View
217
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
Universidade Federal de Ouro Preto
Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas
Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia
Danielle Rodrigues de Amorim
IMUNOGENICIDADE DE TRÊS FRAÇÕES ANTIGÊNICAS DE LEISHMANIA
AMAZONENSIS COMO CANDIDATOS VACINAIS AVALIADOS EM
HAMSTER CONTRA LEISHMANIOSE VISCERAL
Ouro Preto, MG
2015
II
Danielle Rodrigues de Amorim
IMUNOGENICIDADE DE TRÊS FRAÇÕES ANTIGÊNICAS DE LEISHMANIA
AMAZONENSIS COMO CANDIDATOS VACINAIS AVALIADOS EM
HAMSTER CONTRA LEISHMANIOSE VISCERAL
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Biotecnologia do
Núcleo de Pesquisas em Ciências
Biológicas da Universidade Federal de
Ouro Preto, como parte integrante dos
requisitos para obtenção do Título de
Mestre em Biotecnologia.
Orientador: Prof. Rodolfo Cordeiro Giunchetti – Laboratório de Biologia das Interações
Celulares (ICB/UFMG) e Laboratório de Imunopatologia (NUPEB/UFOP).
Ouro Preto, MG
2015
III
Amorim, D.R. Colaboradores
IV
Dra. Amanda Brito Wardini1
Dra. Rita de Cássia Oliveira Sant’Ana1
Dra.Walderez Ornelas Dutra
2
Ms. Kelvinson Fernandes Viana1
Ms. Ludmila Zanandreis de Mendonça1
Laíz Aparecida da Conceição Castro1
Luiza Rodrigues Moreira Guerra1
Shaline Braga Ramos1
Tatiane Boleta1
Dr. Ricardo Fujiwara2
Dra. Maria Norma Melo3
Dra. Denise da Silveira Lemos4
Dr. Alexandre Barbosa Reis5
1 – Laboratório de Biologia das Interações Celulares, Departamento de Morfologia,
Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo
Horizonte, Minas Gerais.
2 – Laboratório de Imunologia e Genômica de Parasitos, Departamento de
Parasitologia,Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais,
Belo Horizonte, Minas Gerais.
3 –Laboratório de Biologia de Leishmania, Departamento de Parasitologia, Instituto de
Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, Minas
Gerais.
4 - Laboratório de Biomarcadores de Diagnóstico e Monitoração, Centro de Pesquisas
René Rachou – FioCruz/MG, Fundação Oswaldo Cruz, Belo Horizonte, Minas Gerais.
5 – Laboratório de Imunopatologia, Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas,
Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, Minas Gerais.
Amorim, D.R. Suporte Financeiro
V
Edital/Chamada: Produtividade em Desenvolvimento Tecnológico e Extensão
Inovadora - DT 2011 – processo 310129/2011-7. Projeto: “Desenvolvimento de
Protótipo para Predição de Imunogenicidade e Eficácia em Candidatos a Vacinais
contra Leishmaniose Visceral Canina”.
Edital Universal – MCTI/CNPq 14/2012 – processo 482249/2012-9. Projeto:
“Estabelecimento da plataforma de testes destinada aos ensaios pré-clínicos vacinais
contra leishmanioses”.
Programa Institucional de Auxílio à Pesquisa de Doutores Recém-Contratados da
UFMG. EDITAL PRPq - 01/2013. Projeto: “Análise da imunogenicidade e eficácia de
diferentes candidatos vacinais contra leishmaniose visceral em uma plataforma de testes
in vivo”.
Edital Universal FAPEMIG 01/2013 – processo APQ-02372-13. Projeto:
“Estabelecimento de um Modelo de Testes in vivo para Avaliação da Imunogenicidade
Vacinal com Implantes de Esponjas em Camundongos BALB/c e C57BL/6”.
Programa de Pesquisa para o SUS – PPSUS - processo CDS - APQ-03576-13. Projeto:
“Desenvolvimento tecnológico para o controle da leishmaniose visceral: uma nova
estratégia empregando-se seleção e teste de alvos vacinais com antígenos do hospedeiro
invertebrado e do parasito em uma plataforma de ensaios pré-clínicos e clínicos
vacinais”.
EDITAL 02/2015 - Programa Pesquisador Mineiro - PPM IX – processo CBB - PPM-
00609-15. Projeto: “Estabelecimento de um modelo de testes in vivo para avaliação da
imunogenicidade vacinal com implantes de esponjas em camundongos BALB/C e
C57BL/6”.
Amorim, D.R. Dedicatória
VI
Ao meu pai Raimundo,à minha mãe
Julienicie e ao meu irmão Diego, dedico,
Amorim, D.R. Prefácio
VII
“É muito melhor lançar-se em busca de
conquistas grandiosas, mesmo expondo-
se ao fracasso, do que alinhar-se com os
pobres de espírito, que nem gozam muito
nem sofrem muito, porque vivem numa
penumbra cinzenta, onde não conhecem
nem vitória, nem derrota.” Theodore
Roosevelt
Amorim, D.R. Agradecimentos
VIII
AGRADECIMENTOS
À Deus pela constante presença em minha vida.
Agradeço à minha mãe Julienicie pela dedicação e orações imprescindíveis para
a minha calma na realização deste trabalho, ao meu pai Raimundo pelo apoio e
interesse, e ao meu querido irmão Diego pela amizade e compreensão e a toda minha
família pelo estímulo e confiança.
À Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP) e ao Núcleo de Pesquisas em
Ciências Biológicas, pela oportunidade de realização do curso.
Ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia pela minha formação.
A CAPES e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq), pela concessão da bolsa de estudo e à Fundação de Amparo à
Pesquisa em Minas Gerais (FAPEMIG) pelo auxílio financeiro para o desenvolvimento
do projeto.
A Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG) pela estrutura e suporte ao
curso.
Ao orientador, Professor Dr. Rodolfo Cordeiro Giunchetti, que sempre me
incentivou, pela oportunidade de trabalhar em seu laboratório.
Agradeço de forma especial aos amigos do LABICpor terem confiado em mim,
incentivado a realização deste trabalho e aberto tantos caminhos, mas principalmente
pela grande amizade e boas conversas. Em especial agradeço aos colegas de laboratório
Amanda, Carol, Ludmila, Maurício, Nayara, Rita e Thaís pelo apoio e imensa ajuda na
reta final do trabalho e pela amizade e carinho fora dele. Sem vocês tudo se tornaria
ainda mais difícil.
Aos professoresVanessa, Juliana, Evandro e Alexandre por aceitarem participar
da banca de defesa.
Às alunas de iniciação científica, Luíza, Shaline, Tatiane e Laíz pela dedicação
com que realizaram as tarefas e pela amizade.
Aos meus amigos Gisele, Flávio, Amanda, Cínthia, Gracielle e meus familiares
por tanta paciência e incentivo durante os momentos difíceis pelos quais atravessei.
Aos meus colegas de trabalho do LANAGRO pela compreensão e incentivo.
Amorim, D.R. Agradecimentos
IX
Às minhas amigas da Capadócia, Bianca, Prímula, Nirlane, Bárbara, Isabela e
Amanda, que mesmo com a distância se fizeram presente em minha vida.
Ao Secretário do Programa de Pós-graduação Josino pela colaboração.
A todos que de uma forma ou de outra, contribuíram e incentivaram para a
conclusão deste trabalho.
“Agradecer é admitir que houve um momento que se precisou de alguém; é reconhecer
que o homem jamais poderá lograr para si o dom de ser autossuficiente”.
Amorim, D.R. Sumário
IX
Sumário
Resumo ..................................................................................................... XV
Abstract ................................................................................................... XVI
1. Introdução ................................................................................................ 1
2. Revisão de Literatura ............................................................................. 4
2.1 Aspectos epidemiológicos da leishmaniose visceral ........................................... 5
2.2 Aspectos imunopatológicos e clínicos da leishmaniose visceral canina ........... 6
2.3 Modelos experimentais utilizados no estudo de vacinas anti-leishmaniose
visceral ......................................................................................................................... 7
2.4 Adjuvantes em vacinas anti-leishmaniose visceral .......................................... 10
2.5 Vacinas como estratégias imunoprofiláticas contra a leishmaniose visceral. 13
3. Justificativa ............................................................................................ 17
4. Objetivos ................................................................................................ 19
4.1 Objetivo Geral ..................................................................................................... 20
4.2 Objetivos Específicos .......................................................................................... 20
5. Animais, Material e Métodos ............................................................... 21
5.1 Animais ................................................................................................................ 22
5.2 Delineamento e protocolo experimental ........................................................... 24
5.3 Obtenção do Antígeno Vacinal .......................................................................... 25
5.4 Avaliação da inocuidade dos imunobiológicos ................................................. 26
5.5 Coleta e procedimentos realizados com as amostras de sangue ..................... 26
5.6 Análises sorológicas para reatividade de IgG total anti-Leishmania por
ELISA ........................................................................................................................ 27
5.7 Immunoblotting para identificação de anticorpos IgG .................................... 28
5.8 Análises Estatísticas ............................................................................................ 29
6. Resultados .............................................................................................. 31
6.1 Hemograma – séries vermelha e branca ........................................................... 32
6.2 Avaliação da resposta humoral ......................................................................... 36
6.3 Identificação de proteínas imunogênicas por western blot .............................. 37
7. Discussão ................................................................................................ 38
Conclusão ................................................................................................... 44
Amorim, D.R. Sumário
X
Perspectivas ................................................................................................ 45
8. Referência Bibliográfica ....................................................................... 46
Anexo .......................................................................................................... 65
Amorim, D.R. Lista de diagrama, figuras e tabelas
XI
Lista de Diagrama, Figuras e Tabelas
Diagrama 1. Esquema do desenho experimental para avaliação de hamsters submetidos
a diferentes protocolos vacinais. ................................................................................... 223
Tabela 1. Eritrograma de hamsters submetidos a diferentes protocolos vacinais. ......... 34
Tabela 2. Leucograma de hamsters controle e submetidos a diferentes protocolos
vacinais. .......................................................................................................................... 35
Figura 1: Reatividade de IgG total no soro de hamsters dos antes da 1ª imunização (pré
imune) e após 15 dias da 3ª imunização nos diferentes grupos avaliados ...................... 36
Figura 2: Western blot com soros de hamsters controle (C) e imunizados com as vacinas
LASap, LASapSol
e LASapPart
......................................................................................... 37
Amorim, D.R. Lista de abreviaturas e siglas
XII
Lista de Abreviaturas e Siglas
BSA – Albumina sérica bovina
C – Grupo controle
Sap – Grupo Saponinae.v. via endovenosa
ELISA – Enzyme linked immunosorbent assay
FML – Fucose-manoseligant(Ligante fucose-manose)
i.p. – via intraperitoneal
IFN-γ - Interferon gamma
Ig - Imunoglobulina
IgG - Imunoglobulina da classe G
IgG1- Imunoglobulina da subclasse G1
IL - Interleucina
NOS - Enzima óxido nítrico sintase
LA – Grupo vacinal composto porantígeno bruto de Leishmania amazonensis
LASol
– Grupovacinal composto porantígeno solúvelde Leishmania amazonensis
LAPart
– Grupo vacinal composto por antígeno particuladode Leishmania amazonensis
LASap – Grupo vacinal composto por antígeno bruto de Leishmania
amazonensisassociado a saponina
LASapSol
– Grupovacinal composto porantígeno solúvelde Leishmania amazonensis
associado asaponina
LASapPart
– Grupo vacinal composto por antígeno particuladode Leishmania
amazonensis associado asaponina
LV – Leishmaniose visceral
LVC – Leishmaniose visceral canina
MAPA - Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
Amorim, D.R. Lista de abreviaturas e siglas
XIII
NK – Células Natural Killer
NO - Óxido Nítrico
PBS - Tampão Fosfato Salínico
PBS-P - Tampão Fosfato Salínico com 0,5%
de BSA e 0,5% de saponina
PBS-W - Tampão Fosfato Salínico com 0,5%
de BSA
PCR – Polymerase Chain Reaction
ROS – Espécies reativas de oxigênio (radicais livres)
rpm – rotação por minuto
s.c. – via subcutânea
Sb5+ - N-metil glucaminapentavalente
T0 – Tempo antes da imunização
T1 – Tempo 15 dias após a 3º dose de imunização
T2 – Tempo 30 dias após a infecção
Th1 – T helper 1
Th17 – T helper 17
Th2 – T helper 2
Th9 – T helper 9
TLR2 -Toll-like receptor 2
TNF-α - Fator de Necrose Tumoral-alfa
Treg – Células T regulagoras
WHO – World Health Organization
Amorim, D.R. Resumo
XIV
Resumo
A Leishmaniose é um conjunto de síndromes complexas e multifacetadas causadas por
espécies de protozoários do gênero Leishmania, sendo transmitida através da picada de
flebotomíneos infectados. Endêmica em 88 países do mundo estima-se que cerca de 350
milhões de pessoas estão em risco de contrair a doença, e aproximadamente 12 a 14
milhões estão infectadas. Cerca de 500 mil pessoas desenvolvem a forma visceral da
doença, sendo que 90% dos casos ocorrem na Índia, Bangladesh, Nepal, Sudão, e no
Brasil. Diversos pesquisadores no mundo tem buscado respostas para a prevenção da
leishmaniose visceral canina (LVC), através da caracterização de antígenos de espécies
de Leishmania, já que o cão é considerado o reservatório doméstico do parasito e um
importante elo na cadeia epidemiológica de transmissão da doença. Ainda não existe
uma vacina que apresente eficácia vacinal compatível para o controle da LVC e que seja
recomendada pelo Ministério da Saúde de nosso país como medida profilática da
doença. Considerando o hamster amplamente utilizado como modelo experimental em
ensaios vacinais com diversos protocolos anti-Leishmania, estabelecemos uma
plataforma para testes rápidos in vivo buscando avaliar simultaneamente diferentes
candidatos vacinais. Neste sentido, o presente projeto propôs a avaliação de um ensaio
pré-clínico vacinal, em hamsters Mesocricetusauratus, considerando aspectos
relacionados à inocuidade, toxicidade e imunogenicidade dos candidatos contra
leishmaniose visceral, entre os quais: (i) grupo inoculado com salina 0,85% estéril, (ii)
grupo inoculado com adjuvante saponina, (iii) grupo inoculado com antígeno bruto de
Leishmania amazonensis(LA), (iv)grupo inoculado comantígeno solúvel de L.
amazonensis(LASol
), (v) grupo inoculado com antígeno particulado de L. amazonensis
(LAPart
), (vi) grupo inoculado com antígeno bruto de L. amazonensis associado a
saponina (LASap), (vii) grupo inoculado com antígeno solúvel de L. amazonensis
associado a saponina (LASapSol
)e (viii)grupo inoculado comantígeno particulado de L.
amazonensis associado a saponina (LASapPart
). Os resultados mostraram que nenhuma
das formulações vacinais induziu alterações no local do inóculo ou alterações sistêmicas
avaliadas pela inspeção clínica e pelo hemograma. Deste modo, ficou constatado que as
diferentes formulações vacinais não induziram hemólise ou anemia nos diferentes
grupos avaliados. A análise do leucograma revelou linfocitose restrita apenas aos
grupos que receberam antígenos vacinais associados ou não ao adjuvante saponina. De
forma semelhante, a análise de antigenicidade revelou aumento dos níveis de IgG total
anti-Leishmania, acima do cut-off, nos mesmos grupos que apresentaram linfocitose. A
análise do immunoblotting, realizada nas formulações em que foi associado antígeno ao
adjuvante saponina (LASap, LASapSol,
LASapPart
), demonstrou a presença de três
bandas imunogênicas com peso molecular próximas de 40 kDa, 30 kDa e bandas entre
20 e 30 kDa. As proteínas encontradas nesse trabalho abrem perspectivas para a análise
de novas formulações vacinais contra a leishmaniose visceral.
Amorim, D.R. Abstract
XV
Abstract
Leishmaniasis is a set of complex and multifaceted syndromes caused by species of
protozoa of the genus Leishmania and is transmitted through the bite of infected
sandfly. Endemic in 88 countries of the world it is estimated that about 350 million
people are at risk of contracting the disease, and about from 12 to 14 million are
infected. About 500,000 people develop the visceral form of the disease, with 90% of
cases occur in India, Bangladesh, Nepal, Sudan and Brazil. Several researchers in the
world have sought answers for the prevention of canine visceral leishmaniasis (CVL),
through the characterization of Leishmania species antigens, as the dog is considered
the domestic reservoir of the parasite and an important link in the epidemiological chain
of transmission. Although there is no vaccine to present vaccine efficacy compatible for
control of LVC and is recommended by the Ministry of Health of our country as a
prophylactic measure of the disease. Considering the hamster widely used as an
experimental model in vaccine testing with several anti-Leishmania protocols, we have
established a platform for rapid in vivo testing to simultaneously evaluate different
vaccine candidates. In this sense, this project proposed the evaluation of a vaccine pre-
clinical trial, in hamsters Golden Hamster, considering aspects related to safety, toxicity
and immunogenicity of the candidates against visceral leishmaniasis, including: (i) the
group inoculated with saline sterile 0,85%, (ii) the group inoculated with saponin
adjuvant, (iii) the group inoculated with crude antigen of Leishmania amazonensis
(LA), (iv) the group inoculated with soluble antigen of L. amazonensis (LASol
), (v) the
group inoculated with particulate antigen L. amazonensis (LaPart
), (vi) the group
inoculated with crude antigen of L. amazonensis associated with saponin (LASap), (vii)
the group inoculated with soluble antigen associated with L. amazonensis saponin
(LASapSol
) and (viii) group inoculated with particulate antigen L. amazonensis
associated with saponin (LASapPart
). The results showed that none of the vaccine
formulations induced changes in the inoculum local or systemic abnormalities assessed
by clinical inspection and the CBC. Thus it was found that different vaccine
formulations did not induce hemolysis or anemia in the different study groups. Analysis
of the white blood cell count revealed lymphocytosis restricted to the groups that
received vaccine antigens associated or not with saponin adjuvant. Similarly,
antigenicity analysis revealed increased levels of total IgG anti-Leishmania, above the
cut-off, the same groups showed lymphocytosis. The analysis of immunoblotting
performed in formulations wherein the antigen is associated to the saponin adjuvant
(LASap, LASapSol
, LASapPart
) showed the presence of three bands with molecular
weight immunogenic next 40kDa, 30kDa and bands between 20 and 30 kDa. The
proteins found in this work open up prospects for the analysis of new vaccine
formulations against visceral leishmaniasis.
Amorim, D.R. Introdução
1
1. Introdução
Amorim, D.R Introdução
2
A leishmaniose é uma protozoose tropical negligenciada que está entre as seis
endemias de maior relevância mundial e é causada por espécies de protozoários
unicelulares pertencentes ao gênero Leishmania (Kinetoplastida, Trypanosomatidae),
apresentando ciclo heteroxeno. Pode ser classificada de várias formas conforme um
conjunto de características clínicas, destacando-se as formas tegumentar ou cutânea e
visceral (Ready, 2014).
A Organização Mundial da Saúde (OMS) publicou em 2012 os resultados de
um levantamento global sobre a situação da leishmaniose no mundo (Alvar et al.,
2012), indicando que a endemia está presente em 98 países, com mais de 350 milhões
de pessoas sob risco de infecção (Desjeux, 2004). No período de 2001 a 2011 foram
registrados mais de 358 mil casos de leishmaniose cutânea nas Américas, representando
o Brasil 42,36% desse valor. A forma visceral acomete mais de 38 mil pessoas, e o
Brasil corresponde a 96,6% desse total (PAHO, 2013).
A OMS divide as leishmanioses em quatro formas clínicas distintas: cutânea,
mucocutânea, cutâneo-difusa e a visceral (Croft et al., 2001). Em relação à leishmaniose
visceral (LV), Lainson e Shaw (1987) agruparam as trêsespécies causadoras no
subgênero Leishmania, sendo estas pertencentes ao complexo Donovani. Entre as
espécies causadoras presentes neste complexo estão: Leishmania (L.) donovani
(Laveran e Mesnil, 1903), Leishmania (L.) infantum (Nicolle, 1908) presentes no Velho
Mundo e Leishmania (L.) chagasi (Cunha e Chagas, 1937) no Novo Mundo.
Atualmente, mesmo apresentando nomes e localizações geográficas distintas, as
espécies Leishmania (L.) chagasi e Leishmania (L.) infantum são consideradas a mesma
espécie em função de estudos em biologia molecular (Maurício et al., 2000).
A LV é uma doença endêmica em 65 países e apresenta incidência anual de
aproximadamente 500.000 novos casos. Destes casos, 90% apresentam-se concentrados
em países como Bangladesh, Brasil, Índia e Nepal. O Brasil concentra
aproximadamente 90% das ocorrências no continente americano com incidência em 21
estados, sendo a região nordeste responsável por 70% dos casos (Desjeux, 2004; Harhay
et al., 2011). Em 2011 foi relatada a incidência de 3.894 casos de LV no Brasil, sendo
que 262 indivíduos evoluíram ao óbito (SINAN/SVS/MS, 2011).
Amorim, D.R Introdução
3
Na LV em hospedeiros vertebrados como o cão e o homem, ocorre a
disseminação do parasito pelo organismo e o acometimento de alguns órgãos, causando
hepatoesplenomegalia, febre, fadiga e perda de peso. A LV representa a forma mais
grave da doença, sendo fatal se não for tratada adequadamente (Chappuis et al., 2007).
O Ministério da Saúde sugere ações a fim de controlar o avanço da doença,
dentre as quais estão o diagnóstico precoce da LV, o tratamento de humanos infectados,
a redução da população de flebotomíneos pela pulverização de inseticidas com efeito
residual em regiões endêmicas e a eliminação de reservatórios domésticos através da
eutanásia de cães infectados (Ministério da Saúde, 2006).
Nos últimos anos, um número crescente de antígenos de Leishmania tem sido
caracterizado, com o objetivo de constituírem novos candidatos para o diagnóstico e
vacina contra a LV. No campo das aplicações de metodologias destinadas a triagem
racional de candidatos vacinais destaca-se a proteômica, que permite a identificação de
proteínas imunogênicas anti-Leishmania com precisão (Kumari et al., 2008). Neste
contexto, a proteômica é um campo de pesquisa emergente facilitado por numerosos
avanços nos últimos anos em separação de proteínas, espectrometria de massas,
sequenciamento e anotação de genomas e algoritmos de busca de proteínas (Aebersold e
Goodlett, 2001).
Considerando as medidas de controle da LV preconizadas pelo Ministério da
Saúde para conter o avanço da doença, uma vacina anti-leishmaniose visceral que seja
efetiva e possa contribuir em programas de controle é considerada a melhor estratégia a
ser utilizada. Esta estratégia seria capaz de bloquear o ciclo do parasito, resultando no
controle da LV. Neste sentido, diversos pesquisadores vêm buscando respostas para a
prevenção da LVC. No entanto, apesar de existir uma vacina comercialmente disponível
contra a LVC no Brasil (Leish-tech®), até o momento o Ministério da Saúde ainda não
recomenda este produto como medida de controle da doença canina. Este fatoilustra a
importância do estabelecimento de plataformas destinadas a novostestes vacinais pré-
clínicos e clínicos contra a LV, buscando identificar formulações imunogênicas e
efetivas contra esta doença (Gradoni, 2001; MS, 2006; Costa et al., 2011).
Diante do exposto, o presente estudo buscou avaliar a imunogenicidade de três
frações antigênicas de Leishmania amazonensis como candidatos vacinais em hamster
dourado contra leishmaniose visceral.
Amorim, D.R Revisão de Literatura
4
2. Revisão de Literatura
Amorim, D.R Revisão de Literatura
5
2.1 Aspectos epidemiológicos da leishmaniose visceral
A Organização Mundial da Saúde reconhece a leishmaniose visceral (LV)
como um importante problema de saúde pública, sendo considerada uma importante
doença negligenciada. A doença apresenta ampla distribuição, ocorrendo na Ásia, na
Europa, no Oriente Médio, na África e nas Américas, onde também é denominada
leishmaniose visceral americana (LVA) ou calazarneo-tropical (WHO, 2012). Na
América Latina, a LV foi descrita em pelo menos 12 países, sendo que cerca de 90%
dos casos ocorrem no Brasil, especialmente na Região Nordeste (MS, 2006).
As áreas endêmicas para LV tem aumentado nos últimos 10 anos, e, apesar da
subnotificação de casos, cerca de 500.000 novos casos de LV humana ocorrem
anualmente no mundo (WHO, 2012). O principal agente etiológico desta zoonose nas
Américas é a Leishmania chagasi (Sherlock, 1996), apresentando como principal
espécie de vetor o flebotomíneo Lutzomyia (Lutzomyia) longipalpis (Lutz e Neiva,
1912).
No ano de 2011 foram confirmados 3.894 casos de LV humana no Brasil (MS,
2012), sendo o cão considerado o principal reservatório da infecção em áreas urbanas
(Maia-Elkhouryet al., 2008). Nesse sentido, as tentativas governamentais de controle da
LV, baseadas principalmente na eutanásia de cães soropositivos, é uma prática onerosa,
que encontra resistência ética e emocional, e não tem impedido o aumento do número
de casos humanos no país (Courtenayet al., 2002; Maia-Elkhoury, 2008). Segundo
alguns autores, o êxito da vacinação de cães pode reduzir significativamente a
incidência de casos caninos e humanos, sendo a estratégia de controle com melhor
relação custo-benefício a ser adotada (Dye, 1996; Alvaret al., 2004). Diante deste fato,
há necessidade do desenvolvimento de vacinas como uma importante ferramenta e uma
estratégia de custo-benefício interessante para o controle da leishmaniose visceral
canina, uma vez que é um objetivo viável e com impacto direto na leishmaniose humana
(Reis et al, 2009).
Amorim, D.R Revisão de Literatura
6
2.2 Aspectos imunopatológicos e clínicos da leishmaniose visceral canina
A maioria dos cães infectados por L. chagasi, apesar de não apresentarem sinais
clínicos, são soropositivos, reforçando quea sorologia para o diagnóstico da LV e canina
como uma importante ferramenta diagnóstica (Mancianti et al.,1986; Cabral et al.,
1998; Sideris et al., 1999; Moreno e Alvar, 2002; Moshfe et al., 2009, Mohammadiha,
2013). Torna-se difícil predizer sobre a real incidência da LVC, devido a diferenças de
sensibilidade dos métodos diagnósticos e a ausência de trabalhos epidemiológicos em
algumas regiões (López-Céspedeset al., 2012). Entretanto, estima-se que milhões de
cães estejam infectados na América Latina (Wernecket al., 2007), e em algumas regiões
a prevalência da doençacanina poderia alcançar índices de até 75% (Cortada et al.,
2004).
Dentre os sinais clínicos da LVC, é importante destacar que todos são
inespecíficos como febre, anemia, perda de peso, astenia, desidratação, além de outros
comoum quadro viscero-cutâneo com evolução crônica, hepato e esplenomegalia,
(Gramiccia, 2011). Destaca-se ainda que comumente há o aparecimento de lesões
cutâneas, linfadenopatia, ceratoconjuntivite, epistaxe e onicogrifose (Ciaramella, et al.
1997; Giunchetti et al., 2006).
Cães infectados com LV podem desenvolver muitos sinais clínicos resultando na
morte, ou permanecerem assintomáticos ou oligossintomáticos (Ciaramella et al., 1997).
O resultado histopatológico característico presente nos principais órgãos acometidos na
LVC é uma reação inflamatória granulomatosa repleta de macrófagos com amastigotas
de Leishmania em seu interior (Baneth et al., 2008). Deste modo, a doença canina
poderia ser representada do ponto de vista clínico e imunopatológico por uma forma
assintomática, com a presença de resposta de linfócitos Leishmania-específicos que
induzem a secreção de citocinas favorecendo um balanço mais proinflamatório,
resultando na manutenção de baixos níveis de parasitismo (Reis et al.,2009; Menezes-
Souza, et al., 2012). Por outro lado, cães sintomáticos representariam o polo da infecção
associado à evolução com pior prognóstico, visto que apresentam resposta imune com
marcada produção de IL-10 e TGF- que favorecem a manutenção de elevados níveis
Amorim, D.R Revisão de Literatura
7
de parasitismo em diversos órgãos (Giunchetti et al., 2006, Giunchetti et al., 2008a,b,
Reis et al.,2009; Menezes-Souza,et al. 2012).
O organismo de um cão infectado engaja uma variedade de interações, diversas
e complexas, entre componentes da resposta imune inata e adaptativa. Na pele, iniciam-
se as respostas imunes mistas (Menezes-Souza et al., 2011) e ocorrem infiltrados
inflamatórios com alto parasitismo, que geralmente está associado ao acometimento
clínico (Giunchetti et al, 2006). A ativação de macrófagos por interferon-gama (IFN-γ)
e fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α), e baixos níveis de IL-10consistem nos
principais biomarcadores relacionados a reposta imune protetora contra LVC (Reis et
al., 2009). Este perfil imunológico induz a produção de óxido nítrico pela via da L-
arginina, o qual tem ação leishmanicida sobre as formas amastigotas do parasito, como
foi observado em cães infectados com L. chagasi (Vouldoukis et al., 1996).
Em baços de cães sintomáticos infectados por L. chagasi ocorre formação de
infiltrado celular mononuclear na polpa vermelha e substituição de linfócitos por
macrófagos na polpa branca (Alexandre-Pires et al., 2006), além de acúmulo de IL-10
em animais com alto parasitismo (Lage et al, 2007). No fígado também ocorrem alto
parasitismo e intensas alterações inflamatórias (Giunchetti et al., 2006, Giunchetti et al.,
2008a,b, Reis et al.,2009; Menezes-Souza,et al. 2012).
Quanto aos leucócitos circulantes, cães sintomáticos e com altos níveis de
parasitismo apresentaram baixos níveis de células T CD4+ e CD8
+, com drástica
redução de células B CD21+e monócitos CD14
+, associado à alta densidade parasitária
na medula óssea (Reis et al., 2006).
Ainda na LVC, animais assintomáticos apresentam baixo parasitismo em
diversos tecidos e, de um modo em geral, mantém a habilidade linfoproliferativa frente
a estímulos com antígenos de Leishmania (Reis et al., 2009).
2.3 Modelos experimentais utilizados no estudo de vacinas anti-leishmaniose
visceral
A escolha de um bom modelo experimental deve levar em conta características
do animal e o perfil de resposta imune. A utilização do hamster como modelo
experimental em estudos de leishmaniose, tem sido proposta para melhor compreensão
da evolução do curso da infecção, bem como em ensaios pré-clínicos vacinais (Garg e
Amorim, D.R Revisão de Literatura
8
Dube, 2006; Gomes et al, 2008;Osorio et al, 2012; Moreira et al, 2012; Gomes-Silva et
al, 2013). Neste sentido, a importância do hamster como modelo experimental para o
estudo da LV está baseada no fato desta espécie animal mimetizar a doença ativa e a
progressão da infecção como ocorre em humanos e em cães (Garg e Dube, 2006;
Moreira NdD et al., 2012;Soong et al., 2012; Hamide et al., 2013; Gannavaram et al.,
2014; Loría-Cervera e Andrade-Narváez, 2014).
A forma como os animais são infectados, que pode ser natural (resposta com
flebotomíneo infectado) ou experimental (inóculo por via parenteral), bem como a via
de inóculo na infecção experimental (intradérmica, intraperitoneal, intracardíaca,
subcutânea), leva a diferenças relevantes tanto no início da infecção, quanto na
progressão e nas respostas a vacinas (Garg e Dube, 2006; Aslan et al., 2013). Na
infecção natural, os parasitos são repassados ao hospedeiro juntamente com proteínas
imunomoduladoras da saliva e gel secretado por promastigotas, processo que incita um
rápido influxo de células até o sítio da picada do flebotomíneo (Rogers et al., 2004;
Aslan et al., 2013). No caso da infecção natural pelo vetor Lutzomyia longipalpis, são
depositados no hospedeirocerca de 4x104 parasitos, ao passo que em infecções
experimentais a dose empregada geralmente é maior (por volta de 1x107
parasitos)
(Garg e Dube, 2006; Kushawaha et al., 2011; Aslan et al., 2013 ). Há diferenças na
resposta imunequanto a forma de infecção entre modelos utilizados, e entre os roedores,
o hamster reproduz o curso da infecçãona LV mais fielmente ao que ocorre com os
humanos (Aslan et al., 2013).
O elevado custo de manutenção para experimentação com cães torna este
modelo de estudo restrito, justificando o grande uso de camundongos e hamsters em
análises imunopatológicas e ensaios pré-clínicos vacinais anti-Leishmania.
A evolução da LVocorre de forma diferenciada nos diferentes modelos
experimentais.Diferentes processos imunológicos críticos estão envolvidos na resolução
da infecção hepática em camundongos tais como a geração de uma resposta do tipo 1, a
formação de um granuloma efetivo e a ativação clássica de macrófagos (Stanley, 2007).
A necessidade de células do tipo 1 produtoras de IFN-γ é demonstrada quando se
observa prejuízo no controle da infecção em camundongos deficientes em fatores de
transcrição envolvidos na sinalização para a geração de respostas efetoras do tipo 1
(Beattie et al., 2011; Paunet al., 2011). As células de Küpffer, fagócitos primários no
Amorim, D.R Revisão de Literatura
9
granuloma hepático, iniciam a resposta efetora pela apresentação de antígenos às células
T, favorecendo o controle do parasito (McFarlaneet al., 2008). A ativação dos
macrófagos por IFN-γ e TNF-α ou outros produtos proinflamatórios, além de
mecanismos efetores ainda não identificados, levam à formação de espécies reativas de
oxigênio (ROS) e NO, os quais contribuem no controle da replicação do parasito
(Murray, 1999).
O baço e o fígado de camundongos infectados com L. donovani expressaram
altos níveis de citocinas relacionadas à resposta do tipo 1, como IFN-γ, IL-2, IL-12 e
TNF-α (Melby et al, 2001; Perez et al, 2006). Juntamente a essas respostas, houve
também aumento da expressão pelo baço de citocinas do tipo 2, tais como IL-4, IL-13,
IL-10, IL-21, e TGF-β (Melby et al, 2001; Osorio et al, 2012).
Gomes-Silva et al.(2013) mostraram através de um estudo com hamsters
infectados com L. braziliensis, o qual realizou análises imunológicas, histológicas e
clínicas, que esse modelo apresenta reações durante o curso da infecção semelhantes às
que ocorrem em humanos, sendo altamente susceptível à infecção por espécies de
Leishmania e por isso tem sido amplamente utilizado como um modelo experimental.
Neste sentido, o modelo hamster Sírio dourado (Mesocricetus auratus) possibilita a
investigação de mecanismos imunopatológicos na infecção por Leishmania,
apresentando carga parasitária marcadamente maior que em camundongos (Osorio et al,
2012). Banerjee et al. (2011) constataramque após 45 dias de infecção com L. donovani,
os hamsters sofrem linfadenopatia aparentemente irreversível mesmo após estímulo
com mitógeno (concavalina A), quando comparado à linfoproliferação normal de
linfonodos de hamsters não infectados. No fígado de hamsters, ocorre alto parasitismo
das células de Küpffer que são rodeadas por um infiltrado inflamatório, mas ao
contrário de camundongos, não há formação de granuloma completamente organizado
(Nieto et al, 2011), favorecendo a progressão da infecção no modelo hamster.Durante a
fase aguda da LV no hamster ocorre um processo de supressão linfoproliferativa, o que
pode explicar em parte a deficiência de controle da doença (Goto e Prianti, 2009). A
falta de habilidade de células apresentadoras de antígenos (APC’s) infectadas em
estimular linfócitos T, juntamente com a morte apoptótica de linfócitos desencadeada
por TGF-β, podem ser acontecimentos chaves para a disfunção tardia na LV em
Amorim, D.R Revisão de Literatura
10
hamsters (Rodrigues Júnior et al., 1992; Banerjee et al., 2010; Mookerjee et al., 2003).
Além disto, o desfecho fatal da infecção na LV em hamsters poderia estar associado
também a perda de funções efetoras dos macrófagos (Melby et al., 2011), a falta da
produção de NO em consequência de defeito na ativação transcricional de NOS2 (Perez
et al., 2006), além da dificuldade das APC’s de processarem e apresentarem antígenos
do parasito às células T (Rodrigues Júnior et al., 1992).
Chang e Dwyer (1978) evidenciaram a ocorrência da fusão fagossomo-
lisossomo indicando quantitativamente uma eficiente interaçãode amastigotas de L.
donovani em macrófagos de hamster (Chang e Dwyer, 1978). A escassez de reagentes
disponíveis, como anticorpos, marcadores celulares e de citocinas, é um fator limitante
no estudo da resposta imune em hamsters (Wilson et al., 2005; Gupta e Nishi, 2011;
Melby et al., 2011), embora do ponto de vista parasitológico seja um excelente modelo
de estudo.
Diante o exposto, fica evidente que o modelo hamster por apresentar um curso
de infecção da LV que se aproxima a doença canina e humana, além de apresentear
baixo custo de manutenção em relação ao cão, consiste em um modelo experimental
muito atrativo para ensaios pré-clínicos vacinais (Garg e Dube, 2006).
2.4 Adjuvantes em vacinas anti-leishmaniose visceral
O adjuvante (do latim= adjuvare, ajudar) é capaz de aumentar a imunogenicidade
de antígenos purificados ou recombinantes em relação à aplicação desses isoladamente,
através do estímulo da captação de antígenos por células apresentadoras de antígenos
(APC) os quais induzem a resposta imune (O’Hagan e Valiante, 2003; Aguilar e
Rodriguez, 2007). O uso de adjuvantes aumenta a velocidade e duração da resposta
imune, melhora a eficácia vacinal em pessoas imunocomprometidas, induz a imunidade
de mucosa, reduz o custo de produção da vacina (McElrath, 1995; Douce et al, 1995;
Dey e Srivastava, 2011) e determina a produção, duração, título e a subclasse de
imunoglobulina produzida pela resposta imune (Rajput et al., 2007).
Compostos como os sais de alumínio são adjuvantes utilizados seguramente em
vacinas humanas contra doenças como as hepatites A e B, papilomavírus humano
Amorim, D.R Revisão de Literatura
11
(HPV) dentre várias outras (Hem e Hogen, 2007). Esses sais ativam a proteína 3
receptora tipo domínio ligante de nucleotídeo (NLRP3) através de dois modelos: no
primeira, células fagocíticas englobam partículas de sal e no segundo sugere-se que a
toxicidade do sal de alumínio recruta células potencializando a resposta imune. O sal
aumenta a liberação de ácido úrico que ativa o inflamassomo NLRP3, o qual pode
direcionar respostas para Th1, Th2 ou Threg (Hornung et al., 2008).
As chamadas emulsões óleo-em-água são adjuvantes que têm sido utilizados com
sucesso em vacinas licenciadas (García e Sanctis, 2013). A emulsão MF59® está
presente na vacina da influenza sazonal sendo hábil em estimular primariamente uma
resposta humoral através da via Th2, em aumentar o título de anticorpos neutralizantes,
além de estimular respostas de células T CD8+ (Podda e Del Giudice, 2003). Outro
exemplo de emulsão usada como adjuvante é o sistema adjuvante 03 (AS03), também
empregado em vacinas da influenza, o qual combina três compostos adjuvantes que
induzem a secreção de citocinas, aumentam a carga de antígeno nos macrófagos e
recrutam granulócitos nos linfonodos, parecendo aumentar, dessa forma, as respostas
imuno adaptativas específicas ao antígeno (Morel et al., 2011; Garçon et al., 2012).
Outros adjuvantes que vêm sendo testados em modelos animais e triagens clínicas
humanas são baseados em receptores tipo Toll (TLR), os quais desempenham papel
importante no sistema imune inato e estão presentes em células como macrófagos,
célulasdendríticas (DC’s), neutrófilos,células do epitélio da mucosa e células endoteliais
(Takeda et al., 2003). Esses receptores atuam no reconhecimento de padrões
moleculares associados a patógenos (PAMP’s) que estão presentes em componentes de
muitos fungos, vírus, bactérias e protozoários (Takeda et al., 2003). O TLR9 é capaz de
reconhecer dinucleotídeos CpG (Thomas et al., 2009; Jurk e Vollmer, 2007) não
metilados, os quais sabe-se que tem efeitos imunoestimulatórios (Messina et al, 2001).
Vacinas contra influenza (Moldoveanu et al., 1995), vírus do sarampo (Koravik et al.,
1999), vírus da hepatite B e toxoide de tétano (Mc Cluskie e Davis, 1998; Brazolot
Millan et al, 1998; Eastcott et al., 2001) apresentam títulos aumentados de anticorpos
específicos de antígenos quando da inclusão de CpG em suas formulações, o que parece
potencializar ou modular respostas imunes já existentes (Pali-Schöll et al., 2013).
Algumas citocinas têm sido avaliadas como bons adjuvantes graças à habilidade em
modificar e redirecionar a resposta imune, tais como IL-1, IFN-γ, IL-12 e GM-CSF
Amorim, D.R Revisão de Literatura
12
(Heath, 1995; Tovey e Lallemand, 2010). Uma citocina que recebe destaque nos estudos
é a IL-15, a qual é reconhecida com efeitos imunomodulatórios em células de ambos os
sistemas imunes inato e adaptativo (Perera et al., 2012). A IL-15 ativa células NK,
NKT, CD8+ e linfócitos T de memória, aumentando a resposta imune e tornando-a
assim, uma alternativa para ser utilizada em vacinas (Perera et al., 2012).
Dentre os adjuvantes, a saponina se constitui de moléculas de glicoalcaloides
esteroidais ou triterpenoides (Santos et al., 1997) que é um adjuvante amplamente
utilizado em estudos com modelos experimentais e animais de produção como: cães,
roedores, primatas não-humanos e bovinos (Santos et al., 1997). A saponina possui
propriedades biológicas importantes como apresentar a capacidade em induzir resposta
imune humoral e celular (Powell et al., 1994; Coughlin et al., 1995; Jackson e
Opdebeeck, 1995; Yen et al., 1995; Santos et al., 1997) e as saponinas de Quillaja
saponaria são utilizadas em formulações vacinais contra várias doenças (Khan et al.,
1991; Bomford et al., 1992; Britt et al., 1995; Santos et al., 1997). A saponina pode ser
fracionada em 4 partes chamadas de QS-7, QS-17, QS-18 e QS-21, as quais são
potentes adjuvantes, sendo QS-18 a mais abundante (Kensil et al, 1991). Apesar disso,
QS-18 é a que possui maior toxicidade, e por isso, a QS-21, menos tóxica e mais
abundante que as outras, vêm sendo amplamente utilizada como adjuvante (Kensil et al,
1991).
O uso da saponina como adjuvante de vacina contra a LV mostrou-se seguro e com
ausência de toxicidade em experimentos realizados em camundongos e hamsters
(Santos et al., 1997, Palatnik et al., 1994; Palatnik et al, 1994). A capacidade de atuar
como adjuvante está diretamente associada ao seu efeito hemolítico, que é indesejável,
tornando inviável para utilização na vacinação humana (Santos et al., 1997; Bomford,
1980). Porém, a fração QS-21 tem sido amplamente estudada e vem sendo utilizada
como estratégia imunoterapêutica em pacientes com câncer após resecção de metástases
sistêmicas ou locais (Ragupathi et al., 2011), para vários tipos de cânceres como de
mama (Gilewski et al, 2000; Gilewski et al, 2001; Gilewski et al., 2007), próstata
(Slovin et al, 2003, Slovin et al, 2005; Slovin et al, 2007), ovário (Sabbatini et al.,
2007) e pulmões (Dickler et al., 1999; Krug et al., 2004a; Krug et al., 2004b). As
triagens de fase I realizadas mostram potentes respostas de anticorpos contra antígenos
de peptídeo e carboidrato em vacinas associadas com conjugado de KLH, e os efeitos
Amorim, D.R Revisão de Literatura
13
colaterais se restringem à eritema local e induração na maioria dos pacientes, assim
como ocasionais sintomas gripais (Ragupathi et al., 2011).
Além do câncer, tem sido realizadas triagens para outras doenças como HIV (Evans
et al., 2001), malária (Kashala et al.; 2002) e hepatite B (Vandepapeliere et al.; 2008).
Além disso, ensaios de fase II têm sido realizados em pacientes com a Doença de
Alzheimer que recebem vacinas contendo QS-21(Ragupathi et al., 2011). Apesar de
alguns inconvenientes do uso desse adjuvante, a saber: a toxicidade local e sistêmica
dependendo da dose empregada (Ragupathi et al., 2011), da instabilidade química da
QS-21(Cleland et al.; 1996) e da disponibilidade limitada de fontes naturais (Martin e
Briones, 2000), os resultados obtidos do uso desse adjuvante estimulam seu uso a fim
de aumentar a potência de vacinas contra doenças infecciosas como a leishmaniose
(Ragupathi et al., 2011).
2.5 Vacinas como estratégias imunoprofiláticas contra a leishmaniose visceral
Uma das tentativas atuais de controlar o avanço da LV é a eutanásia de cães
soropositvos. Porém, diante da relação homem-cão, esta medida encontra dificuldade
em ser implementada na prática para a contenção da doença (Courtenay et al., 2002;
Maia-Elkhoury et al., 2008). Considerando que o cão é o principal reservatório
doméstico do parasito, a vacinação destes animais apresentaria um grande potencial
para atuar no controle da LV humana e canina (Dye, 1996; Alvar et al., 2004 ).
As vacinas são classificadas de acordo com suas composições, podendo ser
denominadas vacinas de primeira, de segunda ou de terceira geração (Noazin et al.,
2008). As vacinas de primeira geração são aquelas compostas por parasitos vivos
atenuados, também chamadas de “vacinas-mortas” (Palatnik de Souza, 2008); as
vacinas recombinantes de segunda geração são constituídas por antígenos purificados de
parasitos ou por bactérias vivas recombinantes as quais possuem genes que expressam
antígenos de Leishmania, enquanto as vacinas com plasmídeos de DNA codificadores
de antígenos representam aquelas de terceira geração (Noazin et al., 2008).
O Brasil é pioneiro na disponibilização de vacinas comerciais para imunização
de cães contra leishmaniose visceral. A vacina Leishmune®
(Zoetis, Brasil), composta
por uma glicoproteína ligante de fucose-manose (FML) de Leishmania donovani
Amorim, D.R Revisão de Literatura
14
associada ao adjuvante saponina, foi licenciada pelo Ministério da Agricultura, Pecuária
e Abastecimento (MAPA) em 2003 (da Silva et al., 2001; Borja-Cabrera et al., 2002;
Parra et al., 2007). Esta vacina estava disponível para comercialização em áreas onde a
LVC é endêmica até o início de setembro de 2014, quando sua licença para
comercialização foi suspensa.
A vacina Leish-Tech®
(HertapeCalier, Juatuba, MG) é composta de antígeno A2,
uma proteína recombinante específica do estágio amastigota de diferentes espécies de
Leishmania também associada ao adjuvante saponina, foi licenciada em 2007 pelo
MAPA (Coelho et al., 2003; Zanin et al., 2007; Fernandes et al., 2008). A vacina Leish-
Tech®,atualmente, tem recebido investimentos de grupos de empresas farmacêuticas
britânicas e o fabricante da vacina no Brasil estuda a possibilidade de registrá-la no
continente europeu. Dessa maneira, a vacina poderá atender a países da região do
Mediterrâneo (Portal Brasil, 2014).
Em 2011 foi autorizada a comercialização da vacina CaniLeish® no mercado
europeu (Leishma News, 2011). Composta por proteínas secretadas e excretadas (ESP)
de L. infantum associadas ao extrato de Quillaja saponaria (QS-21) como adjuvante,
essa vacina apresentou resposta protetora e gerou redução efetiva de carga parasitária
em macrófagos infectados (Moreno et al., 2012). Em estudo recente, confirmou-se o
efeito imune eficiente prolongado gerado pela CaniLeish®
um ano após a imunização
desta vacina (Martin et al., 2014).
Apesar de atualmente o Brasil dispor de uma vacina comercial para a LVC,
ainda permanecem importantes questionamentos relacionados à: distinção pelos
sorotestes entre a infecção natural pelo parasito e a resposta imune vacinal, avaliação da
redução da doença e da incidência de infecção em cães indicando sua ação no bloqueio
do ciclo da LV (Saraiva et al., 2006). Até o momento o Ministério da Saúde do Brasil
ainda não indica nenhuma vacina para ser utilizada nos programas de controle nacionais
(Ministério da Saúde, 2006).
Em um estudo realizado em 2012 utilizando promastigotas de L. infantum
atenuadas sob pressão de 10% de gentamicina, Daneshvar et al. avaliaram o perfil
imunofenotípico de células mononucleares de cães infectados tanto com as
promastigotas atenuadas quanto parasitos selvagens. Neste estudo foi observadoindução
de células T CD4+ e CD8
+ nos cães vacinados com promastigotas atenuadas, sem
Amorim, D.R Revisão de Literatura
15
apresentarem sinais clínicos da LVC, ou alteraçõesbioquímicase hematológicas,
sugerindo que a linhagem atenuada foi capaz de proteger cães contra a cepa selvagem
de L. infantum (Daneshvar et al., 2012). Em outro estudo anterior desse grupo, já
haviam sido encontrados maiores níveis de IFN-γ nos grupos vacinados com antígenos
atenuados com gentamicina em relação aos animais controle (Daneshvar et al., 2010).
Outro estudo realizado em 2013avaliou cães vacinados com L. donovani com o
gene centrina deletado (Ld Cen-/-), afetando a multiplicação de formas amastigotasno
hospedeiro vertebrado (Fiuza et al., 2013). Este grupo vacinal apresentou aumento de
TNF-α e de IL-12,maior proliferação de células T e B,resultando em maior efeito
protetor e imunogênico (Fiuza et al., 2013). A segurança da vacina Ld Cen-/- foi
descrita em camundongos e hamsters (Selvapandiyan et al., 2009).
Nosso grupo de pesquisa vem estudando formulações vacinais anti-LVC, sendo
desenvolvido o imunobiológico LBSap, que possui em sua composição antígenos de L.
braziliensis associado ao adjuvante saponina (Giunchetti et al., 2007). Esta vacina foi
patenteada e está inscrita no Instituto Nacional de Propriedade Industrial (INPI) com a
identificação PI 0601225-6.
Dados do nosso grupo de pesquisa evidenciaram que a vacina LBSap foi capaz
de induzir uma redução expressiva da carga parasitária após infecção por L. chagasi em
diferentes modelos experimentais (Roatt, 2010; Motta, 2011; Mendonça, 2011;
Resende, 2011; Roatt et al., 2012). A redução no parasitismo em cães chegou a 54% no
baço (Roatt et al., 2012). Além disso, em um estudo utilizando camundongos
BALB/ccomo modelo experimental foi observado uma redução de 62% no baço de
animais desafiados por L. chagasi (Mendonça, 2013). Estes resultados demonstram que
cepas dermatotrópicas de Leishmania apresentam alto potencial em induzir
imunogenicidade e de promover o controle do parasitismo em diferentes órgãos
(Giunchetti et al., 2007, Mendonça, 2013).
Vale destacar ainda que vacinas de 1° geração, como a vacina LBSap,
apresentam maior estabilidade e segurança com relação às vacinas de subunidades
purificadas (2° geração) e de DNA (3° geração), tornando o seu custo mais acessível aos
países em desenvolvimento (Giunchettiet al., 2007, Giunchetti et al., 2008a, Giunchetti
et al., 2008b).
Amorim, D.R Revisão de Literatura
16
Diante do exposto, e considerando a experiência prévia de nosso grupo de
pesquisa que verificou uma forte indução na imunogenicidade vacinal da vacina LBSap,
este trabalho se propôs a ampliar os estudos de cepas dermatotrópicas, como racional
para o desenvolvimento de uma vacina contra a LVC. Neste sentido, o presente estudo
buscou avaliar em hamsters sírios dourados da espécie Mesocricetus auratus diferentes
formulações vacinais com antígeno de L. amazonensis e suas subfrações frente à
infecção experimental por L. chagasi.
Amorim, D.R Justificativa
17
3. Justificativa
Amorim, D.R. Justificativa
18
A leishmaniose visceral (LV) está presente em diversas regiões do Brasil e a
cada dia se tornam necessárias medidas a fim de interromper o ciclo de transmissão
nessas regiões. Apesar de contínuos esforços em busca de ações mais eficazes, o
emprego da eutanásia de cães infectados com L. chagasi ainda é recomendado, uma vez
que a terapia canina é ineficaz, justificando assim esta medida para eliminação dafonte
de infecção para humanos e outros cães. Entretanto, a eutanásia é uma medida muito
polêmica, devido à relação afetiva de proprietários de cães com estes animais. Além
dessa medida profilática, os medicamentos empregados no tratamento de pacientes
infectados podem gerar graves efeitos colaterais, sendo relatado frequentemente
resistência ao tratamento com medicamento de escolha (antimoniais pentavalentes) da
leishmaniose visceral humana. Diante deste cenário, aimunoprofilaxia tem se destacado
como alternativa mais racional para o controle da LV.
Considerando o hamster como modelo experimental altamente susceptível ao
desenvolvimento da LV, ao seu baixo custo de manutenção e, por mimetizar a doença
canina e humana, torna-se importanteo emprego deste modelo para a realização de
ensaios pré-clínicos vacinais. Esta estratégia permitiria a identificaçãode novos
candidatos vacinais que possam atuar no controle da LV. Neste sentido, o presente
trabalho propõe o teste de novos candidatos vacinais contra a LV, buscando identificar
aspectos relacionados à imunogenicidade. Esta abordagempoderá favorecer a
identificação de novos candidatos vacinais para serem avaliados em futuros estudos
contra esta doença.
Amorim, D.R. Objetivos
19
4. Objetivos
Amorim, D.R. Objetivos
20
4.1 Objetivo Geral
Avaliar a imunogenicidade de três frações antigênicas de
Leishmaniaamazonensis como candidatos vacinais em hamster dourado, contra
leishmaniose visceral.
4.2 Objetivos Específicos
1. Avaliar a toxicidade e inocuidade após as imunizações considerando
parâmetros clínicos e alterações no local do inóculo;
2.Avaliar aspectos relacionados à imunogenicidade vacinal após protocolo
vacinal considerando o hemograma completo e reatividade sérica anti-Leishmania;
3. Avaliar o perfil de reconhecimento antigênico por anticorpos
séricosinduzidos pelo processo de imunização.
Amorim, D.R. Animais, Materiais e Métodos
21
5. Animais, Material e Métodos
Amorim, D.R. Animais, Materiais e Métodos
22
5.1 Animais
Neste trabalho utilizaram-se 64 hamsters sírios dourados, machos, da espécie
Mesocricetus auratus, com aproximadamente 6-8 semanas de vida, provenientes do
Biotério de Produção do Centro de Pesquisas René Rachou/Fiocruz – MG. Estes
animais foram mantidos em salas com temperatura controlada, ciclo claro/escuro de
12h, em racks ventiladas lotadas do Biotério de Ensaios Pré-Clínicos do Laboratório de
Biologia das Interações Celulares do Departamento de Morfologia da Universidade
Federal de Minas Gerais. É importante ressaltar que todos os animais passaram por um
período de quarentena, assim que chegaram ao Biotério de Ensaios Pré-Clínicos,
permanecendo em sala separada, onde foi fornecido ivermectina (0,2mg/kg,
100ml/animal) por via subcutânea. Após 10 dias os animais foram encaminhados à sala
de experimentação para início dos experimentos. Durante todo o período do ensaio foi
fornecido água (coletada no biotério e submetida a sistema de dupla filtração e remoção
do cloro) e ração (Nuvilab®, São Paulo, SP, Brasil) à vontade.
Este projeto foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais da
Universidade Federal de Minas Gerais (CEUA-UFMG), inscrito sob o protocolo nº 385
/ 2013 (Anexo 1).
Amorim, D.R. Animais, Materiais e Métodos
23
Diagrama 1. Esquema do desenho experimental para avaliação de hamsters submetidos a diferentes protocolos vacinais: Controle (C); Adjuvante saponina (Sap); Antígeno bruto de L.
amazonensis (LA); antígeno solúvel de L. amazonensis (LASol
); antígeno particulado de L. amazonensis (LAPart
); antígeno LA associado ao adjuvante saponina (LASap); antígeno LASol
associado ao adjuvante saponina (LASapSol
) e antígeno LAPart
associado ao adjuvante saponina (LASapPart
). T0= coleta de soro antes da primeira imunização. T1= tempo 1; primeira
imunização e análises de inocuidade e toxicidade após inóculo. T1= tempo 2; segunda imunização e análises de inocuidade e toxicidade após inóculo. T3= tempo 3; terceira imunização e
análises de inocuidade e toxicidade após inóculo. T4= tempo 4; Coleta de sangue e procedimentos posteriores.
Amorim, D.R. Animais, Materiais e Métodos
24
5.2 Delineamento e protocolo experimental
Os hamsters foram divididos em 8 grupos experimentais (n=8 animais/grupo),
conforme descrito a seguir (Diagrama 1):
(i) Grupo Controle (C) – os animais receberam 100µL de solução salina estéril
(Sigma Chemical Co., St. Louis, USA) a 0,9%;
(ii) Grupo Saponina (Sap) –receberam 9µg do adjuvante saponina(Sigma
Chemical Co., St. Louis, USA)diluída em 81µL de solução salina estéril a
0,9%;
(iii) Grupo imunizado com antígeno bruto de L. amazonensis (LA) –receberam
60µg do antígeno bruto de L. amazonensis associado a 100µL de solução
salina estéril a 0,9%;
(iv) Grupo imunizado com antígeno solúvel de L. amazonensis (LASol
) –
receberam 60 µg do antígeno solúvel de L. amazonensis associado a 100µL de
solução salina estéril a 0,9%;
(v) Grupo imunizado com antígeno particulado de L.amazonensis (LAPart
) –
receberam 60µg do antígeno particulado de L. amazonensis associado a 100µL
de solução salina estéril a 0,9%;
(vi) Grupo imunizado com antígeno bruto de L. amazonensis associado ao
adjuvante saponina (LASap) –60µg do antígeno bruto de L. amazonensis
associado a 9µg do adjuvante saponina, diluídos em um volume total de
100µL de solução salina estéril a 0,9%;
(vii) Grupo imunizado com antígeno solúvel de L. amazonensis associado ao
adjuvante saponina (LASapSol
) – receberam 60g do antígeno solúvel de L.
amazonensis associado a 9µg do adjuvante saponina, diluídos em um volume
total de 100µL de solução salina estéril a 0,9%;
(viii) Grupo imunizado com antígeno particulado de L. amazonensis associado
ao adjuvante saponina (LASapPart
)–receberam 60µg do antígeno particulado
de L. amazonensis associado a 9µg do adjuvante saponina, diluídos em um
volume total de 100µL de solução salina estéril a 0,9%;
Todos os inóculos utilizaram a via subcutânea, em três doses intervaladas de 21
dias. Ao final da realização do protocolo vacinal (15 dias após a terceira dose) foi
Amorim, D.R. Animais, Materiais e Métodos
25
realizada a coleta do sangue por punção cardíaca para realização do hemograma
completo e obtenção do soro para avaliar o perfil de imunoglobulinas pela técnica de
ELISA, bem como, a realização do immunoblotting para identificar possíveis proteínas
imunogênicas presentes no soro dos animais imunizados. As metodologias necessárias
para cumprir essas etapas estão descritas a seguir.
5.3 Obtenção do Antígeno Vacinal
Todo o antígeno vacinal utilizado neste estudo foi produzido a partir de mesma
partida de cultura, conforme descrito por Giunchetti et al. (2007), com algumas
modificações. Neste sentido, para o crescimento da cultura de promastigotas foi
empregada a cepa de Leishmania amazonensis (PH8), cultivada em meio de cultura
alfa-mem (GIBCO, EUA). A cultura axênica foi expandida a partir de um inóculo
inicial de 10mL de meio alfa-mem contendo entre 107 a 10
8 promastigotas/mL de L.
amazonensis em crescimento logarítmico, sendo realizados repiques a cada três dias de
cultivo, correspondendo à fase logarítmica de crescimento do parasito, em capela de
fluxo laminar (Veco, Campinas, São Paulo, Brasil) e em garrafas de cultura de 250mL
(Pyrex Corning, EUA ), que foram mantidas em estufa biológica refrigerada BOD
(FANEM
modelo 347), à temperatura de 23°C 1°C. A cultura foi mantida por no
máximo 8 repiques, sob condições estéreis, sendo homogeneizadas diariamente.
Após 5 dias do último repique, com a cultura em fase estacionária, contendo
cerca de 107 a 10
8 promastigotas/mL, foi iniciada a etapa de lavagem. Deste modo, a
cultura foi removida em capela de fluxo laminar e transferida para tubos estéreis de
polipropileno de 50mL (Falcon
, Becton Dickinson, EUA), que foram submetidos à
centrifugação a 1540xg durante 15 minutos a 4°C. Após descartar o sobrenadante, o
sedimento de promastigotas foi homogeneizado em solução salina estéril (NaCl 0,9%),
e, em seguida foi realizada a centrifugação na mesma condição. Este procedimento de
lavagem foi repetido por mais duas vezes.
Após as etapas de lavagem, realizou-se o rompimento das promastigotas em
ultra-som (Sonifier Cell Disruptor®- Brason Sonic Power Co. – EUA), por um minuto a
40 Watts em banho de gelo. Parte do antígeno foi aliquotado, sendo a concentração
proteica dosada pelo método de Lowryet al. (1951) e congelado a -70°C (Forma
Scientific, EUA), até o momento do uso como antígeno bruto (4000µg de
Amorim, D.R. Animais, Materiais e Métodos
26
proteínas/mL), conforme descrito nos grupos experimentais deste estudo. A outra parte
da massa de promastigotas foi destinada a obtenção dasfrações antigênicas, aqui
denominadas de antígeno solúvel (660µg/mL) e antígeno particulado (1100µg/mL), que
foram utilizados conforme descrito nos grupos experimentais. Neste sentido, parte da
massa de promastigotas que passou pelo processo de sonicação, foi ultracentrifugada a
18.000 xg durante 90min, a 4oC. Utilizando uma capela de fluxo laminar, em condições
estéreis, o sobrenadante obtido foi separado e aliquotado para ser utilizado como
antígeno solúvel, enquanto o sedimento foi separado, ressuspendido em solução salina
estéril a 0,9% e aliquotado para utilizá-lo como antígeno particulado. Uma alíquota de
cada preparação foi retirada para dosagem de proteína pelo método de Lowry et al.
(1951), e o antígeno foi então mantido congelado a -70°C (Forma Scientific, EUA), até
o momento do uso.
A saponina utilizada no grupo controle e nas formulações foi preparada a partir
da saponina (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA) diluída em solução salina estéril
0,85% no momento do inóculo.
5.4 Avaliação da inocuidade dos imunobiológicos
O local do inóculo e o comportamento dos hamsters foram observados nas
primeiras 72h de cada imunização. Desta forma, foi realizada uma análise macroscópica
do local do inóculo, onde foi observado se havia nódulos, pápulas ou feridas, e onde
houve induração, foi medida com paquímetro digital (Stainless Hardened, EUA). Com
relação ao comportamento, foram avaliados sinais clínicos como: dor, agressividade,
apatia, além de sinais clínicos como inchaço, ulceração, pêlo eriçado, alterações
comportamentais, dentre outros.
5.5 Coleta e procedimentos realizados com as amostras de sangue
Após a realização do protocolo vacinal, foi coletado cerca de 400µL de sangue,
por punção intra-cardíaca, de todos os animais (Diagrama 1), utilizando-se seringas
descartáveis de 1mL (BD PlastipakTM
, Paraná, Brasil ). Os animais foram anestesiados
com tiopental sódico 2,5% via intraperitoneal na dose de 30mg/kg de peso. Cerca de
Amorim, D.R. Animais, Materiais e Métodos
27
40µL do sangue foi transferido para microtubos tipo eppendorf de 1,5mL (Hamburgo,
Alemanha) os quais foram destinados à realização de hemograma completo em um
contador automático de células (Automatic hematolgy analyzer - Bioeasy-2900 Plus),
para realização do leucograma, eritrograma e contagem de plaquetas. Cerca de 10µL de
sangue foi empregado na confecção de lâminas de esfregaço a fim de realizar a
contagem diferencial de leucócitos (linfócitos, neutrófilos, monócitos e eosinófilos),
coradas com Panótico Rápido InstantProv (Newprov®, Paraná, Brasil) e depois lidas em
microscópio óptico (Olympus CX21, EUA). O restante do sangue foi centrifugado a
450 xg durante 15 min para obtenção de amostras de soro, as quais foram
imediatamente armazenadas em freezer -70°C para posterior uso em testes sorológicos e
immunoblotting.
5.6 Análises sorológicas para reatividade de IgG total anti-Leishmania por ELISA
A fim de avaliar o perfil de imunoglobulinas totais da classe IgG, realizaram-se
reações imunoenzimáticas de ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay),
conforme descrito por Moreira et al.(2012). Para isso, empregaram-se placas de
poliestireno de fundo chato de 96 poços (Sarstedt, Alemanha), as quais foram
sensibilizadas com 2µg/well de antígeno solúvel de L. chagasi BH46
(MHOM/BR/1972/BH46) com solução de cobertura (solução de carbonato/ bicarbonato
de sódio, pH 9,6, 100µL/orifício) e incubadas overnight à temperatura de 4°C
protegidas da luz.
No segundo dia, as placas foram lavadas três vezes com solução de lavagem
(PBS 1X contendo Tween 20 a 0,05%) para remoção do excesso de antígeno. Em
seguida foi feito o bloqueio de ligações inespecíficas das placas com solução de
bloqueio [PBS / soro fetal bovino (SFB) 5%, 100µL/orifício], permanecendo incubadas
em estufa (Forma Scientific, EUA) a 37°C durante 90 minutos. Posteriormente, as
placas foram lavadas com a mesma solução de lavagem e os soros foram aplicados
100µL/orifício às placas na diluição de 1:40 e então incubadas em geladeira overnight
(18 horas) protegidas da exposição à luz.
Ao terceiro dia, as placas foram lavadas e o conjugado anti-IgG de hamster
HRPO conjugado (Caltag Laboratories – HA6007) foi aplicado na diluição de 1:2000, e
as placas foram incubadas durante 120 minutos à temperatura ambiente protegidas da
Amorim, D.R. Animais, Materiais e Métodos
28
luz. Após três lavagens, adicionou-se 100µL/orifício do substrato TMB (Sigma 3, 3’, 5,
5’ - Tetramethylbenzidine, EUA) para revelação no leitor e levou-se à estufa a 37ºC por
20 minutos (Forma Scientific, EUA). Para interromper a reação, aplicou-se
32ug/orifício de ácido sulfúrico (H2SO4) a 2,5 M. Em seguida, realizou-se a leitura em
leitor de ELISA (ELX800 Biotek Instruments VT, USA) a 490nm para IgG e os valores
gerados foram expressos como densidade óptica (absorbância). Utilizou-se em todas as
placas controles positivos e negativos e o ponto de corte “cut-off” foi estabelecido pela
média de leituras dos soros de oito hamsters não infectados.
5.7Immunoblotting para identificação de anticorpos IgG
A técnica de eletrotransferência do experimento de immunoblotting foi
executada de acordo com o método de Towbin et al. (1979), em uma membrana de
polivinilfluorideno (PVDF) (Sigma-Aldrich®, EUA). As alíquotas de 40µg de extrato
solúvel, bruto e particulado de L. amazonensis (para o gel e membrana de 7cm), e de
160µg do extrato solúvel de L. amazonensis (para o gel e membrana de 18cm) foram
submetidas a eletrotransferência do gel de poliacrilamida para membrana de PVDF em
1000 mL de solução tampão de transferência composta por Tris 20 mM, Gly 192 mM,
SDS 0,1% (m/v), pH 8,3 em metanol a 10% (v/v), utilizando-se da cuba de
eletrotransferência Semi-Dry TE 70 (Amersham Biosciences – GE, UK).
Após a medição do comprimento e altura verificou-se que os géis de separação
possuíam as dimensões de 8,6 x 8,4cm. Estas medidas foram utilizadas para recorte das
membranas de PVDF. As membranas recortadas foram imersas em 50mL de metanol a
10% (v/v) para ativação por 1 minuto, depois em 50mL de água por 5 minutos e, em
seguida, as membranas foram imersas em 50mL de tampão de eletrotransferência (Tris
20 mM, Gly 192 mM, SDS 0,1% (m/v), pH 8,3) por 10 minutos juntamente com seis
folhas de papel filtro recortadas em dimensões idênticas as das membranas de PVDF. O
gel de poliacrilamida foi imerso em 50mL do tampão de eletrotransferência por 30
minutos para equilíbrio neste tampão. As folhas de papel, gel de poliacrilamida e
membrana de PVDF foram levados para a cuba de eletrotransferência e empilhados na
superfície do catodo da cuba, colocando-se primeiro as 3 folhas de papel filtro, em
seguida o gel, subsequentemente a membrana e outras 3 folhas de papel filtro. Os
parâmetros elétricos empregados foram 50V, 70mA por 10 minutos para os géis com
Amorim, D.R. Animais, Materiais e Métodos
29
dimensões de 8,6 x 8,4 cm. Ao adicionar as folhas utilizou-se de um tubo de plástico
para retirada de bolhas de ar que possivelmente diminuiria a eficiência da transferência
das proteínas.
Após a eletrotransferência, a membrana de PVDF foi imersa em 50mL de
solução tampão TBS-Tween 20 a 0,1% (v/v), pH 7,4, 3 vezes de 5 minutos. Em seguida,
a membrana foi imersa em 100mL de tampão TBS-Tween 20 a 0,1% (v/v) e leite em pó
desnatado 5% (m/v), a fim de bloquear as ligações inespecíficas, em temperatura
ambiente por 30 minutos. Após este período a membrana foi lavada com 50mL tampão
TBS-Tween 20 a 0,1% (v/v) 3 vezes de 5 minutos para retirada do excesso de leite. A
solução com 10mL de anticorpos primários foi feita pela solubilização de soro total de
hamsters imunizados com as diferentes frações antigênicas de L. amazonensis em TBS-
Tween 20 a 0,1% (v/v) e leite em pó 5% (m/v) a concentração de 1:200 para a
membrana de 7 cm. No entanto, para a membrana de 18 cm, foi utilizado pool de soros
dos três grupos vacinais LASap, LASapSol
e LASapPart
, sendo 33,3µL obtidos de cada
grupo, que somados, seriam 100µL, volume necessário para a diluição de 1:200, em um
volume final de 20mL de solução. À membrana (8,6 x 8,4 cm) foi adicionada 20mL da
solução descrita acima e submetida à agitação por 3 horas em temperatura ambiente.
Após essa etapa, a membrana foi lavada com 20mL de TBS-Tween 20 a 0,1%
(v/v) pH 7,4, por três vezes durante 10 minutos em TA para remoção de anticorpos em
excesso. A seguir, a membrana foi incubada com a solução de anticorpo secundário
anti-IgG de hamster, HRPO conjugado (Caltag Laboratories – HA6007) na diluição de
1:2000 em TBS-Tween 20 a 0,1% (v/v) por 1 hora, em temperatura ambiente. Após essa
etapa, a membrana foi lavada com 20mL de TBS-Tween 20 0,1% (v/v) pH 7,4 por três
vezes durante 10 minutos cada lavagem a temperatura ambiente. Em sequência, a
membrana foi submetida à revelação por substrato cromogênico 4-Cloro-1-Naftol na
seguinte solução: 6mg de 4-cloro-1- naftol, 1 mL de metanol, 10 mL de solução TBS
pH 7,4 e 50 μL de peroxido de hidrogênio a 30 volumes.
5.8 Análises Estatísticas
As análises estatísticas foram realizadas usando o GraphPadPrism 6.0
(PrismSoftware, Irvine, CA, USA). Depois de demonstrada a normalidade dos dados
usando oteste Kolmogorov-Smirnoff, foi realizada análise de variância (ANOVA one-
Amorim, D.R. Animais, Materiais e Métodos
30
way) seguidado teste de Tukey para determinar as diferenças específicas entre os grupos.
Em todas as análises estatísticas as diferenças foram consideradas significativas quando
o valor de P foi menor que 0,05.
Amorim, D.R. Resultados
31
6. Resultados
Amorim, D.R. Resultados
32
6.1Hemograma – séries vermelha e branca
Considerando a escassez de reagentes para análise de aspectos relacionados à resposta
imune em hamsters, este trabalho avaliou a resposta celular pelo estudo de parâmetros
hematológicos. Deste modo, foi realizada a análise da série vermelha, incluindo a contagem
de plaquetas (Tabela 1), além do leucograma (Tabela 2).
Foram realizadas comparações em relação ao grupo controle e saponina em função das
diferentes frações antigênicas após o protocolo vacinal. Nesse sentido, a análise da série
vermelhademonstrou aumento (p<0,05) na global de eritrócitosdos grupos LASol
(7,756±0,5528), LAPart
(7,566±0,2016) e LASap (7,484±0,2878) em relação ao grupo
saponina (6.899±0,7140). Entretanto, vale destacar que os valores relacionados ao global de
eritrócitos, de todos os grupos avaliados, encontram-se dentro do limite normal (6-8 x
106/mm
3), conforme descrito por Lapchil et al. (2009). Não foram observadas outras
alterações hematológicas após o protocolo vacinal para os diferentes grupos avaliados (Tabela
1).
Os resultados referentes ao leucograma (Tabela 2) demonstram que não houve
alteração na contagem global de leucócitos nos grupos avaliados. Entretanto, quando realizada
a contagem diferencial das células observou-se que a fração antigênica composta apenas por
antígeno bruto (LA) apresentouaumento (p<0,05)de eosinófilos (57±12) e linfócitos
(4406±65) em relação ao grupo controle (p<0,05).
Na fração antigênica de antígeno solúvel (LASol
) houve aumento(p<0,05) de linfócitos
(4818±69) quando comparado aos grupos controle, saponina e LA. Na fração antigênica de
antígeno bruto particulado (LAPart
) houve aumento(p<0,05) de eosinófilos (66±23) quando
comparado ao grupo controle (p<0,05). Em relação aos monócitos, houve aumento(p<0,05)
no grupo LAPart
(363±44) quando comparado ao grupo LASol
, bem como aumento (p<0,05)na
população de linfócitos (5058±150) quando comparado aos grupos controle, saponina e LA
(p<0,05).Na fração antigênica de antígeno bruto associado a saponina (LASap) observou-se
aumento(p<0,05) de neutrófilos (1091±62) quando comparado ao grupo LASol
. Em relação
aos eosinófilos (7±4) houve redução(p<0,05) no grupo LASap quando comparado ao grupo
LA e LAPart
(p<0,05), bem como redução(p<0,05)na população de monócitos (171±12)
quando comparado aos grupos controle, saponina, LA, LASol
e LAPart
. Em relação aos
resultados referentes à fração antigênica de antígeno solúvel associado à saponina (LASapSol
)
houve aumento (p<0,05)de neutrófilos (1516±209) quando comparado aos grupos saponina,
Amorim, D.R. Resultados
33
LA, LASol
, LAPart
e LASap (p<0,05), além de reduçã (p<0,05) de monócitos (240±42)
comparado ao grupo LAPart
, e aumento (p<0,05) de linfócitos (5824±229) quando comparado
aos grupos controle, saponina, LA, LASol
, LAPart
e LASap (p<0,05). Em relação aos resultados
referentes à fração antigênica de antígeno particulado associado à saponina (LASapPart
) houve
redução (p<0,05)de neutrófilos (918±31) quando comparado aos grupos LASap e
LASapsol
(p<0,05), além de redução (p<0,05) de monócitos (129±28) comparado aos grupos
controle, saponina, LA, LASol
, LAPart
e LASapSol
, e aumento (p<0,05)de linfócitos (4391±45)
comparado aos grupos controle e saponinae redução (p<0,05) em relação aos grupos LASol
,
LAPart
, LASap e LASapSol
.
Os componentes vacinais empregados neste trabalho não devem induzir efeitos
tóxicos, tais como: perda de pêlos no local do inóculo, anorexia, apatia, vômito, dentre outros
(Santos et al., 2002).
Levando em consideração os efeitos colaterais causados pela saponina (Cleland et al.,
1996; Ragupathi et al., 2011), no presente trabalho foi realizada avaliação macroscópica do
local do inóculo, bem como acompanhamento do comportamento dos hamsters imunizados.
Dessa forma, foi observada a presença de uma pápula de 2,3mm em apenas um animal do
grupo inoculado com o adjuvante saponina, após 24 horas do inóculo. Para o restante não
houve nenhuma alteração nos animais inoculados após 24, 48 e 72 horas após cada inóculo
das formulações vacinais, na presença ou ausência da saponina.
Amorim, D.R. Resultados
34
Tabela 1. Eritrograma de hamsters submetidos a diferentes protocolos vacinais.
Eritrograma Após Protocolo Vacinal
Controle Sap LA LASol
LAPart
LASap LASapSol
LASapPart
Eritrócitos (106/uL) 7,363±0,9197 6.899±0,714 7,403±0,347 7,756±0,5528b 7,566±0,2016
b 7,484±0,2878
b 7,349±0,5169 6,861±1,555
Hemoglobina (g/dL)
17,21±1,474 16,80±1,641 17,60±0,7672 17,95±0,7635 17,51±0,3796 17,53±0,5701 17,56±1,053 16,04±3,761
Hematócrito (%)
41,21±4,980 38,26±4,144 39,81±4,113 42,25±3,671 40,74±1,293 40,73±1,529 41,01±2,848 37,70±8,633
Plaquetas (103/uL) 127,5±46,25 133,0±47,57 102,6±22,04 108,5±34,74 114,0±20,43 112,8±22,76 129,5±31,96 116,1±28,89
Grupos: Controle (C, n=8), adjuvante saponina (Sap, n=8), Antígeno bruto de L. amazonensis (LA, n=8), antígeno solúvel de L. amazonensis
(LASol
, n=8), antígeno particulado de L. amazonensis (LAPart
, n=8), antígeno LA associado ao adjuvante saponina (LASap, n=8), antígeno LASol
associado ao adjuvante saponina (LASapSol
, n=8) e antígeno LAPart
associado ao adjuvante saponina (LASapPart
, n=8). Diferença estatística
(p<0,05) indicada pela presença da letra, onde “a” indica diferença em relação ao grupo controle, “b” em relação ao grupo saponina, “c” em
relação ao grupo LA, “d” em relação ao grupo LASol
, “e” em relação ao grupo LAPart
,“f” em relação ao grupo LASap, e “g” em relação ao
grupo LASapSol
. Os valores se referem à média do grupo ± desvio padrão.
Amorim, D.R. Resultados
35
Tabela 2. Leucograma de hamsters controle e submetidos a diferentes protocolos vacinais.
Leucograma Após Protocolo Vacinal
Controle Sap LA LASol
LAPart
LASap LASapSol
LASapPart
Global de Leucócitos (mm3) 5163±1762 5388±2759 5713±1159 6050±2265 6600±2108 5938±1029 7675±2870 5438±1655
Neutrófilos Totais 1168±195 1017±144 964±60 946±53 1114±160 1091±62d 1516±209
bcdef 918±31
fg
Eosinófilos 6±6 34±25 57±12a 30±17 66±23
a 7±4
ce 0±0 0±0
Monócitos 297±70 317±62 307±28 257±45 363±44d 171±12
abcde 240±42
e 129±28
abcdeg
Linfócitos 3698±176 4088±152 4406±65ab
4818±69abc
5058±150abc
4743±50abce
5824±229abcdef
4391±45abdefg
Grupos: Controle (C, n=8), adjuvante saponina (Sap, n=8), Antígeno bruto de L.amazonensis (LA, n=8), antígeno solúvel de L. amazonensis
(LASol
, n=8), antígeno particulado de L. amazonensis (LAPart
, n=8), antígeno LA associado ao adjuvante saponina (LASap, n=8), antígeno
LASol
associado ao adjuvante saponina (LASapSol
, n=8) e antígeno LAPart
associado ao adjuvante saponina (LASapPart
, n=8). Diferença estatística
(p<0,05) indicada pela presença da letra, onde “a” indica diferença em relação ao grupo controle, “b” em relação ao grupo saponina, “c” em
relação ao grupo LA, “d” em relação ao grupo LASol
, “e” em relação ao grupo LAPart
,“f” em relação ao grupo LASap, e “g” em relação ao
grupo LASapSol
. Os valores se referem à média do grupo ± desvio padrão.
Amorim, D.R. Resultados
36
6.2Avaliação da resposta humoral
A análise de antigenicidade foi realizada através de amostras de soro dos
hamsters dos diferentes grupos experimentais, buscando avaliar a reatividade de IgG
total anti-Leishmania. A Figura 1 ilustra as diferentes densidades ópticas. Após o
protocolo vacinal, foi observado que em todos os grupos em que houve inóculo com
antígeno, independente de sua formulação, apresentaram valores de densidade óptica
acima do cutt-off.Além disto, foi observado aumento (p<0,05)dos níveis de IgG total
nos grupos LA (0,13±0,02), LAPart
(0,17±0,07), LASap (0,29±0,13), LASapSol
(0,56±0,13) e LASapPart
(0,22±0,063) em relação ao grupo controle (0,05±0,01). Houve
aumento (p<0,05) também nos grupos LA (0,13±0,02) e LASapPart
(0,22±0,06) em
relação ao grupo saponina (0,05±0,02). Além disso, foi observado aindaaumento
(p<0,05) dos níveis de IgG total no grupo LASapSol
(0,56±0,13) em relação aos grupos
LASap (0,29±0,13) e LASapPart
(0,22±0,06).
Pode-se observar que o grupo que obteve maiores níveis de IgG total (LASapSol
)
também foi o que apresentou maior aumento de linfócitos em relação ao grupo controle
como pode ser visto na Tabela 2.
Figura 1: Reatividade de IgG total no soro de hamsters dos antes da 1ª imunização (pré imune) e após 15
dias da 3ª imunização nos diferentes grupos avaliados, entre os quais: Controle (C, n=8);Adjuvante
saponina (Sap, n=8); Antígeno bruto de L .amazonensis (LA, n=8);Antígeno solúvel de L. amazonensis
(LASol
, n=8);Antígeno particulado de L. amazonensis (LAPart
, n=8), Antígeno LA associado ao adjuvante
saponina (LASap, n=8); Antígeno LASol
associado ao adjuvante saponina (LASapSol
, n=8); e Antígeno
LAPart
associado ao adjuvante saponina (LASapPart
, n=8). Os resultados foram expressos como valores
médios de densidade óptica e desvio padrão. Diferenças significativas (p<0,05) entre as densidades
ópticas de IgG dos diferentes grupos vacinais foram representadas pelas letras acima de cada grupo. A
letra “b” representa diferença significativa em relação ao grupo C. A letra “c” representa diferença
significativa em relação ao grupo Sap. A letra “g” representa diferença significativa em relação ao grupo
LASap. A letra “i” representa diferença significativa em relação ao grupo LASapPart
. O “Cut off”= 0,096
está representado no gráfico pela linha tracejada.
Amorim, D.R. Resultados
37
6.3 Identificação de proteínas imunogênicas por western blot
A fim de identificarpossíveis candidatos vacinais foi realizado o ensaio de
immunoblotting empregando as frações antigênicas vacinais associadas ao soro dos
animais imunizados. Nesse sentido, as quatro tiras à esquerda na figura 2 representam o
gel com o padrão de proteínas e com as bandas marcadas pertinentes às três frações de
L. amazonensis, as quais apresentaram o mesmo perfil protéico. O resultado do western
blot, representado nas quatro tiras à direita da figura 2, indicou que, embora os animais
tenham sido imunizados com diferentes formulações LASap, LASapSol
e LASapPart
, o
padrão de reconhecimento antigênico foi mantido, com bandas próximas de 40 kDa, de
30 kDa e bandas entre 20 e 30 kDa, para as três formulações (Figura 2, painel direito).
Além do potencial vacinal, os resultados aqui encontrados podem ser importantes
também na realização de diagnóstico da leishmaniose.
Figura 2: Westernblot com soros de hamsters controle (C) e imunizados com as vacinas LASap,
LASapSol
e LASapPart
, apresentando perfil de reconhecimento antigênico semelhante, com bandas da
ordem de 40 kDa, 30 kDa e inferiores a 30 kDa.Controle (C, n=8), antígeno LA associado ao adjuvante
saponina (LASap, n=8), antígeno LASol
associado ao adjuvante saponina (LASapSol
, n=8) e antígeno
LAPart associado ao adjuvante saponina (LASapPart
, n=8).As quatro primeiras tiras representam o gel
marcando bandas inespecíficas para as três fomulações vacinais. As quatro tiras da direita representam a
membrana reveladora do immunoblotting marcando apenas as bandas específicas para proteínas com
reatividade imunogênica anti-Leishmania.
LASap LASapSolLASapPart Padrão C LASap LASapSolLASapPart
Amorim, D.R. Discussão
38
7. Discussão
Amorim, D.R. Discussão
39
Um dos grandes desafios relacionados ao controle da leishmaniose visceral
(LV) no Brasil e na Europa consiste na identificação de uma formulação que seja capaz
de proteger o cão. Isto permitiria que o cãodeixasse de ser considerado reservatório do
parasito e, consequentemente, continuasse transmitindo o parasito a outros cães ou
mesmo para o homem (Reis et al., 2010). Atualmente, as vacinas comercialmente
disponíveis contra leishmaniose visceralcanina (LVC) no Brasil (Leish-Tec®) e na
Europa (CaniLeish®
) não são capazes de induzir imunidade estéril. Assim, o cão
imunizado com estas vacinas poderia se infectar com o parasito e manter um quadro
clínico assintomático (Fernandes et al,. 2008; Reis et al., 2009;Bongiornoet al.,
2013;Martin et al., 2014;Olivaet al., 2014; Gradoni et al., 2015). Por este motivo,
mesmo após o processo de imunização, o cão pode ser infectado e transmitir o parasito
na área endêmicapara LV (Bongiornoet al. 2013). Deste modo, o Ministério da Saúde
de nosso país ainda não recomenda a utilização de qualquer formulação vacinal como
estratégia de controle da LVC (Ministério da Saúde, 2006). Nesse sentido há a
necessidade de novos estudos os quais viabilizem uma formulação vacinal que seja
eficaz e contribua efetivamente no combate contra essa doença.
Trabalhos do nosso grupo de pesquisa demonstraram que a formulação vacinal
composta por antígenos de L. braziliensis associado à saponina (vacina LBSap),ou esta
formulação acrescida doextrato da glândula do flebotomíneo (vacina LBSapSal) foram
capazes de induzir forteimunogenicidadee elevados níveis de proteção em cães
(Giunchetti et al., 2007; Giunchetti et al., 2008; Roatt et al., 2012; Resendeet al., 2013;
Aguiar-Soares et al., 2014). Além disso, Grenfell e colaboradores (2010) demonstraram
que empregando extratos antigênicos de cepas dermatotrópicas (L. amazonensis e L.
braziliensis), associados à saponina foram capazes de induzir proteção em
camundongos BALB/c infectados por L. chagasi. Mais recentemente, Guedes e
colaboradores (2014) demonstraram que a vacinação intranasal com serinas proteases
extracelulares purificadas de L. amazonensis foram capazes de conferir imunidade
protetora em modelo murinoinfectado por L. amazonensis.
Vale ressaltar que o grupo coordenado pelo Prof. Mayrink e pelo Prof. Genaro
na UFMG permitiu a formação de uma escola de vacinologia em leishmanioses no
Brasil (Melo et al., 1977; Mayrink et al., 1979; Barros, et al., 1980; Mayrink et al.,
1985; Antunes et al., 1986; Mayrink et al., 1986; Mayrink et al., 1990; Genaro et al.,
1993a,b
; Genaro et al., 1996;Mendonça et al., 1995) e que estabeleceu os pilares ao qual
Amorim, D.R. Discussão
40
estão apoiadas as linhas de pesquisa atualmente em desenvolvimento por nosso grupo
de pesquisa. Os estudos conduzidos pelo Prof. Odair Genaro no final da década de 80
estimulou o desenvolvimento de vacinas contra LVC, permitindo a identificação de
antígenos de Leishmania indutores ou inibidores da atividade linfoproliferativa in vitro
de células caninas (Genaro, dados não publicados). Neste contexto, foi observado por
Genaro, que células de cães com LV quando estimuladas in vitro com antígeno de L.
chagasi apresentavam atividade linfoproliferativa inibida. Por outro lado, quando se
utilizava antígeno de Leishmania proveniente de cepas dermatotrópicas, a atividade
linfoproliferativa de cães imunizados com os mesmos antígenos aumentava
significativamente. Estes resultados indicaram que cepas dermatotrópicas de
Leishmania poderiam conter antígenos com alta capacidade de induzir imunogenicidade
protetora contra a infecção heteróloga por L. chagasi. Estes achados têm estimulado até
hoje nosso grupo de pesquisa, liderado pelo Prof. Rodolfo C. Giunchetti, e sediado na
UFMG, a triar antígenos de cepas dermatotrópicas de Leishmania como estratégia
racional para o desenvolviemtno de uma vacina protetora contra a LVC.
Diante do exposto, este estudo teve como foco principal estudar diferentes
formulações vacinais contendoantígenos de L. amazonensis a fim de avaliar aspectos
gerais relacionados à inocuidade, toxicidade e imunogenicidade em hamsters.
A primeira abordagem utilizada em ensaios pré-clínicos vacinais preconiza a
caracterização de segurança e inocuidade do imunobiológico empregado. Os dados
desse trabalhosobre avaliação da inocuidade e toxicidade estão de acordo com o
trabalho de Garg e Dube, (2006) e Moreira et al. (2009) que descreveram que hamsters
não apresentam efeito colateral quando inoculadoscom antígeno bruto de Leishmania
associado ou não a saponina.É consenso que o adjuvante atua de forma significativa na
indução de efeitos adversos em vacinas, sendo descrita algumas alterações relacionadas
ao uso da saponina em cães (Parra et al., 2007; Rajput et al., 2007). Entretanto, nosso
grupo de pesquisa não tem verificado efeitos adversos nas formulações vacinais
utilizando a saponina como adjuvante, quando avaliadas em modelo murino (Vitoriano-
Souza et al., 2012), hamsters (Moreira et al., 2009) e em cães (Giunchetti et al., 2007;
Giunchetti et al., 2008).
Moreira e colaboradores (2009) demonstraram que o adjuvate saponina
apresenta-se como um excelente indutor de resposta celular em hamsters. Vale ressaltar
que o adjuvante em questão pode exercer um papel hemolítico de acordo com a dose
Amorim, D.R. Discussão
41
empregada (Santos et al., 1997). Sendo assim torna-se relevante a realização do
eritrograma para o monitoramento e acompanhamento clínico dos animais após o
inóculo das formulações vacinais. Nesse sentido, no presente estudo não foi observada a
ocorrência de alteraçõeslocal (dor, inchaço e ulceração) ou sistêmica (alterações clínico-
comportamentais e anemia) nos animais vacinados (Tabela 1). Destaca-se ainda que em
todos os grupos avaliados o número de eritrócitos estava dentro dos limites normais
encontrados em hamsters (Lapchik et al., 2009).
O estudo da resposta imune celularé fundamental após a imunização contra
agentes infecciosos. Sendo assim, a realização do leucograma completo é um
importante parâmetro, uma vez que para o modelo hamster há carência de reagentes
para estudo da resposta imune. Dessa forma, o presente estudo avaliou a resposta imune
sistêmica através da análise de leucograma completo (Tabela 2). Ao considerar apenas
as diferenças significativas que foram observadas em relação ao grupo controle, e que
por este motivo, poderiam ser resultado da formulação vacinal, verificou-se: aumento
no número de eosinófilo (grupo LA e LAPart
), além de aumento (LASap) e redução
(LASapPart
) no número de monócitos (Tabela 2). A eosinofilia observada poderia estar
relacionada a eventos alérgicos, embora clinicamente não tenha sido constatada
nenhuma alteração. Este resultado aponta para a importância de se avaliar em futuros
estudos os níveis de IgE antígeno-específicos, buscando verificar se estas formulações
seriam capazes de induzir um processo alérgico. Vale ressaltar que a monocitose
verificada no grupo LASap, também foi observada durante o processo de imunização
com a vacina LBSap (Giunchetti et al., 2007). Neste estudo, Giunchetti et al. (2007)
relacionaram a monocitose como um dos eventos relacionados ao estabelecimento de
uma intensa imunogenicidade para a vacina LBSap. Além disto, Mendonça et al. (2015)
relatou a indução de monócitos CD14+circulantes em camundongos BALB/c, após
imunização com as vacinas LBSap, Leish-Tec® e Leishmune
®. Este resultado foi
relacionadoao estabelecimento de eventos imunoprotetores com manutenção de baixa
carga parasitária após o desafio experimental (Mendonça et al., 2015).
Do ponto de vista das células avaliadas pelo leucograma e que poderiam estar
associadas à imunidade adaptativa, destaca-se o aumento de linfócitos encontrado em
todos os grupos em que foi utilizado antígeno de L. amazonensis (LA, LASol
, LAPart
,
LASap, LASapSol
, LASapPart
; Tabela 2).Este resultado, poderia indicar um efeito
biológico característico da vacinação empregando-se antígenos de espécies
Amorim, D.R. Discussão
42
dermatotrópicas (Mayrink et al., 1996; Giunchetti et al., 2007; Giunchetti et al., 2008;
Moreira et al., 2009, Mendonça et al., 2015) os mesmos presentes em vacinas como a
Leish-Tec® ou Leishmune
® (Mendonça et al., 2015). Esse resultado poderia
serinteressante para uma vacina contra leishmaniose visceral uma vez que o perfil de
resistência está relacionado à resposta imune celular, sendo os linfócitos as principais
células na defesa contra o estabelecimento da doença (Giunchetti et al., 2007;
Giunchetti et al., 2008; Moreira et al., 2009). Entretanto, embora o aumento de
linfócitos totais tenha sido descrito com um dos marcadores de estabelecimento de
imunogenicidade em vacinas contra a LV, a caracterização da subpopulação de
linfócitos que contribuiria este aumento, bem como o perfil de citocinas e dados de
carga parasitária, seriamfundamentias para relacionar este resultado, de forma mais
segura, com o estabelecimento de imunidade protetora.
O estudo da resposta imune humoral é outro importante parâmetro na avaliação
da resposta imune no que diz respeito à indução de antigenicidade em animais
imunizados. Nesse sentido, foi realizadaa dosagem de IgG total Leishmania-
inespecífico em amostras de soro de hamsters infectados por L. chagasi por ELISA. Os
resultados demonstraram que os níveis de IgG total anti-Leishmania apresentaram-se
acima do limiar estabelecido pelo cutt-off para todas as formulações vacinais (Figura 1),
indicando antigenicidade dos antígenos avaliados.Verificou-se ainda uma tendência de
aumento nos níveis de IgG nas formulações associadas à saponina, especialmente no
grupo LASapSol
(Figura 1). Como as reações de ELISA foram realizadas com antígeno
solúvel de L. chagasi, é possível especular que o aumento dos níveis de IgG total
observado quando utilizado o antígeno LASol
, esteja relacionado ao tipo do antígeno
vacinal e diagnóstico (ambos solúveis). Diferentes estudos têm demonstrado resultados
semelhantes, evidenciando aumento nos níveis de IgG total após o processo de
imunização (Giunchetti et al., 2007, Giunchetti et al., 2008, Kumari et al., 2009, Roatt
et al., 2012, Aguiar-Soares et al., 2014, Mendonça et al., 2015). Bhowmick et al. (2014)
demonstraram que o balanço de IL-4 e INF-γ associado às diferentes subclasses de IgG,
em modelo murino, são importantes para a caracterização de bons alvos vacinais. Nieto
e colaboradores (2011) descrevem a importância do balanço da reposta imune celular e
humoral apresentada por hamsters experimentalmente infectados por LV. Embora no
presente estudo não tenha sido avaliado isotipos de IgG que poderiam demonstrar um
perfil de imunogenicidade protetora, têm sido descrito que antígenos brutos de cepas
Amorim, D.R. Discussão
43
dermatotrópicas são capazes de induzir elevados níveis de IgG total, com aumento
simultâneo da razão IgG2a/IgG1 (Mendonça et al., 2015, dados submetidos). Este
resultado, aliado ao baixo parasitismo tecidual observado no baço e fígado de
camundongos imunizados com a vacina LBSap e desafiados com L. chagasi indicou o
estabelecimento de imunogenicidade protetora (Mendonça et al., 2015, dados
submetidos). Diante do exposto fica evidente que será necessária a análise de novos
estudos buscando avaliar subclasses de IgG (IgG1 e IgG2), para auxiliar na
caracterizaçãodo perfil da resposta imune induzido pelas formulações avaliadas no
presente estudo.
Na busca pela triagem decandidatos vacinais anti-Leishmania, diferentes
técnicas de biologia molecular vêm sendo utilizadas. Nessa área destaca-se a
proteômica, metodologia que permite a identificação de proteínas imunogênicas com
grande precisão (Kumari et al., 2008). No presente estudo, os resultados do western blot
indicaram que os animais imunizados com diferentes formulações vacinais (LASap,
LASapSol
e LASapPart
) apresentaram o mesmo padrão de reconhecimento antigênico. As
bandas apresentadas foram da ordem de: 25 kDa, 35 kDa e 40 kDa (Figura 2). Grupta et
al. (2007) em um estudo preliminar identificaram uma proteína solúvel de L. donovani
da ordem de 68 a 97 kDa, capaz de induzir uma resposta do tipo 1 em PBMC de
pacientes curados após infecção por Leishmania e hamsters infectados. Kushawaha et
al. (2011) realizaram a clonagem, expressão, purificação e caracterização molecular da
proteína proposta por Grupta et al. (2007) e comprovaramsua capacidade protetora após
desafio experimental, demonstrando a importância dessa abordagem. Kumari et al.
(2012) identificaram bandas da ordem de 50 a 80 kDa utilizando sub-frações antigênicas
da membrana de amastigotas de L. donovani. Essas sub-frações foram capazes de
estimular a linfoproliferação em hamsters, além da produção de INF-γ, IL-12 e óxido
nítrico em pacientes curados e hamsters experimentalmente infectados. Kashino et al.
(2012) empregaram uma abordagem inovadora e identificaram antígenos de L. infantum
que, associados a formulações vacinais, podem induzir proteção em camundongos
desafiados devido a um perfil de resposta do tipo 1, em que foi observado redução da
carga parasitária no baço.
Amorim, D.R. Conclusão
44
Conclusão
As análises sobre toxicidade e inocuidade mostraram que a administração das
formulações vacinais utilizadas é segura e não provocou alterações, de uma forma geral,
em hamsters.
As três formulações contendo antígenos de Leishmania associado ao adjuvante
(LASap, LASapSol
, LASapPart
) mostraram intensa antigenicidade, estimulam a
realização de novos estudos para caracterização da resposta imune celular e análise dos
níveis de proteção.
Os animais imunizados com as formulações LASap, LASapSol
, LASapPart
apresentaram um padrão de bandas identificadas pelo immunoblotting semelhantes (25
kDa, 35 kDa e 40 kDa), associado à indução de linfócitos circulantes e de IgG total anti-
Leishmania, indicando o potencial destas proteínas antigências como potenciais alvos
vacinais ou para serem utilizadas como diagnóstico da leishmaniose visceral.
Amorim, D.R. Perspectivas
45
Perspectivas
A fim de estudar melhor osefeitos protetores das formulações vacinais
utilizadas neste estudo, alguns procedimentos serão importantes tais como:
1. Avaliar as subclasses de IgG presentes na composição de IgG total e
suas dosagens;
2. Purificar e testar as proteínas, encontradas por western blotting, para o
potencial imunogênico e de diagnóstico;
3. Avaliar a eficácia vacinal através de técnicas histopatológicas e
principlamente pela realização de PCR em tempo real (qPCR).
Amorim, D.R. Referência Bibliográfica
46
8. Referência Bibliográfica
Amorim, D.R. Referência Bibliográfica
47
Referência Bibliográfica
Aebersold, R.; Goodlett, D.R. (2001). Mass spectrometry in proteomics.Chem Rev.
Feb; 101(2):269-95.
Aguia-Soares, R.D.; Roatt, B.M.; Ker, H.G.; Moreira,Nd.; Mathias, F.A.; Cardoso,
J.M.;Gontijo, N.F.; Bruna-Romero, O.; Teixeira-Carvalho, A.; Martins-Filho, O.A.;
Corrêa-Oliveira, R.; Giunchetti, R.C.; Reis, A.B. (2014). LBSapSal-vaccinated dogs
exhibit increased circulating T-lymphocyte subsets (CD4+ and CD8
+) as well as a
reduction of parasitism after challenge with Leishmania infantum plus salivary gland of
Lutzomyia longipalpis. Parasit vectors.
Aguilar, J. C. e Rodriguez, E. G. (2007). Vaccine adjuvants revisited. Vaccine 25, 3752-
3762.
Alexandre-Pires, G. et al. (2006). Leishmaniosis - a report about the microvascular and
cellular architecture of the infected spleen in Canis familiaris. Microsc. Res. Tech. 69,
227–235.
Alvar J.; Ve´lez, I.D.; Bern, C.; Herrero, M.; Desjeux, P.et al. (2012). Leishmaniasis
Worldwide and Global Estimates of Its Incidence. PLoS ONE 7(5): e35671.
Alvar, J. et al. (2012). Leishmaniasis worldwide and global estimates of its incidence.
PLoS ONE 7, p. e35671.
Alvar, J.; Canavate, C.; Molina, R.; Moreno, J.; Nieto, J. (2004). Canine leishmaniasis.
Adv Parasitol;57:1–88.
Antunes, C.M.; Mayrink, W.; Magalhaes, P.A.; Costa, C.A.; Melo, M.N.; Dias, M.;
Michalick, M.S.; Williams, P.; Lima, A.O.; Vieira, J.B. et al. (1986). Controlled field
trials of a vaccine against New World cutaneous leishmaniasis. Int J Epidemiol. 1986
Dec;15(4):572-80.
Aslan H.; Dey, R.; Meneses, C.; Castrovinci, P.; Jeronimo, S. M. B.; Oliva, G.; Fischer,
L.; Duncan, R. C.; Nakhasi, H. L.; Valenzuela, J. G. e Kamhawi, S. (2013). A New
Model of Progressive Visceral Leishmaniasis in Hamsters by NaturalTransmission via
Bites of Vector Sand Flies. The Journal of Infectious Diseases 2013;207:1328–38.
Banerjee, R.; Kumar, S.; Sen, A.; Mookerjee, A.; Mukherjee, P. et al. (2011). TGF-
beta-regulated tyrosine phosphatases induce lymphocyte apoptosis in Leishmania
donovani-infected hamsters. Immunol Cell Biol.; 89:466–474.
Banerjee, R.; Kumar, S.; Sen, A.; Mookerjee, A.; Roy, S.; Pal, S. et al. (2010). TGF-β-
regulated tyrosine phosphatases induce lymphocyte apoptosis in Leishmania donovani-
infected hamsters. Immunol Cell Biol.;89:466-74.
Amorim, D.R. Referência Bibliográfica
48
Baneth, G.; Koutinas, A.F.; Solano-Gallego, L.; Bourdeau, P.; Ferrer, L. (2008). Canine
leishmaniasisnew concepts and insights on an expanding zoonosis: part one. Trends
Parasitol.;24:324-30.
Barros, G.C.; Sessa, P.A.; Mayrink, W.; Daher, V.R.; Mattos, E.A.; Alencar, J.T.A.
(1980). Foco de leishmaniose tegumentar americana no município de Viana – Estado do
Espírito Santo. Rev. Soc. Bras. Med. Trop., 16:150.
Beattie, L.; Phillips, R.; Brown, N.; Owens, B.M.; Chauhan, N. et al. (2011). Interferon
regulatory factor 7 contributes to the control of Leishmania donovani in the mouse liver.
Infect Immun.; 79:1057–1066.
Bhowmick, S.; Ravindran, R.; Ali, N. (2014) .IL-4 contributes to failure, and colludes
with IL-10 to exacerbate Leishmania donovani infection following administration of a
subcutaneous leishmanial antigen vaccine. BMC Microbiol. Jan 15;14:8.
Bomford, R. (1980). Saponin and other haemolysins (vitamin A, aliphatic amines,
polyene antibiotics) as adjuvants for SRBC in the mouse. Evidence for a role of
cholesterol-binding in saponin adjuvanticity. Int. Arch. Allergy Appl. Immun.; 63, 179-l
77.
Bomford, R.; Stapleton, M.; Winsor, S.; McNight, A. e Andronova, T. (1992). The
control of the antibody isotype response to recombinant immunodeficiency virus gp120
antigen by adjuvants. AIDS Res. Hum. Retrovir.; 8, 1765-1771.
Bongiorno, G.; Paparcone, R.; Foglia Manzillo, V.; Oliva, G.; Cuisinier, A.M.; Gradoni,
L. (2013).Vaccination with LiESP/QA-21 (CaniLeish®) reduces the intensity of
infection inPhlebotomus perniciosus fed on Leishmania infantum infected dogs--a
preliminaryxenodiagnosis study. Vet Parasitol. Nov 8;197(3-4):691-5.
Borja-Cabrera, G.P.; Correia Pontes, N.N.; da Silva, V.O.; de Souza, E.P.; Santos,
W.R.; Gomes, E.M. et al (2002). Long lasting protection against canine kala-azar using
the FMLQuilA saponin vaccine in an endemic area of Brazil (São Gonçalo do
Amarante). Vaccine;20:3277–84.
Brazolot Millan, C.L.; Weeratna, R.; Krieg, A.M.; Siegrist, C.A.; Davis, H.L. (1998).
CpG DNA can induce strong Th1 humoral and cell-mediated immune responses against
hepatitis B surface antigen in young mice. Proc Natl Acad Sci USA;95:15553–8.
Britt, W.; Fay, J. e Kensil, C. (1995). Formulation of an immunogenic human
cytomegalovirus vaccine: response in mice. J. Infect. Dis.; 171, 18-25.
Cabral, M.; O'Grady, J.E.; Gomes, S.; Sousa, J.C.; Thompson, H.; Alexander, J. (1998).
The immunology of canine leishmaniosis: strong evidence for a developing disease
spectrum from asymptomatic dogs. Vet Parasitol. Apr 15;76(3):173-80.
Cândido, T.C.; Perri, S.H.V.; Gerzoschkwitz, T.; Luvizotto, M.C.; de Lima, V.M.
(2008). Comparative evaluation of enzyme-linked immunosorbent assay based on crude
and purified antigen in the diagnosis of canine visceral leishmaniasis in symptomatic
and oligosymptomatic dogs. Vet Parasitol. 157: 175–181.
Amorim, D.R. Referência Bibliográfica
49
Carrillo, E. et al. (2007). Immunogenicity of the P-8 amastigote antigen in the
experimental model of canine visceral leishmaniasis. Vaccine 25, 1534–1543.
Castilho, T.M.; Goldsmith-Pestana, K.; Lozano, C.; Valderrama, L.; Saravia, N.G. et al.
(2010). Murine model of chronic L. (Viannia) panamensis infection: role of IL-13 in
disease. Eur J Immunol.; 40:2816–2829.
Chamizo, C. et al. (2005). Semi-quantitative analysis of cytokine expression in
asymptomatic canine leishmaniasis. Vet. Immunol. Immunopathol. 103, 67–75.
Chang, K.P.; Dwyer, D.M. (1978). Hamster macrophage interactions in vitro: cell entry,
intracellular survival, and multiplication of amastigotes. J Exp Med.;147:515-30.
Chappuis, F.; Sundar, S.; Hailu, A.; Ghalib, H.; Rijal, S.; Peeling, R.W.; Alvar, J.;
Boelaert, M. (2007). Visceral leishmaniasis: what are the needs for diagnosis, treatment
and control?.Nat. Rev. Microbiol. v.5(11), 873-82.
Charest, H. e Matlashewski, G. (1994). Developmental gene expression in Leishmania
donovani: differential cloning and analysis of an amastigote-stage-specific gene. Mol
Cell Biol., v.14(5), p.2975–84.
Ciaramella, P.; Oliva, G.; Luna, R.D.; Gradoni, L.; Ambrosio, R.; Cortese, L. et
al.(1997). A retrospective clinical study of canine leishmaniasis in 150 dogs naturally
infected by Leishmania infantum. Vet Rec.;141:539-43.
Cleland, J.L; Kensil, C.R; Lim, A. et al. (1996). Isomerization and formulation stability
of the vaccine adjuvant QS-21. J. Pharm. Sci.; 85(1):22–28.
Coelho, E.A.; Ramírez, L.; Costa, M.A.; Coelho, V.T.; Martins, V.T.; Chávez-
Fumagalli, M.A. et al. (2009). Specific serodiagnosis of canine visceral leishmaniasis
using Leishmania species ribosomal protein extracts. Clin Vaccine Immunol. 16 (12):
1774-80.
Coelho, E.A.; Tavares, C.A.; Carvalho, F.A.; Chaves, K.F.; Teixeira, K.N.; Rodrigues,
R.C. et al. (2003). Immune responses induced by the Leishmania (Leishmania)
donovani A2 antigen, but not by the LACK antigen, are protective against experimental
Leishmania (Leishmania) amazonensis infection. Infect Immun;71:3988–94.
Cortada, V.M.; Doval, M.E.; Souza Lima, M.A.; Oshiro, E.T.; Meneses, C.R.; Abreu-
Silva, A.L.; Cupolilo, E.; Souza, C.S.; Cardoso, F.O.; Zaverucha do Valle, T.; Brazil,
R.P.; Calabrese, K.S.; Gonçalves da Costa, S.C. (2004). Canine visceral leishmaniosis
in Anastácio, Mato Grosso do Sul state, Brazil.Vet Res Commun. Jul;28(5):365-74.
Costa, N.; Peters N.C.; Maruyama, S.R. et al. (2011). Vaccines for the Leishmaniases:
Proposals for a Research Agenda. Plos Neg. Trop. Dis., v.943(5), p.1-9.
Coughlin, R.T.; Fish, D.; Mather, TN.; Ma, J.; Pavia, C. e Bulger, P. (1995). Protection
of dogs from Lyme disease with a vaccine containing outer surface protein (Osp)A,
OspB, and the saponin adjuvant QS21. J. Infect. Dis.; 171, 1049-l 052.
Amorim, D.R. Referência Bibliográfica
50
Courtenay, O.; Quinnell, R.J.; Garcez, L.M.; Shaw, J.J.; Dye, C. (2002). Infectiousness
of a cohort of Brazilian dogs: why culling fails to control visceral leishmaniasis in areas
of high transmission. J Infect Dis.;186:1314–20.
Croft, S.L. (2001). Monitoring drug resistance in leishmaniasis. Tropical Medicine and
International Health, v. 6, n. 2, p.899-905.
Cua, D.J., Tato; C.M. (2010). Innate IL-17-producing cells: the sentinels of the immune
system. Nat Rev Immunol. 2010; 10:479–489.
Cunha, A.M. e Chagas, E. (1937). Estudos sobre o parasito. In: Leishmaniose Visceral
Americana, nova entidade mórbida do homem na América do Sul. Mem. Inst. Oswaldo
Cruz, v.32, p.329-337.
Da Silva, R.A.A.; Tavares, N.M.; Costa, D.; Pitombo, M.; Barbosa, L.; Fukutani, K.;
Miranda, J.C.; de Oliveira, C.I.; Valenzuela, J.G.; Barral, A.; Soto, M.; Barral-Netto,
M.; Brodskynd, C. (2011). DNA vaccination with KMP11 and Lutzomyia longipalpis
salivary protein protects hamsters against visceral leishmaniasis. Acta Trop. December;
120(3): 185–190.
Da Silva, V.O.; Borja-Cabrera, G.P.; Correia Pontes, N.N.; de Souza, E.P.; Luz, K.G.;
Palatnik, M. et al. (2001). A phase III trial of efficacy of the FML-vaccine against
canine kalaazar in an endemic area of Brazil (São Gonc¸ alo do Amarante, RN).
Vaccine;19:1068–78.
Da Silva-Couto, L.; Ribeiro-Romaño, R.P.; Saavedra, A.F.; da Silva Costa Souza, B.L.;
Moreira, O.C. et al. (2015) Intranasal Vaccination with Leishmanial Antigens Protects
Golden Hamsters (Mesocricetus auratus) Against Leishmania (Viannia) braziliensis
Infection. PLoS Negl Trop Dis 9(1): e3439.
Daneshvar, H.; Molaei, M.M.; Kamiabi, H.; Burchmore, R.; Hagan, P.; Stephen
Phillips, R. (2010). “Gentamicin-attenuated Leishmania infantum: cellular immunity
production and protection of dogs against experimental canine leishmaniasis.” Parasite
Immunology, vol. 32, no. 11-12, pp. 722–730.
Daneshvar, H.; Sedghy, F.; Dabiri, S. et al. (2012). “Alteration in mononuclear cell
subpopulations in dogs immunized with gentamicin attenuated Leishmania infantum,”
Parasitology, vol. 139, no. 13, pp. 1689–1696.
Desjeux, P. (2004). Leishmaniasis: current situation and new perspectives. Com.
Immunol. Microbiol. Infect. Dis., v.27, p.305-318. Gradoni, 2001; MS, 2006.
Dey, A.K.; Srivastava, I.K. (2011). Novel adjuvants and delivery systems for enhancing
immune responses induced by immunogens. Expert Rev Vaccines;10:227–51.
Dickler, M.N.; Ragupathi, G.; Liu, N.X. et al (1999). Immunogenicity of a fucosyl-
GM1-keyhole limpet hemocyanin conjugate vaccine in patients with small cell lung
cancer. Clin. Cancer Res.; 5(10):2773–2779.
Amorim, D.R. Referência Bibliográfica
51
Douce, G.; Turcotte, C.; Cropley, I.; Roberts, M.; Pizza, M.; Domenghini, M. et al.
(1995). Mutants of Escherichia coli heat-labile toxin lacking ADP ribosyl-transferase
activity act as non-toxic mucosal adjuvants. Proc Natl Acad Sci USA;92: 1644–8.
Dye, C. (1996). The logic of visceral leishmaniasis control. Am J Trop Med Hyg;
55:125–30.
Eastcott, J.W.; Holmberg, C.J.; Dewhirst, F.E.; Esch, T.R.; Smith, D.J.; Taubman, M.A.
(2001). Oligonucleotide containing CpG motifs enhances immune response to ucosally
or systemically administered tetanus toxoid. Vaccine;19:1636–42.
Evans, T.G.; McElrath, M.J.; Matthews, T. et al.(2001). QS-21 promotes an adjuvant
effect allowing for reduced antigen dose during HIV-1 envelope subunit immunization
in humans. Vaccine.; 19(15–16):2080–2091.
Fernandes, A.P.; Costa, M.M.S.; Coelho, E.A.F.; Michalick, M.S.M.; Freitas, E.; Melo,
M.N. et al (2008). Protective immunity against challenge with Leishmania (Leishmania)
chagasi in beagle dogsvaccinated with recombinant A2 protein. Vaccine. 2008 Oct
29;26(46):5888-95.
Fiuza, J.A.; Santiago, H.D.C.; Selvapandiyan, A. et al. (2013). “Induction of
immunogenicity by live attenuated Leishmania donovani centrin deleted parasites in
dogs,” Vaccine, vol. 31, no. 14, pp. 1785–1792.
Gannavaram, S.; Dey, R.; Avishek, K.; Selvapandiyan, A.; Salotra, P.; Nakhasi, H.L.
(2014) Biomarkers of safety and immune protection for genetically modified live
attenuated Leishmania vaccines against visceral leishmaniasis – discovery and
implications. Front. Immunol. 5:241.
García, A.; De Sanctis, J.B. (2013). An overview of adjuvant formulations and delivery
systems. APMIS.
Garçon, N.; Vaughn, D.W.; Didierlaurent, A.M. (2012). Development and evaluation of
AS03, an Adjuvant System containing a-tocopherol and squalene in an oil-in-water
emulsion. Expert Rev Vaccines;11:349–66.
Garg, R. e Dube, A. (2006). Animal models for vaccine studies for visceral
leishmaniasis. Indian J. Med. Res., v.123, p.439-454.
Genaro, O. (1993a). Leishmaniose visceral canina experimental. Belo horizonte:
Instituto de Ciências Biológicas da UFMG, 1993a, 202 p. (Tese, Doutorado em
Parasitologia).
Genaro, O.; Lima, D.C.; Fernandes, A.D.; Reis, A.B.; Rotondo-Silva, A.; Hermeto,
M.V.; da Costa, C.A.; Mayrink, W. (1993b). Susceptibility of dogs to infection by
Leishmania naiffi, Leishmania guyanensis and Leishmania amazonensis.
Crossprotection studies. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 88:221, 1993b.
Amorim, D.R. Referência Bibliográfica
52
Genaro, O.; de Toledo, V.P.; da Costa, C.A.; Hermeto, M.V.; Afonso, L.C.; Mayrink,
W. (1996). Vaccine for prophylaxis and immunotherapy, Brazil. Clin Dermatol. Sep-
Oct;14(5):503-12.
Ghoreschi, K.; Laurence, A.; Yang, X.P; Tato, C.M.; McGeachy, M.J. et al (2010).
Generation of pathogenic TH17 cells in the absence of TGF-beta signalling. Nature.
467:967–971.
Ghosh, A.; Zhang, W.W.; Matlashewski, G. (2002). Immunization with A2 protein
results in a mixed Th1/Th2 and a humoral response which protects mice against
Leishmania donovani infections. Vaccine, v.20, p.59-66.
Gilewski, T.; Adluri, S.; Ragupathi, G. et al.(2000). Vaccination of high-risk breast
cancer patients with mucin-1 (MUC1) keyhole limpet hemocyanin conjugate plus QS-
21. Clin. Cancer Res.; 6(5): 1693–1701.
Gilewski, T.; Ragupathi, G.; Bhuta, S. et al (2001). Immunization of metastatic breast
cancer patients with a fully synthetic globo H conjugate: a Phase I trial. Proc. Natl
Acad. Sci. USA.; 98(6):3270– 3275.
Gilewski, T.A.; Ragupathi, G.; Dickler, M. et al (2007). Immunization of high-risk
breast cancer patients with clustered sTn-KLH conjugate plus the immunologic
adjuvant QS-21. Clin. Cancer Res.; 13(10):2977–2985.
Giunchetti, R.C. et al. (2006). Relationship between canine visceral leishmaniosis and
the Leishmania (Leishmania) chagasi burden in dermal inflammatory foci. J. Comp.
Pathol. 135, 100–107.
Giunchetti, R.C.; Correa-Oliveira, R.; Martins-Filho, O.; Teixeira-Carvalho, A.; Roatt,
B.M.; Aguiar-Soares, R.D.O.; Vitoriano-Souza, J.; Moreira, N.D.; Malaquias, L.C.;
Castro, L.L.M.; Lana, M.; Reis, A.B. (2007). Immunogenicity of a killed Leishmania
vaccine with saponin adjuvant in dogs. Vaccine, v.25(44), p.7674-86.
Giunchetti, R.C.; Corrêa-Oliveira, R.; Martins-Filho, O.A.; Teixeira-Carvalho, A.;
Roatt, B.M.; Aguiar-Soares, R.D.O.; Coura-Vital, W.; Abreu, R.T.; Malaquias, L.C.;
Gontijo, N.F.; Brodskyn, C.; Oliveira, C.I.; Costa, D.J.; Lana, M.; Reis, A.B. (2008b). A
killed Leishmania vaccine with sand fly saliva extract and saponin adjuvant displays
immunogenicity in dogs. Vaccine, v.26(5), p.623-638.
Giunchetti, R.C.; Coura-Vital, W.; Roatt, B.M; Aguiar-Soares, R.D.O.; Vitoriano-de-
Souza, J.; Moreira, N.D.; Resende, L.A.; Viana, K.F.; Mendonça, L.Z.; Reis, A.B. et al.
(2013). Biomarkers for canine visceral leishmaniasis and their employment in vaccines.
Rev. Bras. Med. Trop. Aceito para publicação.
Giunchetti, R.C.; Reis, A.B.; Silveira-Lemos, D.; Martins-Filho, O.A.; Corrêa-Oliveira,
R.; Bethony, J.; Vale, A.M.; Quetz, J.; Bueno, L.L.; França-Silva, J.C.; Nascimento, E.;
Mayrink, W.; Fujiwara, R.T. (2008a). Antigenicity of a whole parasite vaccine as
promising candidate against canine leishmaniasis. Rev. Vet. Sci., v 85(1), p.106-112.
Amorim, D.R. Referência Bibliográfica
53
Gomes, R.; Teixeira, C.;Teixeira, M.J.; Oliveira, F.; Menezes M.J.; Silva, C. et al
(2008). Immunity to a salivary protein of a sandfly vector protects against the fatal
outcome of visceral leishmaniasis in a hamster model. ProcNatlAcadSciUSA
105(22):7845–50.
Gomes-Silva, A.; Valverde, J.G.; Ribeiro-Romão, R.P.; Plácido-Pereira, R.M.; Da-Cruz
A.M. (2013). Golden hamster (Mesocricetus auratus) as an experimental model for
Leishmania (Viannia) braziliensis infection. Parasitology. May;140(6):771-9.
Goto, H.; Prianti, M.G. (2009). Immunoactivation and immunopathogeny during active
visceral leishmaniasis. Rev Inst Med Trop Sao Paulo.;51:241-6.
Gradoni, L. (2001). An update on antileishmanial vaccine candidates and prospects for a
canine Leishmania vaccine.Vet Parasitol. Sep 12;100(1-2):87-103.
Gradoni, L. (2015). Canine Leishmania vaccines: still a long way to go. Vet Parasitol.
Feb 28;208(1-2):94-100.
Gramiccia, M. (2011). Recent advances in leishmaniosis in pet animals: epidemiology,
diagnostics and anti-vectorial prophylaxis.Vet Parasitol. Sep 8;181(1):23-30.
Grenfell, R.F.Q.; Marques-da-Silva, E.A.; Souza-Testasicca, M.C.; Coelho, E.A.F.;
Fernandes, A.P.; Afonso, L.C.C.; Rezende, S.A. (2010). Antigenic extracts of
Leishmania braziliensis and Leishmania amazonensis associated with saponin partially
protects BALB/c mice against Leishmania chagasi infection by suppressing IL-10 and
IL-4 production. Mem. Inst. Oswaldo Cruz vol.105 no.6 Rio de Janeiro.
Guedes, H.L.M.; Pinheiro, R.O.; Chaves, S.P.; De-Simone, S.G.; Rossi-Bergmanna, B.
(2010). Serine proteases of Leishmania amazonensis as immunomodulatory and
disease-aggravating components of the crude LaAg vaccine. Vaccine 28 5491–5496
Gupta, S.; Nishi. (2011). Visceral leishmaniasis: experimental models for drug
discovery. Indian J Med Res.;133:27-39.
Gupta, S.K, Sisodia, B.S.; Sinha, S.; Hajela, K.; Naik, S.; Shasany, A.K. and Dube, A.
(2007). Proteomic approach for identification and characterizationof novel
immunostimulatory proteins from solubleantigens of Leishmania donovani
promastigotes. Proteomics 7, 816–823.
Harhay, M.O.; Olliaro, P.L.; Costa, D.L.; Nery-Costa, C.H. (2011). Urban parasitology:
visceral leishmaniasis in Brazil. Trends in Parasitology, v.27(9), p.403-409.
Heath, A.W. (1995). Cytokines as immunological adjuvants. Pharm Biotechnol;6:645–
58.
Hem, S.L. e Hogen, E.H. (2007). Aluminium-containing adjuvants: properties,
formulation and use. In: Singh M editor. Vaccine Adjuvants and Delivery Systems.
Hoboken, NJ: John Wiley e Sons: 81–114.
Amorim, D.R. Referência Bibliográfica
54
Hirota, K.; Duarte, J.H.; Veldhoen, M.; Homsby, E.; Li, Y. et al. (2011). Fate mapping
of IL-17-producing T cells in inflammatory responses. NatImmunol.; 12:255–263.
Hornung, V.; Bauernfeind, F.; Halle, A.; Samstad, E.O.; Kono, H.; Rock, K.L. et
al.(2008). Silica crystals and aluminum salts activate the NALP3 inflammasome
through phagosomal destabilization. Nature Immunol 2008;9:847–56.
Jackson, L.A. e Opdebeeck, J.P. (1995). The effect of various adjuvants on the humoral
response of sheep and cattle to soluble and membrane midgut antigens of Boophitus
microplus. Vet. Parasit.; 56, 129-141.
Jurk, M.; Vollmer, J. (2007). Therapeutic applications of synthetic CpG oligodeoxy
nucleotides as TLR9 agonists for immune modulation. Bio Drugs;21:387–401.
Kashala, O.; Amador, R.; Valero, M.V. et al.(2002). Safety, tolerability and
immunogenicity of new formulations of the Plasmodium falciparum malaria peptide
vaccine SPf66 combined with the immunological adjuvant QS-21. Vaccine.; 20(17–
18):2263–2277.
Kashino, S.S.; Abeijon, C.; Qin, L.; Kanunfre, K.A.; Kubrusly, F.S.; Silva, F.O.; Costa,
D.L.; Campos, D. Jr.; Costa, C.H.; Raw, I.; Campos-Neto, A. (2012). Identification of
Leishmania infantum chagasi proteins in urine of patients with visceral leishmaniasis: a
promising antigen discovery approach of vaccine candidates. Parasite Immunol.
Jul;34(7):360-71.
Kensil, C.R.; Patel, U.; Lennick, M.; Marciani, D. (1991). Separation and
characterization of saponins with adjuvant activity from Quillaja saponaria Molina
cortex. J. Immunol.; 146 (2):431-437. Reports a series of saponin adjuvant (QS-7, QS-
17, QS-18 and QS-21) purification from Quillaja saponaria Molina bark by reverse-
phase chromatography and their adjuvant activities.
Khan, LA.; Ely, K.H. e Kasper, L.H. (1991). A purified parasite antigen (~30) mediates
CD8+ T cell immunity against fatal Toxoplasma gondii infection in mice. J. Immunol.;
147, 3501-3506.
Kovarik, J.; Bozzotti, P.; Love-Homan, L.; Pihlgren, M.; Davis, H.L.; Lambert, P.H. et
al.(1999). CpG oligodeoxynucleotides can circumvent the Th2 polarization of neonatal
responses to vaccines but may fail to fully redirect Th2 responses established by
neonatal priming. J Immunol;162:1611–7.
Krug, L.M.; Ragupathi, G.; Hood, C. et al.(2004). Vaccination of patients with small-
cell lung cancer with synthetic fucosyl GM-1 conjugated to keyhole limpet hemocyanin.
Clin. Cancer Res.; 10(18 Pt 1):6094–6100. (a)
Krug, L.M.; Ragupathi, G.; Ng, K.K. et al. (2004). Vaccination of small cell lung
cancer patients with polysialic acid or N-propionylated polysialic acid conjugated to
keyhole limpet hemocyanin. Clin. Cancer Res.; 10(3):916–923. (b)
Amorim, D.R. Referência Bibliográfica
55
Kumari, S. et al. (2008). Proteomic approaches for discovery of new targets for vaccine
and therapeutics against visceral leishmaniasis. Proteomics - Clinical Applications,v.
2,n. 3, p. 372–386.
Kumari, S., Misra; P., Tandon, R.; Samant, M.; Sundar, S.; Dube, A. (2012).
Leishmania donovani : Immunostimulatory Cellular Responses of Membrane and
Soluble Protein Fractions of Splenic Amastigotes in Cured Patient and Hamsters. PLoS
ONE 7(1): e30746.
Kumari, S.; Kumar, A.; Samant, M.; Singh, N.; Dube, A. (2008). Discovery of novel
vaccine candidates and drug targets against visceral leishmaniasis using proteomics and
transcriptomics. Curr Drug Targets. Nov;9(11):938-47
Kumari, S.; Samant, M.; Khare, P.; Misra, P.; Dutta, S.; Kolli, B.K.; Sharma, S.; Chang,
K.P. and Dube, A. (2009). Photodynamic vaccination of hamsters with inducible
suicidal mutants of Leishmania amazonensis elicits immunity against visceral
leishmaniasis. Eur. J. Immunol. 2009. 39: 178–191.
Kushawaha, P.K.; Gupta, R.; Sundar, S.; Sahasrabuddhe, A.A.; Dube, A. (2011).
Elongation factor-2, a Th1 stimulatory protein of Leishmania donovani, generates
strong IFN-γ and IL-12 response in cured Leishmania-infected patients/hamsters and
protects hamsters against Leishmania challenge. J Immunol. Dec 15;187(12):6417-27.
Kushawaha, P.K.;, Gupta, R.; Tripathi, C.D.; Khare, P.; Jaiswal, A.K.; Sundar, S.;
Dube, A. (2012). Leishmania donovani triose phosphate isomerase: a potential vaccine
target against visceral leishmaniasis. PLoS One.;7(9):e45766.
Lage, R.S.; Oliveira, G.C.; Busek, S.U.; Guerra, L.L.; Giunchetti, R.C; Corrêa-Oliveira,
R.; Reis, A.B. (2007). Analysis of the cytokine profile in spleen cells from dogs
naturally infected by Leishmania chagasi. Veterinary Immunology and
Immunopathology Volume 115, Issues 1–2, 15 January 2007, Pages 135–145.
Lainson, R e Shaw, J.J. (1987). Evolution, classification and geographical distribuition.
In: Peters, Killick-Dendrick. The Leishmaniasis in Biology and Medicine; London,
Academic Press, v.1, p.1-20.
Lapchik, V.B.V.; Mattaraia, V.G. de M.; Ko, G.M. (2009).Cuidados e manejos de
animais de laboratório.
Laveran, A. e Mesnil, F. (1903). Sur um protozaire nouveau (Piroplasma donovani Lav.
e Mesn.). Parasite d` une fièvrew de I’Inde. Comp. R. Hébd. Séanc. Acad. Sci., v.137,
p.957-961.Leishma News. (2011). Disponível em:
http://www.ruminal.com.ar/sites/default/files/vet%20brochure.pdf. Acesso em:
27/01/15.
López-Céspedes, A.; Longoni, S.S.; Sauri-Arceo, C.H.; Sánchez-Moreno, M.;
Rodríguez-Vivas, R.I.; Escobedo-Ortegón, F.J.; Barrera-Pérez, M.A.; Bolio-González,
M.E.; Marín, C. (2012). Leishmania spp. epidemiology of canine leishmaniasis in the
Yucatan Peninsula. ScientificWorldJournal. 2012;2012:945871.
Amorim, D.R. Referência Bibliográfica
56
Loría-Cervera, E.N.; Andrade-Narváez, F.J. (2014). Animal models for the study of
leishmaniasis immunology. Rev Inst Med Trop Sao Paulo. 2014 Jan- Feb;56(1):1-11.
Lutz, A. e Neiva, A. (1912). Contribuição para o conhecimento das espécies do gênero
Phlebotomus existentes no Brasil. Mem. Inst. O. Cruz, 4:84-95.
Maia-Elkhoury, A.N.; Alves, W.A.; Sousa-Gomes, M.L.; Sena, J.M.; Luna, E.A. (2008)
Visceral leishmaniasis in Brazil: trends and challenges. Cad Saud Publica;24:2941–7.
Mancianti, F.; Gradoni, L.; Gramiccia, M.; Pieri, S.; Marconcini A. (1986). Canine
leishmaniasis in the Isle of Elba, Italy. Trop Med Parasitol. Jun;37(2):110-2.
Manna, L. et al. (2006). Leishmania DNA load and cytokine expression levels in
asymptomatic naturally infected dogs. Vet. Parasitol. 142, 271–280.
Martin, R.S.; Briones, R.(2000). Quality control of commercial Quillaja (Quillaja
saponaria Molina) extracts by reverse phase HPLC. J. Sci. Food Agriculture. ; 80:2063–
2068.
Martin, V.; Vouldoukis, I.; Moreno, J.; McGahie, D.; Gueguen, S.; Cuisinier, A.M.
(2014). Theprotective immune response produced in dogs after primary vaccination
with theLiESP/QA-21 vaccine (CaniLeish®) remains effective against an experimental
challenge one year later. Vet Res. Jun 25;45:69.
Martinez, J.E.; Valderrama, L.; Gama, V.; Leiby, D.A.; Saravia, N.G. (2000). Clonal
diversity in the expression and stability of the metastatic capability of Leishmania
guyanensis in the golden hamster. J Parasitol. 2000; 86:792–799.
Maurício, I.L.; Stothard, J.R.; Miles, M.A. (2000). The strange case of Leishmania
chagasi. Parasitology Today, v.16(5), p.188-189.
Mayrink, W.; da Costa, C.A.; Magalhães, P.A.; Melo, M.N.; Dias, M.; Lima, A.O.;
Michalick, M.S.; Williams, P. (1979). A field trial of a vaccine against American
dermal leishmaniasis.Trans R Soc Trop Med Hyg.73(4):385-7.
Mayrink, W.; Williams, P.; da Costa, C.A.; Magalhães, P.A.; Melo, M.N.; Dias, M.;
Oliveira Lima, A.; Michalick, M.S.; Ferreira Carvalho, E.; Barros, G.C.et al.(1985). An
experimental vaccine against American dermal leishmaniasis: experience in the State of
Espírito Santo, Brazil. Ann Trop Med Parasitol. Jun;79(3):259-69.
Mayrink, W.; Antunes, C.M.; Da Costa, C.A.; Melo, M.N.; Dias, M.; Michalick, M.S.;
Magalhães, P.A.; De Oliveira Lima, A.; Williams, P. (1986). Further trials of a vaccine
against American cutaneous leishmaniasis. Trans R Soc Trop Med Hyg. 80(6):1001.
Mayrink W, Genaro O, Dias M, da Costa CA, Michalick MS, Melo MN, Williams P, da
Costa RT, Nascimento E, Oliveira Lima A. (1990). Vaccination of dogs against
Leishmania (Viannia) braziliensis. Rev Inst Med Trop Sao Paulo. Jan-Feb;32(1):67-9.
Amorim, D.R. Referência Bibliográfica
57
Mayrink, W.; Genaro, O.; Silva, J.C.; da Costa, R.T.; Tafuri, W.L.; Toledo, V.P.; da
Silva, A.R.; Reis, A.B.; Williams, P.; da Costa, P.W. (1996). Phase I and II open
clinical trials of a vaccine against Leishmania chagasi infections in dogs. Mem. Inst.
Oswaldo Cruz, v.91, p.695-697, 1996.
Mc Cluskie, M.J.; Davis, H.L. (1998). CpG DNA is a potent enhancer of systemic and
mucosal immune responses against hepatitis B surface antigen with intranasal
administration to mice. J Immunol;161:4463–6.
McElrath, M.J. (1995) Selection of potent immunological adjuvants for vaccine
construction. Semin Cancer Biol;6:375–85.
McFarlane, E.; Perez, C.; Charmoy, M.; Allenbach, C.; Carter, K.C. et al. (2008)
Neutrophils contribute to development of a protective immune response during onset of
infection with Leishmania donovani. Infect Immun.; 76:532–541.
Melby, P.C.; Chandrasekar, B.; Zhao, W.; Coe, J.E. (2001). The hamster as a model of
human visceral leishmaniasis: progressive disease and impaired generation of nitric
oxide in the face of a prominent Th1-like cytokine response. J Immunol.;166:1912-20.
Melo, M.N.; Mayrink, W.; da Costa, C.A.; Magalhaes, P.A.; Dias, M.; Williams, P.;
Araujo, F.G.; Coelho, M.V.; Batista, S.M. (1977). Standardization of the Montenegro
antigen. Rev Inst Med Trop Sao Paulo. May-Jun;19(3):161-4.
Mendonça, C.A. (2011). Avaliação da proteção da vacina LBSapSal contra
leishmaniose Visceral Canina, frente ao desafio intradérmico experimental com
Leishmania chagasi e extrato de glândula salivar de Lutzomyia longipalpis (Dissertação
de Mestrado em Ciências Farmacêuticas). Ouro Preto: Escola de Farmácia da
Universidade Federal de Ouro Preto, 87p.
Mendonca, S.C.; De Luca, P.M.; Mayrink, W.; Restom, T.G.; Conceicao-Silva, F.; Da-
Cruz, A.M.; Bertho, A.L.; Da Costa, C.A.; Genaro, O.; Toledo, V.P. et al.(1995).
Characterization of human T lymphocyte-mediated immune responses induced by a
vaccine against American tegumentary leishmaniasis.Am J Trop Med Hyg.
Aug;53(2):195-201.
Menezes-Souza, D. et al. (2011). Cytokine and transcription factor profiles in the skin
of dogs naturally infected by Leishmania (Leishmania) chagasi and presenting distinct
skin parasite density and clinical status. Vet. Parasitol.
Menezes-Souza, D.; Guerra-Sá, R.; Carneiro, C.M.; Vitoriano-Souza, J.; Giunchetti,
R.C. et al. (2012) Higher Expression of CCL2, CCL4, CCL5, CCL21, and CXCL8
Chemokines in the Skin Associated with Parasite Density in Canine Visceral
Leishmaniasis. PLoS Negl Trop Dis 6(4): e1566.
Messina, J.P.; Gilkeson, G.S.; Pisetsky, D.S. (1991). Stimulation of in vitro murine
lymphocyte proliferation by bacterial DNA. J Immunol;147: 1759–64.
Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, Brasil. Instrução Normativa
Interministerial n◦ 31. Regulamento Técnico para Pesquisa, Desenvolvimento,
Amorim, D.R. Referência Bibliográfica
58
Produção, Avaliação, Registro e Renovação de Licenças, Comercialização e Uso de
Vacina Contra a Leishmaniose Visceral Canina.
http://sistemasweb.agricultura.gov.br/sislegis/action/detalhaAto.do?method=visualizarA
toPortalMapa&chave=815005048 (accessed: 06.06. 11).
Ministério da Saúde, Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, Instrução
normativa interministerial no. 31, 2009, M.A.P.A.; Brasil, Nota de Esclarecimento
sobre as Vacinas Antileishmaniose Visceral Canina registradas no M.A.P.A.,
http://www.agricultura.gov.br/arq editor/file/Aniamal/ Registros Atorizacoes/Produtos
veterinarios/Comunicacoes e instrucoes tecnicas/Nota de esclarecimento sobre a
vacina.pdf (accessed: 07.01.14).
Ministério da Saúde. (2006). Manual de Vigilância e Controle da Leishmaniose
Visceral. Brasília-DF. 1º edição. 122p.
Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde, Brasil. Nota técnica vacina
anti-leishmaniose visceral canina Leishmune®.
http://www.agricultura.gov.br/arq_editor/file/Produtos%20Veterin%C3%A1rios/NOTA
%20TECNICA%20DFIP%2038-14%20LEISHMUNE.pdf. Acessado em: 31.08.15.
Mohammadiha, A.; Haghighi, A.; Mohebali, M.; Mahdian, R.; Abadi, A.R.; Zarei, Z.;
Yeganeh, F.; Kazemi, B.; Taghipour, N.; Akhoundi, B.; Barati, M.; Mahmoudi, M.R.
(2013). Canine visceral leishmaniasis: a comparative study of real-time PCR,
conventional PCR, and direct agglutination on sera for the detection of Leishmania
infantum infection.Vet Parasitol. Feb 18;192(1-3):83-90.
Moldoveanu, Z.; Clements, M.L.; Prince, S.J.; Murphy, B.R.; Mestecky, J. (1995).
Human immune responses to influenza virus vaccines administered by systemic or
mucosal routes. Vaccine;13:1006–12.
Mookerjee, A.; Sen, P.C.; Ghose, A.C. (2003). Immunosuppression in hamsters with
progressive visceral leishmaniasis is associated with an impairment of protein kinase C
activity in their lymphocytes that can be partially reversed by okadaic acid or anti-
transforming growth factor β antibody. Infect Immun.;71:2439-46.
Moreira, N.D.; Giunchetti, R.C.; Carneiro, C.M.; Vitoriano-Souza, J.; Roatt, B.M.;
Malaquias, L.C.; Corrêa-Oliveira, R.; Reis, A.B. (2009). Histological study of cell
migration in the dermis of hamsters after immunisation with two different vaccines
against visceral leishmaniasis. Vet. Immunol. Immunopathol., v.128(4), p.418-424.
Moreira, N.D.; Vitoriano-Souza, J.; Roatt, B.M.; Vieira, P.MdA.; Ker, H.G. et al.
(2012). Parasite Burden in Hamsters Infected with Two Different Strains of Leishmania
(Leishmania) infantum: ‘‘Leishman Donovan Units’’ versus Real-Time PCR. PLoS
ONE 7(10): e47907.
Morel, S.; Didierlaurent, A.; Bourguignon, P.; Delhaye, S.; Baras, B.; Jacob, V. et al
(2011). Adjuvant System AS03 containing a-tocopherol modulates innate immune
response and leads to improved adaptive immunity. Vaccine;29:2461–73.
Amorim, D.R. Referência Bibliográfica
59
Moreno, J. e Alvar J. (2002) Canine leishmaniasis: epidemiological risk and the
experimental model. Trends Parasitol. Sep;18(9):399-405.
Moshfe, A.; Mohebali, M.; Edrissian, G.; Zarei, Z.; Akhoundi, B.; Kazemi; B.;
Jamshidi, S.; Mahmoodi, M. (2009). Canine visceral leishmaniasis: asymptomatic
infected dogs as a source of L. infantum infection.Acta Trop. Nov;112(2):101-5. doi:
10.1016/j.actatropica.2009.07.004. Epub 2009 Jul 10.
Motta, C.B. (2011). Emprego de Diferentes Metodologias Diagnósticas na Avaliação da
Proteção da Vacina LBSap contra Leishmaniose Visceral Canina frente ao desafio
experimental intradérmico com Promastigotas de Leishmania (Leishmania) infantum e
extrato de Glândulas Salivares de Lutzomyia longipalpis (Dissertação de Mestrado em
Ciências Farmacêuticas). Ouro Preto: Escola de Farmácia da Universidade Federal de
Ouro Preto, 79p.
Murray, H.W.; Nathan, C.F. (1999). Macrophage microbicidal mechanisms in vivo:
reactive nitrogen versus oxygen intermediates in the killing of intracellular visceral
Leishmania donovani. J Exp Med.; 189:741–746.
Nicolle, C.H. (1908). Culture des corps de Leishman isoles de La rate dans trois cãs
d’anemic sptenique infantile. Bull. Soc. Pathol. Exot., v.1, p.121.
Nieto, A., Domínguez-Bernal, G., Orden, J. A., De La Fuente, R., Madrid-Elena, N., e
Carrión, J. (2011). Mechanisms of resistance and susceptibility to experimental visceral
leishmaniosis: BALB/c mouse versus syrian hamster model. Veterinary Research,
42(1), 39.
Noazin, S.; Modabber, F.; Khamesipour, A. et al. (2008). “First generation
leishmaniasis vaccines: a review of field efficacy trials,” Vaccine, vol. 26, no. 52, pp.
6759–6767.
O’Hagan, D. T. e Valiante, N. M. (2003). Recent advances in the discovery and delivery
of vaccine adjuvants. Nat. Rev. Drug Discov. 2, 727-735
Oliva, G.; Nieto, J.; Foglia Manzillo, V.; Cappiello, S.; Fiorentino, E.; Di Muccio, T.;
Scalone, A.; Moreno, J.; Chicharro, C.; Carrillo, E.; Butaud, T.; Guegand, L.; Martin,
V.; Cuisinier, A.M.; McGahie, D.; Gueguen, S.; Cañavate, C.; Gradoni, L. (2014). A
randomised,double-blind, controlled efficacy trial of the LiESP/QA-21 vaccine in naïve
dogs exposed to two leishmania infantum transmission seasons. PLoS Negl Trop Dis.
Oct 9;8(10):e3213.
Osorio, E.Y.; Zhao, W.; Espitia, C.;Saldarriaga, O.; Hawel, L. et al (2012). Progressive
visceral leishmaniasis is driven by dominant parasite-induced STAT6 activation and
STAT6-dependent host arginase 1 expression. PLoS Pathog.; 8:e1002417.
Palatnik de Sousa, C.B. (2008). Vaccines for leishmaniasis in the fore coming 25 years.
Vaccine. 2008 Mar 25;26(14):1709-24.
Amorim, D.R. Referência Bibliográfica
60
Palatnik de Sousa, C.B.; Bunn Moreno, M.M.; Paraguai de Souza, E. e Borojevic, R.
(1994). Vaccination with the FML antigen (fucose mannose ligand) of Leishmania
donovani protects hamsters from experimental visceral leishmaniasis. J. Braz. Sot. Adv.
Sci. Cickcia e Cultura; 46, 290-296.
Palatnik de Sousa, C.B.; Paraguai de Souza, E.; Gomes, E.M. e Borojevic, R. (1994).
Experimental murine Leishmania donovani infection: immunoprotection by the fucose
mannose ligand (FML). Braz. J. Med. Biol. Res.; 27, 547-551.
Pali-Schöll, I.; Szöllösi, H.; Starkl, P.; Scheicher, B.; Stremnitzer, C.; Hofmeister, A. et
al.(2013). Protamine nanoparticles with CpG-oligodeoxynucleotide prevent an allergen-
induced Th2-response in BALB/c mice. Eur J Pharm Biopharm.
Parra, L.E.; Borja-Cabrera, G.P.; Santos, F.N.; Sousa, L.O.; Palatnik-de-Sousa, C.B.;
Menz, I. (2007). Safety trial using the Leishmune® vaccine against canine visceral
leishmaniasis in Brazil. Vaccine;25:2180–6.
Paun, A.; Bankoti, R.; Joshi, T.; Pitha, P.M.; Stager, S. (2011). Critical role of IRF-5 in
the development of T helper 1 responses to Leishmania donovani infection. PLoS
Pathog.; 7:e1001246.
Perera, P.Y.; Lichy, J.H.; Waldmann, T.A.; Perera, L.P. (2012). The role of interleukin-
15 in inflammation and immune responses to infection: implications for its therapeutic
use. Microbes Infect;14: 247–61.
Perez, L.E.; Chandrasekar, B.; Saldarriaga, O.A.; Zhao, W.; Arteaga, L.T.; Travi, B.L.
et al. (2006). Reduced nitric oxide synthase 2 (NOS2) promoter activity in the Syrian
hamster renders the animal functionally deficient in NOS2 activity and unable to control
an intracellular pathogen. J Immunol.;176:5519-28.
PHAO – Pan American Health Organization. (2013). Disponível em:
http://www.paho.org/hq/index.php?option=com_docman&task=doc_view&gid=21608
&Itemid=. Acesso em : 27/01/15.
Pinheiro, P.H.; Pinheiro, A.N.; Ferreira, J.H.L.; Costa, F.A.; Katz, S.; Barbiéri, C.L.
(2009). A recombinant cysteine proteinase from Leishmania (Leishmania) chagasi as an
antigen for delayed-type hypersensitivity assays and serodiagnosis of canine visceral
leishmaniasis. Vet Parasitol.162:32–39.
Podda, A.; Del Giudice, G. (2003). Mf59-adjuvanted vaccines: increased
immunogenicity with an optimal safety profile. Expert Rev Vaccines;2: 197–203.
Portal Brasil. (2014). Disponível em: http://www.brasil.gov.br/ciencia-e-
tecnologia/2014/06/vacina-brasileira-podera-ser-comercializada-na-europa .Acesso em:
27/01/15.
Powell, M.F.; Cleland, J.L. and Eastman, D.J. et al. (1994). Immunogenicity and HIV-1
virus neutralization of MN recombinant glycoprotein 120/HIV-1 QS21 vaccine in
baboons. AlDS Res. Hum. Retrovir; 10, S105-108.
Amorim, D.R. Referência Bibliográfica
61
Ragupathi, G.; Gardner, J.R.; Livingston, P.O. e Gin, D.Y. (2011). Natural and
synthetic saponin adjuvant QS-21 for vaccines against cancer. Expert Rev Vaccines.
April; 10(4): 463–470.
Rajput, Z. I.; Hu, S. H.; Xiao, C. W. e Arijo, A. G. (2007). Adjuvant effects of saponins
on animal immune responses. J. Zhejiang. Univ Sci. B 8, 153-161.
Ready, P.D. (2014) Epidemiology of visceral leishmaniasis. Clinical Epidemiology.
[Disease Control Department, Faculty of Infectious and Tropical Diseases, London
School of Hygiene and Tropical Medicine, London, UK].
Reis, A.B. et al. (2006). Phenotypic features of circulating leucocytes as immunological
markers for clinical status and bone marrow parasite density in dogs naturally infected
by Leishmania chagasi. Clin. Exp. Immunol. 146, 303–311.
Reis, A.B. et al. (2009). Systemic and compartmentalized immune response in canine
visceral leishmaniasis. Vet. Immunol. Immunopathol. 128, 87–95.
Resende, L.A. (2011). Perfil de Citocinas e Níveis de Óxido Nítrico em Cães Vacinados
com os Imunobiológicos LBSap e LBSapSal e Submetidos ao Desafio Experimental
com Leishmania (Leishmania) chagasi e saliva de Lutzomyia longipalpis. (Dissertação
de Mestrado em Biotecnologia). Ouro Preto: Núcleo de Pesquisas em Ciências
Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, 106p.
Resende, L.A.;, Roatt, B.M.; Aguiar-Soares, R.D.; Viana, K.F.; Mendonça, L.Z.; Lanna,
M.F.; Silveira-Lemos, D.; Corrêa-Oliveira, R.; Martins-Filho, O.A.; Fujiwara, R.T.;
Carneiro, C.M.; Reis, A.B.; Giunchetti, R.C. (2013). Cytokine and nitric oxide patterns
in dogs immunized with LBSap vaccine, before and after experimental challenge with
Leishmania chagasi plus saliva of Lutzomyia longipalpis. Vet Parasitol. Dec 6;198(3-
4):371-81.
Roatt, B.M. (2010). Imunogenicidade e Eficácia da Vacina LBSap em Cães Após
Desafio Intradérmico com Leishmania (Leishmania) chagasi e Extrato de Glândula
Salivar de Lutzomyia longipalpis. (Dissertação de mestrado em Ciências Biológicas).
Ouro Preto: Instituto de Ciências Exatas e Biológicas da Universidade Federal de Ouro
Preto, 131p.
Roatt, B.M.; Aguiar-Soares, R.D.O.; Vitoriano-Souza, J.; Coura-Vital, W. et al (2012).
Performance of LBSap Vaccine after Intradermal Challenge with L. infantum and Saliva
of Lu. longipalpis: Immunogenicity and Parasitological Evaluation. Plos One, v.7(11),
p.1-12.
Roatt, B.M.; Aguiar-Soares, R.D.; Coura-Vital, W.; Ker, H.G.; Moreira, N.D.,
Vitoriano-Souza, J.; Giunchetti, R.C.; Carneiro, C.M.; Reis, A.B. (2014).
Immunotherapy and Immunochemoterapy in Visceral Leishmaniasis: Promising
Treatments for this Neglected Disease. Front Immunol. Jan 13; 5:272.
Rodrigues Júnior, V.; Da Silva, J.S.; Campos-Neto, A. (1992). Selective inability of
spleen antigen presenting cells from Leishmania donovani infected hamsters to mediate
specific T cell proliferation to parasite antigens. Parasite Immunol.;14:49-58.
Amorim, D.R. Referência Bibliográfica
62
Rogers, M.E.; Ilg, T., Nikolaev, A.V.; Ferguson, M.A.; Bates, P.A. (2004)
Transmissionof cutaneous leishmaniasis by sand flies is enhanced by regurgitation of
fPPG. Nature; 430:463–7.
Sabbatini, P.J.; Ragupathi, G.; Hood, C. et al. (2007). Pilot study of a heptavalent
vaccine-keyhole limpet hemocyanin conjugate plus QS21 in patients with epithelial
ovarian, fallopian tube, or peritoneal cancer. Clin. Cancer Res.; 13(14):4170–4177.
Santarém, N.; Silvestre, R.; Cardoso, L.; Schallig, H.; Reed, S.G. et al. (2010).
Application of an improved enzyme-linked immunosorbent assay method for
serological diagnosis of canine leishmaniasis. J Clin Microbiol. 48(5):1866-74.
Santos, W.R.; Bernardo, R.R.; Pecanha, L.M.; Palatnik, M.; Parente, J.P.; Palatnik de
Sousa, C.B. (1997).Haemolytic activities of plant saponins and adjuvants. Effect of
Periandra mediterranea saponin on the humoral response to the FML antigen of
Leishmania donovani. Vaccine15 : 1024-9.
Santos, W.R.; Lima, V.M.F.; Souza, E.P. (2002). Saponins, IL12 and BCG adjuvant in the
FML-vaccine formulation against murine visceral leishmaniasis. Vaccine, v.21, p.30-43.
Saraiva, E.M.; Figueiredo, B.A.; Santos, F.N.; Borja-Cabrera, G.P.; Nico, D.; Souza,
L.O. et al.(2006). The FML-vaccine (Leishmune®) against canine visceral
leishmaniasis: a transmission blocking vaccine. Vaccine;24:2423–31.
Selvapandiyan, A.; Dey, R.; Nylen, S.; Duncan, R.; Sacks, D.; Nakhasi, H. L. (2009).
“Intracellular replication-deficient Leishmania donovani induces long lasting protective
immunity against visceral leishmaniasis”. The Journal of Immunology, vol. 183, no. 3,
pp. 1813–1820.
Sevinc, F.; Guler, L.; Sevinc, M.; Ekici, O.D.; Isik, N. (2013). Determination of
immunoreactive proteins of Babesia ovis. Vet Parasitol.198(3-4):391-5.
Sherlock, I.A. (1996). Ecological interactions of visceral leishmaniasis in the state of
Bahia, Brazil.Mem Inst Oswaldo Cruz. Nov-Dec;91(6):671-83.
Sideris, V.; Papadopoulou, G.; Dotsika, E.; Karagouni, E. (1999). Asymptomatic canine
leishmaniasis in Greater Athens area, Greece. Eur J Epidemiol. Mar;15(3):271-6.
Slovin S.F.; Ragupathi, G.; Musselli, C. et al. (2003). Fully synthetic carbohydrate-
based vaccines in biochemically relapsed prostate cancer: clinical trial results with α-N-
acetylgalactosamine-Oserine/ threonine conjugate vaccine. J. Clin. Oncol.;
21(23):4292–4298.
Slovin, S.F.; Ragupathi, G.; Fernandez, C. et al. (2007). A polyvalent vaccine for high-
risk prostate patients: “are more antigens better?”. Cancer Immunol. Immunother.;
56(12):1921–1930.
Amorim, D.R. Referência Bibliográfica
63
Slovin, S.F.; Ragupathi, G.; Musselli, C. et al. (2005). Thomsen–Friedenreich (TF)
antigen as a target for prostate cancer vaccine: clinical trial results with TF cluster (c)-
KLH plus QS21 conjugate vaccine in patients with biochemically relapsed prostate
cancer. Cancer Immunol. Immunother.; 54(7):694–702.
Soong, L., Henard, C. A., e Melby, P. C. (2012). Immunopathogenesis of non-healing
American cutaneous leishmaniasis and progressive visceral leishmaniasis. Seminars in
Immunopathology, 34(6), 735–751.
Stanley, A.C.; Engwerda, C.R. (2007). Balancing immunity and pathology in visceral
leishmaniasis. Immunol Cell Biol.; 85:138–147.
Tacchini-Cottier, F.; Weinkopff, T.; Launois, P. (2012). Does T helper differentation
correlate with resistance or susceptibility to infection with L. major? Some insights
form the murine model. Frontiers Immunol.; 3:1–9.
Takeda, K.; Kaisho, T.; Akira, S. (2003). Toll-like receptors. Annu Rev
Immunol;21:335–76.
Thomas, L.J.; Hammond, R.A.; Forsberg, E.M.; Geoghegan-Barek, K.M.; Karalius,
B.H.; Marsh, H.C Jr et al (2009). Co-administration of a CpG adjuvant (VaxImmune,
CPG 7909) with CETP vaccines increased immunogenicity in rabbits and mice. Hum
Vaccine;5:79–84.
Todoli, F.; Rodriguez-Cortés, A.; Núñez, M.dC.; Laurenti, M.D.; Gómez-Sebastián, S.
et al. (2012). Head-to-Head Comparison of Three Vaccination Strategies Based on
DNA and Raw Insect-Derived Recombinant Proteins against Leishmania. PLoS ONE
7(12): e51181.
Tovey, M.G.; Lallemand, C. (2010) Adjuvant activity of cytokines. Methods Mol
Biol;626:287– 309.
Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from
polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc
Natl Acad Sci U S A. 1979 Sep;76(9):4350-4.
Vandepapeliere, P.; Horsmans, Y.; Moris, P. et al.(2008). Vaccine adjuvant systems
containing monophosphoryl lipid A and QS21 induce strong and persistent humoral and
T cell responses against hepatitis B surface antigen in healthy adult volunteers.
Vaccine.; 26(10):1375–1386.
Vitoriano-Souza, J.; Moreira, N.D.; Teixeira-Carvalho, A.; Carneiro, C.M.; Siqueira,
F.A.M.; Vieira, P.M.A.; Giunchetti, R.C.; Moura, S.A.L.; Fujiwara, R.T.; Melo, M.N.;
Reis, A.B. (2012). Cell Recruitment and Cytokines in Skin Mice Sensitized with the
Vaccine Adjuvants: Saponin, Incomplete Freud’s Adjuvant and Monophosphoryl Lipid
A. Plos One, v.7, p.
Amorim, D.R. Referência Bibliográfica
64
Vouldoukis, I.; Drapier, J.C.; Nüssler, A.K.; Tselentis, Y.; Da Silva, O.A.; Gentilini,
M.; Mossalayi, D.M.; Monjour, L.; Dugas, B. (1996). Canine visceral leishmaniasis:
successful chemotherapy induces macrophage antileishmanial activity via the L-
arginine nitric oxide pathway. Antimicrob Agents Chemother. Jan;40(1):253-6.
Wawegama, N.K.; Browning, G.F.; Kanci, A.; Marenda, M.S.; Markham, P.F. (2013).
Development of a recombinant protein based ELISA for diagnosis of Mycoplasma bovis
infection in cattle. Clin Vaccine Immunol. 2013, Dec 11.
Werneck, G.L.; Costa, C.H.; Walker, A.M.; David, J.R.; Wand, M.; Maguire, J.H.
(2007). Multilevel modelling of the incidence of visceral leishmaniasis in Teresina,
Brazil. Epidemiol Infect. Feb;135(2):195-201. Epub 2006 Jul 7.
World Health Organization (WHO). (2012). http://www.who.int/leishmaniasis/en/.
http://gamapserver.who.int/mapLibrary/Files/Maps/Leishmaniasis_VL_2013.png?ua=1.
Acessado em: 31/08/2015.
Wijnans, L.; Lecomte, C.; de Vries, C.; Weibel, D.; Sammon, C.; Hviid, A. et al (2013).
The incidence of narcolepsy in Europe: before, during, and after the influenza A
(H1N1) pdm09 pandemic and vaccination campaigns. Vaccine;31: 1246–54.
Wilson, M.E.; Jeronimo, S.M.B.; Pearson, R.D. (2005). Immunopathogenesis of
infection with the visceralizing Leishmania species. Microb Pathog.;38:147-60.
Yen, M.H.; Lin, C.C. and Yen, CM. (1995). The immunomodulatory effect of saiko
saponin derivatives and the root extract of Bupleurum kaoi in mice. Phytother. Res.; 9,
351358.
Zanin, F.H.; Coelho, E.A.; Tavares, C.A.; Marques-Silva, E.A.; Silva-Costa, M.M.;
Rezende, S.A. et al (2007). Evaluation of immune responses and protection induced by
A2 and nucleoside hydrolase (NH) DNA vaccines against Leishmania chagasi and
Leishmania amazonensis experimental infections. Microb Infect;9:1070–7.
Zhang, W. e Matlashewski, G. (1997). Loss of virulence in Leishmania donovani
deficient in an amastigote-specific protein, A2. Proc. Natl. Acad. Sci., v.94, p.8807–11.
Amorim, D.R. Anexo
65
Anexo
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
CEUA COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS
CERTIFICADO Certificamos que o Protocolo nº. 385 / 2013, relativo ao projeto intitulado “Análise dos níveis de proteção em
plataforma de teste in vivo empregado-se novos candidatos vacinais contra Leishmaniose Visceral”, que tem como
responsável Rodolfo Cordeiro Giunchetti, está de acordo com os Princípios Éticos da Experimentação Animal,
adotados pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA/UFMG), tendo sido aprovado na reunião de 11/03/2014.
Este certificado espira-se em 11/03/2019.
CERTIFICATE
We hereby certify that the Protocol nº. 385 / 2013, related to the Project entilted “Analysis of the protection levels in in
vivo testing platform used to new vaccine candidates against visceral leishmaniasis”, under the supervision of Rodolfo
Cordeiro Giunchetti, is in agreement with the Ethical Principles in Animal Experimentation, adopted by the Ethics
Committee in Animal Experimentation (CEUA/UFMG), and was approved in 11/03/2014. This certificates expires in
11/03/2019.
FRANCISNETE GRACIANE ARAUJO MARTINS
Coordenador(a) da CEUA/UFMG
Belo Horizonte, 11/03/2014.
Atenciosamente.
Sistema CEUA-UFMG
https://www.ufmg.br/bioetica/cetea/ceua/
Universidade Federal de Minas Gerais
Avenida Antônio Carlos, 6627 – Campus Pampulha
Unidade Administrativa II – 2º Andar, Sala 2005
31270-901 – Belo Horizonte, MG – Brasil
Telefone: (31) 3499-4516 – Fax: (31) 3499-4592
www.ufmg.br/bioetica/cetea - cetea@prpq.ufmg.br
Recommended