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Petruccio Tenório Medeiros
CROMATOGRAFIAHistórico
M. TSWEET (1903): Separação de misturas depigmentos vegetais em colunas recheadas com
adsorventes sólidos e solventes variados.
éter depetróleo
CaCO
3
mistura depigmentos
pigmentosseparados
Cromatografia =kroma [cor] + graph [escrever]
(grego)
CROMATOGRAFIAPrincípio Básico
Separação de misturas por interação diferencial dos seuscomponentes entre uma FASE ESTACIONÁRIA (líquido ou
sólido) e uma FASE MÓVEL (líquido ou gás).
CROMATOGRAFIAModalidades e Classificação
FM = Líquido
FM = Gás
CromatografiaLíquida
CromatografiaGasosa (CG)
Em CG a FEpode ser:
Sólida
Líquida
CromatografiaGás-Sólido (CGS)
CromatografiaGás-Líquido (CGL)
CROMATOGRAFIA GASOSAHistórico
Presentemente:Vendas de equipamentos e acessórios para CG nos EUA
estimadas em mais de US$ 750.000.000 (1995).
1940
1950
1960
“CGS” rudimentar
CGL proposta (Martin e Synge)
Separação de ácidos orgâni-cos por CGL: primeiro cro-matógrafo (Martin e James)
Primeiro equipamento comer-cial (Griffin & George)
Detector por Densidade de Gás (Martin e James)
Detector por Ionização em Chama (McWillian e Dewar)
Detector por Captura de Eletrons (Lovelock e Lipsky)
Colunas Capilares (Golay)
CROMATOGRAFIA GASOSAAplicabilidade
Quais misturas podem ser separadas por CG ?
Misturas cujos constituintes sejam
VOLÁTEIS (=“evaporáveis”)
(para uma substãncia qualquer poder ser“arrastada” por um fluxo de um gás ela
deve ser dissolver - pelo menos parcialmente -nesse gás)
DE FORMA GERAL:CG é aplicável para separação e análisede misturas cujos constituintes tenhamPONTOS DE EBULIÇÃO de até 300oCe que termicamente estáveis.
O Cromatógrafo a Gás
1
2
3
4
6
5
1 - Reservatório de Gás e Controles de Vazão / Pressão.2 - Injetor (Vaporizador) de Amostra.3 - Coluna Cromatográfica e Forno da Coluna.4 - Detector.5 - Eletrônica de Tratamento (Amplificação) de Sinal.6 - Registro de Sinal (Registrador ou Computador).Observação: em vermelho: temperatura controlada
INSTRUMENTAÇÃOGás de Arraste
Fase Móvel em CG: NÃO interage com a amos-
tra - apenas a carrega através da coluna. Assim é usualmente referida como GÁS GÁS
DE ARRASTEDE ARRASTERequisitos:
INERTE Não deve reagir com a amostra, fase estacionária ou superfícies do
instrumento.
PURO Deve ser isento de impurezas que possam degradar a fase estacionária.
Impurezas típicas em gases e seus efeitos:
oxida / hidroliza algumas FE
incompatíveis com DCE
H2O, O2
hidrocarbonetos
ruído no sinal de DIC
INSTRUMENTAÇÃOGás de Arraste
Requisitos:
CUSTO Gases de altíssima pureza podem ser muito caros.
COMPATÍVEL COM DETECTOR Cada detector demanda um gás de arraste
específico para melhor funcionamento.
Seleção de Gases de Arraste em Função do Detector:
He , H2
DCTDIC
N2 , H2DC
EN2 (SS), Ar + 5% CH4
CU
ST
O
PUREZA
AB
CA = 99,995 % (4.5)
B = 99,999 % (5.0)
C = 99,9999 % (6.0)
INSTRUMENTAÇÃOAlimentação de Gás de Arraste
Componentes necessários à linha de gás:
controladores de vazão / pressão de gásdispositivos para purificação de gás (“traps”)
1
2
34
5
6
1 - Cilindro de Gás2 - Regulador de Pressão Primário
3 - “Traps” para eliminar impurezas do gás4 - Regulador de Pressão Secundário
5 - Regulador de Vazão (Controlador Diferencial de Fluxo)6 - Medidor de Vazão (Rotâmetro)
Nota: Tubos e Conexões: Aço Inox ou Cobre
INSTRUMENTAÇÃODispositivos de Injeção de Amostra
Os dispositivos para injeção (INJETORES ou VAPORIZADORES) devem prover
meios de introdução INSTANTÂNEA da amostra na coluna cromatográfica
Injeção instantânea:
Injeção lenta:
t = 0
t = x
t = 0
t = x
INSTRUMENTAÇÃOInjetor “on-column” Convencional
1
2
3
4
1 - Septo (silicone)2 - Alimentação de gás de arraste)3 - Bloco metálico aquecido4 - Ponta da coluna cromatográfica
INSTRUMENTAÇÃOInjeção “on-column” de líquidos
1 2 3
1 - Ponta da agulha da microseringa é introduzida no início da coluna.
2 - Amostra injetada e vaporizada instantâneamente no início da coluna.
3 - “Plug” de vapor de amostra forçado pelo gás de arraste a fluir pela coluna.
INSTRUMENTAÇÃOParâmetros de Injeção
TEMPERATURA DO INJETOR Deve ser sufi-cientemente elevada para que a
amostra vapo-rize-se imediatamente, mas sem decomposição
Regra Geral: Tinj = 50oC acima da temperatura de ebulição do componente
menos volátil
VOLUME INJETADO Depende do tipo de coluna e do estado físico da amostra
COLUNAAmostra
sGasosas
Amostras
Líquidasempacotada = 3,2 mm
(1/4”)
0,1 ml ... 50 mL
0,2 L ... 20 L
capilar = 0,25 mm 0,001 ml ... 0,1
mL0,01 L ... 3
L
Sólidos: convencionalmente se dissolve em um solvente adequado e injeta-se a
solução
INSTRUMENTAÇÃOMicrosseringas para Injeção
LÍQUIDOS Capacidades típicas: 1 L, 5 L e 10 L
êmbolo
corpo (pirex)
agulha (inox 316)
Microseringa de 10 L:
Microseringa de 1 L (seção ampliada):
corpo
guia
êmbolo (fio de aço soldado ao
guia)
agulha
INSTRUMENTAÇÃOColunas: Definições Básicas
EMPACOTADA = 3 a 6 mm
L = 0,5 m a 5 mRecheada com sólido
pul-verizado (FE sólida ou FE líquida depositada sobre as
partículas do recheio)
CAPILAR = 0,1 a 0,5 mmL = 5 m a 100 mParedes internas
recober-tas com um filme fino (fra-ção de m) de FE líquida ou
sólida
INSTRUMENTAÇÃOTemperatura da Coluna
Além da interação com a FE, o tempo que um analito demora para percorrer a coluna
depende de sua PRESSÃO DE VAPOR (p0).
p0 = f
Estrutura química
do analitoTemperatur
a da coluna
Temperaturada
coluna
Pressãode
vapor
Velocidadede
migração
ANALITO ELUI MAIS RAPIDA-MENTE (MENOR RETENÇÃO)
INSTRUMENTAÇÃOTemperatura da Coluna
TEM
PER
ATU
RA
DA
C
OLU
NA
CONTROLE CONFIÁVEL DA TEMPERATURA DA COLUNA É ESSENCIAL PARA OBTER BOA
SEPARAÇÃO EM CG
INSTRUMENTAÇÃOForno da Coluna
Características Desejáveis de um Forno:
AMPLA FAIXA DE TEMPERATURA DE USO Pelo menos de Tambiente até
400oC. Sistemas criogênicos (T < Tambiente) podem ser necessários em
casos especiais.
TEMPERATURA INDEPENDENTE DOS DEMAIS MÓDULOS Não deve ser afetado pela temperatura do injetor e detector.
TEMPERATURA UNIFORME EM SEU INTERIOR Sistemas de ventilação interna muito eficientes para manter a temperatura homogênea em todo forno.
INSTRUMENTAÇÃOForno da Coluna
Características Desejáveis de um Forno:
FÁCIL ACESSO À COLUNA A operação de troca de coluna pode ser frequente.
AQUECIMENTO E ESFRIAMENTO RÁPIDO Importante tanto em análises de rotina e durante o desenvolvimento de metodologias analíticas novas.
TEMPERATURA ESTÁVEL E REPRODUTÍVEL
A temperatura deve ser mantida com exatidão e precisão de ± 0,1°C.
Em cromatógrafos modernos (depois de 1980),
o controle de temperatura do forno é totalmente operado por
microprocessadores.
INSTRUMENTAÇÃOForno da Coluna
Características Desejáveis de um Forno:
FÁCIL ACESSO À COLUNA A operação de troca de coluna pode ser frequente.
AQUECIMENTO E ESFRIAMENTO RÁPIDO Importante tanto em análises de rotina e durante o desenvolvimento de metodologias analíticas novas.
TEMPERATURA ESTÁVEL E REPRODUTÍVEL
A temperatura deve ser mantida com exatidão e precisão de ± 0,1°C.
Em cromatógrafos modernos (depois de 1980),
o controle de temperatura do forno é totalmente operado por
microprocessadores.
INSTRUMENTAÇÃOProgramação Linear de Temperatura
Misturas complexas (constituintes com volatilidades muito diferentes) separadas ISOTERMICAMENTE:
TCOL BAIXA:- Componentes mais
voláteis são separados
- Componentes menos volá-teis demoram a
eluir, saindo como picos mal definidos
TCOL ALTA:
- Componentes mais volá-teis não são
separados- Componentes menos volá-teis eluem mais
rapidamente
INSTRUMENTAÇÃOProgramação Linear de Temperatura
A temperatura do forno pode ser variada linearmente durante a
separação:
Consegue-se boa separação dos
componentes da amostra em
menor tempo
TEMPO
TE
MPE
RA
TU
RA
tINI tFIM
TIN
I
TFIM
R
Parâmetros de uma programação de temperatura:
TINI Temperatura Inicial
TFIM Temperatura Final
tINI Tempo Isotérmico
Inicial
tFIM Tempo Final do
Programa
R Velocidade de Aquecimento
INSTRUMENTAÇÃOProgramação Linear de Temperatura
Possíveis problemas associados à PLT:
VARIAÇÕES DE VAZÃO DO GÁS DE
ARRASTE A viscosidade de um gás aumenta com a temperatura.
viscosidade
vazão
DERIVA (“DRIFT”) NA LINHA DE BASE Devido ao aumento de volatilização de FE líquida
INSTRUMENTAÇÃODetectores
Dispositivos que examinam continuamente o material eluido, gerando
sinal quando da pas-sagem de substâncias que não o gás de arraste
Gráfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMAIdealmente: cada substância separada aparece
como um PICO no cromatograma.
INSTRUMENTAÇÃODetectores
Mais Importantes:
DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS
(DCE OU ECD) Supressão de corrente causada pela absorção de elétrons por eluatos altamente eletrofílicos.
DETECTOR POR CONDUTIVIDADE
TÉRMICA (DCT OU TCD) Variação da condutividade térmica do gás de arraste.DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA
(DIC OU FID) Íons gerados durante a queima dos eluatos em uma chama de H2 + ar.
REGISTRODE
SINAL
ANALÓGICORegistradores
XY
DIGITALIntegradore
sComputador
es
TEORIA BÁSICATempo de Retenção Ajustado, tR‘
tR
tM
tR’ = tR - tM
TEMPO
SIN
AL
tR = Tempo de Retenção (tempo decorrido entre a in-jeção e o ápice do pico
cromatográfico)tM = Tempo de Retenção do Composto Não-Retido (tempo mínimo para um composto
que não interaja com a FE atravesse a coluna)tR’ = Tempo de Retenção Ajustado (tempo
médio que as moléculas do analito passam sorvidas na FE)
O parâmetro diretamente mensurável de retenção de um analito é o
TEMPO DE RETENÇÃO AJUSTADO, tR’:
TEORIA BÁSICAVolume de Retenção Ajustado, VR‘
Embora não diretamente mensurável, o parâ-metro fundamental de retenção é oVOLUME DE RETENÇÃO AJUSTADO,
VR’:vazão do gás de arraste
MRR ttt x CF
VR = Volume de Retenção (volume de gás de arraste necessário para eluir um analito)
VM = Volume de Fase Móvel (volume de gás de ar-raste contido na coluna; “volume
morto”)VR’ = Volume de Retenção Ajustado (volume de gás de arraste consumido enquanto o
analito está sorvido na FE)
VR’ =
f
Fatores termodinâmicos
Parâmetros dimensionais da coluna
TEORIA BÁSICAConstante de Distribuição, KC
Coluna cromatográfica: série de estágios inde-pendentes onde acontece o equilíbrio
entre o analito dissolvido na fase estacionária e no gás de arraste:
Ocorre um “quase-equilíbrio” en-tre o analito sorvido na FE e dis-solvido
no gás de arraste.
M
SC A
AK
KC = Constante de Distribuição
[A]S = concentração do analito na FE
[A]M = concentração do analito no gásMENOR
RETENÇÃO !!!Volatilidade
[A]M
Afinidade pela FE
[A]S
TEORIA BÁSICAFator de Retenção, k
Exprimindo o equilíbrio em termos da MASSA do analito em cada fase, ao invés da
concentração:
M
S
W
Wk
FATOR DE RETENÇÃO, k: razão entre as massas de analito
contidas na FE (Ws) e gás de arraste (WM)
S
M
V
V
RAZÃO DE FASES, : razão entre volumes
de FE e gás de arraste na coluna
O fator de retenção k depen-de da constante
termodi-nâmica de distribuição KC e da
razão de fases da coluna
TEORIA BÁSICARazão de Fases,
Depende das DIMENSÕES da coluna:
L = comprimento da coluna
rC = raioda
coluna
df = espessura do filme de
FE fC
fC
dr
dr
2
2
rC >> df
dC / mm df / m
0.10 0.10 2500.20 0.11 4550.20 0.33 1520.25 0.25 2500.25 1.00 630.32 0.17 4710.32 0.52 1540.32 1.00 800.53 0.88 1510.53 2.65 500.53 5.00 27
Valores de para colunas capilares
de dimensões típicas:
Empacotadas:
5 < < 50
TEORIA BÁSICARelações entre VR’, KC e
VR’ pode ser definido em função de KC e
VR’ depende diretamente da constante de dis-tribuição do soluto entre a FE e o gás
de arraste e das dimensões da coluna.
Outra combinaç
ão possível:
É possível estimar tanto o fator de
retenção quanto a constante de distribuição a
partir do cromatograma
TEORIA BÁSICAEficiência de Sistemas
CromatográficosA migração um
analito pela coluna provoca inevitavelmente
o alargamento da sua banda:TEMP
O
Efeitos do alargamento excessivo de picos:
Separação deficiente de analitos com
retenções próximas.
Picos mais largos e menos intensos =
menor detectabilidade
EFICIÊNCIA Capacidade de eluição com o mínimo de dispersão do
analito.
TEORIA BÁSICAQuantificação da Eficiência
Supondo a coluna cromatográfica como uma série de estágios separados onde ocorre o equilíbrio entre o analito, a FE e o gás de
arraste:
Cada “estágio” de equilíbrio é chamado de PRATO TEÓRICO
O número de pratos teó-ricos de uma coluna (N) pode ser calculado por:
Coluna mais
eficiente
tR
wb
N
TEORIA BÁSICAQuantificação da Eficiência
ALTURA EQUIVALENTE A UM PRATO TEÓRI-CO (H) “Tamanho” de cada estágio
de equilíbrio
Valores típicos de H e N:
dC df H N
0.10 0.25 0.081 3703700.25 0.25 0.156 1923080.32 0.32 0.200 1500000.32 0.50 0.228 1315790.32 1.00 0.294 1020410.32 5.00 0.435 689660.53 1.00 0.426 704230.53 5.00 0.683 43924
2.16 10% 0.549 36432.16 5% 0.500 4000
Capilares, L = 30 m
Empacotadas, L = 2 m
Valores de H para colunas capilares e empacotadas são próximos, mas como L
para capilares é MUITO maior tipicamente elas são mais eficientes
(L = comprimento da coluna)
TEORIA BÁSICAOtimização da Eficiência
A altura equivalente a um prato téorico é função da velocidade linear média do gás
de arraste u:
H
uuMAX
HMIN
O valor de H pode ser minimizad
o otimizando-se a vazão de gás de arraste
Relações algébricas entre H e u:
- Colunas Empacotadas: Equação de van Deemter
- Colunas Capilares: Equação de Golay
(A, B, C = constantes)
(B, CM, CS = constantes)
FASES ESTACIONÁRIASConceitos Gerais
LÍQUIDOS Depositados sobre a superfície de: só-lidos porosos inertes (colunas
empacotadas) ou de tubos finos de materiais inertes (colunas capilares)
FElíquida
SUPORTESólido inerte poroso
Tubo capilar de material
inerte
SÓLIDOS Colunas recheadas com material finamente granulado (empacotadas) ou
depositado sobre a superfície interna do tubo (capilar)
Para minimizar a perda de FE líquida por volatilização, normalmente ela é:
Entrecruzada: as cadeias
poliméricas são quimicamente
ligadas entre si
Quimicamente ligadas: as cadeias
poliméricas são “presas” ao suporte
por ligações químicas
FASES ESTACIONÁRIASCaracterísticas de uma FE ideal
SELETIVA Deve interagir diferencialmente com os componentes da amostra.
Regra geral: a FE deve ter características tanto quanto possível próximas das dos
solutos a serem separados (polar, apolar, aromático ...)
FE Seletiva: separação
adequada dos constituintes da amostra
FE pouco Seletiva: má
resolução mesmo com
coluna de boa eficiência
FASES ESTACIONÁRIASCaracterísticas de uma FE ideal
AMPLA FAIXA DE TEMPERATURAS DE USO Maior flexibilidade na otimização da separação.
BOA ESTABILIDADE QUÍMICA E TÉRMICA Maior durabilidade da coluna, não reage com componentes da amostra
POUCO VISCOSA Colunas mais eficientes (menor resistência à transferência do analito entre fases)
DISPONÍVEL EM ELEVADO GRAU DE PUREZA Colunas reprodutíveis; ausência de picos “fantasma” nos cromatogramas.
FASES ESTACIONÁRIASFE Sólidas: Adsorção
O fenômemo físico-químico responsável pela interação analito + FE sólida é a
ADSORÇÃO
A adsorção ocorre na interface entre o gás de arraste e a FE sólida
ADSORÇÃO
Sólidos com grandes áreas superficiais (partículas finas, poros)
Solutos polares
Sólidos com grande número de sítios ativos (hidroxilas, pares de eletrons...)
FASES ESTACIONÁRIASFE Sólidas
Características Gerais: - Sólidos finamente granulados
(diâmetros de par-tículas típicos de 105 µm a 420 µm).
- Grandes áreas superficiais (até 102 m2/g).
Mais usados:Polímeros Porosos Porapak (copolímero
estireno-divi-nilbenzeno), Tenax (polióxido de difenileno)Sólidos Inorgânicos Carboplot, Carboxen (carvões ativos grafitizados), Alumina, Peneira Molecular (argila microporosa)
GASES DE REFINARIAColuna:Carboxen-1000 60-80 mesh; 15’ x 1/8”TCOL: 35oC a 225oC / 20oC. min-1
Gás de Arraste: He @ 30 ml.min-1
Detector: TCD
Principais Aplicações:
- Separação de gases fixos- Compostos leves- Séries homólogas
FASES ESTACIONÁRIASFamílias de FE Líquidas
POLIGLICÓIS Muito polares; sensíveis a umidade e oxidação; ainda muito importantes. Principal: Polietilenoglicol (nomes comerciais: Carbowax, DB-Wax, Supelcowax, HP-Wax, etc.)
CH2 CH2OH OH
n
Estrutura Química:
AMINAS ALIFÁTICASColuna:4 % Carbowax 20M s/ Carbopack B + 0,8% KOH
TCOL: 200oC (isotérmico) Gás de Arraste: N2 @ 20 mL.min-1
Detector: FID Amostra: 0,01 L da mistura de aminas
FASES ESTACIONÁRIASFamílias de FE Líquidas
Maior parte das aplicações em CG modernaQuatro grandes grupos
estruturais:PARAFINAS Apolares; alta inércia química; praticamente abandonadas. Principais: esqua-lano (C30H62), Apiezon (graxas para vácuo).
POLIÉSTERES Ésteres de diálcoois com di-ácidos. Polares; altamente sensíveis a umidade e oxidação; uso em declínio. Principais: DEGS, EGA, EGS.
ÉSTERES METÍLICOS DE ÁCIDOS GRAXOS
Coluna:5%DEGS-PS s/ Supel-coport 100/120 mesh; 6’ x 1/8”TCOL: 200oC (isotérmico)Gás de Arraste: N2 @ 20 ml.min-1
Detector: FIDAmostra: 0,5 L de solução em clorofórmio contendo 0,5 g de cada éster
FASES ESTACIONÁRIASFE Líquidas: Absorção
O fenômemo físico-químico responsável pela interação analito + FE líquida é a
ABSORÇÃO
A absorção ocorre no interior do filme de FE líquida (fenômeno INTRAfacial)
ABSORÇÃO
Filmes espessos de FE líquida
Interação forte entre a FE líquida e o analito (grande solubilidade)
Grande superfície líquida exposta ao gás de arraste
FASES ESTACIONÁRIASFamílias de FE Líquidas
SILICONES (polisiloxanas) As FE mais em-pregadas em CG. Cobrem ampla faixa de pola-ridades e propriedades químicas diversas.
Si
CH3
H3C
CH3
O Si
R1
R2
O Si
CH3
CH3
CH3n
R1, R2 = qualquerradical orgânico
- Ligação Si-O extremamente estável = elevada estabilidade térmica e química das
FE.
- Silicones são fabricados em larga escala para diversas aplicações = minimização de
custo do produto + tecnologia de produção e purificação largamente estudada e conhecida.
- Praticamente qualquer radical orgânico ou inorgânico pode ser ligado à cadeia
polimérica = FE “ajustáveis” a separações específicas + facilidade de imobilização por
entrecruzamento e ligação química a suportes
FASES ESTACIONÁRIASFamílias de FE Líquidas
Substituintes Nomes Comerciais Observações
- - SE-30 OV-1 OV-101 SP-2100 mais apolares da sériepouco seletivas
carborano ? - Dexsil 300GC similar a PDMSestável até > 400oC
fenil 5 % - SE-52 SE-54 OV-3 OV-5OV-73
pouco polar
cianopropil 7% fenil 7% OV-1701 SPB-7 CP-Sil 19CB moderadamente polar
fenil 50 % - OV-17 SP-2250 HP-50+SPB-50
moderadamente polarretém aromáticos
trifluoropropil 50% - OV-210 QF-1 moderadamente polarretém compostos carbonílicos
cianopropil 50% fenil 50% OV-225 SP-2300 CP-Sil43CB
polarretem doadores de elétrons
cianopropil 100% - SP-2340 SP-2330 Silar-9 CP altamente polar
FE derivadas de polidimetilsiloxano (PDMS) por substituição de -CH3 por radicais
orgânicos, em ordem crescente aproximada de polaridade:
Diferenças entre FE de composição similar provenientes de
fornecedores diferentes: pureza, viscosidade.
FASES ESTACIONÁRIASFamílias de FE Líquidas
Separação de pesticidas - FE = 100 % PDMS
1 - TCNB2 - Dichloram3 - Lindano4 - PCNB5 - Pentacloroanilina6 - Ronilano7 - Antor8 - pp’-DDE9 - Rovral10 - Cypermetrin11 - Decametrin
Coluna: CP-Sil 5 (25 m x 0,32 mm x 0,12 m)
TCOL:195oC (6,5 min) / 195oC a 275oC (10oC.min-1)Gás de Arraste: He @ 35
cm.min-1
Detector: FID
Amostra: 2L de solução dos pesticidas “on-column”
17 min
FASES ESTACIONÁRIASFamílias de FE Líquidas
Separação de piridinas - FE = 100 % CNpropilsilicone1 - piridina
2 - 2-metilpiridina3 - 2,6-dimetilpiridina4 - 2-etilpiridina5 - 3-metilpiridina6 - 4-metilpiridina
3 minColuna: CP-Sil 43CB (10 m x 0,10 mm x 0,2 m)
TCOL:110oC (isotérmico)Gás de Arraste: N2 @ 16 cm.min-1
Detector: FID
Amostra: 0,1L de solução 1-2% das piridinas em 3-metilpiridina
FASES ESTACIONÁRIASFamílias de FE Líquidas
Separação de fenóis - FE = fenilmetilsilicones
50% Ph
50% Me
5% Ph
95% Me
FASES ESTACIONÁRIASFE Quirais
Separação de isômeros óticos:
FÁRMACOS Em muitos fármacos apenas um dos isômeros óticos têm atividade farmacológica.
PRODUTOS BIOLÓGICOS Distinção entre pro-dutos de origem sintética e natural (natural = normal-mente substâncias oticamente puras; sintético = mui-tas vezes são misturas racêmicas).
Propriedades físico-químicas de isômeros óticos são MUITO SIMILARES
FE convencionais não interagem diferencialmente com isômeros óticos
Separação de misturas de isômeros óticos só é possível com FE
oticamente ativas
=
FE Quirais
FASES ESTACIONÁRIASFE Quirais
FE oticamente ativas mais importantes:
O Si
CH3
CH2
CHCH3
C
O N
H
C*
C
O
H
CH CH3
CH3
NH C
CH3
CH3
CH3
Si
CH3
CH3
O
n
Chiralsil-Val
Derivados de aminoácidos:
Misturas de compostos
formadores de pontes de
hidrogênio.
Organometálicos:
Separação de enantiômeros formadores de
complexos.
n
O Si
CH3
CH2
Si
CH3
CH3
O
CH2
O
O
Ni
C3F7
/ 2
Chiralsil-Metal
FASES ESTACIONÁRIASFE Quirais
Derivados de ciclodextrinas alquiladas:
-ciclodextrina: oligosacarídeo cíclico quiral
Chiralsil-Dex
- Introduzidas em 1983
- Quando ligadas a cadeias de polisiloxano: uso extremamente favorável como FE líquida
(viscosidade baixa, estabilidade ...)
- Podem ser quimicamente imobilizadas nas colunas
- Colunas disponíveis comercialmente
FASES ESTACIONÁRIASFE Quirais: Aplicações
Óleo essencial artificial de limão: separação de terpenos primários
1 - (+/-) -pineno2 - sabineno3 - (+/-) -pineno4 - (+/-) limoneno
Coluna: Rt-ßDEXsm (30 m x 0.32 mm x 0.25 µm)TCOL: 1 min a 40°C / 2°C min-1 / 3 min a 200°C
Gás de Arraste: H2 @ 80 cm.min-1
Detector: FID
FASES ESTACIONÁRIASFE Quirais: Aplicações
Óleo essencial natural
Essência artificial
Aroma de bergamota: distinção entre aroma natural e artificial
Coluna: Rt-ßDEXse (30 m x 0.32 mm x 0.25 µm)
TCOL: 1 min a 40°C / 4°C min-1 / 200°C
Gás de Arraste: He @ 80 cm.min-1
Detector: MS
FASES ESTACIONÁRIASFE Quirais: Aplicações
Anfetaminas: resolução dos isômeros
Coluna: Rt-ßDEXcst (30 m x 0.25 mm x 0.25 µm)
TCOL: 1 min a 120°C / 1,5°C min-1 / 3 min A 175°C
Gás de Arraste: He @ 25 cm.min-1
Detector: MS
COLUNAS EMPACOTADASDefinições Básicas
Tubo de material inerte recheado com FE sólida gra-nulada ou FE líquida depositada
sobre suporte sólido.
MATERIAL
DOTUBO
ø = 3 mm a 6 mmL = 0,5 m a 5 m
aço inoxvidro pirexníquelTEFLON
Granulometriado
recheio
80 - 100 mesh
149 - 177 m
100 - 120 mesh
125 - 149 m
60 - 80 mesh
177 - 250 m
MESH
dp
Eficiência maximizada com:
- Diminuição de dC- Diminuição de dp- Recheio regular
Limitados pela resistência à passagem de gás de arraste
COLUNAS EMPACOTADASFE Líquidas: Suporte
A FE líquida deve ser disposta
sobre um SUPORTE sólido
área superficial entre 0,5 e 10 m2.g-1
microporos regulares (~ 1 m)NÃO interagir com a amostraboa resistência mecânica
Uso quase universal: TERRA DIATOMÁCEA
Esqueletos
fósseis (SiO2 +
óxidos metálicos) de
algas microscópicas
ChromosorbAnachrom
Supelcoport...
secagemcalcinaçã
ofusão com sodalavagem com
ácidosilanização
COLUNAS EMPACOTADASFE Líquidas: Suporte
Chromosorb - características gerais
Áre
a S
up
erfi
cial
Den
sid
ade
Ap
aren
te
Tam
anh
o d
e P
oro
% M
áx.
de
FE
NOME m 2 .g -1 g.ml -1 m
Chromosorb P 4,0 0,47 0,4 - 2 30Chromosorb W 1,0 0,24 8 - 9 15Chromosorb G 0,5 0,58 - 5
Ord
em
cre
scen
ted
e in
érc
ia
Tratamentos especiais:
AW Lavado com ácido, para remoção de metais
HP ou DMCS ou HDMS Silanizados (menor adsorção)
NAW Sem lavagem com ácido
Chromosorb P Róseo, muito ativo.Chromosorb W Branco, mais inerte que o P.Chromosorb G Similar ao W, maior resistência mecânica
COLUNAS EMPACOTADASFE Líquidas: Carga de FE
TIPICAMENTE % FE = 1 % a 30 % do recheio
Maiores volumes de amostraMelhor blindagem dos sítios adsortivos do
suporteMelhor reprodutibilidade no preparo do recheio
Maior eficiência (d f = N)Menor sangria da FE com temperatura programadaSeparações rápidas e em temperaturas menores
% FE
df = f (% FE no
recheio)
COLUNAS CAPILARESDefinições Básicas
Tubo fino de material inerte com FE líquida ou sólida depositada sobre as paredes
internas.MATERIA
LDO
TUBO
ø = 0,1 mm
a 0,5 mmL = 5 ma 100 m
sílica fundidavidro pirexaço inoxNylonSilcosteel
Colunas de sílica são revestidas externamente com camada de polímero (poliimida) para aumentar
resistência mecânica e química
Colunas Capilares x Empacotadas:
CA
PIL
AR
ES
L = N Colunas mais eficientesFC = 1 ... 10 mL.min-1 Controle de vazão mais difícil Vi Dispositivos especiais de injeção
Famílias de Colunas Capilares :
PLOT (Porous layer open tube) Camada de FE sólida presa às paredes internas
SCOT (Support coated open tube) Predes internas revestidas com material de recheio similar ao das colunas empacotadas
WCOT (Wall coated open tube) FE liquida deposida (ligada // entrecruzada) sobre as paredes internas.
COLUNAS CAPILARESDiâmetro Interno
dC =
Eficiência
0,10 mm
0,25 mm0,32 mm
0,53 mm
1 2 3
Valores comuns:
1Colunas de altíssima eficiência
(amostras complexas, “Fast GC”); capacidade volumétrica limitada de
processamento de amostra
2Diâmetros mais comuns; capacidade
volumétrica limitada de amostra requer dispositivos especiais de injeção
3Colunas “megabore”: menor eficiência,
mas maior capacidade de processamento permite uso de injetores
convencionais
COLUNAS CAPILARES“Fast GC”: Colunas Capilares
Finas
Destilação simulada de óleo diesel:
Coluna: HP-1 (1 m x 0.10 mm x 0.40 µm)
TCOL: 35°C / 40°C min-1 / 0,75 min A 310°C
Gás de Arraste: He @ 90 ml.min-1
Detector: FID
Além de colunas finas: necessário controle acurado de vazão (controle
eletrônico de pressão) e altas velocidades de aquecimento da coluna.
COLUNAS CAPILARESColunas Capilares: Injeção
1
2
3
45
6
1 - Septo;2 - Entrada de gás de arraste;3 - “Liner” (misturador);4 - Coluna Capilar5 - Purga de gás de arraste;6 - Válvula de controle de purga.
Baixa capacidade de processamento de amostra (sub-microlitro)
Injeção direta com microseringa muito difícil !!!Injetores com divisão (“splitters”) Sistema pneumático despreza fração da
amostra injetada
- Menor sensibilidade (boa parte da amostra é desprezada)
- Divisão da amostra raramente é uniforme (fração purgada dos constituintes menos voláteis
é sempre menor)- Ajuste da razão de divisão é mais uma fonte de erros
COLUNAS CAPILARESLarge Volume Injection (LVI)
Combinando injetores com temperatura programada, vál-vulas controladas por
microprocessador e pré-colunas pode ser feita injeção de grandes volumes (> 100 L) de amostra
1 Colunas e injetor frios; válvula de
purga aberta (solvente é eliminado)
2 Colunas e injetor
aquecidos; válvula de
purga fechada (constituintes de interesse transferidos para coluna analítica)
COLUNAS CAPILARESLarge Volume Injection (LVI)
Separação de PAH com LVI (Vinj = 25 L, solução 400 ppb em CH2Cl2)
Coluna: HP-5 (30 m x 0.25 mm x 0.25 µm)
TCOL: 5 min a 50°C / 20°C min-1 / 2 min A 320°C
Gás de Arraste: He @ 2 ml.min-1
Detector: FID
COLUNAS CAPILARESColunas Multicapilares
“Feixes” paralelos de
colunas capilares com dC
convencional
- Eficiência próxima à das colunas convencionais- Capacidade similar à das colunas empacotadas- Colunas mais curtas: análises mais rápidas
Separação de explosivos em
coluna multicapilar (OV-17, 1000
capilares x 6 m)1 - 2,6-DNT2 - 2,4-DNT3 - 2,4,6-TNT4 - 3,4,5-TNT5 - 2,3,4-TNT6 - RDX ?7 - tetryl
DETECTORESDefinições Gerais
Dispositivos que geram um sinal elétrico proporcional à quantidade eluida de um
analito~ 60 detectores já usados em CG
~ 15 equipam cromatógrafos comerciais
4 respondem pela maior parte das aplicações
DCT TCDDetector
porCondutivida
deTérmica
DIC FIDDetector
porIonização
emChama
DCE ECDDetector
porCaptura de
Eletrons
EM MSDetector Es-pectrométri
co de Massas
DETECTORESParâmetros Básicos de
DesempenhoQUANTIDADE MÍNIMA DETECTÁVEL Massa de um analito que gera um pico com altura igual a três vezes o nível de ruído
SIN
AL
(S)
RUÍDO (N)
= 3
SN
RUÍDO Qualquer componente do sinal gerado pelo detector que não se origina da amostra
Fontesde
Ruído
Contaminantes nos gasesImpurezas acumuladas no detectorAterramento elétrico deficiente
DETECTORESParâmetros Básicos de
DesempenhoLIMITE DE DETEÇÃO Quantidade de
analito que gera um pico com S/N = 3 e wb =
1 unidade de tempoMesmo detector, nível de ruído e massa de analito MAS diferentes larguras de base:
wb
QMD = f
Detector (sinal gerado, ruído)Largura do pico
cromatográfico
Definindo limite de detecção como:
LD é independente da eficiência do sistema cromatográfico !
[QMD] =massa(ng,
pg ...)
[LD] = massa / tempo
(ng.s-1, pg.s-
1 ...)
DETECTORESParâmetros Básicos de
DesempenhoVELOCIDADE DE RESPOSTA Tempo decorrido entre a entrada do analito na cela do detector e a geração do sinal elétrico.
63,2% FSD
TEMPO
SIN
AL
Constante de Tempo, :
tempo necessário para o sinal chegar a 63,2 % FSD (full scale deflection
= fundo de escala) após a
entrada de amostra
A constante de tempo do sistema (detector + dispositivos de registro de sinal) igual ou menor a
10% da largura a meia altura (w0.5 ) do pico mais
estreito do cromatograma
>>
w0.5
t R medido > t R real
w medida > w real
Deformação no pico (cauda)
Diminuição do ruído (“damping”)
DETECTORESParâmetros Básicos de
DesempenhoSENSIBILIDADE Relação entre o incremento de área do pico e o incremento de massa do analito
MASSA
ÁR
EA
Fator de Resposta, S: inclinação da reta Área do pico x Massa
do analito
o mesmo incremento de
massa causa um maior incremento
de área
SensibilidadeS
Na ausência de erros determinados:
A = área do pico cromatográfico
m = massa do analito
DETECTORESParâmetros Básicos de
DesempenhoFAIXA LINEAR DINÂMICA Intervalo de massas dentro do qual a resposta do detector é linear
MASSA
ÁR
EA
A partir de certo ponto o sinal não aumenta
mais linearmente
O fim da zona de linearidade pode ser detectado quando a razão (Área / Massa) diverge em mais de 5 % da inclinação da
reta na região linear:
MASSA
ÁR
EA
/
MA
SS
A
0,95 S
1,05 S
DETECTORESClassificação
UNIVERSAIS:Geram sinal para qualquer
substância eluida.
SELETIVOS:Detectam apenas substânciascom determinada propriedade
físico-química.
ESPECÍFICOS:Detectam substâncias que
possuam determinado elementoou grupo funcional em suas
estruturas
DETECTORESDetector por Condutividade
TérmicaPRINCÍPIO Variação na condutividade térmica do gás quando da eluição de um analito.
Cela de Detecção do DCT:
12
35
4
i1 Bloco metálico (aço)
2 Entrada de gás de arraste
3 Saída de gás de arraste
4 Filamento metálico (liga W-Re) aquecido
5 Alimentação de corrente elétrica para aquecimento do filamento
A taxa de transferência de calor entre um corpo quente e um corpo frio
depende da condutividade térmica do gás no espaço que separa os corpos
Se a condutividade térmica do gás diminui, a quantidade de calor
transferido também diminui - o corpo quente se aquece.
DETECTORESDetector por Condutividade
TérmicaConfiguração tradicional do DCT: bloco metálico com quatro celas interligadas em par - por duas passa o efluente da coluna e
por duas, gás de arraste puro:CELAS DA AMOSTRA
CELAS DE REFERÊNCI
A
CO
RTE
SU
PER
IOR
CELAS DA
AMOSTRA
CELAS DE REFERÊNCI
A
CO
RTE
LA
TER
AL
Quando da eluição de um composto com condutividade térmica menor que a do gás de
arraste puro:Diferença
de resistência
elétrica entre os
filamentos de amostra
e referência
Filamentos nas celas de amostra se aquecem
Resistência elétrica dos
filamentos nas celas de amostra
aumenta
Filamentos nas celas de
referência não se aquecem
Resistência elétrica dos
filamentos nas celas de
referência fica constante
DETECTORESDetector por Condutividade
TérmicaOs filamentos do DCT são montados numa ponte de Wheatstone que transforma a diferença de
resistência quando da eluição de amostra numa diferença de voltagem:
V Fonte de CC / Bateria (18 V a 36 V, típico)F Ajuste da corrente nos filamentosI Medida da corrente nos filamentos (100 mA - 200 mA, típico)B1 B2 Balanceamento / ajuste de
zeroR1 R2 Filamentos das celas de
referênciaA1 A2 Filamentos das celas de
amostra
DETECTORESCaracterísticas Operacionais do
DCTSELETIVIDADE Observa-se sinal para qualquer subs-tância eluida diferente do gás de arraste =
UNIVERSAL
SENSIBILIDADE / LINEARIDADE Dependendo da configuração particular e do analito: QMD = 0,4 ng a 1 ng com linearidade de 104 (ng -
dezenas de g)
VAZÃO DE GÁS DE ARRASTE O sinal é proporcional à concentração do analito no
gás de arraste que passa pela cela de amostra.
VAZÃO DE GÁS DE ARRASTE CONSTANTE DURANTE A ELUIÇÃO
VARIAÇÃO DA VAZÃO DE GÁS DE ARRASTE DURANTE
A ELUIÇÃO
Fc = 0
Com DCT, a área dos picos cromatográficos é MUITO dependente da vazão do gás de
arraste !!!
DETECTORESCaracterísticas Operacionais do
DCTNATUREZA DO GÁS DE ARRASTE Quanto maior
a diferença entre a condutividade térmica do
gás de arraste puro, A, e do analito, X, maior a
resposta.
QUANTO MENOR A MASSA MOLECULAR DO GÁS DE ARRASTE, MAIOR A RESPOSTA
Como:
(M = massa molecular)
Gás de arraste com DCT: He ou H2 outr
o gás
1 2
He ou H2
1 2
1Usando He ou H2 como gás de arraste, é maximizado: MAIOR RESPOSTA
2Com outros gases, eventualmenteX > A: PICOS NEGATIVOS
DETECTORESCaracterísticas Operacionais do
DCTFATORES DE RESPOSTA Quanto menor a
condutividade térmica do analito, maior o sinal.
Quantidades iguais de substâncias diferentes geram picos cromatográficos com
áreas diferentes !!!
Os fatores de resposta dependem da condutividade
térmica do analito
Mistura de quantidades
equimolares de:
Etano = 17,5
Clorofórmio = 6,0Etanol = 12,7
C2H
6
CHCl3 C2H5O
H
X
DETECTORESCaracterísticas Operacionais do
DCTTEMPERATURAS DE OPERAÇÃO Quanto maior a diferença entre a temperatura dos filamentos e do
bloco metálico maior a resposta.
Temperatura do filamento, TF: entre 300oC e 350oC. É função da corrente de alimentação dos filamentos, i.
i TFSina
lLimitações:
- Correntes excessivas podem fundir o filamento (Ø típicos do filamento = 20 m)
- Diminuição do tempo de vida útil dos filamentos (oxidação por traços de O2 no
gás de arraste)
Temperatura do bloco, TB: mantida tão baixa quanto possível
TBSina
lLimitação:
- Temperaturas excessivamente baixas podem provocar a condensação de
analitos nas celas (erros analíticos, danos aos filamentos)
DETECTORESDCT: Aplicações
1 Separação e quantificação de compostos que não geram sinal em outros detectores (gases
nobres, gases fixos)
2 Por ser um detector não-destrutivo, pode ser usado em CG preparativa ou detecção sequencial
com dois detectores em “tandem”
Coluna: CP Sil 5CB(50 m x 0.32 mm x 5
µm)Gás de Arraste: He @ 3
ml.min-1
TCOL: 40°CDetector: DCT
1 N2 2 CH4
3 CO2 4 n-C2
5 NH3 6 n-C3
7 i-C4 8 n-C4
Separação de Gases Fixos e Hidrocarbonetos:
DETECTORESDetector por Ionização em
ChamaPRINCÍPIO Formação de íons quando um composto é queimado em uma chama de hidrogênio e oxigênio
O efluente da coluna é misturado com H2 e O2 e queimado. Como numa chama de H2 + O2 não existem íons, ela não
conduz corrente elétrica.
Quando um composto orgânico elui, ele
também é queimado. Como na sua queima são formados íons, a chama
passa a conduzir corrente elétrica
DETECTORESDetector por Ionização em
ChamaCOLETOR
FLAME TIP
BLOCO
AR
H2
COLUNA
O ar e o H2 difundem para o interior do coletor, onde se
misturam ao efluente da coluna e queimam:
Uma diferença de potencial elétrico é aplicada entre o
flame tip e o coletor - quando se formam íons na chama, flue uma corrente
elétrica:
DETECTORESDetector por Ionização em
ChamaQuímica da Chama de Hidrogênio:
Incandescência
Reação
Quebra
Estrutura da chama
três regiões básicas
Região de quebra Mistura dos gases, pré-aquecimento, início da quebra das moléculas de H2, O2 e dos analitos.Zona de reação Reações exotérmicas com
produção e/ou consumo de radicais H, O, OH, HO2 (provenientes do H2), CH e C2 (proveniente do analito) e íons CHO+ (analito).Zona de incandescência Emissão de luz por decaimento de espécies excitadas: OH (luz UV), CH e C2 (visível).
Queima de substâncias com
ligações C-H
CH + O CHO+ + e-
1 íon formado a cada ~105 átomos de C queimados
Queima de H2Formam-se apenas
radicais !!!
DETECTORESCaracterísticas Operacionais do
DICSELETIVIDADE Seletivo para substâncias que contém ligações C-H em sua estrutura
química.(como virtualmente todas as substâncias analizáveis por
CG são orgânicas, na prática o DIC é UNIVERSAL)
Compostos que NÃO produzem resposta no DIC:
Gases nobresH2, O2, N2CO, CO2, CS2
CCl4, peralogenados
NH3, NxOy
SiX4 (X = halogênio)H2O
HCOOH, HCHO *
SENSIBILIDADE / LINEARIDADE QMD típicas = 10 pg a 100 pg com linearidade entre 107 e
108 (pg a mg)
DIC
DCT
N2
CH4CO2
O2
DETECTORESCaracterísticas Operacionais do
DICVAZÕES DE GASES Além do gás de arraste, as vazões de alimentação de ar (comburente)
e hidrogênio (combustível) devem ser otimizadas.
Gráficos Sinal x Vazão de Gases típicos:
SIN
AL
150 300 450 600 15 30 45 60
AR H2
O sinal se mantém aproximadamente constante em uma larga faixa de vazões
de ar e H2
VARIAÇÕES NAS VAZÕES DE AR E H2 AFETAM APENAS MARGINALMENTE O
SINAL = MAIORES REPRODUTIBILIDADE E REPETIBILIDADE
DETECTORESCaracterísticas Operacionais do
DICTEMPERATURA DE OPERAÇÃO O efeito da temperatura sobre o sinal do DIC é negligenciável.
TRATAMENTO DE SINAL Por causa da baixa magnitude da corrente elétrica gerada (pA a nA) ela deve ser amplificada para poder ser registrada.
1
23
4
Diagrama eletrônico
simplificado de um DIC
1 Flame tip / Chama / Coletor2 Bateria ou Fonte de CC Voltagens de
operação normais de 200 V a 300 V (não variável - valor depende da geometria específica do detector).3 Amplificador Eletrométrico Deve amplificar o sinal e converter uma corrente
variável em uma voltagem variável (pA mV). 4 Saída de Registro de
Sinal
DETECTORESCaracterísticas Operacionais do
DICFATORES DE RESPOSTA O fator de resposta de um determinado composto é aproximadamente
proporcional ao número átomos de carbono. Presença de heteroelementos diminui o fator de
resposta.
Número Efetivo de Carbonos (NEC) Prevê com ~20% de aproximação o fator de resposta de um
composto.
Átomo X
C alifático +1,00C aromático +1,00C olefiníco +0,95C carbonila +0,00
O álcool prim. -0,60Cl alifático -0,12
(X = Contribuição de cada átomo ao NEC)
C2H6 NEC = 2,00
C2H5OH NEC =
1,40 CH3CHO NEC =
1,00
Mistura com quantidades
equimolares de:
DETECTORESDetector de Nitrogênio - Fósforo
Modificação do DIC altamente seletiva para compostos orgânicos nitrogenados e
fosforadosPérola de sal de metal alcalino:RbCl (normal),
KCl
Seletividade S para fosforados ou nitrogenados: 10.000 x -
100.000 x em relação a hidrocarbonetos similares
QMD = 0,4 pg a 10 pg (N) e 0,1 a 1 pg (P)
Pesticidas Triazínicos usando DNP:
1 Desetilatrazina2Desisopropilatrazina3 Atraton4 Atrazina5 Trietazina6 Secbumeton7 Sebutilazina8 Simetrin9 Dipropretrina10 Dimetametrina11 Metroprotrina
(100 pg cada)
DETECTORESDetector por Captura de Eletrons
PRINCÍPIO Supressão de um fluxo de eletrons lentos (termais) causada pela sua absorção por espécies eletrofílicasUm fluxo contínuo de
eletrons lentos é estabelecido entre um anôdo (fonte
radioativa -emissora) e um
catodo.
Na passagem de uma substância
eletrofílica alguns eletrons são absorvidos,
resultando uma supressão de
corrente elétrica.
DETECTORESDetector por Captura de Eletrons
12
3
4
5
1 Anôdo (fonte radioativa - emissora)
2 Saída de gases
3 Catodo
4 Cavidade
5 Coluna cromatográfica
DETECTORESDetector por Captura de Eletrons
Mecanismo de Captura de Eletrons
1 Geração de eletrons lentos pela interação entre a ra- diação moléculas do gás de arraste G e molécu- las de bloqueador (“quencher”) Q
- + G G + + e - + e* energia- + G G* + Q G + e - + Q energia
2 Eletrons lentos são capturados pela espécie eletro- fílica AB AB + e - AB - +
energiaO decréscimo na corrente elétrica fluindo pela
cela de detecção é proporcional à concentração a da espécie absorvente no gás
de arrasteIb corrente de
repousoIe corrente na eluição do
analitoK constante de captura
DETECTORESCaracterísticas Operacionais do
DCEFONTE RADIOATIVA O anôdo deve estar dopado com um isótopo radioativo - ou
- emissor
Emprego universal em DCE comerciais:3H (-, 0,02
MeV)Sob a forma de Ta3H3
Tdet deve ser <
225oC
Maior sensibilidade
63Ni (-, 0,06 MeV)
Usado como 63Ni 0Maior linearidadeÚtil até ~400oC
85Kr, 90Sr, 99Tc, 147Pm, 241Am, 226Ra
Raramente
usados:
63Ni preferido em
equipamentos modernos
- Maior durabilidade (t1/2 = 100 a x 12 a para 3H)- Maior estabilidade térmica- Menor risco de uso (radioatividade)
DETECTORESCaracterísticas Operacionais do
DCE
TEMPERATURA DO DETECTOR Dependência do sinal com temperatura de operação
bastante significativa
Variação de 3oC na temperatura
Erro de ~ 10% na área dos picos
Magnitude e sinal do erro depende do composto analisado !
POLARIZAÇÃO DOS ELETRODOS Vários modos de polarização possíveis
VOLTAGEM PULSADA Menos anomalieas elétricas: maior sensibilidade e linearidade.
VOLTAGEM CONSTANTE Pouco usada modernamente - picos cromatográficos podem ser deformados.
TEMPERATURA DO DCE DEVE SER RIGIDAMENTE
CONTROLADA
DETECTORESCaracterísticas Operacionais do
DCEGÁS DE ARRASTE Funcionamento do DCE é muito dependente da natureza do gás de
arraste
MAIS USADOS:
N2Ar + 5%
CH4
Geram eletrons lentos quando
bom-bardeados
com -
O gás deve ser o mais puro possível !!!(traços de H2O e O2 comprometem o sinal
do DCE)
VAZÃO DE GÁS DE ARRASTE Sinal depende dire-tamente da vazão de gás fluindo no
detector
Sinal
F
!Adsorção de contaminantes
sobre os eletrodos causa deformação
nos picos
DETECTORESCaracterísticas Operacionais do
DCESENSIBILIDADE / LINEARIDADE QMD = 0,01 pg a 1 pg (organoclorados), linearidade ~ 104
(pg a ng)
10 fg Lindano (C6H6)
-ECD HP-6890
PESTICIDAS 1 tetracloro-m-
xileno 2 - BHC 3 Lindano 4 Heptachlor 5 Endosulfan 6 Dieldrin 7 Endrin 8 DDD 9 DDT10 Metoxychlor10 decaclorobifenila
~250 fg cada analito
O DCE É O DETECTOR PREFERENCIAL PARA ANÁLISES DE TRAÇOS DE
ORGANOALOGENADOS E SIMILARES
DETECTORESCaracterísticas Operacionais do
DCESELETIVIDADE / FATORES DE RESPOSTA Valores de S maximizados para compostos
eletrofílicos
hidrocarbonetos e esteres alifáticos, dienos
álcoois, cetonas e aldeídos alifáticos, aminas, nitrilas, mono - Cl, mono - F
enóis, oxalatos, mono - Br, di - Cl, hexa - F
tri - Cl, cloretos de ácidos, alquil - Pb, anidridos
mono - I, di - Br, tri - Cl, mono - nitro, CS2
di - I, tri - Br, poli - Cl, di - nitro, 1,2 - dicetonas, fumaratos, organo - Hg
S típicos (clorobenzeno: S = 1)
Comparando-se organoalogenad
os:
I > Br > Cl > F
Terc > Sec > Prim
Tri > Di > Mono
> >
trans > cis
DETECTORESDCE: Aplicações
Contaminantes em ar atmosférico - detecção paralela DIC + DCE
DIC
DCE
1, 2, 3 - Hidrocarbonetos aromáticos4, 5, 6 - Hidrocarbonetos
clorados
ANÁLISE QUALITATIVAConceitos Gerais
Fontes de Informações Qualitativas
RETENÇÃO Uso de dados de retenção de um analito para sua identificação
DETECÇÃO Detectores que fornecem informações estruturais sobre as substâncias eluídas
Identificação individual das espécies contidas na
amostra
Determinação da identidade da amostra
propriamente dita
Aplicações
Qualitativas de CG
Para análise qualitativa confiável por CG é recomendável combinação
de dados provenientes de pelo menos duas fontes
ANÁLISE QUALITATIVATempos de Retenção
t’R = f
Interações analito / FEPressão de vapor do analitoCondições operacionais (TCOL,
FC ...)Fixas as condições operacionais, o tempo
de retenção ajustado de um analito é uma constante
AMOSTRA
PADRÃO
Comparação de
cromatogramas da
amostra e de uma solução padrão do
analito suspeito
ANÁLISE QUALITATIVATempos de Retenção
Identificação por t’R é muito pouco confiável:
Dependência com FC e TCOL Variações nestas condições afetam sensivelmente os t’R
VARIAÇÃO DE 1% NO
t’R
TCOL =
0,1%
FC = 1%
Sobrecarga na coluna Aumento excessivo na massa de material eluido deforma o pico croma-tográfico e altera o seu t’R
MA
SS
A
Saturação da coluna
cromatográfica com aumento
de massa eluida provoca “cauda frontal” no pico
ANÁLISE QUALITATIVATempos de Retenção
Comparação de t’R usando dopagem
(“spiking”) da amostra com o analito suspeito: aumento da confiabilidade de
identificação.
Amostra complexa: incerteza nos t’R
medidos pode levar a identificação
errônea
Comparação com cromatograma da amostra dopada
permite identificação mais
confiável do desconhecido
ANÁLISE QUALITATIVAÍndice de Retenção de Kovàts
FUNDAMENTO Os t’R isotérmicos para uma
série homóloga de compostos dependem logaritmicamente do número de átomos de
carbono na cadeia.
Separação isotérmica de uma mistura de n-
alcanos (n-C4, n-C5, ...
n-C16)
Um gráfico de log(t’R)
em função do número de átomos de carbono
do analito nC é LINEAR
ANÁLISE QUALITATIVAÍndice de Retenção de Kovàts
O índice de retenção de Kovàts I para um analito é definido por:
t’R (A) Tempo de
retenção ajustado do analito A
t’R (N) Tempo de
retenção ajustado do n-alcano com N carbonos
t’R (n) Tempo de
retenção ajustado do n-alcano com n carbonos (n = N + 1)
Ex.: um analito com I = 874 teria um tempo de retenção ajustado equivalente ao de um n-alcano hipotético com cadeia
de 8,74 átomos de carbono
Interpolação logarítmica
dos t’R
ANÁLISE QUALITATIVAÍndice de Retenção de Kovàts
REPETIBILIDADE - REPRODUTIBILIDADE Os
efeitos de TCOL e FC nos índices de Kovàts
são pequenos
ANALITO I/TCHCl3 +0,02 %
CH3CH2OH -0,12 %CH3CHO -0,05 %
CH3(CO)CH3 -0,04 %
Dependência de I para algumas
substâncias em uma coluna apolar na
faixa de TCOL = 70oC
a TCOl = 130oC
Identificação por índices de retenção é muito confiável que comparações baseadas
em t’RÍNDICE DE RETENÇÀO DE KRATZ Para
programação linear de temperatura a relação
entre t’R e nC é linear: cálculo dos índices de
retenção é modificado
ANÁLISE QUALITATIVARetention Time Locking (RTL)PRINCÍPIO Em cromatógrafos com: controles pneumáticos e térmicos
microprocessados, injetores automáticos e colunas cromatográficas de qualidade
excepcional é possível alta repetibilidade
nos t’RCORRIDA #1
TCOL (1)
FC (1)
Coluna A
CORRIDA #2
TCOL (2)
FC (2)
Coluna BO software RTL (Hewlett-Packard)
automaticamente ajusta as condições operacionais em um segundo CG para reproduzir
os t’R obtidos em um primeiro equipamento
Cromatogramas obtidos em diferentes
equipamentos e colunas com condições
operacionais da segunda corrida ajustadas pelo
software de RTL
ANÁLISE QUALITATIVAMétodos de Detecção
QualitativosMétodos de detecção que fornecem informações qualitativas sobre os analitos
eluídos:
Cromatografia Gasosa com Deteção Espectrométrica por Absorção no Infra-Vermelho (CG-EIV)
Cromatografia Gasosa com Deteção Espectrométrica de Massas (CG-EM)
Cromatografia Gasosa com Deteção Espectrométrica por Emissão Atômica (CG-EA)
Identificação muito confiável quando combinados a técnicas de identificação
baseadas em retenção
ANÁLISE QUALITATIVAEspectrometria de Massas
PRINCÍPIO A amostra é fragmentada e ionizada em um padrão característico da
espécie química.1 Moléculas da amostra são bombardeadas por elétrons (electron impact = EI) ou íons (chemical ionization = CI):ABCDE + e- ABCDE.+ +
2 e-
2 O íon formado se fragmenta:ABCDE.+ AB. +
CDE+ABCDE.+ AB+ +
CDE.ABCDE.+ A+ +
BCDE.
3 Os fragmentos iônicos formados são separados magneticamente de acordo com suas massas moleculares e contados:
AB
UN
DÂ
NC
IA
MASSA / CARGA
O gráfico do número de íons formados em
função da razão Massa / Carga dos íons é o ESPECTRO
DE MASSAS do analito
ANÁLISE QUALITATIVAEspectrômetro de Massas
1
2
3
4
1 Câmara de Ionização Eletrons gerados por um filamento aquecido bombardeam a amostra. Os fragmentos ionizados (carga +1) são repelidos pelo eletrodo positivo e conduzidos ao separador magnético.
2 Saída de Vácuo Todo o interior do EM deve estar sob alto vácuo (natm).
3 Separador Magnético A ação do campo magnético deixa apenas íons com determinada razão Massa / Carga atravessar esta área do equipamento.
4 Detector Uma válvula fotomultiplicadora ou um fotodiodo gera um sinal elétrico proporcional ao número de íons que incide sobre o elemento.
ANÁLISE QUALITATIVAEspectro de Massas
m/Z = 118
m/Z = 80
m/Z = 79
- CO
- (CO + H)
m/Z = 90
20
40
60
80
100
120
0
m / Z
ANÁLISE QUALITATIVAAcoplamento CG - EM
Interface cromatógrafo - espectrômetro:
CG
EM
Vácuo
Separador Molecular
O gás de arraste leve (He) difunde mais rapidamente
que o analito e tende a ser drenado
para o vácuo.
Câmarade
Ionização
Coluna
Capilar
Interface Capilar Direta
Com colunas capilares a vazão baixa de gás de arraste pode ser
drenada pelo sistema de vácuo.
ANÁLISE QUALITATIVAAcoplamento CG - EM
Sistema de Controle e Aquisição de Dados:
É MANDATÓRIO que sistemas CG-EM
sejam totalmente controlados por
microcomputador.
Sistema de Controle e Aquisição de Dados:
1 Gerencia e monitora o funcionamento dos módulos de CG e EM.2 Coleta e arquiva espectros de massa em
intervalos regulares de tempo e constroi o cromatograma.3 Após a corrida, compara espectros coletados com bases de dados para identificação dos eluatos.
COMPUTADORES RÁPIDOS E COM GRANDE CAPACIDADE DE ESTOCAGEM
DE DADOS
ANÁLISE QUALITATIVACG-EM: Geração do
CromatogramaEspectros de massas completos coletados e arquivados em intervalos
regulares de tempoGeração do cromatograma a partir dos
espectros:
CROMATOGRAMA DE ÍONS TOTAIS (TIC = To-tal Ion Chromatogram)Para cada espectro o número total de íons detectados na faixa de massas varrida é somado e plotado em função do tempo,
gerando o cromatograma.
MONITORAMENTO DO ÍON SELECIONADO (SIM = Single Ion Monitoring)Seleciona-se um fragmento resultante da
fragmentação da espécie de interesse. Gera-se o cromatograma plotando-se o número de íond detectados com a massa desse fragmento em
função do tempo.
TICUniversal
Similar a DIC
SIMSeletivo
Maior Sensibilidade
ANÁLISE QUALITATIVACG-EM: TIC x SIM
Aroma de polpa industrializada de cajá após extração por SPME
TICAparecem os picos correspondentes a todas substâncias
eluídas
SIM (m/z = 149)
Cromatograma construido a partir dos mesmos dados acima, mas apenas
usando fragementos com
massa = 149 (ftalatos:
plastificante)
ANÁLISE QUALITATIVAIdentificação de Eluatos
TEMPO
CO
NTA
GEN
S
MASSA / CARGA
CO
NTA
GEN
S
1 Seleção manual ou automática do espectro de massa correspondente a um eluato.
2 Interpretação manual do espectro e / ou com-paração automática com biblioteca de espectros padrão do equipamento.
ANÁLISE QUALITATIVAIdentificação de Eluatos
Busca automática em bibliotecas de espectros: comparação estatística
( Probability Based Matching )
BIBLIOTECA DEESPECTROS
ESPECTRODESCONHECID
OPBM
Lista com possíveis
candidatos + porcentagem de confiabilidade
# NOME FÓRM. %
1 1-dodeceno C12H24 99
2 1-dodecanol C12H26O 91
3 ciclododecano C12H24 91
4 2-dodeceno C12H24 66
5 1-undeceno C11H22 35
6 8-metil-3-undeceno C12H24 32
PBM de um eluato
“desconhecido” (1-dodeceno)
LIMITAÇÕES:
Identificação pouco confiável de es-pectros muito simples
Limitada pelo tamanho da base de dados (NIST = 66.000 espectros)
Diferenças entre espectros gerados por diversos EM
ANÁLISE QUALITATIVAEmissão Atômica em Plasmas
PRINCÍPIO A amostra é fragmentada num plasma, os fragmentos são excitados e
emitem luz ao retornarem aos seus estados fundamentais.
1 Amostra é fragmentada ao colidir com moléculas excitadas do gás de suporte do plasma.ABCD + Hem A+ + B + CD +
He + e-
2 Fragmentos são excitados eletronicamente.A+ + B + CD + Hem A+* + B* +
CD* + He
3 Ao retornarem aos seus estados fundamentais os fragmentos excitados emitem luz em comprimentos de onda característicos.
A+* A+ +
h1B* B + h2CD* CD +
h3
O MONITORAMENTO DA EMISSÃO NOS COMPRIMENTOS DE ONDAS CARACTERÍSTICOS DE
CADA FRAGMENTO GERA CROMATOGRAMAS ELEMENTO-ESPECÍFICOS
ANÁLISE QUALITATIVAGeração e Sustentação de
PlasmasPLASMA Gás ionizado por aplicação de uma descarga elétrica e sustido por um campo
elétrico oscilante
Eletrons da descarga elétrica colidem com o
gás gerando íons
Íons formados são acelerados pelo campo
elétrico aplicado gerando continuamente mais íons e
espécies excitadas
Gás de Suporte: HÉLIO (espécies formadas tem energia suficiente para excitar átomos e
fragmentos de não metais)
Sustentação: MICROONDAS (outros tipos de campos elétricos oscilantes não mantém
plasmas estáveis de He a pressão atmosférica de forma conveniente)
ANÁLISE QUALITATIVAEspectro de Emissão Atômica
Mistura de raias de emissão atômicas e moleculares de frag-mentos do analito e raias de
emissão do plasma e impurezas
200 nm
800 nm
n-HexanoFragment
os:C2 CN
OH NH
456 nm
566 nm
Fósforo
BromoCloro
Naled (C4H7Br2Cl2O4P)
ANÁLISE QUALITATIVAEsquema Típico de um CG-DEA
1 Cromatógrafo Gasoso2 Alimentação de Gás de Suporte do Plasma (He)
3 Linha de Transferência (acoplamento CG - DEA)4 Cavidade Ressonante (geração do plasma)
5 Lente de Focalização6 Monocromador / Policromador
7 Detector de Luz (fotomultiplicadora / diode array)
8 Amplificação / Digitalização de Sinal
9 Computador
ANÁLISE QUALITATIVADEA: Geração de Plasma
Uma cavidade ressonante focaliza potência gerada por uma fonte de microondas no interior de uma
cela de detecção por onde passa o gás de suporte.
CELA DE DETECÇÃ
O
PLASMA
CABO DE ALIMENTAÇÃO
DE MICROONDAS
CAVIDADE RESSONANTE
He
Cavidade Ressonante Beenaker TM010:
Permite plasmas de He estáveis a pressão atmosférica e potências de microondas <
100 W
CELA DE DETECÇÃO Tubo de material isolante elétrico e altamente refratário
(quartzo, alumina, BN)
ANÁLISE QUALITATIVAInterface CG - DEA
Plasmas de He se extinguem pela passagem de grandes quantidades de material (~ 1 L de
líquido vaporizado)
Interface para colunas empacotadas:
COLUNA
He
CELA
PURGA
VÁLVULA DIVERSOR
A
Antes de ser misturado ao He, o efluente
da coluna passa por uma
válvula diversora
Quando da eluição de grandes
quantidades de analito o fluxo
da coluna é desviado para
a purga
Colunas capilares: não há necessidade de diversão.
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