B1BlIOTECAFaculdade de Ciências Farmacêuticas

Universidade de São Paulo

ío?-luh.<Jo ~;f -)oVot

LfílolUNIYERSIDADE DE SÃO PAULO N~ u'(,~L~

~. ""' - .

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICASCurso de Pós-Graduação em Ciências dos Alimentos

Área de Nutrição Experimental '

COMPARAÇÃO ENTRE A BIODISPONIBILlDADE DO ~­

CAROTENO SINTÉTICO E DE FONTE NATURAL (COUVE­MANTEIGA): PAPEL DA FIBRA ALIMENTAR EM ANIMAIS DE

LABORATÓRIO

MÁRCIA ELENA ZANUTTO

Dissertação para obtenção do grau deMESTRE

Orientador:Prof. Dr. Hélio Vannucchi

São Paulo.

2000

llo:1br

DEDALUS-Ace~o-CQ

111111111111 11111111111111111111111111111111111111111111111111111

30100003799

Ficha Catalográfica elaborada pela Biblioteca Central Campus USP - Ribeirão Preto

Zanutto, Márcia ElenaComparação entre a biodisponibilidade do p-caroteno sintético e

de fonte natural (couve-manteiga): papel da fibra alimentar em animaisde laboratório. Ribeirão Preto, 2000.

159p.: il.; 30cm.

Dissertação de Mestrado, apresentado à Faculdade de CiênciasFarmacêuticas de São Paulo/USP. Departamento de Alimentos eNutrição Experimental. Área: Nutrição Experimental.

Orientador: Vannucchi, Hélio

1. Biodisponibilidade. 2. p-caroteno. 3. Pectina

81BLlOTECA'ICtlld.Ólo do Ciênci" f arm.cêulk..

Uni.Ill~ ... Sio P....

MÁRCIA ElENA ZANUnO

COMPARAÇÃO ENTRE A BIODlSPONIBILlDADE DO ~-eAROTENO

SINTÉTICO E DE FONTE NATURAL (COUVE-MANTEIGA): PAPEL DA FIBRAALIMENTAR EM ANIMAIS DE LABORATÓRIO

Comissão Julgadora

Dissertação para obtenção do grau deMESTRE

Prof. Dr. Hélio VannucchlOrientadorfPresldente

Prot". DI'" Regina Mara Flsberg1° Examinador

Pro'. Dr. Fernando Salvador Moreno2° Examinador

510 Paulo, 24 de novembro de 2000

"Se eu pudesse deixar algum presente a alguém,

deixaria aceso o sentimento de amar a vida dos

seres humanos. A consciência de aprender tudo

o que foi ensinado pelo tempo a fora. Lembraria

os erros que foram cometidos para que não

se repetissem. A capacidade de escolher novos

rumos. Deixaria a alguém se pudesse, o respeito

àquilo que é indispensável: além do pão o trabalho.

Além do trabalho, a ação. f, quando tudo mais

faltasse ,um segredo: o de ir buscar no interior de

si mesmo a resposta e a força para encontrar a saída."

Gandhi

DEDICATÓRIA

Aos meus pois, Libe!1ino e Ivanir, pelo carinho, pelos ensinamentos e por

estarem sempre presentes em minha vida;

Ao meu irmão Cláudio e suo esposo Lourdes pelo, carinho e apoio;

A minha gratidão.

AGRADECIMENTOS

À Deus, por estar sempre ao meu lado em todos os momentos de minha

vida.

Ao Prof. Or. Hélio Vannucchi, pela orientação, apoio e estímulo no

desenvolvimento deste trabalho.

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP),

pela concessão de bolsa estudo e apoio financeiro a este trabalho.

Aos amigos e técnicos do Laboratório de Nutrição do Oepto de Clínica

Médica da FMRP - USP, Mônica Meirelles, Alceu Afonso Jordão Júnior, Gilberto

Padovan, pela colaboração na fase laboratorial e companheirismo.

Aos amigos e técnicos do Biotério do Oepto de Clínica Médica da FMRP ­

USP, Adalberto Verceze, Maurício Arantes e Roni Charles Fabbris, pelo apoio

técnico e auxílio na manutenção e cuidado com os animais.

À Rosa Fávaro (Instituto Adolfo Lutz de Ribeirão Preto), pela colaboração

nas análises de f3-caroteno da couve-manteiga e ração dos animais, e pela

atenção e gentileza que me foram sempre dispensadas.

Ao Prof. Or. Oswaldo da Fac. Ciências Farmacêuticas - USP - Ribeirão

Preto, pelo colaboração na peletização de rações.

À Prof. Ora Túllia Filliseti da Fac. Ciências Farmacêuticas - USP - São

Paulo, pelas análises de fibra alimentar.

Às secretárias: Márcia Gaioli (Depto Clínica Médica - FMRP - USP)

Ângela Oliveira e Isabel Alves (Depto de Alimentos e Nutrição

Experimental)

Benedita Oliveira e Elaine Ychico (Secretaria da Pós­

Graduação - FCF - USP)

E ao secretário Jorge Lima (Secretaria da Pós- Graduação - FCF - USP)

Aos amigos de pós-graduação (Andréia, Anderson, Cláudia, Éllen, Elma,

Márcia e Paula) pela amizade e companheirismo.

Aos amigos da Moradia da Pós - Graduação - USP - Ribeirão Preto (André,

Cris, Ida, Vai e Pablo), pela amizade e humanismo.

Aos amigos: Clóvis, Cris (BP), Gi, Lyssa e Karina, por sempre me

acompanharem.

Às amigas: Ana Silvia, pelos ouvidos atentos aos bons e maus momentos e

pela disposição em ajudar;

Katlya, pelo incentivo e apoio nesta caminhada;

Roxana, por estar sempre presente, ajudando, apoiando e

aconselhando;

Sandri, pela amizade, sensibilidade e disposição em ajudar.

Em especial, a minha prima Nércia e família, por acolher-me em sua casa,

pelo apoio e carinho.

Enfim, agradeço a todos que participaram e contribuíram de alguma

maneira na realização deste trabalho.

SUMÁRIO

1 - INTRODUÇÃO 1

2 - REVISÃO DA LITERATURA 4

3 - OBJETIVOS 21

4 - MATERIAIS E MÉTODOS 23

4.1 - Animais 24

4.1.1 - EXPERIMENTO I (RATOS) 24

4.1 .1.1 - Rações 24

4.1.1.2 - Ambiente e gaiolas 25

4.1.1.3 -Delineamento experimental 25

4.1.2 - EXPERIMENTO 11 (COELHOS) 31

4.1.2.1 - Rações 31

4.1.2.2 - Ambientes e gaiolas 32

4.1.2.3 - Delineamento experimental 32

4.1.2.4 - Peletização das rações 37

4.2 - Análises 37

4.2.1 - Metodologia da análise de B-caroteno em couve-manteiga 37

4.2.2 - Metodologia da análise de fibra alimentar em couve-manteiga 38

4.2.3 - Determinação das concentrações hepáticas de B-caroteno,

retinol e palmitato de retinila 39

4.2.4 - Determinação das concentrações plasmáticas de retinol,

p-caroteno e palmitato de retinila 41

4.2.5 - Determinação de B-caroteno nas rações 42

4.2.6 - Avaliação da concentração do B-caroteno sintético utilizado

na preparação das rações 42

4.3 - Análise estatística 42

5 - RESULTADOS 44

5.1 - Experimento em ratos 45

5.1.1 - Ganho de peso nos grupos de ratos 45

5.1.2 - Ingestão de ração nos grupos de ratos 45

5.1.3 - Ingestão de ~-caroteno nos grupos de ratos 45

5.1.4 - Concentrações hepáticas de retinol, ~-caroteno e

palmitato de retinila nos grupos de ratos 50

5.1.5 - Concentrações hepáticas totais de retinol, ~-caroteno

e palmitato de retinila no experimento com ratos 53

5.1.6 - índice da quantidade total de retinol, ~-caroteno e

palmitato de retinila em relação ao peso corporal dos

animais nos grupos de ratos 55

5.1.7 - Concentrações plasmáticas de retinol, ~-caroteno e

palmitato de retinila nos grupos de ratos 57

5.1.8 - Correlações entre ingestão de ~-caroteno, concentrações

hepáticas de retinol, ~-caroteno e palmitato de retinila

e concentrações plasmáticas de retinol e ~-caroteno

do Grupo Controle (GC) 59

5.1.9 - Correlações entre ingestão de ~-caroteno, concentrações

hepáticas e retinol, ~-caroteno e palmitato de retinila e

concentrações plasmáticas de retinol e ~-caroteno

do Grupo Experimental (GE) 59

5.1.10 - Avaliação da concentração do ~-caroteno sintético utilizado

na preparação das rações 62

5.1.11 - Concentração de ~-caroteno nas rações no experimento

em ratos 62

5.2 - Experimento em coelhos 63

5.2.1 - Determinação de ~-caroteno em couve-manteiga 63

5.2.2 - Determinação de fibra alimentar (solúveis e insolúveis) em

couve-manteiga 63

5.2.3 - Ganho de peso nos grupos de coelhos 64

5.2.4 - Ingestão de ração nos grupos de coelhos 64

5.2.5 - Ingestão de ~-caroteno nos grupos de coelhos 65

5.2.6 - Concentrações hepáticas de retinol, ~-caroteno e palmitato

de retinila nos grupos de coelhos 71

5.2.7 - Concentrações hepáticas totais de retinol, ~-caroteno e

palmitato de retinila no experimento com coelhos 76

5.2.8 - índice da quantidade total de retinol, ~-caroteno e palmitato de

retinila em relação ao peso corporal dos animais nos grupos de

coelhos 78

5.2.9 - Concentrações plasmáticas de retinol, ~-caroteno e palmitato

de retinila nos grupos de coelhos 80

5.2.10 - Correlações entre ingestão de ~-caroteno, concentrações

hepáticas de retinol, ~-caroteno e palmitato de retinila

e concentrações plasmática de retinol e ~-caroteno

do Grupo Vegetal (GV) 82

5.2.11 - Correlações entre ingestão de ~-caroteno, concentrações

hepáticas de retinol, ~-caroteno e palmitato de retinila

e concentrações plasmáticas de retinol e ~-caroteno

do Grupo Controle Positivo (GCP) 82

5.2.12 - Avaliação da concentração do ~-caroteno sintético utilizado

na preparação das rações 84

5.2.13 - Concentração de ~-caroteno nas rações no experimento

em coelhos 84

6 - DISCUSSÃO 85

7 - CONCLUSÕES 106

8 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 108

9- RESUMO 123

10-SUMMARY 124

ANEXOS

Anexo I - Tabelas com dados individuais do Experimento I (ratos) 125

Anexo II - Tabelas com dados individuais do Experimento II (coelhos) 143

oyJnaOll.lNI-t

2

A vitamina A é lipossolúvel e se origina de dois grupos: os

carotenóides pró-vitamina A, provenientes principalmente dos alimentos de

origem vegetal, e o retinol ou vitamina A pré-formada, existentes nos

alimentos de origem animal, geralmente como ésteres retilínicos, em

especial o palmitato de retinila (RONCADA, 1998).

Entre suas diversas funções, a vitamina A é essencial para o

crescimento, para a visão e para manter os tecidos epiteliais perfeitos e

saudáveis (GABY et ai, 1991). Consequentemente, uma dieta que contenha

quantidades insuficientes desta vitamina ou de seus precursores, causará

distúrbios à saúde.

A deficiência de vitamina A, principalmente entre crianças, é um

problema de saúde pública em países em desenvolvimento (UNDERWOOD

& ARTHUR, 1996). Algumas estratégias, como a fortificação de alimentos

com vitamina A ou ~-caroteno têm sido estudadas com o intuito de reverter

este quadro. Estudos realizados em ratos e humanos (FÃVARO et ai, 1992;

DUTRA DE OLIVEIRA et ai, 1998a; DUTRA DE OLIVEIRA et ai, 1998b;

MORANDI et ai, 1998), demonstraram que o óleo de soja é um bom veículo

de transporte para fortificação com ~-caroteno ou vitamina A (sendo estes

altamente solúveis em óleos), mesmo quando submetidos a tratamentos

térmicos (100°C, por 20min.), preservando o seu valor biológico (90%).

Outra alternativa no combate a deficiência de vitamina A, seria a

utilização de dietas ricas em carotenóides, fontes de pró-vitamina A (ex:

vegetais de folhas verde-escuro). Os vegetais de folhas verdes, são

tradicionalmente considerados boas fontes de vitamina A através dos

carotenóides neles existentes, principalmente o ~-caroteno. MINAZZI­

RODRIGUES & PENTEADO (1989), estudando a atividade pró-vitamina A

de algumas hortaliças folhosas, encontraram que a mostarda e a taioba,

constituem boas fontes de vitamina A. Outras hortaliças, tais como o

almeirão, agrião e a couve-manteiga, também são consideradas ricas em

carotenóides pró-vitamina A (RONCADA, 1998).

Entretanto, nos últimos anos, alguns estudos (MICOZZI et ai, 1992;

BULUX et ai, 1994; De PEE et ai, 1995) têm mostrado resultados que

3

colocam dúvidas a respeito da eficiência desses vegetais como fonte de

vitamina A. Entre estes, um estudo (De PEE et ai, 1995) demonstrou que o

J3-caroteno presente nos vegetais é menos biodisponível em comparação ao

J3-caroteno sintético. Dentre os fatores que possivelmente interferem nessa

baixa biodisponibilidade, destaca-se a influência dos teores de fibra

alimentar presente no vegetal, especialmente a pectina (ERDMAN Jr. et ai,

1986; ROCK & SWENDSEID, 1992; De PEE et ai, 1995; ZHOU et ai, 1996)

Uma das hipóteses para explicar o mecanismo envolvido seria que os

polissacarídeos viscosos, tais como a pectina, interferem com a formação de

micelas necessárias para a absorção de J3-caroteno. Surge daí, a

necessidade de mais estudos sobre a estratégia de combate a deficiência de

vitamina A, utilizando maior consumo de fontes naturais de pró-vitamina A

(carotenóides). Portanto, a fim de contribuir com dados sobre a referida

discussão em torno da utilização de vegetais como fontes de vitamina A, o

presente estudo avaliou a biodisponibilidade do J3-caroteno sintético e de

fonte natural (vegetal de folha verde-escuro), e os possíveis efeitos da fibra

alimentar (pectina).

VlIn.LVlI3.LllvaOVSIA311-Z-

5

2.1- Vitamina A

A vitamina A foi a primeira vitamina lipossolúvel a ser identificada, em

meados da década de 10, simultaneamente, por Osborne e Mendel e por

MacCollum e Davis, sendo que estes a chamaram de fator A lipossolúvel

("fat-soluble factor A"), devido a observação que em alguns alimentos de

origem animal, tais como o fígado, leite e manteiga, existia um fator

lipossolúvel que favorecia o crescimento de ratos. Esta designação foi

utilizada para distinguí-Ia de um outro importante nutriente dietético, porém

solúvel em água, o hidrossolúvel B ("water-soluble B"). Posteriormente, ela

passou a ser chamada de factor A e, mais tarde, de vitamina A (WOLF,

1996; RONCADA, 1998).

O termo "vitamina A" é genérico e refere-se a todos os compostos que

contém um anel ~-ionona e apresentam a atividade biológica do retinol

(LAVOISIER, 1998; RONCADA, 1998).

O retinol é um álcool primário formado por três partes: um anel ~­

ionona com características hidrofóbicas, uma longa cadeia lateral de

carbonos isoprenóides conjugados, que pode sofrer isomerização na

presença da luz, e finalmente um grupo polar terminal. Este último, pode ser

química ou enzimaticamente modificado, resultando por exemplo, num

aldeído como o retinaldeído, ou ainda ser oxidado transformando-se em

ácido retinóico (LAVOISIER, 1998).

O retinol e seus metabólitos retinaldeído e ácido retinóico, incluindo

seus derivados sintéticos, são chamados de retinóides (LAVOISIER, 1998).

2.2- Características dos carotenóides

Os carotenóides representam o grupo de pigmentos mais

amplamente distribuído na natureza. São encontrados principalmente em

plantas de cor amarela, alaranjada, vermelha e verde. Juntamente com as

clorofilas estão presentes em todos os tecidos fotossintéticos, e mesmo em

alguns não fotossintéticos como flores, raízes, sementes e frutos e,

esporadicamente, em microrganismos como mofo, fungos filamentosos e

6

bactérias. Nos alimentos são geralmente lipossolúveis, mas podem estar

ligados a proteínas ou esterificados (SIMPSON & CHICHESTER, 1981).

Quimicamente, são enquadrados numa classe de compostos

conhecidos como terpenóides. São estruturas alifáticas ou alifático­

alicíclicas, normalmente com oito grupos isoprenos ( C5 Ha ) unidos por

ligações tipo cabeça-cauda, exceto na posição central da molécula, onde a

ligação é do tipo cauda-cauda. O sistema de duplas ligações conjugadas

que constitui o sistema cromóforo, é o responsável pela variação de cores

apresentada por estes pigmentos (GROSS, 1991).

Os carotenóides diferem quanto ao grau de saturação, ciclização,

grupos funcionais e número de átomos de carbono (GROSS, 1991). Quando

estão na forma de hidrocarbonados são classificados como carotenos e os

derivados oxigenados como xantofilas ou oxicarotenóides, como mostra a

Figura 1 (THANE & REDDY, 1997).

7

Carotenos ou carotenóides hidrocarbonados

..Ij,.~

Licopeno

a-caroteno

R-caroteno

Xantofilas OU carotenóides oxigenados

~ ....OH

Luteína

OHZeaxantina

OH

Figura 1: Estruturas de alguns carotenóides encontrados em frutas e

hortaliças (Fonte: THANE & REDDY, 1997)

8

2.3- Estabilidade

Os carotenóides são alterados ou parcialmente destruídos por ácidos,

bases (às vezes), lipoxigenases e luz, especialmente na presença de

oxigênio ou de metais. Os passos desta degradação resultam na formação

de compostos derivados do carotenóide original, como isômeros cís-trans,

epóxidos e produtos resultantes da quebra da cadeia; todas essas

alterações levam à perda ou redução na atividade pró-vitamínica A

(SIMPSON & CHICHESTER, 1981; SIMPSON, 1983; THANE & REDDY,

1997).

2.4 - Funções dos carotenóides

De aproximadamente 600 carotenóides conhecidos apenas cerca de

10% apresentam atividade pró-vitamínica A (ERDMAN et ai, 1988), sendo

essa uma das funções desempenhadas por estes compostos. Para o

carotenóide atuar como precursor de vitamina A, deve ter no mínimo um

anel ~-ionona não substituído ligado à cadeia poliênica lateral e pelo menos

11 átomos de carbono (GROSS, 1991). Tais requisitos limitam o número de

carotenóides com atividade pró-vitamínica A.

A molécula do ~-caroteno é simétrica, contendo dois anéis ~-ionona

não substituídos, possuindo potencial pró-vitamínico A fixado teoricamente

em 100%. Outros carotenóides possuem menor atividade pró-vitamínica A

quando comparados ao ~-caroteno (ver Tabela 1). O a-caroteno, o y­

caroteno e a ~-criptoxantina apresentam cerca da metade da atividade pró­

vitamínica A do ~-caroteno (GROSS, 1991). No primeiro, devido à presença

de um anel a-ionona, no segundo, em função da presença de apenas um

anel ~-ionona e no terceiro, devido à presença de um grupo OH em um dos

anéis (SIMPSON, 1983). A luteína (normalmente encontrada em frutas,

hortaliças e ovos), a astaxantina (comum em animais) e a cantaxantina

(comum em cogumelos e crustáceos), são alguns carotenóides que não

possuem atividade pró-vitamínica A.

BIBLIOTECAFaculdade de Ciências Far.nacêutlca

Universidade de São Paulo

9

Tabela1: Biodisponibilidade de carotenóides (CASTENMILLER &

WEST,1998)

Carotenóides Bioconversão relativa (%)

~-caroteno

9-cis-~-caroteno

13-cis-~-caroteno

a-carotenoy-caroteno~-zeacaroteno

~-criptoxantina

3,4-dehidro-~-caroteno

2,2'-dimetil-~-caroteno

~-caroteno-5' ,6'-monoepóxido4-keto-~-caroteno

3-keto-~-caroteno

4-h idroxi-~-caroteno

~-apo-8'-carotenal

~-apo-12' -carotenalCarotenóides não provitamina Ad

100a

38b

53b

50-54a 29c,42-50a

20-40a

50-60a 55c,75a

50a

21 a

25a

44-50a

52a

48a

72a

120a

Oa'llSAUERNFEIND (1972)bZECHMEISTER (1949)cVAN VLlET et ai (1996a)dCarotenóides não pró-vitamina A tais como luteína, Iicopeno, zeaxantina,etc

Além da atividade pró-vitamínica A, outras funções são atribuídas aos

carotenóides. Nas revisões publicadas por GESTER (1993) e BURRI (1997)

os trabalhos mostram a eficiência do ~-caroteno e outros carotenóides, como

equimiopreventivosantimutagênicos,agentes antioxidantes,

anticancerígenos.

No Brasil, vários trabalhos foram e estão sendo feitos no sentido de

elucidar qual o papel dos carotenóides nas diferentes fases do câncer

hepático (MORENO et aI., 1995; RIZZI et al.,1997).

2.5- Hipovitaminose A

A hipovitaminose A resulta da diminuição dos níveis desta vitamina

nos depósitos e no plasma, principalmente pela ingestão de dietas pobres

em vitamina A por um tempo prolongado (SOUZA et ai, 1988).

10

Tabela1: Biodisponibilidade de carotenóides (CASTENMILLER &

WEST,1998)

Carotenóides

f3-caroteno9-cis-f3-caroteno13-cis-f3-carotenou-carotenoy-carotenof3-zeacarotenof3-criptoxantina3,4-dehidro-f3-caroteno2,2'-dimetil-f3-carotenof3-caroteno-5' ,6'-monoepóxido4-keto-f3-caroteno3-keto-f3-caroteno4-hidroxi-f3-carotenof3-apo-8'-carotenalf3-apo-12'-carotenalCarotenóides não provitamina Ad

Bioconversão relativa (%)

100a

38b

53b

50-54a 29c,42-50a

20-40a

50-60a 55c,75a

50a

21 a

25a

44-50a

52a

48a

72a

120a

Oa1l'BAUERNFEIND (1972)bZECHMEISTER (1949)cVAN VLlET et ai (1996a)dCarotenóides não pró-vitamina A tais como luteína, licopeno, zeaxantina,etc

Além da atividade pró-vitamínica A, outras funções são atribuídas aos

carotenóides. Nas revisões publicadas por GESTER (1993) e BURRI (1997)

os trabalhos mostram a eficiência do f3-caroteno e outros carotenóides, como

agentes antioxidantes, antimutagênicos, quimiopreventivos e

anticancerígenos.

No Brasil, vários trabalhos foram e estão sendo feitos no sentido de

elucidar qual o papel dos carotenóides nas diferentes fases do câncer

hepático (MORENO et aI., 1995; RIZZI et aI., 1997).

2.5- Hipovitaminose A

A hipovitaminose A resulta da diminuição dos níveis desta vitamina

nos depósitos e no plasma, principalmente pela ingestão de dietas pobres

em vitamina A por um tempo prolongado (SOUZA et ai, 1988).

11

sugerindo a necessidade de se prestar especial atenção a esse grupo

populacional por ser, entre os grupos de risco, o mais vulnerável aos efeitos

deletérios da carência marginal de vitamina A, em razão do rápido

crescimento nos primeiros meses de vida. FERRAZ (1998), estudando cento

e três crianças de 6 meses a 2 anos de idades, seguidas em um laboratório

de Puericultura na cidade de Ribeirão Preto, Estado de São Paulo, também

encontrou níveis séricos de retinol baixos (~ O,70J-lmoI/L) em 21,4% das

crianças estudadas.

2.6- Absorção e metabolismo dos carotenóides

A absorção e o metabolismo dos carotenóides variam extensamente

de acordo com a espécie animal (ROCK, 1997). Carnívoros estritos, não

dependem de carotenóides para fornecer vitamina A, pois a sua dieta

contém retino!. Por outro lado, herbívoros estritos, são dependentes de

carotenóides como fonte de vitamina A, devido a ausência de retinol em sua

dieta. Assim, estes absorvem e convertem carotenóides pró-vitamina A em

retinol de maneira satisfatoriamente eficiente, com algumas diferenças

dentro do grupo. Em humanos e alguns outros mamíferos (primatas, "ferrets"

e bovinos), uma quantidade apreciável de carotenóides pode ser absorvida

intacta pelas células da mucosa intestinal, e posteriormente aparece na

circulação e tecidos periféricos. Animais que possuem gordura amarela, tais

como o homem e a vaca, acumulam carotenóides, enquanto animais como o

coelho e a ovelha que possuem gordura branca, não estocam prontamente

carotenóides (ERDMAN Jr. et ai, 1993; Van VLlET, 1996b). A Figura 2

mostra uma visão geral do metabolismo do p-caroteno desde de sua

presença no lúmen intestinal até sua ação na célula alvo.

A absorção dos carotenóides pode ser dividida em quatro partes:

digestão da matriz alimentar, formação da mistura micelar lipídica, absorção

dos carotenóides pelas células da mucosa intestinal, e transporte dentro da

circulação geral via sistema linfático. Em cada estágio há a necessidade de

gordura. A gordura dietética estimula a secreção da bile para auxiliar na

formação das micelas lipídicas (WILLlAMS et ai, 1998).

12

SANGUE

-iJe,r··l-~ttT~ FíGADO...

RA

DIETA.I Esteres de retinila.~ Carotenóides INTESTINO"""C: .. . _:I

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.~.~c RE\"~f\ Re1tnoI ..

...

...."'~(?) RA

I,;;,;;iojjii

Figura 2: Uma visão geral do metabolismo do p-caroteno e retinóides naturais, desde a

presença destes no lúmen intestinal até as ações na célula alvo (p-caroteno, p-C; ésteres

de retinila, RE; ácido retinóico,RA; lecitina:retinol aciltransferase, LRAT; proteína celular

ligadora de retinol tipo li, CRBPII; hidrolase de ésteres de retinila, REH; proteína ligadora de

retinol, RBP; transtirretina, TTR; receptor ácido retinóico, RAR; receptor X para retinóides,

RXR). Adaptado de SILVEIRA & MORENO, 1998.

13

Após serem consumidos, os carotenóides, no trato digestivo, são

liberados de sua matriz por enzimas digestivas e solubilizados pelos sais

biliares. Da partícula micelar formada, acredita-se que os carotenóides

sejam absorvidos por difusão passiva pelas células da mucosa duodenal

(Van VLlET, 1996b). A marcha da difusão é provavelmente determinada pelo

gradiente de concentração entre a micela e a membrana plasmática do

enterócito (PARKER, 1996). Nos enterócitos, parte dos carotenóides são

convertidos em vitamina A (Van VLlET, 1996b). O ~-caroteno, sob ação da

enzima 15, 15' dioxigenase, sofre c1ivagem oxidativa na posição central 15'

produzindo 2 moléculas de retinal. Nessa reação molecular, o oxigênio reage

com dois átomos de carbono centrais da molécula do ~-caroteno, após o

qual a dupla ligação central do caroteno é clivada produzindo as duas

moléculas de retinal (WANG, 1994). O retinal é subsequentemente oxidado

à ácido retinóico ou reduzido a retinol (vitamina A) através da ação da

enzima retinal redutase. Além da c1ivagem central, é possível a ocorrência

de quebras excêntricas nas posições 8', 10' e 12' formando apocarotenais e

compostos apo-menores. Os primeiros podem ser enzimaticamente

convertidos a retinal ou oxidados formando o ácido ~-apo-carotenóico, que

posteriormente pode sofrer uma f3-oxidação irreversível produzindo o ácido

retinóico (Figura 3) (XIANG-DONG, 1994; ROCK, 1997; MACLAREN, 1998).

O retinol formado na mucosa intestinal é esterificado através da atividade da

enzima lecitina:retinol aciltransferase (LRAT) ou através da atividade

enzimática da acil:CoA retinol aciltransferase (ARAT). Os ésteres de retinila

sintetizados, bem como os carotenóides que não sofreram c1ivagem,

incorporam-se aos quilomícrons que são, então, transferidos por exocitose

ao sistema linfático (SIMPSON & CHICHESTER, 1981; SIMPSON, 1983;

WANG, 1994; MACLAREN, 1998; SILVEIRA & MORENO, 1998; WILLlAMS

et ai, 1998) (Figura 3). Os quilomícrons na corrente sanguínea submetidos a

Iipólise, catalisada pela lipase lipoprotéica, resultam na formação dos

remanescentes de quilomícrons, os quais são removidos do plasma

principalmente para o fígado (Van VLlET, 1996b).

14

lÚMEN INTESTINALAlimentos de origem animal

R(.. . lipase pancreático.. ~s;;rcolesterol hidrolase

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Figura 3: Aspectos do metabolismo do l3-caroteno e retinóides naturais desde a presença

destes no lúmen intestinal até serem liberados pelos enterócitos. (l3-caroteno, I3-C; ésteres

de retini/a, RE; retinol, ROL; retinal, RAl; ácido retinóico, RA; clivagem excêntrica, Cliv.

Exc., c1ivagem central, Cliv. Cent; hidrolases de ésteres de retinila da borda em escova,

REases; retinol desidrogenase, RODH; retinal desidrogenase, RALDH; retinal redutase,

RED; lecitina:retinol aciltransferase, LRAT; acil:CoA retinol aci/transferase, ARAT; proteína

celular Iigadora de retinol tipo 11, CRBPII; quilomícron, Q). Adaptado de SILVEIRA &

MORENO, 1998.

15

No fígado são encontrados dois diferentes tipos celulares

responsáveis pelo metabolismo da vitamina A. Um deles, representado pelos

hepatócitos, está diretamente envolvido com a captação dos remanescentes

de quilomícrons, enquanto que o outro, constituído pelas células

perissinusoidais estreladas ou de Ito, é responsável pelo armazenamento da

vitamina A, na forma de ésteres de retinila, principalmente na região

periportal (BATRES & OLSON, 1987). Na Figura 4, são ilustrados os

aspectos do metabolismo hepático do ~-caroteno.

Figura 4: Aspectos do metabolismo hepático do ~-caroteno e retinóides naturais, desde a

captação destes pelo hepatócito até a liberação para a célula alvo. (~-caroteno, ~-C; ésteres

de retinHa, RE; retinol, ROL; retinal, RAL; ácido retinóico, RA; hidrolases neutra e ácida de

ésteres retinila, NREH e AREH; retinol desidrogenase , RODH; retinal desidrogenase,

RALDH; hidrolase de ésteres de retinila , REH; lecitina:retinol aciltransferase esterático,

LRAT; proteína Iigadora de retinol, RBP; trantirretina, TTR; proteína ligadora de ácido

retinóico celular, CRABP; Iipoproteína de muito baixa densidade, VLDL). Adaptado de

SILVEIRA & MORENO, 1998.

16

Os remanescentes de quilomícrons são capturados pelos hepatócitos,

que apresentam receptores B/E em suas superfícies, com subsequente

endocitose. Estes receptores, capazes de reconhecer as apoliproteínas

(apoB e apoE) dos remanescentes de quilomícrons, manteria a lipoproteína

ligada à célula, possibilitando uma remoção rápida e eficiente da vitamina A

e de outros nutrientes pelo hepatócito. (BLOMHOFF et ai, 1991;

MACLAREN,1998).

Os ésteres de retinila constituintes desses remanescentes de

quilomícrons são rapidamente hidrolisados pelas hidrolases ácida e neutra,

com atividades independentes de sais biliares, e que estão presentes na

membrana plasmática e/ou endossomo do hepatócito (HARRISON et ai,

1995). O retinol formado, ao invés de ser transferido aos Iisossomos, dirige­

se ao retículo endoplasmático, onde também é sintetizada a proteína

ligadora de retinol (RBP), e que aí se encontra em elevada concentração.

Após sua ligação com a RBP, ocorre migração da holo-proteína para o

complexo de Golgi, e secreção para o exterior da célula (Rone et ai apud

SILVEIRA &MORENO, 1998).

As células estreladas, também possuem grandes quantidades de

proteínas ligadoras de retinol celular (CRBP) e do ácido retinóico celular

(CRABP), bem como das enzimas capazes de sintetizarem (LRAT e ARAT)

e de hidrolisarem ésteres de retinila (HENDRIKS, 1996).

Para o retinol ser liberado das células estreladas à circulação os

ésteres de retinila estocados· devem, inicialmente, serem hidrolisados,

associando-se a seguir, o respectivo retinol formado à molécula de RBP.

Porém, a capacidade das células estreladas para síntese e secreção da

RBP é debatida (ANDERSEN et ai, 1992; HENDRIKS, 1996; Suhara et ai

apud SILVEIRA & MORENO, 1998).

No plasma ou mesmo no lúmen do retículo endoplasmático, o

complexo retinol-RBP liberado das células hepáticas se associa com a

proteína transtirretina (TIR), que reduz sua filtração glomerular

(MACLAREN, 1998; SAUBERLlCH, 1999).·

17

Do fígado, os carotenóides podem ser transportados para outros

tecidos, sendo secretados com as Iipoproteínas (Van VLlET, 1996b). O ~­

caroteno é secretado pelo fígado junto com a lipoproteína de densidade

muito baixa (VLDL), depois é transferido para a lipoproteína de baixa

densidade (LOL). Aproximadamente 75% dos carotenóides plasmáticos

estão associados com a LOL, e os restantes estão distribuídos entre a VLOL

e HDL, embora diferentes carotenóides apresentam padrões distintivos de

distribuição. Os carotenóides mais apoiares (~-caroteno, u-caroteno,

licopeno, etc) estão predominantemente com a LDL, enquanto os

carotenóides mais polares (Iuteína) se encontram mais associados com a

HOL que com a LOL (Van VLlET, 1996b; ROCK, 1997).

Sabe-se que a absorção dos carotenóides pode variar em função de

vários fatores, como por exemplo, a digestibilidade do alimento, teores de

outros nutrientes como gorduras, proteínas, fibras e minerais na dieta, teor

dos próprios carotenóides e espécie animal (SIMPSON, 1983; EROMAN et

ai, 1986; PARKER, 1989; WANG, 1994; Van VLlET, 1996b).

2.7- Biodisponibilidade de carotenóides e a influência da pectina

A biodisponibilidade é definida como a proporção de um nutriente

ingerido, o qual se torna disponível ao organismo por processos metabólicos

(JACKSON et ai, 1997).

Vários fatores podem influenciar a biodisponilibilidade de carotenóides

de alimentos e formulações, entre eles: dieta, matriz, fisiológicos e

ambientais. A eficiência na absorção de carotenóides de fontes alimentares

na ausência de parasitoses, doenças ou desordens do metabolismo

digestivo é provavelmente influenciada pela eficiência da liberação

(extração) da matriz alimentar, pelo volume lipídico suficiente (triglicerídeos)

para solubilização do carotenóide liberado e estimulação da síntese de

quilomícrons, pelos fatores que interferem no lúmen, tais como pectina ou

outras fibras alimentares (RODRIGUEZ-AMAYA, 1996), e pelos outros

carotenóides não pró-vitamina A na mucosa intestinal, que podem interagir

18

com a enzima responsável pela conversão de carotenóides em vitamina A

(PARKER, 1997).

De PEE et ai (1996), em uma revisão de vários trabalhos sobre a

biodisponibilidade de carotenóides, concluíram que o p-caroteno purificado

em óleo é mais biodisponível que os carotenos de vegetais folhosos e

cenoura, sendo que alimentos triturados e homogeneizados aumentam a

biodisponibilidade dos carotenos. Estes autores criaram o termo

SLAMANGHI (Quadro 1) para expor os fatores que interferem na

biodisponilidade dos carotenóides. A quantificação destes fatores capacita

estimar a biodisponiblidade de carotenóides de certos alimentos sob

circunstâncias específicas.

SLAMANGHI

S: espécie de caroteno

L: ligação molecular

A: quantidade de caroteno consumido

M: matriz na qual o caroteno está incorporado

A: modificações na absorção

N: estado do nutriente no hospedeiro

G: fatores genéticos

H: fatores relacionados ao hospedeiro

I: interações

Quadro 1: Fatores que que interferem na biodisponilidade

dos carotenóides (De PEE et ai, 1996)

Frutas de cor amarela ou laranja e, vegetais de folhas verde-escuro

são frequentemente utilizados como um meio para melhorar o estado de

vitamina A, devido ao fato de tais alimentos serem ricos em carotenóides,

especialmente o p-caroteno. Porém, a hipótese que plantas fontes de pró­

vitamina A podem combater eficientemente o quadro de deficiência tem sido

questionada devido aos resultados apresentados recentemente (BROWN et

19

com a enzima responsável pela conversão de carotenóides em vitamina A

(PARKER, 1997).

De PEE et ai (1996), em uma revisão de vários trabalhos sobre a

biodisponibilidade de carotenóides, concluíram que o ~-caroteno purificado

em óleo é mais biodisponível que os carotenos de vegetais folhosos e

cenoura, sendo que alimentos triturados e homogeneizados aumentam a

biodisponibilidade dos carotenos. Estes autores criaram o termo

SLAMANGHI (Quadro 1) para expor os fatores que interferem na

biodisponilidade dos carotenóides. A quantificação destes fatores capacita

estimar a biodisponiblidade de carotenóides de certos alimentos sob

circunstâncias específicas.

SLAMANGHI

S: espécie de caroteno

L: ligação molecular

A: quantidade de caroteno consumido

M: matriz na qual o caroteno está incorporado

A: modificações na absorção

N: estado do nutriente no hospedeiro

G: fatores genéticos

H: fatores relacionados ao hospedeiro

I: interações

Quadro 1: Fatores que que interferem na biodisponilidade

dos carotenóides (De PEE et ai, 1996)

Frutas de cor amarela ou laranja e, vegetais de folhas verde-escuro

são frequentemente utilizados como um meio para melhorar o estado de

vitamina A, devido ao fato de tais alimentos serem ricos em carotenóides,

especialmente o ~-caroteno. Porém, a hipótese que plantas fontes de pró­

vitamina A podem combater eficientemente o quadro de deficiência tem sido

questionada devido aos resultados apresentados recentemente (BROWN et

20

Uma das hipóteses para explicar o mecanismo envolvido, seria que os

polissacarídeos viscosos, tais como a pectina, interfeririam com a formação

de micelas necessárias para a absorção de ~-caroteno. ERDMAN et ai

(1986), caracterizaram várias fontes de pectina cítrica e avaliaram seus

efeitos sobre a utilização de ~-caroteno em pintainhos (empregando em

cada dieta experimental 7% de uma determinada fonte de fibra); também

obtiveram uma marcante redução da utilização de ~-caroteno,

provavelmente pelo consumo de fontes naturais de pectina. Os resultados

desse estudo, demonstraram a ocorrência de uma relação inversa entre o

metoxil contido na pectina e a utilização do ~-caroteno. Pectinas com alto

peso molecular e alto teor metoxil, podem aumentar a viscosidade no

intestino, interferindo na formação de micelas, reduzindo a absorção de ~­

caroteno. Em um outro estudo, ZHOU et ai (1996) também utilizando

animais ("ferrets"), comparou a biodisponibilidade relativa do ~-caroteno de

extratos de cenoura (cromoplasto e suco de cenoura), com uma fonte

comercial (na qual o ~-caroteno é altamente biodisponível), e o efeito do

aquecimento também foi avaliado nos extratos de cenoura. As

concentrações de ~-caroteno no soro e nos tecidos, foram significativamente

altas nos animais que receberam ~-caroteno de fonte comercial (controle),

em r-elação aos outros grupos (cromoplasto e suco de cenoura), sendo que o

grupo que recebeu o suco de cenoura obteve os valores mais baixos,

provavelmente devido a influência das fibras. Os resultados também

indicaram, que o aquecimento (100°C, por 15 min.) não afetou

significantemente a biodisponibilidade do ~-caroteno nos "ferrets".

Com a adição de pectina em dietas humana ou animal, tem sido

obseNado aumento na excreção fecal de ácidos biliares e gordura total,

parecendo razoável que a biodisponibilidade de vitaminas lipossolúveis e a

utilização de pró-vitamina A, em particular, podem ser afetadas

negativamente pelo consumo de alimentos ricos em pectina (Anonymous,

1987).

SOJ\I~3rgO-E

22

3.1 - Objetivo geral

Estudar a biodisponibilidade do p-caroteno sintético e de fonte natural,

e o efeito da fibra alimentar (pectina cítrica) em dois tipos de animais de

laboratório e em condições experimentais.

3.2 - Objetivos específicos

~ Verificar em ratos, o efeito da pectina cítrica na biodisponibilidade

do p-caroteno sintético, usando os parâmetros: ganho de peso, ingestão de

rações e níveis plasmáticos e hepáticos de p-caroteno, retinol e palmitato de

retinila.

~ Comparar em coelhos, a biodisponibilidade do p-caroteno sintético

e de fonte natural, na presença de pectina cítrica, usando os parâmetros:

ganho de peso, ingestão de rações e níveis plasmáticos e hepáticos de p­

caroteno, retinol e palmitato de retinila.

SOaOl;l1l'J3SI'VI~31'VII'J-V

24

4.1 - Animais

Este estudo foi realizado no Laboratório da Divisão de Nutrição do

Departamento de Clínica Médica da Faculadade de Medicina de Ribeirão

Preto da Universidade de São Paulo (USP), de acordo com as

recomendações da Helsinki Declaration.

Foram realizados dois experimentos com dois tipos diferentes de

animais (ratos e coelhos), procedentes do Biotério da Faculdade de

Medicina de Ribeirão Preto. No Experimento I, utilizou-se 30 ratos machos

normais e recém-desmamados da linhagem Wistar, com peso médio de

62,1 9 ± 5,14. E no Experimento", utilizou-se 39 coelhos (fêmeas) normais e

recém-desmamados, da linhagem White, com peso médio de 1002,3g ±

181,3.

4.1.1 - EXPERIMENTO I (RATOS):

Dos 30 ratos utilizados neste experimento, dez deles foram

sacrificados no início do experimento para determinações dos níveis basais

de vitamina A e p-caroteno no plasma e no fígado. Os 20 animais restantes

foram separados em 2 grupos, sendo que cada grupo foi composto por 10

animais:

GC: Grupo Controle com ração contendo 24J.lg de p-caroteno/g de ração e

0% de pectina cítrica

GE: Grupo Experimental com ração contendo 24J.lg de p-caroteno/g de ração

e 7% de pectina cítrica

4.1.1.1- Rações

As rações do Grupo Controle (GC) e do Grupo Experimental (GE)

continham 24J.lg de p-caroteno/g de ração. O óleo de soja foi utilizado como

veículo de transporte do p-caroteno (DUTRA de OLIVEIRA et ai, 1998a).

A ração do Grupo Experimental (GE), teve em sua constituição 7% de

fibra alimentar (pectina cítrica), proporção esta baseada em um estudo

anterior em galináceos (ERDMAN Jr. et ai, 1986). O Grupo Controle (GC),

25

recebeu ração isenta de pectina cítrica. A composição das rações, mistura

salina e mistura vitamínica, estão apresentadas nas Tabelas 2, 3 e 4.

As rações após preparadas, foram colocadas em sacos plásticos

escuros e armazenadas em freezer -4oC para evitar a degradação do p­

caroteno e de outros nutrientes da ração.

4.1.1.2- Ambientes e gaiolas

Durante todo o experimento os animais foram mantidos em uma sala

com ventilação natural, temperatura ambiente, e iluminação artificial

controlada - período de 12 horas de iluminação alternado com igual período

sem iluminação. Os ratos foram acomodados individualmente em gaiolas de

aço inoxidável.

4.1.1.3- Delineamento experimental

Os animais permaneceram em um período de adaptação ao ambiente

durante três dias, recebendo ração (Nuvilab CR1) oferecida pelo biotério. A

composição básica desta ração é apresentada na Tabela 5. Após esta

etapa, os animais dos grupos Controle (GC) e Experimental (GE) receberam

as respectivas rações e água ad libitum, durante 30 dias de experimento.

O controle de peso dos animais, assim como a ingestão de ração,

foram feitos semanalmente.

Decorrido o período experimental de 30 dias, os animais foram

sacrificados por decapitação para determinações de p-caroteno, retinol e

ésteres de retinol no plasma e tecido hepático.

O sangue colhido foi centrifugado para separação do plasma, o qual

foi armazenado em freezer -70oC. O fígado, após ser extraído do animal, foi

lavado em solução salina, pesado (balança analítica Scientech SA120), e

imediatamente envolvido em papel alumínio e colocado em nitrogênio

líquido, e armazenado em freezer -70oC para posteriores análises.

A Figura 5 representa o esquema de delineamento experimental.

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27

TABELA 2: Composição das rações para ratos, baseada na AOAC (1975 )

INGREDIENTES/ANIMAIS Controle Experimental

(g/kg) (g/kg)

Amido de milho q.s.p q.s.p

Caseína (12%) 160,0 160,0

Óleo de soja (8%) 80,0 80,0

Mistura salina AIN-93 (5%) 50,0 50,0

Mistura vitamínica AIN-93 (isenta de vitamina 10,0 10,0

A) (1 %)

24~g/g f3-caroteno Roche (1% - em pó) 2,4 2,4

Pectina cítrica (7%) ----_.- 70,0

Cloreto de colina (0,2%) 2,0 2,0

Tabela 3 - Composição da Mistura Salina AIN-93 (Rhoster)

28

Componentes

Carbonato de cálcio, anidro, 40,04% Ca

Fosfato de potássio, 22,76% P, 28,73% K

Cloreto de sódio, 39,34 Na, 60,66% CI

Sulfato de Potássio, 44,87% K, 18,39% S

Citrato de potássio, tri-potássio, 36,16% K

Óxido de magnésio, 60,32% Mg

Citrato férrico, 16,5% Fe

Carbonato de cálcio, 52,14% Zn

Carbonato de manganês, 47,79% Mn

Carbonato de cobre, 57,47% Cu

lodato de potássio, 59,30% I

Selenato de sódio, 41,79% Se

Paramolibdato de Amônio, 54,34% Mo

Meta-silicato de sódio, 9,88% Si

Sulfato cromo de potássio, 10,42% Cr

Ácido bórico, 17,5% B

Fluoreto de sódio, 45,24% F

Carbonato de níquel, 45% Ni

Cloreto de lítio, 16,38% Li

Vanadato de amônio, 43,55% V

Sacarose (dextrose)

9/10009 mistura

357,00

250,00

74,00

46,60

28,00

24,00

6,06

1,65

0,63

0,30

0,01

0,01025

0,00795

1,15

0,275

0,0815

0,0635

0,0318

0,0174

0,0066

209,806

Tabela 4 - Composição da Mistura Vitamínica AIN-93* (Rosther)

Componentes 9/5009 mistura

29

Nicotinamida

Pantotenato de cálcio

Piridoxina - HCI

Tiamina- HCI

Riboflavina

Ácido fólico

0-8iotina

Vitamina 812 (cianocobalamina)

(0,1% em manitol)

Vitamina E (acetato de a-tocoferil)

(500Ul/g)

Vitamina 0 3 (colicalciferol)

(400.000UI/g)

Vitamina K (filoquinona)

Sacarose (dextrose)

* A Mistura Vitamínica AIN-93 é isenta de vitamina A.

1,50

0,80

0,35

0,30

0,30

0,10

0,010

1,25

7,50

0,125

0,0375

q.s.p

30

Tabela 5 - Composição da ração oferecida aos grupos de ratos durante

o período de adaptação (3 dias).

Componentes

VitaminasVit. A (UI)Vit. 0 3 (UI)Vit. E (mg)Vit. K3 (mg)Vit. B1 (mg)Vit. B2 (mg)Vit. B6 (mg)Vit. B12 (f.!g)Niacina (mg)Ácido pantotênico (mg)Ácido fólico (mg)Biotina (mg)Colina (mg)MineraisFerro (mg)Zinco (mg)Cobre (mg)lodo (mg)Manganês (mg)Selênio (mg)Cobalto (mg)AminoácidosOL-metioninaLisina

Kg de ração

12.0001.800

303567

2060201

0,05600

5060102

600,051,50

300100

Composição básica da ração: Carbonato de cálcio, farelo de milho,

farelo de soja, farelo de trigo, farinha de carne e ossos, cloreto de sódio,

primix mineral vitamínico, aminoácido e farinha de peixe.

Baseada em recomendações do National Research Council e National

Institute of Health - USA.

31

4.1.2 - EXPERIMENTO" (COELHOS)

Dos 39 animais utilizados neste experimento, nove deles foram

sacrificados no início do experimento para determinações dos níveis basais

de vitamina A e p-caroteno no plasma e no fígado. Os 30 animais restantes

foram separados em 3 grupos, sendo que cada grupo foi composto por 10

animais:

GV: Grupo Vegetal (couve-manteiga) com ração isenta de p-caroteno + o

vegetal folhoso equivalente a 6mg/dia de p-caroteno

GCP: Grupo Controle Positivo com ração contendo p-caroteno sintético (óleo

+ p-caroteno) equivalente a quantidade do Grupo GV

GCN: Grupo Controle Negativo com ração isenta de p-caroteno

4.1.2.1- Rações

A ração oferecida aos animais do Grupo Vegetal (GV) e Grupo

Controle Negativo (GCN) foram isentas de p-caroteno, e a ração do Grupo

Controle Positivo (GCP) continha 6mg de p-caroteno sintético (dissolvido em

óleo) a cada 45g de ração. Esta quantidade de p-caroteno na ração dos

animais do Grupo Controle Positivo (GCP) foi baseada na quantidade de p­

caroteno presente na couve-manteiga (162g de couve-manteiga/dia = 6mg

de p-caroteno/dia) oferecida diariamente aos animais do Grupo Vegetal

(GV), ajustada a quantidade de ração diária que um coelho recém­

desmamado ingere, de modo a oferecer a mesma quantidade diária de p­

caroteno aos grupos Vegetal (GV) e Controle Positivo (GCP).

Todos os grupos de coelhos receberam a mesma quantidade de fibra

alimentar na ração (12% de pectina cítrica e 2% de celulose).

A composição das rações, mistura salina e mistura vitamínica, estão

apresentadas nas Tabelas 6,3 e 4.

As rações, após preparadas foram peletizadas e colocadas em sacos

plásticos escuros, e armazenadas em freezer -4°C para evitar a degradação

do p-caroteno e de outros nutrientes da ração.

32

4.1.2.2- Ambientes e gaiolas

Durante todo o experimento os animais foram mantidos em uma sala

com ventilação natural, temperatura ambiente, e iluminação artificial

controlada - período de 12 horas de iluminação alternado com igual período

sem iluminação. Os coelhos foram acomodados individualmente em gaiolas

de aço inoxidável.

4.1.2.3- Delineamento experimental

Os animais permaneceram em um período de adaptação ao ambiente

durante três dias, recebendo ração (Coelhil "R") oferecida pelo biotério. A

composição básica desta ração é apresentada na Tabela 7. Depois, os

grupos de coelhos GV, GCP e GCN passaram por uma semana de

adaptação às respectivas rações experimentais; o Grupo GV recebeu

também o vegetal folhoso (couve-manteiga). Após esta etapa de adaptação,

iniciou-se o período experimental, com os animais de cada grupo de

coelhos, continuando a receber as rações experimentais e água ad libitum ,

durante 30 dias.

O grupo GV, o qual a fonte de ~-caroteno foi natural, recebeu 162 g

diárias de couve-manteiga in natura (Biassica oleracea varo acepha/a),

equivalente a 6 mg de ~-caroteno, e uma ração isenta de ~-caroteno. O

vegetal folhoso foi colhido todas as manhãs, adquirido do mesmo

fornecedor, em uma horta próxima às dependências da universidade. Depois

de lavado com água, o vegetal foi pesado e colocado na gaiola suspenso por

ganchos, para evitar que os animais o desperdiçasse.

O controle de peso dos animais foi feito semanalmente, a ingestão de

ração foi medida a cada dois dias, e a ingestão de couve-manteiga do Grupo

GV foi medida a cada 24 horas.

Decorrido o período experimental de 30 dias, os animais foram

previamente anestesiados com o composto Zoletil 50 (Virbac) e, após a

abertura da parede tóraco-abdominal, foram sacrificados por exangüinação

para determinações de ~-caroteno, retinol e ésteres de retinol no plasma e

tecido hepático.

33

o sangue colhido foi centrifugado para separação do plasma, o qual

foi armazenado em freezer -lO°C. O fígado, após ser extraído do animal, foi

lavado em solução salina, pesado (balança analítica Scientech SA120), e

imediatamente envolvido em papel alumínio e colocado em nitrogênio

líquido, e armazenado em freezer -lO°C para posteriores análises.

A Figura 6 representa o esquema de delineamento experimental.

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BIBLIOTECA 35Faculdade de Ciências Farmacêuticas

Univ&rsidade de São Paulo

TABELA 6: Composição das rações para coelhos, baseada em ADAMSOM et ai

(1973)

INGREDIENTES/ANIMAIS GV GCP GCN

(g/10kg) (g/10kg) (g/10kg)

Amido de milho q.s.p q.s.p q.s.p

Caseína (12%) 1600,0 1600,0 1600,0

Óleo de soja (8%) 800,0 800,0 800,0

Mistura salina AIN-93 (5%) 500,0 500,0 500,0

Mistura vitamínica AIN-93 (isenta de 100,0 100,0 100,0

vitamina A) (1%)

~-caroteno sintético Roche ( all-trans ----- 4,43

30% em óleo)

Pectina cítrica (12%) 1200,Oa 1200,0 1200,0

Celulose (2%) 200,Ob 200,0 200,0

Cloreto de colina (0,2%) 20,0 20,0 20,0

a: Soma da fibras solúveis da couve-manteiga + pectina cítrica sintéticab: Soma das fibras insolúveis da couve-manteiga + celulose sintética

36

Tabela 7 - Composição da ração oferecida aos grupos de coelhos

durante o período de adaptação (3 dias).

Componentes Enriquecimento por Kg

do produto

Vit. A (UI)

Vit. D3 (UI)

Riboflavina (mg)

Vit. E (mg)

Ácido pantotênico (mg)

Niacina (mg)

Vit. 812 (Jlg)

Cobalto (mg)

lodo (mg)

Cobre (mg)

Ferro (mg)

Manganês (mg)

Zinco (mg)

Antibiótico (mg)

Furazolidona (mg)

2.100

400

1,80

1,50

4,83

7,98

8,00

0,18

0,30

1,53

6,56

1,30

11,25

8,70

55,00

Composição básica da ração: farelo de soja, farelo de trigo, farelo

de algodão, farinha de alfafa, milho moído, carbonato de cálcio, sal, melaço,

suplemento mineral e vitamínico.

37

4.1.2.4 - Peletização das rações do Experimento 11 (coelhos)

O processo de peletização da ração, foi realizado da seguinte forma:

- Após a preparação e homogeneização da ração foram

acrescentados 40g de PVP (polivinil pirrolidona K-30) para cada 10kg da

mesma. Este produto é utilizado para dar consistência ao "pellet";

- Em seguida a ração foi passada 3 vezes por uma máquina

granuladora (Filizola), a fim de misturar o PVP à dieta;

- Depois, foram acrescentados à ração 3L de água destilada,

deixando-a úmida para passar por uma máquina (moedor de carne), onde foi

prensada através de um parafuso de rosca tipo sem fim contra uma placa

perfurada, para formação dos "pellets";

- Os "pellets" foram colocados em bandejas e levados à uma estufa a

40°C, até a completa secagem.

4.2 - Análises

4.2.1 - Metodologia da análise de p-Caroteno em couve-manteiga

O p-caroteno foi extraído da couve-manteiga segundo a técnica de

SCHOEP & SCHIERLE (1997), realizada no Instituto Adolfo Lutz de Ribeirão

Preto.

Príncípio do Método:

Está baseado na extração direta do p-caroteno com etanol, seguido

da quantificação através de cromatografia líquida de alta eficiência.

Técnica

- Pesou-se 1g da amostra de couve-manteiga previamente

homogeneizada em um balão volumétrico de 250ml;

- Adicionou-se 5ml de água;

- A amostra foi dispersa em um banho de ultra-som por 5 mino

(temperatura da sala);

- Adicionou-se 1OOml de etanol, agitando-se vigorosamente a mistura;

- Depois, foi adicionado diclorometano, agitou-se vigorosamente até

descoloração completa da amostra. Após atingir a temperatura

ambiente completou-se o volume até o menisco com diclorometano;

38

- Após assentamento dos sólidos retirou-se SOml da porção

sobrenadante, que foi concentrada com vácuo parcial numa

temperatura de ~ SO°C, sob nitrogênio;

- O resíduo foi dissolvido na fase móvel (acetonitrila: diclorometano:

metanol, 70: 20:10) e injetado no HPLC.

- As condições cromatográficas foram as mesmas utilizadas nas

dosagens plasmáticas e hepáticas de ~-caroteno.

- Todos os procedimentos foram realizados sob proteção da luz.

4.2.2 - Metodologia da análise de fibra alimentar em couve­

manteiga

As análises de fibra alimentar (solúveis e insolúveis) em couve­

manteiga, foram realizadas segundo PROSKY et ai (1988), com algumas

modificações, no Laboratório de Alimentos do Depto de Alimentos e Nutrição

Experimental da Faculdade de Ciências Farmacêuticas - USP - São Paulo.

Principio do Método

Está baseado na determinação do peso do resíduo resultante da

eliminação do amido e da proteína, através da hidrólise enzimática, e

posterior precipitação das fibras solúveis na presença de etanol a 78%.

Fibra Alimentar Insolúvel (FAI): o hidrolisado contendo o resíduo, foi

filtrado e lavado com água. O filtrado e a água de lavagem foram utilizados

para determinar a Fibra Alimentar Solúvel. O resíduo foi lavado com etanol a

9S% e acetona, seco e pesado. A FAI corresponde ao peso do resíduo

descontando-se o peso da proteína e das cinzas contidas no resíduo.

Fibra Alimentar Solúvel (FAS): quatro volumes de etanol a 98% foram

adicionados ao filtrado, juntamente com a água de lavagem, com a

finalidade de precipitar a FAS. A solução alcoólica foi filtrada e o precipitado

é retido e lavado com etanol a 78%, etanol a 95% e acetona e,

posteriormente, seco e pesado. A FAS corresponde ao peso do precipitado

descontando-se o peso da proteína e das cinzas contidas no resíduo.

39

4.2.3 - Determinação das concentrações hepáticas de p-caroteno,

retinol e palmitato de retinila

Foram utilizados fragmentos do lobo direito de cada fígado, mantidos

em freezer a -70°C até o momento da análise.

Todas as etapas foram realizadas, protegendo as amostras da luz, do

oxigênio do ar e da temperatura ambiente com auxílio de papel alumínio e

de recipiente com gêlo.

4.2.3.1 - Extração

Fragmentos do lobo direito hepático de cada animal, após descongelados,

foram pesados em balança digital, e daí retirada uma amostra de 0,5 grama

de fígado para extração, com base no procedimento descrito por ARNOULD

et ai (1991). Tal amostra foi homogeneizada com 2,0 ml de metanol (para

cromatografia, Merck) e auxílio de um Politron manual (Post-mounted

Homogenizer, OMNI 2000, EUA). Em seguida, foram adicionados 2,0 ml de

n-hexano (para cromatografia, Merck) e a amostra foi agitada, por 2 minutos,

em agitador de tubos (modelo 251, FANEM). Procedendo-se, a seguir a

centrifugação por 10 minutos a 3000 rpm. Posteriormente, a camada

superior de n-hexano foi retirada com pipeta Pasteur e, transferida para

outros tubos. O n-hexano (para cromatografia , Merck), foi evaporado sob

fluxo de nitrogênio e a amostra residual foi redissolvida em 300 /lI de fase

móvel (acetonitrila, diclorometano e metanol, na proporção 70:20:10).

4.2.3.2 - Análise de p-caroteno, retinol e palmitato de retinila por

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência·. ("HPLC" - "high­

performance Iiquid chromatographyj

4.2.3.2.1 - Preparo dos padrões

Foram utilizados padrões comerciais de p-caroteno (Trans-p­

caroteno, Type I: synthetic, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EUA), retinol

(Retinol (vitamin A), Ali, trans, synthetic, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO,

EUA), e palmitato de retinila (Retinol palmitate, Ali trans, Type IV: synthetic,

Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EUA).

40

Antes de serem utilizados, cada padrão foi quantificado por

espectrofotometria (spectrophotometer BECKMAN, modelo DU 640) a partir

da absorção máxima.

Após a quantificação, as soluções padrão foram diluídas em

concentrações desejadas e colocadas em frascos de vidro âmbar.

A solução padrão de ~-caroteno foi sempre preparada no dia da

análise (para evitar a degradação do ~-caroteno), ao passo que, as soluções

de retinol e palmitato de retiníla foram preparadas semanalmente, e

mantidas em freezer.

4.2.3.2.2 - Condições Cromatográficas

As concentrações hepáticas de ~-caroteno, retinol e palmitato de

retinila foram determinadas por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

("HPLC" - "high-performance liquid chromafography'), segundo o método

descrito por ARNOULD et aI. (1991), com algumas modificações.

As condições utilizadas para a análise das amostras foram as

seguintes:

- Cromatógrafo líquido de alta eficiência (Shimadzu, modelo LC9A) com

sistema isocrático

- Detector espectrofotométrico (UV-visível, Shimadzu, modelo SPD-6AV),

utilizando os comprimentos de ondas:

- ~-caroteno: 450nm

- vitamina A: 325nm

- Injetor manual

- Coluna de fase reversa (C18), 5 flm, com 150 mm de comprimento e 6mm

de diâmetro interno.

- Fase móvel: acetonitrila: diclorometano: metanol (70:20:10)

- Fluxo da fase móvel: 1,5 ml/min.

- Injeção: 100 fll

- Tempo de corrida: 20 mino

A análise foi conduzida com a injeção de 100 fll dos padrões e das

amostras no cromatógrafo. Para tanto, foi utilizado o seguinte procedimento:

41

- As soluções dos padrões de ~-caroteno, retinol, e palmitato de retinila

foram injetadas, isoladamente.

- Em seguida, as amostras foram injetadas.

Os solventes utilizados foram filtrados em sistema Milipore de filtração

a vácuo e, em seguida, degaseificados sob sistema de ultra-som (modelo T­

7C/T, THORTON). As amostras e padrões, por sua vez, foram filtrados em

filtros Milipore, Millex, com diâmetro do poro de 0,45 /..1..

4.2.3.2.3 - Quantificação dos carotenóides

Os valores das áreas dos picos para os padrões e para as amostras

analisadas foram utilizados para o cálculo da concentração dos

carotenóides.

Os resultados finais foram expressos em micrograma por grama de

fígado.

4.2.4 - Determinação das concentrações plasmáticas de retinol, ~­

caroteno e palmitato de retinila

A coleta do sangue em coelhos foi feita através de punção cardíaca

sendo que a agulha e o tubo continham heparina como anticoagulante e em

ratos ocorreu após o processo de decapitação. Em seguida, o sangue foi

centrifugado durante 10 minutos e o plasma obtido foi colocado em tubos e

guardados em freezer a -70°C até análise.

4.2.4.1 - Extração:

Os carotenóides foram extraídos coin base na técnica de ARNOULD

et ai (1991): as amostras foram colocadas em tubos de vidro (75 mm x

12mm I.D.), sendo protegidas por papel alumínio para minimizar a

degradação de vitaminas pela exposição a luz. Um volume de 1,Oml de

etanol foi adicionado a 0,5ml de soro. A mistura foi agitada por agitador

durante 10seg. Depois, as vitaminas foram extraídas com 1,Oml de hexano

por agitação em agitador por 2 min .. Os tubos foram centrifugados por 5min.,

e 500/..1.1 da camada de hexano foram transferidos a outros tubos de vidro e

evaporados, sob fluxo de nitrogênio. O resíduo foi dissolvido em 500/..1.1 de

42

fase móvel (acetonitrila, diclorometano e metanol, na proporção 70:20:10),

misturando por 2min., e 100111 foram imediatamente injetados dentro do

cromatógrafo.

4.2.4.2 - Condições Cromatográficas para análise de retinol, J3­

caroteno e palmitato de retinila no plasma

As condições cromatográficas foram as mesmas descritas para a

análise de J3-caroteno, retinol e palmitato de retinila no fígado.

Os resultados foram expressos em J,Jmol/L de plasma.

4.2.5 - Determinação de J3-caroteno nas rações

O J3-caroteno presente nas rações foi determinado segundo PANFILI

et ai (1994). As análises foram realizadas no Instituto Adolfo Lutz de Ribeirão

Preto.

4.2.6 - Avaliação da concentração do J3-caroteno sintético

utilizado na preparação das rações

A concentração do J3-caroteno sintético utilizado na preparação das

rações no experimento com ratos e no experimento com coelhos foi

confirmada por HPLC.

O J3-caroteno sintético (1 % em pó) utilizado na ração de ratos foi

extraído segundo PANFILI et ai (1994). O J3-caroteno (30% em óleo) utilizado

na ração de coelhos foi diluído emhexano e depois na fase móvel (1:100).

A concentração de cada preparado de J3-caroteno sintético foi

determinada em HPLC, seguindo as mesmas condições cromatográficas

utilizadas nas dosagens plasmáticas e hepáticas de J3-caroteno.

4.3 - Análise estatística

As variáveis estão representadas como média e desvio-padrão.

A determinação das diferenças entre os grupos de animais em cada

experimento (ratos e coelhos), foi feita por análise de variância aplicando o

43

teste de Tukey, considerando 5% o nível de significância (p<0,05), com o

auxílio do programa Statistica, versão 6.0, da Stat Soft.

As correlações entre as variáveis de cada experimento (ratos e

coelhos), foram feitas utilizando o teste não-paramétrico de Spearman,

considerando 5% o nível de significância (p<0,05), com o auxílio do

programa Statistica, versão 6.0, da Stat Soft.

SOaV.LlnS311-5

45

5.1 - EXPERIMENTO EM RATOS

Neste experimento, ocorreu a perda de amostras biológicas de dois

animais, um do Grupo Controle (GC) e um do Grupo Experimental (GE)

durante as análises, sendo estes excluídos da análise de dados.

5.1.1 - Ganho de peso nos grupos de ratos .

A curva do ganho de peso dos animais dos grupos estudados,

durante o período experimental, está representada na Figura 7. O ganho de

peso total nos grupos Controle (GC) e Experimental (GE ) após 30 dias de

experimento está apresentado na Tabela 8.

O Teste de Tukey (ANOVA) para o ganho de peso total dos animais

estudados, mostrou diferença significativa (p<O,05) entre os grupos

Experimental (GE) e Controle (GC), com o Grupo Experimental

apresentando menor ganho de peso (Tabela 8).

5.1.2- Ingestão de ração nos grupos de ratos

A curva de ingestão de ração nos grupos de animais estudados está

representada na Figura 8. A ingestão total de ração nos grupos Controle

(GC) e Experimental (GE) após 30 dias de experimento está apresentada na

Tabela 8.

O Teste de Tukey (ANOVA) para a ingestão total de ração pelos

animais estudados, não mostrou diferença significativa (p>0,05) entre os

grupos Experimental (GE) e Controle (GC), (Tabela 8).

5.1.3- Ingestão de ~-caroteno nos grupos de ratos

A ingestão total de ~-caroteno nos grupos Controle (GC) e

Experimental (GE) após 30 dias de experimento está ilustrada na Figura 9.

O teste de Tukey (ANOVA) não mostrou nenhuma diferença

significativa (p>O,05) na ingestão total de ~-caroteno entre os grupos

Controle (5,77mg ± 0,42) e Experimental (5,41mg ± 0,51).

Tabela 8 - Ganho de peso (g) e ingesl.lo de raç60 (g) nol grupos de ratos":

Ratos n Ganho de peso total IrigoStAO total de raçao

GNpo Controle (GC) 9 176.11 ± 12,641 424,78± 30,6õ'([karoteno + 0% de fibras)

46

Grupo Experimental (GE)(!l-earoteno +7% de fibras)

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50

5.1.4 - Concentrações hepáticas de retinol, ~-carotenoe palmitato

de retinila (flg/g) no experimento com ratos

As concentrações hepáticas de retinol, ~-caroteno e palmitato de

retinila nos grupos Controle (GC) e Experimental (GE), estão representadas

nas Figuras 10a e 10b. Os valores do Grupo Basal foram: retinol =0,36 fl9/9

± 0, 14; ~-caroteno =0,14fl9/9 ± 0,10; palmitato de retinila =23,67fl9/9 ±

10,52.

O teste de Tukey (ANOVA) para o retinol mostrou diferença

significativa (p<0,05) entre os grupos Experimental (2,68fl9/9 ± 1,12) e

Controle (4,90fl9/9 ± 2,51), com o Grupo Experimental apresentando menor

concentração hepática de retinol. Para as concentrações de ~-caroteno, o

teste também mostrou diferença significativa (p<0,05) entre os grupos

Experimental (0,11 fl9/9 ± 0,06) e Controle (0,98fl9/9 ± 0,28), com menor

concentração hepática encontrada no Grupo Experimental, sendo este valor

menor que o encontrado no Grupo Basal (O,14fl9/9 ± 0,10). Quanto à

concentração de palmitato de retinila, também se observou que os grupos

Experimental (37,01 fl9/9 ± 17,20) e Controle (95,47fl9/g ± 45,13) diferiram

estatisticamente (p<0,05), com menor concentração hepática de palmitato

no Grupo Experimental.

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5.1.5- Concentrações hepáticas totais de retinol, ~-caroteno e

palmitato de retinila no experimento com ratos

As concentrações hepáticas totais de retinol, ~-caroteno e palmitato

de retinHa nos grupos Controle (GC) e Experimental (GE), estão

apresentadas na Tabela 9, e foram calculadas através da fómula:

Concentração hepática (Ilg/g) x peso total do fígado

o teste de Tukey (ANOVA) para o retinol hepático total mostrou

diferença significativa (p<O,OS) entre os grupos Experimental (GE) e Controle

(GC), com menor concentração hepática no Grupo Experimental. Para o ~­

caroteno hepático total, o teste também mostrou diferença significativa entre

os grupos (p<O,OS), com o Grupo Experimental (GE) apresentando menor

concentração hepática em relação ao Grupo Controle (GC). E o palmitato de

retinHa hepático total, também apresentou diferença significativa (p<O,OS)

entre os grupos, com menor concentração hepática no Grupo Experimental

(GE) em relação ao Grupo Controle (GC).

As médias dos pesos dos fígados do Grupo Controle (9,72g ± 0,S7) e

Experimental (8,86g ± 0,9S) apresentaram diferença significativa (p<O,OS)

quando o teste de Tukey foi aplicado, com menor peso no Grupo

Experimental.

55

5.1.6- índice da quantidade total de retinol, P-caroteno e palmitato

de retinila no fígado em relação ao peso corporal dos animais nos

grupos de ratos

Este índice foi calculado através da seguinte fórmula:

Concentração total do composto no figado (Jlg)

1=Peso corporal final (g)

o índice da quantidade total de retinol, p-caroteno e palmitato de

retinila no fígado em relação ao peso corporal dos animais estudados

(Controle e Experimental), está apresentado na Tabela 10.

O teste de Tukey (ANOVA) para o índice de retinol, mostrou diferença

significativa (p<0,05) entre os grupos de animais, com o Grupo Experimental

(GE) apresentando menor índice de retinol em relação ao Grupo Controle

(GC). O índice de p-caroteno também apresentou diferença significativa

(p<O,05) entre os grupos de animais, com o Grupo Experimental (GE)

apresentando menor índice de p-caroteno em relação ao Grupo Controle

(GC). E o índice de palmitato de retinila, também mostrou diferença

significativa (p<0,05) entre os grupos Experimental (GC) e Controle (GC),

com o Grupo Experimental (GE) apresentando menor índice de palmitato de

retinila em relação ao Grupo Controle (GC).

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57

5.1.7 - Concentrações plasmáticas de retinol, ~-caroteno e

palmitato de retinila (Ilmol/L) no experimento com ratos

As concentrações plasmáticas de retinol, ~-caroteno e palmitato de

retinila e nos grupos Controle (GC) e Experimental (GE) estão representadas

na Figura 11. Os valores do Grupo Basal foram: retinol = 0,661lmo1lL ± 0,30;

~-caroteno =0,091lmo1lL ± 0,06; palmitato de retinila não foi detectado.

O teste de Tukey (ANOVA) para o retinol não mostrou diferença

significativa (p>0,05) entre os Grupos Controle (1,42IlmoIlL ± 0,36) e

Experimental (1,10llmol/L ± 0,24). Em relação ao ~-caroteno plasmático o

teste mostrou diferença significativa (p<0,05) entre os grupos Experimental

(O,O?llmoI/L ± 0,04) e Controle (0,20llmoI/L ± 0,12), com menor

concentração plasmática de ~-caroteno no Grupo Experimental. Quanto à

concentração de palmitato de retinila, foi encontrado apenas traços no

plasma.

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59

5.1.8- Correlações entre ingestão de ~-caroteno, concentrações

hepáticas de retinol, ~-caroteno e palmitato de retinHa, e concentrações

plasmáticas de retinol e ~-caroteno nos animais do Grupo Controle

(GC)

o resultado do teste de Spearman (não paramétrico) aplicado para as

variáveis ingestão de ~-caroteno, concentrações hepáticas de retinol, ~­

caroteno e palmitato de retinila, e concentrações plasmáticas de retinol e ~­

caroteno do Grupo Controle, está representado na Figura 12.

As correlações significativas (p<O,05) encontradas foram: entre a

ingestão de ~-caroteno e a concentração plasmática de ~-caroteno (R =0,74; p<O,021), concentração hepática e plasmática de retinol (R = 0,84;

p<O,004), concentrações hepáticas de retinol e palmitato de retinila (R =

0,69; p<O,038), e concentração plasmática de retinol e palmitato de retinila

hepático (R =0,70; p<O,036).

5.1.9- Correlações entre ingestão de ~-caroteno, concentrações

hepáticas de retinol, ~-caroteno e palmitato de retinHa, e concentrações

plasmáticas de retinol e ~-caroteno nos animais do Grupo Experimental

O resultado do teste de Spearman (não paramétrico) aplicado para as

variáveis ingestão de ~-caroteno, concentrações hepáticas de retinol, ~­

caroteno e palmitato de retinila, e concentrações plasmáticas de retinol e ~­

caroteno do Grupo Experimental, está representado na Figura 13.

As correlações significativas (p<0,05) encontradas foram: entre as

concentrações hepáticas de palmitato de retinila e ~-caroteno (R = 0,91;

p<O,002), e concentrações de ~-caroteno hepático e plasmático (R = -0,81;

p<O,014).

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5.1.10 • Avaliação da concentração do ~·caroteno sintético

utilizado na preparação das rações no experimento em ratos

O resultado obtido na avaliação da concentração do ~-caroteno

sintético (1 % numa mistura em pó - Roche) utilizado na preparação das

rações dos animais estudados, mostrou que este se encontra numa

concentração de 50%.

5.1.11 - Concentração de ~-caroteno nas rações no experimento

em ratos

A concentração do ~-caroteno nas rações, está representada na

Tabela 11. Os valores obtidos nestas análises, indicam uma baixa

concentração do ~-caroteno nas rações, quando comparado com a

quantidade que foi adicionada à ração (4ER/g de ração = 24/1g de ~­

caroteno/g de ração).

Tabela 11: Concentração do l3-caroteno nas rações no experimento em

ratos.

Amostras Ração Controle Ração Experimental/19/9 /19/9

1 12,42 14,65

2 10,20 12,36

3 15,96 12,55

4 15,78 12,13

Média 13,59 ± 2,78 12,92 ± 1,16

63

5.2 - EXPERIMENTO EM COELHOS

5.2.1 - Determinação de p-caroteno em couve-manteiga

A concentração de p-caroteno na couve-manteiga está representada

na Tabela 12, onde se observa os resultados de 3 determinações e a sua

média. Os resultados obtidos estão de acordo com os já descritos na

literatura (RODRIGUEZ-AMAYA, 1996).

Tabela 12: Concentração de p-caroteno na couve-manteiga utilizada neste

experimento.

Amostras (g)

1) 0,430

2) 0,415

3) 0,407

Média

Concentração de p-caroteno

(~g/g)

35,20

36,56

39,23

37,00 ± 2,05

5.2.2 - Determinação de fibra alimentar (solúveis e insolúveis) em

couve-manteiga

Os resultados das determinações de fibra alimentar na couve­

manteiga estão representadas na Tabela 13. Foram realizadas 2

determinações: uma utilizando couve-manteiga branqueada e uma sem

branqueamento, sendo todas as amostras liofilizadas. A couve-manteiga

sem branqueamento (média de 4 determinações) e com branqueamento

(média de 3 determinações) obtiveram resultados semelhantes.

Como no Experimento 11 foi fornecido couve-manteiga in natura para

os coelhos, o resultado da análise de fibra alimentar da couve-manteiga sem

branquamento (média de 4 determinações) foi utilizado para o cálculo da

quantidade de pectina e celulose a ser adicionada na ração do Grupo GV.

64

Tabela 13: Resultados das determinações de fibra alimentar na couve­

manteiga utilizada neste experimento.,

INSOLÚVELAMOSTRAS UMIDADE SOLUVEL TOTALLIOFILIZADAS (%) (g/100g) (g/100g) (g/100g)Couve-manteiga (com

branqueamento)* -------------- 0,60 2,12 2,72

Couve-manteiga (sem

branqueamento) ** 6,31 0,67 2,06 2,73

Total = sol. + insol.

* Média de três determinações.** Média de quatro determinações.

5.2.3 - Ganho de peso nos grupos de coelhos

A curva do ganho de peso nos grupos GV, GCP e GCN, durante o

período experimental, está representada Figura 14. O ganho de peso total

desses animais após 30 dias de experimento está apresentado na Tabela

14.

o Teste de Tukey (ANOVA) para o ganho de peso total nos animais

estudados, mostrou diferença significativa (p<O,05) entre o grupo GV com os

grupos GCP e GCN, com menor ganho de peso nos grupos GCP e GCN.

Esses dois grupos não diferiram estatisticamente entre si (p>O,05) (Tabela

14).

5.2.4- Ingestão de ração nos grupos de coelhos

Em relação à ingestão de ração pelos animais, a curva desta durante

o período experimental está representada na Figura 15. A ingestão total de

ração pelos grupos GV, GCP e GCN está apresentada na Tabela 14.

O Teste de Tukey (ANOVA) para a ingestão total de ração dos

animais estudados, não mostrou nenhuma diferença significativa (p>0,05)

entre os grupos GV, GCP e GCN (Tabela 14).

65

5.2.5- Ingestão de p-caroteno nos grupos de coelhos

A ingestão total de p-caroteno nos grupos GV e GCP, após 30 dias de

experimento está ilustrada na Figura 16.

O teste de Tukey (ANOVA) não mostrou nenhuma diferença

significativa (p>O,OS) na ingestão total de p-caroteno entre os grupos GV

(171,21 mg ± 14,33) e GCP (177,2Smg ± 20,9).

A curva da ingestão de couve-manteiga, fonte natural do ~-caroteno

do Grupo GV está representada na Figura 17.

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5.2.6 - Concentrações hepáticas de retinol, ~-carotenoe palmitato

de retinila (flg/g) no experimento com coelhos

As concentrações hepáticas de retinol, ~-caroteno e palmitato

de retinila nos grupos de GV, GCP e GCN, estão representadas na Figura

18a e 18b. Os valores do Grupo Basal foram: retinol = 7,01 fl9/9 ± 2,88; ~­

caroteno =0,02fl9/9 ± 0,01; palmitato de retinila =3,78fl9/9 ± 1,38.

Dois cromatogramas das concentrações de retinol e palmitato de

retinila, um do Grupo GV e outro do Grupo GCP, estão visualizados nas

Figuras 19 e 20.

O teste de Tukey (ANOVA) para o retinol, mostrou diferença

significativa (p<0,05) entre todos os grupos de coelhos (GCP: 53,231..1g/g ±

15,54; GV: 38,45I..1g/g ± 11,38; GCN: 1,95I..1g/g ± 0,49), com o Grupo GCP

apresentando maior concentração de retinol e o Grupo GCN com menor

concentração de retinol hepático (abaixo do valor encontrado no grupo

Basal: 7,01I-1g/g ± 2,88). Em relação ao ~-caroteno hepático, o teste não

mostrou diferença significativa (p>0,05) entre os grupos GV (0,65I..1g/g ±

0,03) e GCP (0,68I..1g/g ± 0,22); não foi detectado ~-caroteno no Grupo GCN.

Quanto ao palmitato de retinHa, os grupos GV (71,92I..1g/g ± 29,39) e GCP

(69,66I..1g/g ± 14,09) não diferiram estatisticamente (p>0,05) entre si, mas

diferiram (p<0,05) do Grupo GCN (0,71I..1g/g ± 0,37) que apresentou menor

concentração hepática de palmitato de retinHa (abaixo do valor do Grupo

Basal: 3,78I-1g/g ± 1,38).

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Figura 20: Cromatograma (HPLC) das concentrações hepáticas de retinol (R) e palmitato de retinila

(PR) do Grupo GCP

76

5.2.7- Concentrações hepáticas totais de retinol, f3-caroteno e

palmitato de retinila no experimento com coelhos

As concentrações hepáticas totais de retinol, f3-caroteno e palmitato

de retinila nos grupos GV, GCP e GCN, estão apresentadas na Tabela 15, e

foram calculadas através da fórmula:

Concentração hepática (~g/g) x peso total do fígado

o teste de Tukey (ANOVA) para o retinol hepático total mostrou

diferença significativa (p<O,05) entre o Grupo GCN e os grupos GVe GCP,

com menor concentração hepática no Grupo GCN. Para o f3-caroteno

hepático total, o teste mostrou diferença significativa (p<O,05) entre os

grupos GV e GCP, com menor concentração hepática de f3-caroteno no

Grupo GCP; no Grupo GCN não foi detectado f3-caroteno hepático. E o

palmitato de retinila hepático total, apresentou diferença significativa

(p<O,05) entre todos os grupos, com maior concentração hepática no Grupo

GVe menor concentração hepática no Grupo GCN.

As médias dos pesos dos fígados do Grupo GV (54,93g ± 13,68),

GCP (39,83g ± 7,43) e GCN (54,41g ± 22,23) não apresentaram diferença

significativa (p>O,05) quando o teste de Tukey foi aplicado.

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5.2.8- índice da quantidade total de retinol, ~-caroteno e palmitato

de retinila no fígado em relação ao peso corporal dos animais nos

grupos de coelhos

Este índice foi calculado através da seguinte fórmula:

Concentração total do composto no fígado (mg)

1=Peso corporal final (g)

o índice da quantidade total de retinol, ~-caroteno e palmitato de

retinila no fígado em relação ao peso corporal dos animais estudados (GV,

GCP e GCN), está apresentado na Tabela 16.

O teste de Tukey (ANOVA) apresentou as mesmas diferenças

significativas (p<O,05) entre os grupos estudados, tanto para retinol, ~­

caroteno e palmitato de retinila, os grupos GV e GCP diferiram

significativamente (p<O,05) do Grupo GCN, que apresentou menor índice de

retinol, f3-caroteno e palmitato de retinila.

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5.2.9 - Concentrações plasmáticas de retinol, ~-caroteno e

palmitato de retinila (IlmoI/L) no experimento com coelhos

As concentrações plasmáticas de retinol, ~-caroteno e

palmitato de retinila entre os grupos de animais, estão representadas na

Figura 21, sendo que o palmitato de retinila apresentou somente traços. Os

valores do Grupo Basal foram: retinol =2,18 Ilmol/L ± 0,73; ~-caroteno =O,131lmol/L ± 0,14.

O teste de Tukey (ANOVA) para o retinol, mostrou diferença

significativa (p<0,05) entre o Grupo GV (1 ,881Jmo1/L ± 0,54) com os grupos

GCP (1,331Jmo1lL ± 0,40) e GCN (0,36IJmoI/L ± 0,27), com menor

concentração de retinol nos grupos GCP e GCN, que também diferiram

estatisticamente entre si, com o Grupo GCN apresentando menor (p<0,05)

concentração de retinol plasmático. Os valores de retinol plasmático dos

grupos estudados ficaram abaixo do valor do Grupo Basal (2,18IJmoIlL ±

0,73). Quanto ao ~-caroteno plasmático, o teste estatístico também mostrou

diferenças significativas (p<O,OS) entre os grupos GV (0,33IJmoI/L ± 0,11),

GCP (O,20lJmoIlL ± 0,10) e GCN (O,011Jmo1lL ± 0,00), com o Grupo GV

apresentando maior concentração de ~-caroteno plasmático.

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82

5.2.10- Correlações entre ingestão de ~-caroteno, concentrações

hepáticas de retinol, ~-caroteno e palmitato de retinila, e concentrações

plasmáticas de retinol e ~-caroteno nos animais do Grupo GV

O resultado do teste de Spearman (não paramétrica) aplicado para as

variáveis ingestão de ~-caroteno, concentrações hepáticas de retinol, ~­

caroteno e palmitato de retinHa, e concentrações plasmáticas de retinol e ~­

caroteno do Grupo GV, está representado na Figura 22.

As correlações significativas (p<O,05) encontradas foram: entre a

concentração hepática de retinol e a concentração plasmática de ~-caroteno

(R =-0,71; p<O,05), e entre a concentração hepática de palmitato de retinila

e concentração plasmática de retinol (R =0,71; p<O,05).

5.2.11- Correlações entre ingestão de ~-caroteno, concentrações

hepáticas de retinol, ~-caroteno e palmitato de retinila, e concentrações

plasmáticas de retinol e ~-caroteno nos animais do Grupo GCP

O teste de Spearman (não paramétrica) aplicado para as variáveis

ingestão de ~-caroteno, concentrações hepáticas de retinol, ~-caroteno e

palmitato de retinila, e concentrações plasmáticas de retinol e ~-caroteno do

Grupo Gep, não apresentou nenhuma correlação significativa (p>0,05).

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5.2.12 - Avaliação da concentração do ~-caroteno sintético

utilizado na preparação da ração do Grupo GCP

O resultado obtido da avaliação da concentração do ~-caroteno

sintético (30% em óleo - Roche) utilizado na preparação da ração dos

animais do Grupo GCP, mostrou que este se encontra numa concentração

de 96%.

5.2.13 - Concentração de ~-caroteno nas rações no experimento

em coelhos

A concentração do ~-caroteno nas rações dos grupos GV, GCP e

GCN, está representada na Tabela 17. Nas rações do grupos GV e GCN, o

~-caroteno não foi detectado.

Tabela 17: Concentração do ~-caroteno nas rações no experimento em

coelhos.

Amostras Ração GV Ração GCP Ração GCNmg/g mg/g mg/g

1 ------ 0,12

2 ------ 0,13

Média 0,13 ± 0,002

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86

Ao longo dos anos, tem sido aceito que o conteúdo de nutrientes nos

alimentos não é o bastante para determinar o seu valor nutricional. Vários

fatores internos ou externos aos alimentos podem influenciar na

disponibilidade de nutrientes para o organismo. Mesmo que um nutriente

esteja presente em altas concentrações, sua utilização pode não ser

inteiramente satisfatória se existirem fatores que interferem com a sua

disponibilidade. Assim, estudos sobre a biodisponibilidade de nutrientes são

importantes para se obter informações seguras sobre o valor nutricional dos

alimentos (TEE et ai, 1996).

Neste trabalho avaliou-se a biodisponibilidade do 13-caroteno sintético

e de fonte natural (couve-manteiga) em rações com ou sem pectina cítrica,

em 2 ensaios biológicos diferentes (ratos e coelhos). A utilização de dois

tipos de animais experimentais se deve ao fato de um dos estudos

necessitar de um animal, no caso o coelho, que consumisse naturalmente o

vegetal folhoso in natura. TEE et ai (1996), relatam o problema de

aceitabilidade de vegetais pelos ratos, principalmente, variedades tropicais

de folhas verdes que possuem odores inaceitáveis para esses animais. Já o

outro estudo, não pode ser realizado em coelhos, devido não se adaptarem

a uma dieta isenta de fibra alimentar (informação obtida através de um

estudo piloto antecedente aos experimentos), utilizando-se assim, os ratos.

A escolha da couve-manteiga para o estudo, foi devido o seu teor de

13-caroteno, sua aceitabilidade pelos animais, e por ser de fácil acesso

durante as estações do ano.

Estudos sobre a biodisponibilidade do 13-caroteno em vegetais

folhosos realizados na Indonésia (De PEE et ai, 1995; De PEE et ai, 1998a;

De PEE et ai, 1998b), mostraram que o 13-caroteno provindo desta fonte foi

pouco absorvido pelo organismo. Esta baixa biodisponibilidade do 13­

caroteno, pode ser devida a diversos fatores, entre eles a presença de fibras

solúveis nos alimentos, principalmente a pectina cítrica.

Uma possível explicação para este efeito da pectina cítrica sobre o

metabolismo dos carotenóides, seria a sua interferência na formação das

micelas, interagindo com os sais e ácidos biliares, resultando no aumento da

87

excreção fecal de ácidos biliares, e assim, diminuindo a absorção de

gorduras e substâncias solúveis em gorduras tais como os carotenóides e

colesterol.

6.1 - Utilização de animais neste estudo

Neste trabalho, os dois tipos de animais (ratos e coelhos) utilizados

nos diferentes experimentos, corresponderam ao intuito desejado, que foi

estudar a biodisponibilidade do p-caroteno.

Sabendo-se que tanto o rato como o coelho convertem eficientemente

o p-caroteno em vitamina A, foram analisadas neste estudo não só a

concentração plasmática e hepática de p-caroteno, mas também, as

concentrações de retinol e ésteres de retinol em nível basal e após o período

experimental. Desta forma, pode-se saber quanto p-caroteno foi absorvido e

armazenado em forma de vitamina A pelos animais estudados em cada

experimento.

Há muita controvérsia na utilização de modelos animais em estudos

de carotenóides.

Estudos relatam que "ferrets", "mongolian gerbil" e bovinos são os

melhores modelos para estudo da absorção e metabolismo de carotenóides,

devido a fisiologia destes animais ser parecida a fisiologia humana. Mas,

estes animais também apresentam inconvenientes para este tipo de estudo.

Os "ferrets" possuem metabolismo· semelhante ao do homem, por

absorverem uma substancial porção de p-caroteno intacto e o acumularem

nos tecidos (RIBAYA-MERCADO et ai, 1992). Porém, a concentração

plasmática de ésteres de retinila nesta espécie representa 93% do total da

vitamina A sanguínea, enquanto no homem estes ésteres representam

menos que 3% (WANG, 1994; LEE et ai, 1999). Além disso, são animais

caros e de dificultoso manejo (LEE et ai, 1999).

O "mongolian gerbil" (Meriones unguiculatus) , absorve grandes

quantidades de p-caroteno intacto e tem um perfil de lipoproteínas

semelhantes aos humanos (POLLACK et ai, 1994). Contudo, o que se

88

conhece sobre as necessidades de vitamina A deste animal é limitado (LEE

et ai, 1999).

Os bovinos pré-ruminantes, são monogástricos e como os humanos,

absorvem ~-caroteno intacto (HOPPE et ai, 1996). Estes animais, assim

como os "ferrets", possuem diferenças no metabolismo de ésteres de retinila

(alto nível plasmático de ésteres retinila) quando comparado aos humanos

(Van VLlET, 1996b). Além disso, são animais caros, difícil de mantê-los num

ambiente de laboratório e de obter uma amostra estatística significante.

Outros estudos sobre biodisponibilidade de carotenóides utilizaram

ratos (TEE et ai, 1996), galináceos (ERDMAN Jr et ai, 1986) e coelhos (YAP

et ai, 1997), que como dito anteriormente, são animais que convertem

eficientemente ~-caroteno em vitamina A, e que só armazenam ~-caroteno

em tecidos, quando consomem uma ração com alta quantidade de ~­

caroteno, diferenciando assim, do metabolismo humano, o qual, absorve

uma quantidade de ~-caroteno intacto (Van VLlET, 1996b). Mas, estes

animais apresentam certas vantagens tais como, são baratos, disponíveis e

de fácil manejo no laboratório.

Enfim, todos os modelos animais para estudo dos carotenóides,

apresentam suas vantagens e desvantagens.

Assim, o ideal seria adequar o estudo de acordo com as condições

que são dispostas, escolhendo o animal que mais se encaixe com os

objetivos desejados e que responda as expectativas do pesquisador.

No presente estudo, .a utilização de ratos e coelhos alcançou o

objetivo proposto, que foi o estudo da biodisponibilidade do ~-caroteno.

6.2 • Experimento em ratos

O objetivo deste ensaio biológico foi verificar em ratos, o efeito da

pectina cítrica na absorção do ~-caroteno sintético.

Para tal estudo, foram utilizados dois grupos de animais, um

recebendo uma ração contendo ~-caroteno e 7% de pectina cítrica (Grupo

Experimental) e outro recebendo uma ração contendo ~-caroteno e isenta de

fibra alimentar (Grupo Controle) durante 30 dias.

89

A análise dos dados referentes ao ganho de peso dos animais

durante o período experimental, mostrou que o grupo que recebeu ração

contendo 7% de pectina cítrica (Grupo Experimental), apresentou um menor

ganho de peso (p<O,05) quando comparado ao grupo isento de fibra

alimentar (Grupo Controle).

O menor ganho de peso dos animais do Grupo Experimental pode

estar associado a ingestão de fibra alimentar.

LAFONT et ai (1985) mostraram ganho de peso menor em ratos

recebendo ração com pectina, quando comparados a ratos recebendo ração

isenta de pectina e ração com celulose ou farelo de trigo.

Esses dados condizem com o estudo de VAHOUNY et ai (1987) que

também verificaram um menor ganho de peso em ratos que receberam

rações contendo pectina, goma guar ou alfafa, quando comparados a ratos

que receberam ração isenta de fibra alimentar.

Segundo WISKER et ai (1994), a alta ingestão de fibras às vezes é

considerada como auxiliar na perda de peso, aumentando a excreção de

energia fecal devido ao aumento das perdas de fibras, proteínas e gorduras.

A quantidade de ração ingerida pelos animais, durante o período

experimental deste ensaio biológico não diferiu (p>O,05) entre o grupo que

recebeu pectina cítrica (Grupo Experimental) e o grupo que não recebeu

pectina cítrica (Grupo Controle). Outros estudos também obtiveram

resultados semelhantes.

TSAI et ai (1976), estudando em ratos a influência de certas fibras

alimentares (7% nas rações) nas concentrações de colesterol no soro e

tecidos, verificaram nenhuma diferença na ingestão de rações pelos animais.

ERDMAN Jr et ai (1986), estudando em galináceos, os efeitos de

várias fontes de fibra alimentar na absorção do ~-caroteno, não obtiveram

diferença na ingestão de rações entre o Grupo Controle (isento de fibras) e o

grupo que recebeu uma ração contendo 7% de pectina cítrica.

TINKER et ai (1994), não observaram em ratos (induzidos à

hiperlipidemia), diferença na ingestão de rações contendo 3% de pectina ou

isenta de pectina.

90

Assim como a ingestão de rações não foi diferente entre os grupos

estudados, a ingestão de p-caroteno também não diferiu (p>O,05) entre os

mesmos. Isto significa que os grupos de animais (Controle e Experimental)

consumiram a mesma quantidade de p-caroteno.

No presente estudo, verificou-se que os níveis hepáticos de retinol, p­

caroteno e palmitato de retini/a, foram diferentes estatisticamente (p<O,05)

entre os grupos estudados. Uma síntese dos resultados é mostrada na

tabela a seguir, onde x, y e z representam respectivamente a concentração

em I-lg/g de fígado, concentração total (I-lg/peso de fígado) e índice em

relação ao peso corporal (I-lg/g de peso corporal) e, 1 representa o Grupo

Experimental e 2 o Grupo Controle:

Retinol hepático Palmitato de retinila p-caroteno

Hepático hepático

X1 < X2 X1 < X2 X1 < X2

Y1 < Y2 Y1 < Y2 Y1 < Y2

Z1 < Z2 Z1 < Z2 Z1 < Z2

Como pode-se observar o grupo isento de pectina cítrica (Grupo

Controle) apresentou maior teor hepático de vitamina A e p-caroteno em

todas as análises realizadas, quando comparado ao grupo que recebeu

pectina cítrica (Grupo Experimental). Estes dados, indicam que

possivelmente a presença de pectina na ração dos animais do Grupo

Experimental tenha influenciado na absorção do p-caroteno.

ERDMAN et ai (1986), comparando em galináceos a absorção do p­

caroteno sintético em rações contendo 7%' de várias fontes de fibra

alimentar, mostraram que o grupo que recebeu pectina cítrica teve uma

grande redução (52%) na porcentagem de p-caroteno consumido e estocado

no fígado como vitamina A quando comparado ao grupo que não recebeu

fibra alimentar.

91

Encontrou-se alta concentração de palmitato de retinila e baixa

concentração de ~-caroteno no fígado dos ratos estudados, sugerindo a

ocorrência de conversão do ~-caroteno em ésteres de retinila.

RIBAYA-MERCADO et ai (1989), também encontraram uma grande

quantidade de ésteres de retinila no fígado de ratos que receberam ração

com ~-caroteno, indicando a conversão do ~-caroteno em vitamina A.

O principal éster de retinila encontrado no fígado de ratos após

suplementação com ~-caroteno foi o palmitato de retinila (BIANCHINI­

SANTAMARIA et ai, 1993). Este dado é semelhante ao encontrado no

presente estudo.

Ratos convertem aproximadamente todo o ~-caroteno absorvido em

ésteres de retinila que fica armazenado no fígado. Somente pequena

quantidade de ~-caroteno é incorporada nos tecidos destes animais

(PARKER, 1996).

A correlação positiva (R = 0,69; p<0,038) encontrada no Grupo

Controle para as variáveis concentração de retinol e palmitato de retinila

hepáticos, sugere que o ~-caroteno convertido a retinol foi estocado como

palmitato de retinila no fígado.

No Grupo Experimental, também foi encontrada uma correlação

positiva (R = 0,91; p<0,002) muito forte entre as variáveis palmitato de

retinila e ~-caroteno hepáticos, indicando mais uma vez a principal forma de

armazenamento da vitamina A. Assim, demonstra-se a importância da

determinação deste composto no fígado.

Van VLlET et ai (1995), sugerem que a resposta de ésteres de retinila

pode ser um bom indicador da conversão intestinal do ~-caroteno.

O peso do fígado dos animais do Grupo Experimental foi menor

(p<0,05) em relação ao Grupo Controle. Este resultado, também pode estar

associado com a presença de pectina cítrica na ração consumida por estes

animais.

O estudo de TSAI et ai (1976), também mostrou menor (p<0,05) peso

de fígado em animais que receberam rações com adição de pectina

comparados a animais que receberam rações isentas de pectina. Assim, o

92

resultado encontrado no presente estudo, encontra-se em concordância com

o descrito nesse trabalho.

Com relação a concentração plasmática de j3-caroteno, retinol e

palmitato de retinila, somente o j3-caroteno diferiu (p<O,OS) entre os grupos

estudados, com menor (p<O,OS) concentração no Grupo Experimental em

comparação ao Grupo Controle. Esta menor concentração de j3-caroteno no

plasma dos animais do Grupo Experimental provavelmente é decorrente da

interferência da pectina cítrica na absorção do j3-caroteno.

ROCK & SWENDSEID (1992), avaliaram em humanos o efeito 12g de

pectina cítrica em uma refeição contendo 2Smg de j3-caroteno sintético sobre

a resposta plasmática do j3-caroteno, que foi reduzida pela metade na

presença de pectina.

RIEDL et ai (1999), também observaram em mulheres uma

diminuição de 33%-43% na concentração plasmática do j3-caroteno, quando

foi oferecida uma dieta enriquecida com pectina (O, 1Sg/Kg de peso corpóreo­

1) e contendo uma mistura de antioxidantes (/3-caroteno, licopeno, luteína,

cantaxantina e a-tocoferol).

OLSON (1984), relata que a concentração e composição dos

carotenóides no plasma, geralmente reflete a quantidade de carotenóides

ingeridos na dieta, embora alguns fatores possam interfir neste sentido,

entre eles, a eficiência da absorção.

A correlação encontrada no Grupo Controle entre as variáveis

ingestão de j3-caroteno e concentração plasmática de j3-caroteno (R =0,74;

p<0,021), concorda com o descrito acima.

Como neste trabalho, os grupos estudados receberam a mesma

quantidade de j3-caroteno nas rações e não houve diferença (p>O,OS) no

consumo das mesmas, a diferença (p<O.OS) na concentração de j3-caroteno

plasmático entre os grupos Experimental e Controle, se deve provavelmente

a presença de pectina na ração do Grupo Experimental interagindo na

absorção do j3-caroteno.

93

No Grupo Experimental, encontrou-se uma correlação negativa (R = ­

0,81; p<0,014) entre as variáveis concentração de p-caroteno hepático e

plasmático, indicando o armazenamento do p-caroteno no fígado dos ratos.

Os carotenóides plasmáticos, em seu estado estável, representam

aproximadamente 1% do conteúdo total de carotenóides no organismo,

enquanto uma concentração maior pode ser encontrada no fígado

(CASTENMILLER & WEST, 1998).

A concentração plasmática de palmitato de retinila foi desprezível nos

grupos estudados, apresentando somente traços.

O retinol plasmático não apresentou diferença entre os grupos

Experimental e Controle. Isto possivelmente se deve ao controle

homeostático da concentração de retinol no plasma (De PEE et ai, 1995).

ERDMAN Jr. et ai (1986), no estudo em galináceos citado

anteriormente, não obtiveram diferença estatística na concentração

plasmática de retino!.

RIBAYA-MERCADO et ai (1989) administrando diferentes doses de p­

caroteno (O, 4 e 20 mg/Kg de peso corporal) durante 2 semanas em rações

para ratos e "ferrets", não obtiveram nenhum efeito significante nos valores

de retinol no soro destes animais.

A concentração de retinol circulante parece não estar relacionada com

a ingestão dietética, exceto quando o estoque hepático de retinol está

gravemente depletado. Alta ingestão de retinol ou ésteres de retinol na

alimentação de indivíduos adultos tem somente um pequeno efeito sobre o

retinol plasmático durante o imediato período pós-prandial, e normalmente

não tem demonstrado efeitos fisiológicos a menos que a dose seja muito alta

(THURNHAM & NORTHROP-CLEWES, 1999).

As correlações encontradas no Grupo Controle entre as variáveis

concentração hepática e plasmática de retinol (R = 0,84; p<0,004) e,

concentração plasmática de retinol e palmité;lto de retinila hepático (R = 0,70;

p<0,036), indicaram o armazenamento da vitamina A no fígado.

Os dados aqui observados indicam que a biodisponibilidade do p­

caroteno sintético, na presença de pectina cítrica, foi reduzida em relação ao

94

Grupo Controle, o que demonstra que a pectina cítrica a 7% na ração,

exerceu um efeito inibitório sobre a absorção do ~-caroteno.

Várias fontes de fibra alimentar podem diminuir a velocidade do

processo de digestão e absorção de macronutrientes, incluindo gorduras. As

propriedades físicas das fibras, tais como tamanho da partícula, viscosidade,

capacidade de ligacão com a água, formação de gel, e capacidade de

ligação com os ácidos biliares, podem ser responsáveis pelos efeitos das

fibras na absorção de carotenóides (EL- GORAB et ai, 1975; HOLLANDER &

RUBLE Jr., 1978).

Judd & Truswell apud ERDMAN (1986), relatam que a 'alta

viscosidade no trato gastrointestinal provocada pela fibras solúveis, atuam

sobre os sais biliares, sequestrando-os e, consequentemente ocorre o

rompimento da formação das micelas, limitando assim, a absorção dos

constituintes lipossolúveis da dieta.

ARAÚJO & ARAÚJO (1998), em uma revisão sobre fibra alimentar,

relatam a capacidade de interação das fibras solúveis com os sais biliares.

Estudos mostram que o mecanismo de ação das fibras solúveis,

principalmente a pectina, sobre a absorção do ~-caroteno, envolva

alterações na formação de micelas e no contato das mesmas com a

membrana das células da mucosa intestinal (PARKER, 1996; ROCK, 1997).

As micelas são partículas formadas por um agregado de moléculas. O

complexo micelar bile-gordura forma-se pela combinação dos sais biliares,

monoglicerídeos e fosfolipídeos e apresenta um papel importante no

processo de absorção dos Iipídeos (SANTOS, 1998). Elas são responsáveis

pela remoção dos produtos finais da digestão da gordura vizinhos aos

glóbulos gordurosos em processo de digestão, evitando alterações no

processo digestivo. Além disso, as micelas atuam como meio de transporte

para os ácidos graxos, monoglicerídeos, colesterol e outros lipídios, até a

borda em escova da célúlas epiteliais, local onde ocorre a absorção. Ao

liberar essas substâncias na borda em escova, os sais biliares são

novamente liberados no quimo para serem reutilizados nesse processo de

transporte (GUYTON, 1989).

95

A absorção dos carotenóides solúveis em gorduras, provavelmente

tenha uma necessidade absoluta dos sais biliares das micelas (EL- GORAB

et ai, 1975; HOLLANDER & RUBLE Jr., 1978).

Os sais biliares são necessários para solubilização micelar do p­

caroteno, que virtualmente não possui solubilização em água. E também,

são necessários para a interação com a membrana celular ou como

transportador (EL-GORAB et ai, 1975; HOLLANDER & RUBLE Jr., 1978).

Fibras viscosas ou gelatinosas e ligninas parecem ter grande

capacidade para sequestrar ácidos biliares (importantes na formação de

micelas). Essa ligação parece tratar-se de um fenômeno de adsorção, sendo

influenciada pelo pH e osmolaridade, composição dos ácidos biliares (certos

tipos de fibras parecem preferir ligações com ácidos biliares não­

conjugados), e as formas físicas e químicas das fibras. Em geral, a ligação

de ácidos biliares é grande em pH baixo (VAHOUNY & CASSIDY, 1987).

Esta propriedade destes tipos de fibras pode, assim interferir na formação

das micelas, que são necessárias para absorção do p-caroteno, reduzindo a

sua biodisponibilidade.

Outro aspecto relacionado às propriedades físicas das fibras solúveis

é que elas aumentam a viscosidade e o volume do conteúdo intestinal,

podendo assim, diminuir o processo de difusão de micelas para a superfície

absortiva dos enterócitos (RIEDL et ai, 1999).

Contrações intestinais criam turbulência, permitindo a digestão do

centro do lúmen ser transportada para o epitétio. Os nutrientes, depois são

difundidos através da camada delgada de água estacionária, adjacente a

mucosa intestinal. Um aumento na viscosidade do conteúdo luminal,

obviamente prejudica o processo de mistura peristáltica. Polissacarídeos

dissolvidos também podem inibir a difusão de nutrientes através da camada

de água estacionária (aumentando a sua resistência ou espessura),

apresentando um obstáculo físico à pequenos movimentos. Dificuldades na

mistura do conteúdo luminal devido ao aumento da viscosidade pelos

polissacarídeos dissolvidos possivelmente retarda o transporte de enzimas

96

digestivas aos substratos (VAHOUNY & CASSIDY, 1987; EASTWOOD &

MORRIS, 1992).

Fatores duodenais, como a presença de fibras solúveis, impedindo o

movimento das micelas ou o seu contato com a mucosa, provavelmente

prejudica a absorção de carotenóides (PARKER, 1996).

Pelos resultados observados, pode-se verificar que os dados obtidos

neste trabalho estão em concordância com outros autores, sendo que, a

pectina adicionada na ração determinou o menor ganho de peso dos

animais, o menor peso do fígado e a menor absorção de ~-caroteno. Desta

modo, a pectina cítrica interferiu na biodisponibilidade do ~-caroteno.

6.3 - Experimento em coelhos

O objetivo deste ensaio biológico foi comparar em coelhos, a

biodisponibilidade do ~-caroteno sintético e de fonte natural (couve­

manteiga) na presença de pectina cítrica.

Para tal estudo, foram utilizados três grupos de animais, um

recebendo ~-caroteno de fonte natural (couve-manteiga) (GV), outro

recebendo f3-caroteno sintético (GCP) e um outro que não recebeu (3­

caroteno (GCN), todos recebendo pectina cítrica em suas respectivas

rações.

A análise dos dados referentes ao ganho de peso dos animais

durante o período experimental, mostrou que o grupo que recebeu ~­

caroteno de fonte natural (GV) apresentou um maior ganho de peso

(p<O,OS), quando comparado ao grupo que recebeu ração contendo ~­

caroteno sintético (GCP) e ao grupo que recebeu ração isenta de ~-caroteno

(GCN). Há duas possíveis explicações para este resultado:

• Os animais do Grupo GV consumiram além da ração, uma outra

fonte de alimento, a couve-manteiga, o que não ocorreu com os animais dos

grupos GCP e GCN que só receberam ração. Este consumo de couve­

manteiga, poderia ter acrescentado mais nutrientes na alimentação dos

animais do Grupo GV, resultando em maior (p<O,OS) ganho de peso, quando

comparado aos grupos GCP e GCN.

BfBLJOTECAFaculdade de Ciências Farmacêuticas

Universidada de São Paulo

97

YUYAMA et ai (1991), obtiveram um ganho de peso adequado, em

ratos alimentados com rações contendo manga e pupunha.

YUYAMA et ai (1996), em um outro estudo, obtiveram maior ganho de

peso em ratos alimentados com uma ração experimental mais a adição de

pupunha, quando comparados aos outros grupos estudados.

• A outra possível explicação, para o maior ganho de peso (p<O,OS)

dos animais do Grupo GV, seria que a pectina cítrica poderia ter interferido

na absorção do p-caroteno sintético do Grupo GCP, resultando em menor

ganho de peso (p<O,OS) destes animais, semelhante aos animais do Grupo

GCN (isento de p-caroteno). Como todos os grupos experimentais tiveram a

mesma ingestão de ração (p>O,OS), o menor ganho de peso (p<O,OS) do

Grupo GCN, pode ser explicado pela ausência de p-caroteno na ração.

Estando o Grupo GCP com o mesmo ganho de peso (p>O,OS) do Grupo

GCN, é provável que tenha ocorrido menor absorção de p-caroteno no

Grupo GCP.

Sabe-se que uma das funções da vitamina A é promover o

crescimento, o p-caroteno sendo o precursor desta, também desempenha a

mesma função. Então, a falta ou redução de p-caroteno na alimentação,

provavelmente, leva a diminuição da taxa de ganho de peso corporal.

YUYAMA et ai (1991), encontraram em ratos recebendo uma ração

isenta de vitamina A, perda de apetite, diminuição da taxa de ganho de peso,

sinais de danos oculares e paralisia nas pernas dianteiras e traseiras dos

animais.

No Experimento I deste estudo, foi verificado em ratos, que a pectina

cítrica pode interferir na absorção do p-caroteno sintético, resultando em

menor ganho de peso dos animais.

Neste experimento, ao contrário do Experimento I (em ratos), onde

um grupo de animais recebeu ração com p-caroteno e pectina cítrica e outro

grupo recebeu ração com p-caroteno e isenta de pectina cítrica, os animais

do Grupo GV (p-caroteno de fonte natural) e do Grupo GCP (p-caroteno de

fonte sintética), receberam a mesma quantidade de pectina cítrica (12%).

Como a ingestão de p-caroteno nestes animais foi a mesma (p>O,OS), era

98

esperado que o ganho de peso entre estes dois grupos não apresentasse

diferença estatística, o que não ocorreu. Possivelmente, tenha ocorrido uma

menor absorção de p-caroteno sintético no Grupo GCP, influenciando no

ganho de peso destes animais.

As concentrações hepáticas de retinol, p-caroteno e palmitato de

retinHa, foram diferentes estatisticamente (p<O,OS) entre os grupos

estudados. Uma síntese dos resultados é mostrada na tabela abaixo, onde

x, y e z representam respectivamente a concentração em !J-g/g de fígado,

concentração total (mg/peso de fígado) índice em relação ao peso corporal

(!J-g/g de peso corporal), e, 1 representa o Grupo GV, 2 o Grupo GCP e 3 o

Grupo GCN:

Retinol hepático Palmitato de retinHa p-caroteno

hepático hepático

X3 < X1< X2 X1= X2> X3 X1= X2> X3

Y1= Y2 >Y3 Y1>Y2>Y3 Y1>Y2>Y3

Z1 = Z2 > Z3 Z1 = Z2> Z3 Z1 = Z2> Z3

Como pode-se observar, a concentração hepática em !J-g/g de retinol,

p-caroteno e palmitato de retinila, foi menor (p<O,OS) no Grupo GCN em

relação aos demais grupos estudados. Este resultado, foi confirmado na

concentração hepática total destes animais. Tendo em vista o fato de que

este grupo de coelhos não recebeu p-caroteno, já esperava-se estes

resultados.

Em relação aos demais grupos, observa-se que a concentração

hepática em !J-g/g no Grupo GCP, quanto a retinol, foi maior (p<O,OS) que a

do Grupo GV, e quanto a palmitato de retinila e p-caroteno, não houve

nenhuma diferença (p>O,OS) entre os dois grupos. Estes resultados, quando

em concentração hepática total, apresentaram diferenças nas concentrações

de p-caroteno e palmitato de retinila, mas, não na concentração de retino!.

99

Assim, a concentração hepática total de retinol no Grupo GCP, não diferiu

(p>O,05) do Grupo GV, e as concentrações de ~-caroteno e palmitato de

retinila do Grupo GV, foram maiores (p<O,05) que as do Grupo GCP.

YAP et ai (1997), estudando a distribuição de carotenos de fonte

vegetal (palma) em coelhos, mostraram que a maioria dos a e ~-carotenos

estão estocados no fígado como palmitato de retinila, e que somente uma

pequena quantidade de carotenos não metabalizados são encontrados nos

tecidos. Isto se deve a eficiência desses animais na conversão de ~­

caroteno a retinol, o qual é armazenado no fígado principalmente sob a

forma de palmitato de retinila.

Neste estudo, a distribuição hepática de ~-caroteno, retinol e palmitato

de retinila, concordam com o descrito por YAP et ai (1997) (comentado

acima), ocorrendo uma maior concentração de palmitato de retinila, seguida

da concentração de retinol, e com uma baixa concentração de ~-caroteno.

Comparando as reservas hepáticas do grupo que recebeu ~-caroteno

sintético (GCP) e do grupo que recebeu ~-caroteno de fonte natural (GV),

nota-se que absorção de ~-caroteno (maior parte convertida e encontrada no

fígado sob forma de retinol e palmitato de retinila) foi maior no Grupo GV.

Este resultado, indica que provavelmente a biodisponibilidade de ~-caroteno,

foi melhor no grupo de animais que recebeu ~-caroteno de fonte natural

(GV).

YUYAMA et ai (1996), estudando em ratos o efeito da suplementação

da ração com pupunha (fonte de vitamina A), verificaram que os animais que

receberam ração contendo pupunha, apresentaram uma alta concentração

hepática de vitamina A em relação aos animais que receberam ração

controle.

Concordante com este último, está o trabalho realizado por TEE et ai

(1996), realizado em ratos, onde se comparou a biodisponibilidade de ~­

caroteno de fontes naturais (cenoura e repolho) adicionadas nas rações com

a biodisponibilidade de ~-caroteno sintético, resultando em maior

100

concentração hepática de ~-caroteno e vitamina A no grupo de ratos que

recebeu ~-caroteno de fonte natural.

Por outro lado, ZHOU et ai (1996), comparando em "ferrets" a

biodisponibilidade de ~-caroteno sintético com o ~-caroteno contido em

cenoura (suco de cenoura aquecido ou sem aquecer, cromoplasto de

cenoura isolado aquecido ou sem aquecer), encontraram maior

concentração hepática de ~-caroteno e vitamina A, no grupo de animais que

recebeu ~-caroteno de fonte sintética.

Uma provável explicação para a menor biodisponibilidade do ~­

caroteno de fonte sintética em comparação ao ~-caroteno de fonte natural

neste estudo, seria que a pectina cítrica, poderia ter interagido mais

facilmente com o ~-caroteno de fonte sintética, por este se encontrar na

forma livre (o ~-caroteno da couve-manteiga, encontra-se no interior do

c1oroplasto), interferindo assim, na sua absorção.

Como comentado anteriormente, os animais do Grupo GCP e GV,

não apresentaram diferenças na ingestão de ~-caroteno (p>O,OS), além

disso, também não diferiram (p>O,OS) em relação ao peso do fígado, o que

reforça a possível interferência da pectina cítrica na absorção do ~-caroteno

sintético no Grupo GCP.

O índice hepático de retinol, ~-caroteno e palmitato de retinila, em

relação ao peso corporal do animal, mostrou que o ganho de peso do animal

é proporcional a concentração de vitamina A armazenada no fígado. Assim,

os animais do Grupo GV que apresentaram maior ganho de peso, também

apresentaram maior concentração hepática de vitamina A.

Em relação a concentração plasmática de retinol, ~-caroteno e

palmitato de retinila nos grupos de animais estudados neste experimento,

observou-se que o palmitato de retinila apresentou somente traços, sendo

desprezível. E que os grupos experimentais, apresentaram valores de retinol

abaixo do valor do Grupo Basal, podendo talvez, ser um efeito da pectina

cítrica.

BIBLIOTECAFaculdade de Ciências Farmacêutica~

Universidade de São Paulo

101

Quanto às concentrações plasmáticas de retinol e p-caroteno entre os

grupos experimentais, o grupo que recebeu p-caroteno de fonte natural (GV)

diferiu estatisticamente (p<0,05) do grupo que recebeu p-caroteno sintético

(GCP) e do grupo isento de p-caroteno (GCN), com maior concentração

plasmática de retinol e p-caroteno. Os grupos GCP e GCN, também

diferiram estatisticamente (p<0,05) entre si, com menor concentração

plasmática de retinol e p-caroteno no Grupo GCN.

Estes dados, mostram maior concentração plasmática (p<0,05) de

retinol e p-caroteno nos animais que receberam p-caroteno de fonte natural,

quando comparados aos animais que receberam p-caroteno de fonte

sintética.

Vários estudos, realizados em humanos, comparando a

biodisponibilidade do p-caroteno sintético e de fonte natural, mostraram

resultados contrários ao obtido neste estudo.

MICOZZI et ai (1992), encontraram em indivíduos normais que

receberam uma alimentação balanceada contendo p-caroteno de fonte

sintética (10 ou 30 mg), maior concentração plasmática de p-caroteno,

quando comparados a indivíduos que receberam uma alimentação

balanceada contendo p-caroteno de fonte natural (brócolis, cenoura e suco

de tomate), num período experimental de 6 semanas.

De PEE et ai (1995), compararam a ingestão de uma porção diária de

vegetais de folhas verde-escuro, com uma quantidade igual de p-caroteno

sintético (contido em uma bolacha enriquecida), em mulheres com baixa

concentração de hemoglobina «130g/l) e que estavam amamentando

crianças com idade entre 3-17 meses. O resultado, avaliado no plasma e

leite materno, mostrou melhor biodisponibilidade do p-caroteno sintético

presente na bolacha enriquecida.

Concordando com estes trabalhos, BULUX et ai (1996), estudando

em crianças da Guatemala, a biodisponibilidade do p-caroteno em forma de

cápsula e do p-caroteno de fonte natural (cenoura), obtiveram melhor

102

resposta plasmática no grupo de crianças que receberam p-caroteno em

cápsulas.

Por outro lado, TAKYI (1999), estudando a biodisponibilidade de p­

caroteno em crianças pré-escolares de Ghana, num período de 12 semanas,

onde receberam refeições com vegetais folhosos (Manihot sp e Ceiba sp)

contendo gordura, isenta de gordura e com gordura e adição de

antiparasitário, e uma refeição contendo p-caroteno sintético, encontrou que,

embora o grupo de crianças que recebeu refeição contendo p-caroteno

sintético apresentou um aumento de retinol plasmático de 44,1%, os

vegetais folhosos também aumentaram significativamente a concentração de

retinol plasmático nas crianças estudadas, porém em graus diferentes. O

grupo de crianças que recebeu a refeição que continha vegetais folhosos +

gordura + antiparasitário, obteve um aumento de retinol plasmático de

38,8%, ficando próximo do valor alcançado pelo grupo de crianças que

recebeu refeição contendo p-caroteno sintético. O autor comenta que o

trabalho demostrou a capacidade de alguns vegetais folhosos em aumentar

o retinol para níveis aceitáveis.

Outros estudos, sobre a biodisponibilidade de p-caroteno de fonte

natural em humanos, envolve a matriz onde se encontra o p-caroteno.

De PEE et ai (1998a), compararam em crianças, (idade 7-11 anos) a

biodisponibilidade do p-caroteno de vegetal de folha verde-escuro (contido

no interior do c1oroplasto) com o p-caroteno de frutas amarelas (contido no

interior do cromoplasto), mostraram que o p-caroteno de vegetais de folhas

verde-escuro foi menos biodisponiníveis em relação ao p-caroteno de frutas

amarelas, provavelmente devido a matriz na qual este se encontra.

CASTENMILLER et ai (1999), estudando o efeito da matriz do p­

caroteno do espinafre, durante 4 semanas, concluíram que quando este

vegetal foi processado (homogeneizado), a concentração plasmática do p­

caroteno deste grupo aumentou três vezes mais, em relação ao grupo que

recebeu espinafre não processado.

103

Por outro lado, Van Het HOLF et ai (1999a) não encontraram

nenhuma diferença na concentração plasmática de p-caroteno de indivíduos

que receberam espinafre processado, com indivíduos que receberam

espinafre sem processamento.

Faulsk apud scon & RODRIGUEZ-AMAYA (2000), em um estudo

onde comparou a absorção de p-caroteno e luteína em indivíduos recebendo

uma refeição contendo folhas de espinafre inteiras ou folhas de espinafre

picadas, com 10,7mg de p-caroteno e 15,5mg de luteína, verificou que a

absorção de ambos foi entre 20 - 30%. Na concentração plasmática, não

houve um aumento discernível na concentração dos carotenóides, na fração

quilomícron plasmática ocorreu um aumento marcante, entre 4 e 8 horas

após o consumo da refeição. Este tipo de experimento, indica que a falta de

resposta plasmática, não pode ser interpretada como uma falta de absorção,

contradizendo assim, a idéia que existe pouca ou nenhuma absorção do p­

caroteno de vegetais folhosos (SCOTT & RODRIGUEZ-AMAYA, 2000).

O emprego da análise plasmática da concentração de p-caroteno em

ambos grupos de investigação (fonte natural e sintética de p-caroteno),

aponta para grandes variações individuais na resposta. Especialmente em

humanos, que consomem dietas bem variadas, a resposta na concentração

de carotenóides no plasma pode ser grandemente modificada por vários

componentes da dieta, produzindo difíceis interpretações e conclusões (TEE

et ai, 1996).

Estudos em humanos, mostram resultados nem sempre completos, já

que o material biológico mais disponível e menos invasivo é o sangue. Para

se verificar o metabolismo e o quanto o p-caroteno contribui com a

concentração de vitamina A, é necessário trabalhar com outros tecidos.

Neste trabalho, além de plasma foi estudado o tecido de depósito de

vitamina A, o fígado, que assim, resultou em informações mais completas

sobre a biodisponibilidade do p-caroteno.

O fígado, representa o maior estoque de vitamina A, contendo 90% do

estoque corpóreo total, pequenas quantidades estão presentes em outros

órgãos, tais como os rins, pulmões, cólon e pele. E o palmitato de retinila é a

104

forma predominante de esterificação da vitamina A encontrada no fígado

(Van Den BERGER, 1996).

Duas correlações foram encontradas no Grupo GV, uma correlação

positiva entre as variáveis concentração hepática de palmitato de retinila e

concentração plasmática de retinol (R = 0,71; p<O,05), e uma correlação

negativa entre as variáveis concentração hepática de retinol e concentração

plasmática de p-caroteno (R =-0,71; p<O,05), indicam o armazenamento de

vitamina A no fígado.

Os dados obtidos neste ensaio biológico, realizado em coelhos,

demonstraram que a biodisponibilidade do p-caroteno de fonte natural

(couve-manteiga) foi maior (p<O,05) que a biodisponibilidade do J3-caroteno

sintético, resultando num maior ganho de peso destes animais, na presença

de pectina cítrica adicionada a 12% nas rações dos animais.

Este estudo, difere de outros trabalhos por verificar a

biodisponibilidade do J3-caroteno sintético e de fonte natural na presença de

pectina cítrica, que mostrou interferir mais com absorção do J3-caroteno

sintético, que com a absorção do J3-caroteno de fonte natural.

Outro aspecto que difere este estudo dos trabalhos citados, foi a

determinação de palmitato de retinila hepático, considerada fundamental, por

ser a forma principal de armazenamento de vitamina A no fígado. Neste

estudo, pode-se verificar que as concentrações deste composto no fígado

dos animais que receberam J3-caroteno de fonte sintética foi menor (p<O,05)

que no fígados dos animais que receberam J3-caroteno de fonte natural. A

dosagem deste composto no fígado dos animais estudados, foi essencial

para o estudo da biodisponibilidade do J3-caroteno.

Diante dos resultados deste estudo, onde demostrou-se que o J3­

caroteno sintético pode interagir com a pectina cítrica, resultando em menor

absorção do mesmo, supondo uma situação, na qual indivíduos, após uma

refeição rica em fibras, tome uma cápsula de J3-caroteno sintético, será que

sua absorção sofrerá os efeitos da fibra alimentar? Mais estudos, neste

sentido são necessários.

105

Estudos epidemiológicos, indicam que alta ingestão de vegetais, está

associada com a redução do risco de doenças crônicas não transmissíveis,

tais como câncer de epitélio, doenças cardiovasculares e doenças dos olhos

relacionadas à idade (Van Het HOF et ai, 1999b). Os vegetais, são fontes

entre outros de carotenóides, tocotrienóis e tocoferóis, além disso, possuem

potencial antimutagênico e hipocolesterolémico, capacidade para retardar a

peroxidação e para eliminar os radicais livres (TAKYI, 1999).

Neste trabalho, verificou-se que o ~-caroteno da couve-manteiga

obteve boa biodisponibilidade, sendo utilizado como fonte de vitamina A para

os coelhos.

Assim, o consumo de vegetais (fontes de vários nutrientes) contribui

com efeitos benéficos para organismo.

S3Qsnl:>NO:>-l

107

Com base nos resultados obtidos pode-se concluir que:

~ Experimento I (ratos):

A pectina cítrica adicionada a 7% na ração oferecida para ratos,

provavelmente interferiu na absorção do p-caroteno sintético, prejudicando

a sua biodisponibilidade.

~ Experimento 11 (coelhos):

A biodisponibilidade do p-caroteno de fonte natural (couve-manteiga)

em coelhos, foi maior que a biodisponibilidade do p-caroteno sintético, na

presença de pectina cítrica.

A pectina cítrica, provavelmente interferiu mais na absorção do p­

caroteno de fonte sintética.

A biodisponibilidade do p-caroteno de fonte natural precisa ser mais

estudada.

S"::>I:lVlI90I1SISS"I::>N3113:1311-8 IV

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123

9· Resumo

Este trabalho, buscou comparar a biodisponibilidade do p-caroteno sintético

e de fonte natural (couve-manteiga), e verificar os efeitos da fibra alimentar

(pectina cítrica) sobre a biodisponibilidade do p-caroteno, dentro de 2

experimentos diferentes (ratos e coelhos). No Experimento I (ratos), um

grupo de animais recebeu ração com p-caroteno e isenta de pectina cítrica

(GC) e outro recebeu ração com p-caroteno e adição de pectina cítrica (GE).

No Experimento 11 (coelhos), um grupo de animais recebeu ração com p­

caroteno sintético (GCP), outro recebeu p-caroteno de fonte natural (couve­

manteiga) (GV) e ainda outro não recebeu de p-caroteno (GCN); todos os

grupos de coelhos receberam pectina cítrica. Após 30 dias de experimento,

os animais foram sacrificados para determinações plasmáticas e hepáticas

de vitamina A e p-caroteno, por HPLC. Dos resultados obtidos no estudo em

ratos pode-se verificar que o grupo de animais que recebeu pectina (GE),

apresentou menor (p<O,05) concentração hepática total de vitamina A

(/lg/peso de fígado) (retinol: GC =47,61 ± 24,24 e GE = 23,44 ± 9,68 e

palmitato de retinila: GC =935,30 ± 428,19 e GE =282,34 ± 98,86) e p­

caroteno (/lg/peso de fígado) (GC = 9,64 ± 3,07 e GE = 1,01 ± 0,66) que o

grupo que não recebeu pectina (GC).· E dos resultados obtidos no

experimento em coelhos, verificou-se que o grupo que recebeu p-caroteno

de fonte natural (GV), obteve concentração hepática total de vitamina A

(mg/peso de fígado) (retinol: GV =2,30 ± 0,67, GCP =2,07 ± 0,57 e GCN =0,11 ± 0,08; palmitato de retinila: GV = 4,42 ± 2,17, GCP = 2,77 ± 0,73 e

GCN =0,04 ± 0,02) e p-caroteno (mg/peso de fígado) (GV =0,04 ± 0,01,

GCP =0,03 ± 0,01 e GCN =não detectado), maior (p<0,05) que o grupo que

recebeu p-caroteno sintético (GCP). Conclui-se que no Experimento I (ratos),

a pectina cítrica provavelmente interferiu na absorção do p-caroteno, e no

Experimento 11 (coelhos), que o p-caroteno de fonte natural (GV), foi melhor

absorvido comparando-se com o p-caroteno sintético, na presença de

pectina cítrica.

124

10 - Summary

This work, looked for to compare the bioavailability of synthetic p-carotene and of

natural source (kale), and to verify the effects of the alimentary fiber (citrus pectin)

on the bioavailability of p-carotene, inside of 2 different experiments (rats and

rabbits). In the Experiment I (rats), a group of animais received diet with p-carotene

and it exempts of citrus pectin (CG) and another received diet with p-carotene and

addition of citrus pectin (EG). In the Experiment II (rabbits), a group of animais

received diet with synthetic p-carotene (PCG), another received p-carotene of

natural source (kale) (VG) and still another didn't receive from p-carotene (NCG);

ali the groups of rabbits received citrus pectin. After 30 days of experiment, the

animais were sacrificed for determinations plasmatics and vitamin liverworts A and

b-carotene, by HPLC. Of the results obtained in the study in rats it can be verified

that the group of animais that received pectin (EG), it presented smaller (p <0,05)

concentration hepatic vitamin total A (Iiver mg/weight) (retinol: CG = 47.61 ± 24.24

and EG =23.44 ± 9.68 and retinyl palmitate: CG =935.30 ± 428.19 and EG =282.34 ± 98.86) and p-carotene (Iiver mg/weight) (CG =9.64 ± 3.07 and EG =1.01

± 0.66) that the group that didn't receive pectin (CG). And of the results obtained in

the experiment in rabbits, it was verified that the group that received p-carotene of

natural source (VG), obtained concentration hepatic vitamin total A (liver

mg/weight) (retinol: VG =2.30 ± 0.67, PCG =2.07 ± 0.57 and NCG =0.11 ± 0.08;

retinyl palmitate: VG =4.42 ± 2.17, PCG =2.77± 0.73 and NCG =0.04 ± 0.02)

and p-carotene (liver mg/weight) (VG =0.04 ± 0.01, PCG =0.03 ± 0.01 and NCG =not detected), larger (p <0,05) that the group that received synthetic p-carotene

(PCG). Ended that in the Experiment I (rats), the citrus pectin probably interfered in

the absorption of the p-carotene, and in the Experiment 11 (rabbits), the p-carotene

of natural source (VG), it was absorbed being compared with the synthetic p­

carotene better, in the presence of citrus pectin.

SOl~W3Oa"ZI1"3~I01N3WI~3dX3

oaSI"naIAlaNIsoa"awo~S"138"1

IOX3NV

126

EXPERIMENTO I (RATOS)

Tabela 1: Valores individuais do ganho de peso (g) nos grupos de ratos,

após 30 dias de experimento.

Tabela 2: Valores individuais da ingestão de rações (g) nos grupos de ratos,

após 30 dias de experimento.

Tabela 3: Valores individuais da ingestão de ~-caroteno (mg) nos grupos de

ratos, após 30 dias de experimento.

Tabela 4: Valores individuais das concentrações hepáticas de retinol (J.lg/g)

no experimento com ratos.

Tabela 5: Valores individuais das concentrações hepáticas de ~-caroteno

(J.lg/g) no experimento com ratos.

Tabela 6: Valores individuais das concentrações hepáticas de palmitato de

retinila (J.lg/g) no experimento com ratos.

Tabela 7: Valores individuais das concentrações plasmáticas de retinol

(J.lmoI/L) no experimento com ratos.

Tabela 8: Valores individuais das concentrações plasmáticas de ~-caroteno

(J.lmoIlL) no experimento com ratos.

Tabela 9: Valores individuais das concentrações plasmáticas de palmitato

de retinia (J.lmol/L) no experimento com ratos.

Tabela 10: Valores individuais das concentrações de retinol total hepático

(J.lg) no experimento com ratos.

Tabela 11: Valores individuais das concentrações de ~-caroteno total

hepático (J.lg) no experimento com ratos.

Tabela 12: Valores individuais das concentrações de palmitato de retinila

total hepático (J.lg) no experimento com ratos.

Tabela 13: Valores individuais do índice da quantidade total de retinol no

fígado em relação ao peso corporal dos animais (J.lg/g) nos

grupos de ratos.

Tabela 14: Valores individuais do índice quantidade total de ~-caroteno

hepático em relação ao corporal dos animais (J.lg/g) nos grupos

127

de ratos.

Tabela 15: Valores individuais do índice da quantidade total de palmitato de

retinila no fígado em relação ao peso corporal dos animais (I-lg/g)

nos grupos de ratos.

128

Tabela 1 - Valores individuais do ganho de peso (g) nos grupos de ratos, após

30 dias de experimento:

Ratos Controle (GC)

1 194,0

2 198,0

3 170,0

4 165,0

5 172,0

6 186,0

7 161,0

8 179,0

9 178,0

Média 178,1 ± 12,64

Experimental (GE)

164,0

150,0

153,0

143,0

153,0

129,0

156,0

187,0

154,4 ± 16,71

129

Tabela 2 - Valores individuais da ingestão de rações (g) nos grupos de ratos,

após 30 dias de experimento:

Ratos Controle (GC)

1 458,0

2 461,0

3 391,0

4 374,0

5 402,0

6 448,0

7 439,5

8 432,5

9 417,0

Média 424,8 ± 30,68

Experimental (GE)

407,0

398,0

423,0

403,0

400,0

440,5

386,5

506,5

420,6 ± 38,50

130

Tabela 3 - Valores individuais da ingestão de p-caroteno (mg) nos grupos de

ratos, após 30 dias de experimento:

Ratos Controle (GC)

1 6,22

2 6,26

3 5,31

4 5,08

5 5,46

6 6,09

7 5,97

8 5,88

9 5,67

Média 5,77 ± 0,42

Experimental (GE)

5,25

5,14

5,46

5,07

5,17

5,69

4,99

6,54

5,41 ±O,51

131

Tabela 4 - Valores individuais das concentrações hepáticas de retinol (~g/g) no

experimento com ratos:

Ratos Controle Experimental Basal

(GC) (GE) (GB)1 7,41 0,78 0,40

2 3,20 3,42 0,52

3 3,84 3,33 0,37

4 2,09 1,19 0,30

5 7,41 2,44 0,28

6 9,16 3,68 0,44

7 4,87 3,63 0,59

8 2,36 2,98 0,32

9 3,80 ------ 0,21

10 0,13

Média 4,90 ± 2,51 2,68 ± 1,12 0,36 ± 0,14

132

Tabela 5 - Valores individuais das concentrações hepáticas de p-caroteno (Ilg/g)

no experimento com ratos:

Ratos Controle Experimental Basal

(GC) (GE) (GB)

1 0,93 0,11 0,17

2 1,19 0,15 0,02

3 0,76 0,12 0,07

4 0,58 0,04 0,05

5 0,83 0,09 0,11

6 0,72 0,05 0,08

7 1,37 0,09 0,24

8 1,32 0,23 0,07

9 1,15 ------ 0,25

10 0,32

Média 0,98 ± 0,28 0,11 ± 0,06 0,14±0,10

133

Tabela 6 - Valores individuais das concentrações hepáticas de palmitato de

retinila (~g/g) no experimento com ratos:

Ratos Controle Experimental Basal

(GC) (GE) (GB)1 157,02 28,92 38,88

2 49,84 37,68 29,22

3 137,46 40,88 23,88

4 76,80 22,12 24,78

5 165,86 36,66 15,72

6 76,92 19,63 16,86

7 81,12 23,48 32,41

8 54,84 42,37 37,32

9 70,14 ------ 14,11

10 6,54

Média 96,67 ± 44,40 31,46 ± 9,02 23,67 ± 10,52

134

Tabela 7 - Valores individuais das concentrações plasmáticas de retinol (JlmoIlL)

no experimento com ratos:

Ratos Controle Experimental Basal

(GC) (GE) (GB)

1 1,70 1,34 0,71

2 0,99 1,03 0,57

3 1,42 1,28 0,79

4 1,20 0,87 0,55

5 1,48 1,03 0,58

6 1,81 1,16 1,45

7 2,0 1,40 0,54

8 0,95 0,69 0,59

9 1,27 ------ 0,44

10 0,40

Média 1,42 ± 0,36 1,10 ± 0,24 0,66 ± 0,30

135

Tabela 8 - Valores individuais das concentrações plasmáticas de p-caroteno

(IlmoIlL) no experimento com ratos:

Ratos Controle Experimental Basal

(GC) (GE) (GB)1 0,26 0,06 0,17

2 0,33 0,02 0,15

3 0,08 0,07 0,17

4 0,11 0,13 0,09

5 0,09 0,11 0,04

6 0,19 0,09 0,06

7 0,42 0,05 0,08

8 0,10 0,04 0,03

9 0,19 ------ 0,06

10 0,01

Média 0,20±O,12 0,07 ± 0,04 0,09 ± 0,06

136

Tabela 9 - Valores individuais das concentrações plasmáticas de palmitato de

retinia (~mol/L) no experimento com ratos:

Ratos Controle Experimental Basal

(GC) (GE) (GB)1 NO NO 0,008

2 NO NO 0,005

3 0,005 NO 0,010

4 0,005 NO 0,005

5 0,100 NO NO

6 0,070 NO NO

7 NO NO 0,007

8 NO NO 0,008

9 0,008 ------ 0,006

10 NO

Média 0,04 ± 0,04 0,00 0,01 ± 0,01

ND: não foi detectado

137

Tabela 10 - Valores individuais das concentrações de retinol total hepático (~g)

no experimento com ratos:

Ratos Controle (GC)

1 78,25

2 33,15

3 37,02

4 18,81

5 65,58

6 87,57

7 47,97

8 23,91

9 36,25

Média 47,61± 24,24

Experimental (GE)

7,88

29,58

29,64

9,98

19,67

30,51

28,9

31,38

23,44 ± 9,68

138

Tabela 11- Valores individuais das concentrações de p-caroteno total hepático

(Ilg) no experimento com ratos:

Ratos Controle (GC)

1 9,82

2 12,33

3 7,32

4 5,22

5 7,34

6 6,88

7 13,49

8 13,37

9 10,97

Média 9,47 ± 3,07

Experimental (GE)

1,11

1,3

1,07

0,33

0,72

0,41

0,72

2,42

1,01 ± 0,66

139

Tabela 12 - Valores individuais das concentrações de palmitato de retinila total

hepático (~g) no experimento com ratos:

Ratos Controle (GC)

1 1658,13

2 516,34

3 1325,11

4 691,2

5 1467,86

6 735,35

7 799,03

8 555,53

9 669,13

Média 935,30 ± 428,19

Experimental (GE)

292,09

325,93

363,83

185,59

295,48

162,73

186,9

446,16

282,34 ± 98,86

140

Tabela 13 - Valores individuais do índice da quantidade total de retinol no fígado

em relação ao peso corporal dos animais (~g/g) nos grupos de ratos:

Ratos Controle íGC}

1 0,30

2 0,12

3 0,16

4 0,09

5 0,28

6 0,35

7 0,21

8 0,10

9 0,15

Média 0,19 ± 0,09

Experimental (GE}

0,03

0,14

0,13

0,05

0,09

0,15

0,14

0,13

0,11 ± 0,04

141

Tabela 14 - Valores individuais do índice da quantidade total de f3-caroteno no

fígado em relação ao peso corporal dos animais (l1g/g) nos grupos de ratos:

Ratos Controle (GC)

1 0,04

2 0,04

3 0,03

4 0,02

5 0,03

6 0,03

7 0,06

8 0,05

9 0,05

Média 0,04 ± 0,01

Experimental (GE)

0,005

0,006

0,005

0,002

0,003

0,002

0,003

0,010

0,004 ± 0,003

142

Tabela 15 - Valores individuais do índice da quantidade total de palmitato de

retinila no fígado em relação ao peso corporal dos animais (J..lg/g) nos grupos de

ratos:

Ratos Controle (GC)

1 6,43

2 1,92

3 5,69

4 3,17

5 6,22

6 2,96

7 3,52

8 2,32

9 2,83

Média 3,89 ± 1,74

Experimental (GE)

1,26

1,57

1,66

0,92

1,38

0,80

0,89

1,80

1,28 ± 0,38

SOH130~11\13oaV'ZI1V'3~11OlN311\11~3dX3

oaSIV'naIAlaNIsoaV'aII\IO~SV'138V'1

IIOX3N'V

144

EXPERIMENTO 11 (COELHOS)

Tabela 1: Valores individuais do ganho de peso (g) nos grupos de coelhos,

após 30 dias de experimento.

Tabela 2: Valores individuais da ingestão de rações (g) nos grupos de

coelhos, e ingestão de couve-manteiga (g) pelo grupo GV, após

30 dias de experimento.

Tabela 3: Valores individuais da ingestão de J3-caroteno (mg) nos grupos de

coelhos, após 30 dias de experimento.

Tabela 4: Valores individuais das concentrações hepáticas de retinol (Ilg/g)

no experimento com coelhos.

Tabela 5: Valores individuais das concentrações hepáticas de J3-caroteno

(Ilg/g) nos experimento com coelhos.

Tabela 6: Valores individuais das concentrações hepáticas de palmitato de

retinila (Ilg/g) no experimento com coelhos.

Tabela 7: Valores individuais das concentrações plasmáticas de retinol

(Ilmol/L) no experimento com coelhos.

Tabela 8: Valores individuais das concentrações plasmáticas de J3-caroteno

(Ilmol/L) no experimento com coelhos.

Tabela 9: Valores individuais das concentrações de retinol total hepático

(mg) no experimento com coelhos.

Tabela 10: Valores individuais das concentrações de J3-caroteno total

hepático (mg) no experimento com coelhos.

Tabela 11: Valores individuais das concentrações de palmitato de retinila

total hepático (mg) no experimento com coelhos.

Tabela 12: Valores individuais do índice da quantidade total de retinol no

fígado em relação ao peso corporal dos animais (Ilg/g) nos

grupos de ratos

Tabela 13: Valores individuais do índice da quanitdade total de J3-caroteno

no fígado em relação ao peso corporal dos animais (Ilg/g) nos

grupos de coelhos.

145

Tabela 14: Valores individuais do índice da quantidade de palmitato de

retinila no fígado em relação ao peso corporal dos animais (Ilg/g)

nos grupos de coelhos.

146

Tabela 1 - Valores individuais do ganho de peso (g) nos grupos de coelhos,

após 30 dias de experimento:

Coelhos GV GCP GCN

1 690,0 432,0 412,0

2 824,0 573,0 624,0

3 824,0 527,0 344,0

4 795,0 538,0 415,0

5 600,0 653,0 521,0

6 726,0 446,0 383,0

7 535,0 560,0 447,0

8 709,0 581,0 445,0

9 ------ 423,0 468,0

Média 712,87 ± 104,56 525,89 ± 77,87 451 ± 82,20

147

Tabela 2 - Valores individuais da ingestão de rações (g) nos grupos de coelhos, e

ingestão de couve-manteiga (g) pelo grupo GV, após 30 dias de experimento:

Coelhos GV GCP GCN

(couve-manteiga + ração)

1 4794,0 1521,5 1107,7 993

2 4732,0 1576,8 1492,7 1326,5

3 4745,0 1570,1 1347,6 863,4

4 4756,0 1503,5 1379,1 997,5

5 4772,0 1279,6 1544,2 1141,2

6 4682,0 1308,9 1141,9 876,7

7 3671,0 913,5 1419,6 1022,3

8 4830,0 1214,3 1374,7 1022,1

9 ------ ----- 1167,4 1147,67

Média 4622,7 ± 387,03 1361,0 ± 229,10 1330,5 ± 156,60 1043,4 ± 144,20

BIBlrOTECAFaculdade de Ciências Farmacêutle'il

Universidade d. São Paulo

148

Tabela 3 . Valores individuais da ingestão de ~-caroteno (mg) nos grupos de

coelhos, após 30 dias de experimento:

Coelhos GV GCP

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Média

177,50

175,26

175,74

176,15

176,74

173,41

135,96

178,89

171,21 ± 14,33

147,69

199,03

179,68

183,88

205,89

152,25

189,28

183,29

155,65

177,40 ± 20,9

149

Tabela 4 - Valores individuais das concentrações hepáticas de retinol (Ilg/g) no

experimento com coelhos:

Coelhos GV GCP GCN Basal

1 29,93 70,38 2,03 4,12

2 57,86 76,85 2,98 8,98

3 36,49 50,84 1,67 3,37

4 54,15 62,36 1,73 3,49

5 30,26 54,19 2,15 5,30

6 34,59 43,14 2,01 10,26

7 27,41 35,47 2,17 8,67

8 36,88 29,51 1,23 9,74

9 ------ 56,32 1,57 9,17

Média 38,45 ± 11,38 53,23 ± 15,54 1,95 ± 0,49 7,01 ± 2,88

150

Tabela 5 - Valores individuais das concentrações hepáticas de p-caroteno (Ilg/g)

no experimento com coelhos:

Coelhos GV GCP GCN Basal

1 0,40 0,80 NO 0,01

2 0,32 0,43 NO 0,02

3 0,27 0,99 NO 0,03

4 1,01 0,67 NO 0,04

5 0,56 0,91 NO 0,01

6 1,24 0,36 NO 0,01

7 0,77 0,51 NO 0,04

8 0,65 0,64 NO 0,05

9 ------ 0,82 NO 0,10

Média 0,65 ± 0,03 0,68 ± 0,22 0,02 ± 0,01

ND: não detectado

151

Tabela 6 - Valores individuais das concentrações hepáticas de palmitato de

retinila (f.lg/g) no experimento com coelhos:

Coelhos GV GCP GCN Basal

1 44,36 64,30 0,13 3,41

2 121,08 58,14 0,15 2,30

3 90,86 83,89 0,87 2,20

4 50,57 49,43 0,61 2,84

5 104,79 75,68 0,91 4,64

6 60,32 66,09 0,84 3,28

7 55,03 57,33 1,04 5,67

8 48,38 79,87 0,65 6,01

9 ------ 92,24 1,23 3,71

Média 71,92 ± 29,39 69,66 ± 14,09 0,71 ± 0,37 3,78 ± 1,38

152

Tabela 7 - Valores individuais das concentrações plasmáticas de retinol (~moI/L)

no experimento com coelhos:

Coelhos GV GCP GCN Basal

1 2,07 1,12 0,745 1,86

2 2,39 1,03 0,630 1,67

3 2,32 1,56 0,67 3,88

4 1,16 2,02 0,46 2,15

5 2,59 1,36 0,12 1,63

6 1,73 0,83 0,17 1,49

7 1,61 1,51 0,12 2,33

8 1,21 1,67 0,10 2,61

9 ------ 0,86 0,21 2,05

Média 1,88 ± 0,54 1,33 ± 0,40 0,36 ± 0,27 2,18 ± 0,73

153

Tabela 8 - Valores individuais das concentrações plasmáticas de p-caroteno

(~mol/L) no experimento com coelhos:

Coelhos GV GCP GCN Basal

1 0,39 0,17 0,01 0,08

2 0,27 0,12 0,02 0,03

3 0,43 0,13 NO 0,03

4 0,17 0,11 NO 0,06

5 0,34 0,31 0,01 0,11

6 0,41 0,35 NO 0,14

7 0,46 0,28 NO 0,47

8 0,19 0,25 NO 0,19

9 ------ 0,10 0,01 0,03

Média 0,33 ± 0,11 0,20 ± 0,10 0,01 ± 0,00 0,13 ± 0.14

ND: não foi detectado

154

Tabela 9 - Valores individuais das concentrações de retinol total hepático

(mg) no experimento com coelhos:

Coelhos GV GCP GCN

1 2,20 2,41 0,08

2 3,49 2,40 0,32

3 2,4 1,69 0,07

4 2,82 2,75 0,06

5 2,21 2,89 0,12

6 1,63 1,52 0,10

7 1,29 1,64 0,14

8 2,37 1,30 0,05

9 ------ 2,05 0,08

Média 2,30 ± 0,67 2,07 ± 0,57 0,11 ± 0,08

155

Tabela 10 - Valores individuais das concentrações de p-caroteno total hepático

(mg) no experimento com coelhos:

Coelhos GV GCP GCN

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Média

0,02

0,10

0,02

0,05

0,04

0,06

0,04

0,04

0,04 ± 0,01

0,03

0,01

0,03

0,03

0,05

0,01

0,02

0,03

0,03

0,03 ± 0,01

156

Tabela 11 - Valores individuais das concentrações de palmitato de retinila total

hepático (mg) no experimento com coelhos:

Coelhos GV GCP GCN

1 3,26 2,20 0,00

2 7,29 1,82 0,02

3 5,97 2,79 0,04

4 2,63 2,18 0,02

5 7,64 4,04 0,05

6 2,84 2,33 0,04

7 2,59 2,65 0,07

8 3,11 3,53 0,03

9 ------ 3,36 0,06

Média 4,42 ± 2,17 2,77 ± 0,73 0,04 ± 0,02

157

Tabela 12 - Valores individuais do índice da quantidade total de retinol no

fígado em relação ao peso corporal dos animais (Ilg/g) nos grupos de coelhos:

Coelhos GV GCP GCN

1 1,11 1,66 0,05

1,73 1,74 0,16

3 1,18 1,15 0,05

4 1,38 1,74 0,04

5 1,19 1,62 0,07

6 0,80 1,19 0,07

7 0,80 0,92 0,09

8 1,26 0,71 0,03

9 ------ 1,52 0,05

Média 1,18 ± 0,30 1,36 ± 0,38 0,07 ± 0,04

158

Tabela 13 - Valores individuais do índice da quantidade total de ~-caroteno no

fígado em relação ao peso corporal dos animais (~g/g) nos grupos de coelhos:

Coelhos GV GCP GCN

1 0,01 0,02 0,00

2 0,01 0,01 0,00

3 0,01 0,02 0,00

4 0,02 0,02 0,00

5 0,02 0,03 0,00

6 0,03 0,01 0,00

7 0,02 0,01 0,00

8 0,02 0,01 0,00

9 ------ 0,02 0,00

Média 0,02 ± 0,01 0,02 ± 0,01 0,00

159

Tabela 14 - Valores individuais do índice da quantidade de palmitato de retinila

no fígado em relação ao peso corporal dos animais (Ilg/g) nos grupos de coelhos:

Coelhos GV GCP GCN

1 1,64 1,52 0,00

2 3,62 1,31 0,00

3 2,95 1,89 0,03

4 1,28 1,38 0,01

5 4,13 2,27 0,03

6 1,39 1,82 0,03

7 1,76 .1,49 0,04

8 1,65 1,93 0,02

9 ----- 2,48 0,04

Média 2,30 ± 1,10 1,79 ± 0,40 0,02 ± 0,01