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i
JULIANA SILVEIRA RUAS
METABOLISMO ENERGÉTICO MITOCONDRIAL NA
PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS DE GLIOBLASTOMA
U-87MG E T98G EM CULTURA
CAMPINAS
2015
ii
iii
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
JULIANA SILVEIRA RUAS
“METABOLISMO ENERGÉTICO MITOCONDRIAL NA PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS DE GLIOMA U-87MG E T98G EM
CULTURA”
Orientador/Supervisor: Prof. Dr. Roger Frigerio Castilho
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia Médica, da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas, para a obtenção do título de Mestre em Ciências.
Este exemplar corresponde à versão final da
tese defendida pela aluna Juliana Silveira Ruas
e orientada pelo Prof. Dr. Roger Frigerio
Castilho.
Assinatura do Orientador
CAMPINAS
2015
iv
v
vi
vii
RESUMO
A maioria das células tumorais depende da glicólise para a ressíntese de ATP
durante um processo de rápida proliferação, mesmo que haja disponibilidade de
oxigênio para a transdução de energia mitocondrial (Efeito Warburg). O objetivo do
presente estudo foi avaliar o papel do metabolismo oxidativo mitocondrial na
proliferação de células de glioblastoma humano U-87MG e T98G. Quando as células
foram cultivadas na presença de oligomicina (um inibidor da ATP sintase) ou
antimicina A (um inibidor do complexo III da cadeia transportadora de elétrons),
observou-se apenas uma inibição parcial da proliferação das células. Notadamente,
a incubação dessas células com ambos os inibidores causou uma inibição quase
completa na proliferação celular. Resultados semelhantes foram observados em
cultura primária de astrócitos, havendo uma queda na proliferação celular somente
quando ambos os inibidores mitocondriais estavam presentes. Medidas de consumo
de oxigênio indicaram que células de glioblastoma utilizam parcialmente a
fosforilação oxidativa para a ressíntese de ATP e apresentam uma respiração bem
acoplada. Quando se inibiu, nestas células, a fosforilação oxidativa do ADP com
oligomicina ou antimicina A, houve um pequeno aumento no consumo de glicose e
na produção de lactato. No entanto, o tratamento com ambos os inibidores
mitocondriais promoveu um menor consumo de glicose e produção de lactato, em
comparação com os efeitos que a antimicina A promoveu. Isso indica que a cadeia
transportadora de elétrons quando inibida pela presença de antimicina A, promove
um funcionamento inverso da ATP sintase, promovendo a hidrólise de ATP para que
haja um bombeamento de prótons para o espaço intermembranar mitocodrial. De
acordo com os resultados acima descritos, uma queda quase completa do potencial
de membrana mitocondrial foi observada apenas quando as células de glioblastoma
foram incubadas na presença de ambos os inibidores mitocondriais, oligomicina e
antimicina A. Quando a análise do ciclo celular foi realizada, observou-se uma
diminuição da percentagem das células em G0-G1 e um aumento nas fases S e G2-
M quando tratadas com oligomicina. Quando as células foram tratadas com
antimicina A e oligomicina mais antimicina A foi constatado uma diminuição
viii
significativa nas fases G0-G1 e G2-M, e um aumento na fase S. Em conclusão, estes
resultados indicam que a rápida proliferação de células de glioblastoma depende da
existência do potencial de membrana mitocondrial, mas não da fosforilação oxidativa
ou do transporte de elétrons na cadeia respiratória.
Palavras-Chave: efeito Warburg, fosforilação oxidativa, glicólise, glioblastoma,
inibidores mitocondriais, potencial de membrana mitocondrial.
ix
ABSTRACT
Most tumor cells rely on glycolysis for ATP resynthesis during rapid
proliferation, despite the availability saturating levels of oxygen for mitochondrial
energy transduction (Warburg effect). The aim of the present study was to evaluate
the role of mitochondrial oxidative metabolism on proliferation of human glioblastoma
cells U-87MG and T98G. When cells were cultured in the presence of oligomycin
(ATP synthase inhibitor) or antimycin A (inhibitor of complex III of the electron
transport chain), we observed only a partial inhibition of cell proliferation. Remarkably,
incubation of cells with both inhibitors caused an almost complete inhibition of cell
proliferation. Similar results were observed in primary culture of astrocytes, with a
decrease in cell proliferation only when both mitochondrial inhibitors were present.
Oxygen consumption measurements indicated that glioma cells partially rely on
oxidative phosphorylation for ATP turnover and exhibit a well-coupled respiration. In
fact, shutting down mitochondrial ADP phosphorylation in these glioma cells with
either oligomycin or antimycin inhibitors slightly increased glucose consumption and
lactate release. However, the treatment with both mitochondrial inhibitors promoted
lower glucose consumption and lactate release as compared with the effects of
antimycin alone, which indicates that ATP synthase is operating reversely and thus
hydrolyzing ATP and pumping H+ out when the respiratory chain is inhibited by
antimycin. In agreement, an almost complete collapse of mitochondrial membrane
potential was only observed when the glioma cells were incubated in the presence of
both antimycin and oligomycin, but not of only antimycin. When cell cycle analyses
were performed in oligomycin-treated cells, a decrease in the percentage of cells in
G0-G1 phase and an increase in S and G2-M phases were observed. When cells
were treated with antimycin A or oligomycin plus antimycin A, it was observed a
significant decrease in G0-G1 and G2-M cell phases and an increase in S phase.
Overall, our results suggest that the rapid proliferation of glioblastoma cells is
dependent on the mitochondrial membrane potential, but not on oxidative
phosphorylation or electron transport in the respiratory chain.
x
Key words: Warburg effect, oxidative phosphorylation, glycolysis, glioblastoma,
mitochondrial inhibitors, mitochondrial membrane potential.
xi
SUMÁRIO
RESUMO....................................................................................................................... vii
ABSTRACT ................................................................................................................... ix
1. INTRODUÇÃO .............................................................................................................. . 1
1.1 Metabolismo Energético ................................................................................................. . 1
1.2 Células Tumorais e o efeito Warburg ................................................................... . 7
1.3 Efeito Warburg e Síntese de Biomassa ................................................................ 10
1.4 Gliomas Humanos ................................................................................................ 12
2. OBJETIVOS. ................................................................................................................. 15
2.1 Objetivo Geral ...................................................................................................... 15
2.2 Objetivos específicos ........................................................................................... 15
3. MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................... 16
3.1 Linhagens de células e reagentes químicos ........................................................ 16
3.2 Cultura de Células ................................................................................................ 17
3.3 Cultura Primária de Astrócitos.............................................................................. 17
3.4 Microfotografias .................................................................................................... 18
3.5 Medida de Viabilidade Celular por MTT ............................................................... 19
3.6 Medida de Viabilidade Celular por Azul de Tripan ............................................... 20
3.7 Medida do consumo de O2 em células U-87MG e T98G intactas ........................ 20
3.8 Medida do Consumo de Glicose e Produção de Lactato ..................................... 21
3.9 Estimativa do Potencial de Membrana Mitocondrial de Células Intactas ............. 22
xii
3.10 Análise do Ciclo Celular em células U-87MG e T98G ........................................ 23
3.11 Análise Estatística .............................................................................................. 25
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................ 26
4.1 Efeito da inibição da ATP sintase e/ou da cadeia transportadora de elétrons na
proliferação de células de glioblastoma humano......... ............................................... .... 26
4.2 Efeitos da oligomicina e antimicina A no metabolismo energético das células de
glioma ........................................................................................................................ 32
4.3 Estimativa do potencial de membrana mitocondrial em células de glioblastoma
humano: Efeito de oligomicina e/ou antimicina A ....................................................... 38
4.4 Análise do ciclo celular em células de glioblastoma humano, U-87MG e T98G .. 45
4.5 Efeito da inibição da ATP sintase e/ou da cadeia transportadora de elétrons na
proliferação de astrócitos primários em cultura .......................................................... 50
5. CONCLUSÕES ........................................................................................................ 52
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................... 54
7. ANEXO .......................................................................................................................... 60
xiii
AGRADECIMENTOS
À Deus, por sempre direcionar meus passos e atender às minhas preces, me
dar forças e me reerguer quando precisei.
Ao meu orientador e amigo, Professor Dr. Roger Frigério Castilho, por toda
dedicação e paciência que teve para me ensinar e orientar ao longo de toda esta
jornada. Agradeço pela oportunidade de trabalhar sob sua orientação e pela
confiança depositada em mim. Ao Professor Dr. Anibal Eugênio Vercesi e sua
esposa, Drª Helena, que me indicou para trabalhar neste laboratório.
Aos funcionários Edilene de Souza Siqueira Santos, Roberto C. Stahl, Drª.
Márcia M. Fagian Pansani, pelos ensinamentos, companheirismo, amizade e pela
ajuda. Aos alunos do Laboratório de Bioenergética e do Laboratório de
Neurodegeneração Experimental, Fábio Rogério, Cláudia Navarro, Erika Rodrigues
da Silva, Kézia Moura, Evellyne Figueiroa, Genoefa Amalia Dal'bó, Ana Carolina
Marques, Hanan Chweih, Tiago Figueira, Juliana Ronchi, Raffaela Ignarro, Gustavo
Facchini e Estela Busanello. Aos ex-alunos do laboratório, Guilherme Michelini,
Daniela Melo, Ivan Cappelli, Vinícius Vercesi, Audrey de Moraes, Mary Aranda,
Luciana Luz, Rute Costa, Carina Malagutti, Felipe Gustavo Ravagnini, Silvia Elaine
Ferreira Melo, Sônia Ap. Gurgueira, Franco Rossato, e aos demais colegas, pelo
companheirismo, pelas discussões científicas e aos momentos de descontração.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES),
pela concessão de bolsa para o desenvolvimento dessa dissertação.
Aos meus pais, Aparecida P. Da Silveira Ruas e Luiz Roberto Ruas, por terem
me dado suporte emocional, me motivado e apoiado em todos os momentos. Sou
eternamente grata a vocês. Meu amor por vocês é incondicional.
Ao meu querido namorado Thomas Samara, obrigada por todo o incentivo,
por cada sabádo e domingo que esteve ao meu lado fazendo companhia no
xiv
laboratório, por todo amor e dedicação que tem por mim. À minha querida sogra,
Sônia Samara, pelas conversas, pelos sorrisos, por toda sabedoria que me
acrescentou na vida. Aos meus cunhados amados Cammys, Carol, Tatá, Teté e
Patrick. Ao Luiz Arthur, Rodrigo, Victor Hugo e Dani.
À minha amada irmã, Roberta Silveira Ruas, e a meu cunhado, Kaue Dias de
Souza, pelas risadas e conversas que me proporcionaram. Por sempre me
defenderem e me apoiarem emocionalmente.
À minha avó Lais. Aos meus tios, Maria Auxiliadora, Teresa Cristina, Sueli,
Sílvia, Emílo, Bernardo, Álvaro. Aos meus primos, Vivian, Kika, Carol, Samira,
Emilinho, Jorginho, Léo, Lucas, Mateus. Aos agregados Mateus Dias, Marcelo,
Ricardo, Juscelino, Julia, Grazi. Ao pessoal de São Paulo, tia Eneida, tio Fábio,
Mané, Zé, Adriana, Rafa e Léo. A toda minha família.
Aos meus amigos, Fabio Zatta, Thais Alves, Giovani Felizardo, Augusto
Sancesário, Juliana Camargo, Marindia Freitas, Ana Carolina Arruda, Carol
Magalhães, Fer Pereira, Alex Oliveira, Fernanda Bonato, Alexandre Calix, Marcelo
Castro Lígia Carneiro, Lucia Devito, Romualdo, Rafaela Mendonça, Mateus Vidigal,
pelos momentos de descontração, pela amizade sincera, pela disposição em ouvir e
por todo apoio e confiança.
Aos meus queridos avós Teresinha, Miguel e Fernando. À minha madrinha
Cibele e ao tio Geraldo. Sinto muita falta de vocês. E ao colega Paolo La Guardia (In
Memoriam).
E àqueles que me ajudaram e torceram por mim ao longo desses anos. Muito
obrigada!
xv
Lista de Figuras
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Esquema das fases da glicólise e os possíveis destinos para
o piruvato Pág 03
Figura 2 Esquema ilustrando o transporte de elétrons e a fosforilação
oxidativa mitocondrial Pág 04
Figura 3 Esquema exemplificando o complexo III da cadeia
transportadora de elétrons Pág 06
Figura 4 Esquema exemplificando a ATP sintase mitocondrial Pág 07
Figura 5 Efeito inibitório de oligomicina e antimicina A na proliferação
de células de glioblastoma humano U-87MG e T98G Pág 27
Figura 6 Efeito de oligomicina e antimicina A na proliferação de
células de glioblastoma humano U-87MG e T98G Pág 28
Figura 7 Microfotografias de células U-87MG e T98G mantidas em
cultura durante 5 dias: efeito de oligomicina e/ou antimicina A Pág 30
Figura 8 Efeito inibitório de oligomicina e antimicina A no consumo de
oxigênio de células de glioblastoma humano U-87MG e T98G Pág 34
Figura 9
Avaliação do consumo de glicose e produção de lactato por
células de glioblastoma humano U-87MG e T98G: Efeito de
oligomicina e antimicina A
Pág 36
Figura 10
Efeito da adição de oligomicina e/ou antimicina A no
potencial de membrana mitocondrial estimado em
suspensões de células intactas de glioblastoma humano U-
87MG e T98G
Pág 39
Figura 11
Efeito da incubação por 24 horas com oligomicina e/ou
antimicina A no potencial de membrana mitocondrial de
células intactas de glioblastoma humano U-87MG e T98G
Pág 42
Figura 12
Imagem ilustrativa dos histogramas obtidos em análises por
um citômetro de fluxo quando se quer avaliar a intérfase do
ciclo celular.
Pág 48
Figura 13 Efeito de oligomicina e/ou antimicina A no ciclo celular das
células de glioblastomas U-87MG e T98G Pág 49
Figura 14 Efeito de oligomicina e antimicina A na proliferação de
astrócitos de ratos neonatos Pág 51
xvi
xvii
LISTA DE TABELAS
Tabela I Compostos que interferem na fosforilação oxidativa Pág 06
Tabela II Variação dos locis analisados pelo método de repetição de
arranjos curtos (STR) Pág 14
Tabela III
Porcentagens obtidas por citometria de fluxo para cada
tratamento em células de glioblastoma humano U-87MG
relativas a cada fase da intérfase no ciclo celular
Pág 47
Tabela IV
Porcentagens obtidas por citometria de fluxo para cada
tratamento em células de glioblastoma humano T98G relativas
a cada fase da intérfase no ciclo celular
Pág 47
xviii
xix
LISTA DE ABREVIATURAS
AA Antimicina A
ADP Adenosina difosfato
ANOVA
atm
Análise de variância simples
Atmosfera, unidade de pressão
ATP Adenosina trifosfato
A.U. Unidades arbitrárias (Arbitrary units)
Acetil-CoA Acetil coenzima A
BSA
Ca2+
Albumina soro bovino
Íon cálcio
CDKN2A Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A
CDKN2C Cyclin-dependent kinase inhibitor 2C
C6H12O6 Molécula de glicose
CO2 Dióxido de carbono
Cyt c Citocromo c
DMEM Meio de Eagle modificado por Dulbecco (Dulbecco’s modified Eagle’s médium)
DMSO Dimetilsulfóxido
DNA Ácido desoxirribonucleico
DNAse Deoxiribonuclease I
DPI Cloreto difenileneiodonio
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
EGFR Receptor de fator de crescimento epidérmico
FADH2 Flavina adenina dinucleotídeo reduzido
FCCP Carbonil cianeto de p-trifluorometoxifenil-hidrazona
FH Fumarato hidrase
GOD Glicose oxidase
H+ Cátion hidrogênio (próton)
H2O Molécula de água
xx
H2O2 Peróxido de hidrogênio
HCl Ácido clorídrico
HEPES Ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N’-2’-etanosulfônico
HIF1 Hypoxia-Inducible Factor 1
HIF1 α Hypoxia-Inducible Factor 1, subunit α
HIF1 β Hypoxia-Inducible Factor 1, subunit β
HKI Hexoquinase 1
HKII
IDH2
Hexoquinase 2
Isocitrato desidrogenase 2
KCl Cloreto de potássio
LDH-A Lactato desidrogenase
MCU Canal uniporter mitocondrial (Mitochondrial uniporter channel)
MTT Brometo de azul tiazoil tetrazólio
NAD+ Nicotinamida adenina dinucleotídeo, forma oxidada
NADH
NADP
NADP+
Nicotinamida adenina dinucleotídeo, forma reduzida
Nicotinamida adenina dinucleotídeo monofosfato
Nicotinamida adenina dinucleotídeo monofosfato, forma oxidada
NADPH
NNT
Nicotinamida adenina dinucleotídeo monofosfato, forma reduzida
Transidrogenase de nucleotídeos de nicotinamida
O2 Oxigênio molecular
O2.- Radical ânion superóxido
Oligo Oligomicina
OXPHOS Fosforilação oxidativa
PBS Tampão fosfato salina
PDH Piruvato desidrogenase
Pi Fosfato inorgânico
PI Iodeto de propídeo
PKM2 Piruvato quinase, isoforma M2
PTEN Phosphatase and tensin homolog
xxi
RNA
RNAse
Ácido ribonucleico
Ribonuclease
rpm Rotações por minuto
SDH Succinato desidrogenase
SDS
SNC
SNP
Dodecil sulfato de sódio
Sistema nervoso central
Sistema nervoso periférico
SRC Coativador do receptor esteroide (Steroid receptor coactivator)
STR
TIM
Repetição de arranjos curtos (short tandem repeat)
Translocase de membrana mitocondrial interna
TMRM
TOM
Tetrametilrodamina metil éster
Translocase de membrana mitocondrial interna
TPB- Tetrafenilborato de sódio
UQ Coenzima Q
UQH2 Coenzima Q reduzida
xxii
Introdução
1
1. INTRODUÇÃO
A homeostase bioquímica celular depende de processos que requerem alta
demanda energética, suprida pela disponibilidade de ATP. A contínua ressíntese de
ATP pode ser provida tanto pela glicólise como pela fosforilação oxidativa
(OXPHOS), processo dependente da cadeia transportadora de elétrons mitocondrial
(NELSON, COX, 2012). Quando a célula está em hipóxia, a geração de ATP é
dependente da glicólise (NELSON, COX, 2012).
Nesta Introdução serão descritos os mecanismos de obtenção de ATP por
células normais e as alterações metabólicas mais comumente observadas em
células tumorais. As implicações destas alterações para processos de proliferação
celular e tumorigênese também serão apresentadas.
1.1 Metabolismo Energético
O metabolismo energético de uma célula depende de processos capazes de
promover a ressíntese de ATP. A forma como uma célula em normóxia obtém este
ATP, envolve os processos da glicólise, ciclo do ácido cítrico e fosforilação oxidativa.
A glicólise é uma via central quase universal de catabolismo da glicose, sendo
a via com o maior fluxo de carbono na maioria das células. Na glicólise uma molécula
de glicose, contendo seis carbonos, é degradada por uma série de reações
catalisadas por enzimas formando duas moléculas de piruvato, contendo três
carbonos cada. Durante as reações sequenciais da glicólise, parte da energia livre
liberada a partir da glicose é conservada na forma de ATP e NADH. A glicólise ocorre
em dez reações, sendo as cinco primeiras consideradas a fase preparatória e as
outras cinco reações a fase de pagamento (LODISH et al., 2005; NELSON, COX,
2012).
A fase preparatória da glicólise é caracterizada pela fosforilação da glicose a
glicose-6-fosfato pela enzima hexoquinase e a conversão deste intermediário através
Introdução
2
de mais quatro reações à gliceraldeído-3-fosfato (aldose) mais dihidroxicetona
(cetose). Nas reações desta fase, duas fosforilações são realizadas com gasto de
ATP. Já na fase de pagamento, a célula recupera o gasto de ATP que ocorreu na
fase preparatória. A fase de pagamento consiste em uma sequência de cinco
reações com a conversão do gliceraldeído-3-fosfato em piruvato, produto final da
glicólise. Nestas reações ocorre a formação de ATP e NADH. Para cada molécula de
glicose metabolizada são consumidas duas de ATP na fase preparatória e quatro
moléculas de ATP são produzidas na fase de pagamento, tendo um resultado líquido
de duas moléculas de ATP para cada molécula de glicose convertida a piruvato
(NELSON, COX, 2012).
O piruvato formado pela glicólise pode ter dois destinos (Fig. 1). Na presença
de oxigênio, este piruvato é majoritariamente utilizado pelo ciclo do ácido cítrico, que
provê substratos para a cadeia transportadora de elétrons mitocondrial. Quando em
situação de hipóxia, o piruvato é reduzido a lactato pela lactato desidrogenase com a
oxidação de uma molécula de NADH à NAD+. O NAD+ é essencial para a
continuação da fase de pagamento da glicólise. Em hipóxia, o NADH não pode ser
reoxidado a NAD+ pelas mitocôndrias (NELSON, COX, 2012).
Quando na presença de oxigênio, o complexo da piruvato desidrogenase
(PDH), localizado na matriz mitocondrial, promove a reação de descarboxilação
oxidativa do piruvato, com a redução de uma molécula de NAD+. Essa reação
consiste na remoção do grupo carboxila do piruvato na forma de uma molécula de
CO2. Os dois carbonos remanescentes tornam-se o grupo acetil do acetil-CoA. O
acetil-CoA entra no ciclo do ácido cítrico a medida que a enzima citrato sintase
catalisa sua condensação com o oxaloacetato para a formação de citrato. Em sete
reações em sequência, incluindo duas descarboxilações, o ciclo do ácido cítrico
converte o citrato em oxaloacetato e libera duas moléculas de CO2. A maior parte da
energia de oxidação é temporariamente retida nas coenzimas presentes na matriz
mitocondrial NADH e FADH2, formadas em quatro reações no ciclo do ácido cítrico.
O NADH e FADH2 são oxidados, respectivamente, nos complexos I e II da cadeia
respiratória e os elétrons são transferidos através dos complexos respiratórios para
Introdução
3
O2. O transporte de elétrons está acoplado ao transporte de prótons para o espaço
intermembranas nos complexos I, III e IV, gerando o gradiente eletroquímico de H+
(NICHOLLS, BUDD, 2000; NASSEH et al., 2001; NELSON, COX, 2012).
Glicose
2 Piruvato
2 ATP
2 ADP
4 ADP 2 NAD
+
4 ATP 2 NADH
Fase Preparatória
Fase Pagamento
2 Lactato 2 NAD+
2 FADH2 6 NADH
4 CO2
O2 Hipóxia
Glicólise 2 gliceraldeído
3-fosfato
2 Acetil-CoA 2 CO2
2 NADH
Ciclo do ácido cítrico
Fig. 1 – Esquema das fases da glicólise e os possíveis destinos para o piruvato.
Na membrana mitocondrial interna estão presentes os complexos respiratórios
multienzimáticos (I, II, III e IV); além da ATP sintase (também conhecida como
complexo V) e dos transportadores de elétrons, coenzima Q (UQ) e citocromo c
Introdução
4
conforme apresentados na figura 2 (NICHOLLS, BUDD, 2000; FERREIRA et al.,
2008; NELSON, COX, 2012).
Fig. 2 – Esquema ilustrando o transporte de elétrons e a fosforilação oxidativa mitocondrial (adaptado NELSON, COX, 2012).
Na cadeia transportadora de elétrons, o NADH transfere seus elétrons para a
coenzima Q através do complexo I e o complexo II promove a transferência de
elétrons a partir do FADH2 e succinato para a coenzima Q. Na sequência, o
complexo III transfere elétrons da coenzima Q reduzida (UQH2) para o citocromo c e
então, no complexo IV, os elétrons do citocromo c são transferidos para o oxigênio
molecular, formando água (H2O). É importante ressaltar que à medida que ocorre a
passagem dos elétrons pelos complexos I, III e IV, há o movimento unidirecional de
prótons da matriz para o espaço intermembranar mitocondrial. Portanto um gradiente
eletroquímico de prótons é criado através da membrana mitocondrial interna
(carregada negativamente) (NICHOLLS, BUDD, 2000; NELSON, COX, 2012).
Por existir um potencial eletroquímico mais positivo no espaço intermembranar
quando comparado com a matriz mitocondrial, esta acaba por atrair prótons. Os
Introdução
5
prótons passam pela ATP sintase (Fig. 2) e quando isso ocorre esta muda sua
conformação unindo um ADP à um fosfato (Pi), produzindo ATP (NICHOLLS, BUDD,
2000).
Portanto, a fosforilação oxidativa é o processo final do metabolismo
envolvendo a produção de energia na forma de ATP, ocorrendo apenas na presença
de oxigênio molecular. Estudos recentes mostram uma produção de 30 a 32
moléculas de ATP a partir de uma de glicose, como apresentado abaixo na reação
final de obtenção de ATP pela fosforilação oxidativa a partir de uma molécula de
glicose. Qualquer disfunção da glicólise ou da cadeia transportadora de elétrons
mitocondrial influencia diretamente este processo (FERREIRA et al., 2008; MOTTA,
2011; NELSON, COX, 2012).
Inibidores mitocondriais são comumente utilizados para estudar a função
mitocondrial e o papel no metabolismo energético de cada complexo multienzimático
da cadeia transportadora de elétrons (NICHOLLS, BUDD, 2000). Na tabela 1 estão
representados alguns destes inibidores e o modo como atuam nestes complexos.
Dentre estes compostos, ressaltamos a antimicina A, oligomicina e o FCCP, que
foram utilizados para o presente trabalho.
A antimicina é um inibidor do complexo III da cadeia transportadora de
elétrons, este complexo é um dímero com dois monômeros idênticos, como
apresentado na figura 3. Seus componentes citocromo c1 e a proteína ferro enxofre
de Rieske podem interagir com o citocromo c. Este complexo possui dois sítios de
ligação para a coenzima Q, QN e QP. A antimicina A liga-se ao sítio QN, impedindo o
fluxo de elétrons do heme bH para a coenzima Q (NELSON, COX, 2012).
C6H12O6 + 6 O2 + 30 ADP + 30 Pi 6 CO2 + 6 H2O + 30 ATP
Introdução
6
Fig. 3 – Esquema ilustrativo do complexo III da cadeia transportadora de elétrons (NELSON, COX, 2012).
Tipo de Interferência
Composto Alvo / Modo de ação
Inibição da transferência de
elétrons
Rotenona Impedem a transferência de elétrons do centro Fe-S (complexo I) para a coenzima Q Piericidina A
Mixotiazol Impede o fluxo de elétrons de QH2 para a
proteína ferro enxofre de Rieske
Antimicina A Bloqueia a transferência de elétrons do
citocromo b (complexo III) para o citocromo c
Cianeto Inibe a citocromo c oxidase (complexo IV)
Inibição da ATP sintase
Aurovertina B Inibe a subunidade F1
Oligomicina Inibem as subunidades Fo e CFo
Venturicidina
Desacoplamento da transferência de elétrons com
a fosforilação
FCCP
Carreadores hidrofóbicos de prótons 2,4-Dinitrofenol
Inibição da troca
ATP-ADP Carboxiatractilosídeo
Inibe a translocador de nucleotídeos de
adenina
Tabela I – Compostos que interferem na fosforilação oxidativa (NICHOLLS, BUDD, 2000; NELSON, COX, 2012).
Introdução
7
A ATP sintase (Fig. 4) possui um domínio periférico F1 e uma parte integral Fo,
acoplada a membrana interna mitocondrial. À medida que os prótons fluem do
espaço intermembranas para a matriz mitocondrial através de Fo, o cilindro e a haste
giram, e as subunidades β de F1 mudam de conformação à medida que as
subunidades ɤ se associam com cada uma delas (KAGAWA, RACKER, 1996). Com
isso, uma molécula de ADP é unida com uma de Pi, formando o ATP. Estima-se que
para cada três prótons transportados para a matriz mitocondrial pela ATP sintase,
uma molécula de ATP é formada. Notadamente, a ATP sintase também pode
funcionar de forma inversa, hidrolisando ATP e promovendo o transporte de prótons
da matriz mitocondrial para o espaço intermembranas (NICHOLLS, BUDD, 2000).
Fig. 4 – Esquema exemplificando a ATP sintase mitocondrial (NELSON, COX, 2012).
1.2 Células Tumorais e o Efeito Warburg
Células tumorais apresentam uma organização bioenergética distinta quando
comparadas a células normais. Diferentemente de células normais, onde a maior
parte do ATP obtido é proveniente da fosforilação oxidativa mitocondrial, em células
tumorais o ATP é proveniente majoritariamente da glicólise, mesmo na presença de
oxigênio molecular. Ou seja, células tumorais apresentam predominância da glicólise
e elevada produção de lactato no citosol quando comparadas com a baixa taxa
glicolítica e oxidação do piruvato que ocorre na maioria das células normais. Esse
fenômeno foi observado e caracterizado primeiramente por Otto Warburg há nove
Matriz Mitocondrial
Introdução
8
décadas, recebendo o nome de “efeito Warburg” (WARBURG, 1925; WARBURG et
al., 1927; WARBURG, 1956; HAO et al., 2010; KOPPENOL et al., 2011).
Nos primeiros estudos de Warburg, ele observou um rápido consumo de
oxigênio concomitantemente a uma rápida proliferação celular, levando-o a postular
que tecidos tumorais utilizavam mais oxigênio molecular quando comparados com
tecidos normais. Posteriormente, experimentos de consumo de oxigênio em fígados
de ratos comprometidos por células tumorais foram realizados e observou-se que
estes não consumiam mais oxigênio que tecidos normais, mas que na presença de
O2 o tecido tumoral produzia lactato, o que não se observava em tecidos normais.
Isso indica que em tecidos tumorais a produção de lactato predomina sobre a
entrada de piruvato no ciclo do ácido cítrico, o que daria início à fosforilação oxidativa
(KOPPENOL et al., 2011).
Tecidos normais tendem a consumir menos glicose na presença de O2 do que
o verificado em uma situação de hipóxia, isso porque o rendimento energético em
ATP de uma molécula de glicose é muito maior em meio aeróbico. Já os tecidos que
apresentam células tumorais mostram uma produção de lactato até 100 vezes maior
na presença de oxigênio molecular. Dessa forma, aproximadamente 60% da glicose
consumida pelos tecidos tumorais é convertida a lactato. Com todas essas
indicações, Otto Warburg propôs que o processo de respiração mitocondrial estaria
danificado em células tumorais (KOPPENOL et al., 2011; WU, ZHAO, 2013).
Contudo, estudos recentes têm sugerido que células tumorais apresentam
mitocôndrias funcionais e que a ocorrência do efeito Warburg provavelmente está
associada a uma condição que permite maior síntese de biomassa por estas células
(VANDER HAIDEN et al., 2009; LUNT, VANDER HEIDEN, 2011; KOPPENOL et al.,
2011).
Hipóteses vêm sendo propostas para explicar a ocorrência do efeito Warburg
como mutações em proteínas responsáveis pela regulação da via glicolítica e
mutações genéticas que afetam o funcionamento de enzimas do ciclo do ácido cítrico
como a isocitrato desidrogenase 2 (IDH2), fumarato hidrase (FH) e a succinato
desidrogenase (SDH) (WU, ZHAO, 2013). Portanto, estas alterações enzimáticas
Introdução
9
levariam a uma desregulação no metabolismo oxidativo da glicose em células
tumorais.
Os fatores c-MYC e Hypoxia-Inducible Factor 1 (HIF1) também são críticos
para a tumorigênese em um grande número de tumores. O c-MYC leva à indução da
proliferação celular com consequente aumento em seu metabolismo. Já o HIF1 está
envolvido na adaptação de células quando estas se encontram em microambientes
em hipóxia, levando à ativação da glicólise (DANG, 2007). O HIF1 compreende um
heterodímero constituído pelas subunidades HIF1α e HIF1β, ativando genes
envolvidos na glicólise, contribuindo diretamente com o efeito Warburg.
Circunstâncias em que o c-MYC e o HIF1 são aumentados na presença de oxigênio
molecular, resultam em inibição do efeito Pasteur (menor consumo de glicose na
presença de O2) e indução do efeito Warburg em células tumorais (KIM et al., 2006;
SIMON, 2006). Portanto, estes fatores aumentam a expressão de enzimas que irão
favorecer a ocorrência da glicólise, como piruvato quinase M2 (PKM2), lactato
desidrogenase (LDH-A), e hexoquinase 2 (HKII) (DANG, 2007). Estudos recentes
indicaram evidências que ligam a ocorrência da glicólise aeróbica em células
tumorais pela capacidade do steroid receptor coactivator (SRC) em fosforilar enzimas
glicolíticas. O SRC ativa, posteriormente, o gene HIF1 que irá induzir a glicólise
(KOPPENOL et al., 2011; BAYLEY, DEVILEE, 2012).
A piruvato quinase 2 (PKM2), enzima responsável pela conversão do
fosfoenolpiruvato a piruvato está aumentada em células tumorais (MAZUREK et al.,
2005). Sendo assim, ela permite uma maior captação e utilização da glicose e
produção de lactato. Além disso, ela aumenta a transcrição do HIF1, estimulando
ainda mais a glicólise (BAYLEY, DEVILEE, 2012; YANG et al., 2012). Já se sabe que
ativadores da transcrição da PKM2, como o receptor de fator de crescimento
epidérmico (EGFR), estão alterados em células tumorais, explicando o aumento
desregulado desta enzima (PARSONS et al., 2008; YANG et al., 2012).
A lactato desidrogenase (LDH-A) é ativada pelo HIF1 e é a enzima
responsável pela conversão do piruvato à lactato concomitante com a oxidação do
NADH a NAD+, restabelecendo o potencial redutor para a ocorrência da glicólise. É
Introdução
10
proposto a importância de um ambiente ácido, promovido pelo lactato, favorecendo a
invasão e proliferação de células tumorais para outros tecidos (SHIM et al., 1997;
KOPPENOL et al, 2011; WOLF et al., 2011).
A hexoquinase 2 (HKII) é uma enzima glicolítica chave e geralmente está
desregulada em células tumorais. Normalmente, encontra-se ligada à membrana
mitocondrial externa, tendo acesso a um maior suprimento de ATP, com
consequente favorecimento a sua maior atividade em células tumorais. Cérebros
normais ou gliomas de baixo grau expressam predominantemente a HKI; por outro
lado, gliomas de alto grau de malignidade hiperexpressam a HKII. Verificou-se que
quando ocorre a deleção da HKII, as células são capazes de recuperar seu
metabolismo glicolítico normal e aumentar a sensibilidade à morte celular, sendo
assim, a HKII é apontada como uma possível resistência para a apoptose nessas
células (GERSHON et al., 2013). Além disso, quando a HKII é inativada, ocorre a
inibição da glicólise aeróbica, ou seja, a inibição do metabolismo predominantemente
glicolítico característico de uma célula tumoral, favorecendo o metabolismo oxidativo
normal. Observa-se ainda um aumento de proteínas da cadeia transportadora de
elétrons e o aumento do consumo de oxigênio após a inativação da HKII (WOLF et
al., 2011; BAYLEY, DEVILEE, 2012).
1.3 Efeito Warburg e Síntese de Biomassa
Em células normais uma proliferação descontrolada não ocorre, pois estas
células normalmente não utilizam todos os nutrientes presentes disponíveis em seus
microambientes; a não ser que sejam estimuladas por fatores de crescimento.
Células tumorais possuem mutações gênicas que alteram determinados receptores
que iniciam a via de sinalização para a duplicação celular. Algumas destas
sinalizações ativam a captação e o metabolismo de nutrientes, que promovem a
sobrevivência e a proliferação celular. Como descrito anteriormente, células tumorais
convertem piruvato à lactato mesmo na presença de oxigênio molecular, o que nos
indica que o metabolismo glicolítico pode providenciar energia suficiente para a
Introdução
11
proliferação celular (VANDER HAIDEN et al., 2009; LUNT, VANDER HEIDEN, 2011).
Ainda como característica das células que utilizam a glicólise aeróbica, estas
apresentam uma elevada razão de ATP/ADP e NADH/NAD+ (CHRISTOFK et al.,
2008; DEBERARDINIS et al., 2008).
Para que ocorra o processo mitótico de uma célula, é necessário que todo o
conteúdo celular seja replicado. Sendo assim, nucleotídeos, aminoácidos e lipídeos
são altamente necessários para esse processo. Apesar da hidrólise do ATP
proporcionar energia livre para reações bioquímicas responsáveis pela formação da
biomassa celular, este processo requer outros intermediários metabólicos. A saber, a
síntese do palmitato, um importante constituinte da membrana celular, requer 7
moléculas de ATP, 16 carbonos provenientes de 8 moléculas de acetil-CoA e 28
elétrons de 14 moléculas de NADPH. Da mesma forma, a síntese de aminoácidos e
nucleotídeos consome mais carbono e NADPH que o próprio ATP. Adicionalmente,
para a produção de uma cadeia de ácidos graxos contendo 16 carbonos, uma
molécula de glicose proporciona 5 vezes mais ATP que o necessário, enquanto é
necessário 7 moléculas de glicose para a produção necessária de NADPH (VANDER
HAIDEN et al., 2009, LUNT, VANDER HEIDEN, 2011).
A glicose, por si só, é capaz de fornecer todo o carbono, nitrogênio e energia
livre necessária para suportar o crescimento e divisão celular. Direcionar toda glicose
para a fosforilação oxidativa mitocondrial para maximizar a produção de ATP vai
contra as necessidades do processo de proliferação celular. Parte da glicose deve
ser desviada para percursores macromoleculares, tais como acetil-CoA para a
produção de ácidos graxos, intermediários glicolíticos para a síntese de aminoácidos
não essenciais, e ribose para a produção de nucleotídeos. Isso pode explicar a
vantagem do efeito Warburg, onde até 90% do piruvato, proveniente da glicose, é
convertido a lactato (DEBERARDINIS et al., 2007; VANDER HAIDEN et al., 2009;
LUNT, VANDER HEIDEN, 2011).
Introdução
12
1.4 Gliomas Humanos
Os gliomas são neoplasias tendo origem a partir de células gliais no sistema
nervoso. Os gliomas podem ser originados de astrócitos, oligodendrócitos ou células
ependimárias (SILVA et al., 2010). As células da glia são células não neuronais do
sistema nervoso que proporcionam suporte e nutrição aos neurônios. Os neurônios
são responsáveis pela propagação de impulsos nervosos, já as células da glia
desempenham inúmeras funções. As células da glia são um conjunto de vários tipos
celulares, dentre estes microgliócitos, células ependimárias, astrócitos,
oligodendrócitos, e células de Schwann (MACHADO, 2006).
Os microgliócitos são células que representam o sistema mononuclear
fagocitário no sistema nervoso central (SNC), ou seja, eles são os macrófagos do
tecido nervoso, participando assim do processo de inflamação e da reparação desse
tecido. Os microgliócitos também secretam diversas citocinas, as quais regulam o
processo imune e removem os restos celulares que surgem nas lesões do SNC. As
células ependimárias revestem os ventrículos cerebrais e o canal medular e são
responsáveis pela formação do líquido cefalorraquidiano. Os astrócitos estão
relacionados à homeostase metabólica e iônica do SNC, desempenhando papéis
como o funcionamento e formação das sinapses, nutrição dos neurônios, regulação
da concentração de diversas substâncias com potencial para interferir nas funções
neuronais, liberação de neurotransmissores e participação na barreira
hematoencefálica. Dentre estas funções, se destacam as de sustentação e nutrição
dos neurônios. As extremidades dos prolongamentos dos astrócitos circundam os
vasos sanguíneos e através deles, os nutrientes são levados até os neurônios. Os
oligodendrócitos são os responsáveis pela formação da mielina a partir de lipídeos e
proteínas. A mielina envolve os neurônios do sistema nervoso central fornecendo
uma proteção isolante aos neurônios. As células de Schwann possuem a mesma
função dos oligondendrócitos, diferenciando que as bainhas de mielina são
produzidas em volta dos axônios do sistema nervoso periférico (SNP) (LODISH et al.,
2005).
Introdução
13
Os gliomas são divididos em várias categorias de acordo com as células que
os originaram. Os mais frequentes são os astrocitomas, oligodendrogliomas e
ependimonas. De acordo com a morfologia e histologia, os astrocitomas são
subdivididos em quatro grupos de acordo com seu grau de malignidade. Os
astrocitomas pilocíticos, ou de grau I, apresentam um crescimento lento, limites
morfológicos bem definidos e geralmente estão restritos a uma determinada região
do SNC. Já o astrocitoma de baixo grau, ou grau II, é um tipo de astrocitoma de
crescimento relativamente lento, porém mais rápido do que o astrocitoma pilocítico.
Pode ou não invadir o tecido cerebral normal, no entanto tende a reaparecer após o
tratamento. Este reaparecimento pode ocorrer em um grau de malignidade maior. O
astrocitoma anaplásico, ou de grau III, cresce mais rapidamente do que o
astrocitoma de grau II, tendo uma tendência a invadir o tecido cerebral normal e
também de recidivar após o tratamento. O astrocitoma de grau IV, conhecido como
glioblastoma multiforme, é o tipo mais maligno e com o crescimento mais rápido de
todos os astrocitomas. Sob um microscópio, vários tipos de células diferentes podem
ser observados neste tumor, incluindo astrócitos e oligodendrócitos. Áreas de
necrose tumoral também são frequentemente observadas no centro do tumor. O
glioblastoma multiforme tende a crescer e se espalhar rapidamente, invadindo o
tecido normal do cérebro. A conduta no que diz respeito ao seu tratamento ainda é
bastante ineficaz apresentando um prognóstico, na maioria das vezes, bem ruim,
com uma expectativa média de vida de aproximadamente 14 meses a partir do
momento do diagnóstico (LOUIS et al., 2007; INSTITUTO ONCOGUIA, 2012).
Existem várias linhagens celulares imortalizadas de gliomas que são utilizadas
no estudo destas neoplasias malignas que acometem o sistema nervoso central. A
linhagem U-87MG é uma linhagem imortalizada de glioblastoma multiforme humano
que possui os genes mutantes CDKN2A, PTEN e CDKN2C. A segunda linhagem
celular utilizada neste estudo, T98G, também é derivada de um glioblastoma
multiforme humano. A diferença no cariótipo destas células encontra-se descrita a
seguir na tabela II e foi estabelecida pelo método de análise de repetição de arranjos
curtos (STR, short tandem repeat). A análise de repetição de arranjos curtos é uma
Introdução
14
técnica de análise para avaliar regiões específicas no DNA. Aproximadamente 99%
do DNA de um ser humano é idêntico ao DNA de qualquer outro ser humano. No
entanto, regiões polimórficas do DNA podem variar de pessoa para pessoa. Um tipo
de polimorfismo do DNA são as repetições de arranjos curtos. Portanto, a análise de
STR verifica a variação do número de repetições em cada região polimórfica, sendo
assim, a variação nas repetições distingue um perfil de DNA entre os seres humanos
(ATCC, 2014).
Loci dos
polimorfismos
Análise de Repetição de Arranjos Curtos - STR
U-87MG T98G
Amelogenin X X,Y
CSF1PO 10,11 10,12
D13S317 8,11 13
D7S820 8,9 9,10
D5S818 11,12 10,12
D16S539 12 13
vWA 15,17 17,20
THO1 9.3 7, 9.3
TPOX 8 8
Tabela II – Variação dos locis analisados pelo método de repetição de arranjos curtos (STR) (fonte ATCC.org, 2014).
As linhagens celulares U-87MG e T98G foram utilizadas nos protocolos
experimentais no presente trabalho. Astrócitos de ratos neonatos mantidos em
cultura primária foram utilizados em um protocolo experimental com o objetivo de se
estabelecer uma comparação com uma célula proliferativa, mas não tumoral.
Objetivos
15
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
As células tumorais utilizam quase que exclusivamente a via glicolítica para a
obtenção de ATP, ao contrário da maioria das células não tumorais que utilizam a
fosforilação oxidativa, uma via muito mais eficiente para a obtenção de ATP. Este
trabalho objetivou uma melhor compreensão da bioenergética mitocondrial no
processo de proliferação de células tumorais.
2.2 Objetivos específicos
a) Avaliar a importância da ATP sintase e da cadeia transportadora de
elétrons na proliferação de células de glioblastoma e astrocíticas, conduzindo
experimentos na ausência e presença de inibidores destes sistemas.
b) Correlacionar o efeito na proliferação celular de inibidores da ATP
sintase e da cadeia transportadora de elétrons com alterações no metabolismo
energético celular e do potencial de membrana mitocondrial.
Materiais e Métodos
16
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Linhagens de células e reagentes químicos
A maioria dos compostos químicos, incluindo ácido N-2-hidroxietilpiperazina-
N’-2’-etanosulfônico (HEPES), antimicina A, azul de tripan, brometo de azul tiazoil
tetrazólio (MTT), carbonil cianeto de p-trifluorometoxifenil-hidrazona (FCCP), cloreto
difenileneiodonio (DPI), dimetilsulfóxido (DMSO), oligomicina, tetrafenilborato de
sódio (TPB-) foram obtidos da Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA). Iodeto de
propídeo (PI) e tetrametilrodamina metil éster (TMRM) foram obtidos da Invitrogen
(Carlsbad, CA, USA). Os meios de cultura Dulbecco’s modified Eagle’s medium
(DMEM) contendo 2 g/L e 4,5 g/L de glicose, solução de tripsina/EDTA 250 mg %,
tampão fosfato salina (PBS), soro fetal bovino e soro equino foram obtidos da
Vitrocell (Campinas, SP, Brasil).
As soluções de antimicina A, oligomicina, TMRM foram preparadas em DMSO.
As soluções de oligomicina e antimicina A foram preparadas em uma concentração
de 4 mg/mL e 4 mM respectivamente, filtradas e utilizadas como soluções estoques.
Para possibilitar a adição simultânea destes dois inibidores mitocondriais mantendo-
se a mesma quantidade de DMSO, uma solução estoque foi preparada com ambos
inibidores nas concentrações mencionadas acima.
As células utilizadas foram de linhagens derivadas de glioblastoma multiforme
humano (grau IV), U-87MG e T98G. As linhagens U-87MG e T98G foram adquiridas
da ATCC (Manassas, EUA). A linhagem T98G também nos foi cedida pela Profa Dra
Suely Kazue Nagahashi Marie (USP, São Paulo). As células foram armazenadas em
nitrogênio líquido na sala de cultura do laboratório de Bioenergética da FCM, prédio
FCM 15, UNICAMP.
Materiais e Métodos
17
3.2 Cultura de Células
As células U-87MG e T98G foram continuamente mantidas a 37°C em
atmosfera umidificada com 5% de CO2 e 95% de ar, em frascos de cultura de 150
cm2 de superfície e em meio Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) (2 g/L de
glicose), suplementado com soro fetal bovino 10% e antibiótico (100 U/mL de
penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina). A manutenção das células foi realizada a
cada dois ou três dias por meio da passagem das células (aproximadamente 50.000
células/cm2) para novas garrafas. As células aderidas foram previamente lavadas
com tampão fosfato salina (PBS) e em seguida foi utilizada uma solução de
tripsina/EDTA (250 mg %) a 37°C para dissociar as células da superfície. A ação da
tripsina foi inativada pela adição de meio DMEM suplementado. A passagem das
células para novas garrafas foi realizada após a centrifugação da suspensão a 2.800
g por 5 min e ressuspensão do sedimento resultante em 6 mL de DMEM 2 g/L
glicose suplementado. Os experimentos foram realizados quando as células estavam
entre a 4ª e a 20ª passagem.
3.3 Cultura Primária de Astrócitos
Cultura primária de astrócitos foi obtida a partir de 10 a 12 ratos Wistar com
idade de 2 dias, utilizando o método de MECHA et al. (2011), com modificações.
Primeiramente os neonatos foram higienizados com etanol 70% e em seguida
decapitados dentro de uma cabine de fluxo laminar horizontal. Utilizando materiais
esterilizados, os cérebros foram dissecados em meio DMEM 4,5 g/L de glicose, sem
vermelho de fenol, suplementado com antibiótico (100 U/mL de penicilina e 100
μg/mL de estreptomicina). O cerebelo, tronco encefálico e bulbos foram descartados,
assim como as meninges, com auxílio de uma lupa. Em seguida, o tecido foi
picotado, tratado com tripsina 30 μM e incubado a 37ºC em atmosfera umidificada
com 5% de CO2 e 95% de ar para dissociação. Após 20 min, DMEM 4,5 g/L de
glicose, suplementado com 10% de soro eqüino, 5% de soro fetal bovino e antibiótico
(100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina) foi adicionado para
Materiais e Métodos
18
inativação da tripsina na presença de DNAse 1 mg/mL. O tecido foi então dissociado
mecanicamente com pipeta sorológica previamente revestida com soro fetal bovino,
e o homogenato celular resultante foi filtrado em malha de nylon de 100 μm (BD
Falcon Cell Strainer) para retirada de resíduos celulares. Na sequência, a suspensão
foi centrifugada a 1.000 rpm durante 10 min. O sobrenadante foi descartado e a
suspensão celular foi novamente centrifugada em solução de BSA 4% para impedir
contaminação por bactérias. O pellet foi ressuspendido em DMEM 4,5 g/L de glicose,
suplementado com 10% de soro equino, 5% de soro fetal bovino e antibiótico (100
U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina). A seguir, o pellet foi disposto e
mantido em 2 ou 3 garrafas com superfície de 75 cm2 próprias para a aderência de
culturas celulares primárias. Após três dias, as garrafas foram mantidas sob agitação
constante de 240 rpm, durante 6 horas para descolamento de oligodendrócitos e
outros tipos celulares. Em seguida, as garrafas foram lavadas de 3 a 5 vezes com
PBS e os astrócitos que permaneceram aderidos foram tripsinizados e passaram
pelo procedimento usual de manutenção das culturas celulares, permanecendo
viáveis por até 5 passagens.
3.4 Microfotografias
As microfotografias das células U-87MG e T98G foram capturadas através de
microscópio Leica DMLB operando com sistema digital de imagem Leica DC 300F
acoplado ao software de aquisição “Image Manager 50 1.2” (Leica Microsystems,
Bannockburn, IL), localizado no Instituto de Biologia, UNICAMP. Para captura das
fotos foi empregado o modo de contraste de fase óptico invertido, utilizando objetiva
com aumento de 20x.
Estas células foram dispostas em placas de 6 poços (9,6 cm²/poço) em uma
confluência de 15.000 células/cm² em 4 mL de meio DMEM contendo vermelho de
fenol, glicose 2 g/L, suplementado como descrito no item 3.2. As culturas de células
foram mantidas a 37°C em atmosfera umidificada com 5% de CO2 e 95% de ar. Após
24 h do plaqueamento (D0), o meio foi trocado e foram adicionados DMSO 0,025%,
oligomicina 1 µg/mL, antimicina A 1 µM ou oligomicina mais antimicina A. Após 2 e 4
Materiais e Métodos
19
dias (D2 e D4), o meio foi renovado com as respectivas drogas. As microfotografias
foram realizadas 24 horas após o plaqueamento (D0) e após 5 dias de tratamento
(D5) com os inibidores mitocondriais.
3.5 Medida de Viabilidade Celular por MTT
O método de viabilidade celular por MTT é um teste colorimétrico que utiliza o
sal brometo de azul tiazoil tetrazólio como substrato de uma reação enzimática. O
método tem como princípio testar a viabilidade celular pela atividade enzimática de
desidrogenases intracelulares (LIU et al., 1997), que convertem o sal em cristais de
formazan. Os cristais de formazam são solubilizados pela adição de uma solução
ácida de dodecil sulfato de sódio (SDS 10% em HCl 10 mM) e após 24 horas a
densidade óptica das amostras é determinada pela subtração das absorbâncias nos
comprimentos de onda 570 e 650 nm, através de um leitor de placas (BIOTEK,
Power Wave XS2) (CHAPDELAINE, 2011). Este teste foi aplicado para se estimar a
proliferação das células de glioblastomas em cultura, U-87MG e T98G, como
também a proliferação de astrócitos em cultura primária.
A solução de MTT 1 mg/mL foi preparada em meio DMEM 2 g/L de glicose e
sem vermelho de fenol e mantida por até uma semana a 4ºC. Em cada amostra,
após a remoção do meio de incubação foi adicionado 2 mL da solução de MTT,
seguindo-se uma incubação por 90 min a 37°C em atmosfera umidificada com 5% de
CO2 e 95% de ar. Em seguida foi adicionada a solução ácida de SDS e após 24 h, as
amostras foram lidas conforme descrito anteriormente.
Previamente à adição da solução de MTT, as células foram plaqueadas em
placas de 6 poços (9,6 cm²/poço) em uma confluência de 15.000 células/cm² em 4
mL de meio DMEM contendo vermelho de fenol, glicose 2 g/L, suplementado como
descrito no item 3.2. As placas foram mantidas a 37°C em atmosfera umidificada
com 5% de CO2 e 95% de ar durante 24 h após o plaqueamento para aderirem à
superfície dos poços. Logo após, as células foram tratadas com DMSO 0,025%
(controle), oligomicina 1 µg/mL, antimicina A 1 µM ou oligomicina mais antimicina A.
Materiais e Métodos
20
Este experimento transcorreu durante 7 dias corridos, D0 – D7, onde “D” representa
os dias. D0 é o tempo em que as células começaram a ser tratadas (após 24 horas
do plaqueamento). D0, D2, D4 e D6 foram os dias em que o teste do MTT foi iniciado
e as respectivas leituras foram feitas em D1, D3, D5 e D7. As células tiveram o meio
renovado com as respectivas drogas em D2 e D4.
3.6 Medida de Viabilidade Celular por Azul de Tripan
Primeiramente foi realizado o plaqueamento das células U-87MG e T98G
(5.000 células/cm2) em placas de 6 poços (9,6 cm2) e estas foram mantidas em 4 mL
de meio DMEM 2 g/L com vermelho de fenol suplementado como descrito no item
3.2, mantidas a 37°C em atmosfera umidificada com 5% de CO2 e 95% de ar. Após
transcorridas 24 h (D0) para aderência das células na superfície dos poços, o meio
foi trocado e foram adicionados DMSO 0,025% (Controle), oligomicina 1 µg/mL,
antimicina A 1 µM ou oligomicina mais antimicina A. Após 2 e 4 dias (D2 e D4), o
meio foi renovado com as respectivas drogas e as células permaneceram incubadas
nas mesmas condições descritas anteriormente. Posteriormente, as células foram
ressuspendidas e a estimativa da viabilidade celular foi realizada por meio da
contagem das células em câmara de Neubauer após a diluição da suspensão celular
em azul de tripan 0,1% em PBS. Os valores absolutos obtidos são de células viáveis
por poço encontrados no quinto dia após a adição dos compostos mencionados
acima (D5).
3.7 Medida do consumo de O2 por células U-87MG e T98G intactas
Para as medidas do consumo de oxigênio molecular (O2) por células intactas
em suspensão foi utilizado um oxígrafo constituído por uma cubeta de 1,4 mL com
temperatura controlada a 37ºC, agitação constante e um eletrodo sensível ao
oxigênio, eletrodo de Clark (Yellow Spring Instruments, EUA). Este eletrodo é envolto
por uma membrana de poliestireno e por uma solução saturada de cloreto de
potássio (KCl), localizada entre o eletrodo e a membrana, sendo possível a
Materiais e Métodos
21
passagem de corrente elétrica. Considerou-se a solubilidade do oxigênio molecular
(O2) em água como sendo de 200 μmol/L, a 37°C e 1 atm (ROBINSON, COOPER;
1970).
As células U-87MG e T98G foram tripsinizadas, contadas em câmara de
Neubauer e adicionadas a uma concentração de 4.000.000 células/mL na cubeta do
oxígrafo em meio DMEM 2 g/L com vermelho de fenol suplementado com HEPES 20
mM (pH 7,2). Após o registro da respiração basal, foi adicionada oligomicina 1 µg/mL
e/ou antimicina A 1 µM, seguida pela adição de FCCP 1 µM, para se obter o máximo
consumo de oxigênio.
3.8 Medida do Consumo de Glicose e Produção de Lactato
As medidas do consumo de glicose e da produção de lactato por células U-
87MG e T98G em cultura foram realizadas através de kits colorimétricos
comercializados pela empresa Bioclin (Belo Horizonte, MG, Brasil), cuja referência
dos produtos é K082 e K084, respectivamente.
O kit de glicose é constituído por elemento tamponante (pH 7,0) 36 mmol/L,
fenol 10 mmol/L, 4-aminoantipirina 0,3 mmol/L, azida sódica 7,7 mmol/L, glicose
oxidase >10.000 U/L e peroxidase >700 U/L. O teste consiste na oxidação da glicose
pela enzima glicose oxidase (GOD), de acordo com a seguinte reação:
Na presença da peroxidase, o peróxido de hidrogênio formado, reage com a 4-
aminoantipirina e fenol, originando um produto de coloração avermelhada, cuja cor é
proporcional à concentração de glicose no meio. Como padrão foi utilizado uma
amostra contendo 100 mg/dL de glicose. A absorbância das amostras foi lida em um
comprimento de onda de 505 nm.
O kit de lactato é constituído por tampão borato (pH 10,0), lactato
desidrogenase (LDH) >24 kU/L, azida sódica 15,38 mmol/L, NAD+ >4 mmol/L e
Glicose + O2 + H2O Ácido Glucônico + H2O2 GOD
Materiais e Métodos
22
tampão citrato (pH 3,0) 200 mmol/L. O teste consiste na reação catalisada pela LDH
entre lactato e NAD+, com a produção de piruvato e NADH.
Como padrão foi utilizado uma amostra contendo 10 mg/dL de lactato. A absorbância
do NADH foi determinada em um comprimento de onda de 340 nm.
As células foram plaqueadas em placas de 6 poços (9,6 cm²/poço) em uma
confluência de 15.000 células/cm² em 4 mL de meio DMEM contendo vermelho de
fenol, glicose 2 g/L, suplementado como descrito no item 3.2, mantidas a 37°C em
atmosfera umidificada com 5% de CO2 e 95% de ar. Após 24 h o meio foi renovado e
depois de 48 h as células foram tratadas com DMSO 0,025% (Controle), oligomicina
1 µg/mL, antimicina A 1 µM ou oligomicina mais antimicina A em meio DMEM 2 g/L
de glicose, suplementado e sem vermelho de fenol. Após 20 h do tratamento, foi
retirado 1 mL de meio de cada poço para a realização das dosagens de glicose e
lactato, em placas de 96 poços. Os valores obtidos foram descontados do valor do
branco (reagentes dos kits de determinação mais meio de cultura).
3.9 Estimativa do Potencial de Membrana Mitocondrial de Células Intactas
Dois protocolos experimentais foram utilizados para a avaliação dos efeitos
dos inibidores mitocondriais no potencial de membrana mitocondrial em células
intactas, U-87MG e T98G. No primeiro protocolo, avaliou-se o efeito imediato no
potencial de membrana dos inibidores mitocondriais. Em um segundo protocolo,
avaliou-se o impacto da incubação durante 24 horas com os inibidores mitocondriais
(oligomicina e/ou antimicina A) no potencial de membrana. Em ambos os protocolos,
o potencial de membrana das suspensões celulares foi avaliado sob proteção da luz
em um fluorímetro (Shimadzu RF-5301PC, Kyoto, Japão) equipado com agitação
magnética constante e operando em comprimentos de onda de 553 e 576 nm para
excitação e emissão respectivamente, slits de 3 nm e uma resposta de 2 segundos.
As suspensões celulares foram tripsinizadas e ressuspensas em meio de leitura
Lactato + NAD+ Piruvato + NADH LDH
Materiais e Métodos
23
DMEM 2 g/L de glicose, sem vermelho de fenol e suplementado com HEPES 20 mM
(pH 7,2). Ambos protocolos foram estabelecidos pela metodologia de PERRY et al.
(2011).
Para a avaliação do efeito imediato dos inibidores mitocondriais no potencial
de membrana, o meio foi acrescido do marcador fluorescente catiônico, TMRM 500
nM, que é rapidamente sequestrado pelas mitocôndrias ativas, na presença de TPB-
1 µM. Após 3-4 minutos adicionou-se as células (2.000.000 células/mL) ao meio de
leitura e durante os 7-8 minutos seguintes observou-se a captação, pelas células, do
marcador TMRM. A seguir, os inibidores mitocondriais foram adicionados conforme
mostrado nas figuras correspondentes. Ao final de cada medida adicionou-se o
desacoplador mitocondrial FCCP 250 nM, um protonóforo que desfaz o gradiente
eletroquímico de prótons transmembrana.
No segundo protocolo para avaliação do potencial de membrana mitocondrial,
15.000 células/cm2 foram mantidas em placas de 6 poços de 9,6 cm2 e incubadas em
meio DMEM 2 g/L de glicose suplementado como descrito no item 3.2 e mantidas a
37°C em atmosfera umidificada com 5% de CO2 e 95% de ar. O meio foi renovado
após 24 h e as culturas de células foram mantidas por mais 48 h a 37°C em
atmosfera umidificada com 5% de CO2 e 95% de ar. A seguir, as células foram
incubadas durante 24 h na presença dos inibidores mitocondriais. Posteriormente, as
células foram ressuspensas em 2 mL no meio de leitura acrescido de seus
respectivos inibidores mitocondriais e TPB- 1 µM. Após os 3 primeiros minutos,
adicionou-se TMRM 500 nM e a fluorescência foi acompanhada por 9-10 min. Ao
final de cada traçado adicionou-se FCCP 250 nM. Para cada condição experimental,
a diferença entre a fluorescência antes (F) e após a adição de FCCP (FFCCP) foi
utilizada como um parâmetro na estimativa do potencial de membrana mitocondrial.
3.10 Análise do Ciclo Celular em Células U-87MG e T98G
O protocolo experimental para a avaliação do ciclo celular nas células U-87MG
e T98G foi adaptado de POZAROWSKI, DARZYNKIEWICZ (2004) e CARVALHO et
Materiais e Métodos
24
al. (2008) utilizando-se iodeto de propídeo (PI) mediante a presença dos tratamentos
com DMSO 0,025% (Controle), oligomicina 1 µg/mL, antimicina A 1 µM ou
oligomicina mais antimicina A. O experimento transcorreu durante 6 dias.
Primeiramente, as células foram plaqueadas em garrafas de 25 cm² (7.000
células/cm²) em 6 mL de meio DMEM 2 g/L de glicose com vermelho de fenol,
suplementado conforme descrito no item 3.2 e mantidas a 37°C em atmosfera
umidificada com 5% de CO2 e 95% de ar. Após 24 horas do plaqueamento, essas
células sofreram o processo de carenciamento, que consiste na troca por um meio
DMEM 2 g/L de glicose suplementado apenas com antibiótico (100 U/mL de
penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina). Nesta etapa, o soro fetal bovino, que é um
fator de crescimento celular, foi retirado possibilitando que todas as células partissem
da mesma fase do ciclo celular. Após 24 horas do carenciamento (D0), as primeiras
amostras foram retiradas e mantidas à -20ºC, para avaliar a sincronização das fases
do ciclo celular, e as outras amostras receberam seus tratamentos específicos. Após
48 horas (D2), o meio foi renovado com seus respectivos tratamentos e então, após
mais 48 horas (D4) as amostras foram tripsinizadas, centrifugadas a 4°C durante 5
minutos à 500 g. As suspensões celulares foram ressuspendidas em 1 mL de etanol
70% e mantidas a -20ºC. As células permaneceram nesta temperatura por pelo
menos 24 horas para que ocorresse a lise da membrana plasmática e nuclear,
liberando o DNA.
As amostras retiradas do freezer foram centrifugadas à 4°C, durante 10
minutos, à 500 g. O sobrenadante foi aspirado delicadamente com uma pipeta
automática e descartado. Ao pellet de células, foi adicionado 4 µL de RNAse 1
mg/mL, e 40 µL de uma solução com o marcador fluorescente iodeto de propídeo
(1% citrato de sódio, 1% triton X-100 e 500 µg/mL de iodeto de propídeo) e 356 µL
de PBS, totalizando um volume final de 400 µL. As amostras foram incubadas à
37ºC, durante 30 min, protegidas da luz e em seguida foram incubadas à 4ºC,
durante 2 h, protegidas da luz. A análise do ciclo celular foi realizada por um
citômetro de fluxo FACSCalibur (Becton Dickinson), equipado com laser de argônio,
por meio da leitura da fluorescência do iodeto de propídeo (PI) captado no canal FL-
Materiais e Métodos
25
2, coletando-se 10.000 eventos de cada amostra. Os dados resultantes foram
analisados utilizando-se o software ModFit LT versão 2.0.
3.11 Análise Estatística
Os dados experimentais foram analisados utilizando-se o software GraphPad
Prism 5 (GraphPad Software, La Jolla, CA). Os valores foram submetidos à análise
de variância de medidas repetidas (ANOVA de uma ou duas vias), seguida por teste
Bonferroni. Os dados estão representados como a média ± erro padrão da média (±
SEM) de pelo menos quatro experimentos independentes onde P < 0,05 (*, #) e P <
0,01 (**, ##) foram considerados significativos.
Resultados e Discussão
26
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Células tumorais utilizam preferencialmente a glicólise como fonte de
obtenção de ATP, ao contrário de células diferenciadas e não tumorais que utilizam
sobretudo a fosforilação oxidativa para a produção do mesmo. Na glicólise são
produzidos somente 2 ATPs por molécula de glicose, enquanto que na fosforilação
oxidativa são obtidos aproximadamente 30 ATPs. Sendo assim, as células tumorais
utilizam pouco a mitocôndria para a obtenção de energia. Os experimentos descritos
a seguir foram realizados tentando elucidar qual o papel da bioenergética
mitocondrial na proliferação de células de glioblastoma humano.
4.1 Efeito da inibição da ATP sintase e/ou da cadeia transportadora de
elétrons na proliferação de células de glioblastoma humano
Para verificar a taxa de proliferação das células de glioblastoma humano, U-
87MG e T98G, três metodologias distintas foram utilizadas: teste de redução do MTT
com a produção de cristais de formazan (Fig. 5), contagem de células viáveis pelo
método de exclusão com azul de Tripan (Fig. 6) e aquisição de microfotografias por
um microscópio de contraste de fases invertido (Fig. 7).
Em células U-87MG mantidas em cultura durante 6 dias, observou-se que em
situação controle ocorre um aumento de aproximadamente 14 vezes na atividade
metabólica de redução do MTT, o que pode ser evidenciado pelos valores de
absorbância que passaram de 0,1 para 1,4 neste período. Quando estas células
foram tratadas com oligomicina, um inibidor da ATP sintase, observou-se uma
inibição de 21,1% na proliferação desta linhagem. Uma vez que o tratamento
transcorreu com antimicina A, um inibidor do complexo III da cadeia transportadora
de elétrons, a inibição da proliferação celular foi de 49,8%. Quando ambas as drogas
estavam presentes, i.e. oligomicina mais antimicina A, as células mostraram um
pequeno aumento na proliferação durante os 4 primeiros dias, seguido por uma
tendência à diminuição da atividade metabólica da redução do MTT até o final do
Resultados e Discussão
27
sexto dia. Ao final do sexto dia observou-se uma inibição de 81,2% na proliferação
desta linhagem na presença de oligomicina mais antimicina A.
Quando se avaliou as células T98G após 6 dias em cultura, a situação
controle apresentou um aumento de aproximadamente 6 vezes na atividade de
redução do MTT em relação ao primeiro dia de leitura das absorbâncias das
amostras, sendo obtidos os valores de absorbância de 0,2 no início do tratamento e
1,4 ao final dos 6 dias. Durante o tratamento com oligomicina, observou-se uma
inibição na taxa de proliferação celular de 25%. Quando se avaliou a taxa de inibição
da proliferação celular pela antimicina A, esta foi de 33,5%. Uma vez que estiveram
presentes oligomicina mais antimicina A, foi constatado um pequeno aumento na
proliferação das células até o segundo dia, seguido por um declínio durante os
próximos 4 dias em cultura. Ao final do sexto dia, na presença de oligomicina mais
antimicina A, observou-se uma inibição de 83,3% na proliferação desta linhagem.
Fig. 5 - Efeito inibitório de oligomicina e antimicina A na proliferação de células de glioblastoma humano U-87MG e T98G.
Células U-87MG e T98G (15.000 células/cm2) foram dispostas em placas de 6 poços (9,6 cm2/poço) em 4 mL de meio DMEM contendo vermelho de fenol, glicose 2 g/L, soro fetal bovino 10% e antibiótico. As culturas de células foram mantidas a 37°C em atmosfera umidificada com 5% de CO2 e 95% de ar. Após 24 h (D0), o meio foi trocado e foram adicionados DMSO 0,025% (Control), oligomicina 1 µg/mL (Oligo), antimicina A 1 µM (AA) ou oligomicina mais antimicina A (Oligo + AA). Após 2 e 4 dias (D2 e D4), o meio foi renovado com as respectivas drogas. A figura apresenta os resultados de proliferação celular estimados pela redução de MTT com a produção de azul de formazan. Os dados representam a média ± S.E.M de pelo menos 4 experimentos independentes realizados em duplicata. *P<0,05, **P<0,01 vs Control. #P<0,05, ##P<0,01 vs Oligo+AA.
U-87MG
0 2 4 60.0
0.5
1.0
1.5 Control
Oligo
AA
Oligo + AA **##
**####
*#
Days of Treatment
Op
tica
l d
en
sity
of
form
aza
n a
bso
rba
nce
T98G
0 2 4 60.0
0.5
1.0
1.5 Control
Oligo
AA
Oligo + AA **##
**##
**##
**##
Days of Treatment
Op
tica
l d
en
sity
of
form
aza
n a
bso
rba
nce
Resultados e Discussão
28
Quando foi avaliada a proliferação celular pela contagem de células viáveis
por exclusão de azul de Tripan (Fig. 6), um padrão semelhante de proliferação
àquele observado pelo método do MTT foi verificada. As células U-87MG
apresentaram uma maior taxa proliferativa em relação às células T98G.
U-87MG
0 2 4 60
1.0106
2.0106
3.0106
Control
Oligo
AA
Oligo + AA
**##
**##
Time (days)
Ce
ll N
um
be
r
T98G
0 2 4 60
1.0106
2.0106
Control
Oligo
AA
Oligo + AA
**##
**##
Time (days)
Ce
ll N
um
be
r
Fig. 6 - Efeito de oligomicina e antimicina A na proliferação de células de glioblastoma humano U-87MG e T98G.
Células U-87MG e T98G (5.000 células/cm2) foram dispostas em placas de 6 poços (9,6 cm2/poço) em 4 mL de meio DMEM contendo vermelho de fenol, glicose 2 g/L, soro fetal bovino 10% e antibiótico. As culturas de células foram mantidas a 37°C em atmosfera umidificada com 5% de CO2 e 95% de ar. Após 24 h (D0), o meio foi trocado e foram adicionados DMSO 0,025% (Control), oligomicina 1 µg/mL (Oligo), antimicina A 1 µM (AA) ou oligomicina mais antimicina A (Oligo + AA). Após 2 e 4 dias (D2 e D4), o meio foi renovado com as respectivas drogas. Na figura são mostrados os valores absolutos de células viáveis por poço encontrados no sexto dia após o plaqueamento nas situações descritas acima. As células viáveis foram contadas em câmara de Neubauer com azul de tripan a 0,1% em PBS. Na figura, os valores representam a média ± S.E.M de pelo menos 6 experimentos independentes. **P<0,01 vs Control. ##P<0,01 vs Oligo+AA.
No início do tratamento haviam sido plaqueadas 48.000 células U-87MG por
poço e ao final do sexto dia, na situação controle havia uma média de 2.517.691
células por poço, ou seja, um aumento de aproximadamente 52,5 vezes. No
tratamento com oligomicina, havia 1.254.000 células, indicando um aumento
Resultados e Discussão
29
proliferativo de 26,1 vezes. Quando as células foram tratadas com antimicina A, o
número de células caiu para 321.142, mostrando que neste tratamento o aumento foi
de 6,7 vezes no número de células. Notadamente, quando as células foram tratadas
com a associação de oligomicina mais antimicina A, o número final de células
(49.750) manteve-se praticamente igual ao número inicial de células plaqueadas.
Também foram plaqueadas 48.000 células T98G por poço. Após transcorridos
6 dias com seus respectivos tratamentos, pode-se observar que em uma situação
controle, as células apresentaram uma taxa de crescimento de 35,1 vezes,
totalizando em média 1.682.142 células por poço. Quando as células foram tratadas
com oligomicina, o aumento na proliferação celular foi de 21,5 vezes, havendo
1.030.714 células. Já quando tratadas com antimicina A, o número de células caiu
para 302.857, indicando que a taxa proliferativa foi de 6,3 vezes. Na última condição
de tratamento, onde as drogas oligomicina e antimicina foram adicionadas
simultaneamente, o número de células caiu para 23.930, indicando um decréscimo
de 0,5 vez em relação ao número de células inicialmente plaqueadas.
A aquisição de microfotografias foi a última metodologia utilizada para avaliar
a taxa de proliferação de ambas as linhagens celulares de glioblastoma, U-87MG e
T98G. As fotos apresentadas na Fig. 7 representam o crescimento destas células ao
longo de 5 dias em cultura. Em condições controle (DMSO), as células atingiram uma
alta confluência em D5 e até mesmo algumas células começaram a crescer uma
sobre as outras. Na presença de qualquer uma das drogas, oligomicina ou antimicina
A, uma moderada diminuição na confluência celular foi observada, sendo a
confluência celular com antimicina A menor quando comparada com a da
oligomicina. Nenhuma evidência clara de morte celular foi observada sob essas
condições. Notadamente, quando as células foram incubadas na presença de ambas
as drogas, oligomicina mais antimicina A, uma inibição quase total da proliferação
das células foi observada. Pode-se notar, nesta mesma condição, uma mistura de
células normais e outras com morfologia menor e arredondada sugerindo morte
celular por apoptose.
Resultados e Discussão
30
-
Co
ntr
ol
(D5
)
Resultados e Discussão
31
Fig. 7 - Microfotografias de células U-87MG e T98G mantidas em cultura: efeito de oligomicina e/ou antimicina A.
Células U-87MG e T98G (15.000 células/cm²) foram dispostas em placas de 6 poços (9,6 cm²/poço) em 4 mL de meio DMEM contendo vermelho de fenol, glicose 2 g/L, soro fetal bovino 10% e antibiótico. As culturas de células foram mantidas a 37°C em atmosfera umidificada com 5% de CO2 e 95% de ar. Após 24 h (D0), o meio foi trocado e foram adicionados DMSO 0,025% (Control), oligomicina 1 µg/mL (Oligo), antimicina A 1 µM (AA) ou oligomicina mais antimicina A (Oligo + AA). Após 2 e 4 dias, o meio foi renovado com as respectivas drogas. As microfotografias foram realizadas utilizando-se contraste de fase óptico nos tempos 0 (D0) e após 5 dias de tratamento (D5) com os inibidores mitocondriais. As imagens originais foram igualmente ajustadas aumentando-se o contraste. Barra de escala: 50 µm.
As três metodologias de avaliação de proliferação celular, acima descritas,
indicam que a inibição da ATP sintase pela oligomicina, e a inibição do complexo III
da cadeia transportadora de elétrons mitocondrial pela antimicina A, prejudicaram
parcialmente a proliferação de células de glioblastoma humano. No entanto, quando
se promoveu uma inibição simultânea da ATP sintase e da cadeia respiratória houve
um prejuízo significativo na proliferação celular, ou seja, uma inibição quase total
desta proliferação.
Quando a ATP sintase está inibida pela oligomicina, a cadeia transportadora
de elétrons ainda continua funcional e as mitocôndrias mantém um potencial de
prótons transmembrana. Nesta condição, espera-se que o potencial de prótons
transmembrana aumente ligeiramente, pois a ATP sintase não estará funcional e não
ocorrerá a fosforilação do ADP em ATP, não utilizando este gradiente de prótons
(NICHOLLS, BUDD, 2000; NELSON, COX, 2012).
Quando a cadeia transportadora de elétrons está inibida pela antimicina A, a
fosforilação oxidativa não ocorre, pois o bombeamento de prótons para o espaço
intermembranas pelos complexos respiratórios I, III e IV não ocorre. No entanto, na
presença de antimicina A, espera-se que a ATP sintase possa funcionar de maneira
inversa promovendo a hidrólise de ATP da matriz mitocondrial com o bombeamento
de prótons para o espaço intermembranas, o que gera um potencial de prótons
transmembrana (NICHOLLS, BUDD, 2000; NELSON, COX, 2012).
Resultados e Discussão
32
Quando os dois inibidores estão presentes, espera-se que não se forme um
significativo potencial de prótons transmembrana, uma vez que estará inibido o
bombeamento de prótons tanto pelos complexos respiratórios I, III e IV, como pelo
funcionamento inverso da ATP sintase. Assim, podemos interpretar que a potente
inibição da proliferação celular pela associação da oligomicina mais antimicina A
deve estar relacionada com incapacidade das mitocôndrias em manterem um
potencial de prótons transmembrana nesta condição, como abordado adiante.
4.2 Efeitos da oligomicina e antimicina A no metabolismo energético das
células de glioma
A fim de caracterizar o efeito da inibição da ATP sintase mitocondrial e/ou da
cadeia transportadora de elétrons no metabolismo energético de células de
glioblastoma humano, foram realizados experimentos para a determinação da
respiração celular e do consumo de glicose e produção de lactato.
Primeiramente, o efeito dos inibidores oligomicina e antimicina A foi testado
sobre o consumo de oxigênio por células intactas (Fig. 8). Além dos tratamentos
padrões, verificamos a capacidade máxima respiratória pela utilização de um
protonóforo, FCCP, que promove o transporte de prótons do espaço intermembranas
para a matriz mitocondrial, desfazendo o gradiente eletroquímico de prótons e
estimulando a respiração. Isso ocorre porque o FCCP fica constantemente carreando
prótons para a matriz mitocondrial, mantendo um baixo gradiente de prótons
transmembrana (NELSON, COX, 2012); sendo assim, os prótons são transportados
novamente para o espaço intermembranas pelos complexos I, III e IV da cadeia
transportadora de elétrons, gerando um ciclo fútil e estimulando ao máximo a
respiração. E ainda, para verificarmos a participação da NADPH oxidase no consumo
de oxigênio insensível à antimicina A, utilizamos um inibidor da NADPH oxidase, o
cloreto de difenileneiodônio (DPI). A NADPH oxidase, localizada na membrana
plasmática de algumas células de origem astrocítica (GAO et al., 2012; BRANDES et
al, 2014), consome oxigênio molecular produzindo o radical ânion superóxido (O2.-).
O superóxido formado, em uma reação de dismutação com outro superóxido formará
Resultados e Discussão
33
uma molécula de H2O2 e outra de O2. O H2O2 será degradado a H2O através da ação
da glutationa peroxidase ou peroxiredoxina, ou também pode ser degradado em H2O
e O2 pela ação da catalase (AUGUSTO, 2006).
Na linhagem celular U-87MG observamos a capacidade respiratória celular
máxima pela utilização do FCCP que, em valores numéricos, correspondeu a 36,7
pmol O2.mL-1/s/106 células (Fig. 8, painel B). Em condição controle, esta linhagem
utilizou cerca de 50% de sua capacidade respiratória total, consumindo 18,1 pmol
O2.mL-1/s/106 células. Após cinco minutos de incubação em condição controle, foram
adicionados os respectivos tratamentos. Quando a oligomicina foi adicionada, as
células passaram a consumir 9,1 pmol O2.mL-1/s/106 células, indicando uma inibição
de 49,5% na respiração das mesmas em relação ao controle. Já após a adição de
antimicina A, a respiração foi inibida em 68,5% em relação ao controle, passando a
consumir 5,7 pmol O2.mL-1/s/106 células. Quando ambas as drogas foram
adicionadas simultaneamente, a respiração manteve-se em 5,9 pmol O2.mL-1/s/106
células. Uma vez que o DPI foi adicionado após a antimicina A, observou-se uma
inibição adicional da respiração de aproximadamente 27,6% em relação à antimicina
A.
Nas células T98G (Fig. 8, painel C), foi observado que a capacidade
respiratória máxima foi de 65,0 pmol O2.mL-1/s/106 células e que em condição
controle estas utilizam apenas 52,3% (34,0 pmol O2.mL-1/s/106 células) de sua
capacidade máxima respiratória. Passados também cinco minutos, os tratamentos
foram adicionados e uma inibição de 56,8%, passando a consumir 14,7 pmol O2.mL-
1/s/106 células, ocorreu na presença de oligomicina. Após a adição de antimicina A,
as células passaram a consumir 7,6 pmol O2.mL-1/s/106 células, o que corresponde a
uma inibição de 77,5% da respiração em relação ao controle. Quando ambos os
tratamentos foram associados, a inibição foi de 75,9%, passando a consumir 8,3
pmol O2.mL-1/s/106 células. Na presença de antimicina A e DPI, as células respiraram
5,3 pmol O2.mL-1/s/106 células, ou seja, a inibição foi de 31,3% em relação à
antimicina A. O painel A mostra traçados representativos obtidos com as células
T98G.
Resultados e Discussão
34
Fig. 8 - Efeito inibitório de oligomicina e antimicina A no consumo de oxigênio de
células de glioblastoma humano U-87MG e T98G.
Células U-87MG e T98G (4×106/mL) foram tripsinizadas e ressuspensas em meio DMEM 2
g/L de glicose suplementado com HEPES 20 mM (pH 7,2). Após 4-5 min de incubação,
foram adicionados oligomicina 1 µg/mL (Oligo), antimicina A 1 µM (AA), oligomicina mais
antimicina A (Oligo + AA), antimicina A mais DPI 10 µM (AA + DPI) ou FCCP 1 µM.
Painel A: Traçados representativos de medidas do consumo de oxigênio pelas células de
glioblastoma T98G. Antimicina A (AA) ou FCCP foram adicionados onde indicados pela seta
(*).
Painéis B e C: Valores absolutos do consumo de oxigênio por células U-87MG e T98G
observados nas diferentes condições experimentais. Dados representam a média ± S.E.M.
de 5 e 10 experimentos independentes para as células U-87MG e T98G, respectivamente.
**P<0,01 vs Control. #P<0,05, ##P<0,01 vs Oligo+AA.
Resultados e Discussão
35
Em ambas linhagens celulares, a inibição da ATP sintase por oligomicina
resultou em uma diminuição significativa no consumo de oxigênio, indicando que em
condições basais grande parte do consumo de oxigênio mitocondrial é devida a
fosforilação oxidativa do ADP a ATP. O alto potencial de prótons transmembrana, na
presença de oligomicina, não permite que haja o bombeamento de prótons para este
espaço. Sendo assim, o transporte de elétrons por essa cadeia é bastante inibido e
consequentemente a respiração diminui. Como o efeito inibitório da oligomicina no
consumo de oxigênio foi próximo ao obtido pela antimicina A, pode-se deduzir que
células de glioblastoma humano têm uma respiração bem acoplada. Esta observação
está de acordo com um processo eficiente de fosforilação oxidativa em células
tumorais (HAO et al., 2010; KOPPENOL et al, 2011).
Em seguida, foi quantificado o consumo de glicose e produção de lactato
pelas células U-87MG e T98G (Fig. 9), assim como o efeito dos inibidores
mitocondriais nestes parâmetros. Ambas as linhagens apresentaram um consumo de
glicose semelhante à produção de lactato na situação controle, o que pode ser um
indicativo do elevado metabolismo glicolítico das células de glioblastoma. O consumo
de glicose em 20 horas na situação controle, foi cerca de 50 mg/mL e a produção de
lactato de aproximadamente 40 mg/mL. Uma vez que a ATP sintase foi inibida por
oligomicina, observou-se um aumento no consumo de glicose de 35,6% e 31,4%, e
na produção de lactato de 65,2% e 34% nas células U-87MG e T98G,
respectivamente. Um efeito similar foi obtido quando a cadeia respiratória foi inibida
pela antimicina A, onde o consumo de glicose aumentou em 43% e 32,8% e a
produção de lactato em 67,2% e 47% nas células U-87MG e T98G, respectivamente.
Curiosamente, quando ambos inibidores foram adicionados, ocorreu uma diminuição
significativa no consumo de glicose e na produção de lactato quando comparados ao
tratamento somente com antimicina A. Na presença de oligomicina mais antimicina
A, houve uma diminuição de 17,8% e 16,2% no consumo de glicose e uma
diminuição de 18,4% e 18,1% na produção de lactato nas células U-87MG e T98G,
respectivamente, quando comparados com o tratamento somente com a antimicina
A.
Resultados e Discussão
36
Fig. 9 - Avaliação do consumo de glicose e produção de lactato por células de
glioblastoma humano U-87MG e T98G: Efeito de oligomicina e antimicina A.
Células U-87MG e T98G (15.000 células/cm2) foram dispostas em placas de 6 poços (9,6 cm2/poço) em 4 mL de meio DMEM contendo vermelho de fenol, glicose 2 g/L, soro fetal bovino 10% e antibiótico. As culturas de células foram mantidas a 37°C em atmosfera umidificada com 5% de CO2 e 95% de ar. Após 24 h do plaqueamento o meio foi renovado. Após 48 h, o meio foi trocado para DMEM 2 g/L de glicose sem vermelho de fenol, na presença das drogas DMSO 0,025% (Control), oligomicina 1 µg/mL (Oligo), antimicina A 1 µM (AA) ou oligomicina mais antimicina A (Oligo + AA). As células foram incubadas nestas condições experimentais durante 20 horas e amostras do meio foram retiradas para quantificação da concentração de glicose e lactato por kits enzimáticos. Na figura, os valores representam a média ± S.E.M. de 9 experimentos independentes realizados em duplicata. **P<0,01 vs Control. #P<0,05, ##P<0,01 vs Oligo+AA.
Estes resultados indicam que na presença de oligomicina ou antimicina A,
ocorre um aumento do metabolismo glicolitico nas células de glioblastoma. Assim
como foi observado por PAUWELS et al (1985) para células de neuroblastoma em
cultura, estes resultados indicaram que as células de glioblastoma humano resistem
a uma inibição da respiração, desde que haja glicose suficiente disponível. Quando
as células estão inibidas somente pela oligomicina, a ATP sintase não está funcional
e não há a fosforilação oxidativa do ADP à ATP, portanto o potencial de prótons
mitocondrial não é utilizado para a síntese de ATP, que nesta condição deverá ser
suprido pela glicólise. No entanto, na presença de oligomicina, a cadeia
U-87MG
Con
trol
Olig
oAA
Olig
o + A
A
Con
trol
Olig
oAA
Olig
o + A
A
0
20
40
60
80
0
20
40
60
80****
** **
# #
# ##
De
cre
ase
in G
luco
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Me
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mg
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) Incre
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T98G
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De
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Me
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mg
/dL
) Incre
ase
in L
acta
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ed
ium
(mg
/dL
)
Resultados e Discussão
37
transportadora de elétrons está funcional e até determinado ponto continua
transferindo H+ para o espaço intermembranas, e parte do piruvato é convertido a
acetil-CoA para atender às necessidades de substratos para o ciclo do ácido cítrico.
Quando o potencial de membrana já está elevado a um ponto em que os prótons não
podem ser mais transferidos para o espaço intermembranas, o piruvato é convertido
a lactato (NICHOLLS, BUDD, 2000; NELSON, COX, 2012). Logo o aumento da
produção de lactato na presença de oligomicina se deve tanto a uma maior demanda
da via glicolítica para a produção de ATP, como a uma menor demanda de
substratos respiratórios (intermediários do ciclo do ácido cítrico).
Quando o complexo III da cadeira transportadora de elétrons está inibido pela
antimicina A, não haverá o transporte de elétrons pelos complexos I, III e IV, assim
como o transporte de prótons por esses complexos respiratórios para o espaço
intermembranas. Nesta condição, espera-se que a ATP sintase mitocondrial passe a
funcionar de maneira inversa, hidrolisando ATP e promovendo o efluxo de prótons
para o espaço intermembranas (NICHOLLS, BUDD, 2000; NELSON, COX, 2012).
Assim, na presença de antimicina A, a glicólise deverá suprir uma maior demanda de
ATP, uma vez que não está havendo a fosforilação oxidativa do ADP a ATP e a
mitocôndria está consumindo ATP. Nesta condição, acaba havendo um acúmulo dos
intermediários no ciclo do ácido cítrico pela ausência de respiração mitocondrial,
impedindo que o piruvato se converta em acetil-CoA. Este piruvato é então
convertido à lactato, em uma reação catalisada pela lactato desidrogenase, com a
oxidação de uma molécula de NADH à NAD+. O NAD+ é essencial para a
continuação da glicólise (NELSON, COX, 2012).
Já na presença de oligomicina mais antimicina A, observa-se uma menor
demanda no metabolismo glicolítico quando comparado às condições na presença
dos inibidores isoladamente. Isso porque na presença dos dois inibidores, apesar da
mitocôndria não promover a síntese de ATP, não haverá gasto dos intermediários do
ciclo do ácido cítrico para manter a respiração pela cadeia transportadora de
elétrons, nem a hidrólise de ATP pela ATP sintase. Nesta condição, as mitocôndrias
Resultados e Discussão
38
estarão “desligadas” pelo fato de não estarem promovendo a fosforilação oxidativa e
nem apresentarem o potencial de prótons transmembrana.
4.3 Estimativa do potencial de membrana mitocondrial em células de
glioblastoma humano: Efeito de oligomicina e/ou antimicina A
Para avaliar o potencial de membrana mitocondrial em células U-87MG e
T98G intactas em suspensão dois protocolos distintos utilizando o marcador TMRM
foram empregados. Primeiramente avaliou-se o efeito imediato da adição dos
inibidores mitocondriais oligomicina e/ou antimicina A no potencial de membrana
mitocondrial (Fig. 10). No segundo protocolo, o efeito de inibidores mitocondriais no
potencial de membrana foi avaliado após a incubação com as células por 24 h (Fig.
11).
Para verificarmos o efeito da adição de oligomicina e/ou antimicina A no
potencial de membrana em células de glioblastoma humano, conduzimos
experimentos em um período de 30 minutos, monitorando a fluorescência emitida
pelo TMRM à medida que as drogas foram adicionadas (Fig. 10). Em ambas as
linhagens, obtivemos um padrão de fluorescência semelhante para cada droga
adicionada. No início da leitura do experimento, juntamente com o meio de cultura
celular sem vermelho de fenol, foi adicionado o marcador fluorescente catiônico,
TMRM, capaz de detectar o potencial de membrana mitocondrial, e um reagente que
permite o acúmulo do TMRM mais facilmente para o interior celular, o TPB-.
Estes traçados devem ser entendidos de forma que quanto menor a
fluorescência emitida pela suspenção celular, maior é o potencial de membrana
mitocondrial das células e quanto maior a fluorescência, menor é o seu potencial de
membrana mitocondrial. Isso se deve ao fenômeno de quenching de fluorescência.
Quanto maior o potencial de membrana das mitocôndrias, mais marcador
fluorescente será captado e acumulado por estas. No entanto, esse marcador vai
para o interior celular e ficará restrito a um pequeno volume de matriz mitocondrial,
então a fluorescência da maior parte das moléculas de TMRM deixa de ser
Resultados e Discussão
39
detectada, pois a alta concentração de moléculas acaba por limitar a detecção da
intensidade de fluorescência emitida por todas as moléculas (quenching). Em adição,
a diminuição da concentração do marcador fluorescente no meio reacional, devida a
sua captação pelas mitocôndrias polarizadas, irá diminuir a detecção de sua
fluorescência emitida (FIGUEIRA et al., 2013).
Fig. 10 - Efeito da adição de oligomicina e/ou antimicina A no potencial de membrana mitocondrial estimado em suspensões de células intactas de glioblastoma humano U-87MG e T98G.
Células U-87MG e T98G (2×106/mL) foram tripsinizadas e ressuspensas em meio DMEM 2 g/L de glicose, sem vermelho de fenol e suplementado com HEPES 20 mM (pH 7,2). Para a estimativa do potencial de membrana, o meio foi acrescido do marcador fluorescente TMRM 500 nM, na presença de TPB- 1 µM. Após 3-4 minutos adicionou-se as células de glioblastoma U-87MG ou T98G e durante os 7-8 minutos seguintes observou-se a captação, pelas células, do marcador TMRM. A seguir, adicionou-se oligomicina 1 µg/mL (Oligo) e/ou antimicina A 1 µM (AA). Ao final de cada medida adicionou-se o desacoplador mitocondrial FCCP 250 nM. Os traçados correspondem a resultados representativos de 4 experimentos independentes.
D C
B A
0 5 10 15 20 25 302
4
6
8
10
12
14
TM
RM
Flu
ore
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(A
.U.)
Time (minutes)
U-87MG
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0 5 10 15 20 25 30
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Time (minutes)
T98G
AA
Oligo
FCCP
0 5 10 15 20 25 302
4
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12
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ore
scence
(A
.U.)
Time (minutes)
U-87MG
AA
Oligo
FCCP
0 5 10 15 20 25 30
6
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12
14
TM
RM
Flu
ore
sce
nce
(A
.U.)
Time (minutes)
T98G
AA
FCCP
Oligo
Resultados e Discussão
40
Após 2-3 minutos observou-se uma estabilização do sinal de fluorescência do
meio reacional contendo TMRM. Após este período as células foram adicionadas e
verificou-se a captação do marcador fluorescente pelas mesmas. Após 7 a 8
minutos, adicionaram-se as drogas oligomicina ou antimicina A e foi observada a
mudança no potencial de membrana mitocondrial. Quando a leitura de fluorescência
do potencial de membrana apresentou uma estabilização, foram adicionadas
novamente as drogas. Quando primeiramente adicionamos oligomicina, em seguida
adicionou-se antimicina A e vice-versa. No momento da segunda adição, vale
lembrar que temos uma situação de tratamento oligomicina mais antimicina A. Após
ocorrer novamente a estabilização da medida do potencial de membrana, adicionou-
se o protonóforo FCCP, que promove o transporte de prótons do espaço
intermembranas para a matriz mitocondrial, desfazendo o potencial de membrana
mitocondrial.
Quando a oligomicina foi adicionada primeiramente, observou-se uma
hiperpolarização do potencial de membrana mitocondrial das células U-87MG e
T98G. Isso ocorre devida a inibição da ATP sintase, com a inibição da síntese de
ATP, ou seja, a ATP sintase não utiliza os prótons do espaço intermembrana para
que ocorra a fosforilação do ADP em ATP. No entanto, a cadeia transportadora de
elétrons mitocondrial está funcional, transportando prótons da matriz mitocondrial
para o espaço intermembranar. Pelo fato da ATP sintase não utilizar esses prótons,
quando inibida pela oligomicina, o potencial de membrana mitocondrial aumenta
ligeiramente (NICHOLLS, BUDD, 2000).
Uma vez que a antimicina A foi inicialmente adicionada, observa-se uma
diminuição no potencial de membrana mitocondrial. A antimicina A, por ser um
inibidor do complexo III da cadeia transportadora de elétrons, acaba por não permitir
que os complexos mitocondriais I, III e IV transportem prótons da matriz mitocondrial
para o espaço intermembranas. Na tentativa de restabelecer esse potencial, a ATP
sintase atua de forma inversa, hidrolisando ATP em ADP para promover o efluxo dos
prótons para o espaço intermembranas. Contudo, o desempenho da ATP sintase em
Resultados e Discussão
41
manter um potencial de membrana mitocondrial não é tão eficiente quando
comparado com a cadeia transportadora de elétrons (NICHOLLS, BUDD, 2000).
Quando a adição da segunda droga foi realizada e, portanto, tivemos uma
situação com a presença de oligomicina mais antimicina A, o potencial de membrana
mitocondrial caiu drasticamente. Tanto a ATP sintase como a cadeia transportadora
de elétrons estavam inibidas. Sendo assim, as mitocôndrias não têm como enviar
prótons para o espaço intermembranas, ficando apenas um potencial de membrana
residual. Quando foi adicionado o FCCP, as mitocôndrias perderam quase que
totalmente seu potencial de membrana. Como dito anteriormente, o FCCP fica
constantemente carreando prótons para a matriz mitocondrial, mantendo um baixo
gradiente de prótons transmembrana, desfazendo o potencial de membrana
mitocondrial.
A seguir, foi verificado o efeito da incubação das células com os inibidores
mitocondriais durante 24 horas no potencial de membrana mitocondrial (Fig. 11), de
acordo com a metodologia descrita no segundo protocolo do item 3.9. O valor
numérico da fluorescência de cada suspenção celular foi calculado pela diferença
entre os valores de fluorescência do potencial de membrana mitocondrial entre as
condições descritas na figura (Control, Oligo, AA e O+AA) e aquele obtido após a
adição do FCCP.
A linhagem de glioblastoma humano U-87MG apresentou na condição controle
um valor de 2,56 F, onde F indica a diferença (em módulo) de fluorescência descrita
acima. Quando as células foram tratadas com a oligomicina, obteve-se 3,61 F,
indicando que houve uma hiperpolarização mitocondrial em relação ao controle. Já
na presença do inibidor do complexo III da cadeia transportadora de elétrons,
antimicina A, observou-se uma queda, em relação ao controle, do potencial de
membrana mitocondrial, resultando em 1,07 F. As células tratadas com ambos os
inibidores, oligomicina mais antimicina A, apresentaram 0,1 F, o que representa uma
queda drástica no potencial de membrana mitocondrial em relação ao controle.
Resultados e Discussão
42
Fig. 11 - Efeito da incubação por 24 horas com oligomicina e/ou antimicina A no potencial de membrana mitocondrial de células intactas de glioblastoma humano U-87MG e T98G.
Células U-87MG e T98G (15.000/cm2) foram dispostas em placas de 6 poços (9,6 cm2/poço) em 4 mL de meio DMEM contendo vermelho de fenol, glicose 2 g/L, soro fetal bovino 10% e antibiótico. O meio foi renovado após 24 h e as culturas de células foram mantidas por mais 48 h a 37°C em atmosfera umidificada com 5% de CO2 e 95% de ar. A seguir, as células foram incubadas durante 24 h na presença das drogas DMSO 0,025% (Control), oligomicina 1 µg/mL (Oligo), antimicina A 1 µM (AA) ou oligomicina mais antimicina A (Oligo + AA). Posteriormente, as células foram tripsinizadas e ressuspensas em 2 mL de meio DMEM 2 g/L de glicose sem vermelho de fenol contendo os respectivos tratamentos, tampão HEPES 20 mM e TPB- 1 µM. As suspensões celulares foram avaliadas por um fluorímetro. Após os 3
primeiros minutos, adicionou-se TMRM 500 nM, a fluorescência foi acompanhada por 9-10 min e no final de cada traçado adicionou-se FCCP 250 nM. Para cada condição experimental, a diferença entre a fluorescência antes (F) e após a adição de FCCP (FFCCP) foi utilizada como um parâmetro na estimativa do potencial de membrana mitocondrial. Na figura, os valores representam a média ± S.E.M de 5 experimentos independentes. *P<0,05, **P<0,01 vs Control. ##P<0,01 vs Oligo+AA.
A linhagem T98G apresentou na condição controle um valor de 4,62 F.
Quando foi adicionado um inibidor da ATP sintase, oligomicina, ocorreu uma
hiperpolarização mitocondrial em relação ao controle, obtendo-se um valor de F de
5,81. A antimicina A causou uma queda no potencial de membrana mitocondrial,
quando comparada ao controle, apresentando 2,43 F. O tratamento com as duas
drogas simultaneamente, oligomicina mais antimicina A, também fez com que as
U-87MG
Con
trol
Olig
oAA
O +
AA
0
1
2
3
4
5
**
**
**
##
##
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F -
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P) T98G
Con
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Olig
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O +
AA
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4
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8
*
**
**
##
##
- F
luo
rescence (
F -
FF
CC
P)
**
Resultados e Discussão
43
células T98G perdessem de forma drástica o potencial de membrana mitocondrial,
com um F de apenas 0,1, em comparação com o controle.
Sendo assim podemos dizer que em células incubadas por até 20 horas na
presença de oligomicina ou antimicina A, as mitocôndrias ainda mantiveram seu
potencial de membrana. Na condição com oligomicina, as células podem ter seu
potencial aumentado pelo fato da ATP sintase estar inibida e dessa forma não estar
utilizando o gradiente de prótons transmembrana para a produção de ATP, e ainda
pelo fato da cadeia transportadora de elétrons estar funcional e bombeando prótons
para o espaço intermembranas. Já as células quando incubadas com antimicina A,
apresentam uma queda em seu potencial de membrana mitocondrial, que é
parcialmente mantido pela atividade inversa da ATP sintase que hidrolisa ATP e
transporta prótons para o espaço intermembranas. Já quando houve a incubação
simultânea das drogas, as células não conseguiram manter seu potencial de
membrana mitocondrial, pois ambos os mecanismos presentes capazes de formar
um gradiente de prótons transmembrana, cadeia transportadora de elétrons e
atividade reversa da ATP sintase, estavam inibidos.
O potencial de membrana mitocondrial pode ser necessário para diversas
funções celulares fundamentais para o metabolismo e proliferação celular. A seguir
serão discutidas três funções mitocondriais relacionadas ao metabolismo celular e
que são dependentes do potencial de membrana mitocondrial, a saber, a captação e
acúmulo mitocondrial de Ca2+, o transporte mitocondrial de proteínas e o
funcionamento da transidrogenase de nucleotídeos de nicotinamida (NNT).
A captação de Ca2+ por mitocôndrias é mediada por um canal de Ca2+ (MCU)
presente na membrana mitocondrial interna e é dependente do potencial elétrico
transmembrana (RIZZUTO et al., 2012; FIGUEIRA et al., 2013). Uma vez que deixa
de ocorrer o transporte de Ca2+ para a matriz mitocondrial pelo MCU devido à
ausência de potencial transmembrana, pode ocorrer um acúmulo deste segundo
mensageiro no citosol celular. O aumento de Ca2+ citosólico pode interferir em
funções celulares, como a recaptação de neurotransmissores da fenda sináptica, e
até mesmo desencadear um processo de morte celular (SZYDLOWSKA,
Resultados e Discussão
44
TYMIANSKI, 2010). Elevações na concentração citosólica de cálcio podem ativar
algumas quinases e fosfatases que transmitem seus sinais para o núcleo, alterando
a taxa de transcrição de genes (SZYDLOWSKA, TYMIANSKI, 2010). Já a falta de
Ca2+ na matriz mitocondrial influencia diretamente a taxa de respiração mitocondrial
(KAVANAUGH et al., 2000), isto se deve ao fato de algumas das desidrogenases
presentes na matriz mitocondrial serem ativadas por Ca2+, como a piruvato, isocitrato
e α-cetoglutarato desidrogenase (MCCORMACK, DENTON, 1994; HUANG et al.,
2013).
Um segundo processo dependente do potencial de membrana mitocondrial é o
transporte de proteínas e precursores codificados pelo DNA celular (LODISH et al.,
2005). Para que ocorra o transporte mitocondrial de proteínas, estas precisam ter
sequências que serão reconhecidas por receptores mitocondriais. A transferência de
proteínas mitocondriais é pós-traducional e ocorre pela ação de translocadores.
Existem dois grupos de translocadores, os complexos TOM (translocase de
membrana mitocondrial externa) e TIM (translocase de membrana mitocondrial
interna). Eles podem funcionar separadamente, somente o TOM para as proteínas
de membrana externa e espaço intermembranar e, TOM e TIM para proteínas de
membrana interna e matriz. As proteínas são orientadas para as mitocôndrias por
uma pré-sequência amino terminal contendo aminoácidos carregados positivamente.
Desta forma, o potencial elétrico transmembrana mitocondrial (mais negativo
internamente), facilita o transporte destas proteínas. Uma vez que estas proteínas
são reconhecidas pelos receptores mitocondriais, elas são transportadas pelo
translocador TOM e em sequência, transferidas para o translocador TIM da
membrana interna. As proteínas destinadas às membranas mitocondriais contêm
sequências hidrofóbicas de parada de transferência que interrompem sua
transposição através dos componentes TOM e TIM, levando a sua incorporação,
respectivamente nas membranas externa e interna (LILL, NEUPERT, 1996;
PFANNER, MEIJER, 1997; REHLING et al., 2001).
Um terceiro mecanismo dependente de potencial de membrana mitocondrial é
a manutenção de um alto poder redutor na matriz mitocondrial, representado por
Resultados e Discussão
45
NADPH e glutationa. A NNT promove a transferência de um hidreto de NADH para o
NADP+ na matriz mitocondrial, em um processo acoplado à translocação de prótons
para o interior da organela (HOEK, RYDSTRÖM, 1988). Assim, na ausência de
potencial de membrana mitocondrial, o NADP, se encontrará em um estado mais
oxidado (RONCHI et al., 2013), diminuindo a eficácia de sistemas antioxidantes
dependentes de glutationa e tioredoxina (KOWALTOWSKI et al., 2009).
Notadamente, trabalhos com células derivadas de tumores de cólon de
humanos indicaram que células que apresentam maiores valores de potencial de
membrana mitocondrial têm uma maior capacidade de invasão e resistência à
apoptose (HEERDT et al., 2005; HEERDT et al., 2006).
4.4 Análise do ciclo celular em células de glioblastoma humano, U-87MG e
T98G
O ciclo de vida das células depende da divisão celular, tendo início assim que
uma célula é dividida e o término quando esta célula se divide ou morre por apoptose
ou necrose. O processo de divisão celular consiste na intérfase e na fase mitótica. A
intérfase é determinada por uma organização celular em atividade constante,
produzindo diversas substâncias, realizando processos físicos e químicos, é a fase
em que ocorre a duplicação do material genético. As células permanecem no estágio
da intérfase a maior parte de suas vidas (LODISH et al., 2005).
A intérfase é subdividida em três fases: G0-G1, S e G2-M. Durante a fase G0,
a célula não recebe nenhum tipo de estímulo para a divisão celular, realizando
exclusivamente a sua atividade celular. Quando há um estímulo para a divisão
celular, a célula entra em G1, onde ocorre a síntese de muitas proteínas, entre elas,
enzimas e RNA. Consequentemente, a célula aumenta seu tamanho nesta fase. A
fase S apresenta, como característica, a replicação das moléculas de DNA para cada
cromossomo existente. É nesta fase que cada cromossomo passa a ter duas
cromátides ligadas por um centrômero. Durante fase G2-M, ocorre a síntese de tudo
Resultados e Discussão
46
que é necessário para a formação de duas novas células, portanto, nesta etapa,
devem ter duplicadas todas as organelas celulares (LODISH et al., 2005).
O ciclo celular é regulado por diversos fatores, sendo assim, este pode ser
interrompido até determinada fase e só ter continuidade quando as condições ideais
se mostrarem presentes, como uma quantidade ideal de nutrientes ou quando a
célula atinge as dimensões apropriadas para a divisão. As células neuronais, em
condições normais, param de se dividir quando o animal atinge o estado adulto e
permanecem em G0 pelo resto da vida do animal.
No entanto, existem três momentos em que os mecanismos de regulação
atuam. No final da fase G1, células que não têm as condições apropriadas para dar
continuidade ao seu ciclo celular param e permanecem em G0. Além disso, caso
sejam detectados erros no DNA que são impossíveis de se reparar, as células
entram em apoptose. No final da fase G2-M, é verificado se a replicação do DNA
ocorreu corretamente, caso contrário, o ciclo é interrompido e as células voltam para
a fase S (LODISH et al., 2005).
A fim de se verificar a influência dos tratamentos com oligomicina e/ou
antimicina A nas fases do ciclo celular em células U-87MG e T98G, analisamos por
citometria de fluxo as fases da intérfase após um tratamento de 4 dias na presença
dos inibidores mitocondriais citados acima. Os resultados em valores percentuais
estão descritos nas tabelas III e IV, totalizando 100% das células em cada
tratamento. Estes resultados também estão mostrados na figura 13, painéis B e C.
Na linhagem celular U-87MG, quando foi adicionado um inibidor da ATP
sintase, oligomicina, ocorreu uma diminuição da porcentagem das células em G0-G1,
um aumento de 2,09 vezes na fase S, e um aumento de 1,1 vezes na fase G2-M.
Quando os tratamentos com antimicina A e oligomicina mais antimicina A foram
realizados, percebeu-se uma diminuição significativa celular na fase G0-G1 e um
aumento de 3,12 e 3,01 vezes na fase S quando as células foram tratadas com
antimicina A e oligomicina mais antimicina A, respectivamente. Esse grande aumento
percentual de células na fase S pode ser explicado por uma dificuldade em completar
Resultados e Discussão
47
os processos da divisão celular na presença destes inibidores mitocondriais, parando
em S, ou voltando da fase G2-M para a fase S. No entanto, quando observamos a
porcentagem de células na fase G2-M nestes tratamentos, percebemos uma
diminuição de 1,3 e 1,89 vezes no tratamento com antimicina A e oligomicina mais
antimicina A, respectivamente. Essa queda pode ter ocorrido devido à diminuição do
potencial de membrana mitocondrial, que é necessário para diversos mecanismos
intracelulares, não favorecendo a proliferação celular, conforme discutido no item 4.3.
U-87MG
Tratamento G0-G1 (%) S (%) G2-M (%)
Controle 79,93 13,5 6,57
Oligomicina 64,48 28,26 7,26
Antimicina A 52,82 42,16 5,02
O + AA 55,89 40,64 3,47
Tabela III – Porcentagens obtidas por citometria de fluxo para cada tratamento em células de glioblastoma humano U-87MG relativas a cada fase da intérfase no ciclo celular.
T98G
Tratamentos G0-G1 (%) S (%) G2-M (%)
Controle 71,33 21,45 7,22
Oligomicina 70,30 22,44 7,26
Antimicina A 57,05 42,59 0,36
O + AA 66,64 30,72 2,64
Tabela IV – Porcentagens obtidas por citometria de fluxo para cada tratamento em células de glioblastoma humano T98G relativas a cada fase da intérfase no ciclo celular.
Resultados e Discussão
48
O mesmo padrão percentual das fases da intérfase na presença dos
tratamentos oligomicina e/ou antimicina A ocorreu com a linhagem T98G. Observou-
se uma diminuição percentual em G0-G1, com consequente aumento na fase S e um
pequeno aumento na fase G2-M quando tratadas com oligomicina. Já com os
tratamentos com antimicina A e oligomicina mais antimicina A, houve uma maior
queda no percentual de células em G0-G1 quando comparado com o controle,
aumentando consequentemente a porcentagem de células na fase S e uma
significativa diminuição de células na fase G2-M. Os resultados devem ser
interpretados da mesma forma como os das células U-87MG.
A figura 13, painel A, apresenta os histogramas obtidos em análises por um
citômetro de fluxo em ambas as linhagens celulares estudadas, U-87MG e T98G. O
primeiro pico representa a fase da intérfase G0-G1, o segundo pico representa as
células que se encontram em G2-M e entre os dois picos estão as células na fase S,
como mostrado na figura ilustrativa 12.
Fig. 12 – Imagem ilustrativa dos histogramas obtidos em análises por um citômetro de fluxo quando se avalia a intérfase do ciclo celular. O eixo X é representado pela quantidade de DNA por célula, e o eixo Y pela quantidade de células que apresentam os valores de DNA estabelecidos no eixo X. O eixo X é avaliado por unidades arbitrárias de
fluorescência e o eixo Y pela quantidade de eventos que o citômetro identificou (RESINO, 2014).
Resultados e Discussão
49
A
Resultados e Discussão
50
Fig. 13 - Efeito de oligomicina e/ou antimicina A no ciclo celular das células de glioblastomas U-87MG e T98G.
Células U-87MG e T98G (7.000 células/cm2) foram plaqueadas em garrafas de 25 cm2 com 6 mL de meio DMEM contendo vermelho de fenol, glicose 2 g/L, soro fetal bovino 10% e antibiótico. As culturas de células foram mantidas a 37°C em atmosfera umidificada com 5% de CO2 e 95% de ar. Após 24 horas do plaqueamento, o meio foi renovado com a privação do soro fetal bovino. Após 24 horas, o meio foi renovado novamente, com a presença de soro fetal bovino, e as culturas celulares receberam os tratamentos específicos: DMSO 0,025% (Control), oligomicina 1 µg/mL (Oligo), antimicina A 1 µM (AA) ou oligomicina mais antimicina A (Oligo + AA). Após 2 dias, o meio foi renovado com as respectivas drogas. Após 4 dias de tratamento com os inibidores mitocondriais, as células foram fixadas em etanol 70% e mantidas a -20°C por pelo menos 24 horas. Após processamento das amostras, as fases do ciclo celular foram analisadas por citometria de fluxo. Os dados representam a média ± S.E.M de 8 experimentos independentes.
Painel A: Histogramas representativos da análise do ciclo celular por citometria de fluxo.
Painéis B e C: Porcentagens relativas das fases do ciclo celular após tratamentos nas condições indicadas. *P<0,05, **P<0,01 vs DMSO. #P<0,05, ##P<0,01 vs Oligo+AA.
4.5 Efeito da inibição da ATP sintase e/ou da cadeia transportadora de
elétrons na proliferação de astrócitos primários em cultura
Para verificar a taxa de proliferação de astrócitos provenientes de ratos
neonatos foi utilizado o teste de redução do MTT com a produção de cristais de
formazan (Fig. 14). Estas células foram escolhidas devido à origem astrocítica das
células de glioblastoma humano utilizadas neste trabalho.
As células de astrócitos foram mantidas em cultura durante 6 dias, após este
período pôde-se observar um aumento de 2,82 vezes na atividade metabólica de
redução do MTT na situação controle, passando de um valor de absorbância de
0,084 no início do tratamento para 0,238 ao final dos 6 dias. Quando estas células
foram tratadas com oligomicina ou antimicina A observou-se, ao final de 6 dias, uma
proliferação celular semelhante às obtidas na condição controle, apresentando
absorbâncias de 0,243 e de 0,226, respectivamente. Quando ambas as drogas
estavam presentes, oligomicina mais antimicina A, as células acompanharam o
crescimento observado nos demais tratamentos até o segundo dia, seguido por uma
diminuição da atividade metabólica da redução do MTT ao final do sexto dia de
aproximadamente 20,5% quando comparadas ao controle, indicando que a
proliferação celular diminuiu significativamente.
Resultados e Discussão
51
Conclui-se que os astrócitos tratados com as drogas oligomicina ou antimicina
A conseguiram se proliferar em uma taxa similar aos de uma situação controle.
Contudo, quando as drogas foram adicionadas simultaneamente, houve uma queda
significativa em sua proliferação. Estes resultados indicam que há um prejuízo na
proliferação de astrócitos quando estes não mantem um potencial de membrana
mitocondrial.
A sobrevivência e proliferação de astrócitos na presença de inibidores
mitocondriais, oligomicina ou antimicina A, pode ser explicada pelo comportamento
glicolítico dos mesmos, assim como observado para as células de glioblastomas. Isto
é, a maior parte da glicose captada por astrócitos é convertida à lactato que é
utilizado por neurônios (MAGISTRETTI, 2006; RODRIGUES et al., 2013).
Fig. 14 - Efeito de oligomicina e antimicina A na proliferação de astrócitos de ratos neonatos.
Astrócitos (15.000 células/cm2) provenientes de ratos neonatos (2 dias) foram dispostos em discos de 9,2 cm2 com 2 mL de meio DMEM contendo vermelho de fenol, glicose 2 g/L, soro fetal bovino 10% e antibiótico. As culturas de células foram mantidas a 37°C em atmosfera umidificada com 5% de CO2 e 95% de ar. Após 24 h, o meio foi trocado e foram adicionados DMSO 0,025% (Control), oligomicina 1 µg/mL (Oligo), antimicina A 1 µM (AA) ou oligomicina mais antimicina A (Oligo + AA). Após 2 e 4 dias, o meio foi renovado com as respectivas drogas. A figura apresenta os resultados de proliferação celular estimados pela redução de MTT com a produção de azul de formazan. Os dados representam a média ± S.E.M de pelo menos 6 experimentos independentes realizados em duplicata. **P<0,01 vs Control or Oligo.
Astrocyte
0 2 4 60.0
0.1
0.2
0.3Control
Oligo
AA
Oligo + AA
**
Days of Treatment
Op
tical d
ensity
of
form
aza
n a
bso
rbance
(a.u
.)
Conclusões
52
5. CONCLUSÕES
Concluímos que a rápida proliferação de células de glioma humano é altamente
dependente do funcionamento mitocondrial. Diferentemente do que se poderia
esperar, esta dependência não se deve à fosforilação oxidativa, mas a outros
processos dependentes do potencial de prótons transmembrana mitocondrial.
Relacionamos abaixo as principais conclusões dos experimentos, que nos
permitiram chegar à afirmação apresentada acima:
5.1 A inibição da ATP sintase pela oligomicina e a inibição do complexo III da
cadeia transportadora de elétrons mitocondrial pela antimicina A inibiram
parcialmente a proliferação de células de glioblastoma humano U-87MG e T98G. No
entanto, quando se promoveu uma inibição simultânea da ATP sintase e da cadeia
transportadora de elétrons houve uma quase total inibição da proliferação celular.
Resultados semelhantes foram obtidos em culturas de astrócitos de ratos neonatos.
5.2 Medidas de potencial de membrana mitocondrial em células intactas,
incubadas na presença de oligomicina, mostraram uma hiperpolarização
mitocondrial. Na presença de antimicina A uma redução parcial do potencial
transmembrana mitocondrial foi observada. Já a associação de oligomicina mais
antimicina A resultou em uma quase completa redução no potencial de membrana
mitocondrial, restando apenas um potencial de membrana residual. Podemos
interpretar que a potente inibição da proliferação celular pela associação da
oligomicina mais antimicina A está associada à incapacidade das mitocôndrias em
manterem um potencial de prótons transmembrana nesta condição.
5.3 Notadamente, o consumo de oxigênio pelas células U-87MG e T98G em
suspensão foi em grande parte inibido na presença de oligomicina, indicando que em
condições basais grande parte do consumo de oxigênio mitocondrial se deve à
Conclusões
53
5.4 fosforilação oxidativa do ADP a ATP. O efeito inibitório da antimicina A no
consumo de oxigênio foi próximo ao obtido pela oligomicina, o que indica que células
de glioblastoma humano têm uma respiração mitocondrial bem acoplada ao processo
de fosforilação oxidativa.
5.5 Os experimentos de medida do consumo de glicose e produção de lactato
pelas células de glioblastoma indicaram que estas células utilizam majoritariamente a
glicólise como fonte produtora de ATP (efeito Warburg).
5.6 Quando a análise do ciclo celular foi realizada observou-se uma diminuição da
porcentagem das células em G0-G1 e um aumento nas fases S e G2-M quando
tratadas com oligomicina. Quando as células foram tratadas com antimicina A ou
oligomicina mais antimicina A foi constatado uma diminuição significativa nas fases
G0-G1 e G2-M, e um aumento na fase S. Esse grande aumento percentual de
células na fase S pode ser explicado por uma dificuldade em completar os processos
da divisão celular na presença destes inibidores mitocondriais, parando em S, ou
voltando da fase G2-M para a fase S. A diminuição na porcentagem de células na
fase G2-M pode ter ocorrido devido à diminuição do potencial de membrana
mitocondrial, que é necessário para diversos mecanismos intracelulares, não
favorecendo a proliferação celular.
A caracterização dos processos dependentes do potencial de membrana
mitocondrial necessários à proliferação de células de glioblastoma poderá trazer
conhecimentos para a melhor compreensão da fisiopatologia de glioblastomas, assim
como para o aprimoramento de seu tratamento quimioterápico.
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Anexo
60
7. ANEXO
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