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Ceroido-Lipofuscinose Neuronal
Estudos de localização celular da proteína CLN6
Mariana Isabel Quaresma da Rocha Alves
2007
Ceroido-Lipofuscinose Neuronal
Estudos de localização celular da proteína CLN6
Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina da
Universidade do Porto, para obtenção do grau de Mestre
em Medicina e Oncologia Molecular, realizada sob a
orientação científica da Doutora Maria Gil Roseira Ribeiro
(Centro de Genética Médica Dr. Jacinto Magalhães,
Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge)
Mariana Isabel Quaresma da Rocha Alves
2007
Aos meus pais…
Agradecimentos
Foram várias as pessoas que, de uma forma ou de outra, permitiram a realização
deste trabalho. A todas elas muito obrigada! Gostaria de citar algumas, agradecendo:
À minha orientadora, Doutora Maria Gil Ribeiro, não só pela fantástica orientação
científica, mas também pelo incentivo e conselhos prestados. Muito obrigada por tudo
isto, e ainda pela disponibilidade demonstrada.
À Doutora Maximina Pinto, por me ter proporcionado a realização deste trabalho no
Centro de Genética Médica Dr. Jacinto Magalhães do Instituto Nacional de Saúde Dr.
Ricardo Jorge.
À Doutora Lúcia Lacerda, por me ter proporcionado a concretização do trabalho
prático na Unidade de Enzimologia.
A todos os meus colegas da Unidade de Enzimologia, por toda a ajuda e ambiente de
trabalho proporcionados. Em especial ao Dr. Carlos Bessa e à Doutora Carla Teixeira
pelos conhecimentos e também pela amizade. À Doutora Sandra, à Dra. Marisa e à
Dra. Francisca pelo incentivo. À Dra. Lurdes pela ajuda e disponibilidade prestadas.
Aos meus Pais e ao meu irmão, que são o meu porto seguro. Obrigada por todo o
carinho demonstrado nesta, e em todas as anteriores etapas da minha contínua
aprendizagem.
Índice Geral
Abreviaturas i
Índice das Figuras v
Índice das Tabelas vii
Resumo ix
Abstract xi
Capítulo 1 - Introdução
1.1. Lisossoma 3
1.1.1. Ultraestrutura e composição 3
1.1.2. Biogénese 5
1.2. Doenças de Sobrecarga Lisossomal 9
1.3. Ceroido Lipofuscinose Neuronal 10
1.3.1. Características clínico-patológicas 10
1.3.2. Biologia funcional das proteínas NCL 13
1.3.3. Heterogeneidade genética e alélica 19
1.3.4. Fisiopatologia 21
1.3.5. Diagnóstico 23
1.3.6. Tratamento 25
1.3.7. Modelos animais 28
Capítulo 2 - Objectivos 31
Capítulo 3 - Materiais e Métodos
3.1 Anticorpos 35
3.2. Amostras biológicas 35
3.3. Procedimento experimental 38
3.3.1. Culturas celulares 38
3.3.2. SDS-PAGE e Western Blot 38
3.3.3. Imunofluorescência 40
Capítulo 4 - Resultados 45
4.1. Avaliação da sensibilidade e especificidade de anticorpos policlonais anti-CLN6 47 4.2. Estudos de co-localização por imunofluorescência da proteína endógena de FHC 50
4.3. Estudos de imunofluorescência em células murinas 55
4.4. Avaliação do efeito de mutações no gene CLN6 sobre a localização intracelular da proteína 55
4.5. Impacto de mutações noutros genes CLN na localização intracelular da proteína CLN6 57
Capítulo 5 - Discussão 61
Capítulo 6 - Conclusões 71
Capítulo 7 - Perspectivas Futuras 75
Capítulo 8 - Referências bibliográficas 79
i
Abreviaturas
AAV - Adenovírus associado
AF 594 - Alexa flúor 594
ANCL - Forma adulta da ceroido lipofuscinose neuronal
ATP - Adenosina trifosfato
BHK21 - Células de rim de hamster bébé
BSA - Albumina bovina sérica
cDNA - DNA complementar
CG - Complexo de Golgi
CHO - Células de ovários de hamster chinês
CLN - Gene ceroido lipofuscinose neuronal
CLNp - Proteína NCL
CoA - Coenzima A
CoNCL - Forma congénita da ceroido lipofuscinose neuronal
COP - Cytosolic coated proteins
COS-1 - Células de rim de macaco verde africano
CV - Inclusões de perfil curvilíneo
CTSD - Gene da catepsina D
Cy5 - Fluorocromo cianina5
DAPI - 2`,6 - diamidino-2-fenilindole
DNA - Ácido desoxirribonucleico
DSL – Doenças de sobrecarga lisossomal
DTT - 1,4 - ditiotreitol
EDTA - Ácido etilenodiaminotetracético
EE - Endossomas precoces
EPMR - Epilepsia progressiva com atraso mental.
ERT - Terapia de substituição enzimática
FHC - Fibroblastos humanos cultivados
Lamp- Lysosome-associated membrane protein
Lgp - Lysosomal membrane glycoprotein
Limp - Lysosomal integral membrane protein
LE - Endossomas tardios
FITC - Fluorocromo fluoresceína isotiocianato
FP - Inclusões do tipo impressão digital
GalCer - Galactosilceramida
GlcNAc-P - N-acetilglucosamina-fosfato
ii
GM2 - Gangliósido 2
GM3 - Gangliósido 3
GROD – Depósitos granulares osmiofílicos
GTPases - Guanosina trifosfatases
HEK293 - Células de rim embrionário humano
HRP - Horseradish peroxidase
IBD - International Batten disease
INCL - Forma infantil da ceroido lipofuscinose neuronal
kb - kilo base
kDa - kilo Daltons
JNCL - Forma juvenil da ceroido lipofuscinose neuronal
LINCL - Forma infantil-tardia da ceroido lipofuscinose neuronal
LE - Endossomas tardios
ME - Microscopia electrónica
MEM - Meio essencial mínimo
MFSD - Major facilitator superfamily
mnd - Motor neuronal degeneration
MP - Membrana plasmática
M6P - Manose-6-fosfato
NaOH - Hidróxido de sódio
NCL - Ceroido lipofuscinose neuronal
nclf - Variante de LINCL em ratinho
NIH3T3 - Linha celular de fibroblastos embrionários de ratinho
NLS - Nuclear localization signal
NX(S/T) - Asparafina X( Serina/Treonina): X, uma aminoácido qualquer
OMIM - Online mendelian inheritance in man
ON - Over nigth
PBS - Tampão fosfato salino
PM- Peso molecular
PMSF - Fluoreto de fenilmetanosulfunilo
PPT1 - Palmitoil transferase 1
Rab - Membro da superfamília Ras
Ras - Família de proteínas G de baixo peso molecular
RE - Retículo endoplasmático
RER - Retículo endoplasmático rugoso
RNAm - Ácido ribonucleico mensageiro
RL - Complexos rectilíneos
iii
SDS - Dodecil sulfato de sódio
SDS-PAGE - Dodecil sulfato de sódio-electroforese em gel de poliacrilamida SLC29 - Transportadores de nucleósidos
SVF - Soro de vitelo-fetal
SNARE - Soluble NSF attachment receptor
NSF - N-etilmaleimide sensitive factor
SNC - Sistema nervoso central TA - Temperatura ambiente
TBS - Tampão tris salino
TBST - Tampão tris salino-Tween20 TEMED - Tetrametiletilenodiamina
TGN - Rede trans Golgi
TLC - TRAM–Lag1p–CLN8
Tris- Trishidroximetilaminometano
TPP1 - Tripeptidilamino peptidase 1
vLINCL - Variante da forma infantil tardia da ceroido lipofuscinose neuronal
v
Índice das Figuras Figura 1.1: Lisossoma: topologia das principais proteínas integrais.
4
Figura 1.2: Contribuição da via biossintética e da via endocítica para a formação dos lisossomas.
6
Figura 1.3: Integração das vias biossintética, endocítica e exocítica.
8
Figura1.4: Análise ultra-estrutural de células das glândulas sudoríferas da pele.
11
Figura 1.5: Estratégia de estudo bioquímico e molecular visando o diagnóstico das variantes genéticas de NCL.
24
Figura 4.1: Alinhamento da sequência primária da proteína CLN6 de diferentes espécies.
46
Figura 4.2: Detecção da proteína CLN6 endógena de FHC com o anticorpo anti-CLN6/34.
47
Figura 4.3: Localização intracelular da proteína CLN6 de FHC com o anticorpo anti-CLN6/35.
48
Figura 4.4: Localização intracelular da proteína CLN6 de FHC com o anticorpo anti-CLN6/LAL.
49
Figura 4.5: Co–localização da proteína CLN6 de FHC com proteínas marcadoras do RE e do lisossoma.
51
Figura 4.6: Co-localização da proteína CLN6 de FHC com DAPI
52
Figura 4.7: Co-localização da proteína CLN6 de FHC com anticorpos anti-CLN6/35 e faloidina-FITC.
52
Figura 4.8: Co-localização da proteína CLN6 de FHC com anticorpos anti-CLN6/35 e anti-CLN6/LAL.
53
Figura 4.9: Co-localização da proteína CLN6 de FHC com anticorpos anti-CLN6/35 e anti-CLN6/RMB.
54
Figura 4.10 Co-localização da proteína CLN6 em células murinas NIH3T3 com os anticorpos anti-CLN6/35 e anti-calregulina
55
Figura 4.11: Detecção da proteína CLN6 endógena de FHC de doentes com a variante CLN6 com o anticorpo anti-CLN6/34.
56
Figura 4.12: Imunofluorescência com o anticorpo anti-CLN6/35 em fibroblastos cultivados de doentes com a variante CLN6.
56
Figura 4.13: Efeito de mutações nos genes CLN na localização intracelular da proteína CLN6.
58
vii
Índice das Tabelas Tabela 1.1: Localização e função das principais proteínas Rab.
9
Tabela 1.2:: Características clínico-patológicas da NCL.
12
Tabela 1.3: Base genética da Ceroido Lipofuscinose Neuronal.
20
Tabela 3.1: Descrição dos anticorpos usados no protocolo de imunofluorescência e de Western blot.
36
Tabela 3.2: Espectro mutacional de doentes portugueses com NCL e análise do efeito das mutações na expressão da proteína.
37
ix
Resumo
A ceroido lipofuscinose neuronal (NCL) é um grupo de doenças
neurodegenertativas de transmissão autossómica recessiva, geralmente fatais.
Caracteriza-se pela acumulação lisossomal de um lipopigmento autofluorescente com
propriedades semelhantes à lipofuscina, em vários tipos de células. As NCLs são
causadas por mutações presentes em pelo menos 8 genes. As formas INCL/CLN1,
LINCL/CLN2, e CoNCL/CLN10 são causadas pela deficiência em enzimas lisossomais
solúveis, tiosterase, aminopeptidase e protease, respectivamente. As formas
vLINCL/CLN3, vLINCL/CLN5, vLINCL/CLN6, vLINCL/CLN7 e vLINCL/CLN8, são
causadas por defeitos em proteínas de topologia membranar de função ainda
desconhecida. A observação de morte celular, de alterações no tráfego intracelular de
proteínas e lípidos e de alterações no metabolismo dos esfingolípidos, na maioria das
variantes da doença, sugere que as proteínas NCL deverão actuar numa via celular
comum, especialmente importante para o funcionamento neuronal.
A variante CLN6, recentemente descrita, é causada por mutações no gene
CLN6. Esta proteína é altamente conservada e não possui, sequências péptido sinal
ou locais de N-glicosilação. Em estudos realizados recentemente, a proteína CLN6 foi
observada em vários compartimentos celulares, incluindo o RE, CG, endossomas de
reciclagem e lipid rafts.
No sentido de contribuir para o conhecimento da localização celular da proteína
CLN6 foram produzidos e caracterizadas três anticorpos policlonais imunopurificados.
Em fibroblastos humanos cultivados, estes detectaram a proteína endógena quer em
estudos de SDS-PAGE/Western blot, quer de imunofluorescência. Os dados obtidos
na exposição das células a soro pré-imune ou ao péptido bloqueador sugerem que o
padrão de marcação é específico. Estudos de microscopia de imunofluorescência com
marcação dupla revelaram co-localização parcial da proteína CLN6 no núcleo e ao
longo da membrana plasmática, em regiões marcadas pela faloidina que interactua
especificamente com filamentos de actina.
A mutação p.I154del no gene CLN6 não interfere com o tráfego intracelular da
proteína CLN6. Além disso, estudos de imunofluorescência em fibroblastos de doentes
x
CLN1, CLN2, CLN3 e CLN5 não revelaram alterações significativas do padrão de
marcação da proteína CLN6.
Os resultados obtidos no âmbito do presente trabalho, fornecem pistas novas
para o conhecimento da localização celular da proteína CLN6. Tais evidências,
juntamente com dados obtidos anteriormente, sugerem que a proteína CLN6 poderá
desempenhar um papel importante na transdução de sinal da membrana para o
citossol, e depois para o núcleo onde deverá causar alterações específicas na
expressão genética. Os participantes moleculares desta cascata deverão ser
identificados no futuro.
Desta forma, os resultados obtidos representam uma contribuição importante
para futuros estudos de investigação que visem explorar o conhecimento da função da
proteína CLN6 e dos mecanismos patobiológicos da CLN6 e de outras NCLs, bem
como, os mecanismos moleculares associados à neurodegeneração e ao
envelhecimento celular.
xi
Abstract
The neuronal ceroid lipofuscinoses (NCLs) are a group of fatal genetically inherited
neurodegenerative diseases. The hallmark is the lysosomal accumulation of lipofuscin-
like material in multiple cell types. NCLs are caused by at least 8 mutant genes.
INCL/CLN1, LINCL/CLN2 and CoNCL/CLN10 are caused by defects in soluble
lysosomal enzymes, thiosterase, aminopeptidase and protease, respectively.
vLINCL/CLN3, vLINCL/CLN5, vLINCL/CLN6, vLINCL/CLN7 and vLINCL/CLN8 are
caused by defects in membrane-bound proteins whose function is currently unknown.
Most variants manifest cell death, intracellular trafficking defects and dysregulated
sphingolipid metabolism, suggesting that NCL proteins may interact along one pathway
especially important for proper neuronal functioning.
One of the most recent described variants is the CLN6, which is caused by
mutations in the CLN6 gene. This highly conserved protein contains no signal peptide
or asparagine linked glycosylation sites. The function of the CLN6 protein is unknown.
Recently, the CLN6 protein has been located to various cellular compartments
including endoplasmatic reticulum, Golgi, recycling endosomes and lipid rafts.
Aiming to get novel insights into the CLN6 cell location three polyclonal
immunopurified peptide antibodies were produced and characterised. In cultured
human fibroblasts, these antibodies were able to detect the endogenous protein in
either SDS-PAGE/Western blot or immunofluorescence studies. Furthermore, data
obtained by exposing the cells to pre immune serum or blocking peptide indicated that
the labelling pattern was specific. The intracellular distribution of CLN6 in cultured
human fibroblasts was investigated by double immunofluorescence microscopy. The
wild type CLN6 showed partial co-localization in nucleus and along cell membrane in
regions stained with phalloidin that specifically interacts with actin microfilaments. The
mutation p.I154del in the CLN6 gene did not interfere with CLN6 intracellular trafficking.
Moreover, fibroblasts from CLN1, CLN2, CLN3 and CLN5 patients did not showed any
severe miss localization of CLN6 protein.
The data here reported provided novel clues into the knowledge of CLN6 protein
cell location. Altogether, data here reported along with previous findings suggest that
the CLN6 protein may have a role in signal transduction from the membrane to the
xii
cytosol, and then to the nucleus where can cause specific changes in gene expression.
The molecular players of this cascade must be identified in the future.
Overall, the data reported in the present study will contribute to the design of future
studies aiming to investigate the protein cell function and the disease pathology of
CLN6 and other NCLs, as well as the mechanisms of neurodegeneration and aging.
Capítulo 1
Introdução
Introdução
3
1. Introdução
1.1. Lisossoma
A descoberta dos lisossomas ficou a dever-se a De Duve e seus colaboradores,
quando, na década de 50, estudavam a actividade da fosfatase ácida no fígado de rato
(De Duve et al., 1955). Estes investigadores observaram que a actividade desta e de
outras hidrolases ácidas aumentava consideravelmente quando os homogeneizados
de fígado eram submetidos a meios hipotónicos, tratados com detergentes e sujeitos a
congelação. Esta observação sugeria que as hidrolases ácidas deveriam estar
contidas num compartimento limitado por uma membrana que impedia o contacto
entre as enzimas e os substratos. Os meios hipotónicos, os detergentes ou o processo
de congelação/descongelação, provocariam rupturas na membrana dos lisossomas,
causando a libertação das enzimas, e consequente detecção da sua actividade por
métodos bioquímicos (Baudhuin et al., 1965). Na sequência destes estudos, foi
possível observar ao microscópio electrónico estruturas que correspondiam a corpos
densos e limitados por uma membrana. Organelos deste tipo já tinham sido
observados em cortes ultra-finos de hepatócitos, mas o seu significado funcional só foi
compreendido após os estudos bioquímicos de Duve (rev. em De Duve e Wattiaux,
1966).
1.1.1. Ultraestrutura e composição
Os lisossomas encontram-se praticamente em todas as células eucarioticas. São
organelos intracelulares delimitados por uma membrana e constituídos por enzimas
hidrolíticas (solúveis ou membranares) responsáveis pela digestão celular (Figura 1.1).
Conhecem-se cerca de 50-60 tipos de enzimas lisossomais, que incluem proteases,
nucleases, glicosilases, lipidases, fosfolipipases, fosfatases e sulfatases. Toda esta
variedade enzimática permite a digestão intracelular de praticamente todos os tipos de
macromoléculas nos seus monómeros estruturais (aminoácidos, ácidos gordos,
nucleótidos e açúcares simples) (Barrett e Heath, 1977).
Introdução
4
Estas enzimas são preferencialmente activas em meio ácido (~ pH 5.0). A
acidificação do lúmen é efectuada por uma bomba de protões localizada na membrana
do lisossoma (Figura 1.1) (Alberts et al., 2002).
A célula está protegida contra ataques do próprio sistema digestivo uma vez que
a membrana do lisossoma mantém as enzimas digestivas isoladas do citoplasma
(essa função é exercida, aparentemente, pelos carbohidratos associados à face
interna da membrana); no caso de uma eventual lise da membrana lisossomal a acção
destas enzimas estará inibida a pH citoplasmático (~ 7.2).
Figura 1.1: Lisossoma: topologia das principais proteínas integrais. H+-ATPase promove a acidificação do lúmen lisossomal; LAMP- Lysosome-associated membrane protein; LIMP - Lysosomal integral membrane protein; LGP - lysosomal membrane glycoprotein. Figura extraída de Eskelinen et al. (2003), Cell Biology.
Introdução
5
1.1.2. Biogénese
Via biossintética
As proteínas lisossomais são, na sua maioria, glicoproteínas constituídas por
oligossacáridos ricos em manose. A sua síntese ocorre nos ribossomas associados ao
retículo endoplasmático rugoso (RER), com subsequente translocação dos
polipéptidos para o lúmen do RER onde são N-glicosilados em resíduos específicos de
asparagina (Asn-X-Ser/Thr). Estas glicoproteínas são transportada para a fase cis do
complexo de Golgi (CG) e resíduos de manose dos N-oligossacáridos são fosforilados
pela adição de GlcNAc-P catalizada pela enzima N-Acetilglucosamina-1-
fosfotransferase. Durante o seu transporte vectorial no CG, as glicoproteínas são alvo
de processamento proteolítico e oligossacarídico, nomeadamente conversão dos N-
oligossacáridos ricos em manose, em N-oligossacáridos complexos ou em estruturas
híbridas e imposição do grupo fosfato por acção da enzima N-Acetilglucosamina-1-
fosfodiéster α-N-Acetilglucosaminidase, com formação do marcador de
endereçamento lisossomal manose-6-fosfato (M6P). Na rede trans do CG, as
glicoproteínas lisossomais ligam-se a receptores específicos membranares (receptores
M6P). Os referidos receptores reconhecem resíduos de M6P e são responsáveis pelo
transporte vesicular das glicoproteínas lisossomais até aos endossomas tardios (LE)
(Figura 1.2A). Deste modo, a segregação entre as proteínas lisossomais e as
proteínas de secreção ocorre na rede trans do CG.
A fusão entre LE e lisossomas preexistentes pode dar origem a estruturas
híbridas que contém enzimas lisossomais e receptores M6P inseridos na membrana
(Figura 1.2B).
Nos LE e estruturas híbridas, a diminuição de pH (5-6) origina a separação entre
os receptores e as proteínas lisossomais. Adicionalmente, as enzimas lisossomais são
desfosforiladas para impedir o seu retorno ao CG. Os receptores M6P são incluídos na
membrana de vesículas que os transportam de regresso ao CG ou à membrana
plasmática (MP), onde são reutilizados. Desta forma, os lisossomas definem-se não só
pela presença de hidrolases ácidas e de glicoproteínas integrais de membrana, mas
também, pela ausência de dois receptores de manose-6-fosfato e de recycling cell
surface receptors, o que os distingue dos endossomas (rev. em Kornfeld e Mellman
1989, rev. em Luzio et al., 2000; rev. em Mullins e Bonifacino, 2001).
Introdução
6
Uma outra via, que não depende dos receptores de M6P, é responsável pela
incorporação de certas proteínas na membrana lisossomal e da fosfatase ácida nos
lisossomas. Estas proteínas são transportadas por vesículas desde a rede trans do
CG, até à MP. A partir da MP são incorporadas em vesículas de endocitose, que as
transportam até aos endossomas precoces (EE), estrutura a partir da qual podem
circular repetidamente até à MP. A partir dos EE, estas proteínas são transportadas
até aos lisossomas via LE (Braun et al., 1989).
Figura 1.2: Contribuição da via biossintética e da via endocítica para a formação dos lisossomas. A: Transporte de hidrolases lisossomais sintetizadas de novo para o lisossoma. Os precursores das hidrolases lisossomais são covalentemente modificados na rede cis do CG pela adição de M6P. Estes precursores são segregados ao nível da rede trans do CG, onde as adaptinas de vesículas de clatrina se ligam aos receptores M6P, que por sua vez ligam as hidrolases lisossomais modificadas. As vesículas cobertas por clatrina desligam-se da rede trans do CG e fundem-se com os LE. Nos LE, a diminuição do pH origina a dissociação das hidrolases dos receptores M6P, sendo estes reciclados para o CG onde ficam disponíveis para ligar outras hidrolases. Nos LE, o grupo fosfato do marcador M6P é removido para impedir o retorno das glicoproteínas ao CG. A Figura foi extraída de Alberts et al., 2002, Molecular Biology of the Cell. B: Transporte das macromoléculas internalizadas por endocitose. Inicialmente as biomoléculas são endereçadas para os EE, e de seguida para os LE. A formação dos lisossomas ocorre a partir da fusão dos LE com lisossomas pré-existentes ou com organelos híbridos. A figura foi extraída de Luzio et al. (2003), Molecular Membrane Biology.
A
B
Introdução
7
Via endocítica
Em células de mamíferos, os organelos da via endocítica tardia interagem entre
si e encontram-se num equilíbrio dinâmico, quer in vivo como in vitro. Assim, pode
verificar-se uma mistura de conteúdos e/ou troca de proteínas membranares entre LE
(Aniento et al.,1993), entre lisossomas (Bakker et al., 1997; Ward et al., 1997; rev. em
Storrie e Desjardins, 1996) e entre LE e lisossomas (Mullock et al., 1994).
Presentemente existem 3 hipóteses, não exclusivas, para explicar a mistura de
conteúdos entre os LE e lisossomas. A primeira hipótese assume a existência de
transporte vesicular entre os dois organelos (rev. em Mellan e Warren, 2000),
enquanto que a segunda hipótese, conhecida por kiss and run, propõe que os LE e os
lisossomas repetida e continuamente se fundem e afastam (rev. em Storrie e
Desjardins, 1996). A terceira hipótese envolve a fusão directa e completa entre os LE
e os lisossomas, através da formação de uma estrutura híbrida e subsequente
recuperação do lisossoma (Griffiths, 1996; Thilo et al., 1995) (Figura 1.2B).
Integração da via biossintética, endocítica e exocítica
Nas células eucarióticas, a via secretora e a via endocítica envolvem múltiplos
compartimentos, cada um com um conjunto específico de proteínas e lípidos. Deste
modo, a biogénese desses organelos está associada a mecanismos de transporte
específicos que visam assegurar a sua identidade, função e correcta inter-
comunicação. Por conseguinte, o tráfego intracelular dessas moléculas é um processo
complexo; os organelos são estruturas dinâmicas e as suas proteínas de membrana
estão sujeitas a múltiplas e diversas interacções moleculares.
Avanços recentes na compreensão dos mecanismos moleculares do transporte
membranar devem-se, essencialmente, a estudos multidisciplinares que integram
conhecimentos de biologia celular, biologia estrutural, imagiologia, genética e
bioquímica de proteínas e de lípidos (rev. em van Vliet et al., 2003). Na Figura 1.3 é
apresentado um esquema geral da integração destas 3 vias.
Introdução
8
Figura 1.3: Integração das vias biossintética, endocítica e exocítica. Vesículas de transporte intracelular e localização de algumas Rabs. Na via biossintética as proteínas são transportadas do RE através do CG para a MP. Na TGN, as moléculas podem ser transportadas para vesículas secretoras constitutivas (CV) ou para vesículas secretoras de regulação (RV). O material internalizado do exterior da célula, chega aos EE, podendo ser reciclado de volta à superfície da célula, ou transportado para os LE e lisossomas. As vias biossintética e endocítica trocam material a nível do CG e dos compartimentos endossomais. É indicada a localização das diferentes Rabs nos compartimentos membranares onde participam. Figura extraída de Stenmark e Vesa, 2001, Genome Biology.
A identificação de marcadores bioquímicos para cada população de endossomas
(rev. em. Seabra et al., 2002) veio facilitar o estudo do tráfego intracelular de proteínas
e lípidos. Estes marcadores são proteínas da família Rab, isto é, pequenas GTPases
que regulam o transporte de vesículas ao longo das vias endocítica e exocítica,
actuando principalmente ao nível da associação entre vesículas e posterior fusão com
as membranas, mecanismo no qual participam as proteínas do complexo SNARE
(Novick et al., 2006). As proteínas Rab estão intimamente associadas a proteínas do
citoesqueleto, designadamente aos microtúbulos, regulando o transporte das vesículas
ao longo destes filamentos (rev. em Seabra et al., 2002). Mais de 60 genes Rab foram
identificados e a função do produto de muitos deles caracterizada (Tabela 1.1). Esta
diversidade de proteínas Rab indica que a homeostasia celular está associada a um
elevado controlo e organização interna na célula.
Introdução
9
Tabela 1.1: Localização e função das principais proteínas Rab.
Proteína Localização Função
Rab1a RE e CG Transporte RE-CG e intra Golgi
Rab2 cis-Golgi Transporte CG-RE
Rab3a Vesículas sinápticas, grânulos secretores
Regulação da libertação de neurotransmissores; regulação da secreção
Rab4a EE, MP Endereçamento e EE-MP
Rab5a MP, EE e vesículas de clatrina Transporte EE-MP; fusão EE-EE
Rab6a RE, CG, TGN Tráfego CG-RE e intra Golgi;
Rab7 LE Tráfego EE-LE; tráfego LE-lisossoma
Rab8a TGN, vesículas secretoras, MP Secreção polarizada: transporte TGN-MP
Rab9 LE, TGN Transporte LE-TGN
Rab11 RE, TGN, MP Tráfego RE-TGN
1.2. Doenças de Sobrecarga Lisossomal
As Doenças de Sobrecarga Lisossomal (DSL) são causadas pela actividade
deficiente de uma proteína lisossomal resultando na acumulação intra-lisossomal de
metabolitos não degradados. Apesar da base genética estar relativamente bem
estabelecida para a maioria das DSL, pouco se sabe acerca da relação entre a
acumulação intra-lisossomal e o desenvolvimento da patologia.
Presentemente estima-se que existam no lisossoma pelo menos 50 a 60
hidrolases e 7 proteínas integrais de membrana (Journet et al., 2002). Em princípio,
mutações em genes que codificam qualquer uma destas proteínas podem causar DSL.
Cerca de 40 DSL que envolvem hidrolases solúveis e/ou cofactores proteicos são
actualmente conhecidas.
A classificação das DSL em lipidoses, esfingolipidoses, mucopolissacaridoses,
glicogenoses, mucolipidoses, glicoproteinoses, oligossacaridoses e ceroido
lipofuscinoses neuronais (NCLs) reflecte a natureza do substrato acumulado. Com a
excepção da doença de Fabry e MPS tipo II que são doenças ligadas ao cromossoma
X, as DSL são doenças autossómicas recessivas. Embora as DSL sejam
individualmente raras, no seu conjunto apresentam uma incidência de
aproximadamente 1:8000 nascimentos (Meikle et al., 1999), representando, por isso,
Introdução
10
um reconhecido problema de saúde a nível mundial. Recentemente, a prevalência da
doença em Portugal foi estimada em 1:4000 nascimentos (Pinto et al., 2004).
As DSLs são doenças monogénicas associadas a uma considerável variabilidade
clínico-patológica e heterogeneidade alélica resultantes da presença de diferentes
tipos de mutações (missense, nonsense, splite-site, delecções parciais e inserções) no
respectivo gene. Algumas mutações originam perda completa de actividade
enzimática, enquanto que outras causam apenas redução dessa actividade. Em geral,
a actividade residual correlaciona-se inversamente com gravidade do fenótipo clínico.
No entanto, as DSLs são um grupo heterogéneo de doenças, incluindo formas
neuropatológicas muito graves, formas suaves com envolvimento apenas de tecidos
periféricos e casos assintomáticos, e, não raramente, o mesmo genótipo é identificado
em doentes com formas severas e formas suaves da doença (rev. em Futerman e
Meer, 2004). Assim, em certos casos de DSL a severidade da doença pode também
estar relacionada, não só com a natureza da alteração genética, mas também com o
tipo e nível de substrato acumulado, e com o tipo de tecidos ou células afectadas por
essa acumulação. No futuro, um conhecimento mais profundo acerca das vias
celulares e bioquímicas secundárias que estão alteradas em virtude da acumulação de
substratos específicos nos lisossomas (rev. em Futerman e Meer, 2004) permitirá uma
melhor compreensão das implicações fenotípicas decorrentes da identificação de
mutações.
1.3. Ceroido Lipofuscinose Neuronal
1.3.1. Características clínico-patológicas
A Ceroido Lipofuscinose Neuronal (NCL) é um grupo de doenças
neurodegenerativas, de transmissão autossómica recessiva, que se caracteriza pela
acumulação lisossomal de um lipopigmento autofluorescente com características
semelhantes a ceroido e lipofuscina, principalmente em tecidos neuronais. O termo
ceroido lipofuscinose neuronal foi introduzido por Zeman e Dyken (1969) de forma a
diferenciar estas patologias das gangliosidoses. A primeira descrição da doença surgiu
em 1826, por Stengel, que caracterizou quatro casos de doentes com cegueira
progressiva, demência, epilepsia, declínio cognitivo e disfunção motora. Hoje,
Introdução
11
sabemos tratar-se da forma juvenil da NCL. Outros casos de NCL juvenil foram
descritos por Batten (1903), Spielmeyer (1923) e Hallervorden (1938). Jansky (1908) e
Bielschowsky (1923) documentaram doentes com a forma infantil tardia e Kufs (1925)
descreveu a forma adulta. Haltia e colegas descreveram a forma infantil da NCL
(1973) (Wisniewski e Zhong, 2001).
A análise de dados provenientes de estudos de microscopia electrónica de vários
tecidos, obtidos por autópsias e biópsias, revelaram que as inclusões lisossomais em
doentes com NCL podem ser de quatro tipos: depósitos granulares osmiofílicos
(GROD), perfis curvilíneos (CV), perfis do tipo impressão digital (FP) e complexos
rectilíneos (RL) (rev. em Bennett e Hofmann, 1999) (Figura 1.4).
Figura 1.4: Análise ultra-estrutural de células das glândulas sudoríferas da pele. Figura extraída de Teixeira et al., 2003a.
GROD CV
CV/FP CV/FP
GROD CV
CV/FP CV/FP
Introdução
12
Estas doenças caracterizam-se clinicamente pela perda progressiva de visão,
declínio da função motora e intelectual, epilepsia, atrofia cerebral, alterações de
comportamento e morte precoce nas formas mais graves da doença (rev. em
Santavuori, 1988). Com base na idade de aparecimento dos sintomas são distinguidas
5 formas clínicas: congénita (CoNCL), infantil (INCL), infantil-tardia (LINCL), juvenil
(JNCL) e adulta (ANCL). A progressão clínica nestas formas da doença não é ainda
bem conhecida. A base genética e patológica destas variantes clínicas é apresentada
na Tabela 1.2.
Até ao final da década de 90 era observada uma correlação quase perfeita entre
o fenótipo clínico-patológico e a variante genética da NCL. A forma infantil, infantil-
tardia e juvenil eram associadas, respectivamente, a inclusões do tipo GROD, CV e
FP, e causadas por mutações nos genes CLN1, CLN2 e CLN3. A identificação de
novas variantes (CLN5-CLN8 e CLN10) em doentes que exibiam um fenótipo clínico
mais suave que o infantil-tardio clássico associado à deficiência da enzima
TPP1/CLN2, e a identificação da mesma variante genética em doentes com um
fenótipo clínico distinto sugere que, a cada gene, deverá estar associado um espectro
clínico que inclui quer formas muito severas quer formas adultas ou praticamente
assintomáticas.
Tabela 1.2: Características clínico-patológicas da NCL.
*Subunidade c da ATP sintetase; CTSD, Gene da catepsina D; MFSD, Major facilitator superfamily; Onset,
Idade em que se manifestou o 1º sintoma da doença; GROD, Depósitos granulares osmiofílicos; CV, Perfil curvilíneo; FP, Perfil do tipo impressão digital; RL, Complexo rectilíneo.
Proteína Idadede Variante Gene Onset Inclusões acumulada morte
CoNCL CLN10/CTSD neonatal GROD SaposinaA/D
INCL CLN1 6-18 meses GROD SaposinaA/D 8-13 anos
LINCL CLN2 2-8 anos CV/misto Subunidadec* 5-12 anos
JNCL CLN3 4-10 anos FP/misto Subunidadec* 8-51 anos
vLINCL CLN5 4-7 anos CV/FP/RL Subunidadec*
CLN6 8 meses-8 anos CV/FP/RL Subunidadec*
CLN7/MFSD8 2-7 anos CV/FP/RL Subunidadec*
CLN8 1-10 anos CV/GROD Subunidadec* > 40-50 anos
CLN10/CTSD 4-7 anos Estruturas lamelares
Proteína Idadede Variante Gene Onset Inclusões acumulada morte
CoNCL CLN10/CTSD neonatal GROD SaposinaA/D
INCL CLN1 6-18 meses GROD SaposinaA/D 8-13 anos
LINCL CLN2 2-8 anos CV/misto Subunidadec* 5-12 anos
JNCL CLN3 4-10 anos FP/misto Subunidadec* 8-51 anos
vLINCL CLN5 4-7 anos CV/FP/RL Subunidadec*
CLN6 8 meses-8 anos CV/FP/RL Subunidadec*
CLN7/MFSD8 2-7 anos CV/FP/RL Subunidadec*
CLN8 1-10 anos CV/GROD Subunidadec* > 40-50 anos
CLN10/CTSD 4-7 anos Estruturas lamelares
Introdução
13
1.3.2. Biologia funcional das proteínas NCL
Presentemente são conhecidas 8 proteínas (CLN1, CLN2, CLN3, CLN5, CLN6,
CLN7, CLN8 e CLN10); três são enzimas lisossomais solúveis (CLN1, CLN2 e CLN10)
e as restantes são proteínas de topologia membranar de função ainda desconhecida.
Os aspectos estruturais e funcionais mais relevantes para a compreensão do presente
trabalho são a seguir apresentados.
Estrutura e função
Proteína CLN1 / PPT1:
A PPT1, proteína palmitoil transferase 1, é codificada por um gene de 25-kb,
constituído por 9 exões, localizado no cromossoma humano 1p32. Este gene produz
um único RNAm de 2.5-kb (Schriner et al., 1996). A proteína codificada, de 306
aminoácidos, contém uma sequência péptido sinal (26 aminoácidos), que é clivada co-
traducionalmente. A proteína madura migra como um dupleto de 37/35kDa, ficando
reduzida a 31kDa após desglicosilação (Verkruyse e Hofmann, 1996). A PPT1 possui
três locais de N-glicosilação (aminoácidos 197, 212 e 232) que contribuem para a
actividade e/ou estabilidade da enzima (Bellizzi et al., 2000). A enzima é transportada
para o lisossoma pela via da M6P (Hellsten et al., 1996; Sleat et al., 1996; Verkruyse e
Hofmann, 1996). Estudos proteómicos identificaram a enzima no cérebro, lisossomas
placentários e fagossomas macrofágicos (Chataway et al., 1998; Garin et al., 2001;
Sleat et al., 2005). O seu pH óptimo de actividade é entre 4,5 e 5,5. (Verkruyse e
Hofmann, 1996).
A PPT1 é uma enzima que remove ácidos gordos ligados covalentemente à
cadeia lateral de resíduos de cisteína de proteínas (Camp e Hofmann, 1993; Camp et
al., 1994), preferencialmente os ácidos gordos que possuem entre 14 e 18 carbonos
(Lu et al., 1996; Lu et al., 2002). Estudos in vitro sugerem que a PPT1 promove a
despalmitoilação de proteínas S-aciladas, tais como H-Ras, palmitoil-CoA e
subunidades de proteínas Gα modificadas (Lu e Hofmann, 2006). No entanto, os
substratos fisiológicos desta enzima ainda não são conhecidos (Camp e Hofmann,
1993).
Introdução
14
A palmitoilação/despalmitoilação é uma modificação pós-traducional reversível e
dinâmica das proteínas. Ao nível fisiológico, a palmitoilação tem um papel importante
na modulação da actividade de proteínas que participam no processo de transporte
vesicular e sinalização intra e inter celular (rev. em Bijlmakers e Marsh, 2003; rev. em
E l-Husseini e Bredt, 2002; rev. em Huang e El-Husseini, 2005). É conhecido o seu
papel na associação de polipéptidos com a membrana ou citoesqueleto, prevenção de
dimerização de proteínas, restrição da sua mobilidade lateral e reciclagem de
receptores. Desta forma, é possível que a enzima PPT1 regule a função de diversas
proteínas do sistema nervoso central envolvidas na transmissão neuronal, vias de
sinalização ou transporte de proteínas (rev. em Bizzozero, 1997; rev. em Dunphy e
Linder, 1998). Assim, a deficiente actividade em PPT1 pode ter implicações
patofisiológicas ao nível destes eventos celulares e, deste modo, induzir um mau
funcionamento no sistema nervoso central, causando morte neuronal.
Proteína CLN2 / TPP1:
O gene CLN2, de 6.6-kb, está localizado no cromossoma humano 11p15 e
compreende 13 exões, que originam transcritos de 3.7-kb e 2.7-kb. Este gene codifica
um polipéptido de 563 aminoácidos com massa molecular de 61 kDa.
A glicoproteína precursora inactiva é autocataliticamente activada a pH ácido
através da remoção de um segmento N-terminal, formando-se a enzima madura
lisossomal de 46 kDa. O pH óptimo para a autoactivação (pH~3) é mais baixo do que
o pH óptimo de actividade da enzima madura (pH~4.5) que apresenta uma actividade
fraca a pH 3.0 (Ezaki et al., 2000b). O seu transporte para o lisossoma ocorre pela via
mediada pelo receptor da M6P (Andersen e McDonald, 1987; Doebber et al., 1978; Lin
e Lobel, 2001; McDonald et al., 1985; Sleat et al., 1997).
A CLN2 é uma tripeptidilaminopeptidase (TPP1), isto é, cliva tripéptidos dos
amino-terminais de péptidos com grupos α-amino livres (Junaid et al., 2000; Vines e
Warburton, 1998) com preferência por aminoácidos hidrofóbicos na posição P1
(Bernardini e Warburton, 2001). Estudos in vitro sugerem que esta proteína possui
também actividade de endopeptidase (Ezaki et al., 2000b). Estudos de modificação
química indicam que a Ser475 é o local activo nucleofílico da TPP1 (Lin et al., 2001).
Estudos mutacionais e com inibidores sugerem que esta enzima não apresenta a
Introdução
15
tríade catalítica Ser-Asp-His, característica de muitas serina proteases e lipases, mas
sim Ser475-Asp276-Glu272 (Lin et al., 2001; Oyama et al., 2005, Walus et al., 2005).
O conhecimento acerca dos substratos naturais da TPP1 é limitado. Evidências
experimentais in vitro indicam que a TPP1 poderá estar envolvida na degradação de
hormonas peptídicas (Doebber et al., 1978), péptido β – amilóide (Wisniewski et al.,
1990a; Wisniewski et al., 1990b) e subunidade c da ATP sintetase (rev. em Ezaki et
al., 1999).
Proteína CLN3:
Apesar da caracterização do gene CLN3 e da proteína correspondente ter
ocorrido na década de 90 (IBD Consortium, 1995), a função desta proteína membranar
politópica permanece desconhecida.
O gene CLN3 localiza-se no cromossoma humano 16p12.1-p11.2 e é constituído
por 15 exões, abrangendo uma região com 15-kb. Este gene produz um RNAm de 1.3
kb. A proteína CLN3 possui 438 aminoácidos (48 kDa).
A CLN3 não possui homologia com outras proteínas conhecidas. A análise in
silico, designadamente quanto ao perfil hidropático, e estudos bioquímicos sugerem
que a CLN3p possui 6 domínios transmembranares e que os terminais amino e
carboxílico estão orientados para o citossol (Ezaki et al., 2003, Kyttälä et al., 2004).
A proteína CLN3 foi localizada em vários organelos celulares, entre os quais, os
lisossomas (Järvelä et al., 1998; Kida et al., 1999), CG (Kremmidiotis et al., 1999;
Persaud-Sawin et al., 2004), núcleo, membrana celular (Margraf et al.1999),
mitocôndria (Katz et al., 1997) e lipid rafts (Rakheja et al., 2004). Estudos bioquímicos,
moleculares e celulares sugerem que a proteína está localizada no sistema
endossomal/lisossomal em células neuronais (Kyttälä et al., 2004) e em células não
neuronais (Järvelä et al., 1998; Ezaki et al., 2003; Persaud-Sawin et al., 2004). Em
células neuronais, a proteína foi encontrada na região sináptica, sugerindo uma
possível função extra-lisossomal (Haskell et al., 2000; Järvelä et al., 1999; Luiro et al.,
2001). Existem também evidências experimentais que sugerem uma função
neuroprotectora (Persaud-Sawin et al., 2004; Rylova et al., 2002). Dada a sua
natureza politópica e a relação distante à família de transportadores de nucleósidos
SLC29 (rev. em Baldwin et al., 2004), é possível que a CLN3p desempenhe uma
Introdução
16
função de transporte e/ou canal. A interacção de segmentos citoplasmáticos de CLN3p
com a proteína Hook1 que estabelece ligação aos microtúbulos e o facto de Hook1
interactuar directamente com as proteínas Rab7, Rab9 e Rab11 (Luiro et al., 2004),
sugere que a CLN3p poderá desempenhar funções relacionadas com o citoesqueleto
e tráfego endomembranar. Recentemente, foi identificado na proteína CLN3 um
domínio de ligação à galactosilceramida (GalCer), um lípido especialmente abundante
nas membranas neuronais. Esta observação sugere o envolvimento da proteína CLN3
no transporte deste cerebrosídeo para a MP (Persaud-Sawin et al., 2004).
Existem também observações em doentes JNCL e em ratinhos CLN3 knock-out,
que associam a proteína CLN3 à morte celular Neste processo podem estar
implicadas quer a apoptose, em que a CLN3 desempenhará um papel protector
(Persaud-Sawin et al., 2002; Puranam et al., 1999), quer a autofagia (Lane et al., 1996;
rev. em Mitchison et al., 2004; Persaud-Sawin et al., 2005; Seigel et al., 2002). O papel
protector da CLN3 na morte celular poderá ocorrer através da modulação de síntese
de ceramida que é um lípido indutor de apoptose dependente de caspases (Persaud-
Sawin et al., 2002).
Proteína CLN5:
O gene CLN5 encontra-se localizado no cromossoma 13q22 e abrange uma
região de 13-kb no DNA genómico. Este gene é constituído por 4 exões e codifica para
uma proteína de 407 aminoácidos (46 kDa). Três transcritos de 2.0, 3.0 e 4.5 kb foram
detectados em diversos tecidos humanos, incluindo o cérebro (Savukoski et al., 1998).
A sequência de aminoácidos da proteína não tem homologia com nenhuma proteína
identificada. A análise in silico revela a existência de 4 potenciais codões de iniciação
e a ausência de péptido sinal no polipéptido produzido a partir do primeiro codão de
iniciação. O segmento amino terminal até ao terceiro resíduo de metionina não é
conservado. Estudos de tradução in vitro e estudos de transfecção e marcação
metabólica sugerem que os 4 codões de iniciação podem ser utilizados in vivo
originando polipéptidos de 47, 44, 42 e 40 kDa (Isosomppi et al., 2002; Vesa et al.,
2002). Em células COS-1 transfectadas com cDNA CLN5 foi observado um polipéptido
glicosilado de 60 kDa. Estudos de co-imunoprecipitação e ensaios de interacção de
proteínas in vitro sugerem interacção de CLN5 com os polipéptidos CLN2 e CLN3
(Vesa et al., 2002).
Introdução
17
A análise in silico sugere que a CLN5 é uma proteína com 2 domínios
membranares (Savukoski et al., 1998). Em células BHK-21 transfectadas com cDNA
CLN5 foram observados polipéptidos solúveis (Isosomppi et al., 2002; Vesa et al.,
2002) com excepção do polipéptido mais longo, resultante da utilização do primeiro
codão de iniciação, de natureza membranar (Vesa et al., 2002). Recentemente, Bessa
e colaboradores (2006) observaram em extractos celulares de fibroblastos, 4
polipéptidos membranares de peso molecular semelhante aos observados in vitro.
Em estudos de imunofluorescência com células BHK-21 transfectadas, a
proteína CLN5 foi localizada principalmente nos lisossomas, RE e CG, reflectindo
assim, o tráfego intracelular da proteína através dos organelos da via biossintética
(Isosomppi et al., 2002). No entanto, estudos mais recentes indicam a presença da
proteína endógena na MP em domínios membranares que co-localizam com a
conexina-43, uma proteína marcadora das junções comunicantes ou junções de hiato
(Bessa C, comunicação pessoal). O significado fisiopatológico desta observação não é
ainda conhecido.
Proteína CLN6:
Este gene localiza-se no cromossoma 15q23. O gene CLN6, de 22.7-kb,
compreende 7 exões. Em vários tecidos humanos, incluindo o cérebro, foi detectado
um RNAm de 2.4-kb (Gao et al., 2002; Wheeler et al., 2002). O gene CLN6 codifica
para um polipéptido de 311 aminoácidos (36 kDa). A análise da sequência de
aminoácidos revela ausência de locais potenciais de N-glicosilação (Asp-X-Ser/Thr,
X=qualquer aminoácido) e de sinais clássicos de endereçamento para o lisossoma. No
entanto, a sequência N-terminal RRR (aminoácidos 5-7) presente na CLN6p foi
previamente descrita numa proteína membranar tipo II do RE, a glucosidase I (Hardt et
al., 2003). Adicionalmente, no segmento N-terminal de CLN6p codificado pelo exão 1
(aminoácidos 1-28) foi detectado um sinal peptídico potencialmente envolvido no
endereçamento da proteína para a mitocôndria (Gao et al., 2002).
Em termos topológicos, a proteína possui um domínio N-terminal citoplasmático,
7 domínios transmembranares e um domínio C-terminal luminal (Heine et al., 2004,
Heine et al., 2007).
Introdução
18
Estudos de imunocitofluorescência da proteína sobre expressa em células
BHK21 e HEK293 (Mole et al., 2004 e Heine et al., 2007) revelaram a presença da
proteína CLN6 no RE.
Proteína CLN7 / MFSD8:
O gene CLN7 (45.5-kb) está localizado no cromossoma humano 4q28.1-q28.2 e
compreende 11 exões. O RNAm de 5-kb codifica um polipéptido de 518 aminoácidos
com massa molecular de 58 kDa. O perfil hidropático sugere uma organização
topológica com 12 domínios transmembranares (Siintola et al., 2007). A CLN7p
pertence a uma das maiores classes de proteínas transportadoras (permeases)
(MFSD, Major facilitator superfamily). Estudos recentes de imunofluorescência co-
localizaram a proteína CLN7 com proteínas marcadoras do lisossoma (Siintola et al.,
2007). No entanto, a sua função não é presentemente conhecida.
Proteína CLN8:
O gene CLN8 localiza-se no cromossoma 8p23q e abrange uma região de DNA
genómico com cerca de 20-kb. Este gene, constituído por 2 exões, produz transcriptos
de 1.4, 3.4, 7.5-Kb. Este gene codifica para uma proteína de 286 aminoácidos (~
33kDa). A análise in silico prevê 6 domínios transmembranares, ausência de sinal
peptídico e de N-glicosilação. Estudos de imunofluorescência em células neuronais e
não neuronais transfectadas com cDNA CLN8 sugerem a sua localização no RE e no
compartimento, entre o RE e o CG (Lonka et al., 2004).
A função desta proteína não é conhecida. No entanto, a CLN8p apresenta
domínios homólogos à família TLC de proteínas eucarióticas (rev. em Winter e
Ponting, 2002). Membros desta família de proteínas facilitam a translocação de
cadeias polipéptídicas novas para o RE, a exportação de proteínas ancoradas ao
glicosilfosfatidilinositol para fora do RE (Barz e Walter, 1999; Hegde et al., 1998;
Heinrich et al., 2000) e estão associadas à síntese e transporte de lípidos, podendo
ainda actuar como sensores de lípidos intracelulares. Proteínas desta família não
partilham grande similaridade a nível de aminoácidos, mas possuem um domínio
conservado com pelo menos cinco α hélices transmembranares e alguns aminoácidos
altamente conservados. Dados recentes obtidos em leveduras (Guillas et al., 2001;
Introdução
19
Schorling et al., 2001) e em células de mamíferos (Mizutani et al., 2005; Riebeling et
al., 2003; Venkataraman et al., 2002) sugerem um papel das proteínas TLC na
regulação da síntese de ceramida dependente de acil-CoA.
Proteína CLN10 / CTSD:
O gene CTSD humano de 16.3-kb localiza-se no cromossoma 11p15.5, contém 9
exões e codifica para uma proteína de 412 aminoácidos, a CTSD, uma protease
aspártica lisossomal. Esta enzima é sintetizada no RE como uma pré-proenzima
inactiva de 53 kDa, que sofre várias modificações pós-transducionais durante o
transporte para os lisossomas. Após clivagem co-transducional do péptido sinal N-
terminal, a pró-CTSD é N-glicosilada em 2 resíduos de asparagina. Os N-
oligossacáridos possuem resíduos de M6P, possibilitando a segregação da enzima
para o lisossoma pela via clássica da M6P. No entanto, dependendo do tipo de célula,
esta via pode não ser exclusiva, isto é, o transporte para o lisossoma pode também
ocorrer de modo independente da M6P (Storch e Braulke, 2005). No compartimento
endossomal, a clivagem proteolítica de 44 aminoácidos do propéptido resulta na forma
activa precursora de cadeia simples com 47 kDa (rev. em Kyttälä et al., 2006). A
maturação proteolítica final ocorre nos lisossomas e é dependente de proteases
cisteína, resultando na formação de 2 cadeias polipeptídicas de 31 e 14 kDa ligadas
por ligações dissulfureto (Gieselmann et al., 1983; Gieselmann et al., 1985),
provavelmente com exclusão de seis aminoácidos posicionados entre as cadeias
(Kobayashi et al.,1992). Ao contrário da proteína humana, a proteína madura isolada
de ratos e ratinho é constituída por um único polipéptido (Storch e Braulke, 2005). No
entanto, a implicação fisiológico desta observação não é presentemente conhecida.
1.3.3. Heterogeneidade genética e alélica
Mais de uma centena de mutações foram descritas
(http://www.ucl.ac.uk/ncl/mutation.shtml) nos 8 genes implicados na doença (Tabela
1.3). A forma mais prevalente da doença é a variante CLN3 (OMIM 204200), com mais
de 500 famílias identificadas, seguindo-se a variante CLN2 (OMIM 204500). As formas
CLN1 (OMIM 256730), CLN5 (OMIM 256731), CLN6 (OMIM 601780), CLN7 (OMIM
610951), CLN8 (OMIM 600143) e CLN10 (OMIM 610127) são raras na população em
Introdução
20
geral (rev. Siintola et al., 2006a). Contudo, as formas CLN1, CLN5 e CLN8 são
particularmente frequentes na Finlândia (rev. em Siintola et al., 2006a), e
recentemente foram descritos os primeiros doentes de origem não finlandesa
afectados com a variante CLN5 (Bessa et al., 2006; Pineda-Trujillo et al., 2005) e a
variante CLN8 (Striano et al., 2006).
Mutações prevalentes foram identificadas nos genes CLN1, CLN2 e CLN3
(Tabela 1.3). Nos restantes genes, a maioria das mutações identificadas são
esporádicas.
Tabela 1.3: Base genética da Ceroido Lipofuscinose Neuronal.
Forma Proteína Localização Localização Mutações # mutações/clínica mutada proteína do gene comuns famílias
CoNCLvLINCL Protease aspártica Lisossomal 11p15.5 desconhecida 3 / 3(CLN10) (CTSD) solúvel
INCL Palmitoil-tioesterase 1 Lisossomal 1p32 c.223A>C / T75P 45 / 171(CLN1) (TPP1) solúvel c.364A>T / R122W
c.451 C>T / R151X
LINCL Tripeptidil-peptidase 1 Lisossomal 11p15 IVS5-1G>C / g.3556 G>C 54 / 318(CLN2) (TPP1, protease serina) solúvel c.622C>T / R208X
JNCL Batenina, CLN3 Transmembranar 16p12 c.462-677del (1.02-kb del) 40 / >400(CLN3) RE/Golgi/MP/Lis
vLINCL CLN5 Glicoproteína 13q22 c.1175delAT / Y392X 7 / 33(CLN5, v. Finlandesa)
vLINCL CLN6 Transmembranar 15q21-q23 desconhecida 22 / >41(CLN6, v. Cigana/Indiana) RE
vLINCL CLN7 Transmembranar 4q28 desconhecida 5 / 7
vLINCL CLN8 Transmembranar 8p23 c.70C>G / R24G 10 / 24 (CLN8, EPMR) RE-ERIGC
Forma Proteína Localização Localização Mutações # mutações/clínica mutada proteína do gene comuns famílias
CoNCLvLINCL Protease aspártica Lisossomal 11p15.5 desconhecida 3 / 3(CLN10) (CTSD) solúvel
INCL Palmitoil-tioesterase 1 Lisossomal 1p32 c.223A>C / T75P 45 / 171(CLN1) (TPP1) solúvel c.364A>T / R122W
c.451 C>T / R151X
LINCL Tripeptidil-peptidase 1 Lisossomal 11p15 IVS5-1G>C / g.3556 G>C 54 / 318(CLN2) (TPP1, protease serina) solúvel c.622C>T / R208X
JNCL Batenina, CLN3 Transmembranar 16p12 c.462-677del (1.02-kb del) 40 / >400(CLN3) RE/Golgi/MP/Lis
vLINCL CLN5 Glicoproteína 13q22 c.1175delAT / Y392X 7 / 33(CLN5, v. Finlandesa)
vLINCL CLN6 Transmembranar 15q21-q23 desconhecida 22 / >41(CLN6, v. Cigana/Indiana) RE
vLINCL CLN7 Transmembranar 4q28 desconhecida 5 / 7
vLINCL CLN8 Transmembranar 8p23 c.70C>G / R24G 10 / 24 (CLN8, EPMR) RE-ERIGC
Introdução
21
1.3.4. Fisiopatologia
O material acumulado na forma infantil clássica (associada ao gene CLN1)
corresponde, aproximadamente, a 35% de lípidos e 45% de proteínas (principalmente
saposinas A e D) (Tyynelä et al., 1993). Em tecidos de doentes com a forma CLN10
também está documentada a acumulação das saposinas A e D (Siintola et al., 2006b).
Em cérebro de doentes com a forma infantil-tardia (CLN2), a subunidade c da
ATP sintetase mitocondrial, é o principal componente das inclusões lisossomais,
constituindo cerca de 85% do material proteico acumulado (Kominami et al., 1992,
Palmer et al., 1992). Esta proteína foi detectada, embora em menor quantidade, em
diversos tecidos e órgãos extra-neuronais.
Em doentes com a forma juvenil (CLN3), a subunidade c da ATP sintetase
constitui cerca de 20% do material proteico acumulado (Palmer et al., 1992). Outros
compostos acumulados incluem dolicóis fosforilados (Hall e Patrick, 1985; Pullarkat et
al., 1988) e o péptido β-amilóide (Wisniewski et al., 1990a, Wisniewski et al., 1990b).
Os níveis de numerosas enzimas lisossomais estão também significativamente
aumentados no cérebro destes doentes (Sleat et al., 1998; Pohl et al., 2007).
Nas variantes CLN5 a CLN8, similarmente à CLN2, o material acumulado contém
principalmente a subunidade c da ATP sintetase mitocondrial (Elleder et al., 1997). No
entanto, nas variantes CLN5 e CLN8 também foram detectadas as saposinas A e D
(Tyynelä et al., 1995, rev. em Tyynelä et al., 1997; rev. em Ranta et al., 2001). Na
variante CLN8 foi também observado o péptido β-amilóide. (rev. em Ranta et al.,
2001).
O significado fisiopatológico da acumulação diferencial das saposinas A e D
versus subunidade c da ATP sintetase em diferentes variantes da patologia não é
presentemente conhecido.
As saposinas são glicoproteínas que derivam de uma proteína precursora
comum (prosaposina) que é clivada proteoliticamente no lisossoma (Hiesberg et al.,
1998). Estas proteínas actuam como cofactores proteicos necessários para a
degradação in vivo de esfingolípidos com cadeias curtas de oligossacáridos. A
saposina A é indispensável para a actividade catabólica da β-galactosilceramidase. A
função da saposina D não é conhecida, embora existam evidências experimentais que
sugerem a sua participação na degradação da ceramida. Um outro co-factor proteico,
Introdução
22
o activador GM2, auxilia a enzima lisossomal β-hexosaminidase A na degradação do
gangliósido GM2 em gangliósido GM3 (Sandhoff et al, 2001). O transporte destas
proteínas activadoras para o lisossoma é mediado pela sortilina (rev. em Ni et al.,
2006). Se as proteínas deficientes nas variantes CLN1, CLN5, CLN8 e CLN10
desempenham uma função na maturação e/ou actividade biológica destas saposinas
não é presentemente conhecido.
Relativamente à acumulação da subunidade c da ATP sintetase observada na
maioria das variantes de NCL (CLN2, CLN3, CLN5-CLN8), vários estudos (Ezaki et al.,
1999; Ezaki et al., 2000a; rev. em Junaid et al., 2000) sugerem que a degradação da
subunidade c é iniciada pela TPP1 e continuada pela catepsina D. Esta subunidade é
ainda especialmente sensível ao pH intralisossomal elevado (Kominami, 2002), que é
uma característica partilhada pela CLN2p, CLN3p e CLN6p (Holopainen et al., 2001).
No entanto, a importância da acumulação da subunidade c no mecanismo de
neurodegeneração permanece por esclarecer.
A razão pela qual a deficiência em proteínas NCL origina neurodegeneração
selectiva permanece desconhecida. Estudos diversos recorrendo a diferentes
abordagens experimentais, desde estudos de biologia celular e molecular a cDNA
microarrays, utilizando amostras de modelos animais naturais ou artificiais, sugerem
vários mecanismos moleculares potencialmente envolvidos na resposta inflamatória
(Qiao et al., 2007; Teixeira et al., 2006), defeitos ao nível do tráfego vesicular
intracelular de proteínas e lípidos (Luiro et al. 2004; Persaud-Sawin et al., 2004;
Rakheja et al., 2004; Teixeira et al., 2006), transporte de vesículas sinápticas,
alterações do pH lisossomal (Holopainen et al., 2001; Padilla-López e Pearce, 2006),
apoptose (Cho e Dawnson, 2000; Dhar et al., 2002; Heine et al., 2003; Persaud-Sawin
et al., 2002; Rylova et al., 2002; Teixeira et al., 2006), e outros mecanismos, como por
exemplo a remodelação da matriz extracelular (Teixeira et al., 2006), na patogénese
da NCL e de forma não mutuamente exclusiva.
Se populações de neurónios apresentam sensibilidade diferencial a estes
mecanismos moleculares é uma questão que não está esclarecida.
O grau de envolvimento lisossomal, primário ou secundário, na patogénese da
doença, o conhecimento da função das proteínas e a composição exacta das
inclusões lisossomais são questões essenciais a investigar no futuro para uma melhor
compreensão da etio-patologia da NCL. Adicionalmente, é provável que mais genes
Introdução
23
estejam envolvidos na patologia. De facto, foi descrita uma proteína homóloga da
PPT1, a proteína PPT2, que hidrolisa a palmitoil-CoA mas não palmitoil cisteínas
(Soyombo e Hofmann, 1997; Soyombo et al., 1999). Em modelos artificiais produzidos
por inactivação do gene PPT2 foi observado um fenótipo semelhante a NCL mas com
características viscerais pouco comuns (Gupta et al., 2003). Porém, a deficiência
natural em PPT2 não foi detectada até à data. Uma enzima distinta mas com
actividade similar à TPP1, a TPP2, localiza-se no citossol, onde participa na
degradação de proteínas intracelulares e no processamento antigénico (rev. em
Tomkinson e Lindas, 2005). Tal como para a PPT2, a deficiência natural em TPP2 não
foi detectada até à data. Outras proteínas potencialmente associadas ao fenótipo NCL
são as pertencentes à família de canais de cloreto, nomeadamente CLC-3 (Yoshikawa
et al., 2002) e CLC-7 (Kasper et al., 2005).
De salientar ainda que existem várias evidências que sugerem que estas
proteínas poderão participar numa via celular comum cujos intervenientes moleculares
ainda não são conhecidos. De facto, estudos de co-imunoprecipitação, ensaios de
interacção in vitro e estudos de co-localização por imunofluorescência com a proteína
endógena ou com a proteína sobre expressa sugerem múltiplas interacções entre
proteínas CLN (Persaud-Sawin et al., 2007; Vesa et al., 2002;). Os resultados
publicados por Vesa e colaboradores (2002) sugerem que a proteína CLN5 interactua
com as proteínas CLN2 e CLN3. O aumento da actividade da enzima CLN2/TPP1
geralmente observado em células de doentes com deficiência na proteína CLN3 (Sleat
et al., 1998) ou na proteína CLN5 (Vesa et al., 2002) traduz, assim, a redundância
funcional deste sistema de proteínas. Mais recentemente (Persaud-Sawin et al., 2007),
estudos de co-localização da proteína endógena de fibroblastos humanos cultivados
(FHC) sugerem interacções entre as proteínas CLN2-CLN8, CLN2-CLN3, CLN3-CLN6,
CLN3-CLN8 e CLN6-CLN8.
1.3.5. Diagnóstico
A NCL é considerada a patologia neurodegenerativa hereditária mais comum na
infância. A sua prevalência na população mundial varia entre 1:20.000 e 1:100.000,
enquanto que na população finlandesa está descrita a prevalência de 1:12.500 nados
vivos (rev. em Mole, 1998).
Introdução
24
O diagnóstico da NCL é estabelecido segundo critérios clínico-patológicos,
bioquímicos e genéticos. A informação clínica e patológica é útil para a definição da
estratégia a adoptar no estudo diferencial dos genes envolvidos na patologia (Figura
1.5). A actividade deficiente das enzimas PPT1, TPP1 ou CTSD, em extractos
celulares de leucócitos obtidos a partir de sangue periférico ou de fibroblastos
cultivados a partir de biópsias de pele, estabelece o diagnóstico das formas CLN1,
CLN2 ou CLN10, respectivamente. No caso da actividade destas enzimas se
encontrar dentro da gama controlo de referência, será necessário proceder ao rastreio
de mutações nos genes CLN3, CLN5-CLN8. A existência de mutações prevalentes
poderá facilitar esta etapa do diagnóstico laboratorial (rev. em Williams et al., 2006).
Uma vez identificada a(s) alteração(ões) no gene respectivo, será importante
avaliar a sua causalidade. Este aspecto é particularmente relevante no caso de
mutações esporádicas com mecanismo molecular patogénico desconhecido. Nestes
casos, deverá proceder-se à caracterização funcional da alteração genética
encontrada no DNA genómico e confirmada ao nível do cDNA, recorrendo a uma
abordagem molecular, celular e fisiológica.
Em doenças raras e de etiologia ainda pouco conhecida, como é o caso da
doença NCL, uma actividade integrada de prestação de serviços de diagnóstico
genético e de investigação é importante para acelerar o conhecimento da patogénese
molecular destas doenças genéticas.
Figura 1.5: Estratégia de estudo bioquímico e molecular visando o diagnóstico das variantes genéticas de NCL. ME- Microscopia electrónica.
Actividade enzimática
PPT1 TPP1 CTSD PPT1, TPP1 e CTSD
Reduzida Reduzida Reduzida Normal
CLN1 CLN2 CLN3 / CLN5 / CLN6 / CLN7 / CLN8
Forma Congénita / Infantil / Infantil-tardia / Juvenil /Adulta
Estudo molecular
CLN3: delecção 1-kb1
Ausente Presente
CLN3
Rastreio de mutações
Estudo patológico por ME
CLN10
Introdução
25
1.3.6. Tratamento
Uma vez que, actualmente, não existe um tratamento efectivo para a NCL, a
única forma de actuar na diminuição da sua incidência é através da prevenção da
patologia nas famílias em risco. Nesse sentido procede-se, inicialmente, à
identificação de portadores através da pesquisa da mutação familiar, e
subsequentemente à identificação dos casais em risco para a patologia. A actividade
de prevenção inclui, por isso, o diagnóstico molecular pós-natal, o aconselhamento
genético e, eventualmente, o diagnóstico pré-natal.
Em termos terapêuticos, o principal objectivo consiste em aliviar os sintomas da
doença, incluindo a epilepsia, os problemas comportamentais e a depressão.
Adicionalmente a fisioterapia e a terapia ocupacional poderão ajudar a retardar as
debilidades físicas nos doentes com NCL (rev. em Hobert e Dawnson, 2006). O uso de
suplementos antioxidantes para o tratamento da NCL tem sido investigado desde que
se observou que granulócitos de doentes que tinham uma actividade peroxidase
reduzida, e mais especificamente, que eritrócitos de doentes que apresentavam um
decréscimo da actividade da glutationa peroxidase, aumentaram os níveis de
actividade enzimática com suplementos de selénio (Westermark e Sandholm, 1977).
Os principais dados deste estudo demonstram que o tratamento com antioxidantes em
doentes JNCL parece abrandar, mas não parar, a progressão da doença (Santavuori e
Moren, 1977; Santavuori et al., 1989).
Várias abordagens terapêuticas têm sido investigadas durante os últimos anos
(rev. em Hobert e Dawson et al., 2006), nomeadamente a terapia com chaperones
químicos, a terapia de redução de substrato, a terapia de substituição enzimática, a
terapia com células estaminais e a terapia génica. A sua aplicabilidade ao tratamento
da NCL é a seguir discutida.
Terapia com chaperones químicos
O enrolamento anormal das proteínas está na base da patogénese de várias
doenças neurodegenerativas como a doença de Huntington e a doença Alzheimer
(rev. em Cohen e Kelly, 2003).
Introdução
26
Uma vez sintetizadas, as proteínas adquirem a sua conformação tridimensional
nativa, de forma a ficarem no estado termodinamicamente mais estável.
Frequentemente, o enrolamento ocorre com a ajuda de proteínas chaperones.
Mutações missense resultam frequentemente em proteínas mal enroladas, e portanto,
com uma estabilidade termodinâmica alterada o que, consequentemente, origina
redução ou até mesmo perda, de actividade biológica. Estudos in vitro, recentemente
realizados (rev. em Hobert e Dawnson, 2006), demonstraram que a adição de
compostos de baixo peso molecular, como inibidores de enzimas e/ou substratos,
podem aumentar a actividade das enzimas mutadas. Tal acontece porque os
inibidores e/ou substratos funcionam como moduladores conformacionais
estabilizando e reestruturando a proteína mutada, restituindo-lhe, pelo menos
parcialmente, actividade biológica.
Em princípio, inibidores de hidrolases podem ser usados para aumentar a
actividade enzimática de CLN1/PPT1 e CLN2/TPP1 quando mutações missense estão
presentes nestas proteínas. No entanto, uma das dificuldades deverá ser o transporte
dos inibidores ao longo da barreira hematoencefálica (rev. em Hobert e Dawnson,
2006). No entanto, a vantagem da terapia com chaperones, reside no facto deste
método conseguir corrigir os enrolamentos quer de proteínas solúveis quer de
proteínas de membrana, sendo potencialmente úteis para o tratamento das diferentes
variantes da NCL causadas por mutações missense.
Terapia de redução do substrato
A enzima PPT1 hidrolisa os substratos palmitoil-cisteína e palmitoil-CoA (Camp e
Hofmann, 1993; Camp et al., 1994). A sua deficiência origina uma acumulação de
péptidos palmitoilados nas células de doentes com a forma INCL/CLN1 (Lu et al.,
1996). A cisteamina hidroliza o palmitoil-CoA in vitro, embora com uma velocidade
substancialmente inferior à da degradação da cistina, e reduz a acumulação de
substratos em células cultivadas (Lu et al., 2002). Presentemente, o efeito de um
fármaco que contém a substância activa cisteamina (Cystagon), na degradação das
inclusões lisossomais que se observam nestes doentes está a ser estudado no
National Institutes of Health Clinical Center, Bethesda, USA.
Introdução
27
Terapia de substituição enzimática (ERT)
A doença de Gaucher foi a primeira DSL a ser tratada com sucesso com ERT
(Rice et al., 1996; Schiffmann et al., 1997). O facto da LINCL/TPP1 ser igualmente
uma doença monogénica de sobrecarga lisossomal causada pela deficiência numa
enzima solúvel que utiliza a via de transporte dependente da M6P, levou a que a
aplicação da ERT para o tratamento da deficiência em TPP1 fosse investigada. A
forma de proenzima da proteína TPP1 foi expressa em células CHO, purificada e
estudada (Lin e Lobel, 2001). Fibroblastos de doentes com deficiência em TPP1 e
neurónios de ratos em cultura foram capazes de internalizar a enzima recombinante
marcada com a M6P. Adicionalmente, foi observada uma redução na acumulação da
subunidade c da ATP sintetase, indicando que a enzima foi capaz de degradar o
principal composto que se acumula nesta doença (Lin e Lobel, 2001).
Assim, a ERT poderá vir a ser uma opção terapêutica para as formas CLN1,
CLN2 e CLN10, embora se coloque, presentemente, o problema da transposição
eficiente da enzima através da barreira hematoencefálica.
Terapia com células estaminais
Em ratinhos knockout para a enzima PPT1 que receberam enxertos de células
estaminais neuronais foi observado o aumento da actividade enzimática, a redução da
quantidade de material acumulado nas células neuronais, neuroprotecção e uma maior
taxa de sobrevivência (rev. em Hobert e Dawson, 2006). Teste de segurança e eficácia
foram já efectuados em ratinho knockout e em primatas não humanos (Steiner R,
comunicação pessoal, Oregon Health and Science University, USA, StemCells Inc.).
Terapia génica
Vários estudos (Crystal et al., 2004; Passini et al., 2006; Hacket et al., 2005) em
modelos murinos da INCL/CLN1 e LINCL/CLN2 sugerem que a terapia génica directa
no SNC utilizando o adenovirus associado (AAV), resulta no aumento da actividade
enzimática e melhoria da condição fisiopatológica. Testes de segurança e eficácia
foram efectuados em modelos murinos, entre outros, e presentemente encontra-se em
curso, na Universidade Cornell (Nova Iorque, EUA), um ensaio clínico de fase I que
Introdução
28
visa avaliar o nível de segurança correspondente à administração intracerebral de um
vector recombinante viral em crianças com a forma LINCL da doença.
1.3.7. Modelos animais
Desde que a NCL foi reconhecida como um grupo etio-patológico específico,
doenças com características semelhantes à NCL foram descritas em vários animais
(Bildfell et al., 1995; Bronson et al., 1993; Goebel et al., 1988; Palmer et al., 1997;
http://www.ucl.ac.uk/ncl/mutation.shtml). Entre os animais cuja doença ocorre
naturalmente, e que têm sido usados como modelos de estudo para as diferentes
formas de NCL, existe o cão Longhaired Dachshund (Canine CLN2/TPPI) como
modelo de estudo da forma LINCL; o cão Border collie (Canine CLN5), a ovelha
Borderdale, e a vaca de Devon (Bovine CLN5) como modelos para a forma
vLINCL/CLN5; ovelhas South Hampshire, merinos (Ovine CLN6) e o ratinho nclf
(CLN6) causado pela inserção de uma base no exão 4 (c.316dupC), como modelo de
estudo da forma vLINCL/CLN6; o cão Setter Inglês (Canine CLN8); ratinhos mnd
(motor neuronal degeneration) (CLN8), como modelo de estudo da forma vLINCL
(CLN8); o Bulldog americano (Canine CTSD/CLN10); e a ovelha Swedish landrace
(Ovine CoNCL/CTSD) como modelos de estudo para a forma congénita da NCL.
Vários modelos animais (White Swedish Landrace sheep ou Bulldogs americanos com
aparecimento tardio dos primeiros sintomas) foram descritos com mutações no gene
CTSD, exibindo sintomas idênticos aos observados numa forma severa de NCL
congénita (Awano et al., 2006).
O desenvolvimento tecnológico ao nível da manipulação de genes permitiu criar
estirpes de ratinhos com alterações específicas em genes ortólogos aos genes NCL.
Presentemente existem modelos murinos para as variantes CLN1, CLN3 e CLN5 (rev.
em Jalanko et al., 2006).
A existência de modelos animais naturais e artificiais facilita a investigação dos
mecanismos moleculares etio-patogénicos e a descoberta de novas abordagens
terapêuticas, até porque, para algumas variantes da doença existe um número muito
reduzido de doentes identificados a nível mundial.
Capítulo 2
Objectivos
Objectivos
31
2. Objectivos
O Centro de Genética Médica Dr. Jacinto Magalhães (CGMJM) do Instituto
Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge, localizado no Porto, dedica-se ao estudo da
Ceroido Lipofuscinose Neuronal desde 2000, integrando a actividade assistencial de
diagnóstico genético desta doença com a investigação da sua patogénese molecular
através da caracterização funcional de alterações genéticas.
Na população portuguesa, a incidência da patologia foi estimada em 1:65.000
nascimentos (Teixeira et al., 2003a). Em virtude da actividade desenvolvida no
CGMJM, desde 2000 foram identificados 53 doentes pertencentes a 43 famílias
portuguesas. O estudo bioquímico e genético revelou que 44% desses doentes eram
afectados com uma das variantes clássicas da NCL, CLN1, CLN2 ou CLN3 (Teixeira
et al., 2003a). Após a identificação do gene CLN6, em 2002 (Gao et al., 2002; Wheeler
et al., 2002), foram identificadas 5 famílias portuguesas afectadas com esta variante
da doença (Teixeira et al., 2003b).
Presentemente pouco se conhece acerca da patogénese molecular da variante
CLN6. Até à data esta variante foi identificada em cerca de 50 famílias de diferentes
origens geográficas afectadas com esta doença, nas quais foram identificadas 28
mutações, uma das quais de natureza polimórfica (http://www.ucl.ac.uk/ncl/cln6.shtml).
Cerca de 50% das mutações identificadas no gene CLN6 são do tipo missense, mas o
seu mecanismo molecular patogénico não é ainda conhecido. Em estudos de
microscopia de imunofluorescência a proteína CLN6 foi observada no RE (Heine et al.,
2004; Mole et al., 2004). Este organelo já anteriormente tinha sido implicado na
fisiopatologia da NCL em virtude de uma outra proteína, a CLN8, ter sido localizada no
RE (Lonka et al., 2004). Das 8 proteínas caracterizadas até à presente data, apenas a
CLN6 e a CLN8 não foram observadas no compartimento lisossomal. Apesar da
função lisossomal se encontrar comprometida em todas as variantes da NCL, hoje
sabe-se que nem todas as proteínas implicadas na doença são proteínas lisossomais.
Assim, o presente trabalho teve como objectivo a caracterização da localização
intracelular da proteína CLN6 visando contribuir para o desenvolvimento futuro de
estudos funcionais e subsequente compreensão dos mecanismos moleculares
fisiopatológicos associados a alterações específicas no gene CLN6. Para a
concretização desses objectivos foram produzidos anticorpos contra péptidos
Objectivos
32
específicos da proteína CLN6 humana, que inicialmente foram caracterizados em
termos de sensibilidade e de especificidade. Estes anticorpos detectam níveis
endógenos de proteína, constituindo, por isso, uma ferramenta importante para
prosseguir os estudos de biologia celular e molecular nesta variante da NCL.
Os estudos efectuados e descritos no presente trabalho de mestrado estão
inseridos num projecto de investigação em curso, financiado pela Fundação da
Ciência e Tecnologia (FCT/POCTI/SAL-MMO/55374/04), que visa contribuir para o
conhecimento da fisiopatologia da NCL, em especial das variantes raras da doença
associadas à deficiência de proteínas não lisossomais.
Capítulo 3
Materiais e Métodos
Materiais e Métodos
35
3. Materiais e Métodos
3.1 Anticorpos
Os anticorpos policlonais CLN6/34 e CLN6/35 foram produzidos em coelho
utilizando péptidos sintéticos, respectivamente MEATRRRQHLGATGGP (aminoácidos
1-16) e KLIERSPRTLPRSIT (aminoácidos 99-113) acoplados a KLH (imunogénio). O
antisoro foi imunopurificado contra o péptido respectivo utilizando a matriz AF-Amino
TOYOPEARL 650M, com uma eficiência de acoplamento de 98%. A eluição foi
efectuada com 100 mM glicina pH 2.5 (Eurogentec, Belgium).
O anticorpo policlonal CLN6/LAL foi produzido em galinha utilizando o péptido
sintético LALVLHQKRKRLFLDS (aminoácidos 242-257) (Davids Biotechnologie
GmbH, Alemanha).
O anticorpo policlonal CLN6/RMB foi oferta da Prof. R-M. Boustany (Duke
University Medical Center, Durham, USA). Este anticorpo foi produzido em ovelha
utilizando o péptido sintético corrrespondente aos aminoácidos 284-301.
Na Tabela 3.1 são resumidos os anticorpos primários e secundários que foram
utilizados no presente estudo bem como a respectiva diluição de trabalho.
3.2. Amostras biológicas
Para a realização deste trabalho foram utilizadas células cultivadas e
crioconservadas em azoto líquido, nomeadamente fibroblastos de pele de doentes
com NCL. Para a utilização de amostras biológicas de doentes em estudos de
investigação, foi obtido consentimento informado e o projecto de investigação em que
os estudos se inserem aprovado pela Comissão de Ética do ex-Instituto de Genética
Médica Dr. Jacinto Magalhães.
As características clínico-patológicas, o perfil enzimático da CLN1/PPT1 e
CLN2/TPP1, e o genótipo dos doentes portugueses com NCL incluídos no presente
trabalho foram caracterizados em estudos prévios (Bessa et al., 2006; Bessa et al.,
2007; Teixeira et al., 2003a; Teixeira et al., 2003b) e são apresentados na Tabela 3.2.
A nomenclatura das mutações está de acordo com as recomendações internacionais
Materiais e Métodos
36
(den Dunnen e Antonarakis, 2000). A natureza polimórfica das mutações missense foi
avaliada através da pesquisa da alteração génica em 100 alelos de indivíduos
portugueses saudáveis, sem relação familiar conhecida entre si ou com as famílias de
NCL estudadas. Adicionalmente, efectuou-se a análise in silico da causalidade das
mutações missense recorrendo a 4 programas bioinformáticos que analisam as
características biofísicas dos aminoácidos, informação estrutural e/ou filogenética:
SIFT, Sorting Intolerant From Tolerant (http://blocks.fhcrc.org/sift/SIFT.html), Align-
GVGD (http://agvgd.iarc.fr) e Panther (http://www.pantherdb.org/) (Mathe et al., 2006;
Ng e Henikoff, 2001; Ng e Henikoff, 2002; Tavtigian et al., 2006; Thomas et al., 2003).
Tabela 3.1: Descrição dos anticorpos usados no protocolo da imunofluorescência e de Western blot.
Anticorpo Primário Marca (referência) Diluição
Anti-CLN6 coelho1
(abCLN6/34) Eurogentec (não comercial) 1:100
Anti-CLN6 coelho2
(abCLN6/35) Eurogentec (não comercial) 1:100
Anti-CLN6 galinha3 (abCLN6/LAL)
Dabio (não comercial) 1:100
Anti-CLN6 ovelha4 (abCLN6/RMB)
Oferta da Prof. R.-M. Boustany, Duke University, NC, USA
1:4000
Anti-calregulina cabra5 Santa Cruz Biotech inc. (sc-6467) 1:150 Anti-lamp1 ratinho6 Santa Cruz Biotech inc. (sc-20011) 1:150
Anticorpo Secundário
Cabra anti-coelho FITC Santa Cruz Biotech inc. (sc- 2012) 1:200
Burro anti-coelho Cy5 Chemicon (AP182S) 1:150
Cabra anti coelho HRP Pierce (34075) 1:500
Bovino anti-galinha FITC Santa Cruz Biotech inc. (sc-2700) 1:200
Burro anti-ovelha AF594 Molecular Probes (A-21442) 1:250
Burro anti-cabra FITC Santa Cruz Biotech inc. (sc-2024) 1:200
Cabra anti-ratinho FITC Santa Cruz Biotech inc. (sc-2078) 1:200
1 Anticorpo produzido contra o segmento peptídico 1-16 da proteína CLN6 humana; 2 Anticorpo produzido contra o segmento peptídico 99-113 da proteína CLN6 humana; 3 Anticorpo produzido contra o segmento peptídico 242-257 da proteína CLN6 humana; 4 Anticorpo produzido contra o segmento peptídico 284-301 da proteína CLN6 humana; 5 A calregulina é uma proteína extrínseca da membrana do RE; 6 As lamp-1 (Lysosome-associated membrane proteins) são proteínas extrínsecas da membrana lisossomal.
Materiais e Métodos
37
Tabela 3.2: Espectro mutacional de doentes portugueses com NCL e análise do efeito das mutações na expressão da proteína.
Estudos de expressão
Genótipo Proteína mutada1
Actividade enzimática3 (nmol/h/mg proteína)
Variante genética Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 (S-A-Pa)
Alelo 2 (S-P-A) Nível de mRNA2 PPT1 TPP1
CLN1 (n=1) c.541G>A c.541G>A p.V181M (D-D-D)
p.V181M (D-D-D)
n.d. 4.60 (L) 6.60 (F)
261 (L) 304 (F)
CLN2 (n=1) n.d. n.d n.d. n.d. 0.320 125 (F) 8.03 (F)
CLN3 (n=8) c.462-677del c.462-677del p.C153fs p.C153fs 0.108 (1.000 ± 0.114) 46.0 ± 13.0 (L) 283 ± 115 (L)
(p<0.005) 124 ± 23 (F) 208 ± 86 (F)
CLN5 (n=1) c.565C>T c. 335G>C p.Q189X
p.R112P (NC-N-NC)
0.440 (1.000 ± 0.078)(p=0.025)
40.1 (L) 64.3 (F)
225 (L) 169 (F)
CLN6 (n=5) c.460_462delATC c.460_462delATC p.I154del p.I154del 0.841 (1.000 ± 0.064) 43.3 ± 15.2 (L) 173 ± 86 (L)
CLN6 (n=1) c.460_462delATC c.829_837delGTCGCCTGGinsCCTG
p.I154del W276fs (p=0.265) 111 ± 27 (F) 206 ± 90 (F)
1 A análise do impacto das mutações missense na função da proteína foi efectuada através dos programas SIFT (S), Align-GVGD (A) e Panther (Pa); N, alteração neutra; D, alteração deletéria; NC, alteração não classificada. 2 O nível do mRNA do gene CLN respectivo foi determinado em fibroblastos por PCR a tempo real e os resultados expressos sob a forma de média ± d.p.; o teste de t-student foi utilizado na análise da significância estatística dos resultados obtidos. 3 Os ensaios enzimáticos foram efectuados em duplicado utilizando substratos sintéticos fluorogénicos e a actividade expressa em nmol/h/mg proteína. Os resultados representam a média ± d.p.Intervalo controlo: PPT1: leucócitos (n=60), 52±19, fibroblastos (n=20), 151±50; TPP1: leucócitos (n=60) 247±85, fibroblastos (n=20) 247±90; L, Leucócitos; F, Fibroblastos; A enzima β-galactosidase foi utilizada nos ensaios enzimáticos in vitro como enzima referência. Nas células de doentes com NCL não foram observadas alterações com significado patológico ao nível da actividade enzimática da enzima de referência. As alterações quantitativas com significado patológico foram sombreadas a cinzento. n.d, não determinado.
Materiais e Métodos
38
3.3. Procedimento experimental
3.3.1. Culturas celulares
Após a reposição em cultura, as células cresceram em meio essencial mínimo
suplementado (MEM, Dullbecco’s) com antibióticos (10000U/mL de estreptomicina e
penicilina; 125 mg/mL de kanamicina e 1250 μg/mL de fungizona) e com 10% SVF
(Gibco), e foram mantidas a uma temperatura de 37ºC, numa atmosfera humidificada
com 5% dióxido de carbono. O meio de cultura foi renovado regularmente e a cultura
expandida por tripsinização.
3.3.2. SDS-PAGE e Western Blot
Preparação das Amostras
Cerca de 1.5 x 10 7 células de uma cultura com células regularmente distribuídas
a 80-90% de confluência, foram lavadas com PBS (137 mM cloreto de sódio, 10 mM
monoidrogenofosfato de sódio, 1.8 mM monofosfato de potássio, 2.7 mM cloreto de
potássio, pH 7.4) e tripsinizadas. De seguida, centrifugaram-se as células a 334g
durante 10 minutos (Refrigerated Micro Centrifuge Model 5417R, Eppendorf) e o pellet
foi ressuspendido em 1mL de PBS e sujeito a uma segunda centrifugação nas
mesmas condições.
Para obtenção de extractos totais foi adicionado ao pellet celular tampão de lise
(0.25 mM sacarose; 5 mM imidazole; 1 mM EDTA pH 7.4; 0.05mg/mL PMSF (Sigma) e
inibidores de proteases (Sigma Aldrich, 1:500). A lise celular foi efectuada por
sonicação (Ultrasonic processor Model W-375, Heat Systems-Ultrasonics,Inc)
utilizando 3x 25 impulsos com intervalos de 1 minuto no gelo.
De seguida procedeu-se à quantificação das proteínas do extracto total de
fibroblastos.
Materiais e Métodos
39
Quantificação da Proteína
As proteínas foram quantificadas por um ensaio colorímetro, baseado no método
de Lowry, utilizando um kit comercial (BioRad DC Protein Assay, BioRad).
Este ensaio baseia-se na reacção da proteína com uma solução de tartarato de
cobre alcalino e com o reagente Folin. O desenvolvimento da cor deve-se à reacção
entre as proteínas e o cobre num meio alcalino e à consequente redução do reagente
de Folin pelo complexo formado. O aparecimento de cor resulta essencialmente da
presença dos aminoácidos tirosina e triptofano e em menor extensão de resíduos de
cistina, cisteína e histidina. As proteínas efectuam a redução do reagente Folin pela
perda de 1,2 ou 3 átomos de oxigénio, produzindo uma ou mais espécies reduzidas de
coloração azul característica com uma absorvância máxima de 750nm e mínima de
405nm.
Procedeu-se à leitura da absorvância a 750 nm no Espectrofotómetro UV-Vis
UVmini 1240 (Shimadzu) utilizando uma curva padrão de BSA de concentração
conhecida. A concentração da proteína foi calculada e expressa em mg/mL.
SDS-PAGE
Ao volume de extracto total correspondente a 100 μg de proteína total foi
adicionado 50% tampão da amostra (0.15M Tris pH 8.8, 0.22M SDS, 0.75mM azul de
bromofenol, 34.5% glicerol, 6mM EDTA.NaOH pH 8.8), 10% DTT perfazendo com H2O
o volume final de 60 μL. Procedeu-se à desnaturação das amostras a 90ºC durante 10
minutos, seguida de uma centrifugação a 17400g durante 5 minutos.
As proteínas foram separadas por SDS-PAGE, à temperatura ambiente, num gel
de poliacrilamida 11%. O tampão de electroforese consistiu em 24mM Tris, 250mM
glicerol e 0.05% SDS. A electroforese foi realizada a 30 mA no gel de empacotamento
(11% acrilamida, 0.24M Tris pH 6.8, 0.050% SDS, 0.050% persulfato de amónio e
0.05%TEMED) e a 25mA no gel de resolução (4.2% acrilamida, 0.32M Tris pH 8.8,
0.080% SDS, 0.080% de persulfato de amónio e 0.080% TEMED). O tempo de
electroforese foi variável, dependendo das dimensões do gel, e controlado pela
migração das proteínas padrão de peso molecular conhecido (mistura de 7 proteínas
purificadas que originam bandas numa gama de 14.4 kDa a 116 kDa) (Fermentas). A
solução das proteínas padrão foi utilizada numa concentração final de 25%.
Materiais e Métodos
40
Western Blot
As proteínas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose utilizando o
tampão de 25mM Tris, 20% metanol, 192mM glicina e 0.02% SDS. A transferência foi
efectuada no aparelho Semi-dry blotting system (The W.E.P. Company) a 275mA,
durante 2 horas. Todas as incubações a seguir descritas decorreram com agitação
constante. A membrana foi incubada em TBS (20mM Tris, 136mM NaCl pH 7,4) com
5% de leite em pó durante 2 horas à T.A. e, a seguir, incubada com o anticorpo
primário (Tabela 3.1), apropriadamente diluído em TBS 5% leite em pó a 4ºC durante
16-20 horas. A remoção do excesso de anticorpo foi efectuada por incubação da
membrana em TBST (TBS com 0.1% Tween20) durante 10 minutos à T.A.. De
seguida procedeu-se à incubação com uma solução de anticorpo secundário (Tabela
3.1), previamente diluído em TBST com 5% leite em pó, durante 2 horas à T.A. Após
incubação da membrana 5 minutos em TBST (2 lavagens), a detecção foi realizada
por quimioluminescência, usando o kit Super Signal West Dura extended duration
substrate kit (Pierce Biotechnology). A membrana foi exposta a um filme CL-X Posure
(Pierce Biotechnology) numa cassete de revelação (Hypercassette RPV 1642,
Amersham). A revelação do filme foi efectuada pelo processador (Fuji Medical Film
Processor FPM-100A , Fuji Photo Film CO.LTD).
As imagens do western blot foram tratadas através do programa GNU Image
Manipulation Program 2.4.
3.3.3. Imunofluorescência
Após a lavagem das células com PBS e tripsinização, procedeu-se ao seu
plaqueamento em lamelas (Roth), colocadas em caixas de petri (Nunc), com
capacidade máxima de 3 mL e um volume de 8.8 cm2. Quando as células se
apresentaram 80-90% confluentes, retirou-se o meio de cultura e procedeu-se à sua
lavagem, à T.A., incubando 3x5min com PBS. O procedimento decorreu à T.A. até à
incubação com o anticorpo primário. A fixação foi efectuada com uma solução de 4%
formaldeído (Formaldehyde Free Methanol 16% UltraPure EM Grade, Polyscience) em
PBS, durante 25 minutos, seguida de 3 lavagens (5 min por lavagem) com PBS. Para
a permeabilização das células utilizou-se 0.1% Triton X-100/PBS, durante 2 minutos.
Materiais e Métodos
41
Após 3 lavagens de 5 min com PBS, as células foram incubadas com PBS/1%
BSA/0.01% Triton X-100 (solução de bloqueamento), durante 60 minutos. De seguida,
procedeu-se à incubação com o anticorpo primário (Tabela 3.1) previamente diluído
em solução de bloqueamento, O.N., a 4ºC. Após 3 lavagens de 5 min à T.A., as
células foram incubadas com o anticorpo secundário adequado (Tabela 3.1),
previamente diluído em solução de bloqueamento, durante 2 horas à T.A. Lavaram-se
as células 3 vezes em PBS e procedeu-se à montagem das lâminas (Roth) com meio
de montagem (Slow Fade Antifade, Invitrogen). Nos ensaios de co-localização
procedeu-se do mesmo modo, utilizando soluções adequadas de anticorpos primários
ou de anticorpos secundários.
No ensaio com a faloidina, após permeabilização, incubaram-se as células com
uma solução do conjugado faloidina-FITC (50 μg/mL) em PBS, durante 40 min à T.A.
Nos estudos com marcação dupla, inicialmente procedeu-se à exposição das células
com os anticorpos primário e secundário, e de seguida à marcação com o conjugado
faloidina-FITC. Lavaram-se as células 3 vezes em PBS e procedeu-se à montagem
das lâminas (Roth) com meio de montagem (Slow Fade Antifade, Invitrogen).
No ensaio com marcação dupla com o DAPI, após a exposição das células aos
anticorpos primário e secundário, adicionou-se o meio de montagem Vectashield com
DAPI (1,5μg/mL) (Vector Laboratories).
O segmento peptídico usado na imunização, também designado por péptido
bloqueador, apresenta homologia para a epítope do anticorpo anti-CLN6. No ensaio de
competição, procedeu-se à incubação prévia do anticorpo com o péptido. A
especificidade do perfil de imunofluorescência foi avaliada por comparação do padrão
de marcação obtido na presença do anticorpo primário e do complexo (anticorpo
primário-péptido). Foi usada uma concentração de PB/35 47x superior à de anticorpo
CLN6/35 e de PB/LAL 50x superior à de anticorpo CLN6/LAL.
As lâminas foram observadas no microscópio de fluorescência Nikon Eclipse
E400 acoplado a uma câmara fotográfica Nikon Coolpix 950. As imagens resultantes
de imunofluorescência foram tratadas com o programa Wright Cell Imaging Facility –
ImageJ.
Capítulo 4
Resultados
Resultados
45
4. Resultados
O conhecimento preciso acerca da localização celular das proteínas não
lisossomais implicadas na fisiopatologia primária da NCL, como é o caso da proteína
CLN6, é importante, nomeadamente para o desenvolvimento de estudos funcionais e
subsequente compreensão dos mecanismos moleculares patogénicos associados a
mutações entretanto identificadas.
A biologia celular da proteína CLN6 tem sido investigada desde 2004. Nos
trabalhos publicados até à presente data, os resultados foram obtidos com anticorpos
policlonais produzidos contra péptidos específicos da proteína CLN6 humana (Heine et
al., 2004; Mole et al., 2004; Persaud-Sawin et al., 2007).
No sentido de contribuir para a compreensão da estrutura e localização
intracelular da proteína CLN6 foram sintetizados anticorpos contra 3 regiões peptídicas
distintas, aminoácidos 1-16 (anticorpo anti-CLN6/34), 99-113 (anticorpo anti-CLN6/35)
e aminoácidos 242-257 (anticorpo anti-CLN6/LAL), da proteína CLN6 humana. A
sequência do péptido 99-113 foi confirmada por sequenciação (Instituto de Tecnologia
Química e Biológica, Lisboa).
A Figura 4.1 compara a posição dos diferentes péptidos usados na produção dos
anticorpos policlonais anti-CLN6. A maioria dos péptidos ocorre em posições da
proteína em que a sequência dos aminoácidos é conservada.
Resultados
46
Figura 4.1: Alinhamento da sequência primária da proteína CLN6 de diferentes espécies. O alinhamento foi efectuado utilizando o programa bioinformático ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html). A sequência dos péptidos usados na produção de anticorpos anti-CLN6 está identificada com barras coloridas: CLN6/1747 (aminoácido 1-15) e CLN6/1749 (aminoácido 28-39) (Mole et al., 2004) em azul, CLN6/RMB (aminoácido 284-301) (Persaud-Sawin et al., 2007) em verde, CLN6/34, CLN/35 e CLN6/LAL (presente estudo) em rosa. O péptido utilizado na produção do anticorpo CLN6/34 (presente estudo, aminoácidos 1-16) é praticamente sobreponível ao péptido correspondente ao anticorpo CLN6/1747.
Homo sapiens MEATRRRQ-HLGATGGPGAQLGASFLQARHGSVSADEAARTAPFHLDLWFYFTLQNWVLDFGRPIAMLVFPLEWFP 75 Macaca mulatta MTVSLP-------------YLISSIIQ--HGSVSADEAARTAPFHLDLWFYFTLQNWVLDFGRPIAMLVFPLEWFP Mus musculus MEAATRRR-QLLGAAG---GPGVAFVQARHGSVKAEDKDRTAPFHLDLWFYFTLQNWVLDFGRPIAMLVFPIQWFP Bos taurus MEAAARRR-HPGAAGGPGAQPGASFLQARHSSVKADEAAGTAPFHLDLWFYFTLQNWVLDFGRPIAMLVFPLEWFP Ovis aries MEAAARRR-HPGAAGGSGAQPGASFLQARHSSVKADEAAGTAPFHLDLWFYFTLQNWVLDFGRPIAMLVFPLEWFP Canis lupus familiaris MEAAARRRQHPGAAGGAGAQPGASFLQARHSSGKADEAVGTAPFHLDLWFYFTLQNWVLDFGRPIAMLVFPLEWFP Gallus gallus MQGSARRRPFPAAAPGS-PQPSGPLYAGRHGAAKNEDTSKTSPFHLDLWFYFTLQNWVLDFGRPIAMIILPLEWFP Danio rerio ----MRRR-------PQSATFTSAFLRAGSEKTTAAATTR-SQFHTDLWLCFTVQNWILDFGRPIAMIIMPLEWFP Homo sapiens LNKPSVGDYFHMAYNVITPFLLLKLIERSPRTLPRSITYVSIIIFIMGASIHLVGDSVNHRLLFSGYQHHLSVRE 150 Macaca mulatta LNKPSVGDYFHMAYNVITPFLLLKLIERSPRTLPRSITYVSIIIFIMGASIHLVGDSVNHRLLFSGYQHHLSVRE Mus musculus LNKPSVGDYFHMTYNIITPFLLLKLIERSPRTLPRSIVYVSIITFIMGASIHLVGDSVNHRLLFSGYQHHLSVRE Bos taurus LNKPSVGDYFHMAYNIITPFLLLQLIERCPRTLPRSLIYVSIITFIMGASIHLVGDSVNHRLIFSGYQNHLSVRE Ovis aries LNKPSVGDYFHMAYNIITPFLLLKLIERCPRTLPRSLIYVSIITFIMGASIHLVGDSVNHRLIFSGYQNHLSVRE Canis lupus familiaris LNKPSVGDYFHMAYNIITPFLLLKLIERSPRTLPRSVIYVSIITFVMGASIHLVGDSVNHRLLFSGYQHHLSVRE Gallus gallus LNKPSAGDYFPMAYNVITPFLLLKLIERSPKTLPRSMVYVSIITFVMGASIHLVGDSVNHRLIFSGYQHHLSVRE Danio rerio LNKPSVGDYFHMAYNVITPFLLLKLIERSPTALPRSAVYLSIITFVMGASIHLVGDSINHRLILSGYQLHLSVRE Homo sapiens NPIIKNLKPETLIDSFELLYYYDEYLGHCMWYIPFFLILFMYFSGCFTASKAESLIPGPALLLVAPSGLYYWYLV 225 Macaca mulatta NPIIKNLKPETLIDSFELLYYYDEYLGHCMWYIPFFLILFMYFSGCFTACKAERWMPGPALLLVAPSGLYYWYLV Mus musculus NPIIKNLKPETLIDSFELLYYYDEYLGHCMWYIPFFLILFMYFSGCFTTCKAESHMPGPALLLVVPSGLYYWYLV Bos taurus NPIIKNLKPETLIDSFELLYYYDEYLGHSMWYIPFFLILFMYFSSCFTPTKAESSMPGAALLLVVPSGLYYWYLV Ovis aries NPIIKNLKPETLIDSFELLYYYDEYLGHSMWYIPFFLILFMYFSGCFTPTKAESSMPGAALLLVVPSGLYYWYLV Canis lupus familiaris NPIIKNLSPETLIDSFELLYYYDEYLGHCMWYVPFFLILFIYFSGCFTPTKAESSMPGAALLLAMPSGLYYWYLV Gallus gallus NPIIRNLKPETLIDSFELLYYYDEYLGHSMWYIPFFLILFIYFTGCFTPDEDESRMPMSALLLTGPSSLYYWYLV Danio rerio NPIIKDLKPASLIDSFELLYYYDEHLGHSMWYIPFFLIIFLYFTGCFTQVKDEK-MSTSGWLLLGPSAVYYWYLI Homo sapiens TEGQIFILFIFTFFAMLALVLHQKRKRLFLDSNGLFLFSSFALTLLLVALWVAWLWNDPVLRKKYPGVIYVPEPW 300 Macaca mulatta TEGQIFILFIFTFFAMLALVLHQKRKRLFLDSNGLFLFSSFTLTLLLVALWVAWLWNDPVLRKKYPGVIYVPEPW Mus musculus TEGQIFILFIFTFFAMLALVLHQKRRRLFLDSNGLFLLYSFALTLSLVALWVAWLWNDPVLRKKYPGVIYVPEPW Bos taurus TEGQIFILFIFTSFAMLALVLHQKRKRLFLDSNGLFLFYSFALTLLLVALWVAWLWNDPVLRKKYPGVIYVPEPW Ovis aries TEGQIFILFIFTSFAMLALVLHQKRKRLFLDSNGLFLFYSFALALLLVALWVAWLWNDPVLRKKYPGVIYVPEPW Canis lúpus familiaris TEGQIFILFIFTFFAMLALVLHQKRKRLFLDSNGLFLFYSFALTLLLVALWVAWLWNDPVLRKKYPGVIYVPEPW Gallus gallus TEGQIFILYIFTFFAMMALVMHQKRKGLVLDSNGLFLFYSFIITLVLIAVWVVWLWNDKTLRKKYPGVIYIPEPW Danio rerio TEGQIFVLYVFTFFAMVATVMRQRRMGFVLDSNGRFLFYNFIITLGLVLVWVAYLWNDKVLRKKYPGIIYVPEPW Homo sapiens AFYTLHVSSRH------ 311 Macaca mulatta AFYTLHVSSRH------ 297 Mus musculus AFYTLHVSSQQ------ 308 Bos taurus AFYTLHVSSQH------ 311 Ovis aries AFYTLHVSSQ------- 310 Canis lupus familiaris AFYTLHVSSRP------ 312 Gallus gallus AFYTLHMSNLHAAKEGL 317 Danio rerio SFYTLHIKGS------- 298
Resultados
47
4.1. Avaliação da sensibilidade e especificidade de anticorpos policlonais anti-
CLN6
Inicialmente procedeu-se ao estudo da sensibilidade dos anticorpos anti-
CLN6/34 e anti-CLN6/35. A proteína existente em extractos totais de FHC de
indivíduos saudáveis foi analisada por SDS-PAGE e Western blot (Figura 4.2). Em
FHC foi observada uma banda com cerca de 40 kDa, de tamanho ligeiramente
superior ao calculado para a sequência primária da proteína CLN6 (36 kDa). O perfil
de migração obtido com os anticorpos anti-CLN6/34 e anti-CLN6/35 foi semelhante.
Os resultados obtidos indicam que estes anticorpos têm sensibilidade para a detecção
de níveis endógenos de proteína de FHC.
Figura 4.2: Detecção da proteína CLN6 endógena de FHC com o anticorpo anti-CLN6/34. Extractos totais foram submetidos a SDS-PAGE, as proteínas transferidas para uma membrana de nitrocelulose e analisadas com o anticorpo anti-CLN6/34 de acordo com o procedimento experimental descrito no Capítulo 3 “Materiais e métodos”.
Com o objectivo de avaliar a sensibilidade do anticorpo para a detecção de níveis
endógenos de proteína CLN6 nativa realizaram-se estudos de microscopia de
imunofluorescência recorrendo a FHC de indivíduos saudáveis.
Com o anticorpo anti-CLN6/35 observou-se marcação membranar,
essencialmente de tipo tubular, e uma marcação ponteada na região central da célula,
muito provavelmente no núcleo (Figura 4.3_1). Um padrão de marcação semelhante
foi obtido com o anticorpo anti-CLN6/34 (não mostrado). No sentido de avaliar a
especificidade dos anticorpos procedeu-se à incubação diferencial das células com o
soro pré-imune de coelho (Figura 4.3_4) e com o complexo anti-CLN6/35/péptido
bloqueador (Figura 4.3_6). Nestes casos, as células apresentaram um padrão
bastante diferenciado do observado nas células expostas ao anticorpo primário anti-
Resultados
48
CLN6/35 (Figura 4.3_1) e ao soro imune não purificado CLN6/35 (Figura 4.3_5). As
células expostas ao soro imune não purificado (Figura 4.3_5) apresentam marcação
em compartimentos celulares similares aos marcados com o anticorpo primário anti-
CLN6/35 (Figura 4.3_1). Quando as células foram expostas a apenas um dos
anticorpos (primário ou secundário) não foi observada, tal como o esperado, qualquer
coloração (Figura 4.3_2 e Figura 4.3_3).
Figura 4.3: Localização intracelular da proteína CLN6 de FHC com o anticorpo anti-CLN6/35. Os estudos de microscopia de imunofluorescência foram efectuados de acordo com o procedimento descrito na Capítulo 3 “Materiais e métodos”. 1 - Anticorpo anti-CLN6/35 e anticorpo secundário conjugado com FITC; 2 - Sem anticorpo primário e com anticorpo secundário conjugado com FITC; 3 - Anticorpo anti-CLN6/35 e sem anticorpo secundário; 4 - Soro pré-imune CLN6/35 e anticorpo secundário conjugado com FITC; 5 - Soro imune não purificado CLN6/35 e anticorpo secundário conjugado com FITC; 6 - Anticorpo anti-CLN6/35 previamente conjugado com o péptido bloqueador CLN6/35 (ensaio de competição) e anticorpo secundário conjugado com FITC.
Com o anticorpo anti-CLN6/LAL observou-se uma coloração ponteada que
sugere uma localização nuclear para a proteína CLN6 (Figura 4.4_1). No sentido de
excluir a possibilidade de detecção de outros padrões de coloração testaram-se várias
condições experimentais, nomeadamente fixação e permeabilização das células com
metanol, acetona, ou a mistura 1:1 metanol/acetona, permeabilização das células com
0.2% ou 0.5% Triton X-100, e exposição das células a um solução de bloqueamento
com diferentes concentrações de Triton X-100. Em todas as condições experimentais
testadas o padrão de marcação observado era similar ao apresentado na Figura
2 3
4
1
5 6
Resultados
49
4.4._1, obtido nas condições descritas na Capítulo 3 “Materiais e métodos”, ou não foi
detectada qualquer marcação. Este mesmo procedimento de optimização do sinal de
marcação foi efectuado para o caso dos anticorpos anti-CLN6/34 e anti-CLN6/35,
sendo que as imagens apresentadas referem-se ao procedimento descrito em
“Materiais e métodos”.
No intuito de avaliar a especificidade do anticorpo anti-CLN6/LAL procedeu-se à
incubação diferencial das células com o soro pré-imune de coelho (Figura 4.4_4) e
com o complexo anti-CLN6/LAL/péptido bloqueador (Figura 4.4_6). Tal como
observado para o anticorpo anti-CLN6/35, nestes casos as células também
apresentaram um padrão bastante diferenciado do observado nas células expostas ao
anticorpo primário anti-CLN6/LAL (Figura 4.4_1). Quando as células foram expostas a
apenas um dos anticorpos, primário ou secundário, (Figura 4.4_2 e Figura 4.4_3) ou
ao soro imune não purificado (Figura 4.4_5) foi observada alguma coloração; no
entanto, o padrão da marcação era claramente diferenciado do padrão observado em
células expostas ao anticorpo anti-CLN6/LAL.
Figura 4.4: Localização intracelular da proteína CLN6 de FHC com o anticorpo anti-CLN6/LAL. Os estudos de microscopia de imunofluorescência foram efectuados de acordo com o procedimento descrito na Capítulo 3 “Materiais e métodos”. 1 - Anticorpo anti-CLN6/LAL e anticorpo secundário conjugado com FITC; 2 - Sem anticorpo primário e com anticorpo secundário conjugado com FITC; 3 - Anticorpo anti-CLN6/LAL e sem anticorpo secundário; 4 - Soro pré-imune CLN6/LAL e anticorpo secundário conjugado com FITC; 5 - Soro imune não purificado CLN6/LAL e anticorpo secundário conjugado com FITC; 6 - Anticorpo anti-CLN6/LAL previamente complexado com o péptido bloqueador CLN6/LAL (ensaio de competição) e anticorpo secundário conjugado com FITC.
3 1 2
6 4 5
Resultados
50
4.2. Estudos de co-localização por imunofluorescência da proteína endógena de
FHC
A proteína CLN6 integra um grupo de proteínas implicadas em doenças
genéticas caracterizadas por alterações lisossomais. Para a maioria dessas proteínas
(CLN1, CLN2, CLN3, CLN5, CLN7, CLN10) está documentada a sua localização, pelo
menos parcial, nos lisossomas (rev. em Kyttällä et al., 2006). Porém, a proteína CLN6
sobre expressa em células HEK293 (Mole et al., 2004) ou em células BHK21 (Heine et
al., 2004), foi observada no RE.
No sentido de estabelecer a localização celular da proteína endógena detectada
pelos anticorpos anti-CLN6/34 e anti-CLN6/35, procedeu-se inicialmente ao estudo de
co-localização com anticorpos específicos para proteínas marcadoras do retículo
endoplasmático (anti-calregulina) e do lisossoma (anti-lamp-1). A calregulina e lamp-1
são proteínas periféricas presentes na membrana do RE e lisossoma,
respectivamente. Os resultados obtidos são apresentados na Figura 4.5. Dado que foi
observado um padrão de marcação semelhante com ambos os anticorpos, na figura
exemplifica-se o resultado obtido apenas com um dos anticorpos, anti-CLN6/35.
Os resultados obtidos sugerem que a proteína CLN6 não co-localiza com
proteínas do RE (Figura 4.5_3) ou do lisossoma (Figura 4.5_6). No entanto, é de
referir que, nas células marcadas com o anticorpo anti-CLN6/35, adicionalmente à
marcação detectada na região central e que deverá corresponder ao núcleo celular, foi
observada alguma marcação perinuclear (Figura 4.5_2). Porém, dada a diferença de
intensidade de sinal obtida com este anticorpo e o anticorpo anti-calregulina, não foi
possível avaliar a possibilidade de co-localização destas proteínas.
Resultados
51
Figura 4.5: Co-localização da proteína CLN6 de FHC com proteínas marcadoras do RE e do lisossoma. Os estudos de microscopia de imunofluorescência foram efectuados de acordo com o procedimento descrito na Capítulo 3 “Materiais e métodos”. 1 - Anti-calregulina e anticorpo secundário conjugado com FITC (verde); 2 - Anti-CLN6/35 e anticorpo secundário conjugado com Cy5 (vermelho); 3 - Sobreposição das imagens obtidas com anti-calregulina e anti-CLN6/35; 4 - Anti-lamp1 e anticorpo secundário conjugado com FITC (verde); 5 - Anti-CLN6/35 e anticorpo secundário conjugado com Cy5 (vermelho); 6 - Sobreposição das imagens obtidas com os anticorpos anti-lamp1 e anti-CLN6/35.
Foram, a seguir, efectuados estudos de marcação dupla com o anticorpo anti-
CLN6/35 e DAPI (corante que liga fortemente o DNA) em amostras de FHC. A co-
localização observada (Figura 4.6_3) indica que a proteína CLN6 está, de facto,
presente no núcleo, mais precisamente ao nível do nucleoplasma. De referir que os
estudos de co-localização com o anticorpo anti-lâmina A excluíram a proteína CLN6 da
lâmina nuclear (não mostrado). Para confirmação da localização da proteína CLN6 no
nucleoplasma, foram efectuados estudos de co-localização da proteína CLN6 com
anticorpos anti-HP1 (proteína marcadora da heterocromatina) e anti-histona H3
(proteína marcadora dos nucleossomas). No entanto, não foi possível estabelecer as
condições experimentais para a utilização destes anticorpos em estudos de
imunofluorescência.
2 3 1
4 5 6
Resultados
52
Figura 4.6: Co-localização da proteína CLN6 de FHC com DAPI. Os estudos de microscopia de imunofluorescência foram efectuados de acordo com o procedimento descrito na Capítulo 3 “Materiais e métodos”. 1 – DAPI-UV (azul); 2 - Anti-CLN6/35 e anticorpo secundário conjugado com Cy5 (vermelho); 3 - Sobreposição das imagens obtidas com anti-CLN6/35 e DAPI.
A questão que, de seguida, se tentou esclarecer foi a localização da marcação
intracelular do tipo tubular observada em FHC com os anticorpos anti-CLN6/34 e anti-
CLN6/35. Nesse sentido, procedeu-se à marcação dupla das células utilizando
faloidina complexada com FITC. A faloidina é uma toxina fúngica isolada de Amanita
phalloides. A toxicidade da faloidina deve-se à sua capacidade de ligação à actina F.
Como resultado desta ligação, a actina torna-se fortemente estabilizada. A marcação
amarela (Figura 4.7_3) indica que a CLN6 das regiões celulares onde é detectada sob
a forma de uma estrutura do tipo tubular co-localiza com a actina.
Figura 4.7: Co-localização da proteína CLN6 de FHC com os anticorpos anti-CLN6/35 e faloidina-FITC. Os estudos de microscopia de imunofluorescência foram efectuados de acordo com o procedimento descrito na Capítulo 3 “Materiais e métodos”. 1 - faloidina-FITC (verde); 2 - Anti CLN6/35 e anticorpo secundário conjugado com Cy5 (vermelho); 3 - Sobreposição das imagens obtidas com o anticorpo faloidina e anti-CLN6/35.
3 1 2
3 1 2
Resultados
53
Dado que com os anticorpos anti-CLN6/35 e anti-CLN6/LAL se observou um
padrão de marcação nuclear semelhante, procedeu-se a estudos de co-localização
com estes 2 anticorpos. A marcação amarela (Figura 4.8_3) resultante da
sobreposição dos padrões de marcação (Figura 4.8_1 e Figura 4.8_2) sugere que
estes anticorpos, produzidos contra epítopes distintos, reconhecem a proteína
endógena na mesma localização sub-celular.
Figura 4.8: Co-localização da proteína CLN6 de FHC com os anticorpos anti-CLN6/35 e anti-CLN6/LAL. Os estudos de microscopia de imunofluorescência foram efectuados de acordo com o procedimento descrito na Capítulo 3 “Materiais e métodos”. 1 - Anti-CLN6/LAL e anticorpo secundário conjugado com FITC (verde); 2- Anti-CLN6/35 e anticorpo secundário conjugado com Cy5 (vermelho); 3 - Sobreposição das imagens obtidas com anti-CLN6/LAL e anti-CLN6/35.
Com o objectivo de compreender se o padrão de marcação ponteado nuclear
observado com os anticorpos anti-CLN6/34, anti-CLN6/35 e anti-CLN6/LAL era
específico da proteína endógena e independente da natureza da epítope do anticorpo,
procedeu-se à comparação do padrão de marcação obtido com os anticorpos anti-
CLN6/35 e anti-CLN6/RMB (Figura 4.9). Com o anticorpo anti-CLN6/RMB observou-
se, em planos de focagem distintos, marcação parcial ponteada no citossol (Figura
4.9_1) e no núcleo (Figura 4.9_2a) de FHC. A marcação citossólica deverá
corresponder à presença da proteína no CG e endossomas de reciclagem, tal como,
previamente descrito (Persaud-Sawin et al., 2007). Relativamente à marcação nuclear,
quando se efectuaram estudos de co-localização com os estes dois anticorpos anti-
CLN6, verificou-se sobreposição do sinal obtido (Figura 4.9_4). Esta observação
reforça a especificidade da marcação nuclear obtida para a proteína CLN6.
1 2 3
Resultados
54
Figura 4.9: Co-localização da proteína CLN6 de FHC com os anticorpos anti-CLN6/35 e anti-CLN6/RMB. Os estudos de microscopia de imunofluorescência foram efectuados de acordo com o procedimento descrito na Capítulo 3 “Materiais e métodos”. 1, 2a e 2b -Anticorpo CLN6/RMB e anticorpo secundário conjugado com AF594 (1 e 2a, variação de plano de focagem); 3 - Anti CLN6/35 e anticorpo secundário conjugado com Cy5; 4 - Sobreposição das imagens obtidas com os anticorpos anti-CLN6/RMB e anti-CLN6/35.
A análise in silico da sequência linear da proteína CLN6 quanto à existência de
sequências sinal putativas de endereçamento para o núcleo, foi efectuada pelo
programa bioinformático NucPred (Brameier et al., 2007). O resultado obtido foi de
0.36, ao qual corresponde uma especificidade de cerca de 0.60. Os NLS’s previstos
nesta análise correspondem às sequências lineares 5RRR7, 249KRKR252 e 287RKKY290.
Adicionalmente, o programa bioinformático ELM (The eukaryotic linear motif resource
for functional sites in proteins, http://www.elm.eu. org/) prevê a existência de um
motivo (267ALTLLLV273) envolvido na ligação a receptores nucleares. No entanto, no
presente trabalho não foi possível avaliar o significado funcional destas sequências.
2b 4 3
1 2a
Resultados
55
4.3. Estudos de imunofluorescência em células murinas
No sentido de explorar a possibilidade de localização diferencial da proteína
CLN6 em função do tipo de célula, desenvolveram-se estudos de imunofluorescência
com o anticorpo anti-CLN6/35 para detecção da proteína endógena em células
murinas NIH3T3 (Figura 4.10). Nestas células, observou-se um padrão de marcação
ponteada na região perinuclear e nuclear. A marcação dupla destas células com o
anticorpo anti-calregulina não sugere co-localização da proteína CLN6 com esta
proteína marcadora do RE. O padrão de marcação nuclear parece ser semelhante ao
observado em FHC. Porém, nas células murinas não foi observado o padrão de
marcação do tipo tubular.
Figura 4.10: Co-localização da proteína CLN6 em células murinas NIH3T3 com os anticorpos anti-CLN6/35 e anti-calregulina. Os estudos de microscopia de imunofluorescência foram efectuados de acordo com o procedimento descrito na Capítulo 3 “Materiais e métodos”. 1 - Anticorpo anti-calregulina e anticorpo secundário conjugado com FITC; 2 - Anticorpo anti-CLN6/35 e anticorpo secundário conjugado com cy5; 3 - Sobreposição das imagens obtidas com anti-calregulina e anti-CLN6/35.
4.4. Avaliação do efeito de mutações no gene CLN6 sobre a localização
intracelular da proteína
Em FHC de doentes com a variante CLN6 e homozigóticos para a mutação
c.460_462delATC, p.I154del, foi detectada, com o anticorpo anti-CLN6/34, uma banda
que co-migra com a banda (40 kDa) observada em fibroblastos controlo (Figura 4.11).
3 1 2
Resultados
56
Figura 4.11: Detecção da proteína CLN6 endógena de FHC de doentes com a variante CLN6. Extractos totais foram submetidos a SDS-PAGE, as proteínas transferidas para uma membrana de nitrocelulose e analisadas com o anticorpo anti-CLN6/34 de acordo com o procedimento experimental descrito no Capítulo 3 “Materiais e métodos. 1- Indivíduo saudável (controlo); 2- Doente homozigótico para a mutação p.I154del.
Estudos de imunofluorescência realizados em fibroblastos de doentes
homozigóticos para a mutação c.460_462delATC, p.I154del (Figura 4.12_2) ou
compostos heterozigóticos que apresentam num alelo essa mutação e no outro alelo a
alteração c.829_837 delGTCGCCTGGinsCCTG, W276fs (Figura 4.12_3) sugerem que
a delecção in frame do resíduo de isoleucina 154 não interfere com a localização da
proteína.
Figura 4.12: Localização intracelular da proteína CLN6 de fibroblastos cultivados de doentes com a variante CLN6. Os estudos de microscopia de imunofluorescência foram efectuados de acordo com o procedimento descrito na Capítulo 3 “Materiais e métodos”. As células foram marcadas com o anticorpo anti-CLN6/35 e o anticorpo secundário conjugado com FITC. 1 - Indivíduo saudável (células controlo); 2 - Doente homozigótico para a mutação p.I154del; 3 - Doente composto heterozigótico (p.I154del, p.W276fs).
1 2 3
Resultados
57
4.5. Impacto de mutações noutros genes CLN na localização intracelular de
CLN6
As semelhanças clinicopatológicas que se observam entre as diferentes variantes da
NCL sugerem redundância estrutural e/ou funcional ao nível das proteínas implicadas nesta
patologia. De facto, estudos de co-imunoprecipitação sugerem que a proteína CLN5 deverá
associar-se às proteínas CLN3 e CLN2 através de domínios específicos, localizados,
respectivamente, no segmento C-terminal e N-terminal de CLN5 (Vesa et al., 2002). No
sentido de investigar esta possibilidade procedeu-se ao estudo da localização celular da
proteína CLN6 em linhas celulares de fibroblastos de doentes com diferentes variantes de
NCL (CLN1, CLN2, CLN3 e CLN5) disponíveis em banco, no laboratório, à data de
realização do presente estudo. As características genéticas e bioquímicas destas linhas
celulares são documentadas na Capítulo 3 “Materiais e métodos”.
Os resultados obtidos nos estudos de microscopia de imunofluorescência com o
anticorpo anti-CLN6/35 são apresentados na Figura 4.13. Em todas as linhas celulares
estudadas observou-se marcação parcial no núcleo e no citopalsma, sendo o padrão
semelhante ao detectado em células controlo. Face a estes resultados, as mutações nos
genes CLN1 (p.V181M) (Figura 4.13_2), CLN3 (p.C153fs) (Figura 4.13_4) e CLN5
(p.Q189X e/ou p.R112P) (Figura 4.13_5) não deverão interferem com a localização correcta
da proteína CLN6.
Resultados
58
Figura 4.13: Efeito de mutações nos genes CLN na localização intracelular da proteína CLN6. Fibroblastos humanos de doentes com diferentes variantes de NCL marcados com o anticorpo anti-CLN6/35 e o anticorpo secundário conjugado com FITC. 1 - Indivíduo saudável (células controlo); 2 - Doente com a variante CLN1 e homozigótico para a mutação p.V181M; 3 - Doente com a variante CLN2; 4 - Doente com a variante CLN3 e homozigótico para a mutação p.C153fs; 5 - Doente com a variante CLN5 e composto heterozigótico, apresentando a mutação p.Q189X no produto de um alelo e a mutação p.R112P no produto do outro alelo.
3 1 2
4 5 4
Capítulo 5
Discussão
Discussão
61
5. Discussão
Os lisossomas são organelos celulares que contêm enzimas hidrolíticas. A
deficiência em enzimas lisossomais está associada a doenças graves, genericamente
designadas por Doenças de Sobrecaga Lisossomal, demonstrando a importância
destes organelos na fisiologia celular.
A Ceroido Lipofuscinose Neuronal (NCL) é um grupo de doenças
neurodegenerativas autossómicas recessivas e geralmente fatais, caracterizadas por
uma disfunção ao nível do lisossoma que está associada à presença de inclusões com
características de ceroido e lipofuscina, especialmente em células neuronais. Estas
inclusões têm também sido associadas ao processo de envelhecimento celular (rev.
em Seehafer e Pearce, 2006)
Apesar das primeiras descrições clínicas da doença terem sido efectuadas no
início do século XIX (Batten, 1903; Batten, 1914; Bielschowsky, 1913), os primeiros
genes (CLN1 e CLN3) só foram identificados em 1995 (The IBDC, 1995; Vesa et al.,
1995).
Durante a última década foram identificados oito genes (CLN1, CLN2, CLN3,
CLN5, CLN6, CLN7, CLN8 e CLN10) e descritas mais de 100 mutações
(http://www.ucl.ac.uk/ncl/mutation.shtml). A esta heterogeneidade genética e alélica
está associada uma variabilidade clínica considerável. Inicialmente, entre a década de
60 e 80, a NCL compreendia 4 subtipos que eram classificados, de acordo com a
idade de início, a progressão clínica e as características ultra-estruturais das inclusões
lisossomais, em forma infantil (INCL/CLN1), infantil-tardia (LINCL/CLN2), juvenil
(JNCL/CLN3) e adulta (ANCL). Mais recentemente, variantes destes subtipos têm sido
identificadas, muitas das quais resultantes de mutações em mais do que um gene. Por
exemplo, variantes do subtipo clássico LINCL/CLN2 podem ser causadas por
mutações nos genes CLN5, CLN6, CLN7, CLN8 ou CLN10. (rev. em Siintola et al.,
2006a). Tal como para outras doenças monogénicas lisossomais, um espectro
alargado de fenótipos clínicos, desde formas muito graves, como a forma congénita
associada a mutações no gene CLN10, a formas adultas, estará provavelmente
associado a cada uma das variantes genéticas de NCL. Estudos de correlação
genótipo-fenótipo permitem avaliar se a variabilidade clínica está intrinsecamente
Discussão
62
associada a uma heterogeneidade genética. Nesse sentido, o conhecimento da função
da proteína é importante para avaliar o impacto fisiopatológico de mutações. Porém, a
função das proteínas NCL apenas está bem documentada para as enzimas solúveis
lisossomais: CLN1/tioesterase, CLN2/aminopeptidase e CLN10/protease. As restantes
proteínas, provavelmente de natureza membranar, parecem ter uma localização
celular diversa e que inclui o RE, CG, endossomas de reciclagem e lisossomas (rev.
em Kyttälä et al., 2006).
A variante CLN6 foi identificada apenas em 2002 (Gao et al., 2002; Wheeler et
al., 2002). A análise in silico das características estruturais e topológicas indica que o
gene CLN6 codifica para uma proteína de 311 aminoácidos (~36 kDa), sem péptido
sinal N-terminal, locais de N-glicosilação (NX(S/T), X= um qualquer aminoácido) ou
sinais clássicos de endereçamento para o lisossoma (Bonifacino e Dell’Angelica,
1999). Estudos de permeabilização diferencial da membrana com digitonina e
recorrendo a anticorpos específicos, designadamente contra o terminal amino (Heine
et al., 2007), sugerem que a proteína CLN6 possui um domínio N-terminal
citoplasmático, 7 domínios transmembranares e um domínio C-terminal luminal.
Estudos de co-localização da proteína de células HEK293 transfectadas com o cDNA
CLN6 utilizando dois anticorpos produzidos contra péptidos distintos sugerem que a
CLN6 é uma proteína residente do RE (Mole et al., 2004). Em células BHK21
transfectadas com CLN6Myc/His tag, a proteína sobre expressa detectada com o
anticorpo monoclonal anti-Myc foi igualmente observada no RE (Heine et al., 2004).
Os resultados obtidos nestes 2 estudos independentes referem-se à proteína sobre
expressa. Só mais recentemente, em 2007, foram publicados os primeiros resultados
referentes à proteína endógena (Persaud-Sawin et al., 2007).
No sentido de contribuir para o conhecimento da localização intracelular da
proteína CLN6 foram produzidos 3 anticorpos contra péptidos específicos da proteína
CLN6 humana. Estes anticorpos detectaram níveis endógenos da proteína produzida
por fibroblastos cultivados de origem humana.
Em extractos totais de FHC foi detectada, por SDS-PAGE e Western blot, uma
forma molecular com cerca de 40 kDa, de peso molecular ligeiramente superior ao
calculado (36 kDa) para a sequência primária da proteína. O resultado obtido sugere
que a proteína sofre modificações pós-traducionais. Curiosamente, a proteína sobre
Discussão
63
expressa apresenta um peso molecular ligeiramente inferior, correspondente a 29-30
kDa (Heine et al., 2004; Mole et al., 2004).
Estudos de imunofluorescência com marcação dupla em FHC de indivíduos
saudáveis revelaram uma marcação parcial ao longo da membrana plasmática e no
núcleo.
Ao longo da membrana plasmática observou-se um padrão de marcação
ponteado do tipo estrutura tubular. Esta observação foi consistente para 2 dos 3
anticorpos policlonais utilizados no presente estudo, com epítopes localizadas no
segmento N-terminal (aminoácidos 1-16) e num segmento interno da proteína
(aminoácidos 99-113). O padrão de marcação observado sugere a associação da
proteína CLN6, directa ou indirectamente, a filamentos de actina. Estudos de
marcação dupla com a faloidina confirmaram a co-localização parcial da proteína
CLN6 com filamentos de actina. A co-localização da proteína CLN6 com a actina não
está documentada na literatura. No entanto, um padrão de marcação semelhante foi
recentemente observado em células neuronais transfectadas com o cDNA CLN6
(Heine et al., 2007) utilizando um anticorpo N-terminal (aminoácidos 1-15) (Mole et al.,
2004) que foi produzido contra um segmento peptídico praticamente sobreponível a
um dos anticorpos acima referido. No futuro, será importante esclarecer se a proteína
CLN6 se associa directa ou indirectamente a estes filamentos. Até à data, a interacção
de proteínas NCL com componentes do citoesqueleto foi documentada apenas para a
proteína CLN3 por Luiro e colaboradores (2004). Os resultados reportados por estes
autores suportam a possibilidade de interacção da proteína CLN3 com a proteína
Hook1 dos microtúbulos. Por outro lado, as proteínas CLN3, CLN6 e CLN8 foram co-
localizadas em lipid rafts da membrana plasmática e em endossomas de reciclagem
(Persaud-Sawin et al., 2007). Adicionalmente, estudos de expressão génica por cDNA
microarrays sugerem que a proteína CLN6 possa estar envolvida em processos de
tráfego vesicular (Teixeira et al., 2006). Na proteína CLN3 foi identificado um domínio
de ligação à galactosilceramida (Persaud-Sawin et al., 2004) eventualmente
importante para o transporte da proteína do CG para os endossomas de reciclagem.
De referir ainda que a proteína CLN8, localizada no RE, poderá desempenhar um
papel ao nível da biossíntese/transporte de moléculas lipídicas, nomeadamente da
ceramida (rev. em Winter e Ponting, 2002). Neste contexto, a localização da proteína
CLN6 ao longo de filamentos de actina constitui mais um argumento a favor da
Discussão
64
possibilidade de uma interacção concertada entre as proteínas CLN3, CLN6 e CLN8,
nomeadamente ao nível do tráfego vesicular.
Os estudos de imunofluorescência em fibroblastos humanos com os 3 anticorpos
policlonais produzidos contra segmentos peptídicos específicos (segmento N-terminal,
segmento interno e segmento C-terminal, aminoácidos 242-257) co-localizaram a
proteína no núcleo da célula, tendo sido visualizada uma marcação dispersa pelo
nucleoplasma. Com os anticorpos produzidos contra o segmento N-terminal e
segmento interno da proteína, esta marcação foi parcial. Por razões técnicas não foi
possível obter informação adicional quanto ao domínio nuclear correspondente a este
padrão de marcação, nomeadamente eucromatina ou heterocromatina.
A localização nuclear da proteína CLN6 é reforçada pela observação de que um
quarto anticorpo produzido contra um segmento peptídico C-terminal (aminoácidos
284-301) co-localiza parcialmente a proteína no núcleo, com um padrão de marcação
sobreponível ao observado com os 3 anticorpos acima descritos. Estudos recentes
(Persaud-Sawin et al., 2007) em FHC utilizando este mesmo anticorpo sugerem co-
localização parcial da proteína CLN6 no CG, endossomas de reciclagem e
microdomínios membranares específicos intracelulares. Apesar da marcação
ponteada perinuclear e da marcação dispersa pelo citoplasma observada com os 3
anticorpos produzidos contra segmentos distintos (segmento N-terminal, segmento
interno e segmento C-terminal) da proteína ser fraca, não é presentemente de excluir
a possibilidade destes anticorpos detectarem a proteína CLN6 no RE, CG e
endossomas de reciclagem. Estudos de microscopia confocal de fluorescência com a
possibilidade de obtenção de imagens sucessivas de diferentes planos da mesma
amostra deverão ser, no futuro, utilizados para avaliar esta hipótese.
No entanto, esta aparente discrepância face ao descrito na literatura (Heine et
al., 2004; Mole et al., 2004), pode ser explicada pela localização diferencial da proteína
endógena versus proteína sobre expressa, pela localização específica da proteína de
acordo com tipo de célula, ou ainda, pelo facto dos anticorpos exibirem diferente
sensibilidade e/ou especificidade.
De salientar que os anticorpos caracterizados neste estudo não detectaram a
proteína endógena de FHC nos lisossomas, corroborando os resultados previamente
publicados por outros autores (Heine et al., 2004; Mole et al., 2004). Esta observação
Discussão
65
reforça a noção de que a variante CLN6 não é causada por um defeito primário
lisossomal ao contrário do observado para a maioria das NCLs (rev. em Hofmann et
al., 2002; rev. em Kyttällä et al., 2006).
Os anticorpos policlonais avaliados no presente estudo foram produzidos contra
segmentos peptídicos conservados da proteína. De facto, em fibroblastos
embrionários murinos, o padrão de marcação nuclear obtido com o anticorpo anti-
CLN6 produzido contra o segmento interno da proteína é semelhante ao observado
em FHC. No entanto, em fibroblastos murinos não foi observada marcação ao longo
da membrana plasmática do tipo tubular. O significado fisiológico desta aparente
discrepância não foi investigado.
A informação disponível na literatura e os resultados obtidos no presente
trabalho sugerem que a proteína CLN6 tem uma localização celular diversa: RE, CG,
citoesqueleto, endossomas de reciclagem e núcleo. A observação da proteína em
microdomínios membranares intracelulares que co-localizam com a fosfatase alcalina
(Persaud-Sawin et al., 2007) sugere que a proteína CLN6 poderá estar localizada em
lipid rafts, eventualmente no RE e/ou membrana plasmática.
Os determinantes moleculares do tráfego intracelular de proteínas são sinais
peptídicos ou glicosídicos (rev. em van Vliet et al., 2003). A identificação destes sinais
é essencial para a compreensão da biogénese de organelos e estruturas celulares.
Relativamente à presença da proteína no RE, a proteína CLN6 possui 4 motivos
potenciais de retenção (recuperação) no RE, localizados no terminal amino e no
terminal carboxílico: 5RRR7, 249KRKR252, 288KK289 e 305LH306 (Cosson e Letourneur,
1994; Hardt et al., 2003). Porém, estudos recentes de biologia molecular e celular
efectuados por Heine e colaboradores (2007) sugerem que os motivos 249KRKR252, 288KK289 e 305LH306 não actuam como sinais bioquímicos de retenção no RE. Os
resultados obtidos por estes autores sugerem que o terminal amino da proteína estará
associado à retenção da proteína CLN6 no RE. O facto da sequência N-terminal 5RRR7 da proteína CLN6 ter sido descrita numa proteína membranar tipo II do RE, a
glucosidase I (Hardt et al., 2003), suporta a hipótese deste sinal N-terminal ser
responsável pela retenção da proteína CLN6 no RE. Porém, outros motivos de
retenção para além do(s) existente(s) no terminal amino citossólico deverão estar
presentes na proteína CLN6 uma vez que a proteína CLN6 mutada devido à
Discussão
66
supressão dos resíduos 1-49 continua retida no RE (Heine et al., 2007). As proteínas
de membrana residentes no RE são mantidas no organelo devido à presença da
sequência linear K(X)KXX ou de outras sequências menos comuns como um motivo
de arginina (Michelsen et al., 2005), ou CVLF (Zarei et al., 2004). Adicionalmente, é
possível que proteínas integrais de membrana sejam retidas por incorporação em
estruturas oligoméricas de tamanho considerável e que se mantém relativamente
imóveis ao nível da membrana do RE (Nikonov e Kreibich, 2003).
A observação da proteína CLN6 em organelos ou estruturas citopasmáticas
como o CG ou os endossomas de reciclagem sugere que a proteína CLN6 poderá não
ficar retida no RE. Porém, a proteína CLN6 não possui locais de N-glicosilação com a
sequência NX(S/T) (X= um qualquer aminoácido) e, por isso, não é provável a sua
exportação do RE através da via secretora clássica. A exportação de proteínas de
membrana a partir do RE é um processo selectivo mediado por sinais específicos,
nomeadamente motivos diacídicos e dihidrofóbicos (Nufer et al., 2002). Através da
interacção destes sinais de endereçamento específicos com proteínas específicas de
vesículas de clatrina (adaptinas) é possível regular a concentração das proteínas de
membrana em regiões específicas do RE onde são empacotadas em vesículas
transportadoras COP (cytosolic coated proteins) tipo II. O mecanismo pelo qual a
proteína CLN6 é exportada do RE deverá ser investigado no futuro.
Relativamente aos sinais de endereçamento de proteínas para o núcleo (NLS,
nuclear localization signal), o mais comum consiste em péptidos básicos constituídos
por resíduos de arginina e resíduos de lisina/histidina, (K/R)4-6 ou (K/R)2 X10-12 (K/R)3
(X, qualquer aminoácido) (rev. em Jans e Hassan, 2000), estando documentado que
estes sinais também podem desempenhar um papel ao nível citoplasmático (rev. em
Boulikas, 1993). Porém, bastantes mais NLS’s estão descritos, muitos dos quais
esporádicos (rev. em Christophe et al., 2000). No caso da proteína CLN6, a análise in
silico (Brameier et al., 2007) previu 3 NLS’s correspondentes às sequências lineares 5RRR7, 249KRKR252 e 287RKKY290. Se, de facto, estas sequências representam NLS’s
que interactuam com a importina α com vista ao transporte da proteína para o núcleo,
é uma questão que deverá ser investigada no futuro. O facto dos estudos efectuados
por Heine e colaboradores (2007) excluírem, em princípio, o envolvimento das
sequências 249KRKR252 e 288KK289 na retenção da proteína CLN6 no RE suporta a
hipótese destas sequências poderem actuar com NLS’s. O mecanismo de transporte
Discussão
67
do complexo proteína-importina α através do poro nuclear implica a interacção deste
complexo com o receptor importina β, e subsequente interacção com proteínas
específicas do poro nuclear (nucleoporinas). Uma vez transportada para a face luminal
do poro nuclear, a ligação de RanGTP à importina β induz a alteração conformacional
do receptor e subsequentemente a dissociação da proteína do receptor (importinas) e
retorno do receptor ao citoplasma (rev. em Jans e Hassan, 2000). Curiosamente, o
programa bioinformático ELM (The eukaryotic linear motif resource for functional sites
in proteins, http://www.elm.eu.org/) prevê um motivo (267ALTLLLV273) que possibilita a
ligação a receptores nucleares. Este mesmo programa prevê vários locais potenciais
de fosforilação, nomeadamente para a proteína cinase CK2. Por outro lado, é
conhecido que um dos mecanismos de regulação do processo de transporte nuclear
consiste na modulação directa da interacção proteína-importina através de fosforilação
(rev. em Jans e Hassan, 2000). Assim, é possível que a aparente discrepância
observada em SDS-PAGE/Western blot relativamente ao peso molecular da proteína
CLN6 (40 kDa versus 36 kDa) seja explicada por esta modificação pós-traducional
específica. Estudos recentes sugerem que a proteína CLN6 forma dímeros in vivo
(Heine et al., 2004; Heine et al., 2007) e que os segmentos N-terminal e C-terminal da
proteína estarão envolvidos na homodimerização ou interacção com outras proteínas
(heterodímeros). Esta observação é muito interessante na medida em que a
exportação da proteína a partir do RE e/ou a actividade da proteína no núcleo poderá
ser regulada por homo ou heterodimerização. De facto, a proteína CLN6 poderá não
possuir NLS’s e o seu endereçamento para o núcleo celular depender da interacção
com uma proteína que possua NLS’s.
A CLN6 não é a única proteína NCL com localização nuclear. A proteína CLN3
endógena de células de cérebro humano (Margraf et al., 1999) e, mais recentemente,
a proteína CLN5 endógena de fibroblastos humanos foram localizadas no núcleo
(Bessa, não publicado). Estudos futuros deverão explorar a possibilidade de
interacção CLN6-CLN5 e CLN6-CLN3.
Estudos de imunofluorescência em células de doentes com a variante CLN6
sugerem que a delecção do resíduo I154, localizado entre o segmento
transmembranar 3 e 4, numa região luminal da proteína (Sharp et al., 2003), não
interfere com o tráfego da proteína CLN6 para o núcleo ou citossol. Adicionalmente,
em doentes com outras variantes da doença (CLN1, CLN2, CLN3 e CLN5), causadas
Discussão
68
por mutações específicas, não foi observada alteração na localização celular da
proteína CLN6. No entanto, nas variantes CLN1, CLN2 e CLN5 estudadas, é possível
que as mutações resultem na deficiência parcial de actividade biológica e essa
actividade residual seja suficiente para assegurar a localização intracelular correcta da
proteína CLN6. No caso da variante CLN3, não obstante a mutação ser uma delecção
de 1.02 kb, nos fibroblastos destes doentes foi detectado um nível de RNAm/CLN3
correspondente a cerca de 11% do nível observado em células controlo (Bessa et al.,
2006). Adicionalmente, estudos recentes (Kitzmüller et al., 2007) sugerem que a
proteína mutada retém actividade biológica. Essa actividade biológica residual poderá
ser suficiente para assegurar o endereçamento intracelular correcto da proteína CLN6,
no caso da proteína CLN3 estar envolvida no tráfego intracelular da CLN6p. De facto,
uma actividade residual da proteína mutada justificaria o fenótipo mais suave da
doença observado nas formas LINCL e JNCL, comparativamente às formas mais
graves da doença, como a forma congénita ou infantil. No entanto, presentemente não
é de excluir outras possibilidades, nomeadamente o facto da deficiência em qualquer
uma das proteínas NCL ter um impacto, directo ou indirecto, sobre a função das outras
proteínas NCL, mas não interferir com a sua localização celular. Por exemplo, a
actividade e quantidade da enzima TPP1 está aumentada em várias formas de NCL, e
noutras doenças neurodegenerativas como a doença de Alzheimer, tratando-se
possivelmente de uma alteração secundária (Junaid e Pullarkat, 1999); alterações do
pH foram descritas em várias formas de NCL (Holopainen et al., 2001) e podem estar
associadas à acumulação da subunidade c da ATP sintetase mitocondrial uma vez
que a acção sequencial da TPP1 e da catepsina D é necessária para a degradação da
subunidade que é dependente do pH (Kominami, 2002).
Capítulo 6
Conclusões
Conclusão
71
6. Conclusão
Os resultados obtidos no âmbito do presente trabalho contribuíram para o
conhecimento acerca da localização celular da proteína CLN6 de FHC. A co-
localização da proteína ao nível dos filamentos de actina e do núcleo, juntamente com
a informação previamente existente quanto à sua localização no RE, CG e
endossomas de reciclagem, sugere a participação da proteína CLN6 numa via de
sinalização, que se inicia à superfície celular e implica transdução do sinal para o
citossol e núcleo celular, onde serão causadas alterações específicas ao nível da
expressão genética. Uma rápida distribuição da proteína do citossol para o núcleo será
necessária para assegurar a correcta sinalização pretendida pela célula. Se o papel da
proteína CLN6 nessa hipotética via de sinalização está associada a lípidos,
nomeadamente esfingolípidos, é uma questão a investigar no futuro.
A hipótese de participação da proteína CLN6 numa via de sinalização é apoiada
pelos resultados obtidos previamente em estudos de expressão por cDNA microarrays
em fibroblastos de doentes com a variante CLN6 (Teixeira et al., 2006), que sugerem
como factores etio-patogénicos da CLN6 a remodelação da matriz extracelular, o
tráfego vesicular, a transdução de sinal associado à cascata de cinases MAP e os
mecanismos apoptóticos e anti-apoptóticos.
A investigação a desenvolver no futuro deverá procurar explorar estas hipóteses,
tentando esclarecer os determinantes moleculares dessa via de sinalização hipotética,
onde outras proteínas NCL poderão estar também implicadas.
Capítulo 7
Perspectivas Futuras
Perspectivas Futuras
75
7. Perspectivas futuras
Os resultados obtidos no âmbito deste trabalho corroboraram o conceito de
localização celular diversa para a proteína CLN6 e contribuíram para o seu
esclarecimento, na medida em que estudos de imunofluorescência indicaram a
presença desta proteína no núcleo e a sua associação, directa ou indirecta, a
filamentos de actina do citoesqueleto. Estes resultados deverão ser comprovados por
outras abordagens experimentais, nomeadamente por fraccionamento celular e
estudos de imunoprecipitação visando a identificação das proteínas que interactuam
de forma directa ou indirecta com a proteína CLN6 e, subsequentemente, o
conhecimento dos intervenientes moleculares da via celular em que participa a
proteína CLN6. Por outro lado será importante determinar a localização sub-celular da
proteína CLN6 em células neuronais utilizando os anticorpos anti-CLN6 usados neste
estudo. A presença da proteína CLN6 ao nível dos lipid rafts da membrana plasmática,
nas regiões em que foi observada co-localização com a actina, também deverá ser
investigada.
Um aspecto básico a esclarecer no futuro é o da natureza membranar da
proteína CLN6, para a qual não existe, presentemente, uma evidência experimental
bioquímica robusta.
O mecanismo molecular de endereçamento da proteína para os
compartimentos/estruturas celulares onde foi observada é um outro aspecto de
especial relevância. Estudos moleculares, bioquímicos e celulares de linhas celulares
de doentes com a variante CLN6 com mutações específicas poderão ser úteis no
esclarecimento desta questão.
Adicionalmente, estudos de proteómica serão importantes para explorar as
alterações secundárias e terciárias decorrentes da deficiente actividade biológica da
proteína CLN6. Estes estudos deverão fornecer pistas importantes relativas à função
desta proteína a nível celular.
Capítulo 8
Referências Bibliográficas
Referências Bibliográficas
79
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