS/m e Na+ solúvel 29,8
Material e Métodos
• O solo - textura média, pH 9,1, CE de 21,49 dS/m e Na+ solúvel 29,8cmolc/dm3
• O experimento foi montado em delineamento experimental em blocoscasualizados
• Três tratamentos: planta sem poda, planta com poda e a testemunha
Material de estudo e amostragem
• Serão coletadas amostras de solo na profundidade de 0-20 cm• Três locais distintos por bloco: 1) na rizosfera, 2) no pontointermediário entre plantas e na área sem interferência das plantas(tratamento testemunha).
•Ramos terminais contendo folhas
Material e Métodos
• As amostras de solo serão coletadas em duplicata para a identificaçãobiológica e atividade biológica.
Isolamento de bactérias
• Laboratório de Genética e Biotecnologia Microbiana, UAG-UFRPE, paraprocedimento das análises.
• Para separação das bactérias do solo e rizosfera serão feitos osprocedimentos iniciais de desagregação do solo, em Erlenmeryers compérolas de vidro.
Material e Métodos
• Diluições seriadas para inoculação em meio de cultura TSA 10% + 5%de NaCl, juntamente com o fungicida Cercobyn
• Serão avaliadas após 3, 8 e 14 dias através da contagem das UFCs
• Posteriormente serão isoladas e purificadas
http://www.uspinc.com/MCtubes.htmhttp://www.cerveceroscaseros.com.ar/levaansa.jpg
Isolamento de bactérias
• Para o rizoplano, as raízes serão lavadas para retirada do solo
• Depois será seguido o mesmo procedimento para rizosfera e solo
•Para isolamento das bactérias endofíticas de folhas e raízes será feita adesinfecção, que seguirá as etapas:
Material e Métodos
•Depois será seguido o mesmo procedimento para rizosfera, solo e rizoplano
Etanol 70%
Etanol 70%
NaOCl 2%
Água 2
Água 1
1 min 3 min 30 seg
Seleção de bactérias
• Fixação de N2 – meio de cultura sem fonte de N (NFb) – confirmação(presença de halo), após 7 dias a 28ºC
• Produção de AIA – meio de TSA + L-triptofano + membrana denitrocelulose, por 1 dia a 28ºC
• Após este tempo, membrana removida e tratada com reagente deSalkowski- confirmação por um halo rosa em torno da colônia
Material e Métodos
Salkowski- confirmação por um halo rosa em torno da colônia
• Tolerância a salinidade- inoculação em placas de petri comconcentrações de NaCl de 0g/l; 15 g/l; 30 g/l; 45 g/l; 60 g/l e 75 g/l, por 7dias a 28ºC
•Avaliações de acordo com nível do crescimento
Identificação de bactérias
• Análise parcial do 16S rDNA
•Posteriormente analisadas pelo BLAST
• Posteriormente o DNA será analisado através de kits (EMBRAPA MeioAmbiente)
Material e Métodos
• Só então serão realizadas análises de PCR e DGGE
Atividade Biológica
• Laboratório de Química do Solo – UFRPE
• Respiração basal (incubação – reação do CO2 da respiração com NaOH)
•C e N (fumigação-extração)
Material e Métodos
Ensaio em casa de vegetação
• Após avaliação e identificação dos isolados bacterianos
• Montagem de experimento em casa de vegetação
• Envolvendo: mudas de Atriplex (c/ e s/ inoculação), Fertilizantes orgânicoe mineral, além de irrigação com águas de diferentes salinidades
Material e Métodos
• Mudas – micropropagação – CETENE – sacos de polietileno
• Escolha dos inóculos – N2, AIA e tolerância a salinidade
Tratamento Identificação
1 Fertilizante químico
2 Fertilizante orgânico
3 Inóculo 1
4 Inóculo 2
5 Inóculo 3
Material e Métodos
6 Inóculo 4
7 Inóculo 5
8 Combinação de bactérias 1
9 Combinação de bactérias 2
10 Combinação de bactérias 3
11 Testemunha
Esquema fatorial: 11 x 2 (tratamentos x águas de irrigação 1 e 5 dS/m), com 5 repetições – 110 unidades experimentais
Material e Métodos
Ensaio em casa de vegetação
• A cada 15 dias, medições de planta
• Após 90 dias, coleta das plantas e solo
• Da planta, raízes separadas da parte aérea para determinação do N total ematéria seca
• Serão realizadas também análises da atividade microbiana do solo
Material e Métodos
Análise estatística
• Para a densidade populacional bacteriana - programa SAS
• Os valores de UFC/g serão transformados em log10 antes da análise devariância.
• A ANOVA será utilizada para testes a 1% de significância, nodelineamento experimental inteiramente casualizado.delineamento experimental inteiramente casualizado.
•Teste de Tukey - comparação entre as médias.
• Experimento casa de vegetação - Contrastes ortogonais (comparaçãoentre grupos)
Ano 2009 2010 2011
Atividades/mês A S O N D J F M A M J J A S O N D J F
Elaboração e defesa
do projeto
x x
Coleta das amostras x x
Análises
microbiológicas
x x x x x x x x
Análises de DGGE x x
Implementação do
experimento da
x
Cronograma
experimento da
casa-de-
vegetação
Coleta das amostras x
Análise do material
coletado
x x
Análise estatística x x
Avaliação dos
resultados
x x x
Redação de artigos e
da dissertação
x x x x
Defesa da
dissertação
x
Recommended