05 - AULA GENÉTICA - ESTAGIO DOCENCIA - Controle da ... · 27/04/2015 1 Anteriormente... Dogma central O fluxo da informação é unidirecional Refutação definitiva da herança

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Anteriormente...

Dogma central

O fluxo da informação é unidirecional

Refutação definitiva da herança dos caracteres

adquiridos

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O gene eucarioto

Éxon – constitui o mRNA e se traduz emproteína

Íntron – sequência não transcrita

Splicing do RNA

• No splicing alternativo, os éxons podem se juntar em combinações diferentes, produzindo mais de um tipo de polipeptídio a partir de um único gene.

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A U G U U U C U U G A C C C C U G A G G C G U U

Ribossomo

RNA mensageiro5´ 3´

U A C

H H‐OOC – C – N ‐ COH

R

N‐terminal

5´

H‐OOC – C ‐ NH2

R

A U G U U U C U U G A C C C C U G A G G C G U UU A C

• Formação da ligação peptídica

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R

• Translocação• Requer GTP



R

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A U G U U U C U U G A C C C C U G A G G C C A G

H O H H H H‐OOC – C – N – C – C – N – C‐ C –N ‐COH

R H R O R

‐

‐‐

Controle da Regulação Gênica

José Francisco Diogo da Silva Junior – Mestrando CMANS/UECE

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Expressão gênica diferencial

• Quase todas as células de um organismo são geneticamente idênticas

• A expressão gênica é o processo em que a informação contida em um determinado gene é decodificada em uma proteína

• Diferenças entre os tipos celulares são resultado da expressão gênica diferencial, a expressão de diferentes genes pelas células de um mesmo genoma

• A expressão gênica é regulada em vários estágios

Mecanismos para a criação de células especializadas

• As diferenças dramáticas que existem entre os diferentes tipos celulares é produzida por diferenças na expressão gênica

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Como a célula controla quais proteínas ela fabrica?

• Controlando quando e como um determinado gene é transcrito

• Controlando como um transcrito primário de RNA sofre o “splicing” ou é processado

• Selecionando quais mRNA são traduzidos

• Ativando ou inativando seletivamente as proteínas depois da sua síntese

• Controlando a velocidade de degradação das proteínas ativas

DNA

Sinal

Gene

NÚCLEO

Modificação da cromatina

Cromatina

Gene disponívelpara transcrição

Exon

Intron

cauda

RNA

Capa

Processamento do RNA

Transcrito primário

mRNA no núcleo

Transporte ao citoplasma

CITOPLASMA

Transcrição

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mRNA no citoplasma

Tradução

CITOPLASMA

Degradação

do mRNA

Processamento da proteína

Polipeptídio

Proteína ativa

Função celular

Transporte para o destino celular

Degradaçãoda proteína

• Genes presentes na cromatina

altamente compactada geralmente

não são transcritos


• A metilação do DNA geralmente reduz a transcrição

• A acetilação da histona parece

soltar a estrutura da cromatina,

melhorando a transcrição


Transcrição


TraduçãoDegradação do mRNA

Processamento e degradação proteica

Degradação do mRNA

• Cada mRNA possui uma meia vida característica, determinada em parte pela sequência nas UTRs 5’ e 3’ • O processamento e a degradação

pelas proteassomas estão sujeitas a regulação

Processamento e degradação da proteína

• O início da tradução pode ser controlado pela regulação dos fatores de iniciação

Tradução

oumRNA

Transcrito primário do RNA

• Splicing alternativo do RNA:


• Regulação coordenada:

Acentuado para genes

específicos do fígado

Acentuadores para genes

específicos do pâncreas

A dobra do DNA permite que ativadores se conectem a proteínas no promotor, iniciando a transcrição

Transcrição

• Regulação do início da transcrição: os elementos de controle do DNA se ligam a fatores de transcrição específicos

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Pontos de controle da expressão gênica em eucariotos


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O que são fenômenos epigenéticos?

• São alterações herdáveis na expressão gênica sem modificações na sequência de bases do DNA ‐ Reversíveis

Onde os processos epigenéticos ocorrem?

• DNA METILAÇÃO Promotor

Silenciamento

ACETILAÇÃO

METILAÇÃO

• HISTONAS BIOTINILAÇÃO

FOSFORILAÇÃO

UBIQUITINAÇÃO

SUMOilaçãoCompactação da

cromatina

“Código de histonas”

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Como os fatores de transcrição acessam o DNA?

• DNA – empacotado para ocupar menos espaço na célula

• Organização de DNA, RNA e proteínas (histonas) em um complexo chamado cromatina

• Histonas – proteínas que compõe a cromatina

• Heterocromatina

• DNA condensado

• Eucromatina

• DNA estendido

EUCROMATINA/HETEROCROMATINA

• Vai depender do tipo celular que genes estarão ativos ou inativos

Ativa Inativa

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Histonas

• Determinam grau de condensação da cromatina reprime a transcrição

• Interação entre elas grupamentos adicionados

• Eventos epigenéticos:

• Acetilação (lisina)

• Metilação (lisina ou arginina)

• Fosforilação (serina)

• Ubiquitinação (lisina)

• Ribosilação

Histonas

• As histonas possuem caudas que poder ser acetiladas pela enzima HAT (histona acetil transferase)

• A acetilação da histona faz sua carga (+) mais neutra, para que a interação com o DNA seja reduzida

Grupo Acetil

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Histonas

• As subunidades das histonas são:

• 2 unidades de H2A

• 2 unidades de H2B

• 2 unidades de H3

• 2 unidades de H4

• A histona H1 não está no centro, mas age como um grampo e mantêm o DNA ligante no lugar

• As histonas são carregadas positivamente, por isso o DNA, que é carregado negativamente, se enovela ao seu redor

DNA ligante liga umnucleossomo ao próximo

Empacotamento do DNA como controle gênico

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Influência da Estrutura da Cromatina na Transcrição em Eucariotos

• A maior parte do DNA em uma célula eucariótica está complexada nos nucleossomos e a estrutura espiralada dificulta o acesso de fatores de transcrição e da RNA‐polimerase.

• A iniciação da transcrição depende da remoção dos nucleossomos da região promotora do gene.

• Durante a síntese de DNA, quando os nucleossomos são substituídos, poderia haver competição entre as histonas e os fatores de transcrição (p.ex. TFIID) pelos sítios promotores.

• A ligação e ruptura dos nucleossomos por ativadores.

Expressão gênica

• O DNA se enovela ao redor de proteínas de histonas para formar uma estrutura chamada nucleossomo. Os nucleossomos ajudam o empacotamento do DNA no cromossomo

• Quando grupos acetil se ligam a histona, o DNA nos cromossomos se soltam para permitir a transcrição

• A adição de grupos metil à histona pode causar a condensação do DNA e com isso prevenir a transcrição

• No imprinting genômico, a metilação regula a expressão tanto dos alelos maternos como dos paternos de alguns genes no início do desenvolvimento

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Nucleossomos: aproximadamente 147 nucleotídeos enrolados sobre um octâmero de histonas com 2 cópias de cada tipo de histona

Unidade básica da heterocromatinaNUCLEOSSOMOS

Estrutura do DNA : nucleossomos e cromatina

Ativador se liga ao DNA

Complexo de remodelagem da cromatina

Remodelagem da cromatina

Enzimas modificadoras das histonas: histona‐acetilases

Modificação covalente das histonas

Outros ativadores

Outros ativadores ligados às regiões reguladoras

Fatores de transcrição e RNA pol II conseguem acessar o DNA

Montagem do complexo de iniciação no promotor

Outros ativadores e rearranjo das proteínas do complexo

INÍCIO DA TRANSCRIÇÃO

Ativadores e cromatina

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Metilação do DNA

Metilação do DNA

• Dinucleotídeos 5’‐CpG‐3’: união de uma citosina a uma guanina por uma ligação fosfodiéster na mesma fita de DNA ilhas CpG regiões promotoras dos genes

• Metilação do DNA: ocorre normalmente em cerca de 70 a 80% dos sítios CpG, sendo que essa porcentagem aumenta com o envelhecimento.

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Metilação do DNA

• É essencial para o desenvolvimento normal

• Tem ação:

• no controle da expressão gênica espacial e temporal

• na integridade cromossômica e segregação centromérica

• nos eventos de recombinação

• inativação do cromossomo X

• proteção contra elementos genéticos móveis

• imprinting genômico

• envelhecimento

A remodelação da cromatina

A acetilação das histonas melhoram o acesso à região promotora e facilita a transcrição

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Metilação do DNA e controle da transcrição

• Uma pequena porcentagem do DNA recém sintetizado (~3% em mamíferos) são quimicamente modificados pela metilação

• A metilação ocorre mais frequentemente em sequências simétricas CG

• Genes transcricionalente ativos possuem níveis significantemente inferiores de DNA metilado do que genes inativos

• A metilação resulta na síndrome do X frágil; o gene FMR‐1 é silenciado pela metilação

Papel da Metilação/Desacetilação na Repressão do Genoma

• Ilhas CpG não metiladas e histonas acetiladas nucleossomos em configuração aberta cromatina descondensada acesso aos fatores de transcrição Genes transcricionalmente ativos

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Papel da Metilação/Desacetilação na Repressão do Genoma

• Ilhas CpG hipermetiladas e histonas desacetiladasregiões de heterocromatina inativação gênica

• nucleossomos mais compactados cromatina condensada grupos metil fornecem barreira física para acessibilidade aos fatores de transcrição inibe acesso de proteínas reguladoras que promovem a transcrição

Metilação do DNA

• O resultado da metilação do DNA: silenciamento dos genes através da inibição direta ou indireta da ligação dos fatores de transcrição devido ao processo de metilação

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Baccarelli A et al. Circ Cardiovasc Genet 2010;3:567-573

CA CANCER J CLIN 2010;60:376–392

REGULAÇÃO DA TRANSCRIÇÃO

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Imprinting genômico

• É um subgrupo distinto de regulação epigenética em que a atividade de um gene é reversivelmente modificada dependendo do sexo do genitor que o transmitiu

• Processo em que genes específicos são diferencialmente “marcados” durante a gametogênese parental → expressão diferencial de alelos dependendo da origem materna ou paterna


• Assegura a expressão transcricional herdada paternalmente ou maternalmente

• Somente um dos 2 alelos parentais herdados é normalmente expresso e o outro alelo é reprimido

• Expressão monoalélica devido a padrão de metilação

• Imprinting pode ser tecido específico ou tipo celular específico: AS → expressão monoalélica em neurônios mas não na glia.

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Imprinting confirmado:

Materno: 1, 7, 11, 14, 15, 18, 20

Paterno: 1, 6, 7, 11, 14, 15, 19 e 20

Entre 100 a 500 transcritos imprintadosde 13 cromossomos diferentes

Genes imprintados atuam no crescimento embrionário e desenvolvimento e outros influenciam o comportamento após nascimento.


Consequência Funcional: Para que serve

• Funcionalmente estes genes serão “haplóides”.

• O gene A tem somente expressão “materna” (alelo paterno inexpressivo), enquanto o C somente “paterna” (alelo materno inexpressivo). O produto de ambos é o normal e suficiente para o funcionamento da célula.

• O gene B tem expressão em ambos os alelos, e seu produto também é normal para o funcionamento da célula.

P M

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Exemplos de Sinais que Regulam a Expressão Gênica em Eucariotos

• Hormônios (ex: hormônios esteróides)

• Fatores de Crescimento e de Diferenciação Celular

• Contato célula‐célula (adesão celular)

• Alterações nutricionais (resposta é limitada!)

• Alterações ambientais (ex: choque térmico)

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Regulação da expressão de genes por hormônios

esteroides

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Fatores Gerais de Transcrição

• Os fatores gerais de transcrição são proteínas responsáveis:

• pelo posicionamento correto da RNA‐polimerase no promotor

• ajudam na separação das fitas de DNA, para permitir o início da transcrição e

• liberam a RNA‐polimerase do promotor quando a transcrição se inicia.

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Região de controle gênica

• Região de controle gênica – todo o DNA envolvido na regulação de um gene

• Quantidade de proteínas reguladoras de genes

• FTs são similares, as proteínas reguladoras do gene podem ser bastante diferentes para diferentes regulações gênicas

Genes Eucarióticos São Regulados por Combinação de Proteínas

• A maioria das proteínas reguladoras de genes atuam como parte de um “comitê” de proteínas reguladoras, todas essenciais para a expressão de um determinado gene na célula correta, em reposta a uma dada condição, no tempo certo e no nível requerido.

• O termo controle combinatorial refere‐se a forma como grupos de proteínas trabalham juntas para determinar a expressão de um único gene.

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Ação de fatores de transcrição gerais e seletivos

Uma única proteína pode coordenar a expressão de diferentes genes

• Embora o controle da expressão gênica em eucariotos seja combinatorial, o efeito de uma única proteína reguladora pode ser decisiva para ligar e desligar, simplesmente completando a combinação necessária para ativar ou reprimir um gene.

• Exemplo: Em seres humanos, o receptor de glicocorticóide. Para se ligar aos sítios no DNA, o receptor precisa formar um complexo com uma molécula de um hormônio esteróide (p.ex. cortisol). Em resposta aos hormônios glicocorticóides, as células do fígado aumentam a expressão de vários genes.

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Fatores cis e trans

• Fatores Trans‐Atuantes

• Genes que codificam estes fatores de regulação estão em outra região da molécula de DNA, tendo que migrar ao local de ação

• Ligam‐se ao DNA, mas provém de outra região do DNA, que os codifica para agirem sobre os fatores em cis

• Fatores Cis‐Atuantes

• Sequências reguladoras, região de ligação dos fatores trans‐atuantes, estão na mesma molécula que o gene, ou transcrito de RNA, que está sendo regulado

• Estão na fita de DNA. São as regiões reguladoras, como as regiões promotoras dos genes, que são regiões que podem “ligar ou desligar” a expressão do gene

AtivadoresRepressoresReforçadoresElementos isolantes

Regiões reguladoras e regiões promotoras

Fatores cis e trans

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Controle da expressão gênica

• Sob controle positivo

• A transcrição não se iniciará sem a formação do complexo de transcrição

• Fatores de transcrição são proteínas reguladoras que se ligam a região acentuador, ao promotor (TATA box) e uns aos outros

• Uma vez que os fatores de transcrição são formados ao redor do promotor, eles são chamados de complexo de transcrição

Fatores de transcrição se ligam a região promotora

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Fatores de transcrição diferentes se ligam a RNA polimerase

Esse complexo de holoenzima reconhece o fator de transcrição original

Acentuadores agem como ativadores da transcrição

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Acentuadores TATAbox

PromotorAtivadores

DNAGene

Elemento de controle distal

Grupo de proteínas mediadoras

Proteína de dobra do DNA

Fatores de transcrição geral


PromotorAtivadores

DNAGene


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RNApolimerase II

RNApolimerase II

Complexo de iniciação da transcrição Síntese do

RNA

Grupo de proteínas mediadoras

Proteína de dobra do DNA

Fatores de transcrição geral


PromotorAtivadores

DNAGene


Regiões de controle da transcrição

• Promotores

• Sequencia de controle proximal no DNA

• Se liga a RNA polimersase e fatores de transcrição

• Taxa “básica” da transcrição

• Acentuadores

• Sequência de controle distal no DNA

• Ligante das proteínas de ativação

• Taxa “melhorada” (alto nível) da transcrição

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Regiões de controle da transcrição

Elementos de controle

Enhancer

Ativadores disponíveis

Gene da Albumina

(b) Célula ocular

Gene da cristalina expresso

NÚCLEO DA CÉLULA OCULAR

NÚCLEO DA CÉLULA HEPÁTICA

Gene da cristalina

Promotor

(a) Célula hepática

Gene da cristalina não expresso

Gene da albumina expresso

Gene da albumina não expresso

Ativadores disponíveis

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Complexo de transcrição

Acentuador

AtivadorAtivador

Ativador

Coativator

RNA polimerase II

A

B F E

HTFIID

Complexo promotore iniciador principal

Proteínas de ativação• proteínas regulatórias se ligam ao DNA em locais acentuadores distantes

• aumentam a taxa de transcriçãoSítios acentuadoresSítios regulatórios no DNA distante do gene alvo

Complexo de iniciação no sítio promotor sítio de ligação da RNA polimerase


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Mecanismos da regulação pós‐transcricional

• Apenas a transcrição não é o determinante para a expressão gênica

• Mecanismos regulatórios podem operar em vários extágios da transcrição

• Tais mecanismos permitem à célula promover uma sintonia fina na expressão gênica rapidamente em resposta à mudanças ambientais

PROMOTOR

AATAAA

éxon 1 éxon 2 éxon 3

ATG TAA

AAUAAAAUG UAA

AAUAAAAUG UAA

íntron íntron

TRANSCRIÇÃO

Pre-mRNA

mRNA

DNA

SPLICING DO RNA

proteína

TRADUÇÃO

sequência codificante

MAPSSRGG…..

OPEN READING FRAME

5’UTR 3’UTR

CAP AAAAA

NÚCLEO

CITOPLASMA

Regulação da expressão gênica via regulação de mRNAs maduros

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Processamento normal do RNA

• Capeamento• Logo após a transcrição

• Ligação efetiva de 7‐metilguanosina ao primeiro nucleotídeo 5’ do transcrito de RNA.

• Protege o transcrito do ataque da exonuclease 5’→3’

• Facilita o transporte do mRNA para citoplasma

• Papel no encaixe da subunidade 40S dos ribossomos no mRNA

• Poli‐adenilação• Após o término da transcrição – clivagem terminal do RNA

• Adição de cerca de 200 resíduos de adenilato

• Facilitar transporte para o citoplasma

• Estabilizar o mRNA

• Facilita a tradução

Estabilidade do mRNA regulando a expressão gênica

Figure 7-109 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

cauda poli‐A:• participa da terminação da transcrição• auxilia a exportação do mRNA nuclear• protege contra a degradação pelas exonucleases 3‘ ‐ 5‘ no citoplasma• seleciona transcritos para o ribossomo para tradução

3’ UTR possui elementos regulatórios que participam da estabilidade da transcrição

Capa 5‘:• auxilia a exportação do mRNA nuclear• protege contra a degradação pelas exonucleases 5‘ ‐ 3‘ no citoplasma• seleciona transcritos para o ribossomo para tradução

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Estabilidade do mRNA regulando a expressão gênica

• Em eucariotos: vida‐média de várias horas

Figure 7-109 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

Desadenilases citoplasmáticasp.e. PARN


• No splicing alternativo, diferentes moléculas de mRNA são produzidas a partir do mesmo transcrito primário, dependendo de qual segmento de RNA são tratados como éxons e quais são íntrons

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Acentuadores(elemento de controle distal)

Elementos de controle proximal

Sequência Poli-A

Região de terminação

DownstreamPromotor

UpstreamDNA

ÉxonÉxon ÉxonÍntron Íntron

Éxon Éxon ÉxonÍntronÍntron Final 3’ do transcrito primário

Transcrito primário de RNA

SinalPoli-A

Transcrição

5’



Sequência Poli-A


DownstreamPromotor

UpstreamDNA


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SinalPoli-A


Íntron do RNA

Segmento codificante

mRNA

5’ Cap 5’ UTRCódoninicial

Códonfinal

3’ UTR caudaPoli-A

3’

Éxon Éxon ÉxonÍntronÍntron Final 3’ do transcrito primário

Transcrito primário de RNA

Transcrição

5’



Sequência Poli-A


DownstreamPromotor

UpstreamDNA


Tipos de splicing alternativo

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Regulação do transporte de RNA

• Somente mRNA com estrutura de capa 5’ e cauda poli–A vão para o citoplasma

• Grande parte dos RNAs mensageiros nem saem do núcleo

• O mRNA pode ir para locais específicos no citoplasma, próximo de onde a proteína atua

• Região 3’‐ UTR é que quem regula esse direcionamento


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Início da tradução

• O início da tradução de mRNA selecionados pode ser bloqueado por proteínas regulatórias que se ligam a sequências ou estruturas do mRNA

• A tradução de todos os mRNAs em uma célula podem ser regulados simultaneamente

• Por exemplo, fatores de iniciação da tradução são ativados simultaneamente em um óvulo logo após a fertilização

Controle da tradução

• Bloqueio do início da tradução

• Proteínas regulatórias se ligam à porção 5’ do mRNA

• Prevenir a ligação das subunidades ribossomais e tRNA iniciador

• Bloquear a tradução de um mRNA em protéina

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Processamento e degradação de proteínas

• Após a tradução, vários tipos de processamento proteico, incluindo a ligação e a adição de grupos químicos estão sujeitos a controle

• Proteassomas são complexos gigantes de proteínas que ligam moléculas de proteínas e os degradam

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Processamento e degradação de proteínas

• Processamento de proteínas

• Dobramento, ligação, adição de grupos de açúcares, transporte par o sítio alvo

• Degradação de proteínas

• Ligação com a ubiquitina

• Degradação por proteasomas

Regulação pela estabilidade da proteína

• Proteólise dependente da ubiquitina• A molécula de proteína é sinalizada para degradação pela ligação de

uma proteína de 20 kDa, a ubiquitina

• A estabilidade de uma proteína depende do aminoácido N‐terminal• N‐terminal: por exemplo arginine, lisina: vida media = 3 minutos

• N‐terminal: por exemplo metionina, alanine: vida media = > 20 horas

COOH+NH2

NH2ATP

CO NH

CO NH

Ubiquitina ligaseMolécula de proteína para degradação

26Sproteasoma

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Proteassoma e ubiquitina para reciclagemProteassoma

Fragmentos de proteína (peptídeos)Proteína entrando

no proteasoma

Proteína Ubiquitinada

Proteína a ser degradada

Ubiquitina


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