ENZIMAS - Wanderley José de Meambientenet.eng.br/AULAS/AULA 07.pdf · Metabolismo...

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Universidade AgrícolaUppsala - Suécia

Julho - 2003

ENZIMAS

W.J.Melo

Cinética Enzimática

EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DO SUBSTRATO

!Como avaliar?

!Realiza-se experimento com as seguintes características:#A varios tubos de ensaio, colocam-se a mesma concen-

tração da enzima em estudo.#Adiciona-se, a cada tubo, uma concentração diferente

do substrato, partindo-se de um tubo em que não se co-loca subs trato (testemunha ou branco).

#Incuba-se por um certo tempo em um pH e uma tempe-ratura ideal.

#Mede-se a quantidade de produto formado ou a de subs-trato que sobrou.

#Com os resultados obtidos, elabora-se um gráfico emsistema cartesiano.

W.J.Melo

CINÉTICA ENZIMÁTICAEFEITO DA CONCENTRAÇÃO DO SUBSTRATO

T1 T2 T3 T4 T5

EnzimaTampão

adicionar substrato

H2O S1 S2 S3 S4

Substrato

incubarTemperaturaTempo t

Medir Substratoou

ProdutoGRÁFICO

W.J.Melo

CINÉTICA ENZIMÁTICAEFEITO DA CONCENTRAÇÃO DO SUBSTRATO

Vmax

Vmax2

W.J.Melo

II I I

concentração do substrato

0 32 64 12896

ATIVIDADE DA UREASE NO SOLOEFEITO DA CONCENTRAÇÃO DO SUBSTRATO

Longo & Melo (2005)

W.J.Melo

Cinética Enzimática

CINÉTICA ENZIMÁTICA - CONCEITOS

!Equação de Michaelis-Mentem#Equação que descreve a velocidade de uma reação en-

zimatica em função da concentraçao do substrato.

!Velocidade máxima#Qantidade máxima de produto formado por unidade

de tempo e por unidade de enzima nas mesmas con-dições experimentais.

!Constante de Michaelis (KM)#Concentração de substrato que determina que a veloci-

dade de uma ração enzimática ocorra com a metade davelocidade máxima.

W.J.Melo

Cinética Enzimática

CINÉTICA ENZIMÁTICAEFEITO DA CONCENTRAÇÃO DO SUBSTRATO

#Equação de Michaelis-Menten

� A velocidade de reação das enzimas não alos-téricas segue a equação de Michaelis-Menten

� A velocidade da reação em um ponto qualqueré dada pela equação

V=Vmax S

KM + S

W.J.Melo

Cinética Enzimática

A EQUAÇÃO DE MICHAELIS-MENTEN

!V= velocidade da reação

!Vmax= velocidade máxima da reação

!S= concentração do substrato

!KM= constante de Michael#Indica a concentração do substrato que deter-mina que

a velocidade da reção seja a metade da velocidade máxima.#Reflete a afinidade entre a enzima e o substrato

� Quanto menor KM, maior afinidade.

V=Vmax*[S]

KM + [S]

W.J.Melo

Cinética Enzimática

A EQUAÇÃO DE MICHAELIS-MENTENINTERPRETAÇÃO

!Para baixas concentrações de substrato, a velocidade da reação aumenta linearmente com o aumento da concentra-ção do substrato.#Esta é uma reação de primeira ordem.

!Para concentrações intermediárias do substrato o aumento da velocidade não é linear com o aumento da concentra-ção do substrato.#Esta é uma reação de segunda ordem.

!Para altas concentrações do substrato, a velocidade da reação não se altera com o aumento da concentração dosubstrato.

� Esta é uma reação de ordem zero

� O sítio ativo está saturado pelo substrato

W.J.Melo

Cinética Enzimática

A EQUAÇÃO DE LINEWEAVER-BURKE

!Lineweaver e Burke trabalharam com os inversos davelocidade e da concentração do substrato.

!Verificaram que, ao plotarem o inverso da concentra-ção do substrato (eixo x) com o inverso da velocida-de (eixo y), obtinha-se uma equação de reta.

W.J.Melo

Cinética Enzimática

A EQUAÇÃO DE LINEWEAVER-BURKE

Vmax

Y=aX + bb= 1/VmaxSe Y=0, X=-1/KM

W.J.Melo

Cinética Enzimática

EFEITO DA TEMPERATURA

!Efeitos da temperatura#Aumenta a velocidade da reação.#Causa desnaturação da proteína enzimática.#A conjugação dos dois efeitos determina o comporta-

mento da velocidade em função da temperatura.#No caso de enzimas do solo, o efeito é m pouco dife-

rente, devido à proteção dos colóides do solo.

W.J.Melo

Temperatura

II I I I I

CINÉTICA ENZIMÁTICAEFEITO DA TEMPERATURA

Vmax

W.J.Melo

------

II I I II I I

10 20 30 40 50 60 70 800

Temperatura (oC)

ATIVIDADE DA UREASE NO SOLOEFEITO DA TEMPERATURA

LVd

LVef

Longo & Melo (2005)W.J.Melo

Cinética Enzimática

CINÉTICA ENZIMÁTICA EFEITO DO pH

!Desnaturação da proteína enzimática#Em pH muito baixo ou muito alto, tende a ocorrer a des-

naturação da proteína enzimática, resultando em uma diminuição na atividade catalítica.

!A curva de resposta da velocidade da reação enzimáti-ca tende a assumir a forma de um sino, mas é variável emfunção do tipo de enzima.

!As enzimas do solo apresentam um comportamento dife-rente, em função da interação com os colóides do solo.

W.J.Melo

CINÉTICA ENZIMÁTICA EFEITO DO pH

Vmax

W.J.Melo

II I I II

2 -

2,2 3,2 4,2 5,2 6,2 7,2 8,2

LVd

LVef

Longo & Melo (2005) W.J.Melo

ATIVIDADE DA UREASE NO SOLOEFEITO DO pH

Cinética Enzimática

CINÉTICA ENZIMÁTICAEFEITO DA CONCENTRAÇÃO DA ENZIMA

!A velocidade de uma reação enzimática aumenta com oaumento da concentração da enzima.

!Condição#Não haver falta de substrato#As demais condições são as ideais para a atividade da

enzima

W.J.Melo

EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DA ENZIMA

W.J.Melo

Cinética Enzimática

CINÉTICA ENZIMÁTICAEFEITO DA LUZ

!Algumas enzimas, caso da redutase do nitrato, são sen-síveis à presença da luz.

!Quando isto ocorre, há necessdade de se traba-lhar naausência da luz.

W.J.Melo

Enzimas

UNIDADES PARA EXPRESSAR A ATIVIDADEENZIMÁTICA

!Quantidade do substrato ou da enzima#Pode ser expressa em miligrama, micrograma, mol, milimol.#A unidade do SI é o mol.

!Quantidade da enzima#Pode ser expressa em quantidade do material que contém

a enzima (por exemplo g de solo), quantidade de proteí-na, quantidade de enzima, número de moléculas enzimáti-cas.

!Tempo de incubação#Pode ser expresso em horas, minutos ou segundos.

!Deve-se usar unidades do Sistema Internacional (SI).W.J.Melo

Enzimas

UNIDADES PARA EXPRESSAR A ATIVIDADEENZIMÁTICA

!Katal (kat)

#Unidade definida pela EC (Enzyme Comission) em 1961.#É derivada do SI para expressar a atividade catalítica das

enzimas.#Seu uso é recomendado pela Conferência Geral de Pesos

e Medidas (outubro de 1999).#1 kat equivale à transformação de 1 mol do substrato ou

a formação de 1 mol do produto em 1 segundo.

Kat mol/segundo

W.J.Melo

Enzimas

FORMAS DE EXPRESSAR A ATIVIDADEENZIMÁTICA

!Unidade Internacional (IU ou U)

#Definida pela International Union of Biochemistry (1964)#Atividade que catalisa a transformação de 1 micromol do

substrato ou a produção de 1 micromol do produto em 1minuto sob condições padrões.

#U - micromol/minuto

1 kat= 6x107 U

W.J.Melo

Enzimas

FORMAS DE EXPRESSAR A ATIVIDADEENZIMÁTICA

!Atividade específica

#Atividade que representa a massa ou o número de mo-les de substrato transformado ou do produto formado por umidade de enzima ou do material que a contém e por unidade de tempo.

#Exemplo

� Na hidrólise total do amido< Atividade= mg de glicose/g de folha * hora< Atividade= kat/mg folha< Atividade= kat/mg de proteína

W.J.Melo

Enzimas

FORMAS DE EXPRESSAR A ATIVIDADEENZIMÁTICA

!Atividade molar ou molecular

#É o antigo turnover.#Expressa a quantidade de substrato transformado

ou de produto produzido por molécula de enzimaou por sítio ativo.

W.J.Melo

Metabolismo Intermediário de X

X a b c d ... ... YE1 E2 E3 E4 En

X= substrato

Y= produto

a, b, c, d= metabólitos

E1, E2, ... En= enzimas

E1= enzima reguladoraW.J.Melo

Metabolismo

CONCEITOS

!Sistema e ambiente

#Em termodinâmica, sistema é a matéria contida dentrode uma região definida. Ambiente, por seu turno, é a matéria que resta no universo.

!Energia livre

#Símbolo: F ou G#Conceito

� Quantidade de energia existente em um siste-ma.

W.J.Melo

Metabolismo

CONCEITOS-ENERGIA LIVRE

!Avaliação#A energia livre de um sistema pode ser avaliada em u-

ma bomba calorimétrica.

!Constância#A energia livre de um sistema é constante (1ª lei da ter-

modinâmica).

!Variação em uma reação química#É a diferença entre a energia dos produtos e dos rea-

gentes, independentemente do caminho seguido.

W.J.Melo

Metabolismo

reagente produto

E = Ep - Ei

E = variação de energia do sistema

Ep= energia dos produtos

Ei= energia do substrato inicialW.J.Melo

A B

Metabolismo

CONCEITOS

! Entropia#Símbolo: S#Diz respeito ao grau de organização de um sistema.#Quanto mais desorganizado é um sistema, maior sua

entropia.

!Entalpia#Símbolo: H#Diz respeito ao conteúdo de energia interna de um

sistema.

� A unidade no SI é o J/mol

W.J.Melo

Metabolismo

CONCEITOS

!Expontaneidade das reações

#Uma reação somente ocorre expontaneamen-te se a soma das entropias do sistema e do ambiente au-mentar.

#Uma reação em que a entropia do sistema dimi-nui pode ocorrer, desde que a entropia do ambien-te aumente.

W.J.Melo

Metabolismo

CONCEITOS

!Energia de ativação

#É a quantidade de energia que se necessita fornecerao substrato para que o mesmo atinja a barreira e-nergética da transformação.

!Reação endergônica

#É a que ocorre com consumo de energia.#A energia do produto é maior que a do substrato.#A variação de energia é positiva.

W.J.Melo

Metabolismo

CONCEITOS

!Reação exergônica

#É aquela que ocorre com liberação de energia.#A energia do produto é menor que a do substrato.#A variação de energia é negativa.#A energia liberada pode ser perdida na forma de

calor ou usada para realização de trabalho.

W.J.Melo

TIPOS DE REAÇÕES

XEx

Y1aEy1

Ebt

E+

Ey2E-

a= reação endergônica b= reação exergônica W.J.Melo

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