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Alexandre Soares Rosado
Unidade de Ecologia microbiana e biotecnologia do
Petróleo do polo de Biotecnologia BIOINOVAR -
UFRJ
13 de setembro de 2013 -UERJ
Biorremediação de ambientes
contaminados por petróleo e
derivados
Origem do Petróleo
O petróleo é originado de grandes deposições fósseis, é uma
mistura bastante complexa de compostos orgânicos e com um alto
conteúdo de energia.
Rocha geradora
Tipos de hidrocarbonetos encontrados no
Petróleo)
• Fração saturada – Parafinas ( n-alcanos, alcanos ramificados) e Naftenos ( cicloalcanos)
• Fração insaturada (aromáticos, oleofinas, diolefinas e acetilênicos)
• Compostos não hidrocarbônicos, como os ácidos naftênicos e sulfurados
Os efeitos tóxicos imediatos
Os efeitos crônicos da poluição com petróleo são pouco conhecidos.
Moléculas de baixa
massa molecular
Moléculas de alta massa
molecular
Toxicidade
Efeitos carcinogênicos e
citogenéticos de longo prazo
Diminuição da diversidade de espécies
Petróleo
A principal fonte de energia do planeta, de distribuíção não
homogênea entre os países e um recurso não-renovável
A sociedade atual é extremamente dependente da utilização de
petróleo para o seu desenvolvimento.
O Petróleo se tornou provavelmente a mais importante substância
negociada entre países e corporações levando a guerras, massacres e
extermínios.
Crise do petróleo na década de 1970
A Primeira Guerra do Golfo
Diferentes guerras entre os países árabes, inclusive a Guerra Irã-Iraque
A luta pela independência da Chechênia
Guerra Iraque-Estados Unidos (Invasão do Iraque)
Petróleo
FONTES DE POLUIÇÃO DE HIDROCARBONETOS NO MAR
Esgoto Industrial e Urbano 62%
Navios não Petroleiros 15%
Fonte Natural 10%
Operação de Petroleiros 7%
Acidentes com Petroleiros 3%
Exploração & Produção 2%
Terminais / Refinarias 1%
Biodegradação
Utilização de hidrocarbonetos por microrganismos:
ZoBell, 1946, observou a capacidade degradativa de
bactérias pertencentes a 30 gêneros
Ampla distribuição na natureza.
Utilização dependente da natureza química e das
condições ambientais.
Ataque inicial por oxigenases
O2 O2
Degradação por vias periféricas
Ciclo TCA
CO2
H2O
PO4 3-
SO4 2-
Fe3+
Biomassa celular
Multiplicação
NH4=
HIDROCARBONETOS
O2
http://www.miamisci.org/microbes/images/soil-bacteria.gif
http://archive.globe.gov/sda/tg97/soil/img/big/forest_soil.jpg
http://www.umcpegypt.umd.edu/img/dna2.jpg
http://earthstar2000.com/ebay/microtube.jpg
http://www.bio.ic.ac.uk/research/rhac/Gel020706-3.gif http://www.stanford.edu/group/CFRL/chromatogram.jpg
http://plantbio.berkeley.edu/~volkman/courses/dendrogram.gif http://www.santarosa.edu/lifesciences/ensatree.gif
DIVERSIDADE E BIOTECNOLOGIA
MICROBIANA PROMOVENDO
SUSTENTABILIDADE”
O que procuramos?
Estudos sobre a diversidade
e
Bioprospecção
microbiana
Uso de “ Tecnologias Limpas”
Aplicação
de ações que levem ao desenvolvimento sustentável
Estratégias de Remediação
Quantidade do contaminante
Características do ambiente
Seleção
Tecnologias mais
adequadas
•Melhor relação custo-benefício
•Tempo de tratamento
Biorremediação
Processo Promissor
Aceitação
•Agências
Reguladoras
•Opinião pública
FORMA “NATURAL” DE TRATAMENTO
Técnica de remediação Euro/m3
Incineração Ex-situ 785
Aterro Ex-situ 231
Lavagem/Trat. térm. 226-229
Fitorremediação 122 (22-222)
Imobilização In/Ex-Situ 112-139
Air Sparging/Bomb. Trat. 91-71
Biorremediação-Landfarming 62-73
Muros reativos/de contenção 50-55
Atenuação natural monitorada 20
Fonte: www.cordis.lu (junho, 2006)
Custos de técnicas de remediação
Países (11) da CEE
http://www.cordis.lu/
Bioestimulação
Bioaumento
Correção de fatores e/ou adição de
nutrientes específicos para garantir a
quantidade e a qualidade da
microbiota nativa
Adição de linhagens microbianas
compatíveis com o local contaminado
TÉCNICAS DE TRATAMENTO BIOLÓGICO
EMM
Manguezais no Brasil:
Também conhecidos como florestas de mangue ou simplesmente mangues, estes ecossistemas costeiros, situam-se na faixa tropical e subtropical do mundo. No Brasil, estes ambientes distribuem-se ao longo da costa desde o Estado do Amapá até Santa Catarina, perfazendo uma área total de 25.000 Km2 (Vergara-Filho, 1993).
Avaliação de diferentes estratégias para
biorremediação de manguezais
I. Avaliação Pré-tratamento
II. Experimento de microcosmo
III. Experimento Piloto
Amostra de manguezal
Análise físico-química
Análise textural
Análise microbiológica
Análise da profundidade de penetração do óleo e potencial Redox
Técnicas convencionais Isolamento e Contagem de
Rizosfera e sedimentos
Caracterização dos isolados e Potencial de biodegradação
Seleção dos isolados degradadores
Técnicas Moleculares Rizosfera e sedimentos
Biblioteca de clones
Perfil genético da comunidade microbiana (PCR/DGGE)
Etapa I
Planejamento fatorial
Microcosmos
Sem a planta Com a planta
Etapa II
Experimento Piloto
Químico (TPH, óleo residual) Monitoramento Físico químico
Toxicológico Ecológico
Etapa III
Diagnóstico do ambiente
Portão Efluente
3m 3m 3m
Amostra composta controle 1
Amostra composta controle 2
Amostra composta controle 3
0
20
40
60
80
100
120
Gama proteobacteria
alpha proteobacteria
delta proteobacteria
beta proteobacteria
Gama proteobacteria
alpha proteobacteria
delta proteobacteria
beta proteobacteria
a b
c d
e
Bacteria (a); Pseudomonas (b); Actinobacteria (c); Betaproteobacteria (d) and; Alphaproteobacteria (e). O manguezal é representado por nove pontos (1A, 1B, 1C, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C) e o manguezal de referência é representado pela sigla “cab”. S e R indicam amostras de sedimento ou rizosfera, respectivamente.
log CFU/ml
log CFU/ml
Amostras Contagem
(NMP de mo. Deg.de óleo/ 100mL)
R ctr 23 X 102
R3A 43 X 102
R3B 24 X 103
R3C 21 X 103
R2A 23 X 102
R2B 23 X 102
R2C 93 X 102
R1A 23 X 102
R1B < 3 X 102
R1C 15 X 102
S ctr < 3 X 102
S1 comp. 4 X 102
S2 comp. 9 X 102
S3 comp. 2,3 X 103
A B C D E F
1 2 3 4
Isolamento e caracterização de microrganismos degradadores de óleo
Produção de Biossurfactantes
Inoculação das estirpes degradadoras em meio BH
líquido acrescido de óleo a 0,1% para
acompanhamento do perfil de degradação.
Compostos alvo (µg/l, ppb)
Controle
Estirpe R1C -2A
% de degradação
n C10
825,02
21,09
97,44 n C11
1186,84
5,6
99,52 n C12
1401,15
3,25
99,77 n C13
1954,97
40,58
97,92 n C14
2211,94
47,21
97,86 n C15
2471,63
3,1
99,88 n C16
2452,62
1,68
99,93 n C17
3220,89
28,75
99,1 n C18
1961,78
50,58
97,42 n C19
1631,63
1,1
99,93 n C20
1440,83
1,6
99,99 n C21
1388,57
5,61
99,59 n C22
1193,70
8,05
99,32 n C23
1123,38
10,74
99,04 n C24
1046,75
18,62
98,22 n C25
1040,54
2,42
99,77 n C26
849,03
31,54
96,28 n C27
783,62
2,45
99,7 n C28
550,06
16,09
97,07 n C29
480,66
15,37
96,8 n C30
376,32
18,83
95 n C31
526,44
31,52
94 n C32
383,55
27,80
92,75 n C33
288,29
22,84
92,07 n C34
185,65
12,67
93,17 n C35
144,77
9,72
93,28 n C36
114,29
14,40
87,4 Total
333.521,8
1.287,56
99,61
Montagem do Consórcio
Utilização de bomba peristáltica para formação de células em grânulos
Microcosmos
Produção e plantio das mudas
Montagem do Experimento de campo
Montagem do Experimento de campo
Experimento de biorremediação – Campo e Viveiro
Crescimento Vegetal
Fisiologia Vegetal
Taxa de atividade fotossintética das mudas no viveiro e no manguezal
Produção de pigmentos pelas mudas no viveiro e no campo
Taxa de atividade fotossintética das mudas do
campo e no viveiro submetidas aos diferentes
tratamentos de biorremediação
Análise de teores de nutrientes em amostras foliares
Análises microbiológicas Sedimento
Campo -9 meses após inoculação
Análises microbiológicas Rizosfera
Campo –Antes da inoculação e 3 meses após inoculação
L. racemosa
Análises microbiológicas Rizosfera
Viveiro – 3 meses após inoculação
L. racemosa
Análises microbiológicas Rizosfera
Campo – 6 meses após inoculação
R. mangle
Conclusões, Considerações finais e
Recomendações
O projeto intitulado “Avaliação de diferentes
estratégias para biorremediação de manguezais”
contribuiu de maneira bastante abrangente para guiar
futuros estudos de biorremediação de manguezais.
Além de ter contribuído com um extenso
levantamento acerca da diversidade microbiana de
um manguezal brasileiro, esse trabalho pioneiro,
utilizou pela primeira vez diferentes estratégias de
biorremediação in situ em manguezal brasileiro e
técnicas moleculares de monitoramento microbiano.
Esse é o primeiro estudo a realizar esse tipo de mapeamento e correlação entre a diversidade microbiana (utilizando-se métodos convencionais e moleculares) e a estrutura heterogênea química de manguezais, demonstrando que essa diversidade corresponde às variações químicas de diferentes nichos dentro de um mesmo ambiente.
“DNA Barcoding” Indicadores de qualidade
Montagem do consórcio bacteriano de degradação de óleo a ser aplicado nos
experimentos de biorremediação
Nesse ponto, a equipe se deparou com um dos desafios desse projeto; Montar uma estratégia que permitisse a manutenção do consórcio microbiano e do fertilizante (Bioestímulo) em campo ao longo do tempo, sem que houvesse uma “lavagem” desses inóculos devido à ação da maré. Solução encontrada-Fertilizantes: Fertilizantes de liberação lenta, enterrados no sedimento contido
Solução desenvolvida – Consórcio: As bactérias do consórcio foram “encapsuladas” em uma matriz que além de permitir a manutenção física das bactérias no campo, permitiu ainda a liberação desses organismos gradativamente.
Dessa forma, desenvolvemos e utilizamos uma estratégia utilizando os microrganismos e fertilizantes associados às mudas do replantio, garantindo não apenas a manutenção dos inóculos em campo como ainda o estabelecimento desses nas rizosferas das mudas. Assim, além da aplicação na degradação do óleo no sedimento, as próprias mudas puderam utilizar esses inóculos, que por sua vez permitiram um melhor e mais rápido desenvolvimento das plantas.
Segundo obstáculo
A grande heterogeneidade da distribuição do óleo em manguezais (não permite uma avaliação clara dos resultados das análises de HTP e HPA)
Nossa recomendação é que em estudos de biorremediação de manguezais outros
parâmetros sejam levados em conta para avaliar a recuperação do ambiente, entre eles, o uso de indicadores biológicos de
recuperação como a diversidade microbiana e as respostas vegetais.
Microrganismos já são propostos na literatura como excelentes indicadores de alterações e recuperação ambiental; Quanto aos vegetais, eles são uma das bases do ecossistema manguezal. Dessa forma, havendo recuperação das espécies vegetais em manguezais, outros organismos tendem a retornar a esse ambiente e todo o ecossistema tende a se reestruturar e recuperar.
O monitoramento microbiológico e do desenvolvimento de plantas revelou o eficiente estabelecimento dos inóculos através da observação das alterações dos perfis microbianos de áreas sob diferentes tratamentos (microrganismos indicadores de alterações, no caso, dos tipos de tratamento estabelecidos);
O tratamento de Bioestímulo + Bioaumento proporcionou melhor desenvolvimento das espécies vegetais (tanto L. racemosa quanto R. mangle).
Resultado... Estimulo no crescimento das plantas, degradação de
hidrocarbonetos, manutenção da microbiota nativa
=
Recuperação do ambiente sem causar impactos secundários
EMM
Exploring our microbial collection potential
Agradecimentos:
Raquel Peixoto, Norma
Rumjanek, Andrew Macrae,
Heitor Coutinho
Flavia Freitas, Gina Vasques,
Staffan Kjellberg
Fábio Mota & Lucy Seldin
Petrobras
Embrapa
CNPq
mailto:[email protected]