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Técnicas Cromatográficas

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA

CENTRO DE EDUCAÇÃO SUPERIOR NORTE – RS

CURSO DE ENGENHARIA AMBIENTAL

Frederico Westphalen, Julho de 2013

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Fundamentos

MÉTODOS DE SEPARAÇÃO

• PRECIPITAÇÃO

• DESTILAÇÃO

• TROCA IÔNICA

• EXTRAÇÃO POR SOLVENTES

• CROMATOGRAFIA

• ELETROFORESE

Fundamentos

M. TSWEET (1903): Separação de misturas de

pigmentos vegetais em colunas recheadas com

adsorventes sólidos e solventes variados.éter de

petróleo

CaCO3

mistura de

pigmentospigmentos

separados

Cromatografia =

kroma [cor] + graph [escrever]

FONTE: LOUGH & WAINER, 1997.

LCCromatografia a

Líquido

SFCCromatografia a

Fluido Supercrítico

GCCromatografia a

Gás

LCPlanar

LCColuna

CromatografiaPapel

CCDCromatografia

Camada Delgada

ColunaEmpacotada

Coluna "Open Tubular" Capilar

dc < 350 um

Coluna Capilarempacotadadc <= 350 um

Coluna Microbore

350 um < dc < 1 mm

Coluna "Analítica"

1 mm < dc < 8 mm

Coluna Preparativadc >= 8 mm

CROMATOGRAFIA

Fundamentos

Modalidades e Classificação

FM = Líquido

FM = Gás

Cromatografia Líquida

Cromatografia Gasosa

Em CG a FE

pode ser:

Sólida

Líquida

Cromatografia

Gás-Sólido (CGS)

Cromatografia

Gás-Líquido (CGL)

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Princípio Básico

Separação de misturas por interação diferencial dos seus

componentes entre uma FASE ESTACIONÁRIA (líquido ou

sólido) e uma FASE MÓVEL (líquido ou gás).

tR

tM

tR’ = tR - tM

TEMPO

SIN

AL

tR = Tempo de Retenção (tempo decorrido entre a injeção e o ápice do

pico cromatográfico)

tM = Tempo de Retenção da Fase Móvel

tR’ = Tempo de Retenção Ajustado (tR’ = tR – tM)

O parâmetro diretamente mensurável de retenção de um

analito é o Tempo de Retenção Ajustado tR’

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A migração um analito pela

coluna provoca

inevitavelmente o

alargamento da sua banda:TEMPO

Efeitos do alargamento excessivo de picos:

Separação deficiente de analitos

com retenções próximas.

Picos mais largos e menos

intensos = menor detectabilidade

EFICIÊNCIA Capacidade de eluição com o mínimo de

dispersão do analito.

Eficiência = número de pratos teóricos

1 prato teórico = 1 equilíbrio entre a FM e a FE

Quanto maior o número de pratos teóricos, maior o

número de equilíbrios, maior eficiência.

n = 5,545 (tR)2

Wh

Wb = largura do pico na base

Wh = largura do pico a meia altura

Resolução (Rs) = separação entre picos vizinhos

Rs1 SATISFATÓRIA

Rs = 2 (tR2 – tR1 )

Wb1 + Wb2

Rs = 1,17 (tR2 – tR1 )

Wh1 + Wh2

SÉRIE ELUOTRÓPICA

• CROMATOGRAFIA FASE REVERSA

FASE ESTACIONÁRIA: APOLAR FASE MÓVEL: POLAR

• CROMATOGRAFIA FASE NORMAL

FASE ESTACIONÁRIA: POLARFASE MÓVEL: APOLAR

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High Performance Liquid ChromatographyHigh Performance Liquid Chromatography

• Cromatografia a Líquido de Alto Desempenho

• CLAE

HPLCHPLC

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DetectorSistema de Tratamento

de Dados

Bomba HPLC

Injetor

Precoluna

Coluna Analitica

Filtro em linha Scavenger

Reservatórios para

os solventes

HPLCHPLC

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Eluição Isocrática / Eluição Isocrática / GradienteGradiente

• ISOCRÁTICA = a composição da fase móvel não muda durante a corrida.

• GRADIENTE = a composição da fase móvel varia de acordo com a polaridade dos analitos. Bomba binária/quaternária.

Aplicações HPLCAplicações HPLCSubstâncias químicasSubstâncias químicas

• Proteínas

• Ácidos nucléicos

• Aminoácidos

• Corantes

• Polissacarídeos

• Pigmentos plantas

• Metabólitos plantas

• Produtos farmacêuticos

• Compostos iônicos

• Íons metálicos

• Cátions e ânions

• Lipídeos polares

• Complexos metais pesados

• Explosivos

• Polímeros sintéticos

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• Classificação baseada na Natureza da Fase Móvel

• NPC– Fase móvel Apolar hexano, isooctano– Fase estacionária Polar sílica, alumina

• RPC– Fase móvel Polar metanol, água– Fase estacionária Apolar C8, C18

Cromatografia Fase Normal (NPC)Cromatografia Fase Normal (NPC) x x

Cromatografia Fase Reversa (RPC)Cromatografia Fase Reversa (RPC)

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Analgésicos ComprimidosColuna: Pecosphere 3x3 C18

(3-µm, 33 x 4.6 mm i.d.)

Fase Móvel: 15% ACN em HAc a 0.1%

Fluxo: 2 mL/min

Detecção: UV a 240 nm

Identificação Picos

1. Acetaminofeno

2. Cafeína

3. Salicilamida

4. Ácido Acetilsalicílico

1

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CGCG

Fonte: RITA CERDEIRA

Cilindro de gás

Injector da amostra

Coluna CG aquecida

Detector

Registrador

Cromatograma

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Fase MóvelCARACTERÍSTICAS da FASE MÓVEL, OU GÁS DE

ARRASTE:

• InerteInerte não interage nem com a amostra, nem com a não interage nem com a amostra, nem com a

fase estacionária, apenas transporta a amostra através da fase estacionária, apenas transporta a amostra através da

coluna.coluna.

• PuroPuro isento de impurezas que possam contaminar a isento de impurezas que possam contaminar a

amostra, ou gerar ruído no sinal.amostra, ou gerar ruído no sinal.

• Compatível com o DetectorCompatível com o Detector

• Exemplos – Exemplos – HH22, N, N22, He, He

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FASE ESTACIONÁRIA:

• Líquido depositado sobre superfícies de:Líquido depositado sobre superfícies de:

Tubos finos – colunas capilaresTubos finos – colunas capilaresSólidos – colunas empacotadasSólidos – colunas empacotadas

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• QUIMICA:QUIMICA:– Determinação de antioxidantes, nutrientes ou Determinação de antioxidantes, nutrientes ou

contaminantes em alimentoscontaminantes em alimentos• INDÚSTRIA:INDÚSTRIA:

– Monitorização de processos industriaisMonitorização de processos industriais• SAÚDE:SAÚDE:

– Análises dos constituintes do sangueAnálises dos constituintes do sangue– Análise forenseAnálise forense

• AMBIENTE:AMBIENTE:– Determinação de resíduos de pesticidas em produtos Determinação de resíduos de pesticidas em produtos

alimentares, águas ou esgotosalimentares, águas ou esgotos– Determinação de gases e solventes orgânicos na Determinação de gases e solventes orgânicos na

atmosfera, solos ou riosatmosfera, solos ou rios– ......

AplicaçõesAplicações