View
219
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
EntendendoEntendendo o o MetabolismoMetabolismo
de de AminoAminoáácidoscidos emem CereaisCereais
Salete A Salete A GaziolaGaziola
BiBióólogaloga
Laboratório de Genética Bioquímica
de Plantas, Esalq/USPFoto: Prof. Dr. Ricardo A Azevedo
Departamento de Genética
Avenida Pádua Dias, 11 - Caixa Postal 83, CEP: 13400-970 - Piracicaba - São Paulo - BrasilTelefone: (0xx19) 3429-4250 / 4125 / 4126 - Fax: (0xx19) 3433-6706 - http://www.genetica.esalq.usp.br/semina.php
Por que estudar o metabolismo de Por que estudar o metabolismo de
aminoaminoáácidos em cereais??cidos em cereais??
1. Os aminoácidos essenciais (9), incluindo
lisina são sintetizados pela maioria das
plantas e bactérias apenas.
2. Devem ser providos pela dieta
3. Os cereais são deficientes em pelo menos
um dos aminoácidos essenciais
4. Baixa qualidade nutricional dos grãos
AminoAminoáácidos Essenciaiscidos Essenciais
Histidina
Isoleucina
Leucina
Lisina
Metionina
Fenilalanina
Treonina
Triptofano
Valina
Glutamate
Glutamine
ASPARTATEASPARTATE ASPARAGINE
THREONINETHREONINE
METHIONINEMETHIONINE
LYSINELYSINE
ß -Aspartyl phosphate
Aspartate semialdehyde
HSDH
Dihydrodipicolinate Homoserine
O-Phosphohomoserine
Cystathionine
S-adenosylmethionine
ISOLEUCINEISOLEUCINE
ASN
AS
AK
ASADH
DHDPS
HK
TS
TD
CGS
Homocysteine
CBL
MS
SAM-S
Cysteine
AHR1
BCAT
DHAD
DHDPR
THPA*
ADAPAT*
ADPD*
DAPE
DAPDSulphate
Ammonium
-
+
-
-
-
-
Pyruvate
Valine
Leucine
-
AHAS
----------------------------------------------------------------------------------
Tecido % de Lisina solúvel total
----------------------------------------------
WT Homozigoto
Calos 0.5 4.0
Folhas jovens 0.9 1.0
Folhas 1.9 29.0
Sementes imaturas 1.1 1.4
Sementes maturas 0.9 0.8
----------------------------------------------------------------------------------
Ghislain et al. (1995)
MutanteMutante dada enzimaenzima DHDPS DHDPS
emem N. N. sylvestrissylvestris
Catabolismo de lisina
•Cevada, milho e trigo – 14C-lisina
Glutamato
+
Semialdeido
aminoadipatoBrandt, 1975; Sodek e Wilson, 1970
•Caracterização em mamíferos
Hutzler e Dancis, 1968;1970; Fjellstedt e Robinson, 1975
•Milho – sugerem que o catabolismo de lisina é
um dos mecanismos controlando a concentração
de lisina solúvel no endosperma.Arruda et al., 1982
LORLOR
SDHSDH
----------
Via da sacaropina para o
catabolismo de lisina
Recomendado: 5,5% na composição
de lisina (LYS) em arroz (WHO,
1973)
Arroz: 8% de proteína
4% na composição de lisina
Por que arroz???
Objetivos Objetivos
�Purificar parcialmente e caracterizar as
enzimas LOR e SDH envolvidas no
catabolismo de lisina em sementes em
desenvolvimento de arroz.
Material: Cultivar IAC-165 de arroz de
sequeiro
� Sementes de arroz + tampão fosfato (1g:2 mL)
+ inibidores de protease e compostos fenólicos
homogeinização
Centrifugação
Precipitação com Sulfato de amônio
Métodos: 1º. Passo de purificação
“pellet” proteína
centrifugação
Dessalinização coluna sephadex
G-25
Reação enzimática
NADPH +
NADP+
NAD +
NADP
+ NADH
NADPH NADP+ = absorbância
NAD NADH = absorbância
1 nmol NADPH/NAD = 0,00622
Atividade de LORAtividade de LOR--SDH de tecidos SDH de tecidos
de arrozde arroz
Gaziola et al. (1995)
CROMATOGRAFIA
Perfil de Perfil de eluieluiççãoão das enzimas LORdas enzimas LOR--SDH de SDH de
arroz em cromatografia de troca iônica e arroz em cromatografia de troca iônica e
filtrafiltraçção em gel São em gel S--200200
Gaziola et al. (1997)
○ LOR □ SDH
Atividade de LORAtividade de LOR--SDH de arroz SDH de arroz
em PAGEem PAGE
1 2 3 4
LOR SDHLOR SDH
Gaziola et al. (1997) Lugli et al. (2002)
Milho arroz Coix
Passos Passos sequenciaissequenciais de purificade purificaçção das ão das
enzimas LOR e SDHenzimas LOR e SDH
Gaziola et al. (1997)
Regulação da LOR e SDH por Cálcio
LORSDH
Gaziola et al. (2000)
A. 1-Controle
2- +EGTA
3- EGTA + CaCl2
B. Controle +
EGTA
+ crescentes
[CaCl2]
Regulação da LOR e SDH por força
iônica (tris e KCl)
SDHLOR
Gaziola et al. (2000)
A. Aumento [Tris]
B. 10 mM Tris +
aumento [KCl]
C. 100 mM Tris +
aumento [KCl]
Aspectos moleculares
•O arroz é considerado como planta modelo
entre os cereais
•Genoma relativamente pequeno 420 Mb (trigo
15000 Mb)
•Sequenciado em Oriza sativa ssp. Japonica e
ssp. Indica
Paterson et al., 2006
Alinhamento da sequência de 2,6 kb de
arroz com o gene ZLKRSDH de milho
� O cDNA de arroz
codificando a proteína
LOR-SDH apresenta
83% e 98% de
homologia ao milho e
arroz (Oriza sativa L.
ssp. japonica),
respectivamente
Perfil de expressão do gene LORSDH e
DHDPS em sementes em
desenvolvimento de arroz (qRT-PCR)
� LOR-SDH-fw: 5'- GCCGTTGACATTCTCCCTAC
� LOR-SDH-rv: 5'- AGTTCCCCTCTTGCCTCCT
� DHDPS-fw:5'- CATCGGAGCAGCACTACAGA
� DHDPS-rv: 5'- AACAGCGGAGGCAATACAAG
� OsTUB-fw: 5'- TCTCCCCTCTCTCCCTTCTC
� OsTUB-rv: 5'- ATCACCTCCACCAACAGTCC
Perfil de expressão do gene LORSDH e
DHDPS em sementes em
desenvolvimento de arroz (qRT-PCR)
� LOR/TUB
� Est1: 5,6790912
� Est2: não obtido
� Est3: 0,1347982
� DHDPS/TUB
� EST1: 95,16249619
� EST2: 109,2272995
� EST3: 6,468562867
Mutantes de endosperma de milho Mutantes de endosperma de milho
OpacoOpaco
Mutante Natural Opaco-2 - Mertz, 1964
QPM 451 e 473 – programas de melhoramento
combinando o genótipo o2o2 (opaco 2), para
conferir alta qualidade protéica, e modificadores
genéticos, para melhorar as qualidades físicas e a
aparência do grão, foram desenvolvidos os materiais
denominados QPM (milho de qualidade protéica)
�Caracterização das enzimas envolvidas no metabolismo de lisina (AK, HSDH, LOR e SDH).
Atividade de AK e HSDH em milhoAtividade de AK e HSDH em milho
Gaziola et al. (1999)
WT o2
QPM QPM
Atividade de LORAtividade de LOR--SDH em milhoSDH em milho
Gaziola et al. (1999)
WT o2
QPM QPM
Mutantes de endosperma de milho Mutantes de endosperma de milho
Opaco e Opaco e FlouryFloury
Mutantes:
Opaco: o1, o2, o5, o7, o10, o11, o13.
Floury: fl1, fl2.
�Caracterização das enzimas envolvidas no catabolismo de lisina (LOR e SDH).
Atividade de LORAtividade de LOR--SDH em mutantes Opaco SDH em mutantes Opaco eFlouryeFloury------------------------------------------------------------------------Genótipo LOR SDH------------------------------------------------------------------------Oh43+ 3.5053.505 3.4903.490Oh43 o1 3.830 3.050Oh43 o2 0.5900.590 0.7050.705Oh43 fl1 2.115 1.870Oh43 fl2 0.4900.490 0.8900.890
W22+ 3.245 3.295W22o10 0.720 1.505W22o11 3.6153.615 4.6904.690W22o13 0.580 1.310
B37+ 2.926 3.237B37o7 2.610 2.500
B77x79+ 3.397 2.410B77x79o5 0.380 1.300
WT3+ 3.097 3.129WT3fl3 2.490 3.330------------------------------------------------------------------------
Atividade da enzima SDH de mutantes de Atividade da enzima SDH de mutantes de
milho opaco e milho opaco e flouryfloury em PAGEem PAGE
WT WT o2o2 o1 o5 o7 o10 o11 o13o1 o5 o7 o10 o11 o13
WT WT o2o2 fl1 fl2 fl3fl1 fl2 fl3
Atividade de SDH em endosperma Atividade de SDH em endosperma
de milhode milho
(PAGE)(PAGE)
Pompeu et al. (2005)
LOR e SDHLOR e SDH
� LOR-SDH: atividade endosperma
específica.
� LOR-SDH proteína bifuncional.
� Isoformas de LOR e SDH monofuncional.
SuperproduSuperproduçção de lisina e ão de lisina e
AcAcúúmulo em sementes de cereaismulo em sementes de cereais
�Alteração das enzimas AK e DHDPS.
�Manipulação das enzimas do catabolismo de
lisina.
Principais estratPrincipais estratéégias para o gias para o
acacúúmulo de lisina em cereaismulo de lisina em cereais
1. Programas de melhoramento: tempo longo.
2. Mutantes de ocorrência natural: opaco-2.
3. Mutantes bioquímicos: alteração da regulação das
enzimas chave.
4. Transformação de Plantas: produção de plantas
transgênicas expressando enzimas alteradas.
Azevedo and Lea (2001)
AgradecimentosAgradecimentos
Dep. de Genética, Esalq/USP
Prof. Ricardo A Azevedo
FAPESP
CNPq
Recommended