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Ludmila Entiauspe
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASCENTRO DE DESENVOLVIMENTO TECNOLÓGICO
DISCIPLINA DE GENÔMICA FUNCIONAL
O HPV
Vírus que apresenta tropismo específico por célulasepiteliais e da mucosa
Explora o maquinário celular do hospedeiro em seu favor
Indução de tumores
Classificados por genótipos (10% do gene L1)
120 genótipos descritos
40 infecções anogenitais em homens e mulheres
15 CA
Alto risco ou baixo risco (transformação neoplásica)
O HPV
43 genomas completos seqüenciados
Infecções benignas
Lesão intra-epitelial escamosa de baixo grau (LSIL)
Raramente há associações pré-malignas ou malignas
HPV-6, 11, -42, -43 e -44
Papilomatose laríngea juvenil
Papilomatose respiratória recorrente
97% dos casos de verrugas genitais
Lesão intra-epitelial escamosa de alto grau (HSIL)
Carcinoma invasor de colo de útero
HPV-16, -18, -26, -31, -33, -35, -39, -45, -51, -52, -53, -56,-58
Outros cânceres anogenitais
Cabeça e pescoço
Carcinoma epidermóide boca e orofaringe
HPV-58
HPV-18
HPV-18
HPV-58
HPV-33
Distribuição do HPV e genótipos no Brasil
76%GO
64%SP
28%RS
40%
MG
PA63%
BA78%
Assintomáticas
Citologia alterada
NIC II e NIC III
NIC III e CA
Aspectos sóciocomportamentais
Demográficos
Co-fatores virais
Hormônios endógenos
Fatores genéticos
Fatores ligados à resposta imune
A co-infecção HPV/HIV ocorre em mulheres emtodo o mundo.
Estudos mostram um aumento na prevalência deinfecção genital por HPV, lesão intra-epitelial oucâncer cervical em mulheres infectadas pelo HIV
CDC incluiu o CA cervical entre as condiçõesdefinidoras da AIDS
Mulheres HIV positivas tem aumento de 100 vezesna incidência de carcinoma da vulva e ânus
Risco para CA cervical aumentado em 14 vezes
Maior prevalência de infecção e lesões
Mais graves
Progressão rápida
Difíceis de tratar
Alta taxa de recorrência
Ciclo biológico do HPV
Condiloma acuminado
Proliferação induzida pelo HPV
Epitélio escamoso estratificado
Região genital
Perianal
Boca
Laringe
Raramente progride em câncer
Lesão intra-epitelial cervical
A infecção ativa pelo HPV pode provocar mudanças nascélulas infectadas da cérvice uterina
Neoplasias intra-epiteliais cervicais (NIC)
Lesões precursoras do câncer cervical
Maioria das lesões leve e moderada é propensa à regressão
Persistência dos genótipos associada a lesões de alto grau
Lesão intra-epitelial cervical
Câncer cervical (CA cervical)
Segunda malignidade mais comum em mulheres nomundo
Estimativas mundiais relataram 500.000 casos novos porano de câncer de colo de útero
90% em países subdesenvolvidos e em desenvolvimento
1.500 mulheres desenvolverão a doença
Porto AlegreIncidência de 200/100.000 mulheres
Estimativas para o Brasil em 2010:
Estado do Rio Grande do Sul
Incidência de 18.430 casos
Risco estimado de 18 casos a cada 100.000 mulheres
99,7% dos carcinomas apresentam DNA-HPV alto grau
HPV-16, -18, -45, -31, -33, -52, -58 e -35
90% dos casos de CA cervical no mundo
HPV-16: metade dos casos
Métodos de diagnóstico
Tríade clínica
Reação em cadeia da polimerase (PCR)Captura Híbrida (HC)
Colposcopia HistopatologiaCitologia oncológica
Clínico:
Identificação Molecular:
5.5 milhões de pessoas são infectadas por HPV/ano
75% da população já foi infectado por HPV genital
Prevalência entre 28-46%
Centro de prevenção e controle de doenças (CDC):
Idade inferior à 25 anos
90% dessas infecções
Eliminadas espontaneamente pelo sistema imune dentrode 24 meses
Prevalência da infecção clínica e subclínica é baixa
0,7-2,9%
Maior entre jovens sexualmente ativos, entre 25 e 35 anosde idade
Vacinas contra o HPV
Profiláticas
Previnem a infecção por HPV e doenças associadas
VLP (virus like particles)
Terapêuticas
Induzem a regressão das lesões ou remissão do CAcervical avançado
Antígenos virais (E6 e E7)
Vacinas contra o HPV
Brasil, agosto de 2006:
Aprovação da vacina quadrivalente recombinante
HPV-6, -11, -16 e -18
Meninas e mulheres de 9 a 26 anos de idade
Proteção contra verrugas genitais e as lesões precursorasdo câncer
Características Gerais do HPV
Comitê Internacional de Taxonomia dos Vírus (ICTV)
Família: Papillomaviridae
Gênero: Papillomavirus
Não envelopado
DNA fita dupla circular
55 nm de diâmetro
8 kb
Biologia Molecular do HPV
Regiões que codificam a proteína viral
Filamento positivo
Transcreve o mRNA para 10 ORFs
Precoce (E)
Tardia (L)
Genoma do HPV
Genoma do HPV-16 e arranjo das proteínas precoces (E) e tardias (L)
HPV-16
Polimorfismo do p53
Códon 72
Arginina (CGC; Arg72)
Prolina(CCC; Pro72)
Arg/Arg p53 Arg/Pro p53 Pro/Pro p53
Polimorfismo do p53
Storey (1998)
Genótipo Arg/Arg
Risco 7 vezes
Genótipo Pro/Pro
Não apenas a infecção por HPV
Mudança estrutural na p53
Seleção de mulheres com alto risco para CA
Forma epissomalForma integrada
Instabilidade celular Anomalias neoplásicas
Mutações
Ação sobre p53 e pRb
E6E7
Propriedades Dano ao DNA
S (síntese)Replicação do DNA
G2
M
R (checkpoint stop)Checagem do estado do
DNA
G1 (gap)
Ativação do p53 Mecanismos independentes
de p53
S (síntese)Replicação do DNA
Propriedades
G2
M
G1 (gap)
Dano ao DNA
R (checkpoint stop)Checagem do estado do
DNAInibidores de ciclina/CDK
p27
p16p21
Ponto R (fase G1)Recuperação do
DNA
Ativação do p53 Mecanismos independentes
de p53
Inibidores de ciclina/CDK
p27
p16p21
Ponto R (fase G1)Recuperação do
DNA
DNA recuperado
DNA não-recuperado
Propriedades Dano ao DNA
S (síntese)Replicação do DNA
G2
M
R (checkpoint stop)Checagem do estado do
DNA
G1 (gap)
Ativação do p53 Mecanismos independentes
de p53
DNA recuperado
DNA não-recuperado
Apoptose
Propriedades Dano ao DNA
S (síntese)Replicação do DNA
G2
M
R (checkpoint stop)Checagem do estado do
DNA
G1 (gap)
Inibidores de ciclina/CDK
p27
p16p21
Ponto R (fase G1)Recuperação do
DNA
Dano ao DNA
Ativação do p53 Mecanismos independentes
de p53
DNA recuperado
DNA não-recuperado
Apoptose
Ciclina/CDKativado
Sinaliza célulaa continuar
Propriedades
S (síntese)Replicação do DNA
G2
M
R (checkpoint stop)Checagem do estado do
DNA
G1 (gap)
Inibidores de ciclina/CDK
p27
p16p21
Ponto R (fase G1)Recuperação do
DNA
Expressão gênica e câncer cervical
p53 Apoptose na fase S do ciclo celular
E6
Tumorigênese
Regulação da transcrição
Ativação da telomerase
Retardo na diferenciação dos queratinócitos
Expressão gênica e câncer cervical
G0
G2
S
G1
Rb
E2F
Rb
E7
E2F
DP1
DP1
Transcrição
Gharizadeh et al. (2001)
Sistema rápido, confiável e robusto
Adequado para a triagem clínica de rotina com um
grande número de amostras
Facilmente adaptado para a automação de laboratório
Também permite a detecção de
um amplo espectro de HPV,
incluindo putativos novos
genótipos e mutações
PreTect TM HPV-Proofer: Real time detection and typing of E6/E7 mRNA from carcinogenic human papillomaviruses
Testes de DNA-HPV Baixa especificidade
Prevalência de HPV
Mulheres com CA
Região L1
PreTect TM HPV-Proofer: Real time detection and typing of E6/E7 mRNA from carcinogenic human papillomaviruses
PreTectTM HPV-Proofer
PCR Real-time multiplex
Vantagem de detectar mRNA E6/E7
HPV oncogênicos
HPV-16, -18, -31, -33 e -45
Monitorar persistência da infecção
Identificar infecções HPV com potencial transformador
Câncer cervical: genótipos oncogênicos de HPV e polimorfismo da p53 do códon 72
Prevalência da infecção pelo HPV
Investigar dos genótipos presentes
Determinar a prevalência de polimorfismo da p53 nocódon 72
Polimorfismo da p53 Genótipos oncogênicos do HPV
Maior risco para CA
Risco agravado quando associado aos fatores sociodemográficos ?
Tem relação???
Dois momentos:
Estudo transversal, composto por 1100 mulheres, no qualse buscará
Investigar a prevalência de HPV,
Genótipos mais freqüentes
Presença do polimorfismo na p53 do códon 72
Associação entre polimorfismo da p53 e genótiposoncogênicos
Estudo de coorte
Acompanhará pelos próximos dois anos, a cada seismeses,
100 pacientes HIV positivas, positivas para HPV semalterações citopatológicas
Investigar se a persistência da infecção por HPV,
associada à mutação da p53 apresenta maior risco ao
desenvolvimento de câncer cervical.
Serviço de Ginecologia – Faculdade de Medicina / UFPel
FAMED / SAE
Aplicação questionário padronizado
Coleta de amostra secreção cervical
Mulheres que buscarem atendimento nos serviços
de Ginecologia(N = 1100)
Acondicionamento das amostras
Laboratório Genômica Funcional
Serviço de Ginecologia – Faculdade de Medicina / UFPel
Análise laboratorial
Extração do DNA genômico
Nested-PCR (nPCR)
Primers MY 09/11
Primers GP5+/6+
Seqüenciamento dos genótipos do HPV
PCR da p53
Análise dos fragmentos de restrição (RFLP) da p53
Enzima Tha I - HELENA
Região L1 do HPV
Éxon 4
Primers utilizados na amplificação do HPV e região amplificada (L1)
Alta a prevalência por HPV em mulheres na cidade dePelotas
Desconhecida no âmbito molecular
Prevalência dos genótipos
Tais determinações poderão contribuir como medidas deprevenção e controle da infecção.
DNA HPV30% HIV negativas
90% HIV positivas
Comportamento de risco compartilhado para ambas asinfecções
Susceptibilidade ao HPV devido ao comprometimento dosistema imune.
Alelos Arg/Arg Lesão intra-epitelial escamosa (SIL)
Maior risco para o desenvolvimento de CA cervical
Espera-se que com os resultados apresentados
Úteis no futuro
Diagnóstico complementar ao citopatológico e colposcopia
Figura 1
Figura 2
Figura 3
Figura 4
Figura 5
Figura 7Figura 6
Figura 8
Figura 9
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