Pos Usp Aula Biomol Dna Rna Prot Genomica Parte1

Fundamentos de Biologia

Molecular, métodos

avançados e ferramentas

aplicativas a Botânica

Objetivos do Curso

Métodos avançados em biologia

molecular, com aprofundamento do

conhecimento para abordagens

pessoais em biomol, com viés

aplicativo a sua própria pesquisa.

Roberta A. Campos PhD. March 2012 2

Qualificação

Bióloga: Bacharel & Licenciada – RGS (2001)

MSc Biotecnologia (UCS e UFRGS) - (2001-2003)

DTI 7G: Projeto Genoma Sul – Micoplasma – RGS (2004)

PhD Biofísica (UFRJ) - Heat Schock Protein – RJ (2005-2009)

PD IQUSP: Projeto BIOEN – Genoma Cana – SP (2009-2011)

PD Petrobras – Projeto: Transcriptoma Araucaria (2011-2012)

Roberta A. Campos PhD. March 2012 3

DNA – Introdução

O carreador da Informação Genética

Roberta A. Campos PhD. March 2012 4

Os diferentes alfabetos

Roberta A. Campos PhD. March 2012 5

Componentes

dos Ácidos

Nucléicos

BASES

NITROGENADAS

Roberta A. Campos PhD. March 2012 6

DNA - Polímero de desoxribonucleotídeos

Roberta A. Campos PhD. March 2012 7

Anti-paralelismo do DNA

Roberta A. Campos PhD. March 2012 8

DNA

Roberta A. Campos PhD. March 2012 9

RNA

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Modelo de

Replicação do DNA

Watson e Crick

propuseram mais do que isto ...

Roberta A. Campos PhD. March 2012 11

… Eles propuseram:

Dogma Central de BIOMOL

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Dogma Central de BIOMOL

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•DNA macromolécula inerte, ou

seja, não tem atividade catalítica. É

apenas reservatório da informação

genética. (Genótipo).

•Proteínas macromoléculas

catalíticas efetoras da mensagem

genética, ou seja, traduzem a

informação genética em uma

função. (Fenótipo).

•RNA macromoléculas que faz

a intermediação da linguagem de

nucleotídeos para aminoácidos..

Possui atividade catalítica.

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Fluxo da informação gênica

Roberta A. Campos PhD. March 2012 15

Replicação Semi-

conservativa do DNA

Roberta A. Campos PhD. March 2012 16

COMPACTAÇÃO DO DNA EM NUCLEOSOMAS

Roberta A. Campos PhD. March 2012 17

DNA - COMPACTAÇÃO

Roberta A. Campos PhD. March 2012 18

DNA Diferentes Níveis

de Compactação da

Cromatina

Roberta A. Campos PhD. March 2012 19

Síntese de DNA

Mecanismo Enzimático da Replicação

Uma das unidades

PRECURSORA

do RNA

Ribonucleotídeo

trifosfatado

Roberta A. Campos PhD. March 2012 21

Como

duplica?

Replicação

do DNA

Roberta A. Campos PhD. March 2012 22

DNA - Incorporação do primeiro

d-XTP ao primer de RNA

Roberta A. Campos PhD. March 2012 23

DNA - Hidrólise do trifosfato e adição do

primeiro d-XTP

Roberta A. Campos PhD. March 2012 24

Forquilhas de

Replicação

Bi-direcional do DNA

Roberta A. Campos PhD. March 2012 25

A REPLICAÇÃO DO DNA SÓ

OCORRE NO SENTIDO

5’ 3’

E COMO AS FITAS SÃO

ANTI-PARALELAS

ENTÃO ... Roberta A. Campos PhD. March 2012 26

DNA - Forças de Torção Criadas

pela Abertura da Dupla Hélice

Roberta A. Campos PhD. March 2012 27

A REPLICAÇÃO DO DNA SÓ OCORRE NO SENTIDO

5’ 3’

E COMO AS FITAS SÃO ANTI-PARALELAS ENTÃO ...

Roberta A. Campos PhD. March 2012 28

Roberta A. Campos PhD. March 2012 29

Forquilha de Replicação

Simplificada

Roberta A. Campos PhD. March 2012 30

DNA - Remoção dos

Primers de RNA e

Fechamento dos Nicks

Roberta A. Campos PhD. March 2012 31

Proteinas estabilizadoras de DNA

simples fita (SSB Proteins)

Roberta A. Campos PhD. March 2012 32

Complexo de Replicação Completo

Roberta A. Campos PhD. March 2012 33

DNA Ligase

Estabelece a ligação

fosfodiester após a remoção

dos primers de RNA

Roberta A. Campos PhD. March 2012 34

Origem (Iniciação) de Replicação do DNA

Roberta A. Campos PhD. March 2012 35

DNA

Topoisomerase I

Relaxamento das Forças

de Torção pela

Roberta A. Campos PhD. March 2012 36

Atividade

(exonucleásica 3-5)

de Correção de Erros

das DNAs

Polimerases

Roberta A. Campos PhD. March 2012 37

Síntese de RNA

Transcrição

Transcrição do DNA

Roberta A. Campos PhD. March 2012 39

Síntese de RNA

RNAs polimerases I, II e III

(Somente 5’ 3’)

Precursores de RNA

Roberta A. Campos PhD. March 2012 41

O Promotor SEMPRE esta no comando!

Sequências de reconhecimento das RNA polimerases

Roberta A. Campos PhD. March 2012 42

Roberta A. Campos PhD. March 2012 43

Roberta A. Campos PhD. March 2012 44

Ambas as fitas do DNA podem ser transcritas

Roberta A. Campos PhD. March 2012 45

Em EUCARIOTOS

A sequência dos genes/exons é

interrompida por introns

Roberta A. Campos PhD. March 2012 46

Roberta A. Campos PhD. March 2012 47

Síntese do Transcrito Primário do mRNA

Roberta A. Campos PhD. March 2012 48

Síntese de Proteínas

TRADUÇÃO

(Somente sentido 5’ 3’)

Tradução do mRNA

Roberta A. Campos PhD. March 2012 50

t-RNA, O adaptador das Linguagens

Roberta A. Campos PhD. March 2012 51

O Código

Genético

Roberta A. Campos PhD. March 2012 52

Quadros de Leitura

ORFs (open-reading frames) & Codons do mRNA

Roberta A. Campos PhD. March 2012 53

Quadros de diferentes Leituras (ORFs)

Pode resultar em aminoácidos diferentes,

proteínas diferente, polimorfismos gênicos ou

mutação genéticas.

Ex.: doenças metabolismo inato.

Roberta A. Campos PhD. March 2012 54

Superposição de quadros de leitura

(frames)

Roberta A. Campos PhD. March 2012 55

oAlterações da “frame” por mutações

Roberta A. Campos PhD. March 2012 56

Estrutura do tRNA e anti-codon

Roberta A. Campos PhD. March 2012 57

Iniciação da

Síntese de

Proteínas

Roberta A. Campos PhD. March 2012 58

Sinais de Reconhecimento da Iniciação

Roberta A. Campos PhD. March 2012 59

Alongamento

da Síntese de

Proteínas

Roberta A. Campos PhD. March 2012 60

Translocação do

Ribosoma

Roberta A. Campos PhD. March 2012 61

Terminação da

Síntese de

Proteínas

Roberta A. Campos PhD. March 2012 62

Transcrição e Tradução Simultânea

Roberta A. Campos PhD. March 2012 63

Controle da Expressão Gênica

Etapas do Controle da Expressão Gênica

Roberta A. Campos PhD. March 2012 65

Roberta A. Campos PhD. March 2012 66

Síntese do Transcrito Primário do mRNA

mRNA Maduro

Roberta A. Campos PhD. March 2012 67

Elementos Básicos de Região

Promotora da Transcrição no DNA

Roberta A. Campos PhD. March 2012 68

Roberta A. Campos PhD. March 2012 69

Proteínas

PTN Estrutura

Primária ou nível

primário

Secundária ou nível

secundário ou helicoidal

Terciária ou nível

terciário

Quaternária ou nível

quaternário

71 Roberta A. Campos PhD. March 2012

PTN Estrutura

Estrutura Primária ou Nível Primário

É a seqüência em número de aminoácidos (cadeia peptídica). A ligação

estabilizante é a ligação peptídica (covalente). Se imaginarmos os

aminoácidos representados por letras: A, B, C, D, ... teremos uma

esquematização da estrutura primária de uma proteína:

A – B – C – D – A – E É importante salientar que o número de aminoácidos determina o número de

proteínas. Uma variação na seqüência conduz a uma proteína diferente e com

ação bioquímica diferente. Ex: a ocitocina e a vasopressina diferem entre si na

seqüência de apenas dois aa; a ocitocina provoca as contrações uterinas e a

vasopressina provoca aumento da pressão sangüínea.

72 Roberta A. Campos PhD. March 2012

PTN Estrutura

Estrutura secundária ou nível secundário (helicoidal)

É o enrolamento da estrutura primária em torno de um eixo imaginário, originando

uma hélice chamada de hélice. Assim, esta estrutura está relacionada com a

disposição espacial das estruturas primárias, e pode ser em forma de um hélice ou

uma folha pregueada.

73 Roberta A. Campos PhD. March 2012

PTN Estrutura - Estabilidade

Ligação ou Ponte de Hidrogênio: formada pela interação ou atração

entre: - oxigênio da carboxila de um AA e hidrogênio do grupo amina

de outro/ - oxigênio da carboxila de um AA e hidrogênio do grupo

carboxila de outro.

Ligação Iônica: formada pela atração entre as cadeias laterais dos

AA ácidos e AA básicos.

Ligação hidrófoba ou apolar: formada pela interação de radicais

apolares como: metil, etil, metileno. AAs constituintes da molécula.

Ligação ou ponte dissulfeto: formada pela união de grupos –SH dos

AA cisteína.

OBS: - As ligações estabilizantes em maior número são as pontes de “H”.

- A ligação estabilizante mais forte é a ligação dissulfeto.

74 Roberta A. Campos PhD. March 2012

Estrutura

c) Estrutura terciária ou nível terciário

É a sua forma tridimensional ocasionada pelo enrolamento da espiral

sobre si mesma (novelo). As ligações estabilizantes são as mesmas da estrutura

secundária.

75 Roberta A. Campos PhD. March 2012

Estrutura

d) Estrutura Quaternária ou Nível Quaternário

É a que resulta da reunião de várias estruturas terciárias que, em conjunto, assumem

formas espaciais bem definidas. As ligações estabilizantes são as mesmas da estrutura

secundária.

OBS: nem todas as proteínas apresentam esta estrutura, mas de uma maneira geral,

todas as enzimas as apresentam.

76 Roberta A. Campos PhD. March 2012

Desnaturação

A desnaturação de uma proteína é a desorganização das estruturas

quaternárias, terciárias e secundárias.

Agentes desnaturantes são os que provocam a desorganização.

São eles: agentes físicos (calor, radiações UV, alta pressão e ultra som)

agentes químicos (ácidos fortes, bases fortes, metais pesados e uréia)

A proteína desnaturada apresenta as seguintes alterações:

a) Físicas: aumento da viscosidade; não podem ser cristalizadas ou auto-organizadas.

b)Químicas: maior reatividade: devido a exposição de grupos químicos que estavam

encobertos por estruturas; diminuição da solubilidade do PHi e, consequente

precipitação.

c) Biológicas: perda de suas propriedades enzimáticas, antigênicas e hormonais;

facilmente digeridas por enzimas hidrolíticas.

77 Roberta A. Campos PhD. March 2012

Enovelamento

Protéico

Chaperona

Molecular

Roberta A. Campos PhD. March 2012 78

Métodos Avançados

Biotecnologia & Biomol

Sequenciamento

Histórico

Década de 50 até Atualidade...

* 1953 Discovery of the structure of the DNA double helix (Watson, Crick, Franklin).

* 1958 Prove the semi-conservative nature of dna replication (Meselson, Stahl)

* 1961 First DNA triplet is decoded (Matthei, Nierenberg)

* 1972 Development of recombinant DNA technology, which permits isolation of defined fragments

of DNA; = sequencing were from bacteriophage or virus DNA.

* 1972 The first gene is sequenced

* 1975 The first complete DNA genome to be sequenced is that of bacteriophage φX174

* 1977 Allan Maxam and Walter Gilbert publish "DNA sequencing by chemical degradation“.

* Fred Sanger, independently, publishes "DNA sequencing by enzymatic synthesis".

* 1980 Fred Sanger and Wally Gilbert receive the Nobel Prize in Chemistry

* 1982 Genbank starts as a public repository of DNA sequences.

* 1982 Andre Marion and Sam Eletr from Hewlett Packard start Applied Biosystems in May, which

comes to dominate automated sequencing.

* 1982 Akiyoshi Wada proposes automated sequencing and gets support to build robots

with help from Hitachi.

* 1983 Polymerase-Chain-Reaction (Mullis) PCR

* 1984 RFLP fingerprinting (Jeffreys)

* 1984 Medical Research Council decipher complete DNA sequence of the Epstein-

Barr virus, 170 kb.

* 1985 Kary Mullis and colleagues develop the polymerase chain reaction, a technique to replicate

small fragments of DNA

* 1986 Leroy E. Hood's laboratory at the California Institute of Technology and Smith announce the

first semi-automated DNA sequencing machine. by Applied Biosystems as 370A.

* 1987 Applied Biosystems markets first automated sequencing machine, the model ABI 370.

Seq-history

* 1990 The U.S. National Institutes of Health (NIS) begins large-scale sequencing trials on Mycoplasma

capricolum, Escherichia coli, Caenorhabditis elegans, and Saccharomyces cerevisiae (at 75 cents (US)/base).

* 1990 BLAST algorithm for aligning sequences published (Lipman, Myers).

* 1990 capillary electrophoresis published (Barry Karger, Lloyd Smith, Norman Dovichi).

* official start of the Human Genome Project

* 1991 Craig Venter develops strategy to find expressed genes with ESTs (Expressed Sequence Tags).

o Uberbacher develops GRAIL, a gene-prediction program.

* 1992 Craig Venter leaves NIH to set up The Institute for Genomic Research (TIGR).

o William Haseltine heads Human Genome Sciences, to commercialize TIGR products.

o Wellcome Trust begins participation in the Human Genome Project.

o Simon et al. develop BACs (Bacterial Artificial Chromosomes) for cloning.

+ Weissenbach - complete human genetic map[31].

* 1993 Wellcome Trust and MRC open Sanger Centre, near Cambridge, UK.

o The GenBank database migrates from Los Alamos (DOE) to NCBI (NIH).

* 1995 Venter, Fraser and Smith publish first sequence of free-living organism, Haemophilus influenzae

(genome size of 1.8 Mb).

o Michael Reeve and Carl Fuller, thermostable polymerase for sequencing[8].

* 1996 International HGP partners agree to release sequence data into public databases within 24 hours.

o International consortium releases genome sequence of yeast S. cerevisiae (genome size of 12.1 Mb).

o Yoshihide Hayashizaki's at RIKEN completes the first set of full-length mouse cDNAs.

o ABI introduces a capillary electrophoresis system, the ABI310 sequence analyzer.

* 1997 Blattner, Plunkett et al. publish the sequence of E. coli (genome size of 5 Mb).

* 1997 First cloned animal, Sheep "Dolly", is born (Wilmut). Roberta A. Campos PhD. March 2012 82

Seq-history

* 1998 Phil Green and Brent Ewing of Washington University publish “phred” for interpreting

sequencer data.

o Venter starts new company “Celera”; “will sequence HG in 3 yrs for $300m.”

o Applied Biosystems introduces the 3700 capillary sequencing machine.

o Wellcome Trust doubles support for the HGP to $330 million for 1/3 of the sequencing.

o Sulston, Waterston et al finish sequence of C. elegans (genome size of 97Mb).

* 1999 NIH moves up completion date for rough draft, to spring 2000.

o NIH launches the mouse genome sequencing project.

o First sequence of human chromosome 22 published.

* 2000 Celera and collaborators sequence fruit fly Drosophila melanogaster (180Mb) -

validation of Venter's shotgun method.

* 2000 HGP consortium publishes sequence of chromosome 21.

* 2000 HGP & Celera jointly announce working drafts of HG sequence, promise joint publication.

* 2000 Estimates for the number of genes in the human genome range from 35,000 to 120,000.

* 2000 International consortium completes first plant sequence,Arabidopsis thaliana

(genome size of 125 Mb).

* 2001 HGP consortium publishes Human Genome Sequence draft in Nature (15 Feb)[38].

* 2001 Celera publishes the Human Genome sequence.

* 2002 HapMap project initiated to decipher human genetic variation

* 2005 420,000 VariantSEQr human resequencing primer sequences published on new NCBI database.

* 2005 Genographic project launched to study human migration

* 2007 Craig Venter publishes his full diploid genome.

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Seq-history

Era do Pós-genomas

Roberta A. Campos PhD. March 2012 84

Derivar conhecimento significativo de sequências de DNA definirá a pesquisa biológica através das próximas décadas, exigindo a interação entre químicos, biólogos, médicos, farmacêuticos, engenheiros, cientistas da computação, sociólogos e etc = Era da pluralidade.

◦ Temos = Número de genes, localização exata e funções de “N” organismos

◦ Rotas de Regulação gênica

◦ Temos = Organização da sequência de DNA

◦ Temos = Estrutura e organização cromossômica

◦ Tipos, quantidade, distribuição e funções do DNA não-codificante (íntrons)

◦ Mapeamento da expressão gênica, síntese de proteínas e eventos pós-tradução

◦ Interação de proteínas em máquinas moleculares complexas

◦ Funções de genes prevista X experimentalmente determinadas

◦ Conservação evolucionaria entre organismos

◦ Proteomas - Transcriptomas - Regulomas ◦ Predição para pré-disposição a doenças baseada nas variações das

sequências dos genes – SNPs. = EUGENIA – DROGAS PERSONALIZADAS.

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Projeto Genomas Vegetais

By Sanger

Morning - The end

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