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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia
Tese
Prospecção de leveduras não-Saccharomyces com
potencial enológico oriundas de uvas finas da
Região da Campanha do Estado do Rio Grande do
Sul
Suziane Antes Jacobs
Pelotas, 2015
Suziane Antes Jacobs
Prospecção de leveduras não-Saccharomyces com potencial enológico
oriundas de uvas finas da Região da Campanha do Estado do Rio Grande do
Sul
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da Universidade Federal de Pelotas, como requisito parcial à obtenção do título de Doutor em Ciências (área do Conhecimento: Biotecnologia).
Orientador: César Valmor Rombaldi
Coorientador: Fernando Zocche
Pelotas, 2015
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Vitor Manfroi (UFRGS/ICTA)
Prof. Dr. Luciano Manfroi (IFRS – Campus Bento Gonçalves)
Prof. Dr. Rosane da Silva Rodrigues (UFPel/CCQFA)
Prof. Dr. César Valmor Rombaldi (Orientador, UFPel/DCTA)
Aos meus pais, Roque e Rosani,
Irmãos Márcio e Marco,
Pelo apoio e incentivo,
Ofereço
Ao meu marido Bruno, pelo amor, incentivo e compreensão e
ao meu filho Mathias, o melhor de mim,
Dedico
Agradecimentos
À Coordenação do Curso de Pós Graduação em Biotecnologia, da Universidade
Federal de Pelotas, e aos seus professores pelos ensinamentos ministrados.
À todos os professores do Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos da
UFPel, pelo auxílio.
Ao professor Dr. César Valmor Rombaldi que desde meu mestrado vem sabiamente
guiando meus trabalhos de pesquisa, tendo seus ensinamentos e encorajamento
constantes sido fundamentais para minha formação acadêmica e científica, o meu
sincero agradecimento.
Ao professor, colega e amigo Fernando Zocche, que como co-orientador sempre
orientou, auxiliou e esteve presente em todas as etapas do trabalho.
Às colegas e amigos que contribuíram muito para execução deste trabalho, Renata
G. S. Zocche e Gabriela H. Pötter, companheiras de sala de aula, de laboratório e de
pesquisa, pelo auxílio constante.
À Embrapa Clima Temperado e ao Dr. Rufino Fernando Flores Cantillano, pelo
auxílio no início do doutorado.
Aos viticultores do município de Dom Pedrito-RS, por toda a colaboração na
cedência das uvas e amostras para o estudo;
Aos colegas da Unipampa Anelise Martins, Daniele Nascimento, Cíntia Saydelles da
Rosa e Lourdes Hirschmann e Daniel Eckhardt e aos alunos Lucas Martins Simões,
Tiago Stein e Pedro Pohlmann Giriboni, pelo auxilio neste trabalho.
Aos colegas e amigos, Gisele Crizel, Aline Tiecher, Joseana Severo.
Aos amigos e amigas que incentivaram o trabalho e me apoiaram em momentos
difíceis. Não vou tentar citar todos para não cometer nenhum esquecimento.
À meus pais e meus irmãos, que me apoiaram sempre nesta jornada, dando forças
para ir sempre em frente.
À minha sogra Nair, meus cunhados Diogo e Daniel, minhas cunhadas Adriane e
Renata, pelo apoio e amizade.
À meu marido Bruno e meu filho Mathias, pelo amor incondicional e compreensão e
apoio nos momentos mais difíceis.
Agradeço a todos que estiveram ao meu lado e me ajudaram de alguma forma.
E sobretudo a Deus, pela força que me move.
Resumo
JACOBS, Suziane A. Prospecção de leveduras não-Saccharomyces com potencial enológico oriundas de uvas finas da Região da Campanha do Estado do Rio Grande do Sul. 2015. 75f. Tese (Doutorado) - Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas. A prospecção de leveduras autóctones é relevante para a produção de vinhos com sinais distintivos. Embora seja amplamente reconhecido que o crescimento de leveduras não-Saccharomyces (NS) pode afetar positivamente a complexidade de sabor e aroma durante a fermentação do vinho com Saccharomyces cerevisiae, a incapacidade de controlar os processos de co-fermentação espontânea por leveduras NS inviabiliza o seu uso na produção de vinho. Neste estudo, selecionamos três leveduras NS de isolados autóctones da região da Campanha do Rio Grande do Sul-Brasil, e estudou-se o comportamento em processos fermentativos em mosto sulfitado e suco pasteurizado de uva. As três cepas estudadas, isoladas a partir de uvas Cabernet Sauvignon, Merlot e Cabernet Sauvignon cultivada em sistema orgânico, apresentaram 99% de identidade com a espécie Lachancea thermotolerans, 98% com o gênero Hanseniaspora uvarum e 97% de identidade com a espécie Metschnikowia pulcherrima, respectivamente. O comportamento das cepas foi distinto quando comparadas as microvinificações em suco pasteurizado e mosto sulfitado principalmente na produção de álcool durante a fermentação devido, provavelmente, ao desenvolvimento posterior de leveduras do gênero Saccharomyces. Variáveis como índice de polifenóis totais, antocianinas totais e tonalidade de cor também foram influenciadas pela ação das leveduras. Palavras-chave: Enologia, Vinho, Leveduras autóctones.
Abstract
JACOBS, Suziane A. Non-Saccharomyces yeast prospection with oenological potential derived from fine grapes of the Campanha Region of Rio Grande do Sul State. 2015. 75f. Tese (Doutorado) - Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas. The prospect of indigenous yeast is relevant to the production of wines with distinctive features. Although it is widely recognized that the growth of non-Saccharomyces yeasts (NS) can positively affect the complexity the flavor and volatile compounds of the wine during fermentation with Saccharomyces cerevisiae, but the inability to control the spontaneous co-fermentation processes NS yeast prevents their use in the winemaking. In this study, we selected three yeast (among 39 isolates) NS indigenous isolated from the Campanha region of Rio Grande do Sul, Brazil, and studied the behavior in fermentation processes in sulphited must and pasteurized grape juice. Studied three strains isolated from Cabernet Sauvignon, Cabernet Sauvignon and Merlot in organic system, showed 99% identity with the Lachancea thermotolerans species, with 98% genus Hanseniaspora uvarum and 97% identity to the Metschnikowia pulcherrima species, respectively. The behavior of the strains was different when compared to microvinifications in pasteurized juice and sulphited must mainly in the production of alcohol during fermentation, probably due to the further development of Saccharomyces yeasts. Variables such as index of total polyphenols, anthocyanins and color tone were also influenced by the action of yeast. Keywords: Oenology, wine, autochthonous yeasts.
Lista de Tabelas
Tabela 1. Características morfológicas de cepas autóctones isoladas a partir de 3 cv. de Vitis vinífera cultivadas na região da Campanha do Rio Grande do Sul.. 31 Tabela 2. Caracterização tecnológica de cepas autóctones isoladas a partir de 3 vinhedos localizados na região da Campanha do Rio Grande do Sul................ 32 Tabela 3. Identificação das cepas autóctones isoladas a partir de 3 vinhedos localizados na região da Campanha do Rio Grande do Sul................................... 34 Tabela 4. Características físico-químicas de vinhos obtidos através de fermentação em mosto sulfitado com levedura comercial e leveduras nativas...... 35 Tabela 5. Características físico-químicas de vinhos obtidos através de fermentação em suco pasteurizado com levedura comercial e leveduras nativas. 36
Lista de Figuras
Figura 1. Regiões vitivinícolas do Rio Grande do Sul, com destaque para a região da Campanha............................................................................................ 21
Lista de Abreviaturas
% - por cento
l - microlitro
DNA - ácido desoxiribonucleico
et al. - e colaboradores
ºBrix - gramas por cento de sólidos totais
ºC - grau Celsius
v/v - volume por volume
PCR - reação em cadeia da polimerase
pH - potencial hidrogeniônico
SC - Saccharomyces cerevisiae
NS - não-Saccharomyces
m - metro
mm - milímetro
ha - hectare
t/ha - toneladas por hectare
m - micrometro
SO2 - Dióxido de enxofre
rDNA - DNA ribossomal
Kg - quilograma
mL - mililitro
h - horas
mg mL-1 - miligramas por mililitros
meq L-1 - miliequivalente-grama por litro
mg Kg-1 - miligramas por quilogramas
UFC mL-1 - unidades formadoras de colônias por mililitro
cv. - cultivar
H2S - Ácido sulfídrico/Sulfeto de hidrogênio
CV - coeficiente de variação
g mL-1 - gramas por mililitro
RS – Estado do Rio Grande do Sul
Sumário
1 INTRODUÇÃO GERAL .......................................................................................... 14
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................................... 16
2.1 A vitivinicultura no Brasil...................................................................................... 16
2.2 A vitivinicultura na Campanha do Rio Grande do Sul .......................................... 19
2.3 As Leveduras e o processo de vinificação .......................................................... 21
2.3.2 Saccharomyces cerevisiae ........................................................................ 21
2.3.3 Leveduras não-Saccharomyces ................................................................ 22
2.4 Técnicas moleculares empregadas na caracterização de linhagens de
leveduras... ................................................................................................................ 23
2.4.1 Sequenciamento do DNA ribossomal ........................................................ 23
2.4.2 Análise de restrição do DNA ribossomal .................................................... 24
2.4.3 Reação em cadeia da polimerase (PCR), Eletroforese de gradiente em gel
desnaturante (DGCE) ......................................................................................... 24
3 HIPÓTESE E OBJETIVOS ..................................................................................... 25
3.1 Hipótese .............................................................................................................. 25
3.2 Objetivo Geral ..................................................................................................... 25
3.3 Objetivos Específicos .......................................................................................... 25
4 CAPÍTULOS ....................................................................................................... 26
4.1 CAPÍTULO 1 – Relatório de Atividades ........................................................ 26
4.1.1 Material e Métodos ................................................................................ 26
4.2.2 Resultados ............................................................................................. 30
4.2.3 Discussão .............................................................................................. 35
4.2 CAPÍTULO 2 – Microbiological characterization of grapes in the Campanha
Region of Rio Grande do Sul, Brazil reveals non-Saccharomyces autochthonous
yeasts with oenological potential. .............................................................................. 39
5 DISCUSSÃO GERAL E PERSPECTIVAS ............................................................ 60
6 CONCLUSÃO GERAL............................................................................................ 61
7 REFERÊNCIAS ...................................................................................................... 62
7 ANEXOS ................................................................................................................ 68
Anexo A – Resumos aprovados para apresentação e publicação nos anais do XV
Congresso Latino-Americano de Viticultura e Enologia ............................................ 68
Anexo B – Arquivo de submissão do artigo “ Prospecção microbiológica na região da
Campanha do Rio Grande do Sul-Brasil revela leveduras autóctones não-
Saccharomyces com potencial enológico”, à revista International Journal Food
Microbiology. ............................................................................................................. 69
Anexo C – Sequências nucleotídicas genômicas e respectivos alinhamentos para a
geração dos percentuais de identidade entre as espécies. ....................................... 70
14
1 INTRODUÇÃO GERAL
As leveduras empregadas na fermentação alcoólica são interferentes
importantes na enologia, por afetarem a concentração de álcool, a cor, o sabor, o
aroma e a estrutura do vinho (Fleet, 2003; Álvarez-Pérez et al., 2012; Holt et al.,
2013; Liang et al., 2013; Loira et al., 2013). No âmbito geral da enologia, as
leveduras mais importantes no processo de fermentação do mosto da uva em vinho
estão classificadas em dois grupos principais: i) espécies não-Saccharomyces, que
se desenvolvem nos primeiros estágios da fermentação, dificilmente completando
fermentações com elevadas concentrações de álcool; e, ii) cepas de
Saccharomyces, que se tornam dominantes conforme aumenta a concentração de
etanol (Suárez Lepe E Iñigo Leal, 2004; Barata et al., 2012; Tristezza et al., 2013).
Na atualidade, há ampla oferta de leveduras selecionadas para uso
enológico, desde as que realizam fermentações alcoólicas ortodoxas, sem grande
interferência nas demais propriedades do vinho, até aquelas mais utilizadas para
realçar aromas (Molina et al., 2009; Callejon et al. 2010). No entanto, os avanços
conceituais em enologia, com a busca de produtos com sinais distintivos, como a
vinificação valorizando leveduras autóctones, é uma alternativa que vem sendo
buscada e validada em vários países (Chavan et al., 2009; Capece et al, 2012;
Scacco et al, 2012; Settani et al., 2012; Liang et al, 2013; Synos et al., 2015). Isso se
deve ao fato de que, quando leveduras autóctones são isoladas e têm potencial
enológico, elas podem conferir ao produto final características únicas no que se
refere à qualidade do vinho (Domizio et al., 2007; Moreira et al., 2011; Holt et al.,
2013; Liang et al., 2013). Exemplo disso é o trabalho de Settani et al. (2012), que
isolaram três cepas autóctones com aptidão tecnológica para elaboração de vinhos
quando avaliaram 51 cepas de S. cerevisiae do bioma local (Sicília, Itália). De modo
similar, Scacco et al. (2013) estudaram cepas de leveduras autóctones capazes de
produzir maiores concentrações de compostos responsáveis pelas notas frutadas
de pêra, que confere aroma característico aos vinhos da Sicília.
Além disso, nos últimos anos, aumentou o interesse na fermentação mista
utilizando leveduras vínicas de Saccharomyces e não-Saccharomyces com o intuito
de melhorar a qualidade e a complexidade dos vinhos. Gobbi et al. (2013)
demonstraram que a fermentação simultânea utilizando Lachancea (Kluyveromyces)
thermotolerans e Saccharomyces cerevisiae permitiu aumentos significativos nas
notas picantes (pimenta, hortelã, canela e anis) do vinho. Em estudo semelhante
15
sobre as interações entre S. cerevisiae e leveduras não-Saccharomyces, Sadoudi et
al. (2012) revelaram que uma via metabólica aromática inteira pode ser alterada de
acordo com o tipo de levedura empregada durante a vinificação.
No Brasil, uma das principais regiões para a produção de vinhos finos é a
Campanha, participante do Pampa Gaúcho (Latitude 30° S, Longitude 54° W;
altitude de 100-300m). A região se caracteriza por ter solo arenoso, com boa
drenagem, clima temperado com verões quentes e secos, pluviosidade média anual
de 1.370 mm, amplitude térmica média no verão de 17 ºC, e radiação total média de
2.372h (INMET, 2015). Os vinhos oriundos dessa região têm tido destaque no
cenário nacional e internacional, no entanto, há necessidade de investir-se na
elaboração de produtos com características únicas. A prospecção de leveduras com
potencial enológico na Região do Pampa Gaúcho entra nesse cenário como um
elemento inovador, para serem utilizadas individualmente ou em associação com
outras leveduras, agregando valor ao vinho. Nesse sentido, o objetivo desse estudo
foi prospectar leveduras isoladas a partir de uvas finas da Região da Campanha do
Rio Grande do Sul e avaliar o potencial enológico desses microrganismos. Um
possível sucesso nessa etapa contribuirá para outra iniciativa paralela, que é a
produção orgânica de uvas finas na região, o que potencializará, ainda mais, a
sobreposição de sinais distintivos (produção orgânica e uso de leveduras
autóctones).
16
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 A vitivinicultura no Brasil
Baseando-se nos cadastros vitivinícolas, até 1950 a vitivinicultura comercial
brasileira estava restrita aos três Estados do Sul do Brasil e algumas regiões do
Leste de São Paulo e Sul de Minas Gerais. A partir daí, houve uma grande
ampliação da fronteira vitícola, com o plantio de uvas no Vale do Submédio São
Francisco, seguindo-se as regiões Norte do Paraná, Noroeste de São Paulo e Norte
de Minas Gerais. Nas regiões tradicionais, os sistemas de produção foram sendo
modificados ao longo dos anos, em função das oportunidades e exigências do
mercado. A pesquisa deu suporte ao empreendedorismo do viticultor brasileiro,
aportando tecnologias, sem as quais não seria possível atingir o atual nível de
desenvolvimento do setor. Como exemplos, podem ser citadas a seleção de clones
e novas cultivares adaptadas às diferentes regiões, a definição de diferentes
tecnologias de manejo, especialmente para as regiões tropicais e subtropicais, e a
certificação de produtos vitivinícolas, como produção integrada, indicações
geográficas e produção orgânica (Camargo et al., 2011).
A vitivinicultura brasileira está passando por uma transformação. É uma
atividade importante para a sustentabilidade da pequena propriedade no Brasil e tem
se tornado também importante no desenvolvimento de algumas regiões, na geração
de emprego em grandes empreendimentos. Na principal região produtora de uvas
no Brasil, a Serra Gaúcha, a vitivinicultura está fortemente ligada à tradição e ao
turismo. Nos últimos anos, com a popularizada crise econômica mundial, associada
ao ingresso de outros países no mercado, dificultou as exportações de uvas de
mesa do Vale do São Francisco, e ampliou a oferta de vinhos no mercado
internacional, incluso o Brasil, pelo aumento do poder aquisitivo dos brasileiros, o
que facilitou o ingresso de vinhos importados no país (Mello, 2013). O fato é que a
vitivinicultura brasileira é fortemente ameaçada por aquela desenvolvida nos países
vizinhos, como Uruguai, Argentina e Chile, além do input de vinhos europeus. Isso é
consequência da escala de produção adotada nesses países, decorrente das
condições edafoclimáticas favoráveis, dos menores custos de insumos, e,
sobretudo, do “prestígio” e do marketing consolidado desenvolvido por esses países.
Nesse último aspecto, os países de relevância na vitivinicultura evoluíram
significativamente na valorização de sinais distintivos, como as indicações
17
geográficas, as denominações de origem, a produção orgânica, a produção
integrada, a produção biodinâmica, a produção e comércio equitativo, dentre outros.
Além disso, procuraram incorporar conceitos importantes na perspectiva de cadeia
produtiva sustentável, também sob o aspecto cultural e biológico, inserindo valores e
riquezas biológicas da região de produção (relação das famílias produtoras com o
consumidor, envolvimento do setor com o desenvolvimento local, valorização do
bioma e da tradição, uso e valorização de recursos locais, como insumos e
leveduras) (Bengtsson et al., 2005; Saint-Ges e Bélis-Bergouignan, 2009; Gennari,
2014).
É nesse cenário que a região da Campanha vem atuando. Embora esteja
seguindo um perfil de empreendimento mais empresarial do que da agricultura
familiar, as ações vêm para valorizar e incorporar os valores regionais, amplamente
referenciados na história regional, pela produção pecuária, no bioma pampa. A
produção vitícola da região é pautada 100% em cultivares Vitis vinifera, visando a
elaboração de vinhos finos, tintos, brancos e roses, e espumantes. A definição exata
da aptidão de cada cultivar e clone ainda não está estabelecida, mas já há
apontamentos claros para cultivares e clones potenciais, como é o caso de Cabernet
Sauvignon R5/SO4, Tannat A717, Merlot B347, Pinot Noir 668, Chardonnay e
Gewurztraminner. Além disso, a região se caracteriza por ter boa ventilação,
amplitude térmica no período de maturação da uva e, na maioria dos anos, boa
insolação e baixa pluviosidade, o que permite produzir uvas com melhor maturação
do que a maioria das outras regiões brasileiras, além de permitir a produção com
menor aporte de insumos, principalmente fungicidas (Daudt et al, 1973; Rathmann et
al., 2008; Tonietto et al., 2012). Esses atributos deverão constituir diferenciais
positivos na promoção dos vinhos da região.
As exigências do mercado por produtos de qualidade comprovada, oriundos
de processos produtivos que valorizam a origem dos produtos, bem como o
comprometimento com a segurança do vinho e com a proteção ambiental, são cada
vez maiores, tornando indispensável a adoção de sistemas de certificação da
produção para competir em mercados mais exigentes. O setor vitivinícola brasileiro
avançou significativamente nos últimos anos através da produção integrada de uvas
finas de mesa, da definição das primeiras indicações geográficas para a produção
de vinhos finos e da produção orgânica de uva, vinho e suco de uva (Camargo et al.,
2011).
18
De acordo com o Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE), houve,
em 2012, redução de 0,52% na produção de uvas no Brasil, em relação ao ano de
2011. A maior redução da produção ocorreu no Estado do Paraná (-32,86%). Nos
Estados de Pernambuco, Minas Gerais, Santa Catarina e Rio Grande do Sul, houve
aumento de produção de uvas de 7,71%, 3,09%, 4,64% e 1,29%, respectivamente,
em relação ao ano de 2011. A produção de uvas destinadas ao processamento foi
de 830,92 milhões de quilos, representando 57,07% da produção nacional, sendo o
restante (42,93%) destinado ao consumo in natura. No Estado maior produtor de
uvas do Brasil, Rio Grande do Sul, ocorreu aumento da área plantada de apenas
1%, em 2012. Em Pernambuco, a área plantada com videiras sofreu redução de
2,15% e na Bahia, a redução foi de 5% em 2012. Em 2014, observou-se um
aumento de 1,64% na produção nacional de uvas, sendo os principais responsáveis
por este aumento os estados da Bahia e Santa Catarina com um aumento de
46,77% e 24,37%, respectivamente (Mello, 2015).
A produção de vinhos, sucos e derivados do Rio Grande do Sul, em 2012, foi
de 579,31 milhões de litros, 0,09% superior à quantidade produzida em 2011, sendo
o maior acréscimo na produção de suco de uva concentrado e no mosto de uva
(mosto simples). Para os vinhos finos houve um aumento de 4,6% e redução na
produção de vinhos de mesa em 17,48%. Em Santa Catarina foram produzidos
21,18 milhões de litros de vinhos e derivados da uva e do vinho em 2012, sendo
72,57% vinhos de mesa. A produção de vinhos de mesa apresentou aumento de
11,77% e redução de 19,14% na produção de vinhos finos (Mello, 2013). Em 2014, o
Rio Grande do Sul apresentou uma redução na produção de vinhos finos (12,71%) e
vinhos de mesa (0,37%) (Mello, 2015).
O Rio Grande do Sul (RS), em 2012, apresentou redução na comercialização
de suco e vinhos, em relação ao ano anterior, de 3,61%. Os vinhos de mesa tiveram
redução de 10,13%, enquanto os vinhos finos apresentaram aumento de 12,53%.
Esse aumento decorreu do aumento das exportações, devido ao Programa de
Escoamento da Produção do governo federal (PEP). Os vinhos espumantes, em
2012, continuaram sua trajetória crescente. Os espumantes moscatéis obtiveram
aumento de 20,49%, e os espumantes apresentaram crescimento de 9,41% nas
vendas. O aumento crescente dos espumantes nos últimos anos, aliado à trajetória
descendente dos vinhos finos nacionais, mostra que em apenas cinco anos a
proporção de vinhos finos em relação aos vinhos espumantes passou de 2,43 para
19
1,51, ou seja, enquanto em 2008 para cada garrafa de espumante (inclusive
moscatéis) nacional vendida eram comercializadas 2,43 garrafas de vinhos finos, em
2012 essa relação foi de uma garrafa de espumante para 1,51 garrafa de vinho fino
(Mello, 2013). Um estudo mostrou que, entre os anos de 2004 e 2014, houve um
decréscimo na elaboração de vinhos no estado do Rio Grande do Sul, sendo
10,47% para vinhos finos e 37,49% para vinhos comuns (IBRAVIN, 2015).
No primeiro semestre de 2013, o mercado interno brasileiro registrou um
pequeno incremento de 2,54% na comercialização de vinhos finos, de mesa e
espumantes, totalizando 107,9 milhões de litros. Este resultado diz respeito à
comparação ao mesmo período do ano anterior, quando foram comercializados
105,2 milhões de litros. Para o setor vitivinícola brasileiro, este desempenho reflete
uma estagnação nas vendas, com índices tímidos de alta no vinho de mesa, de
3,21%, com quase o mesmo percentual de retração no vinho fino, -3,10%, e um
pequeno recuo nos espumantes, de -1,97% (IBRAVIN, 2015).
Em 2014, o setor vitivinícola apresentou déficit de 350,77 milhões de dólares,
32,49% superior ao verificado em 2013. Enquanto isso, as importações mostraram
aumento de 8,96%, e as exportações tiveram uma redução de 35,84% em valor
(Mello, 2015).
2.2 A vitivinicultura na Campanha do Rio Grande do Sul
A instalação da indústria vinícola na região da Campanha do RS ocorreu de
forma simultânea à diversificação da produção agrícola, principalmente a
fruticultura, cujos efeitos podem ser percebidos em cidades como Aceguá, Bagé,
Dom Pedrito, Pedras Altas, Santana do Livramento e Uruguaiana , com a produção
de uva (BRASIL, 2005).
Localizada na "Metade Sul do Estado", a região da Campanha do RS é uma
região de campo, com topografia ondulada, apta à mecanização, cuja situação
geográfica está entre 29º45'23"S/57º05'37" W (município de Uruguaiana) e
31º33'45"S/53º26'15" W (município de Pinheiro Machado), com altitude variando
entre 75m e 420m. A temperatura média na região varia entre 17,6 ºC e 20,2 ºC, a
precipitação pluviométrica anual média varia entre 1.367mm e 1.444mm, e a
umidade relativa do ar, em média, situa-se entre 71% e 76%. Esta diversidade
ambiental oportuniza a produção de uvas que originam vinhos com diferentes
20
características de tipicidade dentro da própria região, de acordo com as condições
climáticas específicas de cada zona de produção.
A região da Campanha (Figura 1), atualmente com aproximadamente 1.500
ha, consolidou-se como produtora de vinhos finos na década de 1980, a partir de um
projeto implantado por uma empresa multinacional no município de Santana do
Livramento, na fronteira com o Uruguai. Caracteriza-se pelo cultivo de uvas Vitis
vinifera, com predominância das uvas tintas Cabernet Sauvignon, Merlot, Tannat,
Cabernet Franc, Pinot Noir, Touriga Nacional e Tempranillo; e as uvas brancas
Chardonnay, Sauvignon Blanc, Pinot Griogio e Ugni Blanc (Trebbiano) (Tonietto et
al., 2012). A produtividade dos vinhedos na região situa-se entre 8 e 12 t há-1,
dependendo da cultivar e das condições climáticas da safra. As uvas produzidas
originam principalmente vinhos tranquilos, embora venha crescendo em importância
a produção de uvas, das castas Chardonnay e Pinot Noir, para a elaboração de
espumantes (IBRAVIN, 2015).
Figura 1. Regiões vitivinícolas do Rio Grande do Sul, com destaque para a
região da Campanha.
Fonte: Revista Eno Estilo, 2015.
21
2.3 As Leveduras e o processo de vinificação
A conversão do mosto da uva em vinho é promovida por um processo de
fermentação, que ocorre naturalmente pela ação de leveduras autóctones, e que
contribuem significativamente para as características químicas e organolépticas do
produto final (Fleet, 2003). A função principal das leveduras enológicas é garantir a
conversão rápida e completa de açúcar de uva em etanol, dióxido de carbono, e
metabólitos secundários, evitando a produção de defeitos (Jiménez-Martì et al,
2011). Embora muitos compostos do vinho estejam relacionados diretamente às
uvas, parte essencial do sabor do vinho é alcançada durante o processo de
fermentação alcoólica (Ilieva et al., 2015). É amplamente conhecido que a
diversidade de leveduras autóctones é responsável pela produção de vinhos com
qualidade diferenciada por originar produtos de sabor peculiar, pois desempenham
um papel central no desenvolvimento de sabor e aroma de vinho, como resultado de
seus mecanismos bioquímicos e metabólicos (Fleet, 2003; Loira et al., 2015; Medina
et al., 2013).
Para o processo de vinificação, um dos mais importantes avanços
tecnológicos tem sido o uso de culturas selecionadas de Saccharomyces cerevisiae
para a inoculação em mosto de uva. Isto porque o controle microbiológico do
processo de fermentação permite uma melhor gestão da fermentação alcoólica,
garantindo qualidade e predição das suas características (Molina et al., 2009). No
entanto, são as espécies não-Saccharomyces que dominam a fase inicial de
processo de vinificação, e podem persistir durante outros estádios da vinificação,
sendo também responsáveis pela fermentação alcoólica, podendo afetar o estilo do
produto final (Contreras et al., 2015).
2.3.2 Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae (SC) está incluída no Domínio Eukaryota, Reino
Fungi, Filo Ascomycota, Classe Saccharomycetes, Ordem Saccharomycetales,
Família Saccharomycetaceae, Gênero Saccharomyces e espécie cerevisiae. São
fungos unicelulares diplóides que se reproduzem assexuadamente por brotamento
ou sexuada por esporulação (meiose, segregação e formação de haplóides). S.
cerevisiae consiste em células com aproximadamente 3µm de diâmetro que são
22
capazes de dividir-se a cada 90 minutos em condições nutricionais adequadas
(Ribéreau-Gayon et al., 2003; Suárez-Lepe e Iñigo Leal, 2004).
O gênero Saccharomyces teve inúmeras mudanças taxonômicas ao longo
dos anos. Atualmente, de acordo com a última revisão taxonômica, 14 espécies são
aceitas dentro do gênero Saccharomyces, as quais estão classificadas em três
grupos. O complexo Saccharomyces senso lato inclui Saccharomyces barnettii,
Saccharomyces castellii, Saccharomyces dairenensis, Saccharomyces exiguus,
Saccharomyces rosinii, Saccharomyces servazzii, Saccharomyces spencerorum,
Saccharomyces transvaalensis e Saccharomyces unisporus. O segundo grupo inclui
a Saccharomyces kluyveri. O terceiro grupo, o qual inclui espécies de interesse
biotecnológico, consiste do complexo Saccharomyces senso stricto, compreendendo
Saccharomyces bayanus, Saccharomyces cerevisiae e Saccharomyces pastorianus,
todos associados com fermentação industrial, e Saccharomyces paradoxus, a única
espécie Saccharomyces senso stricto, tipicamente isolada a partir de habitat natural
(insetos, árvores e exsudatos). Recentemente, três novas espécies isoladas a partir
de habitat natural, Saccharomyces cariocanus, Saccharomyces kudriavzvii e
Saccharomyces mikatae, têm sido incluídas dentro do grupo Saccharomyces senso
stricto (Querol e Belloch, 2003).
Segundo Querol et al. (2003), a fermentação alcoólica é uma das principais
fases da produção de vinho e é geralmente conduzida por leveduras pertencentes a
espécies de Saccharomyces cerevisiae. As cepas nativas e industriais de S.
cerevisiae são organismos altamente especializados, que evoluíram para utilizar
todo o seu potencial nos diferentes ambientes ou nichos ecológicos. Assim, durante
a fermentação alcoólica, as leveduras foram adaptadas aos diferentes tipos de
condições, tais como o estresse oxidativo, osmótico e etanólico. Condições
extremas como essas, podem conduzir a uma redução na velocidade de
crescimento e taxa de sobrevivência, e portanto, tendem a reduzir a eficiência de
fermentação. A melhor e mais rápida levedura é capaz de adaptar-se às mudanças
no ambiente, aumentando a probabilidade de ser espécie dominante durante o
processo de vinificação.
2.3.3 Leveduras não-Saccharomyces
Para espécies não-Saccharomyces (NS), podem ser citadas como
representativas no processo enológico Torulaspora delbrueckii, Metschnikowia
23
pulcherrima, Candida zemplinina, Lachancea thermotolerans e Hanseniaspora
uvarum (Rodríguez et al, 2010; Comitini et al, 2011; Medina et al, 2012.; Sadoudi et
al, 2012.; Gobbi et al, 2013.; Hong e Park, 2013; Medina et al., 2013).
Recentemente, tem havido um interesse crescente na valorização de cepas
não-Saccharomyces em cultura mista com S. cerevisiae para produção de vinho
(Comitini et al., 2011; Sadoudi et al., 2012; Gobbi et al., 2013; Medina et al., 2013).
Estes estudos demonstraram que as espécies não-Saccharomyces poderiam ter
tanto influências benéficas como negativas sobre as características de fermentação
de vinhos. Para o aspecto benéfico, algumas espécies não- Saccharomyces foram
testados para modificar positivamente a composição química do vinho, contribuindo
especialmente para as características sensoriais (Whitener et al., 2015). Como
impacto negativo, o crescimento de certas cepas não-Saccharomyces em mostos de
uvas podem causar o desenvolvimento e interações antagonistas entre leveduras, e
levarem a excessivo acúmulo de vários metabolitos indesejáveis, tais como ácido
acético, acetato de etila, aldeído, e de acetoína. Outra preocupação é que, algumas
espécies não-Saccharomyces, quando se desenvolvem durante a fermentação,
diminuem o poder de fermentação, bem como a tolerância ao etanol e/ou SO2,
havendo a necessidade de se conduzir co-fermentação. Portanto, o emprego de
cepas não-Saccharomyces ainda não é uma prática comum, sendo que novos e
mais exaustivos estudos são necessários para o conhecimento da influência de
inoculação microbiana no início da elaboração de vinhos.
2.4 Técnicas moleculares empregadas na caracterização de linhagens de
leveduras
A identificação molecular de leveduras é um procedimento amplamente aceito
para a caracterização desses microrganismos (Esteve-Zarzozo et al., 1999; Josepa
et al., 2000; Xufre et al., 2000; Renault et al., 2009; Zott et al, 2010; Tofalo et al.,
2014) . Embora as técnicas estejam em permanente evolução, o princípio é
semelhante entre elas. A seguir estão descritas as principais estratégias.
2.4.1 Sequenciamento do DNA ribossomal
As espécies de leveduras podem ser identificadas por comparação de
sequências de nucleotídeos de regiões de rDNA. As duas regiões mais vulgarmente
24
utilizados são as regiões D1 e D2, que codificam as subunidades ribossomais 26S e
18S (James et al., 1997; Kurtzman e Robnett, 1998). A disponibilidade de
sequências em bancos de dados de DNA, particularmente para a região de D1 / D2
do gene 26S, torna esta técnica útil para a atribuição de levedura desconhecidas
para uma espécie específica, quando a homologia da sequência é superior a 99%
(Kurtzman e Robnett, 1998).
2.4.2 Análise de restrição do DNA ribossomal
Métodos mais simples foram concebidos com base na amplificação por PCR
de regiões de rDNA, seguido por análise de restrição dos produtos amplificados.
Uma região muito útil do DNAr que pode ser usada para diferenciar as espécies é o
gene 5.8S e as regiões adjacentes intergênicas ITS1 e ITS2. Esta técnica foi usada
para identificação de leveduras vínicas (Guillamón et al., 1998). Os fragmentos
amplificados e perfis de restrição para estas espécies com HaeIII, HinfI, CfoI e DdeI
estão disponíveis online em http://yeast-id.com/. Na ausência de perfis de restrição,
o procedimento é sequenciar o DNA ribossomal, como descrito no item anterior.
Quando perfis de restrição são coincidentes, a identificação pode também contar
com a utilização de testes bioquímicos clássicos (Barata et al., 2008).
2.4.3 Reação em cadeia da polimerase (PCR), Eletroforese de gradiente
em gel desnaturante (DGCE)
Esta técnica de impressão digital genética baseada na amplificação por PCR
e eletroforese de gradiente em gel desnaturante (DGGE) foi introduzido na ecologia
microbiana por Muyzer et al. (1993). Ela permite separar fragmentos de DNA com o
mesmo comprimento mas com diferentes sequências. A migração do DNA é
retardada quando as fitas de DNA se dissociam a uma concentração específica do
agente desnaturante. Uma técnica relacionada é a eletroforese em gel com
gradiente de temperatura (TGGE), que se baseia em um gradiente linear de
temperatura para a separação de moléculas de DNA (Fernández-Espinar et al.,
2011). Os métodos de DGGE e TGGE foram recentemente utilizados por Andorrà et
al. (2008) e Renouf e Lonvaud-Funel (2007), para a identificação de leveduras em
fermentações. Estas técnicas são diretamente aplicadas à amostra, mas a baixa
sensibilidade é uma grande desvantagem para estudar as populações minoritárias.
25
3 HIPÓTESE E OBJETIVOS
3.1 Hipótese
Acredita-se que, pela amplitude da atividade vitícola já existente , assim
como pelas peculiaridades do bioma local (radiação, ventos, pluviosidade,
temperaturas), existam cepas de leveduras autóctones, com potencial enológico.
3.2 Objetivo Geral
Prospectar leveduras com potencial enológico dentro do bioma local.
3.3 Objetivos Específicos
- Prospectar cepas de leveduras a partir de 3 variedades de uvas, Cabernet
Sauvignon, Tannat e Merlot, produzidas no município de Dom Pedrito, localizado na
Região da Campanha do RS.
- Caracterizar cepas de leveduras com aptidão enológica;
- Caracterizar cepas de leveduras tolerantes à altas concentrações de açúcar;
- Caracterizar cepas de leveduras tolerantes à altas concentrações de álcool;
- Caracterizar cepas de leveduras com baixa produção de ácido sulfídrico.
26
4 CAPÍTULOS
4.1 CAPÍTULO 1 – Relatório de Atividades
4.1.1 Material e Métodos
4.1.1.1 Leveduras
Foram utilizadas cepas de leveduras autóctones, isoladas a partir de uvas
Vitis vinifera das variedades Tannat, Cabernet Sauvignon e Merlot em estádio de
maturação industrial (acima de 22 °Babo), colhidas em 9 vinhedos, em três
propriedades do município de Dom Pedrito-RS (Latitude 30º 58' 58" S, Longitude 54º
40' 23" W), além de uma levedura comercial Saccharomyces cerevisiae UCD522
(Maurivin, London, UK) como microrganismo controle. Para cada variedade de uva,
foram colhidos aleatoriamente no vinhedo, na safra 2014/15 em torno de 15 kg de
uvas e, destes, 1,5 kg foram utilizados para isolar as leveduras. Para o isolamento,
uma alíquota 0,1 mL de mosto de cada variedade de uva foi semeada na superfície
de ágar YEPD (yeast extract peptone dextrose), com 10 repetições, e incubadas a
30 ºC/72h. Foram selecionadas 55 colônias típicas de leveduras que foram
repicadas para YEPD suplementado com 6 g L-1 ácido tartárico e incubadas a
30ºC/72h. AS 39 colônias que cresceram no meio suplementado com ácido tartárico
e o controle positivo foram semeadas em ágar YEPD suplementado com 30 mg mL-1
de cloranfenicol e incubadas a 30 ºC/72h. As cepas, após isolamento, foram
conservadas em ágar YEPD a 4 ºC, com repiques a cada 15 dias.
4.2.1.2 Caracterização Morfológica
As leveduras já isoladas, foram repicadas em meio YEPD, por esgotamento, e
incubadas a 30 °C/24h. Após, as colônias foram visualizadas em microscópio óptico
Olympus CX21, utilizando lente com aumento de 10X, para avaliação da morfologia
da colônia. Para avaliação da morfologia celular, foi realizada coloração de Gram
dos isolados, que foram visualizados em microscópio óptico, utilizando lente de
imersão com aumento de 100X.
27
4.2.1.3 Caracterização Enológica
Os 39 isolados e o controle positivo foram submetidos à testes para avaliação
da aptidão enológica. Os dados obtidos por caracterização enológica foram
convertidos em valores adimensionais, atribuindo para cada isolado os seguintes
valores: “0” para o nível muito baixo/nulo; “1” para nível baixo; “2” para nível médio;
e, “3” para nível alto (Adaptado de Capece et al., 2012).
- Teste de exclusão por estresse:
As leveduras foram crescidas em meio sólido YEPD a 37 ºC durante 72 horas.
As leveduras que cresceram nesta temperatura foram transferidas para o meio
sólido YEPD contendo 8% (v/v) de etanol e colocadas em estufa a 30 ºC durante 72
horas. As leveduras crescidas na presença de etanol foram semeadas em meio
YEPG 20% (p/v) de glicose e colocadas em estufa a 30 ºC durante 72 horas. As
leveduras resistentes a esta concentração de fonte de carbono foram crescidas em
meio YEP (Yeast Extract Peptone) contendo 20 g% (p/v) de sacarose adicionado de
8% (v/v) de etanol a 30 ºC durante 72 horas.
- Capacidade fermentativa:
A capacidade fermentativa dos isolados foi verificada em tubos de ensaio
contendo tubos de Durhan invertidos, 10 mL de meio para fermentação e um volume
de inóculo contendo 107 UFC (Adaptado de Anchorena-Matienzo, 2002).
- Produção de sulfeto de hidrogênio (H2S):
Os isolados e a levedura controle foram semeadas em placas de Petri
contendo meio Agar LA e em placas de Petri contendo o meio sólido YEPD
(controle) e para o crescimento foram colocadas em estufa a 30 ºC durante 10 dias.
Decorrido o tempo, foi observado o aparecimento ou não de colônias enegrecidas,
característica de produção do sulfeto de hidrogênio (Guimarães, 2006).
- Tolerância à temperatura
Os isolados e a levedura controle foram semeadas em placas de Petri
contendo meio sólido YEPD e colocadas em estufas com diferentes temperaturas
28
durante 72 horas. Para verificar o efeito da temperatura no crescimento foram
empregados 25 ºC, 30 ºC, 37 ºC e 45ºC (Guimarães, 2006).
- Tolerância ao etanol
Para verificar o efeito da concentração de etanol no crescimento, as leveduras
isoladas e a levedura controle foram semeadas em placas de petri contendo meio
YEPD sem e com a suplementação de etanol nas concentrações de 10% (v/v), 13%
(v/v) e 15% (v/v). As placas foram incubadas a 30 ºC durante 72 horas (Adaptado de
Guimarães, 2006 e Reis, 2011).
4.2.1.4 Identificação molecular das leveduras
Foram selecionadas três cepas de leveduras (CS45, GM50 e ORG55) que
apresentaram desempenho semelhante ao controle positivo nos testes de
caracterização tecnológica para identificação molecular, através de sequenciamento
pelo método de Sanger (França et al., 2002). O DNA foi extraído utilizando kit ZR
Fungal/Bacterial DNA MiniPrep™, amplificação (PCR) da região ITS 1 e 2
utilizando primers específicos e purificação do DNA amplificado com o kit QIAquick
Gel Extraction®. A reação foi preparada utilizando kit Big Dye Terminator v 3.1 Cycle
Sequencing (Applied Biosystems, Warrington, UK) e posterior sequenciamento em
plataforma ABI 3500 life Technologies. As sequências obtidas foram comparadas
com a base de dados do Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia
(BLAST/NCBI) (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov).
4.2.1.5 Microvinificação
As três cepas selecionadas para identificação molecular foram utilizadas para
microvinificação. Esse processo foi realizado em dois ensaios: microvinificação em
mosto sulfitado, buscando simular uma condição usual de vinificação, e
microvinificação em suco pasteurizado, com o intuito de se evitar a competição com
a contaminação existente no mosto.
4.2.1.5.1 Ensaio 1: Microvinificação em mosto sulfitado
As uvas da cv. Cabernet Sauvignon, oriundas de um vinhedo localizado no
município de Dom Pedrito-RS, foram recebidas e armazenadas por 1 dia em câmara
fria a 2 ºC, seguindo-se o desengace e esmagamento, análise físico-química
29
(densidade de 1,1319, 26,01 °Babo, pH 3,23, acidez total de 92,7 meq L-1, e acidez
volátil de 1,9 meq L-1), pesagem e sulfitagem com metabissulfito de potássio (15 mg
Kg-1). O experimento foi realizado em triplicata, utilizando um volume de 12 Kg para
cada repetição. O inóculo do controle positivo e das leveduras autóctones foi
adicionado um dia após a sulfitagem do mosto em uma concentração de 107 UFC
mL-1. A maceração com casca ocorreu até o 5º dia de fermentação, com três
remontagens diárias. A descuba aconteceu no 5º dia de fermentação, que foi
acompanhada até o 40º dia, quando realizou-se a trasfega e avaliação do vinho.
4.2.1.5.2 Ensaio 2: Microvinificação em suco pasteurizado
O inoculo do controle positivo e das leveduras autóctones foram adicionados
na concentração de 107 UFC mL-1, em amostras de suco pasteurizado (densidade de
1,1007, 20,37 °Babo, pH 3,26, acidez total de 92,4 meq L-1, e acidez volátil de 5,35
meq L-1), sem adição de conservantes, chaptalizado com quantidade suficiente de
glicose para produzir 14,5% de álcool (v/v). O experimento foi conduzido em
triplicata, com um volume de 500 mL para cada repetição. À semelhança da
microvinificação com mosto sulfitado, procederam-se as análises físico-químicas do
vinho após 40 dias.
4.2.1.6 Análises físico-químicas dos vinhos
Para os vinhos elaborados conforme os itens 4.2.1.5.1 e 4.2.1.5.2, foram
realizadas análises físico-químicas de concentração de densidade, pH, acidez total,
acidez volátil, álcool, açúcares redutores, índice de polifenóis totais (IPT),
antocianinas totais, intensidade de cor, tonalidade de cor, SO2 total e SO2 livre, de
acordo com Rizzon (2010).
4.2.1.7 Análises Estatísticas
Para os resultados obtidos através das análises físico-químicas, foi realizado
teste de análise de variância (ANOVA) com probabilidade de 5% pelo teste de
Tukey, utilizando o Software Satística® 12.
30
4.2.2 Resultados
4.2.2.1 Caracterização morfológica
Da prospecção de leveduras na três cultivares de Vitis vinífera e amostradas,
foi possível isolar 39 cepas, das quais 27 foram isoladas a partir de uvas da cv.
Cabernet Sauvignon, 5 a partir de uvas da cv. Tannat e 7 a partir de uvas da cv.
Merlot. A partir da caracterização morfológica, verificou-se que, das 39 cepas
autóctones analisadas, 21 apresentaram colônias lisas, textura mucosa e formato
convexo e 18 (CS4, CS5, M8, M9, CS11, CS12, CS13, CS14, CS15, CS16, CS17,
M19, M20, CS21, T22, T31, ORG54 e ORG56) apresentaram colônias rugosas,
textura farinosa e formato achatado. Por análise de morfologia celular evidenciou-se
que, das 39 cepas autóctones, 3 (GT47, ORG55 e GCS57) eram células esféricas, 7
(GM59, GT48, GM49, GM 50, GCS51, GCS52 e GT46) células apiculadas, 4
(GCS58, CS45, CS41b e CS41a) células ovoides e as 25 restantes, eram células
ovoide-alargadas (Tabela 1).
Tabela 1. Características morfológicas de cepas autóctones isoladas a partir de
vinhedos cultivados na região da Campanha do Rio Grande do Sul
Código da amostra
Característica morfológica da colônia*
Característica Morfológica
celular**
Código da amostra
Característica morfológica da colônia*
Característica Morfológica
celular**
CT (controle)
1 3 CS 40 1 4
CS 4 3 4 CS 41a 2 3
CS 5 3 4 CS 41b 2 3
M 8 3 4 CS 43 1 4
M 9 3 4 CS 44 1 4
CS 11 3 4 CS 45 1 3
CS 12 3 4 GT 46 1 2
CS 13 3 4 GT 47 2 1
CS 14 3 4 GT 48 1 2
CS 15 3 4 GM 49 1 2
CS 16 3 4 GM 50 1 2
CS 17 3 4 GCS 51 1 2
M 19 3 4 GCS 52 1 2
M 20 3 4 GCS 53 2 4
CS 21 3 4 ORG 54 3 4
T 22 3 4 ORG 55 2 1
T 31 3 4 ORG 56 3 4
31
CS 34 1 4 GCS 57 1 1
CS 35 1 4 GCS 58 1 3
CS 36 1 4 GM 59 1 2
*1= Colônias lisas, textura mucosa e formato convexo; 2= Colônias lisas, textura mucosa com pigmento de coloração laranja e formato convexo; 3= Colônias rugosas, textura farinosa e formato achatado; 4= N/A(não se aplica) ** 1= células esféricas; 2= células apiculadas; 3= células ovoides; 4= células ovoide-alargadas
4.2.2.2 Caracterização Enológica
A capacidade fermentativa das cepas autóctones foi avaliada através da
produção de gás e pelo aprisionamento do gás em tubos de Durham. Dos 39
isolados, apenas 7 (T31, CS40, CS41a, CS41b, GCS53, ORG54 E ORG56)
apresentaram baixa ou nula capacidade fermentativa, enquanto que 10 (CS40,
GT46, GM49, GCS51, GCS53, ORG54, ORG56, GCS57, GCS58 e GM59) cepas
não toleraram estresse osmótico e térmico. A produção de Sulfeto de Hidrogênio
(H2S) foi média ou alta para 16 (CS4, CS5, CS11, CS12, CS15, CS16, CS17, M19,
M20, CS21, CS34, CS35, CS36, CS43, ORG54 e GCS57) isolados estudados.
Todos isolados cresceram nas temperaturas testadas no teste de tolerância e
apenas 4 (CS40, CS43, CS44, GCS51) tiveram baixa tolerância ao etanol (Tabela
2).
Tabela 2. Caracterização tecnológica de cepas autóctones isoladas de vinhedos
localizados na região da Campanha do Rio Grande do Sul
Código da
amostra
Capacidade Fermentativa
Tolerância ao
estresse
Produção de H2S
Tolerância à
temperatura
Tolerância ao
Etanol
CT (controle)
3 3 0 3 3
CS 4 2 3 2 3 3
CS 5 2 3 2 3 3
M 8 3 3 1 3 3
M 9 2 3 1 3 3
CS 11 3 3 3 3 3
CS 12 2 3 3 3 3
CS 13 2 3 1 3 3
CS 14 2 3 1 3 3
CS 15 2 3 3 3 3
CS 16 2 3 3 3 3
CS 17 2 3 2 3 3
32
M 19 3 3 2 3 3
M 20 3 3 2 3 3
CS 21 2 3 2 3 3
T 22 2 3 1 3 3
T 31 1 3 1 3 3
CS 34 2 3 2 3 3
CS 35 3 3 2 3 3
CS 36 2 3 3 3 3
CS 40 0 0 4 2 1
CS 41a 0 3 0 3 2
CS 41b 0 3 0 3 2
CS 43 2 3 2 3 1
CS 44 2 2 0 3 1
CS 45 3 3 0 3 3
GT 46 3 0 0 2 2
GT 47 3 3 0 3 2
GT 48 3 3 0 3 2
GM 49 3 0 0 2 2
GM 50 3 3 0 3 3
GCS 51 3 0 0 2 1
GCS 52 3 1 0 3 2
GCS 53 0 0 4 2 4
ORG 54 0 0 3 2 4
ORG 55 3 3 0 3 3
ORG 56 0 0 4 2 4
GCS 57 3 0 2 2 3
GCS 58 2 0 0 2 2
GM 59 3 0 0 2 2
0= nível muito baixo/nulo; 1= nível baixo; 2= nível médio; 3= nível alto (CAPECE, 2012), 4= N/A (não se aplica).
4.2.2.3 Identificação molecular das leveduras
Para a identificação molecular das leveduras, foram escolhidos três isolados
(CS45, GM50 e ORG55) com comportamento similar ou superior ao controle positivo
nas avaliações de caracterização tecnológica. A cepa CS45, que é um isolado da
uva Cabernet Sauvignon, ao ter sequenciada a região do rDNA, apresentou 99% de
identidade com a espécie Lachancea thermotolerans; a cepa GM50, que é um
isolado de uva Merlot, apresentou sequência do rDNA 98% idêntico ao gênero
Hanseniaspora uvarum, a terceira cepa (ORG55), foi um isolado de uva Cabernet
Sauvignon, cultivada no sistema orgânico, e apresentou 97% de identidade de rDNA
com a espécie Metschnikowia pulcherrima (Tabela 3).
33
Tabela 3. Identificação das cepas autóctones isoladas a partir de 3 vinhedos
localizados na região da Campanha do Rio Grande do Sul
Espécie Identificação
do isolado*
Número de
acesso
% de
identidade Variedade de uva
Lachancea
thermotolerans1 CS45
CU928180
99%
Cabernet
Sauvignon
Hanseniaspora
uvarum2 GM50 KF728823 98% Merlot
Metschnikowia
pulcherrima3 ORG55 HG421420 97%
Cabernet
Sauvignon
cultivada em
sistema orgânico
* CS45: isolado autóctone de uvas Cabernet Sauvignon; GM50: isolado autóctone de uvas Merlot; ORG55: isolado autóctone de uvas Cabernet Sauvignon cultivadas em sistema orgânico.
4.2.2.4 Microvinificação
Para estudar a aptidão enológica, realizou-se microvinificação em mosto sulfitado.
Para isso, foram utilizadas uvas com maturação avançada, de colheita tardia, com
elevada concentração de açúcares. O resultado das análises físico-químicas dos
vinhos produzidos com a cepa comercial (controle) e com as cepas autóctones
(CS45, GM50 e ORG55) diferiu estatisticamente para as variáveis acidez total,
índice de polifenóis totais (IPT), intensidade de cor, acidez volátil (> 15 meq.L-1) e
concentração alcoólica. Apenas as variáveis tonalidade de cor, SO2 livre e SO2 total
não diferiram estatisticamente entre as amostras (Tabela 4). Concluídas as
fermentações, observou-se que todas as leveduras foram capazes de realizar o
processo fermentativo, atingindo elevadas concentrações de álcool (16,98 a 17,90%,
v/v), o que é coerente com o elevado grau Babo inicial (26,01). Da mesma forma, os
valores de densidade (0,9775 a 0,9785) e pH (4,09 a 4,20), após o processo
fermentativo, são coerentes com as características do mosto inicial e indicam que
houve uma evolução normal da fermentação, com o consumo de açúcares (baixo
valores de açúcares residuais) e elevação do conteúdo de álcool. A acidez volátil
34
aumentou em todos os ensaios de fermentação, passando de 1,9 meq.L-1 no mosto,
para valores de até 18,83 meq.L-1 no vinho.
A implicação das leveduras vínicas na cor vinho tinto é dupla. Influenciam na
extração de antocianinas durante a maceração e fermentação, em função da sua
capacidade de produção de álcool e também podem ter efeito sobre a formação de
formas mais estáveis de antocianina durante a maturação e envelhecimento. Por
outro lado, podem promover a degradação das antocianinas e participar de
interações com pigmentos que resultam na perda de cor (Ribéreau-Gayon et al.,
2003). Para antocianinas totais, o isolado CS45 se mostrou capaz de influenciar
significativamente na extração desses compostos em relação aos demais, resultado
que não foi verificado para a variável de intensidade de cor, onde o vinho elaborado
a partir da levedura controle apresentou maior valor.
Tabela 4. Características físico-químicas de vinhos obtidos através de fermentação
em mosto sulfitado com levedura comercial e leveduras nativas
CT** CS45 GM50 ORG55 CV (%)
Densidade 0,9775 b* 0,9785 a 0,9784 a 0,9780 ab 0,02
pH 4,17 ab 4,09 b 4,14 ab 4,20 a 0,87
Acidez total (meq.L-1) 90,533 a 91,067 a 83,733 b 80,067 b 2,86
Acidez volátil (meq.L-1) 16,78 ab 18,83 a 16,08 b 17,48 ab 5,37
Álcool (% v/v) 17,883 a 16,977 b 17,090 b 17,507 ab 1,35
Açúcares redutores ( g.L-1) 4,11 b 8,52 a 3,963 b 5,143 b 17,27
IPT 34,93 a 24,90 b 27,43 ab 27,93 ab 10,39
Antocianinas totais (mg.L-1) 36,601 b 76,565 a 43,068 ab 32,333 b 27,74
Intensidade de cor 1,1993 a 0,5147 b 0,7593 b 0,6730 b 15,16
Tonalidade de cor 1,5627 a 1,6620 a 1,6363 a 1,5317 a 9,54
SO2 total (mg.L-1) 8,67 a 21,93 a 15,33 a 26,47 a 65,44
SO2 livre (mg.L-1) 4,83 a 4,5 a 4,67 a 4,80 a 19,81
* Letras diferentes na linha indicam diferença significativa ao nível de 5% de probabilidade, pelo teste de Tukey. ** CT: controle positivo (levedura Saccharomyces cerevisiae UCD522, Maurivin); CS45: isolado autóctone de uvas Cabernet Sauvignon; GM50: isolado autóctone de uvas Merlot; ORG55: isolado autóctone de uvas Cabernet Sauvignon cultivadas em sistema orgânico.
Os vinhos elaborados a partir de suco pasteurizado apresentaram
características distintas em função da cepa utilizada. As variáveis de densidade e
açúcares redutores apresentaram diferença estatística para todas as amostras. Para
35
as demais variáveis, o isolado com resultados similares ao controle positivo foi
CS45, enquanto ORG55 foi o que mais se diferenciou da cepa controle (Tabela 5).
Ao contrário que diz a literatura (Ribéreau-Gayon et al., 2003), para os vinhos
elaborados a partir de suco pasteurizado as variáveis antocianinas totais e índice de
polifenóis totais foram significativamente maiores para os vinhos com menor
quantidade de álcool, o que pode ser explicado pelo efeito da constante dielétrica
sobre a extração desses compostos. Assim, pode-se relacionar esse resultado a
uma menor interação entre as leveduras e os compostos de cor, em relação os
demais isolados testados. Quando se avaliou tonalidade de cor, os isolados
ORG55 e GM50 foram os que geraram vinhos com menor valor, indicando que os
vinhos apresentavam coloração mais intensa para os matizes vermelhos em relação
aos amarelos (atijolados).
Tabela 5. Características físico-químicas de vinhos obtidos através de fermentação
em suco pasteurizado com levedura comercial e leveduras nativas.
AMOSTRA CT** CS45 GM50 ORG55 CV (%)
Densidade 0,9955 d* 1,0452 c 1,0683 b 1,0849 a 0,32
pH 3,41 a 3,19 c 3,33 b 3,27 b 0,71
Acidez total (meq.L-1) 108,63 b 146,93 a 101,53 bc 99,9 c 2.82
Acidez volátil (meq.L-1) 8,42 b 8,60 b 11,93 a 6,97 b 10,09
Álcool (% v/v) 14,13 a 7,53 b 4,34 c 2,14 d 4,05
Açúcares redutores ( g.L-1) 5,3 d 124,4 c 181,88 b 221,36 a 3,83
IPT 45,63 c 48,17 b 51,37 a 52,23 a 1,45
Antocianinas totais (mg.L-1) 117,31 b 125,19 ab 129,33 ab 143,56 a 6,52
Intensidade de cor 1,0833 a 1,2300 a 1,2567 a 1,2580 a 12,41
Tonalidade de cor 1,0572 a 1,0412 a 0,9884 b 0,9857 b 1,27
* Letras diferentes na linha indicam diferença significativa ao nível de 5% de probabilidade, pelo teste de Tukey. ** CT: controle positivo (levedura Saccharomyces cerevisiae UCD522, Maurivin); CS45: isolado autóctone de uvas Cabernet Sauvignon; GM50: isolado autóctone de uvas Merlot; ORG55: isolado autóctone de uvas Cabernet Sauvignon cultivadas em sistema orgânico.
4.2.3 Discussão
É amplamente conhecido que a vinificação com leveduras autóctones pode
conferir tipicidade a um vinho ou, no mínimo, agregar sinal distintivo, como é o caso
de vinhos orgânicos e biodinâmicos (Fleet, 2003; Domizio et al., 2007; Viana et al.,
36
2008; Moreira et al., 2011; Holt et al., 2013; Liang et al., 2013). Mas, para isso, há
que se prospectar leveduras em cada bioma, tendo em vista que a diversidade e
variabilidade de leveduras na superfície da uva é influenciada, além das condições
climáticas e localização geográfica da região (Raspor et al., 2006), também pela
integridade das bagas (Ribereau-Gayon et al., 2003). É nesse contexto que foram
isoladas 39 leveduras de uvas Cabernet Sauvignon, Tannat e Merlot, todas
produzidas na região da Campanha Gaúcha, novo território da produção de uvas e
vinhos finos no Brasil. Para avaliar a aptidão dessas leveduras, foram feitas
caracterizações morfológicas, tecnológicas e moleculares. A partir da caracterização
morfológica e tecnológica, verificou-se que 3 isolados autóctones (CS45, GM50 E
ORG55) apresentaram potencial enológico, com alta capacidade fermentativa, alta
tolerância ao estresse e baixa produção de H2S, na condição de leveduras não-
Saccharomyces.
Em função do bom desempenho na caracterização tecnológica, 3 cepas
foram selecionadas para sequenciamento do rDNA, região ITS 1 e 2, permitindo a
confirmação de que se tratam de três espécies de leveduras não-Saccharomyces,
com, no mínimo, 97% de identidade genômica às sequências depositadas no
GenBank (Tabela 3). As 3 leveduras autóctones isoladas são Lachancea
thermotolerans, Hanseniaspora uvarum e Metschnikowia pulcherrima e foram
isoladas das cultivares Cabernet Sauvignon, Merlot e Cabernet Sauvignon orgânico,
respectivamente. Essas espécies de leveduras vêm sendo amplamente estudadas
na enologia principalmente por agregarem características sensoriais importantes aos
vinhos (Settanni et al., 2012, Gobbi et al., 2013, Domizio et al., 2014), e por estarem
presentes nas uvas e nas primeiras fases da fermentação espontânea (Ortiz et al.,
2013).
As uvas utilizadas para microvinificação, na forma de mosto sulfitado,
estavam sobremaduras. Nesse caso, a fermentação alcoólica ocorreu nos níveis
clássicos para vinificação em tinto, e atingindo concentração de álcool elevada, de
16,98 a 17,88% (v/v). Esse achado indica que houve desenvolvimento de
Saccharomyces ou outra espécie que tolera altas concentrações de álcool, tendo em
vista que as leveduras-alvo desse trabalho (M. pulcherrima; H. uvarum; L.
thermotolerans), normalmente não toleram produção de álcool acima de 8% (v/v), o
que foi comprovado com o teste de microvinificação em suco pasteurizado. As cepas
testadas, geraram vinhos com 14,13% (Controle), 7,53% (CS45) , 4,34% (GM50) e
37
2,14% (ORG55) de álcool, o que é coerente com as características de leveduras dos
gêneros Saccharomyces, Lachancea, Hanseniaspora e Metscnikowia,
respectivamente (Clemente-Jimenez et al., 2004; Comitini et al., 2011). Quanto aos
resultados observados, nos vinhos obtidos a partir de microvinificação em suco
pasteurizado, para antocianinas totais e índice de polifenóis totais, os maiores
valores foram encontrados nos vinhos com menor concentração de álcool, o que
pode ser explicado pelo aumento da constante dielétrica do meio, sabendo-se que a
solubilidade desses compostos depende mais fortemente da polaridade por serem
pigmentos hidrossolúveis (Gruz et al., 2013). Essas mesmas variáveis, quando
observadas nos vinhos obtidos a partir de microvinificação em mosto sulfitado, foram
influenciadas tanto pela menor concentração de álcool, como pela maior
concentração de SO2 total, que afeta de maneira significativa a extração dos
compostos fenólicos, principalmente as antocianinas (Lopes et al., 2007).
Sob o aspecto tecnológico, o mercado atual já oferece isolados selecionados
de Lachancea (CONCERTOTM/ Viniflora®) e Metschnikowia (Flavia® MP346,
Lallemand). Segundo Comitini, et al. (2011) e Gobbi et al. (2013), quando inoculada
em associação com S. cerevisiae, L. thermotolerans resulta em reduções no pH e
na acidez volátil, aumento de acidez total, de glicerol e de 2- feniletanol. Além
disso, o co-inóculo de uma cepa selvagem com S. cerevisiae contribui para uma
adequada cinética de fermentação com rápido arranque de fermentação,
continuidade e regularidade da fermentação associada. Esse evento provavelmente
ocorreu na fermentação inoculando as cepas não-Sacharomyces no mosto sulfitado.
Mais especificamente, quando se inoculou Lachancea (Kluyveromyces)
thermotolerans isolada em uvas Cabernet Sauvignon do bioma Pampa Gaúcho
(Região da Campanha do Rio Grande do Sul), o vinho se assemelhou àquele
produzido pela levedura controle no que tange ao pH, acidez total e acidez volátil.
Isso indica que, embora se trate de mesmo gênero e espécie daquela usada por
Comitini et al. (2011) e Gobbi et al. (2013), é possível que haja comportamento
enológico distinto principalmente quando a cepa é utilizada individualmente ou como
co-inóculo no início da fermentação, e com uvas de regiões distintas.
Conforme descrito por Clemente-Jimenez et al. (2004), Metschnikowia
pulcherrima, em geral, tem baixo poder fermentativo, o que foi evidenciado nesse
estudo, quando se realizou a microvinificação em suco pasteurizado. Porém, em
efeito sinérgico na co-cultura com S. cerevisiae, é capaz de promover a produção de
38
muitos compostos aromáticos, incluindo os ácidos graxos, ésteres e terpenóis
(Comitini et al., 2011; Sadoudi et al., 2012).
No que concerne à levedura Hanseniaspora uvarum isolada na Campanha do
RS se observou que, embora tolere etanol (Tabela 2), não tem capacidade para
produção de altas concentrações de álcool, tendo atingido até 4,34% (v/v). Além
disso, H. uvarum podem proporcionar aumento da síntese de alguns compostos
desejáveis, tais como álcoois superiores e ésteres (Moreira et al., 2005; Medina et
al., 2013), além de aumentar a acidez volátil (Suárez-Lepe e Iñigo Leal, 2004).
Durante o processo fermentativo com mosto sulfitado de uva C. Sauvignon
sobremadura, as leveduras autóctones foram capazes de produzir um vinho de
elevada concentração de álcool, semelhante ao que ocorreu à cepa comercial. Isso
ocorreu, provavelmente, em função de que, o SO2 tem poder de seleção sobre as
leveduras nativas, entretanto as leveduras do gênero Saccharomyces são bastante
resistentes à esse aditivo (Comitini et al., 2011), podendo ter ocorrido o
desenvolvimento das mesmas ao longo da fermentação, garantindo a fermentação
completa dos vinhos. Frente ao exposto, ficou evidenciado que as 3 cepas isoladas
e caracterizadas têm potencial enológico para serem usadas em processo
fermentativo em co-cultivo.
39
4.2 CAPÍTULO 2 – Microbiological characterization of grapes in the
Campanha Region of Rio Grande do Sul, Brazil reveals non-Saccharomyces
autochthonous yeasts with oenological potential.
(Artigo submetido à revista International Journal of Food Microbiology)
Suziane A. Jacobs a, b, *, Bruno Jacobs b, Fernando Zocche b, Renata G. S. Zocche b,
Gabriela H. Pötter c, Lucas M. Simões b, César V. Rombaldi a
a Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, CDTec, Universidade Federal de
Pelotas, RS, Brasil
b Curso de Enologia, Universidade Federal do Pampa, RS, Brasil
c Guatambu Estância do Vinho, Dom Pedrito, RS, Brasil
* Corresponding author. Tel.: +55 05399369395; fax: +55 05332437301
E-mail address: suzianeantes@unipampa.edu.br (Suziane A. Jacobs)
Curso de Enologia, Universidade Federal do Pampa, 96450-000, Dom Pedrito-RS,
Brazil
40
Abstract
Investigation of autochthonous yeasts is essential to enhance the production of wines
with regionally distinctive traits in a globally competitive market. Although the growth
of non-Saccharomyces yeasts during wine fermentation is widely recognized
to positively affect flavour and aroma when used with S. cerevisiae, the inability to
control spontaneous co-fermentation by these yeasts prevents their use in some
areas. In this study, we analyzed 39 autochthonous yeasts from grapes collected in
the Campanha region of Rio Grande Sul-Brazil, focusing on 3 primary isolates that
shared similar characteristics with an S. cerevisiae control. The behavior of these
yeasts, isolated from Cabernet Sauvignon, Merlot, and organically-grown Cabernet
Sauvignon grapes, during sulphited must and pasteurized grape must fermentation
was also evaluated. Notably, the strains (designated CS45, GM50, and
ORG55) shared 99% identity with Lachancea thermotolerans, 98% identity with
Hanseniaspora uvarum, and 97% identity with Metschnikowia pulcherrima,
respectively. The yeasts also displayed distinct behaviors during microvinification,
particularly in alcohol production. Other variables, such as the total polyphenols
index, total anthocyanins, and color tonality also appear to be influenced. Taken
together, the three autochthonous yeasts characterized here would be ideal
alternatives in co-culture fermentations with other Saccharomyces species during the
production of region-specific wines.
Keywords:
autochthonous yeast
wine
Lachancea thermotolerans
Metschnikowia pulcherrima
Hanseniaspora uvarum.
41
Introduction
Yeasts employed in alcoholic fermentation play an important
role in oenology, and can affect the alcohol content, color, taste, aroma, and
structure of the wine (Álvarez-Pérez et al., 2012; Fleet, 2003; Holt et al., 2013; Liang
et al., 2013; Loira et al., 2013). Notably, the various species of yeast typically
involved in the fermentation of grape must into wine can be classified into two
primary groups: (i) non-Saccharomyces species, which develop in the early stages of
fermentation and are associated with low alcohol levels; and, (ii) Saccharomyces
strains, which become dominant with increasing ethanol concentrations (Barata et.
al., 2012; Suárez-Lepe & Íñigo Leal, 2004; Tristezza et al., 2013). Furthermore, in
these two groups, there is currently an ample assortment of yeasts that can be used
for oenological manipulation, ranging from those that perform orthodox alcoholic
fermentations without significantly affecting other properties of the wine to those
employed with the specific aim of enhancing wine flavour (Callejon et al., 2010;
Molina et al., 2009). While the properties of many of these yeast strains and their
subsequent effect on winemaking have been characterized, the search for final
products with distinctive traits continues worldwide.
Recently, winemaking that utilizes autochthonous yeasts has been evaluated
as an alternative way to enhance wine fermentation in several countries (Capece et
al, 2012; Chavan et al., 2009; Contreras et al., 2015; Liang et al., 2013; Scacco et al.,
2012; Settanni et al., 2012; Synos et al., 2015). This oenological advancement is
largely related to the ability of the autochthonous yeasts to impart unique features to
the wine, making the quality of the final product more region-specific (Domizio et al.,
2007; Holt et al., 2013; Liang et al., 2013; Moreira et al., 2011). For example,
Settanni et al. (2012) isolated three autochthonous yeast species with a technological
aptitude for wine production when evaluating 51 strains of S. cerevisiae from the
local biome (Sicily, Italy). Similarly, Scacco et al. (2012) previously identified other
native yeast strains found in Sicilian wines that are capable of producing higher
concentrations of the compounds responsible for pear fruit notes, a characteristic
aroma of wines from this region.
In addition to the use of autochthonous yeast strains, there has also been a
recent surge of interest in mixed fermentation using both Saccharomyces and non-
Saccharomyces wine yeasts, with the aim of improving wine quality and complexity.
In fact, Gobbi et al. (2013) showed that simultaneous fermentation using Lachancea
42
(Kluyveromyces) thermotolerans and S. cerevisiae significantly increased the spicy
notes found in a wine. Moreover, in a similar study on the interactions between S.
cerevisiae and non-Saccharomyces yeasts (Sadoudi et al., 2012), it appears that the
entire aromatic metabolic pathway can be altered depending on the type of yeast
used during vinification. Thus, it would appear that various techniques, including the
use of native yeasts and mixed species fermentation, can be used to produce
enhanced region-specific wines. However, these techniques have gone largely
underused in some countries.
In Brazil, the main region for the production of fine wines is the Campanha
Gaúcha, a part of the Pampa Gaúcho (Latitude 30°S, Longitude 54°W; altitude 100-
300 m). Notably, this region is characterized by sandy soil with good drainage, a
temperate climate with hot and dry summers, an average annual rainfall of 1,370
mm, an average thermal amplitude of 17 ºC in the summer, and an average total
sunlight of 2.372 h each year. The wines from this region have been praised at both
the national and international level. However, there is currently a need to investigate
oenological alternatives in order to continue developing distinctive features in such a
competitive global market.
In the present study, we sought to evaluate the oenological potential of various
non-Saccharomyces yeasts isolated from fine grapes collected from the Campanha
region of Rio Grande do Sul in Brazil. In doing so, three specific strains, isolated from
Cabernet Sauvignon, Merlot, and organic-grown Cabernet Sauvignon grapes, were
identified as having fermentation properties similar to or better than an S.
cerevisiae control strain and were, therefore, further characterized here. Thus, it
would appear that yeasts with oenological potential in the Pampa Gaúcho region
could constitute an innovative element, to be employed either individually or in
association with other yeasts, in order to add value to wine produced in the area.
43
Materials and Methods
1. Yeasts
Autochthonous yeast strains isolated from Vitis vinifera grapes at a stage of
industrial maturation were collected from the Tannat, Cabernet Sauvignon, and
Merlot varieties in vineyards of the Dom Pedrito-RS city (Latitude 30º 58' 58" S,
Longitude 54º 40' 23" W). Further, a commercial S. cerevisiae UCD522 yeast strain
(Maurivin, London, UK) was used as a control microorganism. For each grape
variety, approximately 15 kg of grapes were randomly collected in the vineyard
during the 2014/2015 season, 1.5 kg of which was used to isolate the yeasts. A 0.1
mL aliquot of grape must from each variety was inoculated on the surface of yeast
extract peptone dextrose (YEPD) agar (n = 10) and incubated at 30 ºC for 72 h. A
total of 55 typical yeast colonies were then selected and subcultured into YEPD
medium supplemented with 6 g/L tartaric acid and incubated at 30 ºC for 72 h. Of
these, 39 colonies, as well as the positive control, were also inoculated in YEPD
medium supplemented with 30 mg/mL chloramphenicol and incubated at 30 ºC for 72
h. After isolation, the strains were conserved in YEPD agar at 4 ºC.
2. Technological characterization
The 39 yeast isolates and the positive control underwent various
characterization tests, including stress tolerance, fermentative capacity, production of
hydrogen sulphide (H2S), tolerance to temperature (24, 28, 32, and 37
ºC), and tolerance to ethanol (10, 13, and 15 %) (Guimarães et al., 2006). The data
obtained in this technological characterization were converted into dimensionless
values, assigning the following values to each isolate: "0" for very low/null levels;
"1" for low levels; "2" for medium levels; and "3" for high levels as previously
described (Capece et al., 2012).
3. Yeast identification
Three yeast strains (CS45, GM50, and ORG55) that presented a performance
similar to that of the positive control in the technological characterization assays were
selected for molecular identification by sequencing according to the Sanger method
(França et al., 2002). DNA was extracted using the ZR Fungal/Bacterial DNA
MiniPrep™ kit. PCR amplification of the ITS 1 and 2 regions was performed
44
using specific primers, and purification of amplified DNA was performed with the
QIAquick Gel Extraction® kit. The reaction was prepared using the Big Dye
Terminator v 3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems, Warrington, UK), and
subsequent sequencing was performed on a Life Technologies ABI 3500 platform.
The sequences obtained were compared with those from the National Center for
Biotechnology Information using BLAST software (BLAST/NCBI)
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov).
4. Microvinification
The three strains selected for molecular identification were then subjected to
microvinification. This process was carried out in two independent assays:
microvinification in sulphited must, simulating a common vinification condition, and
microvinification in pasteurized must, which was intended to represent an
environment without competition from contamination present in the must. These
assays are described below.
i. Microvinification in sulphited must
Cabernet Sauvignon grapes were received and stored for 1 day in a cold
chamber at 2 ºC, followed by destemming and crushing, physicochemical analysis
(density of 1.1319, 26.01 degrees Babo, pH 3.23, total acidity of 92.7 meq/L, and
volatile acidity of 1.9 meq/L), weighing, and sulphiting with potassium
metabisulphite (15 mg/kg). The isolated positive control and three autochthonous
yeast strains were added one day later at a concentration of 107 CFU/mL. The
maceration with skin took place on the fifth day of fermentation, with three daily
pumpings. The solids-liquids separation also occurred on the fifth day of
fermentation, and was monitored up to the fortieth day, when the racking and
evaluation of the completely fermented wines were carried out.
ii. Microvinification in pasteurized must
The positive control and three autochthonous yeasts were added at a
concentration of 107 CFU/mL to pasteurized grape juice samples (density of 1.1007,
20.37 degrees Babo, pH 3.26, total acidity of 92.4 meq/L, and volatile acidity of 5.35
meq/L). These samples lacked preservatives and were chaptalized with enough
45
glucose to yield 14.5 % alcohol (v/v). As in the sulphited must, the physicochemical
analysis of the wine took place 40 days into the fermentation process.
Results
The prospection and sampling of yeasts in three Vitis vinífera cultivars led to
the isolation of 39 strains, 27 of which were isolated from Cabernet Sauvignon
grapes, 5 from Tannat grapes, and 7 from Merlot grapes. Our technological
characterization of these strains revealed that, of the 39 autochthonous
strains isolated, 21 yielded smooth colonies with mucous texture and convex shape,
while 18 (CS4, CS5, M8, M9, CS11, CS12, CS13, CS14, CS15, CS16, CS17, M19,
M20, CS21, T22, T31, ORG54, and ORG56) yielded rough colonies with grainy
texture and flat shape. Further, it appears that the cell morphology of 3 strains
(GT47, ORG55, and GCS57) was spherical, while that of 7 others (GM59, GT48,
GM49, GM 50, GCS51, GCS52, and GT46) appeared to be apiculate, 4 (GCS58,
CS45, CS41b, and CS41a) were ovoid, and the remaining 25 strains were expanded
ovoid cells (Table 1).
Table 1. Morphological characteristics of autochthonous yeast strains isolated
from vineyards located in the Campanha region of Rio Grande do Sul.
Sample Code
Morphological feature of the colony *
Cellular morphologica
l feature **
Sample Code
Morphological feature of the colony *
Cellular morphologica
l feature **
CT (control)
1 3 CS 40 1 4
CS 4 3 4 CS 41a 2 3
CS 5 3 4 CS 41b 2 3
M 8 3 4 CS 43 1 4
M 9 3 4 CS 44 1 4
CS 11 3 4 CS 45 1 3
CS 12 3 4 GT 46 1 2
CS 13 3 4 GT 47 2 1
CS 14 3 4 GT 48 1 2
CS 15 3 4 GM 49 1 2
CS 16 3 4 GM 50 1 2
CS 17 3 4 GCS 51 1 2
M 19 3 4 GCS 52 1 2
M 20 3 4 GCS 53 2 4
46
CS 21 3 4 ORG 54 3 4
T 22 3 4 ORG 55 2 1
T 31 3 4 ORG 56 3 4
CS 34 1 4 GCS 57 1 1
CS 35 1 4 GCS 58 1 3
CS 36 1 4 GM 59 1 2
* 1: Smooth colonies with mucous texture and convex shape; 2: Smooth colonies
with mucous texture, orange pigmentation, and convex shape; 3: Rough colonies
with grainy texture and flat shape.
** 1: spherical; 2: apiculate; 3: ovoid; 4: extended ovoid.
The fermentative capacity, via the production of gas, of the 39 autochthonous
yeast strains was assessed by trapping the gas in Durham tubes. Of the isolates
analyzed, only 7 strains (T31, CS40, CS41a, CS41b, GCS53, ORG54, and ORG56)
showed little to no fermentative capacity, whereas 10 strains (CS40, GT46, GM49,
GCS51, GCS53, ORG54, ORG56, GCS57, GCS58, and GM59) were unable to
tolerate osmotic and thermal stress. Medium or high production of H2S was observed
for 16 yeasts (CS4, CS5, CS11, CS12, CS15, CS16, CS17, M19, M20, CS21, CS34,
CS35, CS36, CS43, ORG54, and GCS57) in this study. Further, all isolates grew at
the temperatures employed during the tolerance test, and only 4 strains (CS40,
CS43, CS44, and GCS51) had low tolerance to ethanol (Table 2).
Table 2. Technological characterization of 39 autochthonous strains isolated
from vineyards located in the Campanha region of Rio Grande do Sul.
Sample Code
Fermentative Capacity
Stress Tolerance
Production of H2S
Temperature tolerance
Tolerance to
Ethanol
CT (control)
3 3 0 3 3
CS 4 2 3 2 3 3
CS 5 2 3 2 3 3
M 8 3 3 1 3 3
M 9 2 3 1 3 3
CS 11 3 3 3 3 3
CS 12 2 3 3 3 3
CS 13 2 3 1 3 3
CS 14 2 3 1 3 3
CS 15 2 3 3 3 3
CS 16 2 3 3 3 3
47
CS 17 2 3 2 3 3
M 19 3 3 2 3 3
M 20 3 3 2 3 3
CS 21 2 3 2 3 3
T 22 2 3 1 3 3
T 31 1 3 1 3 3
CS 34 2 3 2 3 3
CS 35 3 3 2 3 3
CS 36 2 3 3 3 3
CS 40 0 0 4 2 1
CS 41a 0 3 0 3 2
CS 41b 0 3 0 3 2
CS 43 2 3 2 3 1
CS 44 2 2 0 3 1
CS 45 3 3 0 3 3
GT 46 3 0 0 2 2
GT 47 3 3 0 3 2
GT 48 3 3 0 3 2
GM 49 3 0 0 2 2
GM 50 3 3 0 3 3
GCS 51 3 0 0 2 1
GCS 52 3 1 0 3 2
GCS 53 0 0 4 2 4
ORG 54 0 0 3 2 4
ORG 55 3 3 0 3 3
ORG 56 0 0 4 2 4
GCS 57 3 0 2 2 3
GCS 58 2 0 0 2 2
GM 59 3 0 0 2 2 Values indicate the following levels: 0: very low/null; 1: low; 2: medium; 3: high (Capece et
al., 2012).
Interestingly, three isolates (CS45, GM50, and ORG55) appeared to behave
similar or better than the positive control in our technological characterization assays.
These strains were, therefore, selected for further molecular
identification. Sequencing of the rDNA region of strain CS45, isolated from Cabernet
Sauvignon grapes, showed 99% identity with the Lachancea thermotolerans species.
On the other hand, the rDNA sequence of strain GM50, isolated from Merlot
grapes, was observed to have 98% sequence identity to the Hanseniaspora uvarum
species. Finally, the rDNA sequence of the third strain (ORG55), an isolate from
organically grown Cabernet Sauvignon grapes, appears to share 97% identity with
the Metschnikowia pulcherrima species (Table 3, Figs. 1–3).
48
Table 3. Identification of three specific autochthonous strains isolated from vineyards
located in the Campanha region of Rio Grande do Sul.
Species Identification
of isolate *
Accession
Number % identity Grape Variety
Lachancea
thermotolerans CS45
CU928180
99%
Cabernet
Sauvignon
Hanseniaspora
uvarum GM50 KF728823 98% Merlot
Metschnikowia
pulcherrima ORG55 HG421420 97%
Cabernet
Sauvignon grown in
organic system
* The genomic nucleotide sequences and alignments to determine the percentage of
identity between the species are shown in Figs. 1–3.
After identifying these three strains, their oenological suitability was also
assessed by microvinification of sulphited must. To this end, grapes in an advanced
stage of maturation, late-harvested, with high sugar content, were
utilized. Interestingly, the result of various physicochemical analyses of the wines
produced with the commercial control strain and with the autochthonous
strains (CS45, GM50, and ORG55) showed statistically significant differences in
terms of total acidity, total polyphenol index (TPI), color intensity, volatile acidity (> 15
meq/L), and alcoholic content. Only color tonality, free SO2, and total SO2 did not
show statistically significant differences between the samples (Table 4). Following
complete fermentation, all the yeasts assayed appeared to have the ability to carry
out the fermentation process, producing high alcohol content levels (16.98 to 17.90
%, v/v), in agreement with the high initial Babo degree (26.01). Likewise, the density
(0.9775 to 0.9785) and pH (4.09 to 4.20) values obtained after the fermentation
process also appear to be consistent with the characteristics of the original must,
suggesting a normal fermentation process, with sugar consumption (low values of
residual sugars) and an increase of the alcohol content, occurred for each. Notably,
the volatile acidity increased in all fermentation trials, starting from 1.9 meq/L in the
must and increasing up to 18.83 meq/L in the final wine product. Our analysis also
49
indicated that the CS45 isolate was able to significantly influence the extraction of
total anthocyanins in relation to the other isolates; however, this result was not
reflected in the color intensity, which was higher for the wine produced from the
control yeast.
Table 4. Physicochemical characteristics of wines obtained through fermentation in
sulphited must with commercial and three autochthonous yeasts.
CT** CS45 GM50 ORG55 CV 1 (%)
Density 0.9775 b* 0.9785 a 0.9784 a 0.9780 ab 0.02 pH 4.17 ab 4.09 b 4.14 ab 4.20 a 0.87
Total Acidity (meq/L) 90.533 a 91.067 a 83.733 b 80.067 b 2.86
Volatile acidity (meq/L) 16.78 ab 18.83 a 16.08 b 17.48 ab 5.37
Alcohol (% v/v) 17.883 a 16.977 b 17.090 b 17.507 ab 1.35 Reducing Sugars (g/L) 4.11 b 8.52 a 3.963 b 5.143 b 17.27
IPT 34.93 a 24.90 b 27.43 ab 27.93 ab 10.39 Total Anthocyanins (mg/L) 36.601 b 76.565 a 43.068 ab 32.333 b 27.74
Color Intensity 1.1993 a 0.5147 b 0.7593 b 0.6730 b 15.16
Color tonality 1.5627 a 1.6620 a 1.6363 a 1.5317 a 9.54 Total SO2 (mg/L) 8.67 a 21.93 a 15.33 a 26.47 a 65.44
Free SO2 (mg/L) 4.83 a 4.5 a 4.67 a 4.80 a 19.81
* Different letters in the row indicate a significant difference at 5% probability, by the
Tukey test.
** CT: positive control (yeast Saccharomyces cerevisiae UCD522, Maurivin); CS45:
autochthonous isolate from Cabernet Sauvignon grapes; GM50: autochthonous
isolate from Merlot grapes; ORG55: autochthonous isolate from organically grown
Cabernet Sauvignon grapes.
1 Variation Coefficient.
The wines produced from pasteurized grape juice displayed distinct
characteristics depending on the strain employed. The density and levels of reducing
sugars were significantly different for all of the samples. For the remaining variables,
the autochthonous yeasts presented similar results as the positive control, with the
ORG55 being the strain that differed the most from the control strain (Table 5).
Interestingly, the total anthocyanins and index of total polyphenols variables were
significantly higher for those wines with the lowest amount of alcohol. This result is
likely caused by a lower interaction between the yeasts and the colour compounds,
when compared to the other isolates assayed. Moreover, the ORG55 and GM50
50
isolates yielded wines with lower values of color tonality, indicating that the intensity
of the red hues in the wine was higher than that of the yellow hues (brick colored).
Table 5. Physicochemical characteristics of wines obtained through fermentation in
pasteurized must with commercial and three autochthonous yeast strains.
SAMPLE CT ** CS45 GM50 ORG55 CV 1 (%)
Density 0.9955
d* 1.0452
c 1.0683
b 1.0849
a 0.32
pH 3.41 a 3.19 c 3.33 b 3.27 b 0.71
Total Acidity (meq/L) 108.63
b 146.93
a 101.53
bc 99.9 c 2.82
Volatile acidity (meq/L) 8.42 b 8.60 b 11.93 a 6.97 b 10.09
Alcohol (% v/v) 14.13 a 7.53 b 4.34 c 2.14 d 4.05
Reducing Sugars (g/L) 5.3 d 124.4 c 181.88
b 221.36
a 3.83
IPT 45.63 c 48.17 b 51.37 a 52.23 a 1.45
Total Anthocyanins (mg/L) 117.31
b 125.19
ab 129.33
ab 143.56
a 6.52
Color Intensity 1.0833
a 1.2300
a 1.2567
a 1.2580
a 12.41
Color Tonality 1.0572
a 1.0412
a 0.9884
b 0.9857
b 1.27
* Different Letters in the row indicate significant difference at 5% probability, by the
Tukey test.
** CT: positive control (yeast Saccharomyces cerevisiae UCD522, Maurivin); CS45:
autochthonous isolate from Cabernet Sauvignon grapes; GM50: autochthonous
isolate from Merlot grapes; ORG55: autochthonous isolate from organically grown
Cabernet Sauvignon grapes.
1 Variation Coefficient.
Discussion
It is widely known that winemaking with autochthonous yeasts can imbue
typicality to a wine or, at least, add a distinctive feature, as is the case for biodynamic
wines (Domizio et al., 2007; Fleet, 2003; Holt et al., 2013; Liang et al., 2013; Moreira
et al., 2011; Viana et al., 2008). Such unique characteristics are ideal for marketing
and retailing wines in a competitive global market. However, to achieve this,
vineyards must search for yeasts specific to their unique biome as the diversity and
51
variability of each species present on the surface of the grape is influenced by the
region’s climatic conditions and geographical location (Raspor et al., 2006) as well as
the integrity of the grapes (Ribéreau-Gayon et al., 2003). In the present study, 39
yeasts were isolated from Cabernet Sauvignon, Tannat, and Merlot grapes produced
in the new territory (since 1970) Campanha Gaúcha in order to evaluate their use in
the production of grapes and fine wines in Brazil. To assess the suitability of these
yeasts, we performed various morphological, technological, and molecular
characterizations. These data indicate that three autochthonous isolates (CS45,
GM50, and ORG55) have the highest oenological potential under non-
Saccharomyces yeast conditions.
Notably, sequencing of the ITS regions 1 and 2 of the rDNA of the CS45,
GM50, and ORG55 strains confirmed that they correspond to three non-
Saccharomyces yeast species (all with 97% identity): Lachancea
thermotolerans, Hanseniaspora uvarum, and Metschnikowia pulcherrima,
respectively. The three autochthonous strains were isolated from Cabernet
Sauvignon, Merlot, and organic Cabernet Sauvignon cultivars, respectively,
indicating that these yeasts could be exploited during the fermentation of these
particular varieties of wine. To more fully understand the potential unique qualities
these yeasts could add to a wine, we sought to investigate their performance during
the fermentation of sulphited must as well as pasteurized must.
It is important to note that the grapes used for sulphited must
microvinification were over-mature. When using these grapes, we observed typical
alcoholic fermentation levels used for red wine making, and attained high alcoholic
levels, from 16.977 to 17.883 % (v/v), for the CS45, GM50, ORG55, and control
yeasts. These findings suggest that the growth of Saccharomyces and other yeast
species can in fact tolerate high alcohol concentrations, a surprising result
considering that the M. pulcherrima, H. uvarum, and L. thermotolerans do not usually
tolerate alcohol production above 8 % (v/v) (Clemente-Jimenez et al., 2004; Comitini
et al., 2011). Indeed, this low alcohol tolerance was demonstrated during the
microvinification assay using pasteurized grape juice for all three species, whereby
we measured 14.13 % alcohol when using the control yeast and only 7.53 %, 4.34 %,
and 2.14 % alcohol for the CS45, GM50, and ORG55 strains, respectively. Moreover,
we were also particularly interested in the role of these three autochthonous yeasts in
wine color as their involvement in this process, particularly in red wine production, is
52
twofold. They influence the extraction of anthocyanins during maceration and
fermentation, according to their ability to produce alcohol, and can also have an
effect on the formation of more stable forms of anthocyanins during maturation and
aging. On the other hand, they can also promote anthocyanin degradation and
interact with pigments that result in colour loss (Ribéreau-Gayon et al., 2003). During
our analysis, we were surprised to find that the CS45 isolate was able to significantly
influence the extraction of total anthocyanins compared to the other isolates;
however, this result was not reflected in the color intensity, which was higher for the
wine produced by the control yeast. Further, contrary to published data (Ribéreau-
Gayon et al., 2003), the total anthocyanins and index of total polyphenols variables in
the wines produced from pasteurized must were significantly higher for those wines
with the lowest amount of alcohol. These results are supported by the findings
of Loira et al. (2015). Taken together, we believe that these species may be best
used to enhance wine produced in the region when utilized in mixed fermentations
with other Saccharomyces species, thus maximizing their benefits.
Importantly, this is not the first time these species have been detected or used
in oenology. For example, selected isolates of Lachancea (CONCERTOTM/ Viniflora®)
are already commercially available, which, according to Comitini et al. (2011) and
Gobbi et al. (2013), when inoculated with S. cerevisiae, a decrease in pH and volatile
acidity along with an increase in total acidity, glycerol, and 2- phenylethanol can be
achieved. The co-inoculation of a wild-type Lachancea strain with S. cerevisiae also
appears to enhance the fermentation kinetics, speeding up initiation of the
fermentation process while maintaining continuity and regularity. We believe this
phenomenon is likely responsible for the heightened fermentation observed when the
CS45 strain, as well as the other non-Saccharomyces yeasts studied, was inoculated
in the sulphited must. It is, therefore, possible that this Lachancea strain could have
distinct oenological behaviour, when used individually or as co-inoculum at the start
of fermentation, during the fermentation of grapes from different regions.
Similarly, the other two yeasts investigated also appear to be particularly
useful in mixed fermentations. For example, although the H. uvarum yeast species
isolated in this study (GM50) tolerates ethanol, it does not have the ability to
produce high enough levels of alcohol during fermentation when used on its own,
much like the other species. However, using H. uvarum in co-cultures has
been shown to lead to increased synthesis of some desirable compounds, such as
53
higher alcohols and esters (Medina et al., 2013; Moreira et al., 2005;) while also
increasing volatile acidity (Suárez-Lepe & Íñigo Leal, 2004). For the M. pulcherrima
(ORG55) species, we observed a low fermentation capacity during microvinification
of pasteurized must, which is supported by Clemente-Jimenez et al. (2004).
However, in co-culture with S. cerevisiae, this yeast is able to synergistically promote
the production of many aromatic compounds, including fatty acids, esters, and
terpenoids (Comitini et al., 2011; Sadoudi et al., 2012).
In conclusion, we isolated 39 autochthonous yeast strains from grapes
collected in the Campanha Gaúcha region of Brazil, 3 of which appear to have similar
characteristics as the Saccharomyces control strain. During fermentation of sulphited
must from overripe Cabernet Sauvignon grapes, these three autochthonous yeasts
were able to produce wines with high alcohol content, similar to what was observed
for the control strain. However, when using pasteurized must, low alcohol levels were
observed. Overall, our results indicate that these three isolated and characterized
autochthonous strains have oenological potential and would be best used in co-
cultivation fermentation processes with other Saccharomyces species in order to
exploit their full potential. This study represents a significant step in advancing wine
production in the Campanha Gaúcha region, acting as a foundation for the continued
investigation of progressive oenological manipulation. Additional studies are
necessary to determine additional applications for these strains and further evaluate
their distinctive effects on wine produced in the area.
Acknowledgements
We thank the Guatambu Estância do Vinho and the Universidade Federal do
Pampa for their financial support (grant number 4.015.13).
54
References
Álvarez-Pérez, J.M., Campo, E., San-Juan, F., Coque, J.J., Ferreira, V., Hernández-
Orte, P., 2012. Sensory and chemical characterisation of the aroma of Prieto
Picudo rosé wines: the differential role of autochthonous yeast strains on
aroma profiles. Food Chem. 133, 284–292.
Barata, A., Malfeito-Ferreira, M., Loureiro, V., 2012. The microbial ecology of wine
grape berries. Int. J. Food Microbiol. 153, 243–259.
Callejon, R.M., Clavijo, A., Ortigueira, P., Troncoso, A.M., Paneque, P., Morales,
M.L., 2010. Volatile and sensory profile of organic red wines produced by
different selected autochthonous and commercial Saccharomyces cerevisiae
strains. Anal. Chim. Acta. 660, 68–75.
Capece, A., Romaniello, R., Siesto, G., Romano, P., 2012. Diversity of
Saccharomyces cerevisiae yeasts associated to spontaneously fermenting
grapes from an Italian “heroic vine-growing area”. Food Microbiol. 31, 159–
166.
Chavan, P., Mane, S., Kulkarni, G., Shaikh, S., Ghormade, V., Nerkar, D.P.,
Shouche, Y., Deshpande, M.V., 2009. Natural yeast flora of different varieties
of grapes used for wine making in India. Food Microbiol. 26, 801–808.
Clemente-Jimenez, J.M., Mingorance-Cazorla, L., Martínez-Rodríguez, S., Las
Heras-Vázquez, F.J., Rodríguez-Vico, F., 2004. Molecular characterization
and oenological properties of wine yeasts isolated during spontaneous
fermentation of six varieties of grape must. Food Microbiol. 21, 149–155.
Comitini, F., Gobbi, M., Domizio, P., Romani, C., Lencioni, L., Mannazzu, I., Ciani,
M., 2011. Selected non-Saccharomyces wine yeasts in controlled multistarter
fermentations with Saccharomyces cerevisiae. Food Microbiol. 28, 873–882.
55
Contreras, A., Hidalgo, C., Schmidt, S., Henschke, P.A., Curtin, C., Varela, C., 2015.
The application of non-Saccharomyces yeast in fermentations with limited
aeration as a strategy for the production of wine with reduced alcohol content.
Int. J. Food Microbiol. 205, 7–15.
Domizio, P., Lencioni, L., Ciani, M., Di Blasi, S., Pontremolesi, C., Sabatelli, M.P.,
2007. Spontaneous and inoculated yeast populations dynamics and their
effect on organoleptic characters of Vinsanto wine under different process
conditions. Int. J. Food Microbiol. 115, 281–289.
Fleet, G.H., 2003. Yeast interactions and wine flavour. Int. J. Food Microbiol. 86, 11–
22.
França, L.T., Carrilho, E., Kist, T.B., 2002. A review of DNA sequencing techniques.
Q. Rev. Biophys. 35, 169–200.
Gobbi, M., Comitini, F., Domizio, P., Romani, C., Lencioni, L., Mannazzu, I., Ciani,
M., 2013. Lachancea thermotolerans and Saccharomyces cerevisiae in
simultaneous and sequential co-fermentation: a strategy to enhance acidity
and improve the overall quality of wine. Food Microbiol. 33, 271–281.
Guimarães, T.M., Moriel, D.G., Machado, I.P., Fadel Picheth, C.M.T., Bonfim, T.M.B.,
2006. Isolation and characterization of Saccharomyces cerevisiae strains of
winery interest. Rev. Bras. Cienc. Farm. 42, 119–126.
Holt, H., Cozzolino, D., McCarthy, J., Abrahamse, C., Holt, S., Solomon, M., Smith,
P., Chambers, P.J., Curtin, C., 2013. Influence of yeast strain on Shiraz wine
quality indicators. Int. J. Food Microbiol. 165, 302–311.
Liang, H.Y., Chen, J.Y., Reeves, M., Han, B.Z., 2013. Aromatic and sensorial profiles
of young Cabernet Sauvignon wines fermented by different Chinese
autochthonous Saccharomyces cerevisiae strains. Food Res. Int. 51, 855–
865.
56
Loira, I., Vejarano, R., Morata, A., Ricardo-da-Silva, J.M., Laureano, O., González,
M.C., Suárez-Lepe, J.A., 2013. Effect of Saccharomyces strains on the quality
of red wines aged on lees. Food Chem. 139, 1044–1051.
Loira, I., Morata, A., Comuzzo, P., Comuzzo, P., Callejo, M.J., González, C.,
Calderón, F., Suárez-Lepe, J.A., 2015. Use of Schizosaccharomyces pombe
and Torulaspora delbrueckii strains in mixed and sequential fermentations to
improve red wine sensory quality. Food Res. Int. In Press.
doi:10.1016/j.foodres.2015.06.030
Medina, K., Boido, E., Fariña, L., Gioia, O., Gomez, M.E., Barquet, M., Gaggero, C.,
Dellacassa, E., Carrau, F., 2013. Increased flavour diversity of Chardonnay
wines by spontaneous fermentation and co-fermentation with Hanseniaspora
vineae. Food Chem. 141, 2513–2521.
Molina, A.M., Guadalupe, V., Varela, C., Swiegers, J.H., Pretorius, I.S., Agosin, E.,
2009. Differential synthesis of fermentative aroma compounds of two related
commercial wine yeast strains. Food Chem. 117 (2), 189–195.
Moreira, N., Mendes, F., Hogg, T., Vasconcelos, I., 2005. Alcohols, esters and heavy
sulphur compounds production by pure and mixed cultures of apiculate wine
yeasts. Int. J. Food Microbiol. 103 (3), 285–294.
Moreira, N., Pina, C., Mendes, F., Couto, J.A., Hogg, T., Vasconcelos, I., 2011.
Volatile compounds contribution of Hanseniaspora guilliermondii and
Hanseniaspora uvarum during red wine vinifications. Food Control. 22, 662–
667.
Raspor, P., Milek, D.M., Polanc, J., Mozina, S.S., Cadez, N., 2006. Yeasts isolated
from three varieties of grapes cultivated in different locations of the Dolenjska
vine-growing region, Slovenia. Int. J. Food Microbiol. 109, 97–102.
Ribéreau-Gayon, P., Dubordieu, D., Donèche, B., Lonvaud, A., 2003. Tratado de
Enologia: Microbiologia del vino Vinificaciones. Mundi Prensa, Madrid. 655p.
57
Sadoudi, M., Tourdot-Maréchal, R., Rousseaux, S., Steyer, D., Gallardo-Chacón,
J.J., Ballester, J., Vichi, S., Guérin-Schneider, R., Caixach, J., Alexandre, H.,
2012. Yeast-yeast interactions revealed by aromatic profile analysis of
Sauvignon Blanc wine fermented by single or co-culture of non-
Saccharomyces and Saccharomyces yeasts. Food Microbiol. 32, 243–253.
Scacco, A., Oliva, D., Di Maio, S., Polizzotto, G., Genna, G., Tripodi, G., Lanza, C.M.,
Verzera, A., 2012. Indigenous Saccharomyces cerevisiae strains and their
influence on the quality of Cataratto, Inzolia and Grillo white wines. Food Res.
Int. 46, 1–9.
Settanni, L., Sannino, C., Francesca, N., Guarcello, R., Moschetti, G., 2012. Yeast
ecology of vineyards within Marsala wine area (western Sicily) in two
consecutive vintages and selection of autochthonous Saccharomyces
cerevisiae strains. J. Biosci. Bioeng. 114, 606–614.
Suárez-Lepe, J.A., Íñigo Leal, B., 2004. Microbiología Enológica: Fundamentos de
Vinificación, third ed. Ediciones Mundi Prensa: Madrid. 716 p.
Synos, K., Reynolds, A.G., Bowen, A.J., 2015. Effect of yeast strain on aroma
compounds in Cabernet franc icewines. LWT - Food Sci. Technol. 64, 227–
235.
Tristezza, M., Vetrano, C., Bleve, G., Spano, G., Capozzi, V., Logrieco, A., Mita, G.,
Grieco, F., 2013. Biodiversity and safety aspects of yeast strains characterized
from vineyards and spontaneous fermentations in the Apulia Region, Italy.
Food Microbiol. 36, 335–342.
Viana, F., Gil, J.V., Genovés, S., Vallés, S., Manzanares, P., 2008. Rational selection
of non-Saccharomyces wine yeasts for mixed starters based on ester
formation and enological traits. Food Microbiol. 25, 778–785.
58
Figure Legends
Fig. 1. Sequence alignments between the CS45 strain and Lachancea
thermotolerans.
Fig. 2. Sequence alignments between the GM50 strain and Hanseniaspora uvarum.
Fig. 3. Sequence alignments between the ORG55 strain and Metschnikowia
pulcherrima.
60
5 DISCUSSÃO GERAL E PERSPECTIVAS
A busca por elementos distintivos constitui em fator importante para a
valorização e para o marketing dos vinhos. Nesse sentido, torna-se importante a
utilização de distintas cepas de micro-organismos que possam auxiliar o processo
fermentativo de mosto de uvas para diferenciação qualitativa dos vinhos. Nesse
sentido, a região da Campanha do RS, já estabelecida e consolidada como polo
vitivinícola, possui elementos diferenciais para o processo, entre eles, a microbiota
autóctone, que poderá, assim que bem caracterizada e registrada, ser incluída no
processo enológico. A prospecção e o estudo de leveduras nativas, incluindo
gêneros Saccharomyces e não-Saccharomyces, assim como suas interações nos
distintos processos enológicos têm sido alvo de constantes pesquisas, sendo a
busca por produtos sustentáveis e de características únicas o fomento para este
tipo de estudo.
A vitivinicultura na região da Campanha do Rio Grande do Sul iniciou na
década de 70, entretanto somente nos últimos anos foi consolidada a partir do
reconhecimento de seus produtos. É nesse sentido que, pela necessidade de
informações e pesquisas na área da enologia nessa região, se tem perspectivas de
continuidade do trabalho, avaliando a utilização dessas espécies na elaboração de
vinhos tintos e brancos, avaliando a necessidade da inoculação de espécies do tipo
Saccharomyces e a produção dos compostos voláteis, com resultados importantes
para a consagração da região frente às melhores regiões vinícolas mundiais.
A principal contribuição dessa tese foi prospectar leveduras com potencial
enológico e, nesse caso, três leveduras não-Saccharomyces foram isoladas e
identificadas. Os ensaios preliminares, tanto no mosto de uva sulfitado quanto no
mosto pasteurizado, mostraram o potencial dessas leveduras. No entanto, fica claro
que, novos ensaios, com maiores volumes, e avaliando maior numero de variáveis
(químicas e sensoriais), serão necessários. Também, na medida em que esse
recurso genético for validado como útil à enologia, a devida tramitação junto à
Comissão Nacional de Biodiversidade deverá ser dada.
61
6 CONCLUSÃO GERAL
As três espécies de leveduras estudadas (L. thermotolerans; H. uvarum; M.
pulcherrima) apresentaram aptidão enológica, quando avaliados os aspectos de
capacidade fermentativa, tolerância a diferentes concentrações de etanol, tolerância
a diferentes temperaturas, tolerância ao estresse osmótico e etanólico e quanto a
produção de sulfeto de hidrogênio (H2S). Cabe salientar que, essas espécies
apresentam comportamentos distintos quando avaliadas individualmente, como no
caso deste estudo, ou em associação com outras leveduras, tanto em fermentações
espontâneas como naquelas conduzidas com fermentos selecionados.
Em estudos realizados com essas espécies individualmente ou na utilização
das mesmas como co-inoculos, foi verificado a produção de compostos voláteis que
conferem complexidade aromática aos vinhos, resultado que não foi observado na
maioria dos experimentos onde a fermentação foi conduzida de forma espontânea.
Neste estudo não foram analisados os compostos aromáticos, pois os vinhos obtidos
pelas duas microvinificações utilizaram para cada uma matérias-primas (mosto de
uva e suco pasteurizado comercial) distintas.
Assim sendo, as leveduras acima podem ser caracterizadas como úteis na
elaboração de vinhos, desde que sejam realizados experimentos com avaliação dos
compostos aromáticos e utilizando-as em co- inoculo com leveduras do tipo
Saccharomyces.
62
7 REFERÊNCIAS
ÁLVAREZ-PÉREZ, J. M., CAMPO, E., SAN-JUAN, F., COQUE, J. J. R., FERREIRA, V., HERNÁNDEZ-ORTE, P. (2012). Sensory and chemical characterization of the aroma of Prieto Picudo rosé wines: The differential role of autochthonous yeast strains on aroma profiles. Food Chemistry, 133, 284-292.
ANCHORENA-MATIENZO, P. (2002) Re-identificação e caracterização genética da levedura IZ- 987 utilizando marcadores moleculares. Dissertação – Programa de pós–graduação em Ciência e Tecnologia de Alimento, Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Piracicaba.
ANDORRÀ, I., LANDI, S., MAS, A., GUILLAMÓN, J.M., ESTEVE-ZARZOSO, B. (2008). Effect of oenological practices on microbial populations using culture-independent techniques. Food Microbiology, 25, 849–856.
BARATA, A., SEBORRO, F., BELLOCH, C., MALFEITO-FERREIRA, M., LOUREIRO, V. (2008). Ascomycetous yeast species recovered from grapes damaged by honeydew and sour rot. Journal of Applied Microbiology, 104, 1182–1191.
BARATA, A., MALFEITO-FERREIRA, M., LOUREIRO, V. (2012). The microbial ecology of wine grape berries. International Journal of food Microbiology, 153, 243-259.
BENGTSSON, J., AHNSTRÖM, J., WEIBULL, A.C. (2005). The effects of organic agriculture on biodiversity and abundance: a meta-analysis. Journal of Applied Ecology, 42, 261–269. doi:10.1111/j.1365-2664.2005.01005.x.
BRASIL. Ministério da Integração Nacional. Proposta de reestruturação do Programa de Desenvolvimento da faixa de Fronteira: bases de uma política integrada de desenvolvimento regional para a faixa de fronteira. Brasília: Ministério da Integração Nacional, 2005.
CALLEJON, R. M., CLAVIJO, A., ORTIGUEIRA, P., TRONCOSO, A. M. , PANEQUE, P., MORALES, M. L. (2010). Volatile and sensory profile of organic red wines produced by different selected autochthonous and commercial Saccharomyces cerevisiae strains. Analytica Chimica Acta, 660, 68–75.
CAMARGO, U. A., TONIETTO, J., HOFFMANN, A. (2011). Progressos na viticultura brasileira. Revista Brasileira de Fruticultura, 33, http://dx.doi.org/10.1590/S0100-29452011000500017.
CAPECE, A., ROMANIELLO, G., SIESTO, G. ROMANO, P. (2012). Diversity of Saccharomyces cerevisiae yeasts associated to spontaneously fermenting grapes from an italian “heroic vine-growing area”. Food Microbiology, 31, 159-166.
CHAVAN, P., MANE, S., KULKARNI, G., SHAIKH, S., GHORMADE, V., NERKAR, D. P., SHOUCHE, Y., DESHPANDE, M. V. (2009). Natural yeast flora of different varieties of grapes used for wine making in India. Food Microbiology, 26, 801-808.
CLEMENTE-JIMENEZ, J. M., MINGORANCE-CAZORLA, L., MARTÍNEZ-RODRÍGUEZ, S., LAS HERAS-VÁZQUEZ, F. X., RODRÍGUEZ-VICO, F.
63
(2004). Molecular characterization and oenological properties of wine yeasts isolated during spontaneous fermentation of six varieties of grape must. Food Microbiology, 21, 149-155.
COMITINI, F., GOBBI, M., DOMIZIO, P., ROMANI, C., LENCIONI, L., MANNAZZU, I.,CIANI, M. (2011). Selected non-Saccharomyces wine yeasts in controlled multistarter fermentations with Saccharomyces cerevisiae. Food Microbiology, 28, 873-882.
CONTRERAS, A., HIDALGO, C., SCHMIDT, S., HENSCHKE, A., CURTIN, C., VARELA, C. (2015). The application of non-Saccharomyces yeast in fermentations with limited aeration as a strategy for the production of wine with reduced alcohol content. International Journal of Food Microbiology, 205, 7–15.
DAUDT, C.E. et al. (1973) Possibilidades de produção de Vitis vinifera em Uruguaiana e vizinhanças. Revista Centro de Ciências Rurais, v.3, n.1-4, p.163-163.
DOMIZIO, P., LENCIONI, L., CIANI, M., DI BLASI, S., PONTREMOLESI, C., SABATELLI, M. P. (2007). Spontaneous and inoculated yeast populations dynamics and their effect on organoleptic characters of Vinsanto wine under different process conditions. International Journal of Food Microbiology, 115, 281-289.
DOMIZIO, P., LIU, Y., BISSON, L.F., BARILE, D. (2014). Use of non-Saccharomyces wine yeasts as novel sources of mannoproteins in wine. Food Microbiology, 43, 5-15.
ESTEVE-ZARZOSO, B., BELLOCH, C., URUBURU, F., QUEROL, A. (1999). Identification of yeasts by RFLP analysis of the 5.8S rRNA gene and the two ribosomal internal transcribed spacers. International Journal of Systematic Bacteriology, 49, 329-337.
FERNÁNDEZ-ESPINAR, M.T., LLOPIS, S., QUEROL, A., BARRIO, E. (2011). Molecular identification and characterization of wine yeasts, In: Carrascosa, A.V., Muñoz, R., González, R. (Eds.), Molecular Wine Microbiology, 1st ed. Elsevier, Academic Press, London, UK, 111–141.
FLEET, G. H. (2003). Yeast interactions and wine flavour. International Journal of Food Microbiology, 86, 11-12.
FRANÇA, L.T.C., CARRILHO, E., KIST, T. B. L. (2002). A review of DNA sequencing techniques. Quarterly Reviews of Biophysics, 35, 2, 169-200.
GENNARI, A. J. (2014). A letter by the Regional Editor for South America: From varietals to terroir. Wine Economics and Policy, 3, 69–70.
GOBBI, M., COMITINI, F., DOMIZIO, P., ROMANI, C., LENCIONI, L., MANNAZZU, I., CIANI, M. (2013). Lachancea thermotolerans and Saccharomyces cerevisiae in simultaneous and sequential co-fermentation: A strategy to enhance acidity and improve the overall quality of wine. Food Microbiology, 33, 271-281.
GRUZ, A.P. G., SOUZA, C. G. S., TORRES, A. G., FREITAS, S. P., CABRAL, L. M. C. (2013). Recuperação de compostos bioativos a partir do bagaço de uva. Revista Brasileira de Fruticultura, 35 (4), 1147-1157.
64
GUILLAMÓN, J.M., SABATÉ, J., BARRIO, E., CANO, J., QUEROL, A. (1998). Rapid identification of wine yeast species based on RFLP analysis of the ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region. Archives of Microbiology, 169, 387–392.
GUIMARÃES, T. M., MORIEL, D. G., MACHADO, I. M. P., PICHETH, C. M. T. F., BONFIM, T. M. B. (2006). Isolation and characterization of Saccharomyces cerevisiae strains of winery interest. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, 42, 119-126.
HOLT, H., COZZOLINO, D., MCCARTHY, J., ABRAHAMSE, C., HOLT, S., SOLOMON, M., SMITH, P., CHAMBERS, P. J., CURTIN, C. (2013). Influence of yeast strain on Shiraz wine quality indicators. Internacional Journal of Food Microbiology, 163, 302-311.
HONG, Y.A., PARK, H.D. (2013). Role of non-Saccharomyces yeasts in Korean wines produced from Campbell Early grapes: potential use of Hanseniaspora uvarum as a starter culture. Food Microbiology, 34 (1), 207-214.
IBRAVIN. Instituto Brasileiro do vinho. Acesso em 15 de julho de 2015. Disponível em: http://www.ibravin.org.br/
ILIEVA, F., VELIČOVSKA, S.K., DIMOVSKA, V., SPASOV, H., The impact of some wine-making practices on the quality of Vranec red wines from Macedonia produced by the newly-selected local strain “F-78”. Food Chemistry (2015), doi: http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2015.08.088
INMET. Instituto Nacional de Meteorologia. http://www.inmet.gov.br/portal/index.php?r=home2/index. Acesso em 10 de Julho de 2015.
JAMES, S.A., CAI, J., ROBERTS, I.N., COLLINS, M.D. (1997). A phylogenetic analysis of the genus saccharomyces based on 18S rRNA gene sequences: description of saccharomyces kunashirensis sp. nov. and saccharomyces martiniae sp. nov. International Journal of Systematic Bacteriology, 47, 453–460.
JIMÉNEZ-MARTÍ, E., GOMAR-ALBA, M., PALACIOS, A., ORTIZ-JULIEN, A., DEL OLMO, M.L. (2011). Towards an understanding of the adaptation of wine yeasts to must: relevance of the osmotic stress response. Applied Microbiology and Biotechnolology, 89 (5), 1551-1561.
JOSEPA, S.; GUILLAMON, J.M.; CANO, J. (2000). PCR differentiation of Saccharomyces cerevisiae from Saccharomyces bayanus/ Saccharomyces pastorianus using specific primers. FEMS Microbiology Letters, 193, 255-259.
KURTZMAN, C.P., ROBNETT, C.J. (1998). Identification and phylogeny of ascomycetous yeasts from analysis of nuclear large subunit (26S) ribosomal DNA partial sequences. Antonie van Leeuwenhoek, 73, 331–371.
KURTZMAN, C. P., FELL, J. W., BOEKHOUT, T., ROBERT, V. (2011). Methods for isolation maintenance, classification and identification of yeast. In: KREGER-VAN RIJ, N. S. W. (Ed). The yeasts: a taxonomy study. Amsterdam: Elsevier Science, p.88-110.
LIANG, H. Y., CHEN, J. Y., REEVES, M., HAN, B. Z. (2013). Aromatic and sensorial profiles of young Cabernet Sauvignon wines fermented by different Chinese
65
autochthonous Saccharomyces cerevisiae strains. Food Research International, 51, 855-865.
LOIRA, I., VEJARANO, R., BAÑUELOS, M. A., MORATA, A, TESFAYE, W., UTHURRY, C., VILLA, A., CINTORA, I., SUÁREZ-LEPE, J. A. (2013). Effect of Saccharomyces strains on the quality of red wines aged on lees. LWT – Food Science and Technology, 59, 915-922.
LOIRA, I., MORATA, A., COMUZZO, P., CALLEJO, M. J., GONZÁLEZ, C., CALDERÓN, F., SUÁREZ-LEPE, J. A. (2015). Use of Schizosaccharomyces pombe and Torulaspora delbrueckii strains in mixed and sequential fermentations to improve red wine sensory quality. Food Research International, 76, 325–333.
LOPES, T. J., XAVIER, M. F., QUADRI, M. G. N., QUADRI, M. B. (2007). Antocianinas: uma breve revisão das características estruturais e da estabilidade. Revista Brasileira de Agrociência, 13 (3), 291-297.
MEDINA, K., BOIDO, E., DELLACASSA, E., CARRAU, F. (2012). Growth of non-Saccharomyces yeasts affects nutrient availability for Saccharomyces cerevisiae during wine fermentation. International Journal of Food Microbiology, 157 (2), 245-250.
MEDINA, K., BOIDO, E., FARINA, L., GIOIA, O., GOMEZ, M.E., BARQUET, M., GAGGERO, C., DELLACASSA, E., CARRAU, F. (2013). Increased flavour diversity of Chardonnay wines by spontaneous fermentation and co-fermentation with Hanseniaspora vineae. Food Chemistry, 141 (3), 2513-2521.
MELLO, L. M. R. (2013). Vitivinicultura Brasileira: Panorama 2012. Comunicado Técnico 137. Embrapa Uva e Vinho: Bento Gonçalves.
MELLO, L. M. R. (2015). Panorama da Vitivinicultura Brasileira 2014. Revista Campo e Negócios. Acesso em: 15 de julho de 2015. Disponível em: http://www.revistacampoenegocios.com.br/panorama-da-vitivinicultura-brasileira-2014/
MOLINA, A. M., GUADALUPE, V., VARELA, C., SWIEGERS, J. H., PRETORIUS, I. S., AGOSIN, E. (2009). Differential synthesis of fermentative aroma compounds of two related commercial wine yeast strains. Food Chemistry, 117 (2), 189-195.
MOREIRA. N., PINA, C., MENDES, F., COUTO, J. A., HOGG, T., VASCONCELOS, I. (2011). Volatile compounds contribution of Hanseniaspora guilliermondii and Hanseniaspora uvarum during red wine vinifications. Food Control, 22, 662-667.
MUYZER, G., DE WAAL, E.C., UITTERLINDEN, A.G. (1993). Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA. Applied and Environmental Microbiology, 59, 695–700.
ORTIZ, M. J., BARRAJÓN, N., BAFFI, M. A., ARÉVALO-VILLENA, M., BRIONES, A. (2013). Spontaneous must fermentation: Identification and biotechnological properties of wine yeasts. LWT - Food Science and Technology, 50, 371-377.
QUEROL, A., BELLOCH, C. (2003). Molecular evolution in yeast of biotechnological interest. International Microbiology, 6, 201-205.
66
QUEROL, A., FERNÁNDEZ-ESPINAR, M. T., DEL OLMO, M., BARRIOC, E. (2003). Adaptive evolution of wine yeast. International Journal of Food Microbiology, 86, 3-10.
RATHMANN, R., HOFF, D. N., SANTOS, O. I. B., PADULA, A. D. (2008). Diversificação produtiva e as possibilidades de desenvolvimento: um estudo da fruticultura na região da Campanha no RS. Revista de Economia e Sociologia Rural. http://dx.doi.org/10.1590/S0103-2003200800020000
REIS, V. R. (2011). Caracterização de linhagens selvagens de Saccharomyces cerevisiae isoladas de processos fermentativos para a produção de etanol. Dissertação – Programa de pós-graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos, Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Piracicaba.
RENOUF, V., LONVAUD-FUNEL, A. (2007). Development of an enrichment medium to detect Dekkera/Brettanomyces bruxellensis, a spoilage wine yeast, on the surface of grape berries. Microbiological Research, 162, 154–167.
RENAULT, P., MIOT-SERTIER, C., MARULLO, P., HERNÁNDEZ-ORTE, P., LAGARRIGUE, L., LONVAUD-FUNEL, A., BELY, M. (2009). Genetic characterization and phenotypic variability in Torulaspora delbrueckii species: Potential applications in the wine industry. International Journal of Food Microbiology, 134, 201–210.
RIBÉREAU- GAYON, P., DUBORDIEU, D., DONÈCHE, B., LONVAUD, A. (2003). Tratado de Enologia: Microbiologia del vino, Vinificaciones. Mundi Prensa: Madrid. 655p.
RIZZON, L. A. (2010). Metodologia para análise de vinho. Brasília, DF: Embrapa Informação Tecnológica. 120 p.
RODRÍGUEZ, M.E., LOPES, C.A., BARBAGELATA, R.J., BARDA, N.B., CABALLERO, A.C. (2010). Influence of Candida pulcherrima Patagonian strain on alcoholic fermentation behaviour and wine aroma. International Journal of Food Microbiology, 138 (1-2), 19-25
SADOUDI, M., TOURDOT-MARÉCHAL, R., ROUSSEAUX, S., STEYER, D., GALLARDO-CHACÓN, J. J., BALLESTER, J., VICHI, S., GUÉRIN-SCHNEIDER, R., CAIXACH, J., E , ALEXANDRE, H. (2012). Yeast-yeast interactions revealed by aromatic profile analysis of Sauvignon Blanc wine fermented by single or co-culture of non-Saccharomyces and Saccharomyces yeasts. Food Microbiology, 32, 243-253.
SAINT-GES, V., BÉLIS-BERGOUIGNAN, M. C. (2009). Ways of reducing pesticides use in Bordeaux vineyards. Journal of Cleaner Production, 17(18), 1644–1653
SETTANI, L., SANNINO, C., FRANCESCA, N., GUARCELLO, R., MOSCHETTI, G. (2012). Yeast ecology of vineyeards within Marsala wine area (western Sicily) in two consecutive vintages and selection of autochthonous Saccharomyces cerevisiae strains. Journal of Bioscience and Bioengineering, 114, 606-614.
SCACCO, A., OLIVA, D., DI MAIO, S., POLIZZOTTO, G., GENNA, G., TRIPODI, G.; LANZA, C. M., VERZERA, A. (2012). Indigenous Saccharomyces cerevisiae strains and their influence on the quality of Cataratto, Inzolia and Grillo white wines. Food Research International, 46, 1-9.
67
SUÁREZ-LEPE, J. A., ÍÑIGO LEAL, B. (2004). Microbiología Enológica: Fundamentos de vinificación. Mundi Prensa: Madrid. 3ª Ed. 716p.
SYNOS, K., REYNOLDS, A. G., BOWEN, A. J. (2015). Effect of yeast strain on aroma compounds in Cabernet franc icewines. LWT - Food Science and Technology, 64, 227-235.
TOFALO, R.; PERPETUINI, G.; FASOLI, G.; SCHIRONE, M.; CORSETTI, A.; SUZZI, G. (2014). Biodiversity study of wine yeasts belonging to the “terroir” of Montepulciano d’Abruzzo “Colline Teramane” reveled Saccharomyces cerevisiae strains exhibiting atypical and unique 5.8S-ITS restriction patterns. Food Microbiology, 39, 7-12.
TONIETTO, J., RUIZ, V. S., GÓMEZ-MIGUEL, V. D. (2012). Clima, Zonificación y Tipicidad del vino en regiones vitivinícolas Iberoamericanas. Madrid: CYTED. 411p.
TRISTEZZA, M., VETRANO, C., BLEVE, G., SPANO, G., CAPOZZI, V., LOGRIECO, A., MITA, G., GRIECO, F. (2013). Biodiversity and safety aspects of yeast strains characterized from vineyards and spontaneous fermentations in the Apulia Region, Italy. Food Microbiology, 36, 335-342.
VIANA, F., GIL, J. V., GENOVÉS, S., VALLÉS, S., MANZANARES, P. (2008). Rational selection of non-Saccharomyces wine yeasts for mixed starters based on ester formation and enological traits. Food Microbiology, 25, 778– 785.
WHITENER, M. E. B., CARLIN, S., JACOBSON, D., WEIGHILL, D., DIVOL, B., CONTERNO, L., DU TOIT, M., VRHOVSEK, U. (2015). Early fermentation volatile metabolite profile of non-Saccharomyces yeasts in red and white grape must: A targeted approach. LWT - Food Science and Technology, 64, 412-422.
XUFRE, A.; SIMÕES, F.; GÍRIO, F.; CLEMENTE, A.; AMARAL-COLLAÇO, M.T. (2000). Use of RAPD analysis for differentiation among six enological Saccharomyces spp. Strains. Food Technology and Biotechnology, 38, 53-58.
ZOTT, K.; CLAISSE, O.; LUCAS, P.; COULON, J.; LONVAUD-FUNEL, A.; MASNEUF-POMAREDE, I. (2010). Characterization of the yeast ecosystem in grape must and wine using real-time PCR. Food Microbiology, 27, 559-567.
68
7 ANEXOS
Anexo A – Resumos aprovados para apresentação e publicação nos anais
do XV Congresso Latino-Americano de Viticultura e Enologia
69
Anexo B – Arquivo de submissão do artigo “ Prospecção microbiológica na
região da Campanha do Rio Grande do Sul-Brasil revela leveduras
autóctones não-Saccharomyces com potencial enológico”, à revista
International Journal Food Microbiology.
70
Anexo C – Sequências nucleotídicas genômicas e respectivos alinhamentos
para a geração dos percentuais de identidade entre as espécies.
Lachancea Thermotolerans
CS45 10 CCTACCCTGATTTGAGGTC-AACTTTATGAATACTGTTTGCCAGACTGTCTGTACTTTCA 68
L. thermotolerans 1137580 CCTA-CCTGATTTGAGGTCAAACTTTATGAATACTGTTTGCCAGACTGTCTGTACTTTCA 1137638
CS45 69 GTAAAAGCCTTTAAAACGCCTACTAACGCCACTACGAGTTGGTAAAACCTAATACGCAGA 128
L. thermotolerans 1137639 GTAAAAGCCTTTAAAACGCCTACTAACGCCACTACGAGTTGGTAAAACCTAATACGCAGA 1137698
CS45 129 GTATCAGCGGACTGGACTAAAACCTCAGTCAGCAACAGCCAGATGGCCAGCATTTTCAAG 188
L. thermotolerans 1137699 GTATCAGCGGACTGGACTAAAACCTCAGTCAGCAACAGCCAGATGGCCAGCATTTTCAAG 1137758
CS45 189 TTAACCCAGAAAGAGTACCACTCACTACCAAACCCGAGGGTTTGAGAAGGAAATGACGCT 248
L. thermotolerans 1137759 TTAACCCAGAAAGAGTACCACTCACTACCAAACCCGAGGGTTTGAGAAGGAAATGACGCT 1137818
CS45 249 CAAACAGGCATGCCCCCTGGAATACCAGAGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGAT 308
L. thermotolerans 1137819 CAAACAGGCATGCCCCCTGGAATACCAGAGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGAT 1137878
CS45 309 TCACGAATATCTGCAATTCACAATACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGA 368
L. thermotolerans 1137879 TCACGAATATCTGCAATTCACAATACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGA 1137938
CS45 369 GAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAAATAttttttttCTAAAATGAAAAATAATT 428
L. thermotolerans 1137939 GAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAAATATTTTTTTTCTAAAATGAAAAATAATT 1137998
CS45 429 GACAATGTTTAAAATACAATAGTTGTTTGTGTTTGTAACCCTTGGGCCGTAAAGCCCAAA 488
L. thermotolerans 1137999 GACAGTGTTTAAAATACAATAGTTGTTTGTGTTTGTAACCCTTGGGCCGTAAAGCCCAAA 1138058
CS45 489 GAAGAAGCGTTGTAAAATAAATTACTCCACAGTGTGTGTGTAGAGAGACAGTCGTTAACA 548
L. thermotolerans 1138059 GAAGAAGCGTTGTAAAATAAATTACTCCACAGTGTGTGTGTAGAGAGACAGTCGTTAACA 1138118
CS45 549 GAAAGCATCATCGGCCGCGCAATCAAGCGCAGGCTTTCTGAACTTTCCCGGCTGCTCTAA 608
L. thermotolerans 1138119 GAAAGCATCATCGGCCGCGCAATCAAGCGCAGGC-TTCTGAACTTTCCCGGCTGCTCTAA 1138177
CS45 609 CAAAATTCTTTWAATGATCCTTCCRCARGGTTYCACYCTACGGAA 653
L. thermotolerans 1138178 CAAAATTCTTT-AATGATCCTTCCGCA-GGTT-CAC-CTACGGAA 1138218
Hanseniaspora uvarum
GM50 1 TTGTTTAGATCTTTTACAATAATGTGTATCTTTATTGGAGATGYKYGCTTAATTGCGCTG 60
H.uvarum 36 TTGTTTAGATCTTTTACAATAATGTGTATCTTTATTGGAGATGTGCGCTTAATTGCGCTG 95
GM50 61 CTTCATTAGAGTGTCGCAGTAGAAGYWKTCTTGCTTGAATCTCAGTCAACGTTTACACAC 120
H.uvarum 96 CTTCATTAGAGTGTCGCAGTAGAAGTAGTCTTGCTTGAATCTCAGTCAACGTTTACACAC 155
GM50 121 ATTGGAGTTTTTTACTTTAATTTAATTCTTTCTGCTTTGAATCYAAAGGTTCAAGGcaaa 180
H.uvarum 156 ATTGGAGTTTTTTACTTTAATTTAATTCTTTCTGCTTTGAATCGAAAGGTTCAAGGCAAA 215
GM50 181 aaacaaacacaaacaattttattttattatwattttttaaactaaaccaaaattcctaac 240
H.uvarum 216 AAACAAACACAAACAATTTTATTTTATTATAATTTTTTAAACTAAACCAAAATTCCTAAC 275
GM50 241 ggaaattttaaaataatwtaaaacTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGA 300
H.uvarum 276 GGAAATTTTAAAATAATTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGA 335
GM50 301 AGAACGTAGCGAATTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGATACTCGTGAATCATTGAATTT 360
H.uvarum 336 AGAACGTAGCGAATTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGATACTCGTGAATCATTGAATTT 395
GM50 361 TTGAACGCACATTGCGCCCTTGAGCATTCTCAAGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCC 420
H.uvarum 396 TTGAACGCACATTGCGCCCTTGAGCATTCTCAAGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCC 455
GM50 421 TTCTCAAAAGATAAttttttattttttGGTTGTGGGCGATACTCAGGGTTAGCTTGAAAT 480
H.uvarum 456 TTCTCAAAAGATAATTTTTTATTTTTTGGTTGTGGGCGATACTCAGGGTTAGCTTGAAAT 515
GM50 481 TGGAGACTGTTTCAGTCTTTTTTAATTCAACACTTAGCTTCTTTGGAGACGCTGTTCTCG 540
H.uvarum 516 TGGAGACTGTTTCAGTCTTTTTTAATTCAACACTTAGCTTCTTTGGAGACGCTGTTCTCG 575
GM50 541 CTGTGATGTATTTATGGATTTATTCGTTTTACTTTACAAGGGAAATGGTAATGTACCTTA 600
H.uvarum 576 CTGTGATGTATTTATGGATTTATTCGTTTTACTTTACAAGGGAAATGGTAATGTACCTTA 635
GM50 601 GGCAAAGGGTTGCTTTTAATATTCATCAAG-TTGACCTCAAATCA 644
H.uvarum 636 GGCAAAGGGTTGCTTTTAATATTCATCAAGTTTGACCTCAAATCA 680
71
Metschikowia pulcherrima
ORG55 1 TTTTAGGCACAAACTCTAAATCTTAACCYTCAWATAYACAATTaaaaaaaCTTTCAACAA 60
M.pulcherrima 31 TTTTAGGCACAAACTCTAAATCTTAACCCTCAAATACAC-TTTAAAAAAACTTTCAACAA 89
ORG55 61 CGGATCTCTT-GTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATACGTAATATGA-T 118
M.pulcherrima 90 CGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATACGTAATATGACT 149
ORG55 119 TGCAGACGTGAATCATTGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCGGGGTATTCCCCAGGGC 178
M.pulcherrima 150 TGCAGACGTGAATCATTGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCGGGGTATTCCCCAGGGC 209
ORG55 179 ATGCGTGGGTGAGCGATATTTACTCTCAAACCTCCGGTTTGGTCCTGCTTCGGCATAATA 238
M.pulcherrima 210 ATGCGTGGGTGAGCGATATTTACTCTCAAACCTCCGGTTTGGTCCTGCTTCGGCATAATA 269
ORG55 239 TCAACGGCGCTAGAATAAGTTTTAGCCCCAT-CTTTT-CCTCACCCT 283
M.pulcherrima 270 TCAACGGCGCTAGAATAAGTTTTAGCCCCATTCTTTTTCCTCACCCT 316
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