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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ZOOTECNIA
CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN DE TAMBAQUI Colossoma macropomum EM CRIOTUBO
ALLAN CHARLES MARQUES DE CARVALHO
SÃO CRISTÓVÃO-SE 2013
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ZOOTECNIA
ALLAN CHARLES MARQUES DE CARVALHO
CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN DE TAMBAQUI Colossoma macropomum EM CRIOTUBO
SÃO CRISTÓVÃO-SE 2013
Orientador Dr. Alexandre Nizio Maria Co-orientador Dr. Paulo César Falanghe Carneiro
Dissertação apresentada à Universidade Federal de Sergipe como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Zootecnia.
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
Carvalho, Allan Charles Marques de
C331c Criopreservação de sêmen de tambaqui Colossoma
macropomum em criotubo / Allan Charles Marques de Carvalho ; orientador Alexandre Nizio Maria. – São Cristóvão, 2013. 56 f. : il. Dissertação (mestrado em Zootecnia) – Universidade Federal de Sergipe, 2013.
O 1. Peixe. 2. Criopreservação. 3. Peixe - Fertilização. 4.
Cinética espermática. 5. Zootecnia. I. Maria, Alexandre Nizio, orient. II. Título.
CDU 639.3.034
DEDICATÓRIA
Em primeiro lugar a Deus pela energia nos momentos mais difíceis.
Aos meus pais pelo incentivo e por todo o carrinho.
Aos meus irmãos pelos bons conselhos.
À minha namorada que me ajuda a superar os longos percursos.
AGRADECIMENTOS
Ao programa de pós-graduação em Zootecnia da Universidade Federal de Sergipe.
À Embrapa Tabuleiros Costeiros, pelo apoio técnico e laboratorial.
Aos meus colegas de mestrado que trilharam essa jornada comigo, principalmente:
Diana Matos, Marta Jeidjane e Vítor Andrade.
A todos que compõem o Laboratório de Biotecnologias da Reprodução Animal
(LABRA): Allan Rezende, Allisson Ferro, Ana França, Carlos Adriano, David Lopes,
Evelyn da Silva, Flavia Hipolito, Giselle Santana, Jadson Pinheiro, Jofferson Santos, José
Eduardo, Maiana Chaves, Dr. Rafael Venâncio, Rebeca Silva, Sidney Sales e Tarsízio da
Silva, pelo apoio.
Ao Orientador Dr. Alexandre Nizio Maria por todo apoio pedagógico e técnico
durante o mestrado.
Ao Co-orientador Dr. Paulo César Falanghe Carneiro por toda ajuda.
Ao Dr. Hymerson Costa Azevedo pelas conversas produtivas e pelos incentivos.
Ao professor Dr. Anselmo Domingos Ferreira Santos pelos ensinamentos.
Ao professor Dr. Rogério Tubino, que foi meu primeiro orientador do PIBIC.
Obrigado! Quando fazia ler vários livros para testar meus conhecimentos e pelas lições de
vida.
Agradeço a todos que tiveram participação na minha formação acadêmica.
SUMÁRIO
Página
RESUMO ............................................................................................................................... i
ABSTRACT .......................................................................................................................... ii
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 8
2. REFERENCIAL TEÓRICO ............................................................................................. 9
2.1. Tambaqui Colossoma macropomum ............................................................................ 9
2.2. Criopreservação de sêmen.......................................................................................... 10
2.3. Velocidade de congelamento e de descongelamento ................................................. 16
2.4. Criotubos .................................................................................................................... 18
3. REFERENCIAL BIBLIOGRÁFICO ............................................................................. 19
ARTIGO ................................................................................................................................ 1
RESUMO .............................................................................................................................. 1
1. Introdução ......................................................................................................................... 2
2. Material e Métodos ........................................................................................................... 4
2.1. Seleção dos reprodutores, coleta e avaliação inicial do sêmen .................................... 4
2.2. Criopreservação do sêmen ........................................................................................... 6
2.3. Experimento 1: Avaliação do tipo de criotubo e tempo de descongelamento do
sêmen. .................................................................................................................................... 6
2.3.1. Avaliação da cinética espermática ............................................................................... 7
2.3.2. Determinação das velocidades de congelamento e descongelamento ......................... 8
2.4. Experimento 2: Fertilidade do sêmen congelado em diferentes criotubos e sua
correlação com os parâmetros de cinética espermática ....................................................... 10
2.5. Experimento 3: Duração da cinética espermática pós-ativação no sêmen congelado
em diferentes criotubos ........................................................................................................ 11
2.6. Experimento 4: Viabilidade dos espermatozoides descongelados mantidos sob
refrigeração .......................................................................................................................... 12
2.7. Análise estatística ....................................................................................................... 13
3. Resultados ....................................................................................................................... 14
3.1. Experimento 1: Avaliação do tipo de criotubo e tempo de descongelamento do
sêmen. .................................................................................................................................. 14
3.1.1. Avaliação da cinética espermática ............................................................................. 14
3.2. Experimento 2: Fertilidade do sêmen congelado em diferentes criotubos e correlação
com os parâmetros de cinética espermática ......................................................................... 16
3.3. Experimento 3: Duração da cinética espermática pós-ativação no sêmen congelado
em diferentes criotubos ........................................................................................................ 17
3.4. Experimento 4: Viabilidade dos espermatozoides descongelados em diferentes
criotubos mantidos sob refrigeração .................................................................................... 21
4. Discussão ........................................................................................................................ 23
5. Conclusão ........................................................................................................................ 27
6. Referências ...................................................................................................................... 27
i
RESUMO
Carvalho, ACM. Influência do tipo de criotubo e do tempo de descongelamento sobre a qualidade e fertilidade do sêmen de tambaqui Colossoma macropomum criopreservado. Sergipe:UFS, 2013. 56p. (Dissertação - Mestrado em Zootecnia) A criopreservação de sêmen em criotubos reduz o tempo necessário para o envase, congelamento e descongelamento das amostras, além de otimizar os procedimentos de fertilização artificial. No entanto, nenhum estudo ainda foi realizado com o sêmen de tambaqui neste recipiente. Assim, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a influência do tipo de criotubo (1,6 e 4,5 mL) e do tempo de descongelamento (60ºC/70s e 60ºC/90s) sobre a qualidade e fertilidade do sêmen de tambaqui criopreservado. Para isso, amostras de sêmen foram diluídas em solução de congelamento (1:9 v/v) composta por 75% de glicose 290 mOsm, 10% de metilglicol e 5% de gema de ovo, sendo envasadas em criotubos de 1,6 e 4,5 mL, congeladas em vapor de nitrogênio líquido no botijão dry-shipper (-175ºC) e armazenadas em botijão criogênico a -196°C. Para avaliação do tempo de descongelamento do sêmen, os criotubos foram imersas em água a 60°C durante 70 s ou 90 s e a qualidade espermática imediatamente avaliada (Motilidade total - MT; Motilidade progressiva - MP; Velocidade curvilinear - VCL; Velocidade em linha reta - VSL e Velocidade média da trajetória - VAP). Neste estudo foi determinado também o tempo de viabilidade dos espermatozoides descongelados, mantidos sob refrigeração a 5°C e avaliados durante 24 horas. Além dos parâmetros de cinética espermática foram avaliadas a morfologia e a integridade da membrana plasmática dos espermatozoides. A capacidade de fertilização do sêmen foi avaliada a partir das amostras descongeladas no melhor tempo. Todos os parâmetros de cinética espermática apresentaram valores superiores quando as amostras de sêmen foram descongeladas por 90s em relação ao tempo de 70s, independentemente do tipo de criotubo. Não foram observadas diferenças significativas nos parâmetros de cinética espermática pós-descongelamento entre as amostras congeladas nos criotubos de 1,6 e 4,5 mL, com exceção da MT que foi superior nos criotubos de 1,6 mL (47±14%) em comparação com os criotubos de 4,5 mL (40±11%), independentemente do tempo de descongelamento. Após ativação, os espermatozoides reduziram significativamente os valores dos parâmetros de cinética dentro de 37 segundos, exceto a MT que se manteve constante neste período. Baseando-se na maior parte dos parâmetros espermáticos avaliados (VCL, VSL, VAP e Integridade da membrana plásmatica para ambos os criotubos e MT, MP e Morfologia espermática somente para o criotubo de 1,6 mL) o sêmen congelado manteve sua qualidade durante 3h após o descongelamento. A taxa de fertilização obtida com o sêmen in natura (74±6%) foi superior ao sêmen criopreservado (1,6 mL - 45±9% e 4,5 mL - 41±12%). Os dois criotubos não diferiram entre si neste parâmetro. Uma alta correlação significativa (p<0,05) foi observada entre a fertilização e a cinética espermática (MT - 89%; MP - 86%; VCL - 79%; VSL - 69% e VAP - 78%). Conclui-se que os criotubos de 1,6 e 4,5 mL podem ser utilizados na criopreservação do sêmen de tambaqui, sendo recomendado seu descongelamento a 60°C por 90s e seu uso em procedimentos de fertilização dentro de 3 horas após o descongelamento desde que mantido a 5°C. Palavras-chave: Peixe; Cinética espermática; Criopreservação; Fertilização.
ii
ABSTRACT
Carvalho, ACM. Influence of cryotube and thawing time on the quality and fertility of tambaqui Colossoma macropomum cryopreserved semen. Sergipe:UFS, 2013. 56p. (Dissertation - Master in Zootecnia)
The semen cryopreservation in cryotubes reduces the time needed for filling, freezing and thawing of the samples, while optimizing the procedures for artificial fertilization. However, no study has yet been performed with tambaqui semen in this container. The aim of this study was to evaluate the influence of cryotubes (1.6 and 4.5 mL) and thawing time (60ºC/70s and 60ºC/90 s) on the quality and fertility of tambaqui cryopreserved semen. For that, semen samples were diluted in freezing solution (1:9) composed with 75% glucose 290 mOsm , 10% methylglycol and 5% egg yolk, and frozen in liquid nitrogen vapor (in a dry shipper), and stored in liquid nitrogen (-196 °C). The semen samples was thawed at 60ºC in bath water during 70s or 90s and the semen quality was evaluated (Total motility - MT; Progressive motility - MP; Curvilinear velocity - VCL; Straight-line velocity - VSL and Average path velocity - VAP). In this study was also determined the time viability of spermatozoa thawed, maintained under refrigeration at 5°C, and assessed over 24 hours. Besides the kinetic parameters were evaluated sperm morphology and membrane integrity of spermatozoa. The fertilizing capacity of semen was evaluated from the samples thawed in the best time. All parameters of sperm kinetic showed higher values when the semen samples were thawed in 90 s compared to 70 s, independently of cryotube type. No significant differences were observed in sperm kinetic parameters after thawing between samples frozen in 1.6 ml and 4.5 mL cryotubes, except for total motility that was higher in 1.6 mL (47 ± 14% ) compared with 4.5 mL cryotubes (40 ± 11%), independently of thawing time. After activation, the spermatozoa significantly reduced the values of kinetic parameters within 37 seconds, except the MT which remained constant during this period. Relying on the sperm parameters evaluated (VCL, VSL, VAP and membrane integrity for both cryotubes and MT, MP and morphology only for 1.6 mL cryotube) the frozen semen maintained the quality during 3h after thawing. The fertilization rate obtained with fresh semen (74±6%) was higher than cryopreserved semen (1.6 mL - 45±9% and 4.5 mL - 41±12%). The two cryotubes did not differ in this parameter. A high correlation (p <0.05) was observed between fertility and sperm kinetics parameters (MT - 89%, MP - 86%; VCL - 79%; VSL - APV and 69% - 78%). It is concluded that 1.6 and 4.5 mL cryotubes can be used in the cryopreservation of tambaqui semen being recommended to be thawed at 60°C for 90s and their use in fertilization procedures within 3 hours after thawing since kept at 5°C. Key-words: Fish; sperm kinetics; Cryopreservation; Fertilization.
8
1. INTRODUÇÃO
O tambaqui é considerado um peixe de grande importância para o desenvolvimento
da aquicultura no Brasil, principalmente nas regiões Norte e Nordeste. A produção do
tambaqui no Brasil nos anos de 2008, 2009 e 2010 foi de aproximadamente 39.000, 46.000
e 54.000 toneladas, respectivamente, apresentando crescimento linear. Em 2010, a
produção de tambaqui contribuiu com 13,77% da produção da piscicultura continental,
ficando atrás apenas da tilápia com 39,42% e da carpa com 23,98% (MPA, 2010).
Esta espécie é reofílica e sua reprodução nas pisciculturas é feita por meio de
fertilização artificial, onde a indução hormonal se faz necessária. Outro fator relevante
tanto para as pisciculturas como para os programas de melhoramento genético é a
variabilidade genética no plantel de reprodutores, a fim de manter determinadas
características importantes para produção comercial, tais como: aumento das taxas de
crescimento e de sobrevivência, e maior resistência a doenças. Além disso, a técnica de
criopreservação de sêmen tem sido utilizada para auxiliar na manutenção da variabilidade
genética, pois permite a otimização do transporte de sêmen, bem como seu armazenamento
em bancos de germoplasma, garantindo o intercâmbio entre as diversas instituições de
pesquisa e pisciculturas.
A utilização de sêmen criopreservado na fertilização artificial possibilita diminuir o
plantel de reprodutores machos na piscicultura, otimizando o manejo dos reprodutores e
diminuindo os custos de produção.
A criopreservação de sêmen em pequenas unidades de envase como as palhetas de
0,5 mL, não é comercialmente ideal quando se trata de espécies reofílicas, pois existe a
necessidade de um grande número de palhetas para fertilização dos ovócitos. Métodos para
criopreservar grandes quantidades de sêmen estão sendo estudados a fim de aumentar a
viabilidade comercial da técnica (FAUVEL et al., 1998; LINHART et al., 2000;
CABRITA et al., 2001; RODINA et al., 2007; DING et al., 2009; LICHTENSTEIN et al.,
2010). Os criotubos possuem como vantagens, o armazenamento de uma quantidade maior
de sêmen, a facilidade de envase, e a possibilidade de ser esterilizado e reaproveitado em
mais de um processo de criopreservação.
O envase de sêmen congelado em criotubos, sem grandes perdas da qualidade
espermática e fertilidade, pode aumentar a aplicabilidade da criopreservação na produção
9
em escala comercial de peixes pela indústria piscícola, servindo de instrumento para
reprodução artifical ou para formação de bancos de germoplasma.
O objetivo do presente estudo foi avaliar a influência do tipo do criotubo e do tempo
de descongelamento na qualidade e capacidade de fertilização do sêmen criopreservado de
tambaqui.
2. REFERENCIAL TEÓRICO
2.1. Tambaqui (Colossoma macropomum)
O Colossoma macropomum (Cuvier, 1818), popularmente conhecido como
tambaqui, pertence à ordem Characiforme, espécie reofílica e endêmica das bacias dos rios
Amazonas e Orinoco, sendo considerado o segundo maior peixe de escama da bacia
Amazônica (GOULDING & CARVALHO, 1982). Este peixe possui desova total com
fecundação externa, além de apresentar alta fecundidade por desova, ou seja, a fêmea
produz mais de 1.000.000 de ovócitos (VIEIRA et al., 1999).
Essa espécie possui como característica uma coloração variando de amarelo para
verde-oliva no dorso e preto no ventre. A intensidade das cores está correlacionada à cor,
transparência e pH da água. Tem como hábito alimentar zooplânctons, frutos e sementes,
ou seja, é uma espécie onívora (GOULDING & CARVALHO, 1982).
O tambaqui é criado amplamente em pisciculturas no Brasil, principalmente nas
regiões Norte e Nordeste (MUNIZ et al., 2008). Este fato deve-se às características
zootécnicas dessa espécie, tais como: crescimento rápido, resistência em ambientes com
baixo teor de oxigênio dissolvido, adaptação ao confinamento, carne saborosa, hábito
alimentar variado adaptando-se rapidamente ao arraçoamento (MENDONÇA et al., 2009).
Para piscicultura o maior entrave na criação do tambaqui é a sua natureza reofílica,
ou seja, na estação das enchentes dos rios ocorre a migração dos peixes para reprodução
que percorrem cerca de 1000 km (GOULDING & CARVALHO, 1982). Ao subir o rio os
peixes migradores são estimulados pelos fatores ambientais (temperatura, fotoperíodo e
outros), sociais (interação entre machos e fêmeas) e hormonais (ZOHAR & MYLONAS,
2001). Esses estímulos são capturados pelos receptores sensoriais que são transmitidos
para o sistema nervoso central que ativa o eixo endócrino (hipotálamo, hipófise e gônadas),
onde se dá a produção e a liberação de hormônios na corrente sanguínea, tendo como
10
consequência a maturação sexual (NAGAHAMA & YAMASHITA, 2008). Quando os
peixes reofílicos não são estimulados, ocorre uma pequena produção seminal e baixa
qualidade espermática nos machos e a ovulação não se completa nas fêmeas (HONJI et al.,
2009).
Deste modo, quando criado em confinamento o tambaqui, sofre disfunção no sistema
reprodutivo, devido à falta de estímulos ambientais, que diminuem a ação de hormônios
sexuais interferindo na reprodução natural (VIEIRA, et al., 2011). O método de
hipofisação, ou seja, manipulação hormonal utilizada em peixes maduros de espécies
migradoras para a indução da ovulação e espermiação, se tornou um instrumento de suma
importância para criação desses peixes nas pisciculturas (ZOHAR & MYLONAS, 2001;
ZANIBONI FILHO & WEINGARTNER, 2007).
Utilizando a indução hormonal no reprodutor, Colossoma macropomum, o volume
de sêmen coletado foi 25 vezes maior em relação ao volume coletado do reprodutor sem
indução hormonal (MARIA et al., 2011).
2.2. Criopreservação de sêmen
Atualmente a comunidade internacional está empenhada na preservação da
diversidade genética animal, que engloba os animais destinados à agropecuária e os de vida
selvagem (MORITZ & LABBE, 2008).
A formação de um banco de sêmen traz diversas vantagens para reprodução em
cativeiro, tais como: redução da demanda por estrutura e mão-de-obra, diminuição dos
custos e do risco de endocruzamentos e, eliminação da necessidade de captura e transporte
de reprodutores (MARTÍNEZ-PÁRAMO et al., 2009).
A criopreservação visa manter a estrutura e consequentemente a viabilidade celular a
baixas temperaturas por um determinado período (CAVALCANTE et al., 2006). A
preservação a longo prazo consiste no armazenamento e na manutenção da função
biológica das células espermáticas criopreservadas em nitrogênio líquido a -196 ºC.
A criopreservação pode aumentar a escala de utilização do sêmen nas criações sendo
uma ferramenta importante no controle da endogamia dos plantéis de peixe cultivados
(MORITZ & LABBE, 2008). A reprodução artificial através do armazenamento do sêmen
em longo prazo é vantajosa, uma vez que a produção fora da estação reprodutiva pode ser
11
feita utilizando-se espermatozoides de boa qualidade congelados em períodos mais
favoráveis (GROISON et al., 2010).
O processo de criopreservação do sêmen aplicado comumente em peixes
compreende a sua extração, diluição, envase em palhetas ou criotubos e congelamento e de
descongelamento (ROBLES et al., 2005).
Na criopreservação das células espermáticas de algumas espécies de peixes, tais
como: Brycon orbignyanus (MARIA et al., 2006), Piaractus brachypomus
(NASCIMENTO et al., 2010), Piaractus mesopotamicus (ORFÃO et al., 2010),
Prochilodus lineatus (VIVEIROS et al., 2010) e Colossoma macropomum (CARNEIRO et
al, 2012), o congelamento se dá colocando as amostras de sêmen diluídas e envasadas
dentro de um botijão dry shipper com vapor de nitrogênio líquido (N2L) a -175ºC e
armazenadas em botijão criogênico com N2L a -196ºC.
Entretanto o processo de congelação promove crioinjúrias às células espermáticas
devido a cristalização, desidratação e mudança de fase dos fofolipídios da membrana
plasmática (MAZUR, 1984; WATSON, 2000)
Para diminuir os danos causados às células espermáticas pelo congelamento, ao
sêmen é adicionado meio diluidor constituído por crioprotetores intracelulares a exemplo
do metilglicol e extracelulares como a glicose e gema de ovo. Os crioprotetores devem ter
baixa toxidade e não provocarem choque osmótico nos espermatozoides (HOLT, 2000;
BARBAS & MASCARENHAS, 2009; VIVEIROS et al., 2012).
A fim de minimizar as crioinjúrias sobre a membrana plasmática, que prejudicam a
fisiologia da célula espermática, técnicas mais precisas de congelamento e armazenamento
do sêmen em recipientes de maior tipo precisam ser desenvolvidas (CAVALCANTE et al.,
2006).
Devido especialmente a sua grande variedade e capacidade de armazenamento os
criotubos têm sido bastante utilizados em diferentes protocolos de congelamento e
descongelamento de sêmen em diversas espécies de peixe (Quadros 1 e 2).
12
Quadro 1. Protocolos de criopreservação de sêmen de peixes em criotubos.
Volume do Criotubo
Tipo de Congelador
Velocidade de Congelamento Velocidade de Descongelamento
Espécie Referência
1,0 mL Caixa Térmica Não mensurado 35°C/50s Odontesthes bonariensis Lichtenstein et al. (2010)
1,5 mL Caixa Térmica -65,0°C/min 50°C/60s Dicentrarchus labrax Fauvel et al. (1998)
1,6 mL Caixa Térmica Não mensurado
37°C/90s Hippoglossus hippoglossus
Ding et al. (2011) 4,0 mL 37°C/120s
1,8 mL Programável -8,0°C/min 25°C/120s Clarias gariepinus Rurangwa et al. (2001)
1,8 mL Programável -18,6°C/min 37°C/150s Lateolabrax japonicus Ji et. (2004)
1,8 mL Programável -18,6°C/min 37°C/90s Verasper variegatus Tian et al. (2008)
1,8 mL Programável -4°C/min (entre 4 e -9°C) e -11,0°C/min (entre -9 e -80°C); e 40°C/105s Tinca tinca Rodina et al. (2007) -20,0°C/min (entre 4 e -80°C)
1,8 mL Programável -31,0°C/min (entre 16 e -15°C) e
37°C/60-90s Scophthalmus maximus Chen et al. (2004) -18,6°/min (entre -12 e -180°C)
2,0 mL Programável -4,0°C/min (entre 4 e -9 °C) e
35°C/110s Cyprinus carpio Linhart et al. (2000) -11,0°C/min (entre -9 e - 80°C/min)
2,0 mL Programável -20,0°C/min 40°C/90-110s Pagrus major Liu et al. (2006a)
2,0 mL Programável Não mensurado 28°C/120s Paralichthys olivaceus Zhang et al. (2003)
2,0 mL Caixa Térmica Não mensurado 37°C/60s Pelteobagrus fulvidraco Pan et al. (2008)
Todos os procedimentos de congelação foram feitos com vapor de nitrogênio líquido.*Citação do presente estudo.
13
Continuação do Quadro 1.
Volume do Criotubo
Tipo de Congelador
Velocidade de Congelamento
Velocidade de Descongelamento
Espécie Referência
2,0 mL Caixa Térmica Não mensurado 28°C/60s Verasper variegates Liu et al. (2006b)
2,0 mL Caixa Térmica Não mensurado 37°C/60s Siniperca chuatsi Ding et al. (2009)
2,0 mL Botijão Criogênico
-5,0°C/min 50°C/120s Pangasius gigas
Mongkonpunya et al. (1995) 5,0 mL -12,0°C/min 50°C/180s
1,6 mL* Botijão Dry Shipper
-9,6 °C/min 60°C/90s Colossoma macropomum Carvalho et al. (2013)*
4,5 mL* -9,0 °C/min 60°C/90s Todos os procedimentos de congelação foram feitos com vapor de nitrogênio líquido.*Citação do presente estudo.
14
Quadro 2. Resultados da Motilidade Total e da Taxa de Fertilização dos protocolos de criopreservação de sêmen de peixes em criotubos.
Volume do Criotubo Motilidade Total1 Taxa de Fertilização2 Espécie Referência
1,0 mL 70,0% 79,0% Odontesthes bonariensis Lichtenstein et al. (2010)
1,5 mL 70,0% 68,8% Dicentrarchus labrax Fauvel et al. (1998)
1,6 mL 77,0% 58,4% Hippoglossus hippoglossus Ding et al. (2011)
4,0 mL 59,0% 50,8%
1,8 mL 70,7% 36,4% Clarias gariepinus Rurangwa et al. (2001)
1,8 mL 73,3% 81,0% Lateolabrax japonicus Ji et. (2004)
1,8 mL 13,3% 34,5% Verasper variegatus Tian et al. (2008)
1,8 mL 10,0%
Não mensurado Tinca tinca Rodina et al. (2007) 13,9%
1,8 mL 71,7% 70,1% Scophthalmus maximus Chen et al. (2004)
2,0 mL 69,0% 56,0% Cyprinus carpio Linhart et al. (2000)
2,0 mL 79,4-88,6% 89,6-95,6% Pagrus major Liu et al. (2006a)
2,0 mL 79,2% 76,2% Paralichthys olivaceus Zhang et al. (2003)
2,0 mL 65,0% 90,5% Pelteobagrus fulvidraco Pan et al. (2008)
Todos os procedimentos de congelação foram feitos com vapor de nitrogênio líquido.*Citação do presente estudo. 1,2 Foram avaliadas após o descongelamento do sêmen criopreservado.
15
Continuação do Quadro 2.
Volume do Criotubo Motilidade Total1 Taxa de Fertilização2 Espécie Referência
2,0 mL 40,5-67,5% 59,0-70,0% Verasper variegates Liu et al. (2006b)
2,0 mL 96,0% 66,0% Siniperca chuatsi Ding et al. (2009)
2,0 mL 5,0-10,0% 2,9-15,0% Pangasius gigas Mongkonpunya et al. (1995)
5,0 mL 5,0-10,0% 65,0-66,0%
1,6 mL* e 47,0% 45,0% Colossoma macropomum Carvalho et al. (2013)*
4,5 mL* 40,0% 41,0% Todos os procedimentos de congelação foram feitos com vapor de nitrogênio líquido.*Citação do presente estudo. 1,2 Foram avaliadas após o descongelamento do sêmen criopreservado.
16
2.3. Velocidade de congelamento e de descongelamento
As crioinjúrias ocasionadas nos espermatozoides, durante os processos de
congelamento e descongelamento, ocorrem devido a diversas condições, tais como:
desidratação, cristalização/recristalização, toxicidade e mudanças na organização dos
fosfolipídios na membrana plasmática (MAZUR, 1984; WATSON, 2000).
Nesse contexto percebe-se a importância de se aperfeiçoar cada vez mais os
processos de congelamento do sêmen a fim de minimizar as crioinjúrias que causam danos
estruturais e funcionais às células, assim como de descongelamento, a fim de garantir as
características morfológicas e fisiológicas dos espermatozoides tendo-se como referência o
sêmen in natura (SAKS, 1978).
No processo de criopreservação a célula até a temperatura de -5ºC não sofre com a
formação de cristais de gelo, uma vez que as moléculas de água intra e extracelular
encontram-se super-refrigeradas. Porém, na faixa de temperatura de -5 a -15ºC ocorre a
formação de cristais de gelo no meio extracelular, causando concentração de soluto e
dando início a desidratação celular, enquanto o meio intracelular permanece super-
refrigerado (MAZUR, 1984; MEDEIROS et al., 2002). A desidratação pode ocasionar a
desnaturação das macromoléculas da célula e o encolhimento da membrana plasmática de
maneira irreversível (MEDEIROS et al., 2002). Segundo Mazur (1984), a faixa de
temperatura intermediária de -15 a -60ºC é mais crítica, pois ocorre a formação de cristais
de gelo extracelular e intracelular. Os cristais de gelo intracelular podem ocasionar dano
mecânico na célula. Duas vezes nessa faixa crítica de temperatura, a primeira durante o
processo de congelamento e a segunda no processo de descongelamento quando há a
recristalização.
A criopreservação provoca danos às membranas celulares, possivelmente
ocasionando mudanças na disposição dos seus componentes. A queda de temperatura
provoca uma mudança nos fosfolipídios da membrana plasmática, que passa da fase de
líquido cristalino para fase de gel, resultando em uma estrutura mais rígida (MEDEIROS et
al., 2002). Durante o processo de rigidez pode ocorrer a migração lateral dos lipídios e o
rearranjo dos componentes da membrana, ocorrendo a formação de microdomínios de
lipídios e a segregação das proteínas dos arranjos hexagonais dos lipídios gelificados.
Depois do descongelamento pode ocorrer um desordenamento na estrutura da membrana,
17
tendo como consequência a alteração da sua permeabilidade em relação à água e ao soluto
(WATSON, 2000).
Quando a velocidade de congelamento se dá lentamente ocorre o aumento da
concentração de soluto no meio, isto é, o ambiente se torna ligeiramente hiperosmótico,
ocasionando o aumento da tensão na membrana plasmática, a desidratação celular e o
influxo de íons (MAZUR, 1984; YANG & TIERSCH, 2009). Entretanto, quando a
velocidade de congelamento é muito rápida, não dá tempo para que ocorra a desidratação
celular adequada, tendo-se como consequência uma maior formação de cristais de gelo
intracelular (YANG & TIERSCH, 2009; CHAO & LIAO, 2001).
A velocidade de descongelamento lenta provoca um demasiado influxo de água,
fazendo com que a célula fique intumescida e sejam alteradas suas propriedades
morfológicas e fisiológicas. Por outro lado, a velocidade de descongelamento rápida
diminui a recristalização da água e o inchaço na célula, reduzindo danos na membrana
plasmática (MAZUR, 1984).
O tipo de congelação é importante no procedimento de criopreservação de sêmen de
peixe, pois pode influenciar na velocidade de congelamento e descongelamento (RODINA
et al., 2007).
Beirão et al. (2011) estudando o sêmen criopreservado de Sparus aurata, se
comparou cinco velocidades de congelamento em palhetas de 0,5 mL e três velocidades de
congelamento em criotubos de 1,8 mL, onde o sêmen congelado em palhetas obteve uma
melhor motilidade espermática em relação aos criotubos. Ao se comparar o sêmen
congelados em criotubos de 1,8 mL em diferentes velocidades, o sêmen congelado na
velocidade mais rápida a 1cm do N2L (-6,6°C/min no intervalo 4 a -20°C e 19,8°C/min no
intervalo de -20 a -100°C) apresentou melhores parâmetros de qualidade espermática. E ao
comparar o sêmen criopreservado nas palhetas 0,5 mL, a palheta congelada na velocidade
de 22,8°C/min e -104°C/min (no intervalo de 4 a -20°C e -20 a -100°C, respectivamente) a
1 cm do N2L obeteve os melhores parâmetros de qualidade espermática.
Rodina et al. (2007) analisando o sêmen criopreservado de Tinca tinca em palhetas
de 0,5, 1 e 5 mL e criotubo de 1,8 mL, os quais foram descongeladas à 40°C durante 8, 20,
35 e 105 segundos, respectivamente. Avaliaram duas curvas de congelamento, uma lenta
que começou de 4 a -9°C com uma velocidade de 4°C/min e de -9°C a -80°C com
velocidade de 11°C/min e uma rápida foi de 4 a -80°C com velocidade de -20°C/min, foi
observado que houve diferença significativa entre os tratamentos, onde geralmente as
18
velocidades espermáticas foram superiores no sêmen criopreservado na velocidade rápida
(-20°C/min).
2.4. Criotubos
Diversas formas de recipientes vêm sendo avaliadas em relação a sua capacidade de
manter a qualidade espermática durante o processo de congelamento e de descongelamento
(CABRITA et al., 2001). Cada recipiente é constituído de diferentes formas e dimensões
(ex.: forma cilindrica com diferentes diâmetros) e materiais (ex.: polipropileno) que podem
produzir diferentes taxas de transferência de calor modificando a velocidade de
congelamento e descongelamento dos espermatozoides (MONGKONPUNYA et al., 1995).
Os diferentes tipos de recipientes utilizados na criopreservação de células
espermáticas devem assegurar a identificação da amostra e a uniformização da velocidade
de congelamento (YANG & TIERSCH, 2009).
As palhetas francesas de 0,5 mL são as mais utilizadas na criopreservação do sêmen
de peixe, pois possuem perda de calor mais uniforme, devido à relação superfície de
contato e tipo (VIVEIROS & GODINHO, 2009). Mas devido a sua pequena capacidade de
armazenar o sêmen criopreservado, se faz necessário um número maior de palhetas para
fertilização de todos os ovócitos de uma desova, principalmente, em espécies de peixes
reofílicos que possuem uma alta fecundidade (MONGKONPUNYA et al., 1995;
VELASCO-SANTAMARÍA et al., 2006).
O criotubo surgiu como alternativa à criopreservação de sêmen de humanos, porém,
o seu uso está difundido para outras espécies de mamíferos e de peixes (TIAN et al., 2008;
LORENZONI et al., 2011).
Essa difusão ocorre, principalmente, pela quantidade maior de sêmen que se pode
armazenar no criotubo, além da facilidade no manuseio durante o envase (KOZINK et al.,
2006).
O congelamento de espermatozoides em criotubos é de grande importância para
produção em grande escala, uma vez que se pode armazenar uma grande quantidade de
sêmen/espermatozoides por dose (DING et al., 2011).
Mongkonpunya et al. (1995), fertilizando ovócitos de Pangasius gigas com sêmen in
natura e criopreservado em criotubo de 5,0 mL, com relação de 4,2 x 106 espermatozoides
19
por ovócito, obteve uma taxa de fertilização de 72% e 65%, respectivamente, onde não
houve diferença significativa.
Fauvel et al. (1998) comparando o sêmen criopreservado de Dicentrarchus labrax
em palheta de 0,25 mL e criotubo de 1,5 mL, constaram que a diferença entre o tipo dos
criotubos pode afetar o congelamento, tendo como consequência a queda da qualidade
espermática e da taxa de fertilização.
Lichtenstein et al. (2010) avaliaram o sêmen criopreservado de Odontesthes
bonariensis em palhetas de 0,25 mL e em criotubos de 1,0 mL, onde não houve diferença
significativa da taxa de fertilização entre os criotubos.
Horváth et al. (2007) compararam a eficiência da criopreservação em palheta de 1,2 e
de 4,5 mL para o sêmen criopreservado de Cyprinus carpio, e observou-se que os ovócitos
fertilizados com sêmen congelados em palhetas de 4,5 mL teve menores taxas de eclosão
em relação as palhetas de 1,2 mL, quando ambas as palhetas foram congeladas durante 3
minutos.
Os diferentes tipos recipientes utilizados no envase de sêmen criopreservado com
taxas de congelamento e descongelamento lentas podem ocasionar baixa qualidade
espermática afetando a taxa de fertilização e de eclosão (CABRITA et al., 2001).
3. REFERENCIAL BIBLIOGRÁFICO
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*Artigo formatado segundo normas da revista Theriogenology
ARTIGO*
Influência do tipo de criotubo e do tempo de descongelamento sobre a qualidade e
fertilidade do sêmen de tambaqui Colossoma macropomum criopreservado.
RESUMO
A criopreservação de sêmen em criotubos reduz o tempo necessário para o envase,
congelamento e descongelamento das amostras, além de otimizar os procedimentos de
fertilização artificial. No entanto, nenhum estudo ainda foi realizado com o sêmen de
tambaqui neste recipiente. Assim, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a influência
do tipo de criotubo (1,6 e 4,5 mL) e do tempo de descongelamento (60ºC/70s e
60ºC/90s) sobre a qualidade e fertilidade do sêmen de tambaqui criopreservado. Para
isso, amostras de sêmen foram diluídas em solução de congelamento (1:9 v/v) composta
por 75% de glicose 290 mOsm, 10% de metilglicol e 5% de gema de ovo, sendo
envasadas em criotubos de 1,6 e 4,5 mL, congeladas em vapor de nitrogênio líquido no
botijão dry-shipper (-175ºC) e armazenadas em botijão criogênico a -196°C. Para
avaliação do tempo de descongelamento do sêmen, os criotubos foram imersas em água
a 60°C durante 70 s ou 90 s e a qualidade espermática imediatamente avaliada
(Motilidade total - MT; Motilidade progressiva - MP; Velocidade curvilinear - VCL;
Velocidade em linha reta - VSL e Velocidade média da trajetória - VAP). Neste estudo
foi determinado também o tempo de viabilidade dos espermatozoides descongelados,
mantidos sob refrigeração a 5°C e avaliados durante 24 horas. Além dos parâmetros de
cinética espermática foram avaliadas a morfologia e a integridade da membrana
plasmática dos espermatozoides. A capacidade de fertilização do sêmen foi avaliada a
partir das amostras descongeladas no melhor tempo. Todos os parâmetros de cinética
espermática apresentaram valores superiores quando as amostras de sêmen foram
descongeladas por 90s em relação ao tempo de 70s, independentemente do tipo de
criotubo. Não foram observadas diferenças significativas nos parâmetros de cinética
espermática pós-descongelamento entre as amostras congeladas nos criotubos de 1,6 e
4,5 mL, com exceção da MT que foi superior nos criotubos de 1,6 mL (47±14%) em
comparação com os criotubos de 4,5 mL (40±11%), independentemente do tempo de
descongelamento. Após ativação, os espermatozoides reduziram significativamente os
2
valores dos parâmetros de cinética dentro de 37 segundos, exceto a MT que se manteve
constante neste período. Baseando-se na maior parte dos parâmetros espermáticos
avaliados (VCL, VSL, VAP e Integridade da membrana plásmatica para ambos os
criotubos e MT, MP e Morfologia espermática somente para o criotubo de 1,6 mL) o
sêmen congelado manteve sua qualidade durante 3h após o descongelamento. A taxa de
fertilização obtida com o sêmen in natura (74±6%) foi superior ao sêmen
criopreservado (1,6 mL - 45±9% e 4,5 mL - 41±12%). Os dois criotubos não diferiram
entre si neste parâmetro. Uma alta correlação significativa (p<0,05) foi observada entre
a fertilização e a cinética espermática (MT - 89%; MP - 86%; VCL - 79%; VSL - 69% e
VAP - 78%). Conclui-se que os criotubos de 1,6 e 4,5 mL podem ser utilizados na
criopreservação do sêmen de tambaqui, sendo recomendado seu descongelamento a
60°C por 90s e seu uso em procedimentos de fertilização dentro de 3 horas após o
descongelamento desde que mantido a 5°C.
Palavras-chave: Peixe; Cinética espermática; Criopreservação; Fertilização.
1. Introdução
O tambaqui Colossoma macropomum (Cuvier, 1818), é um peixe oriundo da bacia do
rio Amazonas [1]. Sua produção vem aumentando gradativamente ao longo dos últimos
anos, sendo o peixe nativo mais produzido pelas pisciculturas, perdendo apenas para
tilápia e carpa que são espécies exóticas [2].
Nos últimos anos, o tambaqui vem sendo alvo de diversos estudos relacionados à
reprodução, como ciclo reprodutivo [1], indução hormonal [3], caracterização
espermática [4,5] e criopreservação de sêmen [6]. A criopreservação é uma técnica que
visa à conservação de material biológico em nitrogênio líquido a -196ºC. Nesta
temperatura a estrutura e funcionalidade das células são mantidas, conservando-as
geneticamente viáveis e reversivelmente inativas do ponto de vista metabólico [7,8].
3
A criopreservação de sêmen de peixes é um campo novo em que pouco progresso
prático, em nível comercial, foi alcançado no Brasil [9]. Durante os últimos anos várias
espécies já tiveram seu protocolo de criopreservação determinado. Na maioria dos
estudos apenas palhetas francesas de 0,5 mL têm sido utilizadas [6,10]. No entanto, o
uso deste recipiente apresenta algumas limitações quanto à sua utilização na produção
de alevinos em larga escala. Espécies migradoras, como tambaqui, apresentam alta
fecundidade podendo alcançar mais de um milhão de ovócitos por desova [11],
requerendo maior número de espermatozoides e consequentemente de palhetas para
fertilização, o que torna o procedimento pouco prático. A criopreservação em
recipientes com maior capacidade de armazenamento pode diminui custos e espaço para
o acondicionamento das amostras no botijão criogênico, além de otimizar os
procedimentos de congelamento e de descongelamento do sêmen para fertilização
artificial, facilitando a manipulação durante os processos [12].
Vários recipientes são encontrados no mercado e podem ser utilizados na
criopreservação de células espermáticas, entre eles, macropalhetas, criotubos, sacos e
tubos plásticos com capacidade de armazenamento variada (1 a 5 mL). Estes
recipientes, no entanto, são pouco estudados em peixes. O desenvolvimento de novos
recipientes pode facilitar a utilização em campo do sêmen congelado, evitando o uso de
um número muito grande de palhetas e mantendo preservadas as características
espermáticas durante o congelamento e descongelamento [13]. Como características
adequadas, os recipientes devem propiciar velocidades de congelamento e
descongelamento uniformes [14], sendo sugerido neste sentido que estes tenham uma
maior relação superfície/volume [13].
4
Várias pesquisas relatam o uso de sêmen em criotubos para otimização da fertilização
de peixes [15,16]. Os criotubos possuem diversas vantagens, tais como: simples envase
e identificação, higiene, segurança e aceitação no meio científico [17]. Assim, a
utilização destes recipientes na criopreservação de sêmen de peixes abre novas
perspectivas para o aumento da produção de alevinos nas pisciculturas.
Entretanto, como o recipiente de envase influencia as taxas de congelamento e
descongelamento [12,18], estudos são necessários para a adequação ou
desenvolvimento de protocolos específicos para cada tipo de criotubo utilizado.
A fim de diminuir os danos espermáticos especialmente devido ao processo de
recristalização, para cada tipo de recipiente de armazenamento do sêmen congelado,
torna-se importante utilizar o protocolo de descongelamento adequado determinando-se,
por exemplo, os procedimentos, temperaturas e as velocidades de reaquecimento
[12,16].
O objetivo do presente estudo foi avaliar a influência do tipo de criotubo e do tempo de
descongelamento na qualidade e fertilidade do sêmen criopreservado de tambaqui.
2. Material e Métodos
2.1. Seleção dos reprodutores, coleta e avaliação inicial do sêmen
Todos os animais utilizados nesse estudo foram manuseados de acordo com as diretrizes
para experimentação animal [19]. Foram utilizadas amostras seminais de machos
sexualmente maduros de tambaqui Colossoma macropomum, provenientes da
Piscicultura Santa Clara localizada no município de Propriá, Sergipe.
5
Os dados das características corporais e do sêmen in natura de todos os machos
utilizados nesse estudo estão apresentados na tabela 1.
Tabela 1. Características corporais e do sêmen in natura de machos de tambaqui Colossoma macropomum (n=16).
Características Média ± DP*
Variação (min – max)
Coeficiente de Variação (%)
Peso corporal (kg) 6 ± 1 5 – 8 14 Comprimento (cm) 68 ± 4 59 – 74 6 Volume de sêmen (mL) 7 ± 3 3 – 11 40 Concentração (espermatozoides x 109 mL-1) 9 ± 3 5 – 16 38 Motilidade subjetiva (%) 83 ± 5 80 – 90 6
*DP – Desvio Padrão
Os animais que liberaram sêmen em resposta à leve pressão abdominal foram
selecionados para indução hormonal e transportados para tanques de concreto com fluxo
constante de água à temperatura de 27°C. O processo de indução hormonal se deu com
a aplicação de uma dose intramuscular de 2 mg de extrato bruto de hipófise de carpa
Cyprinus carpio por quilo de peso corporal. Aproximadamente 10 horas após a indução
hormonal o sêmen de cada macho foi coletado em tubos de ensaio por massagem
abdominal, tendo-se o cuidado de enxugar a papila urogenital antes da coleta. Uma
alíquota de 2 µL de cada amostra foi colocada sobre uma lâmina e observada sob um
microscópio de luz (Nikon Eclipse E100®, Melville, New York, EUA) na magnitude de
400 x.
Como os espermatozoides de peixes devem permanecer imóveis no plasma seminal,
qualquer motilidade observada foi atribuída à contaminação das amostras por urina ou
água, sendo estas descartadas. Para as amostras que continham espermatozoides
imóveis, a motilidade espermática, expressa em porcentagem de células móveis, foi
estimada subjetivamente imediatamente após a adição de 30 µL de bicarbonato de sódio
6
230 mOsm [6]. Amostras com motilidade superior ou igual a 80% foram utilizadas nos
procedimentos subsequentes. Para cada amostra de sêmen selecionada foram
determinados o volume e a concentração espermática, mensurados diretamente em
tubos graduados e em câmara de Neubauer, respectivamente. Os parâmetros de
qualidade seminal foram avaliados à temperatura ambiente sempre pelo mesmo
avaliador.
2.2. Criopreservação do sêmen
Após a coleta e avaliação inicial, o sêmen foi diluído em solução de congelamento
(composta por 75% de glicose 290 mOsm, 10% de metilglicol e 5% de gema de ovo),
na proporção de 1:9 [6]. Após a diluição, as amostras foram imediatamente envasadas
em criotubos onde permaneceram por 20 minutos (tempo de equilíbrio), em temperatura
ambiente (25°C), antes de serem congeladas por meio da exposição ao vapor de
nitrogênio líquido (N2L) a -175°C em botijão dry-shipper (MVE SC4/2V, GA, EUA).
As amostras de sêmen armazenadas foram transportadas da Piscicultura para o
Laboratório de Biotecnologia da Reprodução Animal (LABRA) da Embrapa Tabuleiros
Costeiros e transferidas após 24 horas para o botijão criogênico (MVE VOLTA 34, GA,
EUA) contendo N2L (-196ºC), onde permaneceram por 6 meses até serem avaliadas.
2.3. Experimento 1: Avaliação do tipo de criotubo e tempo de descongelamento do
sêmen
7
As amostras de sêmen diluído na solução de congelamento foram envasadas em
criotubos de 1,6 mL (Sarstedt Cryopure®, Nümbrecht, Alemanha - fabricado em
polipropileno; tamanho 12 x 47 mm) e 4,5 mL (Sarstedt Cryopure®, Nümbrecht,
Alemanha - fabricado em polipropileno; tamanho 12 x 90 mm), congeladas conforme
metodologia descrita no subitem 2.2 e descongeladas em banho de água a 60°C durante
70s ou 90s. Após o descongelamento, as amostras de sêmen encontravam-se no estado
líquido, e os parâmetros de cinética espermática foram imediatamente avaliados.
A combinação de dois tipos de criotubos e dois tempos de descongelamento,
determinou a formação de quatro grupos experimentais.
2.3.1. Avaliação da cinética espermática
Foi realizada a análise da cinética dos espermatozoides no sêmen congelado de cinco
machos, descongelando-se duas doses de cada grupo experimental. Imediatamente após
o descongelamento 4 µL de sêmen foram adicionados a um recipiente plástico de 1,5
mL e ativado com 50 µL de solução de bicarbonato de sódio 230 mOsm. Imediatamente
após a ativação, 3 µL de sêmen foram transferidos para uma câmara Makler®
(profundidade 10µm) previamente posicionada no “charriot” de um microscópio com
contraste de fase (Nikon Eclipse 50i®, Japão: magnitude de 100 x; filtro verde; posição
pH1). O microscópio foi ligado a uma câmara de vídeo (Basler Vision Technologies®
602FC, Ahrensburg, Alemanha) configurada em 100 quadros s-1, sendo a gravação
iniciada 10 segundos pós-ativação. As imagens foram analisadas usando-se uma
configuração específica do software Sperm Class Analyzer® (SCA®, Microptics, Versão
5.1 SL, Barcelona, Espanha) adaptada para o sêmen de tambaqui. Os parâmetros de
8
cinética espermática avaliados foram: motilidade total (MT); motilidade progressiva
(MP); velocidade curvilinear (VCL); velocidade em linha reta (VSL) e velocidade
média da trajetória (VAP). Para a determinação e avaliação do comportamento da
cinética ao longo do tempo de ativação, foram analisados aproximadamente 300
espermatozoides/campo.
2.3.2. Determinação das velocidades de congelamento e descongelamento
Para determinação da velocidade de congelamento os criotubos de 1,6 e 4,5 mL (n=3
repetições) foram equipados com sensores de temperatura (termômetro digital - BK
Precision 710®, Yorda Linda, Califórnia, EUA) e inseridos dentro do botijão dry
shipper. A curva de congelamento foi gerada pelo software ThermoLink® (Yorda
Linda, Califórnia, EUA) registrando-se a temperatura em intervalos de cinco segundos a
partir de 25°C (temperatura ambiente) até -166ºC (temperatura de estabilização das
amostras congeladas) (Figura 1). Após este procedimento as amostras foram
transferidas para botijão criogênico onde alcançaram a temparatura de -189ºC.
9
-175
-150
-125
-100
-75
-50
-25
0
25
0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0
Tem
pera
tura
( C
)
Tempo (min)
1,6 mL
4,5 mL
Figura 1. Curvas de congelamento do sêmen de Colossoma macropomum envasado em criotubos de 1,6 e 4,5 mL e congelados em vapor de nitrogênio líquido, no botijão dry-shipper, durante 20 minutos.
A partir das curvas geradas, as velocidades de congelamento foram calculadas dentro
dos seguintes intervalos: 25°C a 0°C, 0°C a -20°C, -20°C a -80°C, -80ºC a -166°C e
25°C a -166°C (Tabela 2).
Tabela 2. Velocidade de congelamento (°C/min) do sêmen de Colossoma macropomum envasado em criotubos de 1,6 e 4,5 mL, e congelados sob vapor de nitrogênio líquido em botijão dry-shipper.
Criotubos Intervalos de Temperatura de Congelamento (ºC)
25 a 0 0 a -20 -20 a -80 -80 a -166 25 a -166
1,6 mL -20,0 -11,9 -27,7 -6,2 -9,6
4,5 mL -23,6 -7,9 -24,0 -5,8 -9,0
10
Para determinação das curvas de descongelamento, foi realizado o mesmo procedimento
adotado para as curvas de congelamento, tendo sido utilizado três doses de sêmen
congelado para cada um dos quatro grupos experimentais. As doses de sêmen foram
descongeladas em banho de água a 60°C durante 70 e 90s. A curva de descongelamento
foi gerada registrando-se a temperatura em intervalos de cinco segundos a partir de -
189°C (temperatura de estabilização das amostras no botijão criogênico).
A partir dos dados gerados, as velocidades de descongelamento foram calculadas dentro
dos seguintes intervalos: -189°C a -80°C, -80°C a -20°C, -20°C a -2,3°C e -2,3°C a
2,9°C (Tabela 3).
Tabela 3. Velocidade de descongelamento de sêmen de Colossoma macropomum criopreservado em criotubos de 1,6 e 4,5 mL, e descongelados em banho de água a 60°C durante 70 ou 90s.
2.4. Experimento 2: Fertilidade do sêmen congelado em diferentes criotubos e sua
correlação com os parâmetros de cinética espermática
Para realização deste experimento, amostras de sêmen de cinco machos foram colhidas
separadamente, e congeladas nos criotubos de 1,6 e 4,5 mL, conforme metodologia
descrita nos subitens 2.1 e 2.2.
Criotubos Tempo (s) Intervalos de Descongelamento (ºC)
-189 a -80 -80 a -20 -20 a -2,3 -2,3 a 2,9
1,6 mL 70 476,8 164,2 33,3 -
90 475,4 165,4 31,0 15,0
4,5 mL 70 474,6 165,6 33.2 -
90 474,0 165,7 30,5 16,2
11
Para avaliar a capacidade de fertilização do sêmen criopreservado, uma fêmea foi
selecionada e submetida ao processo de indução hormonal da desova por meio da
aplicação de duas injeções intramusculares de extrato de hipófise de Cyprinus carpio
(0,5 mg e 5,0 mg por quilo de peso corporal) com intervalo de 12h entre as aplicações.
Os ovócitos foram retirados por massagem abdominal, dez horas após a segunda
aplicação, e armazenados em recipiente plástico. Amostras de 0,5 g (600 ovócitos)
foram retiradas (n=10 por tratamento) e o sêmen in natura (controle) e o descongelado
nos criotubos de 1,6 e 4,5 mL (60°C durante 90s) foram adicionados na proporção de
2,5 x 105 espermatozoides por ovócito. A fertilização foi iniciada após a adição de 5 mL
de bicarbonato de sódio 230 mOsm, sendo homogeneizada durante dois minutos. Após
este período os ovos foram transferidos para incubadoras cilíndricas de PVC com fundo
telado (15 cm de altura x 10 cm de diâmetro; volume útil aproximado de 1 L) acopladas
a um sistema de fluxo contínuo de água. A taxa de fertilização foi determinada após 8 h
da fertilização por meio de um estereomicroscópio (ZEISS STEMI 2000-2, Alemanha),
e expressa em porcentagem de ovos fertilizados (fechamento de blastóporo) sobre o
número total de ovos.
Paralelamente, os parâmetros de cinética espermática do sêmen in natura e
descongelado foram avaliados, conforme metodologia descrita no subitem 2.3.1. Os
resultados da fertilização foram posteriormente correlacionados com os parâmetros de
cinética espermática.
2.5. Experimento 3: Duração da cinética espermática pós-ativação do sêmen
congelado em diferentes criotubos
12
Para a avaliação da duração e do comportamento da cinética espermática após a
ativação, amostras de sêmen de 10 machos foram congeladas em criotubos (1,6 e 5,0
mL) e descongeladas em banho de água a 60 ºC durante 90 segundos. As amostras
foram ativadas com bicarbonato de sódio 230 mOsm e avaliadas em duplicata quanto à
queda dos parâmetros de cinética espermática conforme metodologia descrita no item
2.3.1. A leitura foi iniciada 10 segundos pós-ativação até 37 segundos a temperatura
ambiente. Para isso, o software SCA® foi previamente programado para realizar
avaliações a cada três segundos.
2.6. Experimento 4: Viabilidade dos espermatozoides descongelados mantidos sob
refrigeração
Para a avaliação dos espermatozoides mantidos sob refrigeração após o
descongelamento, amostras de sêmen de cinco machos foram congeladas em criotubos
(1,6 e 5,0 mL) e descongeladas em água a 60ºC durante 90 segundos. Após o
descongelamento as doses de sêmen foram armazenadas em microtubos cônicos de 1,5
mL e em seguida, conservadas em refrigerador a temperatura média de 5°C (4 a 6 °C)
sendo avaliadas no tempo zero (imediatamente após o descongelamento, antes da
refrigeração) e às 3, 6, 9, 12 e 24 horas pós-descongelamento já sob efeito da
refrigeração.
As amostras foram avaliadas quanto à cinética, morfologia e viabilidade espermática em
duplicata para cada tipo de criotubo.
Os parâmetros de cinética espermática foram analisados de acordo com metodologia
descrita no item 2.3.1. Para avaliação da morfologia espermática uma alíquota do sêmen
13
descongelado de cada um dos cinco machos foram fixadas em solução de formol-citrato
na proporção de 1:1000. Posteriormente foram realizados os esfregaços com corante
rosa bengala na proporção 1:30 (sêmen fixado:corante). Após a secagem, as lâminas
foram avaliadas em microscópio óptico (1000x com óleo de imersão) para a avaliação
de 200 células, sendo utilizada a seguinte classificação de anormalidades espermáticas:
Cabeça - macrocefalia, microcefalia, degenerada e isolada, e; Cauda - fraturada,
enrolada, curta e dobrada [4]. Os dados foram apresentados em porcentagem de células
morfologicamente normais.
Para avaliação da viabilidade espermática foi considerada a integridade da membrana
plasmática dos espermatozoides. Amostras de sêmen foram incubadas com os
fluorocromos iodeto de propídio e SYBR-14 (kit live/dead; Molecular Probes®, Oregon,
EUA) durante 10 minutos antes da análise em microscópio de fluorescência (Nikon
Eclipse 50i®, Japão: magnitude de 1000 x). Os espermatozoides que apresentaram
membrana plasmática íntegra (emissão de fluorescência verde na cabeça) foram
classificados como viáveis, e aqueles com membrana plasmática lesada (emissão de
fluorescência vermelha na cabeça) como não viáveis.
2.7. Análise estatística
A análise estatística foi realizada pelo programa SISVAR [20]. Os dados foram
comparados pela análise de variância (ANOVA) e apresentados como média ± desvio
padrão (DP). Para avaliação da normalidade dos dados utilizou-se o teste de Shapiro-
Wilk. Os dados que não apresentaram distribuição normal foram transformados pelo
arcseno da raiz de x. Quando a diferença foi significativa, o teste de Scott-Knott foi
14
utilizado para a comparação entre as médias. A relação entre cinética espermática (MT,
MP, VCL, VSL e VAP) e sua duração pós-ativação foi investigada por meio de análise
de regressão. Para a análise de correlação entre os parâmetros de cinética espermática e
a taxa de fertilização foi utilizado o teste de Pearson. O nível de significância utilizado
nos testes foi de 5%.
3. Resultados
3.1. Experimento 1: Avaliação do tipo de criotubo e tempo de descongelamento do
sêmen
A velocidade média de descongelamento do sêmen nos criotubos foi de 160°C/min no
tempo de imersão de 70s (entre -189°C e -2,3°C) e de 128,3°C/min no tempo de 90s
(entre -189°C e 2,9°C).
3.1.1. Avaliação da cinética espermática
Não houve interação significativa entre o tipo do criotubo e os tempos de
descongelamento (p>0,05) para todos os parâmetros de cinética espermática avaliados,
sendo os valores apresentados na Tabela 4.
O sêmen criopreservado em criotubos de 1,6 mL apresentou maior motilidade total em
relação ao de 4,5 mL, independentemente do tempo de descongelamento utilizado. O
mesmo comportamento não foi observado para os parâmetros de motilidade progressiva
e velocidades espermáticas (VCL, VSL e VAP) não sendo detectadas diferenças
15
significativas (p>0,05) entre os dois tipos de criotubos testados. O sêmen descongelado
a 60°C durante 90 s apresentou qualidade espermática significativamente superior
(p<0,05) ao descongelado durante 70 s em todos os parâmetros avaliados,
independentemente do tipo do criotubo utilizado.
Tabela 4. Parâmetros de cinética espermática do sêmen criopreservado de tambaqui em criotubos de 1,6 e 4,5 mL e descongelados a 60°C por 70 ou 90 segundos (n=5).
Parâmetros Criotubos
(mL) Tempo de descongelamento a 60ºC
70 s 90 s Média
MT (%) 1,6 43 ± 17 51 ± 9 47 ± 14A 4,5 36 ± 8 43 ± 10 40 ± 11B
Média 40 ± 13b 48 ± 12a
MP (%) 1,6 9 ± 15 17 ± 7 13 ± 8A 4,5 8 ± 6 15 ± 5 12 ± 7A
Média 8 ± 6b 16 ± 6a
VCL (µm/s) 1,6 62 ± 22 91 ± 14 77 ± 20A 4,5 59 ± 11 83 ± 12 71 ±17A
Média 61 ± 13b 87 ± 13a
VSL (µm/s) 1,6 28 ± 18 58 ± 16 43 ± 20A 4,5 27 ± 15 55 ± 13 41 ± 19A
Média 28 ± 12b 57 ± 14a
VAP (µm/s) 1,6 42 ± 23 80 ± 16 61 ± 24A 4,5 39 ± 14 71 ± 14 55 ± 21A
Média 41 ± 14b 75 ± 15a
A-B a-b Médias seguidas por letras distintas (maiúsculas na coluna e minúsculas nas linhas) diferem entre si pelo teste de Skott-knott (p<0.05). MT – Motilidade Total, MP – Motilidade Progressiva, VCL – Velocidade Curvilinear, VSL – Velocidade em Linha Reta e VAP – Velocidade Média da Trajetória.
Para o descongelamento do sêmen criopreservado nos experimentos 2, 3 e 4 foi
utilizado o tempo de 90 s em banho de água a 60°C, pois os parâmetros da cinética
espermática neste tempo foram superiores em relação ao de 70 s.
16
3.2. Experimento 2: Fertilidade do sêmen congelado em diferentes criotubos e sua correlação com os parâmetros de cinética espermática
Todos os parâmetros do sêmen in natura apresentaram valores significativamente
superiores (p<0,05) ao do sêmen criopreservado nos criotubos (Tabela 5). O tipo de
criotubo não alterou significativamente a cinética espermática e taxa de fertilização pós-
descongelamento, com exceção da motilidade total que foi maior (p<0,05) para o sêmen
criopreservado em criotubo de 1,6 mL em relação ao de 4,5 mL.
Tabela 5. Parâmetros de cinética espermática do sêmen de tambaqui in natura e criopreservado em criotubos de 1,6 e 4,5 mL, que foram utilizados na fertilização (n=5).
Parâmetros Sêmen in natura Sêmen congelado
Criotubos 1,6 mL Criotubos 4,5 mL MT (%) 95 3a 46 4b 36 3c MP (%) 67 14a 15 6b 11 5b
VCL (µm/s) 109 21a 76 14b 67 13b VSL (µm/s) 73 15a 49 17b 40 16b VAP (µm/s) 97 20a 62 17b 51 17b
Taxa de Fertilização (%) 74 6a 45 9b 41 12b a,b Médias seguidas por diferentes letras na mesma linha, diferem entre si pelo teste de Scott-Knott (p<0,05). MT – Motilidade Total, MP – Motilidade Progressiva, VCL – Velocidade Curvilinear, VSL – Velocidade em Linha Reta e VAP – Velocidade Média da Trajetória.
Uma alta correlação positiva (p<0,05) foi observada entre a cinética espermática (MT,
MP, VCL, VSL e VAP) e a taxa de fertilização (Tabela 6).
Tabela 6. Correlação entre os parâmetros de cinética espermática e a taxa de fertilização obtida com sêmen de tambaqui in natura e criopreservado (n = 5 machos e 1 fêmea) .
MT MP VCL VSL VAP
MP 0.96* VCL 0.83* 0.91* VSL 0.74* 0.84* 0.95* VAP 0.82* 0.90* 0.99* 0.97* Fertilização 0.89* 0.86* 0.79* 0.69* 0.78* *Correlação significativa entre os parâmetros (p<0,05). MT – Motilidade Total, MP – Motilidade Progressiva, VCL – Velocidade Curvilinear, VSL – Velocidade em Linha Reta e VAP – Velocidade Média da Trajetória.
17
3.3. Experimento 3: Duração da cinética espermática pós-ativação no sêmen
congelado em diferentes criotubos
Em ambos criotubos não houve redução significativa (p>0,05) da motilidade total dos
espermatozoides durante o período 37s após a ativação (Figura 2A).
Houve uma queda significativa (p<0,05) na motilidade progressiva a partir de 31s e 28s
pós-ativação dos espermatozoides das amostras de sêmen congeladas em criotubos de
1,6 e 4,5 mL, respectivamente (Figura 2B).
18
0
20
40
60
80
100
0 10 20 30 40
Mot
ilida
de T
otal
(%)
Tempo (s)
1,6 mL 4,5 mL
A
*
*
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 10 20 30 40
Mot
ilida
de P
rogr
essi
va (
%)
Tempo (s)
1,6 mL 4,5 mL
B
Figura 2. Duração da Motilidade Total – MT (A) e Motilidade Progressiva – MP (B) dos espermatozoides de tambaqui criopreservados em criotubos de 1,6 e 4,5 mL. A partir do asterisco houve redução significativa. MP - Criotubo 1,6 mL - y = 0,0001x3 – 0,0494x2 + 1,3296x + 16,989 (R² = 0,9936). Criotubo 4,5 mL - y = 0,0011x3 – 0,0811x2 + 1,209x + 13,363 (R² = 0,9936). As velocidades espermáticas reduziram significativamente com o passar do tempo após
ativação. A redução das velocidades espermáticas pós-descongelamento iniciou de
19
forma mais rápida nas amostras congeladas nos criotubos de 4,5 mL em relação àquelas
congeladas nos criotubos de 1,6 mL.
A velocidade curvilinear e a velocidade média da trajetória dos espermatozoides de
tambaqui criopreservados em criotubos de 1,6 e 4,5 mL tiveram uma queda significativa
(p<0,05) a partir de 19 e 16 s pós-ativação, respectivamente (Figuras 3A e 3C). Para a
velocidade em linha reta a queda foi significativa (p<0,05) a partir de 22 e 19 s,
respectivamente (Figura 3B).
*
*
0
20
40
60
80
100
120
140
160
0 10 20 30 40
VC
L (µ
m/s
)
Tempo (s)
1,6 mL 4,5 mL
A
20
**
0
20
40
60
80
100
120
140
160
0 10 20 30 40
VSL
(µ
m/s
)
Tempo (s)
1,6 mL 4,5 mL
B
*
*
0
20
40
60
80
100
120
140
160
0 10 20 30 40
VA
P (µ
m/s
)
Tempo (s)
1,6 mL 4,5 mL
C
Figura 3. Duração da Velocidade Curvilinear – VCL (A), Velocidade em Linha Reta – VSL (B) e Velocidade Média da Trajetória – VAP (C) dos espermatozoides de tambaqui criopreservados em criotubos de 1,6 e 4,5 mL. A partir do asterisco houve redução significativa. VCL - Criotubo 1,6 mL - y = 0,0036x3 – 0,2505x2 + 3,7126x + 82,208 (R² = 0,9965). Criotubo 4,5 mL - y = 0,0023x3 – 0,1285x2 + 0,5488x + 88,917 (R² = 0,9885); VSL - Criotubo 1,6 mL - y = 0,0046x3 - 0,3395x2 + 5,5462x + 42,79 (R² = 0,9993). Criotubo 4,5 mL - VSL: y = 0,0036x3 - 0,2285x2 + 2,4807x + 52,357 (R² = 0,9935); Criotubo 1,6 mL - y = 0,0052x3 - 0,3667x2 + 5,6387x + 62,291 (R² = 0,9987). Criotubo 5.0 mL - y = 0,004x3 - 0,2493x2 + 2,5376x + 67,227 (R² = 0,9931).
21
3.4. Experimento 4: Viabilidade dos espermatozoides descongelados mantidos sob
refrigeração
Houve interação significativa (p<0,05) entre o tipo do criotubo e o tempo de
armazenamento do sêmen descongelado de tambaqui. Três horas após o
descongelamento do sêmen foi observada redução significativa (p<0,05) na motilidade
espermática total e progressiva das amostras congeladas nos criotubos de 4,5 mL em
relação aos criotubos de 1,6 mL. Por outro lado, a velocidade espermática (VCL, VSL e
VAP) apresentou redução significativa somente a partir de 6 horas pós-
descongelamento.
Em geral foi detectada redução contínua e significativa (p<0,05) nas porcentagens de
espermatozoides morfologicamente normais a partir de 3h pós-descongelamento até o
final do período experimental. Na maioria das vezes foram registrados valores
significativamente superiores (p<0,05) para o sêmen armazenado nos criotubos de 1,6
mL em relação ao de 4,5 mL a exceção da avaliação de 24 h cujos valores foram
estatisticamente semelhantes. A porcentagem de espermatozoides com membrana
plasmática íntegra se manteve inalterada durante o armazenamento por até 12 horas no
sêmen congelado/descongelado em criotubos de 1,6 mL e 9 horas naquele em criotubos
de 4,5 mL.
22
Tabela 7. Parâmetros de cinética (MT, MP, VCL, VSL e VAP), morfologia (espermatozoides normais) e integridade da membrana plasmática dos espermatozoides de tambaqui criopreservados em criotubos de 1,6 e 4,5 mL e avaliados durante 24 horas pós-descongelamento sob condições de refrigeração a 5°C (n=5).
a,b; A,B Médias seguidas por letras minúsculas nas linhas e maiúsculas nas colunas distintas dentro de um mesmo parâmetro, diferem entre si pelo teste de Scott-Knott (p<0,05). MT – Motilidade Total, MP – Motilidade Progressiva, VCL – Velocidade Curvilinear, VSL – Velocidade em Linha Reta e VAP – Velocidade Média da Trajetória.
Parâmetro Criotubo
(mL) Tempo de refrigeração a 5°C pós-descongelamento (horas)
0 3 6 9 12 24
MT (%) 1,6 51 9 Aa 47 11 Aa 40 9 Ab 34 9 Ac 31 8 Ac 16 3 Ad 4,5 43 10 Ba 34 8 Bb 29 5 Bc 24 6 Bd 19 5 Be 12 4 Af
MP (%) 1,6 17 7 Aa 15 7 Aa 13 6 Ab 7 3 Ac 8 4 Ac 1 1 Ad 4,5 15 5 Aa 11 5 Bb 8 2 Bc 6 3 Ac 4 3 Bd 0 0 Ae
VCL (µm/s) 1,6 91 14 Aa 89 14 Aa 80 16 Aa 64 10 Ab 68 13 Ab 35 8 Ac 4,5 83 12 Aa 76 15 Ba 66 8 Bb 62 14 Ab 54 12 Bc 31 4 Ad
VSL (µm/s) 1,6 58 16 Aa 59 17 Aa 53 17 Aa 37 11 Ab 42 14 Ab 8 6 Ac 4,5 55 13 Aa 51 14 Ba 42 9 Bb 37 14 Ab 26 10 Bc 5 3 Ad
VAP (µm/s) 1,6 80 16 Aa 78 16 Aa 67 17 Ab 49 12 Ac 54 15 Ac 15 8 Ad 4,5 71 14 Aa 64 16 Ba 53 9 Bb 48 15 Ab 36 11 Bc 12 4 Ad
Espermatozoides Normais (%)
1,6 34 11Aa 23 11Ab 18 10Ac 15 7Ac 17 9Ac 8 5Ad
4,5 35 5 Aa 16 5 Bb 11 5Bc 9 3 Bc 6 3 Bd 3 2 Ad
Integridade da Membrana Plasmática
(%)
1,6 54 11Aa 50 18Aa 50 17Aa 45 16Aa 47 16Aa 40 12Ab
4,5 53 8 Aa 49 5 Aa 49 8 Aa 49 4Aa 41 4Bb 33 6Bc
23
4. Discussão
Este é o primeiro estudo sobre a criopreservação do sêmen de Colossoma macropomum
utilizando-se criotubos. O uso de criotubos para envase do sêmen criopreservado do
Colossoma macropomum tem o intuito de facilitar a fertilização artificial de um grande
número de ovócitos, propiciando a produção desta espécie pelas pisciculturas. Estudos
sobre criopreservação do sêmen de outras espécies de peixes, tais como: Dicentrarchus
labrax [21]; Cyprinus carpio [22]; Tinca tinca [23]; Siniperca chuatsi [24] e
Odontesthes bonariensis [25], constataram que o criotubo mantém a qualidade seminal
adequada com taxa de fertilização aceitável. Esses estudos também justificam o uso de
criotubos por tornar o processo de fertilização mais ágil e produtivo. A qualidade
seminal e a taxa de fertilização do Colossoma macropomum, observadas neste estudo,
foram melhores para o sêmen in natura, mas os criotubos apresentaram valores
aceitáveis em todos os parâmetros analisados.
O tipo de recipiente de envase e o volume de sêmen criopreservado pode influenciar a
velocidade de congelamento, promovendo alterações na qualidade espermática [12, 23,
26]. No presente estudo, os parâmetros de cinética espermática e fertilidade do sêmen
de Colossoma macropomum congelado em criotubos de 1,6 e 4,5 mL tiveram uma
redução de 20 a 30%, em relação a estudos anteriores com sêmen desta mesma espécie
congelado em palhetas de 0,5 mL [6,27]. Nestes estudos foram utilizados os mesmos
protocolos de congelamento e a mesma proporção espermatozoides:ovócito na
fertilização artificial. Provavelmente, esta diferença na qualidade espermática,
observada entre estes dois estudos, deve estar relacionada à velocidade de congelamento
imprimida nos recipientes. O congelamento das palhetas em botijão dry shipper
24
proporcionou uma velocidade cerca de quatro vezes maior (-40ºC/min) [6,27] do que as
observadas no congelamento de criotubos (-9ºC/min e -9,6ºC/min). Richardson et al.
[26], compararam a eficiência de volumes de palhetas na criopreservação do sêmen de
Salvelino alpinus e constataram que as amostras congeladas em macropalhetas de 2,5
mL promovem menores taxas de fertilização do que as amostras armazenadas em
palhetas planas de 1,7 mL devido à lenta velocidade de congelamento do sêmen contido
nas macropalhetas (-20 a -34ºC/min) em relação às palhetas planas (-33 a -46ºC/min).
Nesse estudo, o intervalo de temperatura o qual a velocidade de congelamento foi
determinada foi de -15ºC a -60ºC. Neste intervalo, as velocidades de congelamento das
macropalhetas foram semelhantes àquelas observadas para os criotubos do presente
estudo (-22 a -26ºC/min).
Estudos com várias outras espécies demonstraram que o potencial efeito negativo de
grandes volumes de sêmen no congelamento pode ser reduzido pelo uso de uma
velocidade de congelamento rápida [13,28,29]. As velocidades que mais têm sido
empregadas com sucesso, na criopreservação de sêmen de peixes em criotubos estão
entre -11°C/min e -34°C/min [22,23,30], um pouco superiores ao utilizado neste estudo.
Assim, faz-se necessário o desenvolvimento de novos protocolos de congelamento de
sêmen de Colossoma macropomum em criotubos com o objetivo de promover maiores
velocidades de congelamento, buscando melhorias na qualidade e fertilidade pós-
descongelamento.
Neste estudo, o volume de sêmen congelado não afetou significativamente a maioria
dos parâmetros de cinética espermática avaliados, exceto a motilidade total e a duração
do movimento espermático pós-ativação que foi superior nas amostras de sêmen
congeladas no menor volume. Os espermatozoides de Colossoma macropomum
25
congelados em criotubo de 1,6 mL mantém por mais tempo a sua velocidade máxima e
progressividade após a ativação, em relação aos espermatozoides congelados em
criotubos de 4,5 mL. Apesar da diferença observada nestes parâmetros, a capacidade de
fertilização dos espermatozóides não foi significativamente alterada pelo volume de
sêmen congelado. Resultados semelhantes foram obtidos no congelamento do sêmen de
Hippoglossus hippoglossus, onde também não foi observada diferença na taxa de
fertilização utilizando-se espermatozóides congelados em criotubos de 1,6 e 4,0 mL
[16].
O descongelamento do sêmen é um procedimento considerado tão importante quanto o
próprio congelamento e que merece a mesma atenção durante o desenvolvimento de um
protocolo de criopreservação. Para se realizar o descongelamento, dois fatores devem
ser levados em consideração, a temperatura e o tempo que os recipientes devem ser
mantidos aquecidos. Neste estudo, avaliamos a eficácia do descongelamento do sêmen
em água à 60ºC por 70s ou 90s e verificamos que a exposição dos criotubos durante um
maior tempo proporciona melhores resultados de motilidade e velocidade espermática.
Após o descongelamento dos criotubos foi observada uma diferença na temperatura
final da amostra do interior dos recipientes em função do tempo imersão em água (70s: -
2,6°C e -2,1°C e 90s: 2,7ºC e 3,1°C, para o criotubos de 4,5 e 1,6 mL, respectivamente).
Nos dois tempos estudados foi possível observar que o sêmen encontrava-se em estado
líquido no interior dos recipientes, no entanto as amostras descongeladas durante 70s
encontravam-se super-resfriadas. A diferença da qualidade espermática geradas por
estes dois tempos de descongelamento deve estar relacionada ao processo de
recristalização do gelo intra e extracelular a partir da água já descongelada, o qual deve
ter ocorrido mais fortemente no descongelamento de 70s, onde a temperatura final
26
amostra ainda encontrava-se abaixo de zero grau. A recristalização traz como
consequência lesões de membranas e formação de micro-cristais em mitocôndrias,
afetando a motilidade pós-descongelamento [31].
Além do tempo de descongelamento do sêmen, outro fator que pode ter influenciado
negativamente a qualidade e fertilidade dos espermatozóides de Colossoma
macropomum pode ter sido a alta temperatura de descongelamento utilizada neste
estudo (60ºC). Segundo Lahnsteiner et al. [32] temperaturas maiores que 40°C causam
desnaturação de enzimas e proteínas, especialmente na porção periférica das palhetas de
macropalhetas (1,2 e 5,0 mL) que descongela mais rapidamente que a parte central.
Velasco-Santamaría et al. [33] relataram que o sêmen de Brycon amazonicus
descongelado a 35ºC promoveu maior taxa de fertilização que o sêmen descongelado a
80ºC, independentemente do volume da palheta utilizado no congelamento (0,5; 1,8; 2,5
ou 4,0 mL). Por outro lado, Viveiros et al. [34] não observou diferença na qualidade e
fertilidade do sêmen de Prochilodus lineatus descongelado a 30ºC ou a 60ºC.
Protocolos de criopreservação de sêmen já foram desenvolvidos para mais de uma
centena de espécies de peixes. No entanto, muitos estudos se concentram no uso
imediato do sêmen criopreservado após o descongelamento, não levando em
consideração a possibilidade de uso horas depois do seu descongelamento. Neste
estudo, observamos que a qualidade do sêmen descongelado de Colossoma
macropomum manteve-se significativamente inalterada durante as primeiras 3 h de
armazenamento sob refrigeração, com exceção da morfologia espermática, que
apresentou aumento significativo no número de alterações morfológicas. Kovács et al.
[35], relataram que este estudo é relevante porque o sêmen pode ser descongelado e
enviado para o local da fertilização a partir de um laboratório onde as amostras estão
27
armazenadas. Estes autores relatam ainda que estudos como estes permitem aos
produtores se concentrar apenas na fertilização artificial, sem ter que prestar atenção às
atividades relacionadas à criopreservação, tais como armazenamento e descongelamento
das amostras. Apesar da alta correlação entre cinética espermática e a taxa de
fertilização observada no presente estudo, outros estudos são necessários a fim de
comprovar a capacidade de fertilização do sêmen descongelado, horas depois do seu
descongelamento e armazenamento sob refrigeração.
5. Conclusão
O sêmen de tambaqui pode ser criopreservado tanto em criotubos de 1,6 mL quanto no
de 4,5 mL, sendo recomendado seu descongelamento a 60°C por 90s e seu uso em
procedimentos de fertilização dentro de 3 horas após o descongelamento sob condições
de refrigeraçãode à 5°C.
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