Uma abordagem para trimagem, verificação de contaminação e clusterização de seqüências EST

Uma abordagem para trimagem, verificação de contaminação e clusterização de seqüências EST

Candidato: Christian BaudetOrientador: Zanoni Dias

Tópicos da Apresentação

Motivação Trimagem Verificação de contaminação Clusterização Proposta Cronograma

Motivação Importância dos projetos de

seqüenciamento Projetos EST no Brasil Ausência de metodologia padrão

utilizada pelos diferentes projetos Possibilidade de identificação de

melhorias a serem feitas nos processos existentes

Trimagem

Seqüências EST possuem altas taxas de erros

Remoção de regiões de: baixa qualidade vetores adaptadores trechos de baixa complexidade

Seqüência de bases

1 NCTGGTACGCCTGCAGGTACCGGTCCGGAATTCCCTGCTCGACCCACGCGTCCGAAATTC 61 TTATCCCCGTTATTTTATTCGTTCGTTTCAATCGCATCAAGATCTCGATCTCTCTCTTAT 121 TTCCTCGCCGTGAGCTGCGATCATGGAGATGGAGCGCGTGACGGAGTTTCCTTTTTCGAG 181 ATCTGGATCGGCGTCCTCGTAAGCGAGCGCGTTTGGGCTGGGACGTGCCTCAGGTACCGA 241 AGGCTCAGGTAGGATTATTTTGTGGACAAGAGGTTGGGAATGTAACAAGCTTTGCACCTC 301 CAAGAGCTCCCTCAGACCATGTCACTAGTTCTTCTCTATTTGTAAAGGGAGTGGCTCGAA 361 ATGGTTCTCCCCCATGGCGTGAGGATGGGGGGATGGCCATTATATGTTTGCGCTTGGAGA 421 AAATTTAACTTCTCGCTATAAGATTCACAGCAAAATGGGTGAAGGAACCTTCGGGCAGGT 481 TTTGGAATGCTGGGATCGTGAGAGGAGAGAAATGGGACGCNTTAGAGTTGGGCGGGGGAT 541 CCACAAATGTCGGGCCGCTGCTGGGGTGGACAGTGGGGCGCGTGGCGAAGGGGGAGGGGG 601 GGGGGAGGGGGGGGGGGCCGCGCCGCGGCGGGGCGCGGGCCGCATACGCGGGGAGGGGGG 661 GGGGAGGCGGGGGGCGGGGGGGCGGGCGGGGCCGGAGAGGGAGCGGACGGGGGGGGGGCG 721 CGGGGCGGCGGGGGGCGGGGCGGTAGCGGGGGGGGGGAGGGGGGCCGCGCGGGGGGGGGA 781 GAGAGGATGCCGGGCACCCGGGGGGAGGGGGGNCGGGGGGCCGGGGGGCGGGGGCGCGCC 841 GCGGTGGCCGGCGCGAGGCGCCGCCCGGACCGCCGAGAGCGGAGGAGGGCG

Qualidades das bases

1 NCTGGTACGCCTGCAGGTACCGGTCCGGAATTCCCTGCTCGACCCACGCGTCCGAAATTC 61 TTATCCCCGTTATTTTATTCGTTCGTTTCAATCGCATCAAGATCTCGATCTCTCTCTTAT 121 TTCCTCGCCGTGAGCTGCGATCATGGAGATGGAGCGCGTGACGGAGTTTCCTTTTTCGAG 181 ATCTGGATCGGCGTCCTCGTAAGCGAGCGCGTTTGGGCTGGGACGTGCCTCAGGTACCGA 241 AGGCTCAGGTAGGATTATTTTGTGGACAAGAGGTTGGGAATGTAACAAGCTTTGCACCTC 301 CAAGAGCTCCCTCAGACCATGTCACTAGTTCTTCTCTATTTGTAAAGGGAGTGGCTCGAA 361 ATGGTTCTCCCCCATGGCGTGAGGATGGGGGGATGGCCATTATATGTTTGCGCTTGGAGA 421 AAATTTAACTTCTCGCTATAAGATTCACAGCAAAATGGGTGAAGGAACCTTCGGGCAGGT 481 TTTGGAATGCTGGGATCGTGAGAGGAGAGAAATGGGACGCNTTAGAGTTGGGCGGGGGAT 541 CCACAAATGTCGGGCCGCTGCTGGGGTGGACAGTGGGGCGCGTGGCGAAGGGGGAGGGGG 601 GGGGGAGGGGGGGGGGGCCGCGCCGCGGCGGGGCGCGGGCCGCATACGCGGGGAGGGGGG 661 GGGGAGGCGGGGGGCGGGGGGGCGGGCGGGGCCGGAGAGGGAGCGGACGGGGGGGGGGCG 721 CGGGGCGGCGGGGGGCGGGGCGGTAGCGGGGGGGGGGAGGGGGGCCGCGCGGGGGGGGGA 781 GAGAGGATGCCGGGCACCCGGGGGGAGGGGGGNCGGGGGGCCGGGGGGCGGGGGCGCGCC 841 GCGGTGGCCGGCGCGAGGCGCCGCCCGGACCGCCGAGAGCGGAGGAGGGCG

Baixa Qualidade Alta Qualidade

Baixa qualidade

Baixa Qualidade Alta Qualidade

1 XXXGGTACGCCTGCAGGTACCGGTCCGGAATTCCCTGCTCGACCCACGCGTCCGAAATTC 61 TTATCCCCGTTATTTTATTCGTTCGTTTCAATCGCATCAAGATCTCGATCTCTCTCTTAT 121 TTCCTCGCCGTGAGCTGCGATCATGGAGATGGAGCGCGTGACGGAGTTTCCTTTTTCGAG 181 ATCTGGATCGGCGTCCTCGTAAGCGAGCGCGTTTGGGCTGGGACGTGCCTCAGGTACCGA 241 AGGCTCAGGTAGGATTATTTTGTGGACAAGAGGTTGGGAATGTAACAAGCTTTGCACCTC 301 CAAGAGCTCCCTCAGACCATGTCACTAGTTCTTCTCTATTTGTAAAGGGAGTGGCTCGAA 361 ATGGTTCTCCCCCATGGCGTGAGGATGGGGGGATGGCCATTATATGTTTGCGCTTGGAGA 421 AAATTTAACTTCTCGCTATAAGATTCACAGCAXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 481 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 541 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 601 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 661 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 721 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 781 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 841 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX

Vetor

Baixa Qualidade Alta Qualidade

1 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXCCACGCGTCCGAAATTC 61 TTATCCCCGTTATTTTATTCGTTCGTTTCAATCGCATCAAGATCTCGATCTCTCTCTTAT 121 TTCCTCGCCGTGAGCTGCGATCATGGAGATGGAGCGCGTGACGGAGTTTCCTTTTTCGAG 181 ATCTGGATCGGCGTCCTCGTAAGCGAGCGCGTTTGGGCTGGGACGTGCCTCAGGTACCGA 241 AGGCTCAGGTAGGATTATTTTGTGGACAAGAGGTTGGGAATGTAACAAGCTTTGCACCTC 301 CAAGAGCTCCCTCAGACCATGTCACTAGTTCTTCTCTATTTGTAAAGGGAGTGGCTCGAA 361 ATGGTTCTCCCCCATGGCGTGAGGATGGGGGGATGGCCATTATATGTTTGCGCTTGGAGA 421 AAATTTAACTTCTCGCTATAAGATTCACAGCAXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 481 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 541 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 601 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 661 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 721 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 781 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 841 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX

Adaptador

Baixa Qualidade Alta Qualidade

1 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXGAAATTC

61 TTATCCCCGTTATTTTATTCGTTCGTTTCAATCGCATCAAGATCTCGATCTCTCTCTTAT 121 TTCCTCGCCGTGAGCTGCGATCATGGAGATGGAGCGCGTGACGGAGTTTCCTTTTTCGAG 181 ATCTGGATCGGCGTCCTCGTAAGCGAGCGCGTTTGGGCTGGGACGTGCCTCAGGTACCGA 241 AGGCTCAGGTAGGATTATTTTGTGGACAAGAGGTTGGGAATGTAACAAGCTTTGCACCTC 301 CAAGAGCTCCCTCAGACCATGTCACTAGTTCTTCTCTATTTGTAAAGGGAGTGGCTCGAA 361 ATGGTTCTCCCCCATGGCGTGAGGATGGGGGGATGGCCATTATATGTTTGCGCTTGGAGA 421 AAATTTAACTTCTCGCTATAAGATTCACAGCAXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 481 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 541 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 601 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 661 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 721 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 781 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 841 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX

Seqüência trimada

Baixa Qualidade Alta Qualidade

1 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXGAAATTC 61 TTATCCCCGTTATTTTATTCGTTCGTTTCAATCGCATCAAGATCTCGATCTCTCTCTTAT 121 TTCCTCGCCGTGAGCTGCGATCATGGAGATGGAGCGCGTGACGGAGTTTCCTTTTTCGAG 181 ATCTGGATCGGCGTCCTCGTAAGCGAGCGCGTTTGGGCTGGGACGTGCCTCAGGTACCGA 241 AGGCTCAGGTAGGATTATTTTGTGGACAAGAGGTTGGGAATGTAACAAGCTTTGCACCTC 301 CAAGAGCTCCCTCAGACCATGTCACTAGTTCTTCTCTATTTGTAAAGGGAGTGGCTCGAA 361 ATGGTTCTCCCCCATGGCGTGAGGATGGGGGGATGGCCATTATATGTTTGCGCTTGGAGA 421 AAATTTAACTTCTCGCTATAAGATTCACAGCAXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 481 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 541 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 601 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 661 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 721 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 781 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 841 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX

Problemas – Trimagem

Baixa Qualidade Alta Qualidade

1 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXGCTCGACCCACGCGTCCGAAATTC 61 TTATCCCCGTTATTTTATTCGTTCGTTTCAATCGCATCAAGATCTCGATCTCTCTCTTAT 121 TTCCTCGCCGTGAGCTGCGATCATGGAGATGGAGCGCGTGACGGAGTTTCCTTTTTCGAG 181 ATCTGGATCGGCGTCCTCGTAAGCGAGCGCGTTTGGGCTGGGACGTGCCTCAGGTACCGA 241 AGGCTCAGGTAGGATTATTTTGTGGACAAGAGGTTGGGAATGTAACAAGCTTTGCACCTC 301 CAAGAGCTCCCTCAGACCATGTCACTAGTTCTTCTCTATTTGTAAAGGGAGTGGCTCGAA 361 ATGGTTCTCCCCCATGGCGTGAGGATGGGGGGATGGCCATTATATGTTTGCGCTTGGAGA 421 AAATTTAACTTCTCGCTATAAGATTCACAGCAXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 481 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 541 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 601 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 661 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 721 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 781 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 841 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX

Problemas – Trimagem

1 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXGAAATTC 61 TTATCCCCGTTATTTTATTCGTTCGTTTCAATCGCATCAAGATCTCGATCTCTCTCTTAT 121 TTCCTCGCCGTGAGCTGCGATCATGGAGATGGAGCGCGTGACGGAGTTTCCTTTTTCGAG 181 ATCTGGATCGGCGTCCTCGTAAGCGAGCGCGTTTGGGCTGGGACGTGCCTCAGGTACCGA 241 AGGCTCAGGTAGGATTATTTTXXXXXXXXXXXXXXXXXXXTGTAACAAGCTTTGCACCTC 301 CAAGAGCTCCCTCAGACCATGTCACTAGTTCTTCTCTATTTGTAAAGGGAGTGGCTCGAA 361 ATGGTTCTCCCCCATGGCGTGAGGATGGGGGGATGGCCATTATATGTTTGCGCTTGGAGA 421 AAATTTAACTTCTCGCTATAAGATTCACAGCAXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 481 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 541 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 601 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 661 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 721 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 781 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 841 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX

Baixa Qualidade Alta Qualidade

Verificação de contaminação Seqüências EST comumente sofrem

contaminação de diferentes tipos Identificação e remoção de seqüências

contaminadas são necessárias para que não sejam geradas informações inválidas sobre o organismo em estudo

Métodos de detecção de contaminação: Similaridade Conjunto de características

Similaridade

Contaminação Determinada por critério pré-definidoExemplo: similaridade de 98% e cobertura mínima de 75 bases

BLAST

Seqüências de organismos

Contaminantes

Seqüências a serem verificadas

Seqüências contaminadas

Seqüências não contaminadas

Conjunto de características

Outras seqüências

Seqüências pertencentes ao organismo

Seqüências contaminadas

Comparação

Comparação

Extratores de característica

s Assinatura

Seqüências de organismos

contaminantes

Extratores de característica

s Assinatura

Seqüências a serem

analisadas

Extratores de característica

s Assinatura

Seqüências conhecidas do organismo alvo

Clusterização

Necessária para eliminação de redundância e identificação de genes

Exemplo: 1 CTGCTTTAAGGGTCGTTAATTGACGACTCTTGATATTTACTTAGTTTGAGTT 2 GAGCACTGCTTTAAGGGTCGTTAATTGACGACTCTTGATATTTACTAAGTTT 3 GAAAAGGATCTTTCTGATTCTCGAAGAATGAGGGGCAAGGGGATTGATCGA 4 TTGTGCAAGTAGCTTTGGTAATTCTTCTCAGTACAACCGACCCACCGTTTCAAATC 5 CGTTAATTGACGACTCTGATATTTACTAAGTTTGAGTTATGGACGA 6 CTGCTTTAAGGGTCGTTAATTGACGACTCTTGATATTTACTAAGTTTGAGTTATG 7 CAAGTAGCTTTGGTAATCTTCTCAGTACAACCGACCCACCGTTTCAATCTTTGTA 8 TTAAGGGTCGTTAATTGACGACTCTTGATATTTACTAAGTTTGAGTTATGGA

ClusterizaçãoCluster 1 – Tamanho 5C GAGCACTGCTTTAAGGGTCGTTAATTGACGACTCTTGATATTTACTAAGTTTGAGTTATGGACGA2 GAGCACTGCTTTAAGGGTCGTTAATTGACGACTCTTGATATTTACTAAGTTT6 CTGCTTTAAGGGTCGTTAATTGACGACTCTTGATATTTACTAAGTTTGAGTTATG1 CTGCTTTAAGGGTCGTTAATTGACGACTCTTGATATTTACTTAGTTTGAGTT8 TTAAGGGTCGTTAATTGACGACTCTTGATATTTACTAAGTTTGAGTTATGGA5 CGTTAATTGACGACTC*TGATATTTACTAAGTTTGAGTTATGGACGA

Cluster 2 – Tamanho 2C TTGTGCAAGTAGCTTTGGTAATTCTTCTCAGTACAACCGACCCACCGTTTCAAATCTTTGTA4 TTGTGCAAGTAGCTTTGGTAATTCTTCTCAGTACAACCGACCCACCGTTTCAAATC 7 CAAGTAGCTTTGGTAA*TCTTCTCAGTACAACCGACCCACCGTTTCAA*TCTTTGTA

Singleton3 GAAAAGGATCTTTCTGATTCTCGAAGAATGAGGGGCAAGGGGATTGATCGA

Clusterização Existência de diversos programas de

clusterização: TGICL Phrap TIGR Assembler CAP3

Validação dos resultados obtidos nos processos de trimagem e verificação de contaminação

Proposta – Trimagem

Estudos de possíveis melhorias nos processos de trimagem existentes

Criação de um conjunto de procedimentos padrões

Realização de testes para validação do conjunto de procedimentos

Proposta – Contaminação Estudo de possíveis melhorias nos critérios

de verificação de contaminação existentes Integração entre os métodos de detecção

por similaridade e por conjunto de características

Definição de um critério que melhor se aplique ao contexto de projetos EST

Realização de testes para validação da metodologia

Proposta – Clusterização Análise de programas de

clusterização e de seus parâmetros Testes para identificação do

melhor programa Utilização da clusterização para

validação dos métodos desenvolvidos para trimagem e verificação de contaminação

Cronograma

1 – Trimagem: I – Estudo e identificação de melhorias II – Testes III – Escrita dos resultados obtidos no

testes

Cronograma

2 – Verificação de contaminação: IV – Estudo e identificação de melhorias V – Testes VI – Escrita dos resultados obtidos nos

testes

Cronograma

3 – Clusterização: VII – Escolha dos programas VIII – Avaliação dos valores de parâmetros IX – Testes X – Escrita dos resultados obtidos nos

testes

Cronograma

4 – Dissertação: XI – Revisão final do texto XII – Defesa