UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS

CURSO DE AGRONOMIA

ANA KELLY FIRMINO DA SILVA

INVESTIGAÇÃO DE HOSPEDEIRAS ALTERNATIVAS DE BEGOMOV ÍRUS PARA

TOMATEIRO POR MEIO DE TÉCNICAS BIOLÓGICAS E MOLECUL ARES

FORTALEZA

2007

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ANA KELLY FIRMINO DA SILVA

INVESTIGAÇÃO DE HOSPEDEIRAS ALTERNATIVAS DE BEGOMOV ÍRUS PARA

TOMATEIRO POR MEIO DE TÉCNICAS BIOLÓGICAS E MOLECUL ARES

Monografia apresentada ao Curso de

Agronomia do Centro de Ciências Agrárias da

Universidade Federal do Ceará, como parte

das exigências da Disciplina Atividade

Supervisionada.

Orientadora: Profª Dra Carmem Dolores G. Santos

3

4

ANA KELLY FIRMINO DA SILVA

INVESTIGAÇÃO DE HOSPEDEIRAS ALTERNATIVAS DE BEGOMOV ÍRUS

PARA TOMATEIRO POR MEIO DE TÉCNICAS BIOLÓGICAS E MO LECULARES

Monografia apresentada ao Curso de

Agronomia do Centro de Ciências Agrárias da

Universidade Federal do Ceará, como parte

das exigências da Disciplina Atividade

Supervisionada.

APROVADA em: 05/ 07/2007

Orientadora Prof. Dra. Carmem Dolores Gonzaga Santos

Universidade Federal do Ceará

Conselheira Prof. Dra. Cândida Hermínia Campos Magalhães Bertini

Universidade Federal do Ceará

Conselheiro M. Sc Fernando Antonio Souza de Aragão

Pesquisador da Embrapa Agroindústria Tropical

5

DEDICO

Aos meus pais Francisco Rosário da Silva e

Maria de Fátima Firmino, aos meus irmãos

Alexandre, Ana Lúcia, Ana Maria e Ana

Paula, ao meu esposo Luís Alex, a minha filha

Bianca Gabrielle, aos meus sobrinhos e a

todos os demais familiares pelo apoio e

compreensão nos momentos difíceis e ao

amor a mim dedicado.

6

AGRADECIMENTOS

Á Deus pelo o Dom da vida e por me dar forças para enfrentar os desafios que

surgiram ao longo de minha caminhada.

A Universidade Federal do Ceará por disponibilizar o curso de Agronomia.

Ao PET (Programa de Educação Tutorial), pela formação técnica e intelectual, pela

bolsa de estudos concedida e instalações utilizadas.

Ao Laboratório de Virologia Vegetal-UFC pela colaboração na realização deste

trabalho.

A professora Carmem Dolores Gonzaga Santos por sua orientação, ensinamento, por

seus conselhos e confiança.

Aos professores Ervino Bleicher, Márcio Cleber de Medeiros Correa e Cândida

Hermínia Campos Magalhães Bertini por seu compromisso, disponibilidade, ensinamentos e

amizade.

A professora Cândida Bertini por participar da banca e pelas informações sugeridas.

Ao pesquisador da Embrapa Agroindústria Tropical Fernando Aragão pela

participação na banca, e pelas sugestões.

A todos os professores do curso de Agronomia da Universidade Federal do Ceará,

que de alguma forma contribuíram para minha formação profissional.

Aos meus colegas de Curso pela amizade, solidariedade e ajuda.

A equipe do Laboratório de Virologia: Aline Kelly, Fatinha, Eduardo, Ana Lúcia,

Marilena e a do laboratório de Fitopatologia: Kelma, Natália, Francisco José, Aurigélia,

Conceição, Maria Paula, Camila por toda ajuda na condução dos experimentos.

A todos os bolsistas e colegas do PET-Agronomia por todas as experiências e

amizades.

Em especial as minhas amigas Elisangela Maria, Aline Kelly por fazerem parte dos

momentos alegres e difíceis vividos durante a minha formação profissional.

Enfim, a todos que de alguma forma contribuíram para o sucesso deste trabalho, e de

minha vida acadêmica.

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RESUMO

O tomateiro (Lycopersicon esculentum Mill .) é uma das hortaliças mais apreciadas em todo o mundo. Dentre as numerosas enfermidades da cultura, destacam-se as viroses causadas por begomovírus, os quais são transmitidos pela mosca-branca, Bemisia tabaci biótipo B. Infecções naturais desses vírus têm sido relatadas em plantas daninhas, as quais podem constituir importantes fontes do patógenos para o tomateiro. Na Chapada da Ibiapaba, os begomovírus têm sido relatados em numerosas lavouras de tomate causando sérios danos à produção. Este trabalho teve por objetivo investigar a transmissão de begomovírus a partir de tomateiros infectados para plantas daninhas, bem como verificar a transmissão viral retornando das plantas daninhas para o tomateiro. Para tanto, mudas sadias de tomateiro e de plantas daninhas como: bredo de espinho (Amaranthus spinosus), caruru de mancha (Amaranthus viridis), mentrasto (Ageratum conyzoides) e picão preto (Bidens pilosa), espécies comumente encontradas nas lavouras de tomate, foram submetidas à inoculação, por meio de três formas: moscas-brancas virulíferas, enxertia e inoculação mecânica. Após 15 dias, realizou-se a extração do DNA de amostras foliares das plantas daninhas e dos tomateiros inoculados. A PCR realizada com oligonucleotídeos degenerados e específicos para begomovírus, revelou que na transmissão com o vetor as quatro espécies de plantas daninhas foram infectadas com o begomovírus do tomateiro, enquanto que por enxertia, apenas o picão preto foi infectado. Resultados positivos foram também constatados nas transmissões realizadas a partir das quatro espécies de plantas daninhas para o tomateiro. Constataram-se um percentual de 70%, 50%, 20 % e 12,5% de transmissão para o tomateiro quando o vetor adquiriu o vírus em mentrasto, bredo de espinho, picão preto e caruru de mancha, respectivamente. Na enxertia, a transmissão viral para o tomateiro ocorreu apenas quando se empregaram secções de bredo de espinho e de picão preto infectados. As plantas daninhas investigadas demonstraram ser hospedeiras alternativas do begomovírus de tomate, indicando que, em condições naturais e na presença do vetor podem ser fontes importantes desses begomovírus para a cultura do tomate.

Palavras-Chaves: Plantas daninhas, mosca-branca, PCR.

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ABSTRACT

Investigation of alternative host begomovirus from tomato by biological and molecular techniques

Tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) it is one of the vegetables more appreciated all over the world. Among the numerous diseases of the culture, the viruses caused by begomovirus are considered the most important diseases that affect the tomato plants. They are transmitted by the whitefly, Bemisia tabaci biotype B, and natural infections of those viruses have been reported in weeds, which can constitute important sources of the pathogen for the tomato. In the Chapada da Ibiapaba-Ce, the begomovirus have been found in numerous areas where tomatoes are cultivated causing serious damage to the production. The aim of this project was to investigate the transmission of begomovirus from infected tomatoes to weeds and from infected weeds to tomatoes. Healthy seedlings of weeds commonly found in the tomato farming such as: bredo de espinho (Amaranthus spinosus), caruru de mancha (Amaranthus viridis), mentrasto (Ageratum conyzoides) and picão preto (Bidens pilosa), as well as healthy seedlings of tomato were inoculated with the viruses by using viruliferous whiteflies, grafting or mechanical inoculation. After 15 days of the inoculation, leaves of the weed and tomato plants were collected for DNA extraction. Using specific oligonucleotideos for begomovirus in a PCR reaction we could detected the presence of begomovirus in all four species of weeds tested when tomato was used as a source of inoculum and whiteflies used as a vector. By grafting, only picão preto showed to be infected by begomovirus in the PCR reaction. When the four species of weeds infected with begomovirus were used as inoculum for the tomato seedlings, the transmission was also detected by PCR. When the vector acquired the virus in mentrasto, bredo de espinho, picão preto and caruru de mancha, a 70 %, 50 %, 20% and 12.5 % percentage of transmission was verified, respectively. By grafting, the viral transmission from infected weeds to tomatoes only happened when infected thorn bredo or picão preto were used as grafts. The investigated weeds demonstrated to be alternative hosts of the tomato begomovirus, indicating that, in natural conditions and in the presence of the vector they can be important sources of those begomovirus for the tomato plants. Word-keys: Weeds, whitefly, PCR.

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LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1-Mosca-branca (Bemisia tabaci biótipo B).................................................19

FIGURA 2-Tomate ‘ Santa Clara’ infectado com begomovírus...................................24

FIGURA 3-Mentrasto (Ageratum conyzoides L)..........................................................28

FIGURA 4-Bredo de espinho (Amaranthus spinosus L)..............................................28

FIGURA 5-Caruru de mancha (Amaranthus viridis L)................................................28

FIGURA 6- Picão preto (Bidens pilosa L)....................................................................28

FIGURA 7-Enxertia de ramos de tomateiro infectado..................................................35

FIGURA 8-Ensaio de transmissão de begomovírus com moscas-brancas virulíferas em

mudas de tomate provenientes de plantas daninhas ...............................36

FIGURA 9-Análise eletroforética em gel de agarose 1% de amostras de tomate e de

plantas daninhas infectadas com begomovírus.........................................39

FIGURA 10-Análise eletroforética em gel de agarose 1% de amostras de tomateiro

inoculado empregando-se o vetor tendo por fonte plantas daninhas........41

FIGURA 11-Análise eletroforética em gel de agarose 1% de amostras de tomateiros

enxertados tendo por fonte seções de plantas daninhas. .........................41

.

10

LISTA DE TABELAS

TABELA 1-Relação das plantas daninhas investigadas com relação ao

begomovírus.............................................................................................32

TABELA 2-Ensaio de transmissão de begomovírus de tomateiro para plantas

daninhas.........................................................................................................................38

TABELA 3-Ensaio de transmissão de begomovírus de plantas daninhas para

tomateiro..................................................................................................40

11

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS .......................................................................................................... 9 LISTA DE TABELAS ........................................................................................................ 10 1.INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 12 2 REVISÃO DE LITERATURA ....................................................................................... 14

2.1 A Cultura do Tomate............................................................................................... 14 2.2 Pragas e Doenças do tomateiro................................................................................ 17

2.2.1 Pragas do tomateiro 17 2.2.2 Doenças do tomateiro 20

2.3 Plantas Daninhas......................................................................................................25 2.4 Diagnose Viral.......................................................................................................... 29

2.4.1) O método de diagnose através de plantas indicadoras 29 2.4.2) Métodos Sorológicos 29 2.4.3) Métodos Moleculares 30

2.5 Controle de viroses................................................................................................... 31 3 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................ 32

3.1 Material Vegetal.................................................................................................... 32 3.2 PCR- Método empregado na detecção viral......................................................... 33

3.2.1 Extração de DNA total 33 3.2.2 Preparo das amostras para PCR 33

3.3 Teste de transmissão viral de tomateiro para plantas daninhas............................. 34 3.3.1 Inoculação empregando a mosca-branca 34 3.3.2 Inoculação por enxertia 34 3.3.3 Inoculação mecânica 34

3.4. Teste de transmissão viral de plantas daninhas para tomateiro............................ 35 3.4.1 Inoculação empregando a mosca-branca 35 3.4.2 Inoculação por enxertia 36

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................................... 37 5. CONCLUSÃO................................................................................................................ 41 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................... 43

12

1. INTRODUÇÃO

O tomateiro (Lycopersicon esculentum Mill) é uma hortaliça de grande aceitação

entre diferentes mercados consumidores o que tornou a tomaticultura uma atividade agrícola

de grande importância sócio-econômica, amplamente difundida no mundo todo. A razão de

sua apreciação na dieta humana está associada a sua aparência, ao sabor, ao aroma, à textura e

ao valor nutricional, principalmente, no conteúdo de vitaminas e minerais (ALVARENGA,

2004).

No Brasil são comercializadas, anualmente, cerca de 1,5 milhões de toneladas de

tomate. O tomateiro é a solanácea com maior volume de produção no país, sendo a principal

espécie dentre as hortaliças (MAKISHIMA; MIRANDA, 1995). Em 2006 se destacou na

nona posição da produção de tomate no mundo, com uma safra de 3,3 milhões de toneladas

em 2006 (TOMATE INDUSTRIAL, 2007).

No Ceará, o cultivo de hortaliças, principalmente o tomate, merece destaque

especial por constituir-se fonte geradora de emprego e renda, sobretudo na microrregião da

Ibiapaba, a qual responde pela maior produção do estado (LIMA, et al., 2000, TORRES-

FILHO, 2002).

Segundo Filgueira (2003), as cultivares que têm sido desenvolvida com

resistência genética a uma gama variada de doenças e anomalias, devido à incorporação da

característica “longa vida”, pode ser colhidos maduros e ser conservados à temperatura

ambiente. Os grupos de cultivares atualmente plantada no Brasil são: Santa Cruz, Salada ou

Caqui, Cereja, Italiano e Agroindustrial.

Diversos fatores interferem na produção e produtividade do tomateiro, dentre os

quais se destacam os problemas fitossanitários. Entre as olerícolas de importância econômica,

o tomateiro é uma das que apresenta um maior número de pragas, constituindo um dos fatores

responsáveis por danos à cultura, causando redução da produção Dentre as numerosas

enfermidades, as viroses vêm merecendo uma atenção especial em razão da presença

freqüente de insetos vetores (HAJI et al., 2004). Na natureza a disseminação de vírus em

tomate é feita na maioria das vezes por pulgões (Aphis gossypii Glover), mosca-branca

(Bemisia tabaci Genn. Biótipo B), cigarrinhas (Agallia albidula) e tripes (Frankliniella

schulzei Trybom) (MAKISHIMA; MIRANDA, 1995).

No Brasil, as viroses constituem um dos mais sérios problemas para a

tomaticultura, uma vez que apresenta dificuldade de controle. Os vírus mais comuns são:

Tobacco mosaic virus (TMV); Tomato mosaic virus (ToMV) do gênero Tobamovirus e

13

família Tombusviriridae, Cucumber mosaic virus (CMV), gênero Cucumovirus e família

Bromoviridae; Potato vírus Y (PVY) do gênero Potyvirus e família Potyviridae; Tomato

spotted wilt virus (TSWV), Tomato chlorotic spot virus (TCSV), Groundnut ring spot virus

(GRSV) e o Impatiens necrotic spot virus (INSV), Chrysanthemun stem necrosis virus

(CSNV) do gênero Tospovirus e família Bunyaviridae e o Tomato golden mosaic virus

(TGMV) do gênero Begomovirus e família Geminiviridae (RESENDE; CUPERTINO, 1996;

LOPES; ÁVILA, 2005).

Na última década, surtos epidêmicos de geminiviroses passaram a ocorrer em

todas as regiões produtoras de tomate do Brasil, associados à introdução, da mosca-branca,

vetor muito eficiente e com amplo círculo de hospedeiros. Na Chapada da Ibiapaba-Ce, os

begomovírus são predominantes nas lavouras de tomate, em razão da constante presença da

mosca-branca e, de acordo com Arnaud (2005), os freqüentes prejuízos devido à virose estão

provocando a redução de área plantada com a hortaliça na região.

Infecções por begomovírus têm sido frequentemente relatadas também em plantas

invasoras. Acredita-se que uma grande diversidade de espécies de geminivírus que estavam

restritas às plantas daninhas migrou para o tomateiro (EMBRAPA, 2007). Espécies de plantas

daninhas podem, assim, constituir importantes fontes de inóculo desses vírus para plantas

cultivadas, mediante transmissão pela mosca-branca (ASSUNÇÃO et al., 2004). No Ceará,

várias plantas daninhas já foram encontradas naturalmente infectadas por begomovírus nas

lavouras de tomate. Contudo, são ainda escassas as informações sobre a interação

begomovírus de tomate, plantas daninhas e vetor. Diante disso, este trabalho teve como

objetivo:

• Detectar begomovírus em tomateiros e em plantas daninhas através da PCR;

• Investigar a transmissão do begomovírus por vetor, por enxertia e inoculação

mecânica de tomateiro para plantas daninhas;

• Verificar a transmissão do vírus por vetor e por enxertia retornando das plantas

daninhas para tomateiro.

14

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 A Cultura do Tomate

O tomate é produzido e consumido em inúmeros países, in natura ou

industrializado. No Brasil, introduzido por imigrantes europeus no final do século XIX,

tornou-se a segunda hortaliça em importância, sendo cultivado na maioria dos estados. A

maior parte da colheita nacional destina-se à mesa; porém, a produção destinada às

agroindústrias vem crescendo, especialmente na região dos cerrados (FILGUEIRA, 2003).

O centro primário de origem do tomateiro é um estreito território, limitado ao

norte pelo Equador, ao sul pelo norte de Chile, a oeste pelo oceano Pacífico e a leste pela

Cordilheira dos Andes. Antes da colonização espanhola, o tomate foi levado para o México -

centro secundário, onde passou a ser cultivado e melhorado. Foi introduzido na Europa,

através da Espanha, entre 1523 e 1554. Inicialmente, foi considerada planta ornamental, sendo

o uso culinário retardado, por temor de toxicidade (FILGUEIRA, 2003).

A tomaticultura é uma atividade agrícola de grande importância socioeconômica,

amplamente difundida em todo o mundo, que exige alto investimento, mão-de-obra

qualificada e elevado nível tecnológico (HAJI et al., 2004).

O tomateiro é uma dicotiledônea pertencente à família Solanaceae. É uma planta

herbácea, com haste flexível e incapaz de suportar o peso dos frutos e manter a posição

vertical. Embora sendo uma planta perene, a cultura é anual: da semeadura até a produção de

novas sementes, o ciclo varia de quatro a sete meses. A floração e a frutificação ocorrem

juntamente com o crescimento vegetativo. As folhas são compostas por número ímpar de

folíolos (CAMARGO, 1992; FILGUEIRA, 2003; ALVARENGA, 2004).

As principais vitaminas encontradas no tomate são A, B e C. Entre os minerais,

destacam-se o cálcio, potássio, sódio, cloro, magnésio e ferro. O tomate é considerado

alimento funcional porque contém uma substância que ajuda a reduzir o risco de certas

doenças. Esta substância é um pigmento conhecido como licopeno. O licopeno funciona como

antioxidante que neutraliza a ação dos radicais livres, protegendo as células do

envelhecimento e estimulando as defesas do corpo, com propriedades anticancerígenas.

Pesquisas têm mostrado que o licopeno tem a capacidade de reduzir consideravelmente os

riscos de câncer de próstata. A absorção do licopeno pelo corpo é maior quando o tomate é

consumido na forma de molhos, purês ou extrato do que quando ingerido fresco (PAZINATO

et al., 2005).

15

O tomate apresenta dois hábitos de crescimento distintos, que condiciona o tipo da

cultura. O hábito indeterminado é aquele que acontece na maioria das cultivares apropriada

para produção de frutos para mesa, que são tutoradas e podadas, com caule atingindo mais de

2,5 m de altura. Já o hábito determinado ocorre nas cultivares criadas para o cultivo rasteiro,

com finalidade agroindustrial. Os frutos são bagas carnosas, suculentas, com aspecto,

tamanho e peso variados conforme a cultivar (FILGUEIRA, 2003).

O tomateiro é bastante tolerante às variações dos fatores climáticos. Pode

desenvolver-se em clima tropical de altitude, subtropical e temperado. Isto permite que ele

seja cultivado praticamente em todo o Brasil (MAKISHIMA; MIRANDA, 1995).

O tomateiro prefere solos profundos, de consistência friável, bem drenado e com

médio a alto teor de matéria orgânica. Solos argilosos e compactados ou sujeitos a

encharcamento periódicos devem ser evitados em virtude de propiciarem condições

favoráveis ao desenvolvimento de fungos patógenos de solo (EMPASC, 1991).

A temperatura e a umidade relativa do ar são fatores climáticos que exercem

grande influência nos diversos estádios de desenvolvimento do tomateiro. A cultura é

indiferente ao fotoperíodo desenvolvendo-se bem tanto em época de dias curtos, como em

dias longos. Quanto á temperatura o tomateiro em geral, dependendo do estágio de

desenvolvimento, suporta de 3 a 44 oC por períodos curtos, sendo que as temperaturas ótimas

são 21-28 oC, de dia e 15-20 oC de noite (MAKISHIMA; MIRANDA, 1995; FILGUEIRA,

2003).

As chuvas e elevados índice de umidade relativa do ar associados às variações de

temperatura favorecem a incidência de doenças e pragas e dificultam o seu controle. Já os

ventos fortes e quentes afetam a floração e frutificação, além de alterar o balanço

fotossintético (FILGUEIRA, 2003).

Os grupos de cultivares atualmente plantada são: Santa Cruz, Salada, Cereja,

Italiano e Agroindustrial. A cultivar Santa Clara (grupo Santa Cruz), originou-se de um

cruzamento natural entre as cultivares Rei Umberto e Chacareiro, ocorrido em Suzano-SP. As

razões do sucesso desse tomate é a notável resistência ao manuseio rude e ao transporte pouco

cuidadoso. Em condições de boa adubação e tratos culturais possui uma elevada

produtividade. Nas cultivares modernas, os frutos comerciáveis pesam entre 160 e 200 g.

Entretanto apresentam sabor pobre comparado aos demais grupos, porém criou-se o hábito de

consumo para esse tipo (FILGUEIRA, 2003).

Atualmente, o tomate Santa Clara original não é mais plantado, sendo substituído

por novas cultivares com características mais favoráveis, como a cultivar Santa Clara criada

16

em Campinas-SP. Ao longo da década de 90, houve a introdução de híbridos com a

característica “longa vida”, sendo bons exemplos: ‘Carmem”, ‘Débora Max’, ‘Bruna VF’ e

‘Ataque’. Além dos frutos maiores e de melhor qualidade, apresentam resistência a algumas

doenças, inclusive a certas viroses, em algumas dessas cultivares (FILGUEIRA, 2003).

O grupo Salada, também conhecido como Caqui ou Maçã, apresentamn frutos

maiores em relação ao anterior, com peso superior a 250 g, bem mais delicados e saborosos.

Devido ao tamanho e à fragilidade, apresenta menor resistência ao transporte. Produz o tipo

de fruto mais valorizado para consumo na forma de salada. Alcança preços mais elevados,

porém deve ser cultivado em menor escala, pois a demanda é menor, por atender a um tipo de

consumidor mais exigente e disposto a pagar mais (FILGUEIRA, 2003).

Vários autores têm apresentado o grupo Saladinha como parte do grupo Salada,

considerando o tamanho menor dos frutos. Cultivares ou híbridos desse grupo surgiram do

cruzamento de materiais do grupo da Santa Cruz e do grupo Salada, sendo desse útimo a

maioria. Desse grupo são exemplos os tomates ‘Alambra’, ‘Alboran’, ‘Densus’, ‘Diva’,

‘Infinity’, ‘Facundo’, ‘Fanny’, ‘Monalisa’, ‘Possanga’, ‘Raísa N,’ ‘Saladinha’, ‘Séculos’,

‘Sheila’ e ‘Thomas’, entre outros (ALVARENGA, 2004).

O grupo Cereja foi introduzido no início da década de 90, sendo considerado um

novo grupo de cultivar para mesa. Apresenta frutos de tamanho pequeno (15-25g), com

coloração vermelho-brilhante, lembrando uma cereja, e excelente sabor. São utilizados na

ornamentação de saladas, sendo híbridos todas as cultivares desse grupo (FILGUEIRA,

2003).

Introduzido no final da década de 90, o grupo Italiano é o mais recente grupo de

cultivares para mesa. Os frutos são colhidos maduros e apresentam atrativa coloração

vermelha, destinando-se ao preparo doméstico de molhos e servindo também de

ornamentação de pratos (FILGUEIRA, 2003).

No grupo Agroindústria exige-se um tipo especial de tomate, produzido em

cultivo rasteiro, sem tratos culturais sofisticado. Os frutos devem apresentar alta resistência ao

transporte, coloração vermelha intensa distribuída uniformemente pelo fruto, elevado teor de

sólidos solúveis e teor adequado de ácido cítrico (FILGUEIRA, 2003).

17

2.2 Pragas e Doenças do tomateiro

2.2.1 Pragas do tomateiro

Diversas espécies de insetos atacam o tomateiro durante todo o seu ciclo

fenológico, e os danos variam de acordo com a intensidade do ataque. Algumas pragas

danificam os frutos inutilizando-os para comercialização e outros são vetores de viroses. As

pragas do tomate podem ser classificadas em dois tipos: pragas-chaves, que causam severos

danos na cultura, ocasionando perdas totais na produção, e pragas-secundárias, que não

causam muito prejuízo para o produtor (MAKISHIMA; MIRANDA, 1995; HAJI et al., 1998;

ARNAUD, 2005).

Dentre as pragas-secundárias em geral, destacam-se: lagarta-rosca (Agrotis

ipsilon), mosca-minadora (Liriomyza sativae), lagarta-das-folhas (Manduca difissa), vaquinha

(Diabrotica speciosa), broca-grande-dos-frutos (Helicoverpa zea, Spodoptera frugiperda, S.

eridania e Pseudoplusia includens), ácaro vermelho (Tetranychus evansi), percevejos (Nezara

viridula, Phthia picta). As pragas-chaves são: broca pequena (Neoleucinodes elegantalis),

microácaro (Aculops lycopersici), tripes (Frankliniella schulzei), pulgões (Myzus persicae,

Macrosiphum euphorbiae e Aphis gossypii) e as pragas exóticas: traça-do-tomateiro (Tuta

absoluta) e a mosca-branca (Bemisia tabaci biótipo B (= B. argentifolii)) (HAJI et al., 1998;

FILGUEIRA, 2003). Na região da Ibiapaba-CE as principais pragas são: broca-pequena,

mosca-branca, minadora e traça (informação dada pelo pesquisador Fernando Aragão).

Os pulgões, tripes e mosca-branca, além de pragas chaves, são também insetos

vetores de vírus e por esta razão são destacados a seguir:

• Pulgões (Myzus persicae, Macrosiphum euphorbiae e Aphis gossypii)

Ocorrem durante todo o ciclo da cultura, mas o período mais crítico é até os 50

dias após a emergência. Atacam principalmente as folhas e brotações novas, sungando a

seiva. É o transmissor dos vírus Y, topo amarelo e amarelo-baixeiro (MAKISHIMA;

MIRANDA, 1995; FILGUEIRA, 2003).

Os meios de controle visam impedir o contato do inseto virulífero com a planta,

sendo eles: produção de mudas em estufa provida de tela fina, aplicação de inseticidas

granulados sistêmicos ao sulco de plantio e pulverizações com aficidas específicos, que não

afetam os inimigos naturais (FILGUEIRA, 2003).

18

• Tripes (Frankliniella schulzei)

Os tripes são minúsculos insetos alongados, transmissor do vírus do vira-cabeça.

Ocorre durante todo o ciclo da cultura, mas o período mais crítico é até os 60 dias pós-

emergência, pois a infecção com vírus na fase de muda e/ou logo após transplante causa

morte das plantas. O clima quente favorece a proliferação da praga. Atacam a face inferior

dos folíolos e a brotação nova e habitam, inclusive, botões florais e flores, nas plantas

atacadas seu crescimento é paralisado (MAKISHIMA; MIRANDA, 1995; FILGUEIRA,

2003).

A cultura deve ser mantida no limpo e ficar distante de outras espécies

susceptíveis ou hospedeiras do tripes, como alho, cebola, ervilha, amendoim e algumas ervas

daninhas. Plantas infectadas com o vírus devem ser eliminadas da lavoura e o controle

químico deve ser iniciado a partir da emergência das plantas até mais ou menos 80 dias

(MAKISHIMA; MIRANDA, 1995).

• Mosca-branca (Bemisia tabaci biótipo B)

Os insetos conhecidos vulgarmente como moscas-brancas (FIGURA 1) são

sugadores de seiva e têm como principal gênero Bemisia, o mais prejudicial e mais

amplamente distribuído e estudado em todo o mundo. Estima-se mais de 700 plantas

hospedeiras conhecidas dessa praga (FERREIRA; AVIDOS, 1998; HAJI, 2004).

Nas duas últimas décadas, a mosca-branca tem sido considerada, mundialmente,

uma das principais pragas dos sistemas agrícolas, encontrando-se, atualmente, presente em

todos os continentes. Esta praga vem ocasionando danos e prejuízos bastante expressivos em

inúmeras culturas, principalmente tomate, feijão, algodão, melão, melancia, abóbora,

olerícolas, algumas frutíferas e plantas ornamentais. As moscas-brancas pertencem à ordem

Hemíptera, subordem Sternorrhyncha e família Aleyrodidae. Dentre os gêneros de que

apresentam maiores problemas para a agricultura detaca-se Bemisia, com 37 espécies

conhecidas (HAJI et al., 2004).

São insetos pequenos com asas brancas e abdome amarelado, as fêmeas medem

aproximadamente 0,9mm e os machos 0,8mm, localizam-se na parte inferior das folhas, onde

depositam seus ovos. Possuem grande capacidade de reprodução e adaptação a condições

adversas, desenvolvem resistência aos inseticidas, tornando-se difícil o seu manejo (GALLO

et al., 2002; HAJI et al., 2004).

Além dos danos diretos que causam as plantas, a mosca-branca destaca-se como

eficiente vetor de vírus, que pode ser adquirido ao se alimentar em uma planta infectada por

19

um período de 15 minutos, denominado período acesso de aquisição, transmitindo o vírus na

modalidade persistente circulativa (SANTOS, et al. 2003a). Após 4 a 20 horas, período de

latência, a mosca-branca é capaz de transmitir o vírus por um período de dez a vinte dias,

entretanto, a eficiência de transmissão diminui ao longo desse tempo (METHA et al., 2004;

PICÓ et al., 2004). Períodos secos e quentes favorecem o desenvolvimento e a dispersão

dessa praga, sendo, por isto, observados surtos na estação seca. A chuva é um fator adverso,

causando mortalidade nas populações do inseto, principalmente, quando são fortes e

constantes (VILLAS-BÔAS et al., 1997). A duração do ciclo de vida varia de acordo com a

espécie, sendo a temperatura um dos fatores determinantes. Em temperaturas de 32 oC o ciclo

dura 19 dias, podendo chegar a 73 dias a 15 oC . Sob condições favoráveis, esta praga pode

apresentar de 11 a 15 gerações por ano, podendo cada fêmea ovipositar de 100 a 300 ovos

durante o seu ciclo de vida (BROWN; BIRD, 2004).

Na cultura do tomate os danos podem ser diretos e indiretos. Os danos diretos

produzidos pela mosca-branca ocorrem por meio de anomalias ou desordens fitotóxicas,

causadas pela injeção de toxinas durante a alimentação do inseto, como o amadurecimento

irregular dos frutos e frutos isoporizados (LOURENÇÃO; NAGAI, 1994). A desuniformidade

na maturação dos frutos dificulta o reconhecimento do ponto de colheita, reduz a produção e,

no caso do tomate industrial, a qualidade da pasta. Os danos indiretos podem ser observados

pelas excreções açucaradas produzidas pela praga que favorece o desenvolvimento de

fumagina sobre folhas e frutos, reduzindo o processo fotossintético das plantas, e pela

transmissão de vírus (HAJI et al., 1996).

FIGURA 1: Mosca-branca (Bemisia tabaci biótipo B). Foto: Carmem Santos, 2001.

20

2.2.2 Doenças do tomateiro

Doença de planta é qualquer anormalidade causada por fatores bióticos ou

abióticos que agem na planta, de maneira contínua, alterando o seu metabolismo. A doença

geralmente resulta em queda de produção e/ou perda de qualidade do produto. Pode ainda

manifestar-se no produto após a colheita, inviabilizando-o para o consumo (LOPES; ÁVILA,

2005).

No tomateiro as doenças são mais ou menos intensas em função de vários fatores:

clima, condução da lavoura, método de irrigação, tipo de solo, qualidade da semente,

população de patógenos presente na planta ou no solo. Os fungos, bactérias, micoplasmas,

vírus, viróides e nematóides, provocam doenças de importância cujos agentes causais podem

ser disseminados no campo por vetores ou práticas culturais (LOPES; SANTOS, 1994).

Na natureza, a disseminação dos vírus de plantas ocorre de forma muito

especializada. A maioria é transmitida por insetos vetores: pulgões, moscas-brancas,

cigarrinhas e tripes (LOPES; ÁVILA, 2005).

Das numerosas enfermidades que ocorrem no tomateiro, destacam-se as viroses

pelos danos causados, uma vez que podem ser inexpressivos ou até levar à perda total de

produção.

• Mosaico-Comum

Esta virose é ocasionada pelos vírus Tobacco mosaic virus (TMV) e Tomato

mosaic virus (ToMV), responsáveis pela doença no fumo e no tomateiro. Ocorre a

transmissão pelo contato com mãos contaminadas, ou com implementos agrícolas. A virose

também pode ser vinculada por sementes. Nos folíolos, observa-se o efeito “mosaico” o que

se caracteriza por áreas com tonalidades verdes clara e escura. Plantas afetadas jovens têm

crescimento retardado (FILGUEIRA, 2003).

Algumas estirpes de ToMV podem causar amarelecimento da planta e/ou mosaico

amarelo semelhante aos induzidos por geminivírus. Eventualmente, as folhas podem tomar

forma alongada e retorcida. Em ambientes de alta temperatura, a planta doente pode

permanecer assintomática. Os frutos podem apresentar mosqueamento, bronzeamento,

mosaico amarelo, manchas necróticas ou anéis e amadurecimento irregular (LOPES; ÁVILA,

2005). A cultivar Tropic e os híbridos Carmem e Luxor são resistentes a este vírus

(MAKISHIMA; MIRANDA, 1995).

21

• Vira Cabeça-do-tomateiro

Doença generalizada em quase todas as regiões produtoras do Brasil, causada por

várias espécies de vírus do gênero Tospovirus. Pelo menos quatro espécies do gênero ocorrem

em tomateiro no País: Tomato spotted wilt virus (TSWV), Tomato chlorotic spot virus

(TCSV), Groundnut ring spot virus (GRSV) e Chrysanthemun stem necrosis virus (CSNV)

(LOPES; ÁVILA, 2005).

O vírus TSWV infecta plantas cultivadas e plantas daninhas. É transmitido por

tripes, que o adquire no estado larval, mantendo a capacidade de transmiti-lo por toda a vida,

de modo persistente. Infecção em sementeira leva à perda total do campo e, após o

transplantio, quanto mais precoce a infecção, maiores são as perdas (MAKISHIMA;

MIRANDA, 1995).

Os sintomas do vira-cabeça variam em função da espécie de vírus, da idade em

que a planta foi infectada, da cultivar e das condições climáticas. O nome vira-cabeça do

tomateiro deriva do fato de o ponteiro da planta se curvar para baixo, sintoma típico da

doença (LOPES; ÁVILA, 2005). Em geral os sintomas são: folíolos do ápice arroxeados ou

bronzeados; podem ocorrer lesões necróticas nos folíolos; as folhas do topo curvam-se; há

nanismo em plantas jovens, em frutos verdes há lesões deprimidas; e em frutos maduros

ocorrem manchas aneladas amarelas (FILGUEIRA, 2003).

• Risca-do-tomateiro

O Potato virus Y (PVY), agente causal da risca do tomateiro, ocorre de forma

restrita em lavouras de tomate no Brasil. São poucas as plantas hospedeiras do vírus. É

encontrado também em lavouras de batata, pimentão e pimenta e em plantas daninhas da

família Solanaceae, que podem servir como fonte de inóculo do vírus ao tomateiro. A

transmissão é feita por pulgões, que adquirem o vírus em uma planta doente, a transmissão é

do tipo não persistente, ou seja, só são capazes de transmiti-lo por apenas alguns minutos a

poucas horas (FILGUEIRA, 2003; LOPES; ÁVILA, 2005).

O sintoma mais comum é um mosaico leve ou severo nas folhas mais nova, com

as nervuras apresentando coloração verde escura. Algumas estirpes podem apresentar

sintomas de mosaico associados com necrose do pecíolo e das nervuras da face inferior da

folha, que se volta para baixo dando à planta a aparência de pinheiro de Natal. Não se

observam sintomas nos frutos, mais infecções precoces podem causar perdas totais (LOPES;

ÁVILA, 2005).

22

• Mosaico-amarelo

O vírus do mosaico-amarelo, Pepper yellow mosaic virus (PepYMV), está se

expandindo no Brasil e já ocorre nas principais regiões produtoras de tomate do País. Surtos

epidêmicos ocorrem frequentemente em lavouras de pimentão, pimenta e tomate. Quando a

infecção ocorre no início do ciclo da planta do tomate, os danos são consideráveis. O

PepYMV é transmitido por várias espécies de pulgões de maneira não-persistente. Os

sintomas variam conforme a cultivar de tomate. Nas cultivares muito susceptíveis, observa-se

mosaico severo e deformação foliar. Nas tolerantes, é mais comum mosaico leve e

amarelecimento das folhas novas. Os frutos normalmente não apresentam sintomas, mas

podem ter o seu tamanho reduzido. Podem ocorrer infecções mistas com geminivírus,

tospovirus e tobamovirus (LOPES; ÁVILA, 2005).

• Mosaico-do-pepino

Doença de larga distribuição, mas só ocasionalmente encontrada infectando

tomateiro no Brasil. É mais importante em cultivos de curcubitáceas e de pimentão. O

Cucumber mosaic virus (CMV) é transmitido por pulgões, embora estes não tenham grande

eficiência na transmissão de tomateiro para tomateiro. A infecção geralmente ocorre em

plantios próximos de plantas daninhas infectadas. O vírus não é transmitido por sementes de

tomate, embora sementes de outras espécies possam transmiti-lo. É grande o círculo de

hospedeiras do vírus, entre as quais estão: abóboras, alface, banana, cenoura, maracujá,

melancia, melão, pepino, pimentão, salsão e várias plantas ornamentais. Os sintomas são:

redução de crescimento em plantas jovens infectadas, mosqueado leve e enrolamento nas

folhas e o sintoma mais característico é o estreitamento foliar, conhecido como cordão de

sapato (LOPES; ÁVILA, 2005).

• Mosaico-dourado-do-tomateiro (Geminivirose)

O mosaico-dourado-do-tomateiro, causado por begomovírus Tomato golden

mosaic virus (TGMV), é a virose mais séria da cultura do tomate na atualidade. Contudo,

levantamentos recentes indicam a existência de mais de dez espécies de begomovírus no

Brasil (LOPES; ÁVILA, 2005).

A família Geminiviridae, apresenta vírus com partículas geminadas ou pareadas,

com genoma mono ou bipartido, composto por DNA circular de fita simples, com 2,6 Kb e

segundo a estrutura do genoma, inseto vetor e círculo de hospedeiros, está dividida em três

23

gêneros: Mastrevírus, Curtovírus e Begomovírus, (LAZAROWITZ, 2004; RYBICK et al.,

2004).

Os sintomas da infecção viral surgem nas folhas mais novas, em forma de

mosaico intenso, a partir da região do pecíolo. Também ocorre o enrolamento dos folíolos na

planta toda e a paralisação do crescimento da planta (LOPES; ÁVILA, 2005; FILGUEIRA,

2003).

Begomovírus

Para Polston e Anderson (1997 apud ZERBINI et al., 2002), os begomovírus são

considerados um grupo emergente de vírus de plantas, devido ao aumento da incidência e

severidade das doenças por eles causadas nas últimas décadas. Recentemente, a emergência

de novas espécies de begomovírus infectando tomateiros nas Américas veio ressaltar de forma

dramática o impacto causado por esses patógenos à agricultura. O controle das doenças

causadas por begomovírus é dificultado pela dificuldade de fontes naturais de resistência e

pela diversidade genética do inseto vetor, o que leva à rápida seleção de populações

resistentes a inseticidas.

Um dos principais problemas na cadeia de produção de tomate reside na alta

incidência de vírus da família Geminiviridae, gênero Begomovírus. A ocorrência da doença

tem sido generalizada desde o Nordeste ao Sudeste brasileiro, além de demais países sul-

americanos, onde perdas de 40% até 100% da produção têm sido relatadas. (FARIA et al.,

2000; COTRIM et al., 2004; SANTANA et al., 2007).

Segundo Haji et al., (2004), não existe disponibilidade no mercado nacional de

cultivares ou híbridos de tomate industrial com resistência ao geminivírus. O híbrido Gem

Pride (tomate industrial) de origem americanas, está sendo comercializado no mercado

brasileiro, porém seu alto valor o restringem a algumas áreas de produção e em quantidades

insuficientes para atender a demanda.

Segundo Costa (1976 apud ZERBINI et al. 2002) os begomovírus não são

transmitidos por semente ou por contato entre plantas infectadas e sadias. Sua dispersão ou

introdução no campo dá-se pela ação da mosca-branca a partir de fontes de vírus de áreas

próximas, podendo ser de cultivos antigos como também de fontes alternativas no campo.

Diversidade genética tem sido observada em espécies de begomovírus associadas ao

tomateiro no Nordeste, Sudeste e Centro-Oeste do Brasil (RIBEIRO et al., 2003), e o

relacionamento genético observado entre as espécies de tomate e de plantas daninhas sugere

que os vírus sejam provenientes de plantas nativas e que estão sendo transferidos para o

tomateiro pela mosca-branca (AMBROZEVICIUS et al., 2002). Segundo Villas-Bôas et al.

24

(1999) a B. tabaci tem se dispersado nos campos rapidamente, sendo considerada a espécie de

mosca-branca que comumente devasta os cultivos agrícolas nas várias regiões geográficas do

país.

Como a mosca-branca se alimenta da seiva das plantas, isso faz com que esses

insetos sejam eficientes em adquirir e transmitir vírus associados aos tecidos vasculares das

plantas, como é o caso de geminivírus. A relação begomovírus versus mosca-branca é do tipo

persistente-circulativo, ou seja, o inseto adquire o vírus durante o processo de alimentação em

planta infectada, este circula no seu corpo até atingir as glândulas salivares, tornando-o

infectivo, onde o vírus é inoculado no sistema vascular da planta quando a mosca-branca se

alimentar em uma planta sadia (HAJI et al., 2004).

No Ceará, os begomovírus tem sido constatado em, praticamente, toda a região

produtora da hortaliça. Levantamentos realizados por ARNAUD (2005) revelaram a

predominância de begomovírus nas lavouras comerciais da Chapada da Ibiapaba e a alta

disseminação de mosca-branca. Sintomas de mosaico clorótico, leve epinastia nas folhas além

do subdesenvolvimento, são comumente observados nas plantas de tomate infectadas

(FIGURA 2).

FIGURA 2: Tomate ‘Santa Clara’ infectado com begomovírus.

25

2.3 Plantas Daninhas

As plantas daninhas, também denominadas de invasoras ou infestantes, são

vegetais que crescem onde não são desejados. A presença dessas plantas em áreas de cultivo

compromete a produtividade e a sua interferência sobre as plantas cultivadas afeta também a

qualidade dos frutos. Algumas extraem grandes quantidades de nutrientes do solo e além da

competição direta, apresentam os seguintes mecanismos: alelopatia, hospedeiros

intermediários, desvalorização comercial dos produtos (MAKISHIMA; MIRANDA, 1995;

LORENZI, 2000; DEUBER, 2003).

Quanto à classificação, a qual é baseada no ciclo vital, podem ser: plantas anuais,

bianuais e perenes. Entre as espécies anuais está à maioria das plantas infestantes das grandes

culturas e compreendem aquelas que germinam e completam o ciclo até a maturação das

sementes dentro da mesma estação de crescimento (60 a 140 dias). As espécies bianuais são

aquelas que germinam e crescem até a formação de folhas em roseta no primeiro ano,

completando o ciclo no ano seguinte. As espécies perenes são aquelas que vivem durante

muitos anos. Em regiões muito frias ou muito secas, sua parte aérea pode até desaparecer

durante o inverno ou durante o período seco, entretanto, sua parte subterrânea mantém-se

intacta para reiniciar o crescimento tão logo voltem às condições ideais de temperatura e

umidade (LORENZI, 2000).

As plantas infestantes podem ser hospedeiras de um grande número de insetos,

nematóides, ácaros e ser portadoras de diversas doenças. Impedir a entrada e a disseminação

de sementes e de outros órgãos de reprodução de novas espécies de plantas daninhas é a

primeira prática preventiva. A erradicação das plantas já existentes em uma área é uma das

maneiras de minimizar os danos que essas plantas podem ocasionar às culturas de importância

econômica. A adoção dessa prática é, especialmente, direcionada para espécies de ciclo

perene, mais agressivas, porém, dependendo do método adotado, outras espécies também são

eliminadas (DEUBER, 2003).

Plantas daninhas já foram relatadas como hospedeiras alternativas de vários

patógenos e insetos. A interferência indireta das culturas agrícolas por pragas que tem nas

plantas daninhas seus hospedeiros intermediários, é um fato muito comum (LORENZI, 2000).

Invasoras infectadas com a bactéria Xylella fastidiosa, agente causal da escaldadura das

folhas, foram encontradas em pomares de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl) no

Paraná, representando ameaça para a fruteira uma vez que podem servir como reservatório de

26

patógenos onde insetos vetores podem se multiplicar, adquirir a bactéria e transmiti-la para as

plantas cultivadas (LEITE et al., 1997).

A associação de espécies nativas com vírus do gênero Tospovirus foi relatada em

lavouras comerciais de tomate em São Paulo. O tripes vetor (Frankliniella schultezei Trybom)

tinha nas plantas daninhas importantes hospedeiras e fonte do vírus para o tomateiro. A

dificuldade da erradicação das invasoras desfavoreceu o controle da virose na cultura

(GUIMARÃES et al., 1997). Plantas daninhas das famílias Amaranthaceae, Asteraceae,

Euphorbiaceae, Leguminosae, Malvaceae e Solanaceae, associadas a begomovírus têm sido

relatadas em diversas áreas produtoras do país e podem servir como fonte de inóculo para

plantas cultivadas, mediante a transmissão pelo inseto vetor (AMBROZEVICIUS et al.,.2002;

LIMA et al., 2002; ASSUNÇÃO et al., 2004; ASSUNÇÃO et al., 2006). Para Assunção et al.

(2006), a erradicação dessas plantas das áreas deve ser uma medida adotada visando à redução

da incidência dessas viroses. Ambrozevicius et al. (2002), relataram um alto grau de

diversidade genética de begomovírus em tomateiros e sugeriram que esses vírus foram

transferidos para tomateiro a partir de plantas daninhas. Assunção et al. (2006), também

encontraram diversidade genética de begomovírus nas invasoras, o que pode confirmar essas

plantas invasoras como fonte do inóculo.

No Ceará, begomovírus já foram relatados associados a plantas daninhas da

família Amaranthaceae: Amaranthus spinosus L., A. deflexus L., A. viridis L.; Asteraceae

Acantospermum. hispidium, Bidens pilosa; Rubiaceae: Borreria capitata Ruiz & Pav. e

Euphorbiaceae: Euphorbia heterophyla L. (SANTOS et al., 2003b; ARNAUD et al., 2006)

presentes em área de produção de tomate na Chapada da Ibiapaba.

27

Plantas daninhas comuns em lavouras de tomate

• Ageratum conyzoides L.

Conhecida popularmente como mentrasto, picão-branco, maria-preta, catinga de

bode, erva-de são-joão, é uma planta daninha muito disseminada em todas as regiões agrícolas

do país, infestando tanto lavouras anuais como perene, hortas e terrenos baldios. Pertence à

família Asteraceae e é uma planta anual, herbácea, nativa da América do Sul, muito

empregada na medicina caseira como tônica, estimulante e emenagoga (BRAGA, 1976;

LORENZI, 2000) (FIGURA 3).

• Amaranthus spinosus L.

Também conhecida como caruru-de-espinho, bredo-de-espinho e bredo-branco, é

uma planta anual, herbácea, espinhenta. Suas folhas e brotos são comestíveis em saladas e tem

propriedades diuréticas. Pertencente a família Amaranthaceae é originária da América

Tropical e disseminada em mais de 40 países, amplamente distribuído por todo território

brasileiro ocorrendo em lavouras perenes, terrenos baldios e eventualmente em culturas

anuais (BRAGA, 1976; LORENZI, 2000) (FIGURA 4).

• Amaranthus viridis L.

É conhecida como caruru-de-mancha, bredo e bredo-verdadeiro. Planta anual,

herbácea, muito ramificada, variavelmente pigmentada, pertence à família Amaranthaceae e

suas folhas são comestíveis em forma de salada. Suas folhas são diuréticas e

antiblenorrágicas. Originária do Caribe apresenta como característica diferencial uma mancha

violácea no centro das folhas (BRAGA, 1976; LORENZI, 2000) (FIGURA 5).

• Bidens pilosa L.

Conhecido como picão-preto, carrapicho de agulha, picão e fura-capa pertence à

família Asteraceae. É uma planta anual, herbácea nativa da América Tropical, propaga-se

apenas por semente, sendo capaz de produzir até três gerações por ano. É muito usada na

medicina caseira como diuréticos (BRAGA, 1976; LORENZI, 2000). (FIGURA 6).

28

FIGURA 4: bredo de espinho

(Amaranthus spinosus L).

FIGURA 3: mentrasto

(Ageratum conyzoides L).

FIGURA 6: picão preto

(Bidens pilosa L).

FIGURA 5: caruru de mancha

(Amaranthus viridis L).

29

2.4 Diagnose Viral

Em geral a diagnose de vírus é realizada pela avaliação dos sintomas, sorologia e

por meio de técnicas moleculares utilizando-se a reação em cadeia de polimerase (PCR) e a

hibridização com sonda radioativa (; ZERBINI et al., 2006).

Muitos métodos de diagnose de vírus foram estudados e desenvolvidos com base

nas propriedades inerentes à proteína capsidial, ao ácido nucléico viral e as atividades

biológicas do vírus (MACIEL-ZAMBOLIM, 1999). A detecção mais precisa de vírus vem

sendo realizada por meio de técnicas moleculares que permitem a diagnose das viroses,

inclusive em nível de espécie (HAJI et al., 2004).

São métodos de diagnose:

2.4.1) O método de diagnose através de plantas indicadoras

Consiste na inoculação do vírus em uma série de espécies e variedades de plantas,

ditas indicadora, e na observação e registro dos sintomas induzidos pelo vírus em cada uma

delas. O diagnostico é feito com base na comparação dos sintomas observados com aqueles

relatados na bibliografia (ZERBINI et al., 2006).

2.4.2) Métodos Sorológicos

a) Difusão dupla em gel

Fundamentada na precipitação antígeno-anticorpo, o teste de difusão dupla em gel

é realizado em meio semi-sólido, resultando na formação de bandas fáceis de serem

visualizadas onde se formam na presença de pequenas quantidades de antígeno, o que

aumenta significamente a sensibilidade do teste (ALMEIDA; LIMA, 2001; ZERBINI et al.,

2006).

b) Teste Elisa (Enzyme Linked Imunosorbent Assay)

O teste Elisa é considerado um método para identificação e quantificação de vírus

em plantas e outros antígenos apresentando maior sensibilidade, baseando-se no princípio

clássico onde o antígeno é reconhecido pelo anticorpo (Imunoglobulina) que lhe deu origem,

formando o complexo Ac-Ag (ALMEIDA; LIMA, 2001). A utilização de anti-soros contra a

capa protéica de geminivírus, permite a detecção deste vírus em amostras de plantas

30

infectadas a grande dificuldade em relação a este método é o pequeno número de anti-soros

disponível no mercado (GIVORD et al., 1994; CANCINO et al., 1995).

2.4.3) Métodos Moleculares

As técnicas moleculares como hibridação de ácidos nucléicos e reação em cadeia

de polimerase “Polymerase Chain reaction”-PCR, tem tido mais destaque devido a sua maior

sensibilidade.

a) Reação em cadeia da polimerase (Polymerase Chain Reaction) PCR

A PCR é uma técnica bastante simples, versátil e de ampla aplicação, composta de

ciclos contendo três passos cada um (desnaturação, anelamento e extensão) que possibilita

produzir um grande número de cópias de uma seqüência especifica do DNA, limitada por dois

oligonucleotídeos (“primers”), facilitando o estudo na análise dos genes. Apresenta uma

sensibilidade superior a de qualquer outra técnica uma vez que na sorologia apenas a proteína

capsidal é responsável pela detecção e identificação podendo ser confundidas pelo anti-soro

utilizado para detecção, enquanto que as técnicas moleculares podem detectar outras porções

do genoma viral que não o gene da proteína capsidal (ALMEIDA; LIMA, 2001; ZERBINI et

al., 2006).

A principal vantagem da PCR é devido a sua estrema sensibilidade, onde é

possível detectar ácidos nucléicos em concentrações da ordem de fentogramas (10-18g). Tendo

como desvantagens seu elevado custo e também a ocorrência de falsos positivos devido a

enorme sensibilidade da técnica que pode levar à amplificação a partir de contaminantes da

amostra (ZERBINI et al., 2006).

b) Hibridização de Ácidos Nucléicos

É uma técnica extremamente sensível, baseada na imobilização do ácido nucléico

a ser detectado (na forma de fita simples) fixado em uma membrana de ‘nylon’ e na formação

de híbridos (fita dupla) com a sonda utilizada para detecção. Entre os métodos de hibridização

o dot-blot tem sido mais empregado no diagnóstico das fitoviroses (ALMEIDA; LIMA, 2001;

ZERBINI, 2006). A hibridização com sondas radioativas é um método altamente específico e

de amplo uso em detecção, porém esbarra na necessidade de uma infraestrutura adequada, de

treinamento de pessoal e no aumento de riscos para a saúde dos usuários (SANTANA et al.,

2007).

31

2.5 Controle de viroses

O controle de fitoviroses depende, principalmente, de medidas preventivas, que

devem ser tomadas por todos os produtores de uma região, estado ou país. Muitas medidas

são estabelecidas em legislação fitossanitárias nacionais e internacionais. A idéia generalizada

de controlar vírus com a aplicação de defensivos, visando à eliminação de vetores, quase

sempre leva ao insucesso, eleva o custo de produção, provoca sérios danos ao meio ambiente

e favorece o aparecimento de super pragas. Controlar uma doença não é simplesmente

exterminá-la após o seu aparecimento. O controle deve ser entendido como prática

permanente de medidas integradas, evitando que a doença apareça ou atinja proporções que

resultem em grandes danos e prejuízos (LOPES; ÁVILA, 2005).

Muitos métodos de controle são sugeridos para prevenir as doenças, como

controle cultural, controle biológico, químico e genético (HAJI et al., 2004).

O controle de begomovírus é difícil e todas as práticas que visem à redução de sua

incidência devem ser adotadas como parte de um manejo integrado. Apesar de dispendioso e

de provocar resistência nas populações de mosca-branca, o uso de controle químico do vetor,

deve fazer parte desse manejo (HAJI et al., 2004).

O emprego de práticas agrícolas rotineiras para criar um agroecossistema menos

favorável ao desenvolvimento e à sobrevivência dos insetos tais como: plantio de mudas

sadias, uso de barreiras para impedir ou retardar a entrada do vetor nas lavouras, uso de

armadilhas para atrair e reduzir a população de adultos de mosca-branca e manutenção da

lavoura no limpo, eliminando as plantas hospedeiras de viroses e os restos culturais

(EMBRAPA, 2007).

A resistência genética é a maneira mais efetiva para o controle de geminiviroses.

Alguns genótipos de tomate relatados como tolerantes e/ou resistentes ao geminivírus em

outros paises tem sido avaliados no Brasil, na tentativa de identificar fontes de resistência

(HAJI et al., 2004). No Ceará, o controle de begomovírus na região produtora de tomate da

Ibiapaba concentra-se na utilização de material genético tolerante e no controle sistemático do

inseto vetor (ARNAUD, 2005).

32

3 MATERIAL E MÉTODOS

Os ensaios deste trabalho foram conduzidos em condições de casa-de-vegetação e

nos Laboratórios de Fitopatologia e Virologia Vegetal, na Universidade Federal do Ceará.

3.1 Material Vegetal

Amostras foliares de plantas de tomate com sintomas de infecção viral,

provenientes da Região de Ibiapaba-CE, foram submetidas à extração de DNA total e a PCR

com oligonucleotídeos específicos para begomovírus. Na eletroforese os fragmentos de DNA

amplificados, visualizados em gel de agarose sob luz ultravioleta, confirmaram a infecção.

Amostras de uma única planta foram empregadas como fonte do vírus para tomateiro ‘Santa

Clara’ utilizado nesse trabalho.

A relação das plantas daninhas utilizadas nos ensaios de transmissão viral com o

begomovírus do tomateiro empregando-se a mosca-branca, a enxertia e a inoculação

mecânica, encontra-se na TABELA 1.

TABELA 1. Relação das plantas daninhas investigadas com relação ao begomovírus. .

Família Espécie Nome Vulgar

Amaranthaceae Amaranthus spinosus Bredo de espinho

Caruru de espinho

Amaranthus viridis Bredo verdadeiro

Caruru de mancha

Asteraceae Ageratum conyzoides Mentrasto

Catinga de bode

Bidens pilosa Picão

Picão preto

33

3.2 PCR- Método empregado na detecção viral

3.2.1 Extração de DNA total

Em todas as etapas de detecção de vírus nas plantas inoculadas, foram coletadas

amostras foliares para extração de DNA total, empregando o protocolo de extração elaborado

por DELLAPORTA et al (1983), com modificações. Discos foliares de 1 cm foram triturados

em microtubos em presença de 500 µl de tampão de extração (Tris-HCl 1,0 M; EDTA 0,5M;

NaCl 5,0M; β-mercaptanol; água milli-Q estéril e autoclavada) adicionando-se,

posteriormente, 66 µl de SDS 10%, seguindo uma forte agitação e incubação a 65 0C em

banho-maria por 10 minutos. Em seguida, foi adicionado 160 µl de acetato de potássio 5M,

seguido de uma centrifugação a 10.000g por 10 min. Uma alíquota de 450 µl da parte aquosa

formada foi transferida cuidadosamente para outro microtubo, adicionando-se 225 µl de

isopropanol. Sucedeu-se uma nova centrifugação por 10 min. O sobrenadante foi descartado e

o “pellet” foi lavado com 500 µl de etanol a 70%. Depois se levou a centrifuga (Centrifuge

5415C-EPPENDORF) por 5 min e descartou-se o sobrenadante, o “pellet” foi levado à estufa

a 37 0C para secar. O DNA foi ressuspenso em 100 µl de água milli-Q (estéril e autoclavada)

e acondicionado a -20 0C.

3.2.2 Preparo das amostras para PCR

As reações para a PCR foram preparadas com 3 µl de DNA, 2,5 µl de tampão 10X

da enzima Taq polimerase, 0,75 µl de MgCl2 a 50 mM, 0,5 µl de dNTPs a 10mM, 0,7 µl do

primer PAc368 (CP1) (5’CCCGTCGACATGYCTAAGMGKGAKGCCCC-3’) e 0,7 µl do

primer PAv1320 (CP2) (5’CCCCTGCAGAACTTCCAAGTCTGGACG-3’), 0,2 µl de Taq

polimerase pht e 16,65 µl de água milli-Q estéril e autoclavada, completando o volume final

para 25 µl. Os oligonucleotídeos empregados na PCR amplificam fragmentos do genoma em

torno de 0,9kb do DNA A, referente da capa protéica do vírus.

O programa utilizado na amplificação do begomovírus no termociclador

(Mastercycler gradient-EPPENDORF) foi: aquecimento inicial de 94 ºC durante 3 minutos e

29 ciclos compostos de desnaturação (94 ºC/min) anelamento (53 ºC/1,0min) e extensão (72

ºC/2,0min). Concluídos os 30 ciclos seguiu-se uma extensão final de 72ºC por 7 minutos.

Após a eletroforese os fragmentos de DNA amplificados foram visualizados em gel de

agarose 1% corado com brometo de etídio e observados sob luz ultravioleta em

fotodocumentador (mini-transiluminator Bio-Rad).

34

3.3 Teste de transmissão viral de tomateiro para plantas daninhas

3.3.1 Inoculação empregando a mosca-branca

Para os ensaios de transmissão de vírus, moscas-brancas avirulíferas eram

mantidas em gaiolas antiafídicas, onde plantas de gergelim (Sesamum indicum L.) e de tomate

foram colocadas para multiplicação do vetor. Na retirada das moscas-brancas da gaiola,

utilizou-se um aspirador adaptado para insetos, acoplado a um tubo Falcon.

Tomateiro infectado com begomovírus foi colocado em gaiola telada com

moscas-brancas avirulíferas. Grupos de 4-9 mudas sadias de bredo de espinho, caruru de

mancha, mentrasto e picão preto, foram, alternadamente, colocados naquela gaiola onde

permaneceram por sete dias em contato com as moscas-brancas virulíferas. Mudas de

tomateiro ‘Santa Clara’ sadias foram também levadas para a gaiola, como controle da

transmissão. Decorridos 15 dias da retirada de cada grupo de plantas da gaiola, procedeu-se a

coleta de amostras foliares de todas as plantas daninhas e das mudas de tomate para extração

de DNA.

Após a retirada das plantas da gaiola, realizou-se pulverização das mesmas com

inseticida recomendado para o vetor.

3.3.2 Inoculação por enxertia

Ramos novos de tomateiros infectados foram obtidos por meio de cortes

realizados com lâmina de barbear esterilizada. As secções foram enxertadas por garfagem nas

plantas daninhas sadias no estágio da 4ª folha verdadeira (FIGURA 7a), sendo estas seções

mantidas presas com auxílio de prendedores plásticos. Empregou-se de 08 a 10 plantas de

cada espécie daninha para os enxertos com tomate. Mudas sadias de tomate foram igualmente

inoculadas para controle da transmissão (FIGURA 7b). Após emissão de ramos novos,

amostras foliares eram coletadas para extração de DNA e PCR.

3.3.3 Inoculação mecânica

Na inoculação mecânica, foram utilizadas mudas de plantas daninhas com duas

folhas verdadeiras. Folhas novas de tomates infectados foram trituradas em almofariz de

porcelana, na presença de tampão de fosfato de potássio 0,05M, pH 7,5. O extrato foi

friccionado com pedaços de gazes umedecidas na parte adaxial das folhas previamente

polvilhada com abrasivo carborundum. Após a inoculação as mudas foram lavadas com água

corrente e mantidas em casa de vegetação para observação de surgimento dos sintomas.

35

3.4. Teste de transmissão viral de plantas daninhas para tomateiro

3.4.1 Inoculação empregando a mosca-branca

Após a extração e confirmação da presença do vírus nas quatro espécies de plantas

daninhas, procedeu-se aos ensaios de transmissão do vírus para o tomateiro. Mudas envasadas

de plantas daninhas infectadas foram colocadas em gaiolas individuais com moscas-brancas

avirulíferas (15-20) por um período acesso de aquisição de 24 horas. Depois desse tempo, os

insetos foram transferidos por meio de um aspirador manual para mudas jovens de tomate (6-

12 insetos) com duas folhas definitivas por igual período, ou seja, com período acesso de

inoculação de 24 horas (FIGURA 8). Passados 15 dias da inoculação, foram coletadas

amostras foliares dos tomateiros para extração de DNA e PCR.

FIGURA 7: Enxertia de ramo de tomateiro infectado em: a) muda de mentrasto (seta); b) muda de tomateiro ‘Santa Clara’.

b a

36

3.4.2 Inoculação por enxertia

Seções de ramos novos de plantas daninhas infectadas foram enxertadas por

garfagem em mudas sadias de tomateiro ‘Santa Clara’, no estágio da 4ª folha verdadeira. As

seções foram igualmente presas às plantas com os prendedores plásticos. Após emissão de

ramos novos de tomateiros, amostras foliares foram coletadas para procedimento de extração

de DNA e PCR, visando-se confirmar a transmissão.

FIGURA 8: Ensaio de transmissão de begomovírus com moscas-brancas virulíferas em muda de tomate provenientes de plantas daninhas.

37

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados da transmissão do begomovírus de plantas de tomate para plantas

daninhas são apresentados na TABELA 2. As quantidades de plantas daninhas submetidas à

inoculação com o vetor na gaiola, foram diferentes por não se ter quantidades suficientes para

serem igualadas, uma vez que semeadas no mesmo período havia diferença nas germinações

das sementes, e algumas como o mentrasto e bredo de espinho tinham uma reduzida

emergência. A germinação irregular de plantas daninhas se deve à dormência de suas

sementes, e a intensidade da dormência varia muito entre as espécies, sendo influenciada pela

temperatura e pela umidade do solo (TOMAZ et al, 2004).

Na transmissão do vírus do tomateiro para plantas daninhas tentou-se simular uma

condição natural, empregando-se a fonte viral, o vetor e espécies infestantes comuns em

lavouras de tomate e nas quais já se tinha relato de infecção natural de begomovírus, de

acordo com os levantamentos em campo realizados por Arnaud (2005). Conforme observado,

o begomovírus foi transmitido para as quatro espécies de plantas daninhas em percentual

variando de 22 a 37% (TABELA 2). Em condições naturais, begomovírus foi encontrado

nessas espécies em percentuais de 16% (mentrasto), 20% (caruru-de-mancha), 25% (picão

preto) e 65% (bredo de espinho) das amostras coletadas ao acaso em lavouras de tomate

na Chapada da Ibiapaba (ARNAUD, 2005). Os valores de campo foram similares aos do

ensaio, sendo superior somente para bredo de espinho. Segundo Arnaud (2005), essas

espécies foram encontradas com freqüência nas lavouras da Ibiapaba e nelas, comumente,

observou-se a presença da mosca-branca.. A presença do vírus foi detectada nas amostras

foliares pela visualização de bandas de 0,9kb em gel de agarose, fragmento amplificado de

tamanho esperado (FIGURA 9). Nesse gel, bandas inespecíficas observadas podem ter

resultado de alguma degeneração de oligonucleotídeos (BRIOSO et al. 1996), em razão de os

mesmos não terem sido desenhados para o begomovírus do tomateiro desse trabalho. As

plantas daninhas infectadas com begomovírus nestes ensaios não apresentaram sintomas

visíveis de infecção. Contudo, os tomateiros usados como controle positivo, exibiram os

sintomas de mosaico clorótico, epinastia e subdesenvolvimento da planta.

Na transmissão do vírus para plantas daninhas por meio da enxertia com secções de

tomateiros, apenas o picão preto foi infectado com o vírus (TABELA 2). O insucesso das

inoculações por enxertia, possa em parte, se dever à incompatibilidade dos tecidos envolvidos

ou à má junção e rápida morte dos enxertos. Repetição deste método deve ser realizada para

confirmação desses resultados.

38

Na inoculação mecânica não obtivemos resultados positivos, porém mudas de

tomates também foram inoculados no mesmo período, onde de 10 mudas, duas foram

infectadas com o begomovírus. Na inoculação mecânica o índice de transmissão de

begomovírus pode ser reduzido por fatores, como baixo percentual de replicação do vírus nas

células do mesófilo. Nas tentativas de transmissão de begomovírus isolados de tomateiros

infectados coletados na Ibiapaba para mudas de tomateiro ‘Santa Clara’, Arnaud (2005)

observou baixo percentual de transmissão, tanto nas inoculações mecânicas (5%) como nas

inoculações por enxertia (30%).

TABELA 2. Ensaio de transmissão de begomovírus do tomateiro para plantas daninhas.

Plantas daninhas/transmissão Plantas

infectadas/testadas

Inoculação por mosca-branca

Bredo de espinho 2/6 (33%)

Caruru de mancha 2/9 (22%)

Mentrasto 1/4 (25%)

Picão preto 3/8 (37%)

Inoculação por enxertia

Bredo de espinho 0/3 (0%)

Caruru de mancha 0/3 (0%)

Mentrasto 0/9 (0%)

Picão preto 2/10 (20%)

Inoculação mecânica

Bredo de espinho 0/4 (0%)

Caruru de mancha 0/6 (0%)

Mentrasto 0/10 (0%)

Picão preto 0/3 (0%)

1 2 3 4 5 6 7

39

Os resultados da transmissão do begomovírus das plantas daninhas retornando

para o tomateiro, realizado por meio da mosca-branca e por enxertia estão na TABELA 3.

Com base nesses dados, observou-se que houve uma variação de 12 a 70% na transmissão

viral empregando-se a mosca-branca. O menor percentual de transmissão constatado do

caruru de mancha para tomateiro (12%), pode ter sido em razão da repetida manipulação da

mosca-branca e da menor recuperação desses insetos nessa planta daninha (06/ planta) na

transferência para as mudas de tomate. Contudo, os valores da transmissão viral foram mais

elevados no retorno do begomovírus para o tomateiro do que deste para as quatro invasoras.

Isso pode ter sido em razão de o tomateiro ser a hospedeira natural do mesmo.

Ressalta-se ainda que o período acesso de inoculação do vírus nas mudas de

tomateiros foi de 24h, inferior aos sete dias da passagem do vírus do tomateiro para as plantas

daninhas. As plantas de tomateiro infectadas apresentaram, após 15 dias, os sintomas de

mosaico clorótico, ocasião da coleta das amostras para extração do DNA. Gel ilustrando o

resultado da transmissão viral para os tomateiros inoculados, pode ser observado na FIGURA

10. A infecção nos tomateiros foi constatada para todos os casos em que se empregou a

mosca-branca tendo por fonte de begomovírus as quatro plantas daninhas. Esses resultados

demonstraram que bredo de espinho, caruru de mancha, mentrasto e picão preto são

hospedeiras alternativas de begomovírus de tomate e que podem, no campo e na presença do

vetor, ser importantes fontes do vírus para o tomateiro.

FIGURA 9: Análise eletroforética em gel de agarose 1% de amostras de tomateiro e de plantas daninhas por mosca-branca infectadas com begomovírus. 1- marcador DNA Ladder 1 Kb; 2-tomate (controle positivo); 3-bredo-de-espinho; 4- mentrasto; 5-caruru de mancha; 6- picão-preto; 7- Tomate sadio.

0,9 Kb

40

TABELA 3: Ensaio de transmissão de begomovírus das plantas daninhas para tomateiros.

Transmissão Plantas de tomate

infectadas/inoculadas

Inoculação por mosca-branca

Tomate para Bredo de espinho 5/10 (50%)

Tomate para Caruru de mancha 1/8 (12%)

Tomate para Mentrasto 7/10 (70%)

Tomate para Picão preto 2/10 (20%)

Inoculação por enxertia

Tomate para Bredo de espinho 2/5 (40%)

Tomate para Caruru de mancha 0/3 (0%)

Tomate para Mentrasto 0/5 (0%)

Tomate para Picão preto 3/11 (27%)

Na transmissão por enxertia, onde seções de ramos de plantas daninhas infectadas

foram enxertados em tomateiro, houve resultados positivos somente para o picão (27%) e o

bredo de espinho (40%). Para caruru de mancha, cujo resultado foi negativo, o número de

tomateiros inoculado foi menor, em razão de haver pouco material vegetal para enxertia.

Além disso, dos tomateiros enxertados, somente dois emitiram ramos novos, os quais

apresentaram folhas pouco desenvolvidas, mesmo após os 15 dias da inoculação. O mesmo

ocorreu com a enxertia envolvendo o mentrasto. O pouco material vegetal coletado para teste

pode ter sido a razão do insucesso nesses casos. Na FIGURA 11, observa-se foto ilustrativa

do gel com tomateiros enxertados. Bandas bem visíveis e de tamanho esperado foram

observadas em tomateiros enxertados com picão preto e o bredo de espinho.

A erradicação das espécies daninhas hospedeiras de begomovírus como bredo-de-

espinho, caruru-de-mancha, mentrasto e picão preto, comumente encontrada em lavouras de

tomate na Chapada da Ibiapaba, pode ser recomendada no manejo da virose, visando à

redução da incidência de begomovírus da região produtora. Acrescenta-se ainda que moscas-

brancas são freqüentemente observadas sobre essas invasoras no campo.

A

41

A

B

FIGURA 10: Análise eletroforética em gel de agarose 1% de amostras de tomateiro inoculado empregando-se o vetor tendo por fonte plantas daninhas. A) 1-marcador DNA Ladder 1Kb; 2-tomateiro (controle positivo); 3-5 tomateiro (fonte mentrasto); 6-10 tomateiro (fonte bredo-de-espinho). B) 1-tomateiro (controle positivo); 2- tomate sadio; 3-4 tomateiro (fonte picão); 5- tomateiro (fonte caruru de mancha).

0,9 Kb

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

A B

FIGURA 11: Análise eletroforética em gel de agarose 1% de amostras de tomateiros enxertados tendo por fonte seções de plantas daninhas. 1- marcador DNA Ladder 1 Kb; 2-tomate (controle positivo); 3-5 tomateiro (fonte picão preto); 6 e 7-tomateiros (fonte bredo-de-espinho).

1 2 3 4 5 6 7

0,9 Kb

42

5. CONCLUSÃO

• As plantas daninhas: bredo-de-espinho, caruru-de-mancha, mentrasto e picão

preto são hospedeiras alternativas do begomovírus do tomateiro;

• Mosca-branca transmitiu o begomovírus com maior eficiência para o

tomateiro;

• Bredo-de-espinho, caruru-de-mancha, mentrasto e picão preto, na presença do

vetor, podem ser importantes fontes de begomovírus para o tomateiro.

43

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