1975 - Stanley Cohen1975 - Stanley Cohen

PlasmídeoPlasmídeo

Conferencia de Asilomar - 1975

Pacific Grove - California USA

- 139 cientistas de 17 nações

- Recombinant DNA Advisory Commitee - RAC

Normas para contenção biológica - P1 P4

ENZIMAS DE RESTRIÇÃOW. Alber H. Smith D. Nathans

Ferramentas de trabalhoFerramentas de trabalho

Enzimas de restriçãoEnzimas de restrição

Sistema restrição/modificação

Tipo II - utilizadas na TDR: reconhecem seqüências específicas de nucleotídeos no DNA - palíndromos, atuam como verdadeiras tesouras moleculares

Tipos de cortes:

Produção de terminais coesivos (adesivos, protuberantes)

Produção de terminais abruptos (ou cegos)

a) Clivagem no eixo de simetria

Moléculas com extremidades abruptas

Moléculas com extremidades coesivas

b) Clivagem simétricamente situada ao redor do eixo de simetria

...TC GA...

...AG CT...

3 ’

5 ’ 3 ’

5 ’

+

...GAA TTC...

...CTT AAG...

+3 ’

5 ’ 3 ’

5 ’

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

EcoRI

Enzima Organismo Sequênciab

AluI Arthrobacter luteus 5’ AG CT

BamHI Bacillus amyloliquefasciens H 5’ G GATCC

HaeIII Haemophilus aegyptius 5’ GG CC

HindIII Haemophilus influenzae Rd 5’ A AGCTT

EcoRI Escherichia coli RY13 5’ G AATTC

Gênero

Espécie Linhagem

Ordem de descoberta

Enzima de restrição Enzima de restrição EcoEcoRIRI

A tecnologia do DNA recombinante

Extremidades coesivas

Fragmento de DNA - inserto

DNA plasmidial -

vetor

LIGASELIGASE

LigaçãoLigação

Construção do DNA Recombinante

Molécula de DNA de um plasmídeo circular

Clivagem com enzima de restrição

Molécula de DNA de um plasmídeo linear com extremidades coesivas

anelamento

Ligação covalente pela DNA ligase

Molécula de DNA plasmidial contendo o inserto

Inserção em uma célula hospedeira

VetoresVetores HospedeirosHospedeiros UtilizaçãoUtilizaçãoPlasmídeos

Cosmídeos

Virus

Bactérias / levedurasclonagem

Terapia gênicaCélulas eucarióticas

Bacteriófagos

Plasmídeos: são usados para clonar fragmentos de DNA de vários pares de bases a centenas de pares de bases.

Bacteriófagos: são usados para clonar fragmentos de DNA de 10.000 - 20.000 pares de bases.

Cosmídeos: são estruturas híbridas que possuem características do bacteriófago associadas à do plasmídeo pBR322, e são utilizadas para a clonagem dos maiores segmentos de DNA.

Chromosomos artificiais para bactérias (BAC) e leveduras (YACs): podem ser usados para clonagem de fragmentos de DNA com centenas a milhões de pares de bases.

Tipos de VetoresTipos de Vetores

PlasmídeoPlasmídeopBR 322pBR 322

PlasmídeoPlasmídeopUC 18pUC 18

BacteriófagoBacteriófago

PlasmídeoPlasmídeopara leveduraspara leveduras

Cosmídeos para levedurasCosmídeos para leveduras

Cromossomo Cromossomo artificial para artificial para

bactériabactéria

Cromossomo Cromossomo artificial para artificial para

levedurasleveduras

A tecnologia do DNA recombinante

Cortar o DNA Cortar o DNA com enzimas com enzimas de restriçãode restrição

Inserir Inserir fragmentos em fragmentos em

vetoresvetores

Introduzir Introduzir vetores em vetores em

bactérias por:bactérias por:

eletroporação eletroporação ou choque ou choque

térmicotérmico

Fragmento 1Fragmento 1

Fragmento 2Fragmento 2

Fragmento 3Fragmento 3

Fragmento 4Fragmento 4

Transformação Transformação bacterianabacteriana

EletroporaçãoEletroporação

PlaqueamentoPlaqueamento