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UNIVERSIDADE FEDERAL
FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA
CURSO DE GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA
ANÁLISE ESPECTROFOTOMÉTRICA COMO ALTERNATIVA À METODOLOGIA KJELDAHL PARA DETERMINAÇÃO DO TEOR DE
NITROGÊNIO EM AMOSTRAS DE TECIDO VEGETAL
UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA
FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA
CURSO DE GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA
ANÁLISE ESPECTROFOTOMÉTRICA COMO ALTERNATIVA À METODOLOGIA KJELDAHL PARA DETERMINAÇÃO DO TEOR DE
NITROGÊNIO EM AMOSTRAS DE TECIDO VEGETAL
LORENA MENDES DE SOUZA
Uberlândia – MG
2012
DE UBERLÂNDIA
FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA
CURSO DE GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA
ANÁLISE ESPECTROFOTOMÉTRICA COMO ALTERNATIVA À METODOLOGIA KJELDAHL PARA DETERMINAÇÃO DO TEOR DE
NITROGÊNIO EM AMOSTRAS DE TECIDO VEGETAL
UNIVERSIDADE FEDERAL
FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA
CURSO DE GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA
ANÁLISE ESPECTROFOTOMÉTRICA COMO ALTERNATIVA À METODOLOGIA KJELDAHL PARA DETERMINAÇÃO DO TEOR DE
NITROGÊNIO EM AMOSTRAS DE TECIDO VEGETAL
UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA
FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA
CURSO DE GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA
ANÁLISE ESPECTROFOTOMÉTRICA COMO ALTERNATIVA À METODOLOGIA KJELDAHL PARA DETERMINAÇÃO DO TEOR DE
NITROGÊNIO EM AMOSTRAS DE TECIDO VEGETAL
Lorena Mendes de Souza
Monografia de graduação
Universidade Federal de Uberlândia como
parte dos requisitos necessários
aprovação na disciplina de Trabalho de
Conclusão de Curso do curso de
Química
Uberlândia – MG
2012
DE UBERLÂNDIA
FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA
CURSO DE GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA
ANÁLISE ESPECTROFOTOMÉTRICA COMO ALTERNATIVA À METODOLOGIA KJELDAHL PARA DETERMINAÇÃO DO TEOR DE
NITROGÊNIO EM AMOSTRAS DE TECIDO VEGETAL
raduação apresentada à
Universidade Federal de Uberlândia como
parte dos requisitos necessários para a
aprovação na disciplina de Trabalho de
Conclusão de Curso do curso de Engenharia
FICHA CATALOGRÁFICA
(Coloca-se na parte inferior da página e do lado direito)
MEMBROS DA BANCA EXAMINADORA DA MONOGRAFIA DA DISCIPLINA
TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO DE LORENA MENDES DE SOUZA
APRESENTADA À UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÃNDIA, EM (DATA).
BANCA EXAMINADORA
____________________________________________
Prof. ...............................................
Orientador (FEQ/UFU)
____________________________________________
Prof. .............................................
FEQ/UFU
____________________________________________
Prof. .............................................
FEQ/UFU
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho à minha mãe Nilma Mendes de Souza
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, que me deu força e garra para superar todas as dificuldades enfrentadas ao longo deste curso, bem como me proporcionou alegrias e bênçãos imensuráveis.
Agradeço ao meu pai Adalberto e em especial à minha mãe Nilma, pelo apoio, credibilidade,
amor e dedicação, pelos ensinamentos valiosos e por terem me dado a oportunidade de cursar e me formar no curso de Engenharia Química.
Ao meu irmão Diego, pelo exemplo maravilhoso de dedicação, pelos ensinamentos e apoio. Ao meu irmão Thiago e sobrinha Yasmin pelo carinho de todos os momentos. À minha irmã
Loyane pelo companheirismo inestimável, pelo apoio nos estudos, enfim por enfrentar comigo, com muita fé, perseverança e convicção, a mesma batalha.
Ao meu namorado Heitor pela compreensão, companheirismo, confiança e principalmente
pelo carinho e paciência.
A todos os membros da EMBRAPA arroz e feijão, pelo suporte e por viabilizar a realização deste trabalho. Agradeço em especial ao Ivã Matsushige, supervisor do Laboratório de
Análises Agroambientais e ao analista Diego Mendes de Souza pelo ensinamento e paciência no Laboratório.
Ao Prof. Eloízio Júlio Ribeiro pela credibilidade depositada em mim, credibilidade esta que
foi fundamental para realização deste trabalho.
A todos os professores da Faculdade de Engenharia Química da Universidade Federal de Uberlândia por transmitirem muita sabedoria, sendo assim, essenciais para o meu
crescimento pessoal e profissional. Agradeço em especial ao Prof. Luís Cláudio Oliveira Lopes por me acompanhar desde o início da faculdade, me orientando, ensinando e
contribuindo para minha formação.
Aos meus colegas que compartilharam comigo seus conhecimentos.
A todos aqueles que de alguma forma contribuíram ou torceram pela concretização deste projeto.
EPÍGRAFE
“O conhecimento chega, mas a sabedoria demora." (Alfred Tennyson)
SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS ................................................................................................................. i
LISTA DE TABELAS ............................................................................................................... ii
LISTA DE SÍMBOLOS ............................................................................................................ iii
RESUMO .................................................................................................................................. iv
ABSTRACT ............................................................................................................................... v
1- INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 1
2- REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................................... 4
2.1- Bioquímica Vegetal .......................................................................................................................4
2.2- Amostragem Vegetal.....................................................................................................................4
2.3- Preparação das amostras para análise química ............................................................................5
2.4- Destruição da matéria orgânica ....................................................................................................6
2.4.1- Digestão Úmida ........................................................................................................ 7
2.5- Método Kjeldahl para determinação de Nitrogênio .....................................................................8
2.5.1- Fundamentos da titulação ......................................................................................... 8
2.5.2- O método Kjeldahl ................................................................................................... 9
2.6- Método espectrofotométrico para determinação de Nitrogênio ............................................. 10
2.6.1- Fundamentos da espectrofotometria....................................................................... 10
2.6.2- Lei de Lambert-Beer na espectrofotometria........................................................... 11
2.6.3- Instrumentação analítica na espectrofotometria ..................................................... 12
2.6.3.1- Fontes de Radiação ............................................................................................. 12
2.6.3.2- Monocromadores ................................................................................................ 13
2.6.3.3- Cubetas ................................................................................................................ 14
2.6.4- O método espectrofotométrico baseado na reação de Berthelot ............................ 14
2.7- Validação de um método analítico ............................................................................................ 16
2.7.1- Especificidade/Seletividade ................................................................................... 17
2.7.2- Faixa de trabalho .................................................................................................... 17
2.7.3- Linearidade ............................................................................................................. 18
2.7.4- Sensibilidade .......................................................................................................... 18
2.7.5- Exatidão .................................................................................................................. 18
2.7.6- Precisão .................................................................................................................. 19
2.7.7- Teste de decomposição dos reagentes .................................................................... 20
2.7.8- Teste de estabilidade da coloração ......................................................................... 20
2.7.9- Limite de Detecção (LD)........................................................................................ 20
2.7.10- Limite de quantificação (LQ) ............................................................................... 21
2.8- Estatística ................................................................................................................................... 21
2.8.1- Importância da estatística ....................................................................................... 21
2.8.2- Testes estatísticos ................................................................................................... 22
2.8.2.1- Teste de Hipóteses ............................................................................................... 22
2.8.2.2- Teste F para comparação de variâncias ............................................................. 23
2.8.2.2- Teste T para comparação de médias................................................................... 24
2.9- Gerenciamento de Resíduos gerados em Laboratórios ............................................................. 26
3- METODOLOGIA ................................................................................................................ 27
3.1- Amostragem ............................................................................................................................... 27
3.2- Preparação das amostras para análise química ......................................................................... 27
3.3- Lavagem e descontaminação de vidrarias ................................................................................. 27
3.4- O método Kjeldahl ..................................................................................................................... 27
3.4.1- Insumos, equipamentos e utensílios ....................................................................... 27
3.4.2- Digestão úmida para o método Kjeldahl ................................................................ 29
3.4.3-Destilação ................................................................................................................ 29
3.4.4- Titulação ................................................................................................................. 30
3.5- O método espectrofotométrico baseado na reação de Berthelot ............................................ 30
3.5.1- Insumos, equipamentos e utensílios ....................................................................... 30
3.5.2- Preparo de soluções ................................................................................................ 31
3.5.3- Digestão úmida para o método espectrofotométrico baseado na reação de Berthelot .......................................................................................................................................... 33
3.5.4- Diluição intermediária ............................................................................................ 35
3.5.5- Leitura das amostras ............................................................................................... 36
3.6- Validação .................................................................................................................................... 36
3.6.1- Teste de Especificidade .......................................................................................... 36
3.6.2- Faixa de trabalho/Teste de Linearidade/Teste de Sensibilidade ............................ 36
3.6.3- Teste de Exatidão/Teste de Precisão ...................................................................... 37
3.6.4- Teste de decomposição dos reagentes .................................................................... 37
3.6.5- Teste da estabilidade da coloração ......................................................................... 37
3.6.6- Limite de detecção e Limite de quantificação ........................................................ 38
3.6.7- Comparação de Média e Variância ........................................................................ 38
3.7- Tratamento dos resíduos gerados pelas análises químicas ....................................................... 38
3.7.1- Tratamento de resíduos contendo cobre ................................................................. 38
3.7.2 Tratamento de resíduos contendo selênio ................................................................ 38
4- RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................................... 39
4.1- Reagentes utilizados nos métodos ............................................................................................ 39
4.2- Digestão úmida .......................................................................................................................... 39
4.3- Validação do método ................................................................................................................. 40
4.3.1-Teste de especificidade............................................................................................ 40
4.3.2- Faixa de trabalho, linearidade e sensibilidade ........................................................ 42
4.3.3- Teste de Exatidão ................................................................................................... 43
4.3.4- Teste de Precisão .................................................................................................... 44
4.3.5- Teste de Decomposição dos reagentes ................................................................... 45
4.3.6- Teste da estabilidade da coloração ......................................................................... 47
4.3.7- Limite de Detecção e Limite de Quantificação ...................................................... 48
4.3.8- Comparação de média e variância .......................................................................... 49
4.4-Tratamento dos resíduos gerados pelas análises químicas ........................................................ 50
4.4.1- Tratamento de resíduos contendo cobre ................................................................. 50
4.4.2- Tratamento de resíduos contendo selênio .............................................................. 51
5- CONCLUSÕES .................................................................................................................... 51
I
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Principais componentes de um espetrofotômetro .................................................... 12
Figura 2- Monocromador prismático ........................................................................................ 14
Figura 3- Destilador de Nitrogênio Marconi MA-036 ............................................................. 29
Figura 4- Preparação do reagente R1 ....................................................................................... 32
Figura 5- Pesagem das amostras em papel livre de Nitrogênio ................................................ 33
Figura 6- Sais catalisadores da digestão ................................................................................... 33
Figura 7- Digestão das amostras em bloco digestor ................................................................. 34
Figura 8- Diferença da amostra na primeira hora da digestão e ao término da digestão.......... 35
Figura 9- Adição dos reagentes R1 e R2. ................................................................................. 35
Figura 10- Espectrofotômetro HACH DR2800 ........................................................................ 36
Figura 11- Curva padrão e absorbância do padrão de 100 ppm de amônio sem e com possíveis
interferentes. ............................................................................................................................. 41
Figura 12- Faixa de trabalho testada......................................................................................... 42
Figura 13- Linearidade e sensibilidade do método ................................................................... 43
Figura 14- Curva padrão com R1 e R2 novos .......................................................................... 45
Figura 15- Curva padrão com R1 velho e R2 novo .................................................................. 46
Figura 16- Curva padrão com R1 e R2 velhos ......................................................................... 47
Figura 17- Coloração dos padrões ............................................................................................ 47
Figura 18- Evolução da absorbância ao longo do tempo.......................................................... 48
II
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Quantidade máxima de minerais presentes no extrato e quantidade máxima testada
pela HACH. .............................................................................................................................. 40
Tabela 2- Absorbância do padrão de 100 ppm de amônio sem e com possíveis interferentes. 41
Tabela 3- interferência máxima na leitura. ............................................................................... 41
Tabela 4- Teor de nitrogênio na amostra certificada obtido pelos métodos avaliados ............. 43
Tabela 5- Erro relativo dos métodos em relação ao valor certificado ...................................... 44
Tabela 6- Média, desvio padrão e coeficiente de variação das análises obtidas ...................... 44
Tabela 7- Coeficiente de variação médio das análises ............................................................. 45
Tabela 8- Absorbância dos brancos .......................................................................................... 49
Tabela 9- Limite de Detecção e Limite de Quantificação ........................................................ 49
Tabela 10- Teste de comparação de variância e média ............................................................ 50
III
LISTA DE SÍMBOLOS
A- absorbância
Α- Nível de significância
c- concentração do material absorvedor [ML-3]
CV-coeficiente de variação
DPa- desvio padrão do intercepto com o eixo do Y [ML-3]
DPb- desvio padrão do branco [ML-3]
DPR- desvio padrão relativo
ε- absorvidade molecular ou coeficiente de extinção [L2M-1]
Gerelab- Gerenciamento dos resíduos sólidos
io- intensidade de luz incidindo na solução [Cd]
i- Intensidade da luz saindo da solução [Cd]
l- espessura da amostra da amostra através da qual a luz passa [L]
L.A.A- Laboratório de Análises Agroambientais
LD- limite de detecção
LQ- limite de quantificação
λ- Comprimento de onda [L]
µ- média populacional [ML-3]
t 95% - valor tabelado de t de student para n amostras (95% de confiança)
S- sensibilidade do aparelho
σ- desvio padrão populacional [ML-3]
T- transmitância
IV
RESUMO
O termo nitrogênio total de Kjeldahl (Ntk) refere-se ao nitrogênio orgânico presente em uma determinada amostra e sua determinação consiste basicamente na conversão de toda forma nitrogenada a amônio que por sua vez pode ser detectado por diferentes métodos, tais como, titulação, potenciometria e espectrofotometria. Determinar este elemento em amostras de tecido vegetal tem inestimável importância já que o mesmo está intimamente ligado ao metabolismo de aminoácidos e proteínas envolvendo processos enzimáticos e assimilações através de reações de oxiredução (Dougall & Estaba, 1980). O método mais utilizado para esta análise é o método de Kjeldahl, proposto pelo dinamarquês Johan Gustav Kjeldahl em 1883 que determina o Nitrogênio orgânico total, isto é, o nitrogênio proteico e o nitrogênio não proteico, porém orgânico. Tal método baseia-se na digestão sulfúrica de uma amostra sob alta temperatura, o amoníaco é então liberado e destilado com hidróxido de sódio (NaOH), logo em seguida é titulado com uma solução ácida padrão. A simplicidade deste método torna-o muito empregado em análises de diferentes amostras, contudo o método é lento e a operacionalidade do mesmo, no Laboratório de Análises Agroambientais (LAA) da EMBRAPA arroz e feijão, ainda é questionável já que o laboratório disponibiliza-se de apenas um destilador. Além disso, há uma grande quantidade de solicitações de análise de Nitrogênio total no LAA. Em 2011, o laboratório recebeu cerca de 4000 solicitações sendo que apenas 2500 destas foram realizadas no mesmo ano. Neste contexto, o objetivo deste trabalho é o ajuste da análise espectrofotométrica, baseada na reação de Berthelot como alternativa à metodologia de Kjeldahl para determinação do teor de nitrogênio em amostras de tecido vegetal. Tal método, que é sobretudo mais operacional na rotina do laboratório, foi validada e comparada com a metodologia Kjeldahl. Palavras-chave: Nitrogênio, tecido vegetal, método Kjeldahl, método espectrofotométrico.
V
ABSTRACT
The term total Kjeldahl nitrogen (TKN) refers to organic nitrogen present in a given sample and the determination basically consists in the conversion of the ammonium nitrogen form throughout which in turn can be detected by various methods, such as titration, potentiometry and spectrophotometry. Determine this element in samples of plant tissue has inestimable importance since it is closely linked to the metabolism of amino acids and proteins and enzymatic processes involving assimilation through reactions oxiredução (Estaba & Dougall, 1980). The method used for this analysis is the Kjeldahl method, proposed by Danish Gustav Johan Kjeldahl in 1883 that determines the total organic nitrogen, ie nitrogen protein and non-protein nitrogen, but organic. This method relies on digestion sulfuric a sample under high temperature, ammonia is then released and distilled with sodium hydroxide (NaOH) is then immediately titrated with a standard acid solution. The simplicity of this method makes it widely used in analyzes of different samples, but the method is slow and operability of the same in AE Analytical Laboratory (AAL) EMBRAPA rice and beans, is still questionable since the lab is available only a distiller. In addition, there are a lot of requests for analysis of total nitrogen in the LAA. In 2011, the lab received about 4000 requests and only 2500 of these were made in the same year. In this context, the objective of this work is the setting of spectrophotometric analysis, based on the Berthelot reaction as an alternative to the Kjeldahl method for determining nitrogen content in samples of plant tissue. This method, which is more particularly operating in routine laboratory was validated and compared with the Kjeldahl method.
Keywords: Nitrogen, plant tissue, Kjeldahl method, spectrophotometric method
1
1- INTRODUÇÃO
O desenvolvimento ou aprimoramento de métodos para determinação de nitrogênio
total em materiais vegetais torna-se necessário devido à importância do controle deste
nutriente, em função principalmente de seu papel no metabolismo de aminoácidos e proteínas
envolvendo processos enzimáticos e assimilações através de reações de oxiredução.
(DOUGALL; ESTABA, 1980)
O Nitrogênio é um importante componente quanto às funções no metabolismo das
plantas, participando como constituinte de moléculas de proteínas, coenzimas, ácido
nucleicos, citocromos, clorofila etc. (FERREIRA et al, 2001). Além disso, é um dos nutrientes
mais relevantes para o aumento da produção, pois está diretamente associado à atividade
fotossintética, aos processos de multiplicação e expansão celular, bem como à fixação de
vagens e ao enchimento dos grãos.
Quando ocorre na planta em níveis inferiores a 2,8% ou superiores a 6,0%, podem
ser desencadeados estados de deficiência ou toxidez, respectivamente. A deficiência de
nitrogênio ocorre principalmente, em solos arenosos e lixiviados, com baixo teor de matéria
orgânica (< 2 %). Em solos férteis, quando cultivados intensamente, fortemente lixiviados ou
inundados por tempo prolongado, também pode ocorrer deficiência de nitrogênio. Essa
deficiência também pode ser verificada como consequência de aplicação excessiva de
fertilizantes fosfatados. Podem ocorrer em plantas deficientes de nitrogênio: amarelecimento
das folhas, iniciando-se pelas mais velhas; crescimento reduzido; baixa produção de ramos e
botões florais; menor pegamento de vagens, redução no tamanho das sementes e
consequentemente, baixa produtividade e qualidade inferior de grãos conforme MANUAL
EMBRAPA RONDÔNIA (2005).
O nitrogênio altera-se entre várias formas e estados de oxidação, sendo as de maior
interesse, em ordem decrescente do estado de oxidação, nitrato (NO3-), nitrito (NO2-), amônia
(NH3 ou NH4+) e nitrogênio orgânico (dissolvido ou em suspensão).
Nitrogênio orgânico inclui matéria natural (proteínas, peptídeos, ácidos nucleicos,
ureia) e numerosos compostos orgânicos sintéticos. A amônia está naturalmente presente em
águas superficiais e águas residuárias e esta é produzida largamente pela amonificação de
nitrogênio orgânico e pela hidrólise da ureia. Nitrato e nitrito são formas oxidadas, sendo que
o nitrato geralmente ocorre em pequenas quantidades em águas superficiais, mas podem
alcançar altos níveis em algumas águas subterrâneas. Nitrito é um estado de oxidação
2
intermediário do nitrogênio, obtido tanto da oxidação da amônia a nitrato como da redução do
nitrato. (KRAMER, 2009)
A maioria dos métodos para determinação de nitrogênio total requer a transformação
de todas as formas nitrogenadas a amônio e, neste contexto, o método Kjeldahl de digestão
desenvolvido em 1883 tem sido o mais utilizado para a análise de materiais vegetais. (JONES,
1987).
É válido ressaltar que a metodologia de Kjeldahl detecta não apenas o nitrogênio
proteico de uma amostra, mas também o nitrogênio orgânico de fonte não proteica.
Entretanto, na maioria dos alimentos este último é muito pequeno em relação ao proteico, o
que não confere grandes desvios ao teor real de nitrogênio presente na amostra.
Íons amônio podem ser quantificados por potenciometria (SHEN et al., 1997),
titulação (OHLWEILER, 1976) ou espectrofotometria utilizando reagente de Nessler
(DORICH; NELSON, 1983), salicilato de sódio (BREMNER; MULVANEY, 1982), etc, em
procedimentos que frequentemente requerem etapas de difusão gasosa ou destilação.
Há também metodologias a seco para determinação de nitrogênio presente em uma
amostra de tecido vegetal, como é o caso da metodologia Dumas, proposta por Jean-Baptiste
Dumas, que é um processo oxidativo seco que determina nitrogênio de uma amostra após a
combustão da mesma.
Ambos os métodos são utilizados atualmente na rotina do laboratório de análises
agroambientais da EMBRAPA arroz e feijão, localizada no município de Santo Antônio de
Goiás-GO. Porém, o alto custo de manutenção do analisador elementar utilizado no método
Dumas e a falta de operacionalidade da metodologia Kjeldahl, tendo em vista o processo ser
relativamente lento faz com que alternativas a essas metodologias sejam ajustadas ao
laboratório.
Durante a realização deste trabalho foi ajustado o método espectrofotométrico
baseado na reação de Berthelot para determinação de Nitrogênio total em amostras de tecido
vegetal. A operacionalidade, a média das concentrações de nitrogênio bem como a precisão
do método foi comparada com a metodologia padrão Kjeldahl.
As análises da validação foram feitas em amostras de feijão, arroz e braquiária
(Brachiaria sp.) já que o L.A.A de química de plantas da EMBRAPA arroz e feijão realiza,
principalmente, em sua rotina laboratorial, análises de teor mineral em amostras de arroz e
feijão. Além destes dois, a braquiária também foi escolhida para as análises da validação
porque esta apresenta maior dificuldade de extração dos seus elementos, devido ao seu alto
teor de lignina. Assim, é possível inferir que se a braquiária consegue ser oxidada na etapa de
3
digestão do método validado neste trabalho, grande parte das outras amostras de tecido
vegetal também poderão ser analisadas por este.
A análise de nitrogênio em feijão tem grande importância principalmente porque este
é uma leguminosa produtora de frutos ricos em proteína. Pelo fato desta tamanha importância
do feijão na alimentação, há grandes necessidades de se fazer adubação nitrogenada nas
culturas já que o nitrogênio é um nutriente com deficiência freqüente em leguminosas,
sobretudo nos feijoeiros.
Em arroz, faz-se de grande valia determinar a quantidade de nitrogênio, já que a
proteína do arroz é a mais nobre entre os cereais. A fração proteica do arroz, embora
quantitativamente pequena, apresenta a melhor composição de aminoácidos para o
metabolismo humano (entre os cereais). Quando metabolizado, gera menos resíduos
nitrogenados, favorecendo a função renal de filtragem desses catabólitos.
A braquiária foi introduzida no Brasil há mais de 50 anos e atualmente possui grande
relevância econômica, devido aos seus usos como forragem animal, cobertura e adubo verde
em sistemas de produção vegetal. Sua importância na nutrição animal pode ser avaliada
através das estimativas da área sob pastagem de braquiárias no Brasil, as quais já atingiam ao
redor de 85 milhões de ha em 2002 (SOUZA et al., 2012). Assim, faz-se importante
determinar o teor de nitrogênio presente em amostras de braquiária tendo em vista sua
importância na nutrição animal, bem como sua caracerística peculiar de apresentar grande teor
de lignina.
A análise de nitrogênio em rotinas de laboratório serve como fonte de determinação
do teor bruto de proteína em uma amostra. Assim, em amostras de tecido vegetal determina-se
o teor bruto de proteína a partir do nitrogênio total multiplicado por um fator de correção 6,25
(GALVANI, 2008).
Para realização das análises, recomenda-se escolher laboratórios idôneos, que
participam de programas de controle de qualidade, os quais divulgam anualmente aqueles
com padrões desejáveis de qualidade. O Laboratório de Análises Agroambientais do Centro
Nacional de Pesquisa de Arroz e Feijão da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
(EMBRAPA), em Goiás, onde foi realizado este trabalho, é certificado pelo Programa
Interlaboratorial de Análise de Tecido Vegetal (PIATV).
4
2- REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1- Bioquímica Vegetal
Na natureza vários elementos estão disponíveis às plantas, porém uma simples
análise química de um vegetal não é capaz de determinar quais destes elementos são
essenciais, pois a planta pode absorver e armazenar em seus tecidos muitos elementos que não
lhe são essenciais. É necessário determinar os nutrientes de acordo com um critério de
essencialidade.
A maneira mais comum de se determinar a essencialidade de um elemento às plantas
é através de experimentos com soluções nutritivas preparadas com água e sais purificados.
Assim, pode-se omitir os elementos da solução um a um, podendo ser classificados como
essenciais os que atendam aos seguintes critérios (MALAVOLTA et al., 2006): Na ausência
do elemento a planta não cresce normalmente nem completa o seu ciclo de vida, ou seja, não
se desenvolve corretamente e não se reproduz; o elemento é insubstituível, ou seja, deficiência
só pode ser corrigida através do seu fornecimento e não de algum outro e o último critério
estabelece que o elemento químico faz parte de uma molécula, de um constituinte ou de uma
reação bioquímica essencial à planta.
Para classificar os elementos essenciais, dividem-se estes em dois grandes grupos:
macronutrientes e micronutrientes. O primeiro refere-se aos elementos básicos necessários em
maior volume às plantas: carbono, oxigênio, nitrogênio, fósforo, potássio, cálcio, magnésio e
enxofre. O segundo refere-se aos elementos requeridos em pequenas quantidades pela planta:
boro, cloro, cobre, ferro, manganês, molibdênio, cobalto, níquel e zinco.
Quando um elemento essencial está disponível em quantidades insuficientes ou em
combinações químicas que são dificilmente absorvidas, a deficiência deste elemento
provocará desarranjos nos processos metabólicos da planta. Muitas vezes esse distúrbio é
demonstrado por sintomas visíveis, como desenvolvimento lento, amarelecimento e outras
anormalidades. A intensidade desses sintomas é dependente do elemento em falta, da espécie
ou variedade da planta e de fatores ambientais.( EPSTEIN; BLOMM, 2006)
2.2- Amostragem Vegetal
5
A análise dos minerais presentes em amostras de tecido vegetal é uma das técnicas
utilizadas para a verificação do estado nutricional das plantas. A coleta de tecido para
análise deve ser feita, portanto, de forma adequada e representativa, já que os nutrientes
não existem nas diversas partes da planta em quantidades iguais, alternando de acordo com a
idade da planta e a variedade considerada. Os resultados da análise foliar somente serão
eficientes se a amostragem for bem feita e representativa da lavoura. (VELOSO et al., 2004)
Havendo suspeita de alguma deficiência nutricional, deve-se coletar separadamente
o tecido de plantas com e sem sintomas. Segundo a COMISSÃO DE QUÍMICA E
FERTILIDADE DO SOLO (2004), na maior parte dos casos a concentração de
nutrientes em folhas completamente expandidas de plantas é a melhor indicação do seu
estado nutricional, refletindo a condição de fertilidade do solo.
As amostras são geralmente colhidas quando as culturas estão em pleno crescimento
vegetativo e o órgão colhido, em geral, é a folha recém madura. Mas, em condições eventuais,
analisa-se porções do caule ou ramos. Como a composição de diferentes partes das plantas é
heterogênea, bem como o estágio de crescimento influi na concentração de nutrientes, há
necessidade não só de estabelecer as partes das plantas que devem ser amostradas, mas
também, a melhor época. Devido a essas variações, a amostragem deve ser feita de acordo
com as recomendações indicadas, para o sucesso da diagnose foliar.
Estudos realizados por MALAVOLTA et al. (1997) indicam diferentes
metodologias para amostragem de diferentes espécies vegetais. Em seu trabalho, ele
predefiniu a parte da planta a ser amostrada, bem como a idade, época, posição e número de
folhas e plantas a serem amostradas para cada cultura vegetal.
2.3- Preparação das amostras para análise química
O sucesso da análise química de tecido vegetal em laboratório depende, em grande
parte, do procedimento de coleta do material e do tempo decorrido entre a coleta e a chegada
deste no laboratório de análise. Recomenda-se que esse tempo seja o mais breve para que os
processos de respiração e de decomposição do vegetal não venham comprometer os
resultados da análise. O ideal seria que a amostra chegasse ao laboratório no mesmo dia da
coleta, acondicionada em saco plástico para transporte a baixa temperatura ou em sacos de
papel. Ao chegar no laboratório, as amostras devem ser registradas e identificadas.
O preparo de amostras de tecido vegetal para análise química consiste em quatro
operações unitárias: lavagem, secagem, moagem e peneiramento. Em resumo, a lavagem
consiste na eliminação de qualquer contaminante do tecido vegetal, seja solo, pesticida ou
6
adubos foliares; a secagem consiste na eliminação ou redução significativa da água livre
(umidade) e estabilização enzimática da amostra e a moagem é a redução da granulometria do
tecido vegetal seco para facilitar a extração dos minerais presentes neste tecido e o
peneiramento é uma homogeneização da dimensão do material moído.
Inicialmente, deve-se fazer a descontaminação do tecido vegetal através da lavagem,
eliminando folhas ou outros componentes vegetais que estejam secos, murchos ou
deteriorados. Deve-se lavar com solução de detergente antes de seguir para a lavagem
convencional tecidos contendo resíduos de pesticias ou adubos. É importante ressaltar que as
lavagens devem ser feitas rapidamente, pois existe a possibilidade de perdas por solubilização
de nitrato, boro, potássio e cloreto. (SILVA, 1999).
Após a lavagem, deve-se realizar a secagem em que a umidade da amostra deverá ser
removida por volatilização, causada por secagem ao calor ou a frio. Em casos de secagem em
estufas, deve-se haver um sistema de circulação forçada de ar, com temperatura variando de
65-70º C, até peso constante (aproximadamente 72h). A percentagem da amostra que sobra
após a remoção desta umidade é conhecida como percentagem de matéria seca ou matéria
parcialmente seca. O objetivo deste procedimento é obter matéria seca do material coletado.
O próximo passo é a moagem da amostra seca que é feita, geralmente, em moinhos
de facas de aço inoxidável, tipo Willey, passando em peneira de 1 mm de malha (20 mesh)
para que os grânulos tenham tamanhos mais homogêneos possíveis. É importante ressaltar a
importância da limpeza do moinho entre uma amostra e outra que evita a contaminação das
amostras. As amostras moídas devem ser preferencialmente armazenas em frasco com tampa
rosquiável, a fim de evitar a umidificação. Além disto a amostra pode ser armazenada por
longo período de tempo se mantida a baixa temperatura, protegida da luz e de umidade.
(FAQUIN, 2002)
2.4- Destruição da matéria orgânica
Poucas amostras podem ser analisadas sem a necessidade de alterações físicas ou
químicas. Na maioria dos instrumentos empregados em análises químicas, é preciso que o
analito esteja dissolvido em água ou em algum solvente. Para isso existem os métodos onde
ocorre a destruição da matéria orgânica por via úmida: digestão úmida em bloco digestor e
digestão úmida em forno microondas; outro método de obtenção do analito dissolvido é o
método extrativo através da solubilização em HCl 1mol.L-1, em que não ocorre destruição da
matéria orgânica, apenas solubilização dos elementos em ácidos com o auxílio de calor e
agitação.
7
Além destes métodos, existe a destruição da matéria orgânica através da digestão
seca em que o material vegetal é submetido a uma mufla a temperatura de 500 a 550°C por 4
a 8 horas. Nesse processo a matéria orgânica é destruída (oxidada) pela ação do calor. As
cinzas restantes são solubilizadas em ácidos diluídos. (KARLA, 1998)
Nos métodos estudados neste trabalho: Método Kjelhdal e método
espectrofotométrico baseado na reação de Berthelot, ambos para determinação de nitrogênio
em amostras de tecido vegetal, a digestão das amostras são realizadas via úmida.
2.4.1- Digestão Úmida
A característica básica da digestão úmida é a decomposição das plantas (matéria
orgânica) em ácidos ou misturas de ácidos, com ou sem água oxigenada. Para isso utiliza-se
blocos digestores para que possa ocorrer a digestão a quente.
Os ácidos clorídrico, nítrico, perclórico e sulfúrico são utilizados individualmente ou
em conjunto. A escolha de qual ou quais ácidos utilizar irá depender de características da
amostra e do que se quer analisar. De uma maneira genérica, não se pode utilizar ácido
clorídrico na determinação de Cloreto (Cl-), porque esse ânion constitui o ácido; não se utiliza
ácido nítrico em determinação de nitrogênio. O ácido sulfúrico é recomendado quando se tem
amostras com alto teor de cinzas, pois ele diminui o efeito de respingos.
A mistura nitro-perclórica, ácido nítrico e ácido perclórico, é a mais utilizada. É
recomendada para um grande número de amostras, tais como: folhas, sementes, raízes, caules
e cascas.
Na quantificação de nitrogênio em amostras de tecido vegetal, utiliza-se a digestão
úmida com ácido sulfúrico e peróxido de hidrogênio com o auxílio de um catalisador. Os
catalisadores mais utilizados para acelerar o processo de decomposição da matéria orgânica
são o sulfato de cobre, óxido de mercúrio, óxido de cobre, selênio, dentre outros.
A maior limitação da digestão úmida é o desprendimento de vapores e gases tóxicos
dentro do laboratório e salas vizinhas. Geralmente, o sistema de exaustão das capelas não são
suficientemente eficientes para evitar que os vapores e gases difundam no interior das salas. É
comum, mesmo quando os vapores e gases são eliminados para o exterior através de um
eficiente sistema de exaustão, os gases e vapores retornarem ao laboratório e salas próximas
principalmente nos dias de umidade relativa baixa. (MORAES; RABELO, 1986)
8
2.5- Método Kjeldahl para determinação de Nitrogênio
2.5.1- Fundamentos da titulação
A determinação da concentração de um ácido ou de uma base através da destilação é
uma das aplicações mais importantes de uma reação ácido-base. Este procedimento é
conhecido como titulação ácido base.
Segundo a INFOPÉDIA (2012), no procedimento citado, adiciona-se uma solução de
concentração rigorosa – o titulante, que se encontra numa bureta a uma solução contida num
balão Erlenmeyer de concentração desconhecida – o titulado. A reação processa-se enquanto
houver excesso de ácido ou base, ou seja, até que sejam adicionadas quantidades equivalentes
das duas soluções. Atinge-se nessa altura o ponto de equivalência. Do ponto de vista prático, a
deteção do ponto de equivalência pode ser feita usando um indicador ácido-base apropriado,
que, mudando de cor para um valor de pH, o mais próximo possível do ponto de equivalência,
assinala o fim da titulação. No entanto, existem outros processos de detecção como o uso de
um medidor de pH (método potenciométrico) ou a medição da condutividade elétrica do
titulado (método condutimétrico).
As titulações de ácido-base baseiam-se no pH do titulado que varia ao longo da
titulação, à medida que se adiciona o titulante. Essa propriedade, torna de grande importância,
conhecer o tipo de variação do valor do pH no decurso da reação.
Podem considerar-se quatro tipos de titulações: ácido forte/base forte; ácido
fraco/base forte; ácido forte/base fraca e ácidofraco/base fraca. Numa titulação de um ácido
forte com uma base forte, pode concluir-se que no ponto de equivalência, a 25 ºC, a solução é
neutra, pelo que o pH da solução é 7. Numa titulação de um ácido fraco com uma base forte,
pode concluir-se que no ponto de equivalência, a 25 ºC, dada a formação do íon OH-, o pH do
titulado é superior.
Numa titulação de um ácido forte com uma base fraca pode concluir-se que no ponto
de equivalência, a 25 ºC, dada a formação do íon H3O+, o pH do titulado é inferior a 7.
Finalmente, numa titulação de um ácido fraco com uma base fraca o valor do pH poderá estar
situado na zona ácida, básica ou neutra, dependendo da força relativa de cada espécie
envolvida.
9
2.5.2- O método Kjeldahl
O método Kjeldahl, proposto por Johan Gustav Kjeldahl é um processo oxidativo via
digestão úmida em que a amostra é aquecida com ácido sulfúrico até temperaturas elevadas
por algumas horas. Para aumentar a temperatura de ebulição do ácido são utilizados sais como
sulfato de potássio-K2SO4 ou sulfato de sódio-Na2SO4. Além disso, selênio, cobre ou chumbo
são utilizados como catalisadores promovendo maior velocidade de oxidação da matéria
orgânica (BREMMER, 1982).
A utilização de sais, como o sulfato de sódio ou de potássio, tem como finalidade, a
eliminação de umidade da amostra, para permitir o ataque dos reagentes, esses sais também
diminuem a pressão de vapor da amostra que está sendo digerida, diminuindo assim sua
temperatura de ebulição, já que para um processo eficiente a digestão acorre a altas
temperaturas chegando a até 500ºC e o ácido sulfúrico utilizado que tem ponto de ebulição
300ºC não pode ser totalmente vaporizado.
Neste processo, carbono e hidrogênio são oxidados e o nitrogênio reduz-se à sulfato
de amônio. Este, por sua vez, é convertido à amônia na presença de uma base concentrada
(NaOH) segundo as reações seguintes.
�NH���SO� + 2NaOH∆→ 2NH�OH +Na�SO�
(1) NH�OH
∆→NH� + H�O (2)
Em seguida, a amônia desprendida na reação junto a um indicador é coletada em um
recipiente contendo ácido bórico em um processo de destilação. A medida que vai se
formando borato de amônio, segundo a reação a seguir, a solução passa de uma coloração
rósea para azulada.
H�BO� + NH� →NH� H�BO� (3)
Por fim, o borato de amônio é titulado com ácido clorídrico (HCl) de título
conhecido até o ponto de viragem do indicador, segundo a reação que se segue (GALVANI,
2008).
10
NH� H�BO� + HCl →H�BO� + NH�Cl
(4)
Deste modo, através de uma titulação volumétrica ácido-base é possível conhecer o
teor de nitrogênio inicial presente na amostra.
2.6- Método espectrofotométrico para determinação de Nitrogênio
2.6.1- Fundamentos da espectrofotometria
A espectrofotometria é definida como toda técnica analítica que usa a luz para medir
as concentrações das soluções, através da interação da luz com a matéria. Os métodos
espectroscópicos baseiam-se na absorção e/ou emissão de radiação eletromagnética por
muitas moléculas, quando os seus elétrons se movimentam entre níveis energéticos,
permitindo comparar a radiação absorvida ou transmitida por uma solução que contém uma
quantidade desconhecida de soluto, com uma quantidade conhecida da mesma substância.
(JONES; ATKINS, 2006)
Esta técnica baseia-se, portanto, na absorção da radiação nos comprimentos de onda
que corresponde a uma gama de comprimentos de onda que vai desde o ultravioleta ao
infravermelho no espectro da radiação eletromagnética. O espectro visível está contido
essencialmente na zona entre 400 e 800 nm. A espectrofotometria visível e ultravioleta são
um dos métodos analíticos mais usados nas determinações analíticas em diversas áreas e são
aplicadas para determinações de compostos orgânicos e inorgânicos, como, por exemplo, na
identificação do princípio ativo de fármacos.
A espectroscopia de absorção molecular é valiosa para a identificação dos grupos
funcionais na molécula. Mais importante, entretanto, são as aplicações da espectroscopia de
absorção visível/ ultravioleta para a determinação quantitativa de compostos contendo grupos
absorventes.
O espectrofotômetro é um aparelho que faz passar um feixe de luz monocromática
através de uma solução, e mede a quantidade de luz que foi absorvida por essa solução.
Usando um prisma o aparelho separa a luz em feixes com diferentes comprimentos de onda
(tal como acontece no arco íris com a separação das cores da luz branca). Pode-se assim fazer
passar através da amostra um feixe de luz monocromática (de um único comprimento de
onda, ou quase) permitindo-nos saber que quantidade de luz é absorvida a cada comprimento
de onda. (HARRIS, 1999)
11
Diferentes substâncias têm diferentes padrões de absorção, a espectrofotometria
permite-nos, por exemplo, identificar substâncias com base no seu espectro. Permite também
quantificá-las, uma vez que a quantidade de luz absorvida está relacionada com a
concentração da substância.
2.6.2- Lei de Lambert-Beer na espectrofotometria
A absorção da luz depende de dois princípios,o primeiro é que a absorção será tanto
maior quanto mais concentrada for a solução por ela atravessada, e o segundo princípio
baseia-se no fato de que a absorção da luz é tanto maior quanto maior for a distância
percorrida pelo feixe luminoso através das amostras. Para que seja possível relacionar a
quantidade de luz absorvida por uma amostra com a concentração do analito investigado, é
preciso correlacionar estas grandezas. Isto é possível pela lei de Beer- Lambert, que dá a
relação entre a intensidade da luz incidindo na solução (io), e a intensidade da luz saindo da
solução (i).
Log (io/ i) =A=ε.c.l
(5)
A razão entre a intensidade de luz que incide na solução com a intensidade de luz
que sai da solução é determinada de transmitância.
T= i/io
(6)
Assim, a transmitância se encontra entre 0 (0%) e 1 (100%). A absorbância A é,
portanto, definida como o logaritmo do inverso da transmitância. Quando nenhuma luz é
absorvida i = io, então, T = 1 e A = 0. A absorbância é muito importante, pois tem, segundo
Lambert-Beer, relação linear com a concentração da espécie absorvedora da radiação.
(HARRIS, 1999)
Embora largamente aplicável, a Lei de Lambert-Beer tem suas limitações que devem
ser observadas pelo analista. Essa lei só é válida para radiação monocromática passando
através de uma solução diluída (<0,01 mol.L-1), já que em soluções muito concentradas, as
moléculas de soluto influenciam uma às outras devido suas proximidades, gerando desvios na
absortividade. Além disso, a Lei de Lambert-Beer só pode ser utilizada onde a espécie
12
absorvente não está participando de um equilíbrio que seja dependente da concentração.
(HARRIS, 1999)
2.6.3- Instrumentação analítica na espectrofotometria
Quando a região espectral usada é a ultravioleta/visível, são necessários componentes
óticos de quartzo e detectores altamente sensíveis capazes de detectar radiações nessa extensa
faixa espectral em que atua o instrumento. Os espectrofotômetros, em geral, contêm cinco
componentes principais: fontes de radiação, monocromador, recipientes para conter as
soluções, detectores e indicadores de sinal. A Figura 1 mostra o esquema dos componentes
principais de um espectrofotômetro.
2.6.3.1- Fontes de Radiação
As fontes de radiação mais comuns baseiam-se na incandescência e são muito práticas
no infravermelho e no visível, mas devem atuar em temperaturas elevadas na faixa do
ultravioleta. As fontes de radiação são constituídas por filamentos de materiais que são
excitados por descargas elétricas com elevada voltagem ou aquecimento elétrico e estas
devem gerar radiação continua, ou seja, emitir todos os comprimentos de onda, dentro da
região espectral utilizada. Além disso, as fontes de radiação devem ter intensidade de potência
radiante suficiente para permitir a sua detecção pelo sistema detector da máquina, bem como
devem ser estáveis, isto é, a potência radiante deve ser constante com vida longa e baixo
custo. Existem diferentes tipos de fontes de radiação (SILVERSTEIN et al.,1979) e
(VINADÉ, 2005):
Fontes de radiação Monocromador Compartimento Amostra/padrão
Sistema detector Dispositivo de processamentos de dados
Figura 1 - Principais componentes de um espetrofotômetro
13
Lâmpada de filamento de tungstênio: incandescente, produz emissão continua na
faixa e 320 a 2500nm. O invólucro de vidro absorve toda radiação abaixo de 320nm,
limitando o uso da lâmpada para o visível e infravermelho.
Lâmpada de quartzo-iodo: incandescente, o invólucro de quartzo emite radiação de
200 a 3000nm. Sua vantagem é que pode atuar na região do ultravioleta.
Lâmpada de descarga de hidrogênio ou de deutério: é a mais usada para emissão de
radiação ultravioleta. Consiste em um par de eletrodos fechados em um tubo de quartzo ou
vidro, com janela de quartzo, preenchido com gás hidrogênio ou deutério. Aplicando alta
voltagem, produz-se uma descarga de elétrons que excitam outros elétrons gasosos a altos
níveis energéticos. Quando os elétrons voltam a seus estados fundamentais, emitem radiação
contínua de 180 a 370nm.
Lâmpada de catodo oco: tipo especial de fonte de linha. É preenchida com um gás
nobre, a fim de manter uma descarga de arco. O cátodo tem a forma de um cilindro oco,
fechado em uma extremidade, revestido com o metal cujas linhas espectrais se desejam obter.
O ânodo é um fio reto ao lado do cátodo. A energia do arco causa ejeção dos átomos
metálicos do revestimento do cátodo os quais, excitados, emitem os seus espectros
característicos.
Laser: pelo processo de emissão estimulada, os lasers produzem uma enxurrada de
feixes muito estreitos e intensos de radiação. Todas as ondas procedentes ao material emissor
estão em fase entre si, e, por isso, praticamente não apresenta dispersão quando se propaga.
2.6.3.2- Monocromadores
Os monocromadores são dispositivos essenciais dos espectrofotômetros e tem como
função a seleção do comprimento de onda de interesse para a análise. Este é constituído de
uma fenda de entrada de um elemento de dispersão de radiação e de uma fenda de saída. O
elemento de dispersão pode ser um prisma ou uma rede de difração (SILVERSTEIN et
al.,1979) e (VINADÉ, 2005).
Monocromador prismático: a radiação policromática procedente da fonte de radiação
passa pela fenda de entrada e incide sobre a face de um prisma, sofrendo desvio. Os prismas
de quartzo são indicados para trabalhar na região ultravioleta, embora tenham mais dispersão
que o vidro. Na região do visível são empregados primas de vidro. Os prismas de quartzo
apresentam desvantagem de serem altamente refringentes e oticamente ativos. A Figura 2
mostra a ação de um monocromador prismático.
14
Figura 2- Monocromador prismático
Monocromador reticular: o principal elemento de dispersão dos monocromadores
reticulares é a rede de difração, que consiste em uma placa transparente com inúmeras
ranhuras paralelas e de mesma distância. As redes de difração dispersam a radiação
policromática baseadas no fenômeno da interferência, e a dispersão resultante desta rede é
linear. As redes de difração possuem resolução melhor que os prismas e podem ser utilizadas
em todas as regiões espectrais.
2.6.3.3- Cubetas
São usados como recipientes das amostras a serem analisadas, cubas ou cubetas
retangulares de vidro ou quartzo. As cubetas de vidro são usadas quando se trabalha na região
do visível. Para a região do ultravioleta, devem-se usar as cubetas de quartzo, que são
transparentes à radiação ultravioleta, pois o vidro absorve a mesma (SILVERSTEIN et
al.,1979) e (VINADÉ, 2005).
Para simplificar os cálculos da expressão da Lei de Beer, costuma-se utilizar cubetas
de 1 cm. As cubetas, no entanto, podem ter dimensões diferentes, e esse dado deve ser
considerado no cálculo.
Para aplicações industriais, como, por exemplo, no controle de qualidade de lotes de
produção, utiliza-se um sistema automatizado em que as amostras circulam em série em
cubetas adequadas. Esse sistema é chamado de análise por injeção de fluxo ou FIA (do inglês
Flow Injection Analysis).
2.6.4- O método espectrofotométrico baseado na reação de Berthelot
O método espectrofotométrico para determinação de nitrogênio total baseia-se na
reação de Berthelot (BERTHELOT, 1859). Os reagentes utilizados na reação de Berthelot ou
15
em alguma versão modificada são um composto fenólico, um catalisador e um agente
oxidante, sendo que a reação deve ocorrer em pH alto, aproximadamente 12. (FEREIRA,
2007)
Nessa reação, ocorre a produção do azul de indofenol a partir da reação de fenol com
amônia e hipoclorito em meio alcalino (PATTON, 1977) e (BOLLTER, 1961). O mecanismo
da reação de Berthelot é mostrado a seguir (HARFMANN; CROUCH, 1989).
(7)
(8)
(9)
Na reação 7 a amônia reage com o hipoclorito, formando a monoclorimina. Na
reação 8, a monoclorimina reage com um fenol formando a benzoquinaclorimina e na reação
9, a benzoquinaclorimina reage com outra molécula de fenol formando assim o azul de
indofenol. (SEARLE, 1984).
O azul de indofenol confere uma coloração azulada à amostra a ser analisada e assim,
é possível através de um espectrofotômetro, determinar de forma indireta a quantidade de
nitrogênio total presente na amostra. No entanto, o fenol é uma substância tóxica e altamente
volátil, o que fez com que a utilização do mesmo neste método fosse suspendida. Além disso,
nesta reação há a formação de um intermediário de odor muito forte. Tal intermediário foi
estudado por VERDOUW et al (1978) através de espectroscopia por infravermelho e
determinou-se a presença de orto-clorofenol no mesmo. Este composto tem a capacidade de
penetrar na pele humana, sendo cerca de três vezes mais tóxico que o fenol. (BOWER;
HOLM-HANSEN, 1980)
Um substituto ao fenol nesta reação é o salicilato que também faz a determinação
colorimétrica do nitrogênio amoniacal sem, contudo, promover a formação de orto-clorofenol.
Apesar da não utilização do fenol nesta metodologia, o termo “azul de indofenol” prevalece
na literatura. O mecanismo da reação de Berthelot modificada, utilizando salicilato, é
mostrado a seguir (DEEPA et al., 2003)
16
(10)
(11)
(12)
A substância mais utilizada como catalisadora dessa reação é o nitroprussiato de
sódio Na2[Fe(CN)5NO].2H2O (DEEPA et al., 2003) que promove um aumento da velocidade
de formação do composto colorido, aumentando o sinal espectrofotométrico. Entre as fontes
de oxidantes mais empregadas pode-se citar o hipoclorito (DEEPA et al., 2003) e o
hipobromito (GLEBKO et al., 1967). Uma solução realizada com hipobromito apresenta
estabilidade de até 4 semanas se mantida entre 4ºC e 5ºC e em geral é utilizada quando o
composto fenólico utilizado é o timol. (SEARLE, 1984).
Após a reação se completar, é possível determinar a quantidade de nitrogênio
presente na amostra utilizando um espectrofotômetro.
2.7- Validação de um método analítico
Para o desenvolvimento de um novo método analítico, adaptação ou implementação
de método conhecido, deve-se fazer uma avaliação que estime a eficiência do método na
rotina do laboratório. A este processo, costuma-se dar o nome de validação. O objetivo da
validação consiste em demonstrar que o método analítico é adequado para o seu propósito.
(WALSH, 1999). Alguns parâmetros envolvidos na validação de uma metodologia analítica
são: Especificidade/Seletividade, Faixa de Trabalho, Linearidade, Sensibilidade, Exatidão,
Precisão, Limite de Detecção (LD), Limite de Quantificação (LQ) e Robustez.
17
2.7.1- Especificidade/Seletividade
É a capacidade que o método possui de medir exatamente um composto específico
independente da matriz da amostra e de suas impurezas. Para análise qualitativa (teste de
identificação) é necessário demonstrar a capacidade de seleção do método entre compostos
com estruturas relacionadas que podem estar presentes. Isto deve ser confirmado pela
obtenção de resultados positivos em amostras contendo o analito, comparativamente com
resultados negativos obtidos com amostras que não contém o analito, contendo estruturas
semelhantes. A especificidade e a seletividade estão relacionadas ao evento da detecção. A
especificidade refere-se a um método específico para um único analito e a seletividade refere-
se a um método utilizado para vários analitos com capacidade de distinção entre eles (SILVA;
ALVES, 2006).
Os testes de especificidade objetivam determinar os componentes que precisam ser
analisados na amostra, para isso, é necessário definir a matriz, assim como os possíveis
interferentes. A especificidade pode ser determinada pela comparação dos resultados obtidos
de amostras contaminadas com quantidades conhecidas de impurezas com amostras não
contaminadas. Dessa forma é possível demonstrar que o resultado do teste não é afetado por
esses materiais contaminantes.
2.7.2- Faixa de trabalho
Em qualquer método quantitativo, existe uma faixa de concentrações do analito no
qual o método pode ser aplicado. Os primeiros valores da faixa podem ser dos valores dos
limites de detecção e de quantificação, que serão discutidos nos próximos tópicos, e os
últimos dependem do sistema de resposta do equipamento de medição (SILVA; ALVES,
2006).
A faixa linear é definida como a faixa de concentrações na qual a sensibilidade pode
ser considerada constante e são normalmente expressas nas mesmas unidades do resultado
obtido pelo método analítico. Para escolher a faixa de trabalho deve-se proceder da seguinte
maneira: quando se tem uma amostra específica, a concentração esperada deve se situar no
meio da faixa de trabalho e quando a concentração do analito é desconhecida utiliza-se a faixa
de trabalho estudada para amostras diversificadas. Os valores medidos têm que estar dentro da
faixa de trabalho. No caso de concentração do analito muito pequena, os valores medidos
devem estar próximos ao limite inferior da faixa de trabalho, sendo, porém, diferente dos
brancos dos métodos.
18
Geralmente, os analistas selecionam o intervalo de trabalho (baseado no nível de
concentração do analito que desejam estudar) e depois determinam se a relação sinal versus
concentração é linear.
2.7.3- Linearidade
Segundo a International Conference on Harmonisation (ICH) a linearidade refere-se
à capacidade do método de gerar resultados linearmente proporcionais à concentração do
analito, enquadrados em faixa analítica especificada.
A linearidade é obtida por padronização interna ou externa e formulada como
expressão matemática (equação da regressão linear) usada para o cálculo da concentração do
analito a ser determinado na amostra real. O coeficiente de correlação linear (r) é
freqüentemente usado para indicar a adequabilidade da curva como modelo matemático. Um
valor maior que 0,90 é, usualmente, requerido. O método pode ser considerado como livre de
tendências (unbiased) se o corredor de confiança da reta de regressão linear contiver a origem.
(SILVA; ALVES, 2006)
2.7.4- Sensibilidade
A sensibilidade é a capacidade do método em distinguir, com determinado nível de
confiança, duas concentrações próximas (AMARANTE et al., 2001). Este parâmetro pode ser
expresso pela inclinação da curva de regressão linear de calibração.
Em métodos sensíveis, uma pequena diferença na concentração do analito causa
grande variação no valor do sinal analítico medido. Esse critério expressa a capacidade do
procedimento analítico gerar variação no valor da propriedade monitorada ou medida,
causada por pequeno incremento na concentração ou quantidade do analito.
2.7.5- Exatidão
Exatidão é o grau de concordância entre os resultados individuais encontrados e um
valor de referência aceito como verdadeiro (MENDHAM, 2002).
A RESOLUÇÃO Nº899 de 29 de maio de 2003 define que a exatidão é calculada
como porcentagem de recuperação da quantidade conhecida do analito adicionado à amostra,
ou como a diferença porcentual entre as médias e o valor verdadeiro aceito, acrescida dos
intervalos de confiança. Ainda de acordo com esta resolução, a exatidão é expressa pela
19
relação entre a concentração média determinada experimentalmente e a concentração teórica
correspondente.
Exatidão = �������� çã�!é"# �$%��#!��� &������� çã���ó�#� *100 (13)
2.7.6- Precisão
A RESOLUÇÃO Nº899 (2003) define a precisão como a avaliação da proximidade
dos resultados obtidos em uma série de medidas de uma amostragem múltipla de uma mesma
amostra. Esta é considerada em três níveis: repetibilidade (precisão intra-corrida) que é a
concordância entre os resultados dentro de um curto período de tempo com o mesmo analista
e mesma instrumentação; precisão intermediária (precisão inter-corridas) que é a
concordância entre os resultados do mesmo laboratório, mas obtidos em dias diferentes, com
analistas diferentes e/ou equipamentos diferentes e a reprodutibilidade (precisão inter-
laboratorial) que é a concordância entre os resultados obtidos em laboratórios diferentes como
em estudos colaborativos, geralmente aplicados à padronização de metodologia analítica
A precisão pode ser expressa como desvio padrão relativo (DPR) ou coeficiente de
variação (CV%), segundo a Equação 14.
DPR�CV%� = ,�-.#�/ "�ã�������� çã�!é"# "����!#� " *100 (14)
20
2.7.7- Teste de decomposição dos reagentes
O teste de decomposição dos reagentes é importante para a operacionalidade do
método em questão. Neste caso, este teste está relacionado com a verificação da necessidade
de se preparar os reagentes utilizados nas análises no mesmo dia da realização das mesmas.
Para uma melhor operacionalidade, o ideal é que os reagentes possam ser preparados
em um dia e serem utilizados em todas as análises da semana. Para tanto, isto só poderá ser
feito caso os reagentes não se decomponham ao longo de um curto intervalo de tempo.
2.7.8- Teste de estabilidade da coloração
Apesar deste teste não estar comumente apresentado em livros de validação
metodológica, nesta validação espectrofotométrica este é de suma importância para que se
possa determinar por quanto tempo a solução de coloração verde é estável sem se decompor.
2.7.9- Limite de Detecção (LD)
A RESOLUÇÃO Nº899 (2003) define limite de detecção como sendo a menor
quantidade do analito presente em uma amostra que pode ser detectado, porém não
necessariamente quantificado, sob as condições experimentais estabelecidas.
Este parâmetro é estabelecido por meio da análise de soluções de concentrações
conhecidas e decrescentes do analito, até o menor nível detectável.
Segundo a resolução, no caso de métodos não instrumentais (CCD, titulação,
comparação de cor), esta determinação pode ser feita visualmente, onde o limite de detecção é
o menor valor de concentração capaz de produzir o efeito esperado (mudança de cor,
turvação, etc). No caso de métodos instrumentais (CLAE, CG, absorção atômica), a
estimativa do limite de detecção pode ser feita com base na relação de 3 vezes o ruído da
linha de base. Podendo ser determinado pela equação 15.
LD = ,/ 1 *3 (15)
Em que DPa é o desvio padrão do intercepto com o eixo do Y de, no mínimo, 3
curvas de calibração construídas contendo concentrações do fármaco próximas ao suposto
21
limite de quantificação. Este desvio padrão pode ainda ser obtido a partir da curva de
calibração proveniente da análise de um número apropriado de amostras do branco; S é a
sensibilidade do método.
No caso dos processos estatísticos, utiliza-se o "teste de hipótese" para estimar o LD
com valores obtidos de várias medidas do branco, conforme a Equação 16.
LD = 2 ∗ DP3 ∗ t45%S
(16)
Em que t 95% é o valor tabelado em função do número de análises; DPb é o desvio-
padrão do branco. Quando se obtém poucos valores de medidas do branco ou quando tais
valores se apresentam como linha de base, esse tipo de estimativa pode não ser adequado.
2.7.10- Limite de quantificação (LQ)
A RESOLUÇÃO Nº899 (2003) define limite de quantificação como sendo a menor
quantidade do analito em uma amostra que pode ser determinada com precisão e exatidão
aceitáveis sob as condições experimentais estabelecidas.
O limite de quantificação é estabelecido por meio da análise de soluções contendo
concentrações decrescentes do analito até o menor nível determinável com precisão e exatidão
aceitáveis. Pode ser expresso pela equação 17.
LQ = ,/31 *10 (17)
2.8- Estatística
2.8.1- Importância da estatística
Ao propormos ou validarmos uma metodologia em nível de laboratório, infelizmente,
não existe nenhum método amplamente aplicável para a determinação da confiabilidade de
um dado com absoluta certeza. O uso da estatística na análise dos dados experimentais é de
suma importância para que um resultado analítico possua uma confiabilidade aceitável.
A confiabilidade necessária de um resultado justifica o esforço extra requerido para
que análises em replicatas sejam realizadas, uma vez que os resultados individuais de um
conjunto de medidas raramente são iguais.
22
KEITH et al. (1983) fazem relevante observação sobre a estatística na tomada de
decisões:
“Químicos analíticos sempre devem enfatizar ao público que a característica mais
importante de qualquer resultado obtido de uma ou mais medidas analíticas é uma afirmação
adequada de seus intervalos de incerteza. Advogados geralmente tentam prescindir de
incertezas e tentam obter sentenças inequívocas; portanto, um intervalo de certeza deve ficar
claramente definido no caso que envolvem questões judiciais e/ou processos de execução. Por
outro lado, um valor de 1,001 sem uma incerteza especificada, por exemplo, pode ser visto
como excedendo um nível tolerável de 1.”
2.8.2- Testes estatísticos
Para que se possa estabelecer uma comparação entre dois conjuntos de dados é
necessário fazer uma comparação de médias e variância já que o pesquisador precisa de um
método que forneça a diferença mínima significante entre duas médias.
Toda vez que o valor absoluto da diferença entre duas médias é igual ou maior do
que a diferença mínima significante, as médias são consideradas estatisticamente diferentes,
ao nível de significância estabelecida (VIEIRA et al., 1989).
Segundo VIEIRA et al. (1989), a comparação de médias só pode ser feita após a
análise de variância. Isto porque todos os procedimentos para obter o desvio de médias
exigem o cálculo do quadrado médio do resíduo.
Segundo FONSECA et al. (1982) o método de análise de variância indica a aceitação
ou rejeição da hipótese de igualdade das médias. Se a hipótese de nulidade (Ho) for rejeitada,
estaremos admitindo que, pelo menos, uma das médias é diferente das demais.
2.8.2.1- Teste de Hipóteses
Os testes de hipóteses constituem procedimentos estatísticos cujo maior objetivo é
tomar decisões baseadas nas evidências fornecidas pelos dados amostrais ou populacionais.
Supondo que seja levantada uma hipótese sobre o valor do parâmetro, essa hipótese será
considerada até que prove o contrário Deste modo, o teste de hipótese é o procedimento que
nos fará tomar a decisão de rejeitar ou não determinada hipótese. Para formulação levantamos
duas hipóteses:
Hipótese nula (Ho): Sugere que a afirmação que estamos fazendo sobre o parâmetro
23
populacional ou amostral é verdadeira. Ho, portanto sempre inclui o sinal de igualdade.
Hipótese alternativa (Ha): Sugere que a afirmação que estamos fazendo sobre o
parâmetro populacional ou amostral é falsa, isto é, que o valor do parâmetro é diferente,
menor ou maior que o estipulado. Há, portanto, inclui sempre o sentido de variação.
Para tomarmos a decisão em um teste estatístico, isto é, decidirmos se rejeitamos ou
não a hipótese de nulidade precisamos comparar o valor especificado para o parâmetro com
aquele estimado a partir de uma amostra da população.
Do ponto de vista matemático, o valor estimado pode diferir do valor esperado para o
parâmetro. Esta diferença matemática nem sempre representa que a hipótese de nulidade deva
ser rejeitada, pois como o valor estimado é uma variável aleatória, é esperado que ele assuma
valor esperado dentro de um intervalo.
O que um teste de hipóteses faz é comparar o valor especificado para um parâmetro
com a estimativa fornecida pelo estimador. Se a variação entre os dois valores for pequena
diz-se que o valor do parâmetro é realmente o especificado. Logo, a diferença entre o valor
paramétrico e sua estimativa não é significativa e não se rejeita a hipótese de nulidade.
2.8.2.2- Teste F para comparação de variâncias
Suponha que queremos comparar as variâncias σ12 e σ2
2 de duas populações normais
independentes. Para isso, retiramos uma amostra aleatória X1, X2, ..., Xn1 da população 1, com
distribuição N (µ1, σ12), e uma amostra Y1, Y2, ..., Yn2 da população 2, com distribuição N(µ2,
σ22).
Primeiramente, como em qualquer outro teste, precisamos fazer a formulação das
hipóteses, que nesse caso são dadas pelas Equações 18 e 19.
(18)
(19)
Nesta formulação de hipótese, a hipótese nula é que o desvio padrão dos conjuntos
populacionais é estatisticamente igual. A hipótese alternativa, por sua vez, afirma que o
desvio padrão dos conjuntos populacionais é estatisticamente diferente. (GUIMARÃES,
2008).
Quando desejamos comparar variâncias, devemos utilizar a estatística F (ou teste de
Fisher-Snedecor). O Fcalculado ou simplesmente Fc é dada pelo quociente entre as duas
24
estimativas de variâncias ao quadrado. Assim, é preciso utilizar n-1 graus de liberdade para
cada um dos conjuntos de amotras (neste caso utiliza-se o desvio padrão amostral) ou
populações (neste caso utiliza-se o desvio padrão populacional).
(20)
O Fcrítico ou Ftabelado é obtido na tabela da distribuição F apresentada no ANEXO 1,
com n1-1 e n2-1 e com um nível de confiabilidade α fixado. Em que n1 é o número de
elementos da população 1 e n2 é o número de elementos da população 2.
A conclusão do teste pode ser feita comparando o valor de F calculado com os dados
da amostra (Fc) e o valor de F tabelado (Fcrítico), obtido na tabela da ditribuição F. Assim, se
Fc≥ Fcrítico, rejeita-se Ho. Neste caso não podemos dizer, a nível α de confiança que as
variâncias dos dois conjuntos populacionais são estatisticamente iguais. Se, por outro lado,
Fc< Fcrítico podemos inferir a nível α de confiança que as variâncias dos dois conjuntos
populacionais são estatisticamente iguais.
2.8.2.2- Teste T para comparação de médias
Fazer a comparação de médias de dois conjuntos amostrais ou populacionais é de
suma importância em validação de um método analítico, isto porque é através deste que
podemos considerar que dois métodos fornecem valores médios estatisticamente iguais.
Para realizarmos este teste, precisamos primeiramente ter realizado o teste F. Isto
porque o teste de comparação de médias se difere para casos em que foi comprovada
igualdade estatística entre as variâncias dos casos em que não foi comprovada igualdade
estatística entre as variâncias. Consideremos uma das seguintes hipóteses:
Ho: µ1 = µ2
Ha: µ1 < µ2
(21)
Ho: µ1 = µ2
Ha: µ1 > µ2
(22)
Ho: µ1 = µ2
(23)
25
Ha: µ1 ≠ µ2
As duas primeiras hipóteses estabelecem os chamados testes unilaterais, já que a
região de rejeição está somente em uma das caudas da distribuição. A última situação
estabelece o teste bilateral, no qual a região de rejeição se distribui igualmente em ambas as
caudas da distribuição.
Assim, se estivermos interessados em mostrar que um parâmetro é significativamente
superior ou inferior a um determinado valor, teremos que realizar um teste unilateral e
teremos uma única região de rejeição, do tamanho do nível de significância fixado. Mas se, no
entanto, estivermos interessados em mostrar que um determinado parâmetro é diferente de um
determinado valor (sem especificar se inferior ou superior) teremos que realizar um teste
bilateral e a região de rejeição será dividida em duas partes iguais, nas extremidades da curva
do teste, em que cada região de rejeição terá metade do nível de significância. Dessa forma,
para realização do teste, deveremos primeiramente estimar a média e o desvio padrão de cada
uma das amostras envolvidas e calcular a estatística do teste. (GUIMARÃES, 2008)
A Equação 24 é a estimativa do parâmetro t de t de Students e deve ser utilizada
quando o teste F mostrar equivalência estatística entre as variâncias da amostra.
t = μ8 −μ�Sp.< 1n8 + 1n�
(24)
O parâmetro Sp é calculado pela Equação 25:
Sp = �n8 − 1�. s8� + �n� − 1�. s��n8 +n� − 2 (25)
No caso em que o Teste F não ter mostrado equivalência estatística entre as
variâncias, deve-se utilizar a Equação 25.
t = μ8 −μ�@s8�n8 + s��n�
(26)
26
Em que:
µ1 e µ2 são as médias do grupo 1 e 2, respectivamente;
S1 e S2 são os desvios padrões do grupo 1 e 2 respectivamente;
n1 e n2 são os tamanhos de amostra do grupo 1 e 2 respectivamente.
Para o caso de testes bilaterais, rejeita-se Ho se Tcalculado > t (α/2) n1+n2-2,
com nível α de significância. O valor de t (α/2) n1+n2-2 é tabelado conforme a distribuição T
de Student apresentada no ANEXO 1.
2.9- Gerenciamento de Resíduos gerados em Laboratórios
Em laboratórios de análises químicas, os resíduos gerados merecem uma
considerável atenção, já que estes apresentam elevada complexidade, principalmente pela
inconstância e variação do nível de toxidade, bem como das características físico-químicas
dos compostos. Outro aspecto é a complexidade, em nível de estrutura dos compostos, que
torna tal gerenciamento uma atividade difícil. Além disso, os resíduos gerados em unidades
laboratoriais são, muitas vezes, manuseados inadequadamente e tem-se observado que os
resíduos que apresentam maior periculosidade são acondicionados e armazenados no próprio
laboratório, em áreas inseguras, e outros com menor periculosidade são descartados
diretamente na pia (SCHNEIDER, 2007).
Surge então, a necessidade de um gerenciamento capaz de minimizar a geração de
resíduos, além de tratar aqueles que não são passíveis de serem evitados. Além disso, é
necessária também uma racionalização dos reagentes, visando maior economia dos mesmos, o
que garante um melhor aproveitamento do ponto de vista econômico, bem como ambiental,
devido a menor geração de resíduos.
A prevenção da poluição é a forma mais eficaz para preservação ambiental. Se não
for possível reduzir a fonte de geração de resíduo, deve-se promover a reciclagem do mesmo
de forma ambientalmente segura. Se ainda assim, a reciclagem não for possível, então a
poluição deve ser evitada, com modificação na metodologia analítica ou tratamento do
resíduo gerado. O descarte no ambiente deverá ser entendido e praticado como último recurso,
sendo realizado de maneira ambientalmente segura.
A implementação de um programa de gestão de resíduos é algo que exige, antes de
tudo, mudança de atitudes, e por isto, é uma atividade que traz resultados a médio e longo
prazo, além de requerer realimentação contínua. (JARDIM, 1997)
27
3- METODOLOGIA
3.1- Amostragem
Coletou-se amostras da cultura de feijão-vagem (Phaseolus vulgaris) do tipo Rudá,
BRS Esplendor Yoki, além de amostras de Folha de Arroz e Braquiária (Brachiaria
ruziziensi), selecionando-se brotos e folhas verdes. O material foi coletado em quantidade
suficiente para as análises subsequentes.
3.2- Preparação das amostras para análise química
Antes das análises químicas, preparou-se as amostras de mandeira que o primeiro
passo foi a descontaminação do material foliar. Realizou-se uma lavagem com água destilada,
a seguir com detergente neutro, na concentração de 0,1%. Em seguida, o material foi
novamente lavado com água destilada.
Após o processo de lavagem, as amostras foram submetidas à secagem em estufa
com temperatura controlada em 80°C (+/-5°C) por 24 horas.
Depois de seco, o material foi moído em moinho de facas de aço inoxidável (tipo
Willey). No intervalo de moagens entre as amostras de Feijão-Vagem e Braquiária realizou-
se a limpeza do moinho com auxílio de escova plástica e aspirador.
3.3- Lavagem e descontaminação de vidrarias
Durante as análises, todas as vidrarias utilizadas foram lavas e descontaminadas. Na
descontaminação das vidrarias, fez-se a lavagem das mesmas com detergente neutro e em
seguida estes foram enxaguados com água corrente. Após esta etapa, cada vidraria foi
enxaguada três vezes com água deionizada (Mili Q- System Millipore, Bedford, MA) e
descontaminadas em seguida com a imersão das mesmas em solução de ácido nítrico (5%)
por 24 horas. Por fim, as vidrarias foram enxaguadas novamente com água deionizada.
3.4- O método Kjeldahl
3.4.1- Insumos, equipamentos e utensílios
Insumos:
• Mistura catalisadora: sulfato de potássio (K2SO4) e sulfato de cobre penta-
28
hidratado (CuSO4.5H2O);
• Ácido sulfúrico (H2SO4) P.A 98%;
• Solução de NaOH 40%;
• Solução Indicadora de H3BO3 2%;
• Solução Fatorada de H2SO4 0,01 mol/L
Equipamentos e Utensílios:
• Tubos de digestão;
• Frascos conta-gotas;
• Erlenmeyer de 125 mL;
• Proveta graduada de 50 mL;
• Béquer 100 mL.
Instrumentos de medição e equipamentos:
• Balança analítica;
• Balança analítica;
• Bloco digestor para 40 tubos;
• Tubo digestor de 100 mL ou balão Kjeldahl de 100 mL;
• Destilador de Nitrogênio;
• Bureta eletrônica;
• Dispensador para ácido sulfúrico;
• Dispensador para solução indicadora de H3BO3 2%.
29
3.4.2- Digestão úmida para o método Kjeldahl
Pesou-se 40 tubos de ensaio (1 bateria) e com uma caneta de retroprojetor
identificou-se com números sequenciais os tubos de digestão limpos e secos. O número de
cada tubo, bem como o peso dos tubos vazios foram anotados em uma planilha de registro de
dados brutos.
A seguir foram pesados em torno de 0,1000 a 0,1500 g de amostra de cada amostra
em balança analítica e o peso exato foi anotado. Essas amostras foram pesadas em papel
vegetal livre de nitrogênio para que não ficasse nenhuma massa retida na parede do tubo de
ensaio, garantindo a posterior digestão completa de toda a amostra pesada. Cada papel livre
de nitrogênio, contendo uma amostra foi empacotado e adicionado a um tubo, exceto no caso
do branco, em que o papel não continha nenhuma amostra.
Com o auxílio de uma colher dosadora, adicionou-se 1,2 g da mistura de sais
catalisadora. Em seguida, os tubos foram levados para capela e o exaustor foi ligado.
Utilizando-se um dispensador de ácido sulfúrico, adicionou-se 3,5 mL de ácido concentrado
98% PA em cada tubo de digestão.
A seguir, os tubos foram colocados no bloco digestor e a temperatura do mesmo foi
aumentada até 360°C de forma lenta e gradativa.
3.4.3-Destilação
Para destilação das amostras, utilizou-se o Destilador de Nitrogênio Marconi MA-
036 (Figura 3).
Figura 3- Destilador de Nitrogênio Marconi MA-036
30
Neste processo, deslocou-se a mesa suporte do erlenmeyer e introduziu-se pelo bico
do condensador um erlenmeyer contendo 20 mL de solução indicadora de ácido bórico 2%.
Essa solução foi transferida utilizando-se um dispensador de líquidos dedicado à solução de
ácido bórico.
Para que o bico do condensador ficasse submerso na solução de ácido bórico,
evitando a perda de nitrogênio não condensado, regulou-se a altura da mesa através do
parafuso com canopla presente na mesa.
O tubo de digestão com o produto digerido foi acoplado ao bocal apropriado para
que não houvesse vazamento de nitrogênio. No copo de soda do destilador, foi adicionado
12,5 mL de solução de hidróxido de sódio, com o auxílio de uma proveta de 25 mL. Em
seguida, a torneira frontal foi aberta lentamente para a passagem da solução de hidróxido,
iniciando-se assim a destilação.
Foi coletado 50 mL de destilado de cada amostra, que por sua vez foi titulado com
ácido sulfúrico 0,01 mol/L, conforme o item 3.4.4.
3.4.4- Titulação
Utilizando-se uma bureta eletrônica, titulou-se o destilado utilizando a solução
padronizada de ácido sulfúrico 0,01 mol/L. O volume de ácido gasto para viragem foi anotado
para que fosse possível calcular a concentração de nitrogênio total presente na amostra.
3.5- O método espectrofotométrico baseado na reação de Berthelot
3.5.1- Insumos, equipamentos e utensílios
Para as análises de nitrogênio via método espectrofotométrico, utilizou-se em cada
amostra:
• 1g de sulfato de potássio (K2SO4) com pureza do reagente apresentada nas
especificações do rótulo de 99% e quantidade máxima de nitrogênio de 0,0005%;
• 35 mg de selênio metálico ;
• 3 mL de ácido sulfúrico (H2SO4) P.A 98%
• 2 mL de peróxido de hidrogênio (H2O2) 30%
• 8 mL de R1 + 1,5 mL de R2 (Estes reagentes serão detalhados no item 3.5.2)
31
Para as análises os seguintes instrumentos foram utilizados:
• Tubos de digestão: tubo micro em vidro borossilicato de 100mL (25x250mm);
• Dispensador graduado de 0 a 20 mL;
• Suporte para tubos;
• Espátula (de material polimérico ou aço inox).
• Balança analítica;
• Bloco digestor com capacidade para 40 provas micro. Controle de temperatura
digital; Temperatura: de ambiente +7 até 450ºC; Sensor: tipo J; Precisão: ±2ºC;
Uniformidade: ±5ºC; Potência da resistência: 2200 Watts; Gabinete: em aço
inoxidável 304; Bloco em alumínio fundido com profundidade dos orifícios de
45mm; Segurança: resistência blindada evitando contato com o ácido; Tensão:
220 Volts.
3.5.2- Preparo de soluções
• Reagente 1 (R1)
Em uma balança analítica pesou-se 32,68 g de Salicilato; 56,96 g de Fosfato de
Sódio Dibásico e 1 g de Nitroprussiato. Em um béquer de plástico de 2L foram adicionados
aproximadamente 800 mL de Água Deionizada. Em seguida, adicionou-se o Salicilato e o
Fosfato de Sódio Dibásico pesados anteriormente e agitou-se a mistura até que os mesmos
fossem dissolvidos. Com o auxilio de um pHmetro, ajustou-se o pH para 13,1 com uma
solução de NaOH 40%. Adicionou-se o nitroprussiato e manteve a agitação até que o mesmo
fosse dissolvido. Em seguida a solução foi transferida para um balão volumétrico de 2L e
aferiu-se o volume. A Figura 4 mostra a etapa de agitação no preparo do reagente R1.
32
Figura 4- Preparação do reagente R1
• Reagente 2 (R2)
Diluiu-se 20mL da solução de hipocolrito de sódio 6% em 1000mL de água
deionizada.
33
3.5.3- Digestão úmida para o método espectrofotométrico baseado na reação de
Berthelot
Pesou-se 40 tubos de ensaio (1 bateria) e com uma caneta de retroprojetor
identificou-se com números sequenciais os tubos de digestão limpos e secos. O número de
cada tubo, bem como o peso dos tubos vazios foram anotados em uma planilha de registro de
dados brutos.
A seguir foram pesados em torno de 0,1000 a 0,1500 g de amostra de cada amostra
em balança analítica e o peso exato foi anotado. Essas amostras foram pesadas em papel
vegetal livre de nitrogênio para que não ficasse nenhuma massa retida na parede do tubo de
ensaio, garantindo a posterior digestão completa de toda a amostra pesada. Cada papel livre
de nitrogênio, contendo uma amostra foi empacotado e adicionado a um tubo, exceto no caso
do branco, em que o papel não continha nenhuma amostra. A Figura 5 retrata a pesagem das
amostras.
Figura 5- Pesagem das amostras em papel livre de Nitrogênio
A seguir, adicionou-se, com o auxilio de uma colher dosadora, aproximadamente 1,0
g de sulfato de potássio e 35 mg de Selênio (Figura 6). Os tubos de digestão contendo as
amostras foram levados para a capela e o exaustor foi ligado.
Figura 6- Sais catalisadores da digestão
34
Com auxílio do dispensador adicionou-se a cada tubo de digestão 3,5 mL de ácido
sulfúrico PA, e deixou-os em over night. A seguir, adicionou-se 2,0mL de Peróxido de
Hidrogênio a 30% e com o auxílio do suporte para tubos colocou-se os mesmos no bloco
digestor.
Em seguida, regulou-se a temperatura do bloco digestor para 360º C e os tubos foram
mantidos no bloco por 3h após atingir esta temperatura. (Figura 7)
Figura 7- Digestão das amostras em bloco digestor
Em casos que foram formados materiais carbonizados nas paredes do tubo, a
seguinte metodologia foi realizada: O tubo foi retirado cuidadosamente do bloco digestor,
inclinou-se o tubo e este foi girado para que o ácido entrasse em contato com o material
carbonizado na parede do tubo, direcionando assim todo o material ao fundo do mesmo. Este
procedimento dói feito com muito cuidado para que não fosse derramado nenhum material
durante o procedimento.
Ao término da digestão, retirou-se os tubos do bloco e esperou-se até que os mesmos
estivessem resfriados à temperatura ambiente. A Figura 8 mostra o tubo da esquerda com a
amostra após 1 hora de digestão e o tubo da direita com a amostra no final da digestão.
35
Figura 8- Diferença da amostra na primeira hora da digestão e ao término da digestão.
Após resfriados, foram adicionados a cada tubo 40mL de Água Deionizada e em
seguida, pesou-se os tubos contendo o extrato.
Após a pesagem, os tubos foram agitados por aproximadamente 40 segundos até que o
sólido contido no fundo deste fosse dissolvido.
3.5.4- Diluição intermediária
Pipetou-se do tubo digestor 0,5mL e este foi transferido para um tubo de ensaio. Em
seguida adicionou-se 9,5mL de Água Deionizada e agitou-se. Da diluição intermediaria
retirou-se uma alíquota de 0,5mL e transferiu-a para um tubo micro borosilicato, marca Pirex.
Adicionou-se em seguida 8,0mL do R1 e 1,5 mL do R2, nesta ordem. Os tubos foram
fechados imediatamente. A Figura 9 mostra a etapa de adição dos reagentes utilizando pipetas
automáticas. Na esquerda está representada a adição do Reagente R1 e na direita a adição do
Reagente R2.
Figura 9- Adição dos reagentes R1 e R2.
36
3.5.5- Leitura das amostras
Para a leitura das amostras foi utilizado o espectrofotômetro HACH DR2800 (Figura
10). Ajustou-se o comprimento de onda (λ) para 685nm e o equipamento foi zerado com o
padrao de zero. Em seguida foi anotado a Absorbância de cada leitura.
Figura 10- Espectrofotômetro HACH DR2800
3.6- Validação
3.6.1- Teste de Especificidade
Para o teste de especificidade preparou-se em triplicata duas soluções padrão de 100
ppm contendo possíveis interferentes. A primeira solução foi preparada com 1,19 ppm de
fósforo e a segunda solução contendo 0,06 ppm de manganês. O procedimento para diluição
intermediária, adição dos reagentes e leitura são idênticos aos aplicados para as amostras.
Além das duas soluções contendo quantidades conhecidas dos possíveis interferentes, foi
preparada, também em triplicata, uma solução padrão de 100 ppm sem interferentes. Após a
leitura, verificou-se a possível interferência destes elementos na determinação de nitrogênio
pelo método espectrofotométrico.
3.6.2- Faixa de trabalho/Teste de Linearidade/Teste de Sensibilidade
A faixa de trabalho foi determinada preparando-se padrões em triplicata de 0, 5, 10,
15, 20, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 180, 210, 240, 270 e 300 ppm de amônio. Após este preparo
realizou-se o procedimento para diluição intermediária, adição dos reagentes e leitura
idênticos aos aplicados para as amostras. Em seguida, construiu-se a curva da absorbância
37
pela concentração dos padrões, obtendo em seguida o coeficiente de correlação da curva.
Para o teste de linearidade, preparou-se em triplicatas soluções padrão de 25, 50, 75,
100, 125 e 150 ppm de amônio, além de triplicatas de brancos (soluções preparadas sem
adição do analito). Após a leitura, construiu-se uma curva da absorbância pela concentração e
calculou-se os coeficientes angulares e lineares da curva de calibração, bem como o
coeficiente de correlação. O coeficiente angular da curva de calibração é determinado como o
fator de sensibilidade do método (S).
3.6.3- Teste de Exatidão/Teste de Precisão
Para o teste de exatidão, utilizou-se como referência uma amostra certificada pela
IPE- International Plant-Analytical Exchange (IPE sample 903). Esta amostra foi analisada
pelos método de Kjeldahl e pelo método espectrofotométrico. Os valores obtidos foram
comparados e em seguida determinou-se a exatidão de cada método.
Para o teste de precisão fez-se as análises de nitrogênio em quintuplicata pelo método
espectrofotométrico para as amostras de Folha de Arroz, Braquiária, Feijão Rudá, Feijão
Esplendor e Feijão Yoki. Dos resultados obtidos fez-se a média, o desvio padrão e calculou-se
o coeficiente de variação de cada conjunto de quintuplicatas. Após este processo, determinou-
se o coeficiente de variação (CV%) médio do método.
3.6.4- Teste de decomposição dos reagentes
Para realização do teste de decomposição dos reagentes, preparou-se em um dia o
reagente R1 e R2 e em seguida, realizou-se o processo de análise do teor de nitrogênio das
amostras padrão de 0 a 150 ppm. Em uma segunda bateria de análises, preparou -se em um
dia o reagente R2 e na semana seguinte, preparou–se o reagente R1, fazendo em seguida a
leitura das amostras. Por último, realizou-se as mesmas análise com os reagentes R1 e R2
velhos, isto é, preparados ambos na semana anterior.
O resultado destas análises foram plotados em uma curva de absorbância por
concentração do padrão e em seguida analisados.
3.6.5- Teste da estabilidade da coloração
Para realização do teste da estabilidade da coloração verde obtida após a adição dos
reagentes nos extratos diluídos, realizou-se a leitura no espectrofotômetro da absorbância de
uma amostra em intervalos de tempo de 10 em 10 minutos por 4 horas e anotou-se cada
38
leitura em uma planilha de registro de dados brutos. Feito isto, plotou-se uma curva das
absorbâncias medidas por tempo.
3.6.6- Limite de detecção e Limite de quantificação
O limite de detecção e de quantificação foram obtidos calculando o desvio padrão da
absorbância observada a partir da leitura de 10 amostras de branco realizadas em dias
diferentes. Além disso, utilizou-se a sensibilidade do método, calculada no item 3.6.2.
3.6.7- Comparação de Média e Variância
A comparação de médias e variâncias foi feita a partir das análises de nitrogênio em
quintuplicata pelo método de Kjeldahl e pelo método espectrofotométrico para as amostras de
Folha de Arroz, Braquiária, Feijão Rudá, Feijão Esplendor e Feijão Yoki. A partir das análises
foi calculado as médias, variâncias e desvio padrão de cada conjunto de quintuplicas. Em
seguida, aplicou-se o Teste F para comprovar se havia ou não igualdade estatística entre as
variâncias dos dois métodos e aplicou-se o Teste T para comprovar se havia ou não igualdade
estatística entre as médias dos dois métodos.
3.7- Tratamento dos resíduos gerados pelas análises químicas
3.7.1- Tratamento de resíduos contendo cobre
Para reduzir o volume de resíduos de cobre gerados pelas análises, fez-se a
decantação dos íons Cu2+ na forma de hidróxidos insolúveis. Para tanto, esperou-se a
decantação do resíduo básico formado nas análises e em seguida, fez-se a sifonação, retirando
o sobrenadante e descartando-o na pia. O sólido formado foi seco em estufa e encaminhado ao
GERELAB (Gerenciamento de Resíduos Químicos de Laboratório) da EMBRAPA Arroz e
Feijão.
A reação que se segue é a de formação do composto sólido insolúvel hidróxido de
Cobre-Cu(OH)2.
CuSO�� B� + 2NaOH� B� → Cu�OH���-� + Na�SO�� B�
3.7.2 Tratamento de resíduos contendo selênio
A solução ácida de selênio foi tratada com metabissulfito de sódio (Na2S2O5),
39
ocorrendo a precipitação de um sólido vermelho que é uma das formas alotrópicas desse
elemento, tendo uma estrutura semelhante àquela do enxofre amarelo (S8). Abaixo está a
reação de redução com metabissulfito de sódio.
8SeO��E + 8Na�S�O5 → SeF ↓ +8Na�SO� + 8SO��E
Em seguida fez-se a neutralização com hidróxido de sódio (NaOH), e esperou-se até
ocorrer a decantação. Logo em seguida, retirou-se o sobrenadante por sifonação, descartando-
o na pia. O precipitado de coloração vermelha (S8) foi seco e encaminhado ao Gerelab. A
reação de neutralização segue abaixo.
H�SO� + 2NaOH → Na�SO� + 2H�O
4- RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1- Reagentes utilizados nos métodos
O catalisador da reação de Berthelot Modificada, utilizado na determinação de
nitrogênio pelo método espectrofotométrico é o selênio metálico. Este não interfere na
coloração final após a adição dos reagentes colorimétricos. O sulfato de cobre, por sua vez,
tem uma coloração levemente azulada e interfere na coloração obtida após a adição dos
reagentes colorimétricos. Esta interferência é significante na absorbância detectada pelo
espectrofotômetro e poderia levar a erros consideráveis nas análises de nitrogênio.
Ambos catalisadores são considerados tóxicos, sendo assim, o resíduo gerado pelas
análises dos dois métodos foram devidamente tratados.
4.2- Digestão úmida
A digestão úmida é bastante operacional, pois trabalha com tubos de digestão em
estantes, porém existe a desvantagem da necessidade desta exigir um sistema de exaustão.
Durante a digestão úmida ocorre a liberação de vapores ácidos oxidantes já que neste
processo, a matéria orgânica é oxidada e expelida na forma de gases (CO2, NOx e H2O).
Ao final da digestão úmida, a amostra de brachiaria não foi digerida totalmente,
restando material particulado no fundo do tubo. Do ponto de vista analítico, isso acarretaria
menor recuperação de nitrogênio, podendo acarretar em erro negativo nas análises. Contudo,
40
foi observado nas análises realizadas pelo Laboratório de Análises Agroambientais da
Embrapa Arroz e Feijão, que alguns tipos de tecido vegetal não digerem totalmente nem
perdurando o tempo no bloco digestor. Isso ocorre devido a existência de compostos
orgânicos (principalmente a lignina) que são mais resistentes ao ataque ácido e térmico. A
lignina, um polímero não-carboidrato é um dos principais componentes responsáveis pela
queda da digestibilidade dos nutrientes das plantas forrageiras. (FUKUSHIMA et al, 1999)
4.3- Validação do método
4.3.1-Teste de especificidade
A HACH, fabricante do espectrofotômetro presente no laboratório L.A.A, testou
possíveis interferentes na determinação de nitrogênio pelo método espectrofotométrico e
apresentou em seu manual a quantidade máxima testada sem que fosse observado
interferência na leitura. Além disso, está apresentada no Handbook de tecido vegetal (MILLS;
JONES, 1996), a quantidade máxima de diversos nutrientes que pode ser encontrada em
amostras de tecido vegetal, sendo possível conhecer a quantidade máxima destes nutrientes
nos extratos analisados pelo método em questão. O fósforo e manganês foram os únicos
elementos em que a quantidade máxima possível de ser encontrada nos extratos foi superior a
máxima testada pela HACH. Desta forma, foi feito neste trabalho, o teste de especificidade
apenas para os elementos fósforo e manganês e a quantidade máxima destes minerais no
extrato e testados pela HACH são apresentados na Tabela 1.
Tabela 1- Quantidade máxima de minerais presentes no extrato e quantidade máxima testada
pela HACH.
Quantidade máxima em tecido
vegetal presente no extrato
(ppm)
Máximo testado pela HACH
(ppm)
Fósforo 1,19 0,65
Manganês 0,06 0,05
A escolha pelo padrão de 100 ppm de amônio na elaboração do teste foi feita pelo
fato deste ser um valor médio de nitrogênio observado nos extratos das análises de amostras
de tecido vegetal. A Tabela 2 mostra a absorbância lida das triplicatas sem interferentes; com
1,19 ppm de fósforo e com 0,06 ppm de manganês.
Tabela 2- Absorbância do padrão de 100 ppm de amônio sem e com possíveis interferentes.
Sem interferentes
P
Mn
Estes valores foram plotados
proximidade das leituras obtidas para o padrão de 100 ppm.
Figura 11- Curva padrão e absorbância do padrão de 100 ppm de amônio sem e com
Assim, a partir da média dos valores de cada triplicata, a Tabela 3 apresenta
interferência máxima na leitura ca
Tabela
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0
Ab
sorb
ân
cia
1,19 ppm de fósforo e com 0,06 ppm de manganês.
Absorbância do padrão de 100 ppm de amônio sem e com possíveis interferentes.
Padrões (ppm de amônio) Absorbância100 0,245 100 0,252
100 0,240
Estes valores foram plotados (Figura 11) de forma a ser possível observar a
proximidade das leituras obtidas para o padrão de 100 ppm.
Curva padrão e absorbância do padrão de 100 ppm de amônio sem e com
possíveis interferentes.
, a partir da média dos valores de cada triplicata, a Tabela 3 apresenta
máxima na leitura causada por interferentes.
Tabela 3- interferência máxima na leitura.
y = 0,002x + 0,001
R² = 0,999
50 100 150
Concentração de amônio (ppm)
Curva Padrão
Padrão de 100 ppm com fósforo
Padrão de 100 ppm com manganês
41
Absorbância do padrão de 100 ppm de amônio sem e com possíveis interferentes.
Absorbância 0,242 0,240 0,240 0,244
0,245 0,244
de forma a ser possível observar a
Curva padrão e absorbância do padrão de 100 ppm de amônio sem e com
, a partir da média dos valores de cada triplicata, a Tabela 3 apresenta a
200
42
Interferência (%)
Fósforo 1,23
Manganês 0,27
Estes valores de interferência são muito baixos (<5%) e não são considerados
significativos pelos solicitantes das análises feitas pelo Laboratório de Análises
Agroambientais.
4.3.2- Faixa de trabalho, linearidade e sensibilidade
A Figura 12 mostra a faixa de trabalho testada para o método espectrofotométrico de
determinação de Nitrogênio.
Figura 12- Faixa de trabalho testada
Com o coeficiente de correlação de 0,996 é possível inferir que o método em questão
é capaz de fornecer resultados satisfatórios para amostras com concentrações entre 0 e 300
ppm.
A figura 13 mostra o resultado do teste de linearidade e sensibilidade do método.
y = 0,004x + 0,013
R² = 0,996
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0 50 100 150 200 250 300 350
Ab
sorb
ân
cia
-6
85
nm
Concentração (ppm)
43
Figura 13- Linearidade e sensibilidade do método
A boa aproximação dos pontos a uma curva linear nos testes de faixa de trabalho,
linearidade e sensibilidade mostra que a menor diferença de concentração do analito gera a
maior diferença na absorbância. Assim, se duas amostras apresentarem uma pequena
diferença na concentração de amônio, a análise irá gerar sinais diferentes suficientemente para
distinguir a concentração das duas amostras. Dessa forma, o método em questão é dito
sensível a concentração de amônio. A sensibilidade em questão é o coeficiente angular da
curva de regressão (S=0,002).
4.3.3- Teste de Exatidão
A tabela 4 mostra as concentrações de nitrogênio obtidas pelos métodos
espectrofotométrico e pelo método Kjeldahl a partir de uma amostra certificada pela
Internacional Plant-Analytical Exchange (IPE sample 903).
Tabela 4- Teor de nitrogênio na amostra certificada obtido pelos métodos avaliados
Método
Espectrofotométrico Método Kjedahl
Valor Certificado
N (g/kg)
44,93 Média 44,63 Média 45,4 - 46,5
47,07
45,60 45,13
44,78 Média Esperada
44,80 44,59 45,95
A partir da média dos valores obtidos em ambos os métodos, determinou-se o erro
y = 0,002x + 0,003
R² = 0,998
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0 50 100 150 200
Ab
sorb
ân
cia
-6
85
nm
Concentração (ppm)
44
relativo dos métodos em relação ao valor certificado.
Tabela 5- Erro relativo dos métodos em relação ao valor certificado
Método Espectrofotométrico Método Kjedahl
Erro Relativo (%) 0,76 2,54
Assim, é possível verificar que o método espectrofotométrico se mostrou mais exato
que o método Kjeldahl, já que o método espectrofotométrico apresentou um erro relativo em
relação ao valor certificado menor.
4.3.4- Teste de Precisão
A Tabela 6 mostra a média, o desvio padrão e o coeficiente de variação das análises
de nitrogênio obtidas por ambos os métodos.
Tabela 6- Média, desvio padrão e coeficiente de variação das análises obtidas
Amostras Método Espectrofotométrico Método Kjeldahl
Média (g/kg)
Desvio Padrão
CV (%) Média (g/kg)
Desvio Padrão
CV (%)
Folha de arroz
26,46 1,34 5,08 25,66 0,37 1,42
Braquiária 15,36 0,46 3,00 15,09 0,25 1,65
Feijão Rudá
28,45 0,47 1,64 28,89 0,23 0,79
Feijão Esplendor
35,96 1,02 2,84 34,44 0,29 0,84
Feijão Yoki
37,93 1,45 3,83 38,31 0,98 2,56
A tabela 7 mostra o valor médio do coeficiente de variação para cada método.
45
Tabela 7- Coeficiente de variação médio das análises
Teste de Precisão Método Espectrofotométrico Método Kjeldahl
CV médio(%) 3,01 1,42
A partir da análise da Tabela 7 é possível verificar que o método espectrofotométrico
é menos preciso que o método Kjeldahl, isto é, a repetibilidade representada pelo coeficiente
de variação se mostrou mais precisa no método Kjeldahl.
Segundo a Resolução-RE Nº 899, de 29 de maio de 2003, O valor máximo aceitável
para o coeficiente de variação deve ser definido de acordo com a metodologia empregada, a
concentração do analito na amostra, o tipo de matriz e a finalidade do método, não se
admitindo valores superiores a 5%.
Nas análises realizadas no Laboratório de Análises Agroambientais, o teor de
nitrogênio presente nas amostras é baixo, sendo que o valor de CV=3,01% é admitido
aceitável pelos solicitantes das análises.
4.3.5- Teste de Decomposição dos reagentes
O primeiro passo para verificar a possível decomposição dos reagentes R1 e R2, foi
preparar uma curva padrão com os reagentes novos, isto é, preparados no mesmo dia da
realização das análises. A Figura 14 mostra a curva obtida da absorbância pela concentração.
Figura 14- Curva padrão com R1 e R2 novos
O coeficiente de correlação R2=0,996, mostra o bom ajuste linear dos dados obtidos.
y = 0,002x - 9E-05
R² = 0,996
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Ab
sorb
ân
cia
-6
85
nm
Concentração (ppm)
46
Para verificar a possibilidade da preparação do reagente R1 alguns dias antes da análise,
preparou-se o reagente R1 em uma semana e apenas na semana posterior realizou análises de
nitrogênio utilizando este reagente. A Figura 15 mostra a curva obtida.
Figura 15- Curva padrão com R1 velho e R2 novo
O coeficiente de correlação R2=0,997 mostra que não há, ao longo de uma semana,
decomposição do reagente R1, sendo que este pode ser preparado dias antes da análise. Este
teste se mostra importante na validação do método já que a preparação do reagente R1 é uma
etapa lenta no processo, sendo assim, o preparo deste reagente em volumes maiores torna o
processo mais operacional ao analista, que não precisa realizar o procedimento a cada dia.
Por fim, foi realizada as análises de nitrogênio utilizando os dois reagentes (R1 e R2)
velhos, isto é, preparados na semana anterior ao processo de análise. A Figura 16 mostra a
curva obtida.
y = 0,002x - 0,000
R² = 0,997
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0,5
0 50 100 150 200
Ab
sorb
ân
cia
-6
85
nm
Concentração (ppm)
47
Figura 16- Curva padrão com R1 e R2 velhos
Pelo coeficiente de correlação R2=0,999, percebe-se que não há decomposição de
ambos os reagentes com o tempo. Assim, é possível preparar os reagentes e armazená-los para
que se possa ser utilizados nas análises subsequentes.
4.3.6- Teste da estabilidade da coloração
A coloração obtida após a adição dos reagentes colorimétricos ao extrato diluído,
provoca uma coloração verde mais intensa quando há alto teor de nitrogênio na amostra e
menos intensa, quando há baixo teor de nitrogênio na amostra, segundo as reações químicas
apresentadas pelas equações 10, 11 e 12. A Figura 17 mostra, da esquerda para a direita, a
intensificação da coloração verde para o padrão de zero ppm (branco) ao padrão de 150 ppm.
Figura 17- Coloração dos padrões
y = 0,003x + 0,000
R² = 0,999
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0,5
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Ab
sorb
ân
cia
-6
85
nm
Concentração (ppm)
Para verificar a estabilidade da coloração
absorbância de cada padrão pelo tempo. A Figura 18 mostra tal evolução.
Figura 18
A Série azul mostra os valores médios da absorbância dos padrões com o passar do
tempo. As séries vermelha e verde mostram respectivamente, os valores mínimos e máximos
de absorbância obtidos nas leituras dos padrões em cada tempo medido.
A partir da análise desta curva, fica perceptível que a absorbância provocada pela
coloração decai lentamente com o passar do tempo, sendo estável por pelo menos 4 horas.
Além disso, os valores mínimos e máximos obtidos para a absorbância dos padrões mostr
proximidade destes em relação à média, isto é, em cada instante de leitura, não houve
variações significativas de absorbância.
O instante cuja absorbância é máxima acontece por volta de 40 minutos após a adição
dos reagentes colorimétricos, sendo assim
instante ótimo de leitura das amostras.
4.3.7- Limite de Detecção e Limite de Quantificação
A Tabela 8 mostra os valores das absorbância
0,400
0,450
0,500
0,550
0,600
0,650
0,700
0,750
0,8000
:25
0:3
5
0:4
5
0:5
5
1:0
5
Ab
sso
rbâ
nci
a
Para verificar a estabilidade da coloração verde, foi feita uma análise da evolução da
absorbância de cada padrão pelo tempo. A Figura 18 mostra tal evolução.
18- Evolução da absorbância ao longo do tempo
A Série azul mostra os valores médios da absorbância dos padrões com o passar do
tempo. As séries vermelha e verde mostram respectivamente, os valores mínimos e máximos
de absorbância obtidos nas leituras dos padrões em cada tempo medido.
A partir da análise desta curva, fica perceptível que a absorbância provocada pela
coloração decai lentamente com o passar do tempo, sendo estável por pelo menos 4 horas.
Além disso, os valores mínimos e máximos obtidos para a absorbância dos padrões mostr
proximidade destes em relação à média, isto é, em cada instante de leitura, não houve
variações significativas de absorbância.
O instante cuja absorbância é máxima acontece por volta de 40 minutos após a adição
dos reagentes colorimétricos, sendo assim, a partir deste teste, determinou
instante ótimo de leitura das amostras.
Limite de Detecção e Limite de Quantificação
A Tabela 8 mostra os valores das absorbâncias de 10 amostras de zero ppm, isto é,
1:0
5
1:1
5
1:2
5
1:3
5
1:4
5
1:5
5
2:0
5
2:1
5
2:2
5
2:3
5
2:4
5
2:5
5
3:0
5
3:1
5
3:2
5
3:3
5
Tempo (horas)
Média das absorbâncias Absorbância mínima Absorbância máxima
48
verde, foi feita uma análise da evolução da
absorbância de cada padrão pelo tempo. A Figura 18 mostra tal evolução.
tempo
A Série azul mostra os valores médios da absorbância dos padrões com o passar do
tempo. As séries vermelha e verde mostram respectivamente, os valores mínimos e máximos
A partir da análise desta curva, fica perceptível que a absorbância provocada pela
coloração decai lentamente com o passar do tempo, sendo estável por pelo menos 4 horas.
Além disso, os valores mínimos e máximos obtidos para a absorbância dos padrões mostra a
proximidade destes em relação à média, isto é, em cada instante de leitura, não houve
O instante cuja absorbância é máxima acontece por volta de 40 minutos após a adição
, a partir deste teste, determinou-se 40 minutos o
s de 10 amostras de zero ppm, isto é,
3:3
5
3:4
5
3:5
5
49
amostras branco em relação ao nitrogênio.
Tabela 8- Absorbância dos brancos
Brancos Absorbância 1 0,000 2 0,000 3 0,000 4 0,000 5 0,001 6 0,000 7 0,000 8 0,000 9 0,000
10 0,002
Para a determinação do Limite de Detecção (LD) e Limite de Quantificação (LQ),
determinou-se o desvio padrão dos brancos (DPa). Além disso, foi resgatado o coeficiente
angular da curva de calibração, isto é, a sensibilidade do método, de acordo com item 4.3.2.
A Tabela 9 mostra o desvio padrão dos brancos, a sensibilidade do método, bem
como os limites de detecção e de quantificação.
Tabela 9- Limite de Detecção e Limite de Quantificação
Desvio padrão Sensibilidade Limite de Detecção
(LD) Limite de quantificação
(LQ)
0,0007 0,002 0,0079 0,0247
Assim, a partir do Limite de detecção (LD) podemos estabelecer que a menor
quantidade de analito que é "significativamente diferente" de um branco é 0,0079 ppm. Além
disso, pelo Limite de quantificação (LQ) podemos estabelecer que o sinal suficientemente
forte para ser medido com mais exatidão é aquele gerado por uma concentração de analito
igual a 0,0247 ppm.
4.3.8- Comparação de média e variância
A partir dos dados obtidos pela Tabela 6, foi possível construir a Tabela 10, em que é
mostrado os valores dos testes de hipóteses F e T. Os valores calculados foram obtidos a partir
50
da média e do desvio padrão das concentrações de nitrogênio obtida para a quintuplicata de
cada amostra e os valores críticos foram determinados com o auxílio da tabela F e T tendo
como base 95% de confiança.
Tabela 10- Teste de comparação de variância e média
Amostras Comparação de variâncias Comparação de médias
F calculado F crítico T calculado T crítico
Folha de arroz 13,54 6,39 0,26 2,31
Braquiária 3,41 6,39 0,34 2,31
Feijão Rudá 4,13 6,39 0,24 2,31
Feijão Esplendor 12,61 6,39 0,24 2,31
Feijão Yoki 2,19 6,39 0,64 2,31
A variância dos métodos espectrofotométrico e de Kjeldahl não é estatisticamente
igual apenas para a folha de arroz e para o feijão esplendor, já que o F calculado foi maior que
o crítico. Para todas as amostras, porém, a média dos resultados se mostrou estatisticamente
igual. Assim, é possível inferir, com 95% de confiança que as análises de nitrogênio
realizadas por ambos os métodos fornecem valores médios estatisticamente iguais.
4.4-Tratamento dos resíduos gerados pelas análises químicas
4.4.1- Tratamento de resíduos contendo cobre
Na determinação de Nitrogênio pelo método convencional de destilação (Método
Kjeldahl) utiliza-se uma mistura de reagentes contendo 86,44% em massa de sulfato de sódio
e 13,56% de sulfato de cobre penta-hidratado como catalisador da reação de oxidação da
matéria orgânica presente no tecido vegetal.
Cada análise de Nitrogênio por este método gera aproximadamente 15 ml de NaOH
(40%V:V) e 3,5 ml de H2SO4 P.A. Neste volume está contido também 1 g de mistura
catalisadora contendo 0,864 g de K2SO4 e 0,136 g de sulfato de potássio penta hidratado
(CuSO4.5H20).
O resíduo gerado apresenta, portanto, uma concentração de 1868,42 mg/L de íons
51
Cu2+.
Para reduzir o volume de resíduos de cobre gerados pelas análises, faz-se a
decantação dos íons Cu2+ na forma de hidróxidos insolúveis. Para tanto, espera-se a
decantação do resíduo básico formado nas análises. Em seguida, faz-se a sifonação, retirando
o sobrenadante e descartando-o na pia. O sólido formado é seco e encaminhado ao
GERELAB.
Na neutralização da solução alcalina formada (pH=14,073) foram necessários 0,643
ml de H2SO4 para cada amostra analisada.
4.4.2- Tratamento de resíduos contendo selênio
Nas análises de nitrogênio total pelo método espectrofotométrico são gerados
extratos ácidos cuja concentração de selênio é de 875 mg.L-1 e extratos diluído de
concentração de selênio 43,75 mg.L-1. Cada amostra gera 43,5 mL de extrato ácido e 10,0 mL
de extrato ácido diluído, totalizando 53,5 mL a 719 mg.L-1.
A solução ácida de selênio foi tratada com metabissulfito de sódio (Na2S2O5),
ocorrendo a precipitação de um sólido vermelho. Assim, são necessários para cada 1 litro de
resíduo 1,73 g de metabissulfito. Partindo-se de 10% de excesso usa-se 1,91g de Na2S2O5 ou
103 mg por amostra.
Em seguida faz-se a neutralização com hidróxido de sódio (NaOH), e espera-se até
ocorrer a decantação. Logo em seguida, retira-se o sobrenadante por sifonação, descartando-o
na pia. O precipitado de coloração vermelha (S8) é seco e em seguida encaminhado ao
Gerelab.
O extrato resultante da mistura do extrato ácido com o diluído contém 4,9% de
H2SO4 sendo necessário, portanto, 69,04 g de NaOH para neutralização de cada litro do
extrato, ou 3,69 g de NaOH com 10% em excesso para cada amostra analisada.
5- CONCLUSÕES
O método de determinação de nitrogênio a partir do método espectrofotométrico,
baseado na reação de Berthelot modificada é compatível com a metodologia Kjeldah e pode
ser utilizada em rotinas laboratoriais, tendo em vista sua maior operacionalidade, quando
comparada com a metodologia Kjeldah. Para comprovar tal compatibilidade, os testes de
validação realizados neste trabalho mostraram que o método espectrofotométrico é seletivo,
52
linear, apresenta grande faixa de trabalho, é sensível e exato, porém menos preciso que o
método convencional de Kjeldahl.
Além disso, com os testes estatísticos de comparação de média e variância, foi
possível concluir que os métodos geram resultados médios estatisticamente iguais.
53
ANEXO 1 Distribuição F
54
55
Distribuição t-Studentes
56
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