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Universidade Federal Rural de PernambucoPrograma de Pós-Graduação em Ciência do Solo
Disciplina: Seminário IIProfessor: Mario de Andrade Lira Junior
Indicadores microbiológicos para qualidade do solo
Mestranda: Rayssa Pereira VicentinOrientador: Mario de Andrade Lira JuniorCo-orientador: José Carlos Batista Dubeux Junior Co-orientador: Márcia do Vale Barreto Figueiredo
Recife, 04 de dezembro de 2009.
para qualidade do solo
Introdução
Qualidade do solo é a capacidade do solo
funcionar nos limites do ecossistema,
sustentando a produtividade biológica, mantendo
Indicadores microbiológicos para qualidade do solo.
a qualidade ambiental e promovendo a saúde
vegetal e animal.
Biológicas
•Composição vegetal.•Fauna: Macro.
Meso.Micro.
•Microbiota.
Indicadores microbiológicos para qualidade do solo.
Parâmetros da Qualidade do Solo
Químicas Físicas
•Condutividade Hidráulica.•Resistência a Penetração.•Agregação.
•Teores totais do elementos.•Conteúdo e composição da Matéria Orgânica.•Xenobióticos.
Indicadores microbiológicos para qualidade do solo.
Desenvolvimento
Quando têm sido utilizados os indicadores microbiológicos?
Parâmetro sensível.
Quando a microbiologia é foco do trabalho.
No estudo do Fluxo e Ciclagem dos Elementos.
Indicadores Microbiológicos
Densidade.
Indicadores microbiológicos para qualidade do solo.
Diversidade.
Atividade.
Densidade
Indicadores microbiológicos para qualidade do solo.
• Contagem de nódulos.
Métodos:
http://www.cnpab.embrapa.br/images/fbnl.jpg
Indicadores microbiológicos para qualidade do solo.
• Infecção micorrízica.
Densidade - Métodos
Clareamento com KOH e
Coloração com azul de tripano.
Observação com microscópio
H2O2.azul de tripano. microscópio
estereoscópico.
• Número de esporos de fungos.
Densidade - Métodos
Indicadores microbiológicos para qualidade do solo.
Amostras tratadas com corantes.
Observação em microscópios
• NMP (Número mais Provável.
Indicadores microbiológicos para qualidade do solo.
Densidade - Métodos
Diluições seriadas de amostras
Inoculação em meio líquido ou semi-
sólido.
Tabela estatística
NMP
http://bervieira.sites.uol.com.br/dilui.htm
• NMP (Número
mais Provável.
Tabela Estatística de Cochran
Moreira & Siqueira, 2006.
P1 > P2 > P3
• Carbono da biomassa microbiana.
Indicadores microbiológicos para qualidade do solo.
Densidade - Métodos
Amostras frescas
Fumigada.Extração com K2SO4, seguida de filtragem.Não-Fumigada.
Digestão com Dicromato, ácido sulfúrico e ácido
ortofosfórico.
Titulação com sulfato ferroso amoniacal,
utilizando fenolftaleína como indicador.
Silva et al., 2007.
Carbono total – Carbono solo = Carbono da biomassa.KC
Indicadores microbiológicos para qualidade do solo.
Diversidade
Variedade de indivíduos.
Bactérias: Apenas 1% é passível de cultivo.
Métodos Moleculares
Moreira & Siqueira, 2006.
Indicadores microbiológicos para qualidade do solo.
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) –Polimorfismo do comprimento de fragmentos de restrição.
Indicadores microbiológicos para qualidade do solo.Diversidade
Proximidade genética de isolados.
Extração de DNA do isolado.
Digestão com enzima de restrição.
Separação de fragmentos em
Métodos:
DNA do isolado.
http://static.hsw.com.br/gif/how-to-prepare-soil-for-planting-4.jpghttp://www.mundovestibular.com.br/articles/219/1/O-DNA/Paacutegina1.htmlhttp://1.bp.blogspot.com/_YnaVC3EBaBU/Ssn1Ob2gUBI/AAAAAAAAANw/W9y2BjSioxA/s320/replicação+semiconservativa.JPG
enzima de restrição. fragmentos em eletroforese horizontal.
RFLP
Indicadores microbiológicos para qualidade do solo.
http://www.scielo.cl/fbpe/img/amv/v40n2/art11-figura01.jpg
• AFLP (Amplified fragment length polymorphism) –
polimorfismos de comprimento de fragmentos
amplificados.
Indicadores microbiológicos para qualidade do solo.
Diversidade – Métodos
Extração do DNA genômico
Digestão com enzimas de restrição Amplificação.DNA genômico
do isolado.enzimas de restrição com corte adesivo.
Amplificação.
Eletroforese em gel de agarose.Dendrograma de
similaridade.
PCR
Reagentes:
• Tampão.
• dNTP.
• Primer
Indicadores microbiológicos para qualidade do solo.
94°C
50-60°C
• Amostra de DNA.
• Taq Polimerase.
• MgCl.
50-60°C
72°C
http://www.bio.miami.edu/~cmallery/150/gene/Taq.htm
• ARDRA.
Indicadores microbiológicos para qualidade do solo.
Diversidade
Indicadores microbiológicos para qualidade do solo.
Diversidade – Métodos
Extração do DNA
genômico do isolado.
Amplificação de genes
universais.
Digestão com enzimas de restrição.
do isolado.
Eletroforese em gel de agarose.
Dendrograma de similaridade.
http://pgrc3.agr.gc.ca/facilities-installations_e.html
•DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) –Eletroforese em Gel com Gradiente de Desnaturação.
Indicadores microbiológicos para qualidade do solo.
Diversidade – Métodos
Extração do DNA Total de
Microrganismos do Solo.
Amplificação (genes
universais ou de grupos).
Eletroforese em gel de
agarose.Solo. grupos).
agarose.
Eletroforese em gel com gradiente de
desnaturação
DendrogramaSequênciamento.
DGGE
Indicadores microbiológicos para qualidade do solo.
Diversidade – Métodos
Menos [ ]
A=TC=G
Desnaturante – Formamida.
http://www.eeescience.utoledo.edu/Faculty/Sigler/RESEARCH/Protocols/DGGE/DGGE.pdf
Mais [ ]http://biomicrolab.web.ua.pt/images/DGGEgela.jpg
• Biblioteca Metagenômica/Sequenciamento.
Indicadores microbiológicos para qualidade do solo.
Diversidade
Indicadores microbiológicos para qualidade do solo.
Diversidade – Métodos
DNA de amostra
ambiental
Amplificação
http://www.libertaria.pro.br/d_ressurgentes_arquivo/cadeia.jpg
ambiental
Sequenciamento
Indicadores microbiológicos para qualidade do solo.
Sequenciamento
Desnaturação do DNA
Anelamento de 1 primer
Polimerização com nucletídeos marcados.
• Microarranjos.
Indicadores microbiológicos para qualidade do solo.
Diversidade
Indicadores microbiológicos para qualidade do solo.
Diversidade – Métodos
Poços com DNA fita
simples.
Hibridização com DNA da
http://www.fiocruz.br/ccs/media/grafico_microarranjo.JPG
Hibridização com DNA da
amostra.
Identificação através da
fluorescência.
• Box-PCR.
Indicadores microbiológicos para qualidade do solo.
Diversidade
Os Primers utilizados são sequências grandes
de nucleotídeos que se repetem no DNA.
Gerando uma variedade diferente tamanho de
http://www.bspp.org.uk/publications/new-disease-reports/012/2005-84-1.gif
Gerando uma variedade diferente tamanho de
fragmento.
Indicadores microbiológicos para qualidade do solo.
Atividade microbiana
Respiração Basal
Amostras Frescas
Incubar amostra + frascos contendo
NaOH em ambiente hermético.
Frascos NaOH são acrescidos
BaCl2 para precipitar o CO2.
Titulação com ácido Titulação com ácido clorídrico na presença
de fenolftaleína.
RBS (mg de C-CO2 kg-1 solo hora-1)
Coeficiente Metabólico qCO (mgC-CO2 .g-1 BMS C.h-1 )
Silva et al., 2007.
Indicadores microbiológicos para qualidade do solo.
Atividade microbiana
Atividade Enzimática
Princípio: Incubação com substrato, por determinado tempo e temperatura, e leitura do produto da reação.
Enzimas: • Arilsulfatase (mineralização de Enxofre).• Arilsulfatase (mineralização de Enxofre).
• Fosfatase (mineralização do Fóforo).
• Celulase (degradação da Celulase).Celulose Celobiose
• β-glucosidase (degradação da Celobiose).Celobiose Glicose
Indicadores microbiológicos para qualidade do solo.
Atividade microbiana
Determinação de ATP
Extração:• Ácido Tricloroacético.• Solução de Fosfato.• Ácido Sulfúrico.• Ácido Fosfórico.• Ácido Fosfórico.
Leitura: HPLC (High performance liquid chromatography) Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Considerações finais
•É de suma importância a determinação de mais
de um parâmetro de qualidade do solo.
• Os Indicadores Microbiológicos são
parâmetros sensíveis pra determinar as
alterações da qualidade do solo.
•Devido a dificuldade de cultivar as bactérias,
métodos moleculares viabilizam o estudo da sua
diversidade.
Obrigada!
Indicadores microbiológicos para qualidade do solo.
Obrigada!
rayssapv@yahoo.com.br
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