UPCII M Microbiologia Teórica 23-24

UPCII M MicrobiologiaTeórica 23-24

2º Ano2012/2013

Sumário

T 23-24 MJC 2

F. Patologia Oral de Etiologia Microbiana Capítulo XXIV. Cárie

Etiologia Bacteriana da cárie Modelos animais Imunologia da cárie e vacinas Aplicação de técnicas moleculares ao estudo da cárie Implicações para terapêutica

21-12-2012

Cárie – O que é?

21-12-20123 T 23-24 MJC

Progressão da carie

21-12-2012T 23-24 MJC 4

Tipos de carie Da superfície do dente Das fissuras ou zonas interproximais Radicular Recorrente Rampante Carie de biberão

21-12-2012T 23-24 MJC 5

Etiologia Bacteriana Streptococci:

mutans sanguinis gordonii sobrinus salivarius mitis anginosus ....

S. mutans: a S. cricetus b S. ratti (us) c S. mutans d S. sobrinus e S. mutans f S. mutans g S. sobrinus

21-12-20126 T 23-24 MJC

Grupo IV

Grupo II

Grupo I

Grupo III

Além dos streptococci …. Lactobacilli (dificuldade em colonizar

superfícies lisas) Actinomyces

21-12-2012T 23-24 MJC 7

Bifidobacterium, Propionobacterium, Veillonella, AttopobiumAtopobium, Olsenella, Pseudoramibacter, Propionibacterium e Selenomonas

Rothia, Propionibacterium

Factores de Virulência de Streptococci

21-12-2012T 23-24 MJC 8

Factores de virulência de streptococci

21-12-2012T 23-24 MJC 9

21-12-2012

Metabolismo da sacarose por S.mutans

Glucosiltransferase

Glucanos alfa(1,3) e alfa(1,6)

+

Frutose

Fructanos beta(2,1) e beta(2,6)

+

GlicoseGlicose

Dextranase

Fructanase

PSI

Fructosiltransferase

T 23-24 MJC

Factores de virulência de S. mutansFactorFactor FunçãoFunção LocalizaçãoLocalização

SpaP (AgB, AgI/II), PI Aderência (saliva, aglutinina gp340) Superficie da célula

Proteinas de ligação ao glucano (GbpA-C)

Aderência aos glucanos (dentes e biofilme) Superfície da célula

Glucosyl transferases (GtfB-D) Produção de polímeros de glicose apartir da sacarose (glucanos)

Secretadas, muitas vezes associadas à parede

Fructosyl transferase (Ftf) Produção de polímeros de fructose apartir da sacarose (fructanos – reservas extracelulares de glicose)

Secretadas, muitas vezes associadas à parede

Fructanase Hidrólise dos fructanos. Aumenta e preserva a acidificação

Secretadas, muitas vezes associadas à parede

Dextranase Hidrólise de glucanos Secretadas, muitas vezes associadas à parede

Polissacarideos intracelulares Polímero intracelular de glicose Intracelular

Fosfoenolpiruvato:fosfotransferase (PTS)

Cataliza internalização de vários açucares em baixas concentrações extracelulares

Membrana/citoplasma

ATPases (F1F0 ATPase ou H+ATPase)

Complexo enzimático que bombeia H+ para fora da célula. Importância?

F0 membranar F1 citoplasmático

Tolerância ao ácido Vantagem competitiva em pH baixo Global e multifactorial

21-12-2012 11T 23-24 MJC

Biofilme e controlo do QS Os CSP

21-12-2012T 23-24 MJC 12

Factores envolvidos

21-12-2012T 23-24 MJC 13

Factores envolvidos

21-12-2012T 23-24 MJC 14

Mais factores

21-12-2012T 23-24 MJC 15

Fluor na prevenção da cárie

21-12-2012T 23-24 MJC 16

Prevenção da carie

21-12-2012T 23-24 MJC 17

Estudo das caries – Modelos animais

Rat (ratazana) Tamanho Desenvolvem cárie

segundo dieta (4 semanas)

Modelos gnotobióticos e pathogen free

16-21 dias todos os molares infecção

MI Alterações do esmalte

Cães, gatos, cavalos, porcos. Primatas.

21-12-2012 18T 23-24 MJC

Técnicas de BM usadas1. Clonagem de genes / Sequenciação2. Mutações no cromossoma de S.mutans. Em

que genes?3. Produção de potenciais proteínas de puras

para estudos bioquímicos. Quais? 4. Expressão de genes de virulência.5. Expressão de genes em heterólogos.6. Utilização de bactérias com moléculas

repórter para a expressão de determinados genes.

21-12-201219 T 23-24 MJC

1. Clonagem de genes Genes codificantes de proteínas

extracelulares envolvidas na formação de polímeros de açucar.

O que se sabia? Gtf e Ftf glucosiltransferase e

fructosiltransferase O que não se sabia?

Como eram regulados? Quantos genes existiam? Como é que as proteínas contribuiam para a

virulência?

21-12-201220 T 23-24 MJC

1. Clonagem de genes Quantos genes existiam?

Existem 3 genes gtf diferentes em cada estirpe Existe 1 gene ftf

21-12-201221 T 23-24 MJC

2. Mutação dos genes de S. mutans Como é que as proteínas contribuem para a

virulência? Fazendo mutação dirigida Com os genes gtf e ftf mutados a capacidade de

provocar patologia é bastante diminuida.

21-12-201222 T 23-24 MJC

3. Produção de potenciais proteínas de puras para estudos bioquímicos

Cada uma das enzimas têm domínios conservados Há dois domínios

Um enzimático para a síntese do glucano Um de reconhecimento e ligação ao glucano

(específico de mutans)

21-12-201223 T 23-24 MJC

4. Expressão de genes de virulência

Quando são os genes gtf activados? Quando há baixo pH

21-12-201224 T 23-24 MJC

Outras questões além de gtf

Síntese de polisacarídeos intracelulares de armazenamento

Internalização dos vários açucares Proteínas de superfícies (AgI/II) Biofilmes

21-12-201225 T 23-24 MJC

Caracterização das respostas ao stress

Identificação dos genes Criação de mutantes Criar chimeras genéticas para observar o

efeito das mutações. Para quê saber as respostas ao stress?

21-12-201226 T 23-24 MJC

Respostas ao pH

+ 100 proteínas diferentes são expressas a pH 5.0

61 são bombas de protões ATPase Algumas são enzimas para produzir amónia

intracelularmente. Como pode ser amonia produzida

intracelularmente? Produção de S.mutans com urease do

S.salivarius

21-12-201227 T 23-24 MJC

PCR “Isolamento” de genes de função

desconhecida. Cerca de 1/3 do genoma de S. mutans codifica

proteínas de função desconhecida. Estudos de expressão por microarrays.

21-12-201228 T 23-24 MJC

Microarrays Não servem para estudar proteínas cujo

controlo é feito pós transcrição. Qual é a solução?

21-12-201229 T 23-24 MJC

Vacinas contra cáries Produção sistémica de anticorpos memória

S.mutans (superfícies sólidas) sIgA

Resposta de curta duração Reforços

Especificidade Etiologia Factores de virulência

Adesão Formas de vacinação

21-12-201230 T 23-24 MJC

Antigénios e modos de imunização Comprimidos de S. mutans inactivado Proteínas secretadas ou expressas por S.mutans

Gtfs, Gbps, ag (I/II) e SpaP Disponibilização dos antigénio o máximo de tempo

Tecido linfóide na associação da mucosa nasal e oral Peyer’s patches intestino

Moléculas inteiras combinadas com partículas de alumínio, incluídas em esferas de poli-L-lactose.

Actualmente partes das moléculas: Mais eficazes Mais fáceis de recombinar (junção da parte antigénica

com toxinas aumenta longevidade da resposta)

21-12-201231 T 23-24 MJC

Antigénios e modos de imunização Bactérias vivas (Salmonella enterica)

Recombinante c/ agI/II + subunidade beta da toxina da colera.

Administrado na mucosa nasal e no intestino

21-12-201232 T 23-24 MJC

Segurança das vacinas Ensaios em humanos

Soro de ratos imunizados com Strep. mutans reagia com tecido cardíaco.

O material a ser utilizado como imunogénico tem de estar livre de material que possa ser prejudicial ao hospedeiro.

21-12-201233 T 23-24 MJC

Resumo das estratégias de imunização

21-12-2012T 23-24 MJC 34

Novas perspectivas Cárie tem etiologia microbiana mas...

Polimicrobiana Há outros factores...

Relação com o pH (bem estabelecida) mas poucas terapêuticas exploram este factor.

Remineralização diminuída Conhecem-se alguns dos mecanismos associados à

recuperação da dentina. Concentração dos iões necessários à reminenalização

Terapêuticas inovadoras com Células estaminais Substituição de microrganismos não acidogénicos

no biofilme oral21-12-2012T 23-24 MJC 35

Bibliografia

T 23-24 MJC 36 21-12-2012

Capítulo 11

Capítulo 32

Capítulo 16-19