Laboratório de Virologia Clínica e Molecular, Departamento de...

Luiz Gustavo Bentim Góes (Pós-Doc) BSc, MSc, PhD

Laboratório de Virologia Clínica e Molecular, Departamento de Microbiologia

Instituto de Ciências Biomédicas – Universidade de São Paulo

Plataforma Científica Pasteur-USP (SPPU)

Contato: lgbgoes@usp.br

Lab: 11-3091-7293

• O que são virus ?

• Origem da nomeclatura de Coronavírus/Partícula viral

• Genoma viral

• Hospedeiros e doenças relacionadas

• Classificação

• Provável histórico evolutivo de CoV

• Ciclo de Replicação

• Origem e histórico evolutivo de coronaviroses humanas

• Coronavírus emergentes (SARS-CoV, MERS-CoV)

• Coronavírus e morcegos

• Origem do Novo Coronavírus-2019 SARS-CoV-2

• Contém DNA ou RNA como material genético (não apenas DNA como células)

• Material genético é envolto por proteína e envelope em alguns casos

• Vírus se replicam através do arranjo dos componentes produzidos em células

hospederias gerando um grande número de novos vírions

• Parasitas intracelulares obrigatórios infecciosos formados por material genético

(DNA/RNA) envolto por uma capa protéica podendo conter envelope derivado

da membrana celular hospedeiras.

• Sua replicação ocorre apenas em células

• Vírus são dependentes de células hospedeiras

• Blocos moleculares (aminoácidos e nucleosídeos)

• Maquinaria de síntese protéica (ribossomos)

• Energia em forma de adenosina trifosfato (ATP)

• Todos os virus devem, dentro da célula, gerar mRNA para ser traduzido em

proteínas pelo ribossomo da célula hospedeira, ou seja, são parasitas do

maquinário de síntese protéica da célula hospedeira.

Vírus envelopados

Apresentam aspecto de coroa ao microscópio eletrônico

Content Providers(s): CDC/Dr. Fred

Murphy - This media comes from the

Centers for Disease Control and

Prevention's Public Health Image

Library (PHIL)

Holmes KV. N Engl J Med

2003; 348:1948-1951

RNA polaridade positiva (atua como RNAm)

Linear não segmentado

É o maior genoma entre os virus de RNA (~27 a 32 mil bases)

Proteína Não estruturais (ORF1ab) + Proteínas Estruturais + Proteínas acess.

Ex: Proteases, RNA Polimerase, Helicase

Perlman e Netland. Nature Reviews

Microbiology 7, 439-450 (June 2009).Holmes KV. N Engl J Med

2003; 348:1948-1951

Hospedeiros: Grande diversidade de aves e mamíferos

Associados com doenças respiratórias*, entéricas*, hepáticas e neurológicas

Grupo com grande potencial de transmissão entre espécies diferentes e rápida adaptação (spillover)

Alta taxa de mutação

Elevada taxa de recombinação

Tamanho do genoma

Ordem: Nidovirales

Familia: Coronaviridae

Genero: - Alphacoronavirus, Betacoronavirus: predominantemente em mamíferos

- Gammacoronavirus, Deltacoronavirus: predominantemente em aves

AlphaCoV

BetaCoV

GammaCoV

DeltaCoV

HCoV-OC43

CoV-MERS

CoV emergente em humanos

CoV endêmicos em humanos

Estreita relação de CoV

humanos com CoV de

outros mamíferos

nCoV-2019

• SARS-CoV

• SARS-CoV-2

• MERS CoV

• HCoV 229e

• HCoV NL63

• HCoV OC43

• HCoV HKU-1

Fases da replicação viral:

1. Adsorção (Spike/receptor)

2. Liberação genoma viral p/ interior

celular

3. Traducão enzimas do complexo

Replicação/Transcrição (pol1ab)

4. Transcrição RNAm em segmentos

de polaridade neg.

5. Transcrição RNAm em segmentos

de polaridade +

6. Tradução Proteínas estruturais

7. Replicação RNA gênomico

8. Composição do novo vírion

9. Liberação partícula viral

1

2

3

4

56

7

8

9

Retículo endoplasmático (ER)

Compartimento intermediário ER-Golgi (ERGIC)

• Spike (Espícula)

- Responsável pelo reconhecimento do receptor celular

- Determina o tropismo tecidual e do hopedeiro

• Cada coronavírus apresenta um receptor celular específico

• Mutações, deleções e recombinações no gene Spike

permitem a adaptação para novos tecidos e Hospedeiros

Domínio de ligação

com receptor

Sítio de

clivagem

Peptídeo

de fusão

Suínos

Felino

Canino

Humano

1936: Vírus da Bronquite Infecciosa (IBV) (Aves)

1946: Vírus da Gastroenterite Transmissível (TGEV) (Porcos)

1949: Vírus da Hepatite de Murinos (MHV)

1966: Coronavírus Humano 229E e OC43

1975: Classificação oficial do novo gênero Coronavírus pelo ICTV

2003: Coronavírus SARS

2004: Coronavírus Humano NL63

2005: Coronavírus Humano HKU1

2012: Coronavírus MERS

2013: Porcine Deltacoronavírus (suínos)

2017: SADS – Coronavírus da Síndrome Aguda da Diarréia Severa (suínos)

2019: New CoV 2019 (nomeclatura temporária)

. HCoV NL63: ancestral comum mais recente com CoV morcego datado de 560-830 anos

. HCoV-229E: 200 anos (Morcegos)

. HCoV-OC43: 120 anos (Bovinos)

. HCoV-HKU-1: 50 anos (Roedores)

. SARS-CoV: 4 -17 anos antes da Epidemia (Morcegos/Civetas)

. MERS-CoV: 2006 (Morcegos africanos/Camelos)

Spillover p hosp. intermediário

Infecções moderadas

Infecções severas

. Coronavírus Humanos endêmicos

. Circulação anual e mundial.

. Responsáveis por episódios de resfriado

comum (0-20% casos de IRA)

. Não emergentes, não zoonóticos

. Origem zoonótica

Coronavírus emergentes e zoonóticos

• Agente etiológico da Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS)

• Epidemia iniciada em Nov de 2002 na província de Guangdong, China

• Transmissão por secreções respiratórias (droplets)

• Atingiu 29 diferentes países em 6 meses

• N0 casos: 8096 / N0 de mortes: 774

• Taxa de mortalidade de 9,6 %

• Originado de transmissão viral entre diferentes espécies

• Transmissão por partículas respiratórias (droplets)

• Atuação importante de Super-spreaders (ex: metropolitan hotel)

Caso Index - Hotel Metropolitan, Hong Kong

- Infecção 16 hóspedes:

- Hong Kong

- Canada

- USA

- Singapura

- Vietnam

- Irlanda

• 300 casos

• Amoy Gardens Housing State

• Transmissão provavél pela aerossolização de esgoto contaminado com vírus

Evidências que o SARS-CoV era um agente zoonótico emergente

• Alguns casos humanos ligados aos “Mercados Molhados” (Wet Markets)

• Ausência de Anticorpos anti-SARS em bibliotecas de soros humanos (doença nova)

• Alta soroprevalência de anti-CoV-SARS em comerciantes e manipuladores de animais dos mercados

Evidência sorológica e genética de virus em animais nos mercados

• Detecção de RNA viral e alta soroprevalência em:

Paguma larvata – (Himalayan palm civet)

Nyctereutes procyonoides - Racoon dogs

Obtenção de genomas virais completos de swabs nasais de Civetas (SZ3, SZ16)

Característica genômica diferentes em casos iniciais e tardios de SARS-CoV

ORF8 +29nt: civetas e primeiros casos humanos

ORF8 -29nT: casos humanos do meio ao final da epidemia (possível adaptação a transm entre humanos)

Mas civetas são os reservatórios ? Provavelmente não

Estudos epidemiológicos extensos indicaram ausência de SARS-CoV em civetas de fazendas e livres na natureza

Infecçõe experimentais demonstraram uma alta susceptibilidade a infecção por SARS-CoV

2013: Detecção de SARS-like CoV altamente relacionados a SARS-CoV

95% de similaridade Nt (98% AA)

Capaz de utilizer ACE2

Vírus neutralizado com soro de paciente da SARS

ORf8 com pouca similaridade ao SARS humano

2005: Detecção CoV SARS-like (SL-CoV) em diferentes espécies de morcegos rhinolophus.

Espécies: Rhinolophus sinicus, R. pusillus, R. macrotis, and R. ferrumequinum

87-92% de similaridade Nt

Não utilizam mesmo receptor da SARS (cultivo inviável)

Todas CoVs apresentavam um motif de +29nt na ORF8

2010: Detecção de SL-CoV em morcegos europeus (Bulgaria, Italia, Slovenia) e África

76-86% nt similarity

2005: Primeira detecção de coronavirus (alfaCoV) em morcegos

SARS host

2017: Gde variedade de CoV Sars-like, em morcegos de uma única caverna, altamente

similares ao SARS, com capacidade de utilizar o mesmo receptor celular (ACE2) e relativa

similaridade na ORF8

2015: Detecção de SL-CoV com alta similaridade na ORF8

Alta identidade com SARS-CoV SZ3 de civetas (cepas iniciais)

Agente etiológico da Síndrome Respiratória do Oriente Médio (MERS)

Primeiro caso ocorreu no Reino da Arábia Saudita

Situação epidemiológica atual: 2494 casos / 858 Mortes (Taxa mortalidade 34%)

Encontrado em 27 paises

• Análise filogenética de seq.s do CoV MERS de casos humanos e de camelos sugerem

multiplos eventos de Spillover

Evidências da origem zoonótica

1. Alta relação filogenética com CoV de morcegos (HKU-4; HKU-5)

2. Detecção de RNA viral e obtenção de virus infectantes de camelos

3. Observação da presença de Anticorpos contra CoV-MERS em amostras de

sangue de camelo obtidas em diferentes paises e datadas de até 20 anos

anterior a descoberta viral

4. Detecção de virus de alta similaridade em morcegos

Taphozous perforates do Reino da Arábia Saudita

Neoromicia capensis da África do Sul (85,6% de identidade nt).

• MERS‐CoVs circulam em camelos por ao menos 2 décadas

• MERS-CoV pode ser transmitido ao homem por contato próximo com

camelos infectados

• A análise do ancestral comum mais recente indica que o ancestral do CoV-

MERS pode ter sofrido spillover de morcegos para camelos a

aproximadamente 20 anos na África

• Camelos infectados foram então importados para a Península Arábica

CoV com alta similaridade genética e capazes de utilizarem o mesmo recetor

de SARS e MERS já foram encontrados em morcegos

Gallagher & Perlman,. 2013

(Modified)

• Até a descoberta do CoV-SARS em 2002 não era conhecido a relação entre

coronavirus e morcegos.

• Após a epidemia de SARS novos coronavirus humanos foram descobertos, sendo dois

endêmicos e não zoonóticos e 2 zoonóticos emergentes (CoV-MERS e New CoV

2019)

• Atualmente 7 CoV são capazes de infectar humanos

• Estudos de vigilância de CoV em morcegos foram realizados em diferentes morcegos

do mundo e atualmente estes são reconhecidos como hospedeiros reservatórios de

CoV e certamente comportaram CoV ancestrais de diferentes mamíferos.

ΒetaCoV_B

ΒetaCoV_C

ΒetaCoV_D

Drexler JF, et l. 2013.

CoV já foram detectados

192 espécies morcegos (13%)

11 famílias de morc.

59 países

Prevalência de 9.6%

Diversidade viral esta

correlacionado à diversidade

de espécies de morcegos

• Alfa e Betacoronavírus são classificados em 15 espécies

• 8 das 15 são espécies de morcegos

V

V

Morcegos apresentam a maior diversidade genética de coronavirus quando

comparado a todos os outros mamíferos e são, provavelemente, os

reservatórios naturais e ancestrais de todos coronavirus de mamíferos.

Alguns coronavírus de morcegos evoluem e infectam novas espécies.

Uma grande diversidade de CoV similares ao SARS-CoV circulam em

morcegos da China e Europa e mutações/recombinações em seu gene Spike

permitem a infecção de novos hospedeiros

Alguns Coronavírus de morcegos são altamente similares a CoV emergentes

da SARS e do MERS e podem utilizar os mesmos receptores, o que evidencia

a possibilidade de uma transmissão direta destes vírus para humanos e

outros animais.

Morcegos são os prováveis reservatórios do CoV-SARS, CoV-MERS e do novo

Coronavírus 2019 SARS-CoV-2.

Uma grande diversidade de CoV com potencial zoonótico desconhecido já

foram detectados em morcegos de diferentes espécies por todo o globo,

incluindo no Brasil e um número maior aguarda ser descoberto.

A transmissão de coronavírus animais para humanos vai continuar

ocorrendo.

Estudos de vigilância e entendimento de eventos de spillover de CoV,

estratégias de diagnóstico rápido e avaliação da ocorrência destes eventos

devem ser estimulados, inclusive em território nacional.

Quais animais podem ser hospedeiros de vírus relacionados ao

SARS-CoV-2 ?

Como e onde ocorreram os eventos de spillover de SARS-CoV-2 ?

Foi um evento único ou múltiplo?

Eventos de Spillover de CoV estão ocorrendo ou ainda podem

ocorrer?

Como surgem doenças emergentes como O SARS-CoV-2 ?

Cobras, Morcegos, Pangolins ? SARS host

SARS-CoV-2

RBD: 75% nt

Células HELA ACE2 Humano

Células HELA ACE2 Morcego

(Rhinolophus sinicus)

Células HELA ACE2 suínos

Células HELA ACE2 civeta

Células HELA ACE2 murino

Células HELA (sem ACE2)

R: Não. Surgimento do CoV-SADS em 2017. Vírus emergente em suínos responsável

pela morte de 25.000 leitões na China (SADS)

A SADS é, muito provavelmente, oriundo de um spillover de CoV de morcegos

relacionados ao Corona de Morcegos HKU2

Nas últimas 2 décadas vírus zoonóticos causadores de alta

mortalidade em humanos e animais foram identificados em

morcegos

• Paramixoírus: Nipah e Hendra

• Coronavírus: SARS, MERS

• Filovírus: Ebola e Marburg

Morcegos:

• Apresentam a maior proporção de vírus zoonóticos e emergentes do

que todas outras ordens de mamíferos

• Apresentam a maior diversidade viral por espécie

• Aparente imunidade a diferentes virus zoonóticos

?

BetaCoV-C

Alfa, BetaCoV B, C, D

Um grupo de cientistas da Universidade de Hong Kong afirmam ter

sequenciado um CoV com 99% de similaridade ao SARS-CoV-2 em

Pangolim da China

Dados de metagenômica indicaram similaridade rm parte do Domínio de ligação do

receptor de CoV de pangolim com SARS-CoV-2

Diferenças ainda estão presents no gene Spike e sequências genômicas completes ainda

não foram liberadas

• O surgimento de virus emergentes é uma consequência da relação entre:

1. Fatores evolutivos virais (ex: taxa mutação ou aspectos da replicação)

2. Aumento do contato direto ou indireto com reservatórios silvestres

• Intensificação da agricultura e pecuária

• Urbanização

• Deflorestamento

• Alterações do habitat

• Invasão de populações humanas em áreas florestais intactas

• Consumo e comercialização de animais silvestres

3. Alta diversidade de mamíferos

4. Perda da biodiversidade

5. Alta densidade pop prox. áreas florestais

1. Presença de uma grande diversidade de CoV em morcegos e

capacidade de alguns utilizarem receptors conservados entre

diferentes espécies (Ex: SARS x ACE2 morcegos, suínos, civetas)

2. Capacidade adaptativa de Coronavírus a novos nichos ou

hospedeiros

3. Aumento do potencial de contato e transmissão de agentes virais

de morcegos reservatórios para hospedeiros intermediários ou

mesmo humanos

1. Transporte de animais infectados para mercados inseridos em áreas

urbanas altamente populosas (ex: comércio illegal)

• Morcegos não são os culpados das pessoas estarem ficando

doentes. Os morcegos coevoluiram com estes vírus, sendo

atualmente inofencíveis para estes organismos. O problema

ocorre quando vírus pulam para novas espécies e atividades

humanas são os causadores destas oportunidades

Perguntas?

• Departamento de Microbiologia, ICB-2 - SP

• Plataforma Científica Pasteur USP

• Full Prof. Dr. Edison Luiz Durigon

• Dra. Angélica Cristine de Almeida Campos

• Universidade Estadual de São Paulo– UNESP

• Prof. Dr. Luzia Queiroz

• Prof. Dr. Ariovaldo Pereira da Cruz Neto

• Dr. Cristiano de Carvalho

• BSc. Guilherme Ambar

• Animal and Plant Health Agency

• Prof. Dr. Anthony Fooks

• Universidade de Medicina CHARITÉ Berlim (Alemanha)

• Prof. Dr. Felix Drexler

• Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo

• Centro Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento