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2013.2
IMUNOLOGIA
Profª: Jamilie Sena
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Imunologia www.ifcursos.com.br Jamilie Sena
INTRODUÇÃO À IMUNOLOGIA
Imunologia é uma ciência recente. Historicamente, o primeiro exemplo claro de manipulação do sistema imune
sob condições controladas, foi o da vacinação bem-sucedida contra a varíola. Sua origem é atribuída, por alguns
autores, a Edward Jenner, que, em 1796, verificou proteção induzida pelo cowpox (vírus da varíola bovina) contra
a varíola humana, nomeando tal processo da vacinação. No entanto, é sabido que, na antiguidade, os chineses já
inalavam o pó das crostas secas das pústulas de varíola ou as inseriam em pequenos cortes na pele, em busca de
proteção.
Fig. 1 Edward
Jenner
Em 1789 Jenner observou que as vacas tinham nas tetas feridas iguais às provocadas pela varíola no corpo de
humanos. Os animais tinham uma versão mais leve da doença, a varíola bovina, ou bexiga vacum. Em 1796,
resolveu pôr à prova a sabedoria popular que dizia que quem lidava com gado não contraía varíola. Ao observar
que as mulheres responsáveis pela ordenha quando expostas ao vírus bovino tinham uma versão mais suave da
doença, então ele conduziu sua primeira experiência com James Phipps, um menino de oito anos. Jenner inoculou
com o pus extraído de feridas de vacas contaminadas recolhendo o líquido que saía destas feridas e o passou em
cima de arranhões que ele provocou no braço do garoto. O menino teve um pouco de febre e algumas lesões
leves, tendo uma recuperação rápida. A partir daí, o cientista pegou o líquido da ferida de outro paciente com
varíola e novamente expôs o garoto ao material. Semanas depois, ao entrar em contato com o vírus da varíola, o
pequeno passou incólume à doença. Estava descoberta assim a propriedade de imunização.
No ano seguinte, ele relatou seu experimento à Royal Society - a Academia de Ciências do Reino Unido -, mas as
provas que ele apresentou foram consideradas insuficientes. Ele realizou então novas inoculações em outras
crianças, inclusive em seu próprio filho. Em 1798, seu trabalho foi reconhecido e publicado. No entanto, seus
críticos procuravam ridicularizá-lo, denunciando como repulsivo o processo de infectar gente com material
colhido de animais doentes. Mas as vantagens da vacinação, porém, logo se tornaram tão evidentes tornando
imune à varíola humana, uma das doenças epidêmicas mais mortais da humanidade.
A varíola só seria erradicada na década de 1980, de acordo com a Organização Mundial de Saúde. Edward Jenner
foi capaz de descobrir a vacina para essa doença que tanto matava naquela época.
As vacinas foram sendo criadas para quase todo o tipo de doença, e está sendo uma das melhores coisas já
criadas pelo homem, pois tem salvado a vida de muita gente.
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Fig. 1.2 Jenner injetando o material de uma pústula de varíola no braço de um menino de 8 anos.
Quando Jenner introduziu a vacinação, ele nada sabia sobre os agentes infecciosos que causam as doenças. No
século XIX, Robert Koch provou que as doenças infecciosas eram causadas por microorganismos patogênicos,
cada qual responsável por uma determinada enfermidade ou patologia. Atualmente, existem quatro grandes
categorias de microorganismos causadores de doença ou patógenos: os vírus, as bactérias, os fungos e os
parasitas.
Fig. 1.3 LuisPauter
As descobertas de Koch e outros pesquisadores do século XIX possibilitaram odesenvolvimento da imunologia,
estendendo a vacinação para outras doenças. Por volta de 1880, Louis Pasteur projetou com sucesso uma vacina
contra a cólera aviária e desenvolveu uma vacina anti-rábica também bem sucedida na inoculação de uma criança
mordida porum cão raivoso. Tantos triunfos práticos resultaram na busca pelos mecanismos de
proteçãoimunológica.
Pasteur, embora bem sucedido no desenvolvimento de vacinas, possuía muito poucoconhecimento sobre os
mecanismos envolvidos no processo de imunização. Ele sugeriu queorganismos na vacina eram capazes de
remover nutrientes essenciais do corpo e, assim,evitar o crescimento e proliferação dos agentes causadores de
doença. Aproximadamentedez anos mais tarde, em 1890, Emil vonBehring e ShibasaburoKitasato demonstraram
quea proteção induzida pelos processos de vacinação não se devia a remoção de nutrientes, masestavam
associadas ao surgimento de fatores de proteção no soro dos indivíduos vacinados.
Estas substâncias foram denominadas de anticorpos, as quais se ligavam especificamente e eram capazes de
neutralizar os agentes infecciosos. Emil vonBehring recebeu, em 1901, oprimeiro prêmio Nobel em medicina pelo
seu trabalho sobre a produção de anticorpos. A primeira grande controvérsia em imunologia surgiu quando Elie
Metchnikoff demonstrouem 1882, primeiro em animais invertebrados e depois nos mamíferos, que algumas
célulaseram capazes de “comer” microorganismos. Estas células foram denominadas de fagócitos, e ele propôs
que elas compunham o principal mecanismo de defesa contra estesmicroorganismos. Ele sugeriu que os
anticorpos apresentavam pouca importância nosistema imunológico. O conflito quanto à relevância dos fagócitos
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e anticorpos foiresolvido em 1904 quando Almroth Wright e Joseph Denys demonstraram que osanticorpos eram
capazes de se ligar a bactérias e promover a sua destruição pelos fagócitos.
O sistema imune é o conjunto de células, tecidos, órgãos e moléculas que os humanos e outros seres vivos usam
para a eliminação de agentes ou moléculas estranhas, inclusive o câncer, com a finalidade de se manter a
homeostasia do organismo. Os mecanismos fisiológicos do sistema imune consistem numa resposta coordenada
dessas células e moléculas diante dos organismos infecciosos e dos demais ativadores, o que leva ao
aparecimento de respostas específicas e seletivas, inclusive com memória imunitária, que também pode ser
criada artificialmente, através das vacinas. Na ausência de um sistema imune funcional, infecções leves podem
sobrepujar o hospedeiro e levá-lo à morte. Porém, mesmo com um sistema imune funcional, o homem, por
exemplo, pode adquirir uma doença infecciosa ou um câncer, pois a resposta imune específica, diante de um
agente agressor, leva tempo para se desenvolver e, além disso, tanto organismos estranhos, como células
neoplásicas, desenvolvem mecanismos de evasão para fugir da resposta imune.
ÓRGÃOS, TECIDOS E CÉLULAS ENVOLVIDOS NA RESPOSTA IMUNITÁRIA
Células que participam do sistema imunitário: As respostas imunes são mediadas por uma variedade de
células e por moléculas que estas células expressam. Os leucócitos são as células que desempenham as
principais ações, mas outras células, que se encontram nos tecidos, também participam da resposta
imunitária, enviando sinais e recebendo estímulos dos leucócitos.
As células que participam do sistema imunitário se originam na medula óssea, onde muitas evoluem para a
fase adulta. A partir da medula, e por meio de vasos sanguíneos, elas migram junto com todos os
elementos celulares do sangue. Inclusive as hemácias, que transportam o oxigênio, e as plaquetas que
participam da coagulação, uma vez que estes elementos se originam das células-tronco progenitoras da
medula. As células que derivam do progenitor mieloide e do progenitor linfoide são as que mais interessam
para o entendimento das ações do sistema imunitário, de modo que, neste texto, não serão considerados
os megacariócitos e os eritrócitos.
O progenitor mieloide é o precursor dos granulócitos, fagócitosmononucleares (macrófagos), células
dendríticas e mastócitos do sistema imune.
Os macrófagos são as células fagocitárias mais relevantes. Estas células sãoa forma diferenciada dos
monócitos sanguíneos, que se encontram estrategicamentedistribuída em vários tecidos para dar origem
ao sistema fagocitário mononuclear. Os microgliócitos são os macrófagos do cérebro, as células de Kupffer
são os macrófagos do fígado, os macrófagos alveolares fazem parte do tecido pulmonar, entre outros
macrófagos residentes em diferentes tecidos. As funções dos macrófagos se caracterizam pela
neutralização, ingestão e destruição de partículas, incluindo os biopatógenos, além de processar e
apresentar antígenos para os linfócitos T. Neste contexto, são as células dendríticasas mais especializadas
na captura e na apresentação de antígenos para os linfócitos T. As células dendríticas imaturas migram do
sangue para residirem nos tecidos e realizam tanto a fagocitose quanto a micropinocitose. Após o encontro
com um patógeno, maturam rapidamente e migram para os nódulos linfáticos, onde encontram o
ambiente adequado para a apresentação de antígenos.
Os granulócitos recebem essa denominação por possuírem grânulos em
seu citoplasma que se coram densamente por corantes hematológicos tradicionais.
São também chamados de leucócitos polimorfonucleares, devido às formasde seus núcleos. Existem três
tipos de granulócitos, sendo eles os neutrófilos, os eosinófilos e os basófilos; todos com um tempo de vida
relativamente curto e produzido em grande número durante as respostas inflamatórias.
Os neutrófilos, assim como os macrófagos e as células dendríticas, sãorepresentantes do grupo de células
fagocitárias do sistema imunitário, mas, diferentemente destas células, não apresentam antígenos para os
linfócitos T. Os neutrófilos são os elementos celulares mais numerosos e importantes da resposta inata. Os
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eosinófilos parecem ser importantes, principalmente na respostadiante de infecções parasitárias ou
processos alérgicos, já que seu número aumenta no curso destas reações. A função dos basófilos
provavelmente é similar e complementar à dos eosinófilos e mastócitos. Os mastócitos, cujo precursor
parece ser comum aos basófilos, devido a semelhanças funcionais, também se diferenciam ao chegar aos
tecidos onde residem. Eles se localizam principalmente à margem dos vasos sanguíneos e liberam
mediadores que agem nas paredes vasculares quando ativados.
O progenitor linfoide comum dá origem aos linfócitos. Os linfócitos sãoas células que reconhecem,
especificamente, os antígenos. Sua morfologia típica consiste em uma pequena célula redonda com núcleo
esférico. Apesar da aparência uniforme à microscopia ótica, vários tipos de linfócitos podem ser
distinguidos com base nas suas propriedades funcionais e proteínas específicas que expressam.
A distinção mais fundamental consiste na classificação destas células em duaslinhagens principais,
conhecidas como linfócitos B e linfócitos T. Os linfócitos B, também chamados de células B (de bursa ou
bolsa deFabricius, nas aves, e derivadas da medula óssea, nos mamíferos), quando ativados, proliferam e se
diferenciam em células plasmáticas ou plasmócitos,que são as células efetoras da linhagem B, cuja função
principal é a secreção de anticorpos. Os linfócitos T, ou células T (derivados do timo), se apresentam em
duas classes principais. Uma se diferencia, quando ativada, em células T CD8+ ou citotóxicas, que matam as
células infectadas, ao passo que a outra classe de células T, chamadas de células T CD4+ ou auxiliares,
atuam na ativação de outras células, como os linfócitos B e os macrófagos, além de coordenar a resposta
imunitária.
O receptor de antígeno da célula B (BCR) é uma forma de anticorpo ligada à membrana que a célula B passa
a produzir, após sua ativação e diferenciação em célula plasmática. Os anticorpos são moléculas agrupadas
em uma classe de substâncias denominadas imunoglobulinas, e o receptor de antígeno do linfócito B é
também conhecido como imunoglobulina de membrana.
A imunidade humoral é a principal função das células B e dos plasmócitos, e consiste em secretar
anticorpos no sangue e em outros líquidos orgânicos, resultando efeitos protetores, mediados por líquidos
teciduais. O receptor de antígeno da célula T (TCR) constitui uma classe heterogênea de proteínas de
membrana que, embora estejam relacionadas evolutivamente com as imunoglobulinas, são diferentes
delas, já que estão adaptadas para detectar antígenos derivados de proteínas estranhas ou patógenos que
entram nas células hospedeiras. Todavia, em contraste com as imunoglobulinas, os TCRs nunca são
secretados, de modo que a célula T precisa migrar até as áreas de lesão para exercer seus efeitos
protetores, por meio de contato direto com a célula alvo ou para influenciar as atividades de outras células
do sistema imunitário. Juntamente com os macrófagos, as células T desenvolvem uma categoria de
resposta imune denominada imunidade mediada por células.
A maioria dos linfócitos virgens possui uma sobrevida muito curta,sendo programada para morrer em
poucos dias após ter saído da medula óssea ou do timo. No entanto, se uma dessas células receber sinais
indicando a presença de um imunógeno (antígeno que estimula uma resposta imuneespecífica), ela poderá
responder por meio de um fenômeno conhecido como ativação, durante o qual pode sofrer vários ciclos de
divisão celular.
Algumas das células-filhas retomam ao estado de repouso, tornando-se célulasde memória, que podem
sobreviver por vários anos. Estes linfócitos dememória representam uma grande proporção das células do
sistema imunitário. A outra progênie do linfócito virgem ativado diferencia-se em células efetoras, que
sobrevivem apenas alguns dias, mas que, durante este período, executam atividade que resultam em
defesa.
Outra classe de células linfoides, chamada de células matadoras naturaisou células natural killer (NK), é
desprovida de receptores antígenoespecíficos, sendo parte do sistema imune inato. Essas células circulam
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no sangue como grandes linfócitos, com diferentes grânulos citotóxicos, e sãocapazes de reconhecer e
matar algumas células anormais, tais como células tumorais e células infectadas por vírus. E parecem ser
importantes na defesa contra biopatógenos intracelulares na imunidade inata.
CELULAS:
Linfócitos: são mais comuns no sistema linfático. Os três tipos principais são:
Linfócitos B: Células B produzem anticorpos que se ligam ao patógeno para sua posterior
destruição. Células B também são responsáveis pelo sistema de memória ("guardam resposta
contra um novo ataque do mesmo agente patógeno").
Linfócitos T Auxiliares ou (CD4+): coordena a resposta imune.
Linfócitos T citotóxicos (ou CD8+): Destroem as células infectadas.
Natural killers (ou NK): capazes de matar o vírus
Morfologia: Geralmente os linfócitos entre os leucócitos do sangue são as menores células. Os
linfócitos possuem núcleo esférico, preenchendo quase toda a célula, deixando o citoplasma com pequena
área. O núcleo é bem maciço.
Fig. 1.4 Linfócitos
Linfócitos T e linfócitos B são indiferenciados pela microscopia, sendo portanto, diferenciáveis pelas
técnicas imunocitoquímicas para detecção de receptores específicos de membrana.
Neutrófilos: estão envolvidos na defesa contra infecção bacteriana e outros pequenos processos
inflamatórios. Também são chamados Micrófagos e são o tipo mais abundante no sangue humano. São
leucócitos polimorfonucleados, têm um tempo de vida médio de 6h no sangue e 1-3 dias nos tecidos e são
os primeiros a chegar às áreas de inflamação, tendo uma grande capacidade de fagocitose.
Morfologia: Seu núcleo é polilobulado geralmente apresenta três lóbulos ligados por um fino filamento
nuclear. Seu citoplasma é abundante e possui grânulos finos dispersos. Os seus grânulos são divididos em
primários e secundárias.
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Os primários aparecem no estágio promielócito. Os secundários (específicos) encontrados no estágio
mielocitico e predominantes no neutrófilo maduro.
Eosinófilos: são responsáveis pelo combate às infecções no corpo por parte de parasitas. É classificado
comogranulócito por ter grânulos citoplasmáticos que podem ser visualizados através de microscopia de
luz, seus grânulos são acidófilos (têm afinidade por corantes ácidos) e são corados pelo corante eosina.
Morfologia: Seu núcleo contém dois lóbulos ligados por um fino filamento nuclear.
Seu citoplasma é tomado por grânulos vermelhos-alaranjados.
Macrófagos: Resulta da diferenciação dos Monócitos. Possuem grande capacidade fagocítica. Estão
ausentes no sangue. Intervêm na defesa do organismo contra infecções. Também são ativos no processo
de involução fisiológica de alguns órgãos.
Morfologia: Têm núcleo presente.
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ÓRGÃOS
Timo: é um órgão linfoepitelial e consiste em células epiteliais organizadas nas áreas corticais
(parte externa) e medulares (central) que são infiltradas com células linfóides. O córtex é densamente
povoado por linfócitos de várias dimensões. Está localizado no mediastino anterior. É vital contra a
autoimunidade. É o órgão linfático mais desenvolvido no período pré-natal. Ele involui desde o nascimento
até a puberdade. A função do timo é promover a maturação dos linfócitos T que vieram da medula óssea
Morfologia: É um órgão dividido em dois lobos, o direito e o esquerdo, revestido por uma cápsula
fibrosa, que vai penetrando pelo parênquima tímico e formando os septos conjuntivos que divide os lobos
em inúmeros lóbulos. Cada lóbulo possui uma zona cortical e uma medular. Tanto a zona cortical quanto a
medular apresentam células de estrutura epitelial misturadas com um grande número de linfócitos T (mais
presentes na zona cortical).
Fig. 1.4Zona cortical; Medular.
Bursa de Fabricius: órgão linfóide, onde são formados os linfócitos B, responsáveis pela produção de
anticorpos. É umdivertículo oval em forma de saco na zona dorsal da parede do proctodeu, uma parte
da cloaca das aves. Os mamíferos não possuem bursa de Fabricius.
Morfologia: Este tecido está dividido em lóbulos poliédricos (folículos) por septos de tecido conjuntivo.
Cada folículo apresenta córtex e medula. Uma camada de células epiteliais indiferenciadas ocupa a periferia
da medula, que é separada do córtex por uma camada capilar.
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Linfonodos: Atuam na defesa do organismo humano e produzem anticorpos. Quando o corpo é
invadido pormicroorganismos, os linfócitos dos linfonodos, próximos ao local da invasão, começam a se
multiplicar ativamente para dar combate aos invasores. Eles “filtram” a linfa que chega até eles, e
removem bactérias, vírus, restos celulares, etc
Morfologia: Os linfonodos são órgãos encapsulados constituídos por tecido linfóide e, em geral,
apresentam o formato de um rim.
O parênquima do linfonodo é dividido em: Região cortical: Nessa região, os linfócitos agrupam-se em
formações arredondadas (folículos ou nódulos). As células predominantes na região cortical são os
linfócitos B. Região medular: Nessa região, os linfócitos agrupam-se em cordões linfáticos, entre os quais se
formam os seios medulares. Região paracortical: Situada entre as duas regiões já citadas, sem limites
morfológicos precisos. Nela, há um predomínio de linfócitos T.
Baço: É o maior dos órgãos linfáticos e faz parte do Sistema Retículo-Endotelial, participando dos processos
dehematopoiese. Função: Formação de linfócitos, destruição de eritrócitos desgastados (hemocaterese),
defesa do organismo contra invasores e armazenamento de sangue. O baço é o único órgão linfóide
interposto na circulação sanguínea, por isso atua como um “filtro” para o sangue.
Morfologia: O baço é um órgão compacto, intensamente corado de violeta (hematoxilina) devido à
presença de uma infinidade de linfócitos. O baço tem dois compartimentos:
Fig. 1.5Polpa
Branca Esplênica e a Polpa Vermelha Esplênica. A polpa branca esplênica é constituída por cordões
irregulares de tecido linfóide denso que se continua com os nódulos ou folículos linfáticos. A polpa
vermelha esplênica é constituída por cordões esplênicos, separados por sinusóides.
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CONCLUSÃO
As células do sistema imune são altamente organizadas como um exército. Cada tipo de célula age de
acordo com sua função. Algumas são encarregadas de receber ou enviar mensagens de ataque, ou
mensagens de supressão (inibição), outras apresentam o “inimigo” ao exército do sistema imune, outras só
atacam para matar, outras constroem substâncias que neutralizam os “inimigos” ou neutralizam
substâncias liberadas pelos inimigos”.
ANOTAÇÕES
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TIPOS DE IMUNIDADE
A imunidade nada mais é do que a capacidade de resistir a organismos ou toxinas que tendem a lesar os
tecidos e órgãos do ser humano. A imunidade divide-se em: Imunidade inata, que abrange: a fagocitose de
agentes invasores por leucócitos e células do sistema de macrófagos teciduais; a destruição de
microrganismos deglutidos pelas secreções ácidas do estômago e pelas enzimas digestivas; a resistência da
pele à invasão por microorganismos; a presença no sangue de certos compostos químicos que se fixam aos
microorganismos estranhos ou às toxinas, destruindo-os (lisozima, polipeptídios básicos, linfócitos
citotóxicos naturais, etc.).
Outra parte da imunidade é a Imunidade adquirida que faz parte do sistema imune especial formador de
anticorpos e linfócitos ativados que atacam e destroem os microorganismos ou toxinas específicas.
IMUNIDADE ADQUIRIDA
A imunidade adquirida quase sempre pode conferir grau extremo de proteção. Por exemplo, a toxina
tetânica, pode ter sua ação anulada em doses até 100.000 vezes a quantidade que seria letal sem
imunidade.
O organismo possui dois tipos básicos e estreitamente ligados de imunidade adquirida: imunidade
humoral ou imunidade das células B, onde o organismo forma anticorpos circulantes, que são moléculas de
globulina capazes de atacar o agente invasor. O outro tipo é a imunidade celular ou imunidade das células
T, onde ocorre a formação de um grande número de linfócitos ativados, produzidos especificamente para
atacar o agente invasor.
IMUNIDADE HUMORAL
É uma subdivisão da imunidade adquirida onde a resposta imunológica é realizada por moléculas existentes
nosangue, denominadas de anticorpos, produzidos pelos linfócitos B, diferente da imunidade mediada por
células, que são realizadas pelos linfócitos T.
É importante no combate a organismos extracelulares e pode ainda haver participação de
mastócitos/basófilos, com eliminação de grânulos contendo substâncias com atividade microbicida.
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Tipos de Imunidade humoral:
Ativa natural: adquirida através de doença clínica ou subclínica
Ativa artificial: adquirida por meio de vacinas
Passiva natural: passagem de IgG por meio da placenta (congênita)
Passiva artificial: passagem de anticorpos prontos (Ex. soro antitetânico)
ANTÍGENOS
A imunidade adquirida não ocorre até que haja uma primeira invasão. Cada toxina ou tipo de
microrganismo contém quase sempre um ou mias compostos químicos específicos na sua estrutura que
difere de todos os outros compostos. Em geral trata-se de proteínas ou polissacarídeos, sendo eles que
desencadeiam a imunidade adquirida. Essas substâncias são conhecidas como antígenos.
FUNÇÃO DOS LINFÓCITOS NA IMUNIDADE ADQUIRIDA
A imunidade adquirida é o produto do sistema linfóide do organismo. Os linfócitos são essenciais para a
vida humana. Os indivíduos com deficiência genética ou que tiveram seus linfócitos destruídos por
irradiação ou substâncias químicas, não podem desenvolver qualquer imunidade adquirida.
Os linfócitos localizam-se predominantemente nos linfonodos, mas também são encontrados em tecidos
especiais, como o baço, áreas submucosas do tubo gastrointestinal e medula óssea. O tecido linfóide possui
distribuição muito propícia no organismo para interceptar os microrganismos invasores ou as toxinas antes
que possam disseminar-se extensamente.
Ambos os tipos de linfócitos originam-se no embrião a partir de células-tronco hemopoéticas pluripotentes
que se diferenciam e se tornam compromissadas para formar linfócitos. Eles ainda sofrem maior
diferenciação da seguinte maneira:
Os linfócitos destinados eventualmente a formar linfócitos ativados migram a princípio para o timo
(linfócitos T). São responsáveis pela imunidade celular.
A outra parte dos linfócitos, destinada a produzir anticorpos, é pré-processada pela medula óssea
(linfócitos B). São responsáveis pela imunidade humoral.
O PAPEL DO PRÉ-PROCESSAMENTO
Felizmente, o mecanismo imune normalmente “reconhece” os tecidos da própria pessoa como totalmente
distintos dos tecidos dos invasores, de modo que seu sistema de imunidade forma poucos anticorpos e
células ativadas contra seus próprios antígenos. Esse fenômeno é conhecido como autotolerância aos
próprios tecidos do corpo. A maior parte do mecanismo de tolerância ocorre durante o processamento dos
linfócitos T no timo e linfócitos B na medula óssea.
Existe também outro tipo de autotolerância que é formado pelas células T supressoras. Elas atuam quando
ocorre uma reação auto-imune contra os próprios tecidos do organismo servindo numa espécie de
feedback negativo a esta reação. Este processo ainda não foi totalmente elucidado.
Falhas no mecanismo de tolerância causam as chamadas doenças auto-imunes. Geralmente, o processo de
perda de parte da tolerância imune aos próprios tecidos ocorre com o avanço da idade. Exemplos mais
clássicos de doenças auto-imunes estão o lúpus e o reumatismo.
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VACINAÇÃO
A vacinação é um processo que provoca imunidade adquirida contra doenças específicas. A vacinação pode
ser basicamente de três maneiras: utilizando microrganismos mortos, que não são mais capazes de causar
doença, mas que ainda possuem seus antígenos químicos (utilizados basicamente em doenças bacterianas).
O segundo tipo de vacinação utiliza-se de toxinas previamente tratadas com substâncias químicas, de modo
que sua natureza tóxica tenha sido destruída, com preservação dos antígenos para causar imunidade
(utilizados contra botulismo e demais doenças tóxicas). O terceiro tipo de vacinação utiliza-se de
microrganismos vivos previamente “atenuados”. Esses microrganismos cresceram em meios de cultura
especiais ou passaram por uma série de animais até sofrerem mutações suficientes para não causar mais a
doença, mas ainda possuírem antígenos específicos (utilizados basicamente em doenças causadas por
vírus).
IMUNIDADE PASSIVA
Toda imunidade adquirida discutida até o momento foi a imunidade ativa, ou seja, o próprio
indivíduo desenvolveu anticorpos e linfócitos ativados em resposta à invasão por antígeno estranho.
Contudo, pode-se obter imunidade temporária em um indivíduo sem injetar qualquer tipo de antígeno.
Para isso, administram-se anticorpos, células T ativadas ou ambos, obtidos de outra pessoa ou de algum
animal que tenha sido ativamente imunizado contra o antígeno. Os anticorpos permanecerão entre duas e
três semanas e, durante esse tempo, a pessoa ficará protegida contra a doença invasora. Esta transfusão de
anticorpos é chamada imunidade passiva.
IMUNOGLOBULINA
Anticorpos (Ac), imunoglobulinas (Ig), são glicoproteínassintetizadas e excretadas por células plasmáticas
derivadas dos linfócitos B, os plasmócitos, presentes no plasma, tecidos e secreções que atacam proteínas
estranhas aocorpo, chamadas de antígenos, realizando assim a defesa do organismo (imunidade humoral).
Depois que o sistema imunológico entra em contato com um antígeno (proveniente de bactérias, fungos,
etc.), são produzidos anticorpos específicos contra ele.
Há cinco classes de imunoglobulina com função de anticorpo: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Os diferentes tipos se
diferenciam pela suas propriedades biológicas, localizações funcionais e habilidade para lidar com
diferentes antígenos.
As principais ações dos anticorpos são a neutralização de toxinas, opsonização (recobrimento)
de antígenos, destruição celular e fagocitose auxiliada pelo sistema complemento.
IgM é a primeira imunoglobulina a ser expressa na membrana do linfócito B durante seu
desenvolvimento. Na membrana das células B, a IgM está na forma monomérica. O primeiro
anticorpo produzido numa resposta imune primária é sempre IgMpentamérica.
IgD perfaz menos de 1% do total de imunoglobulinas plasmáticas e a função biológica precisa
dessa classe de imunoglobulina é ainda incerta. A IgD é co-expressa com a IgM na superfície de
quase todas as células B maduras.
IgG é a imunoglobulina mais abundante no soro e está distribuída uniformemente entre os
espaços intra e extravasculares. É o anticorpo mais importante da resposta imune secundária. Em
humanos, as moléculas de IgG de todas as subclasses atravessam a barreira placentária e conferem
um alto grau de imunidade passiva ao feto e ao recém-nascido.
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IgA é a imunoglobulina predominante nas secreções mucosserosas como saliva, colostro, leite e
secreções traqueobronquiais e geniturinárias.
IgE é encontrada nas membranas superficiais dos mastócitos e basófilos em todos os indivíduos.
Essa classe de imunoglobulina sensibiliza as células nas superfícies das mucosas conjuntiva, nasal e
brônquica. A IgE pode, ainda ter papel importante na imunidade contra os helmintos, embora nos
países desenvolvidos esteja mais comumente associada a reações alérgicas como asma e febre do
feno.
Sistema completo
O nome complemento foi originado a partir da atividade complementar deproteínas na ação
bactericida de alguns Acs. O sistema complemento é um complexoproteico existente no plasma, sob a
forma inativa, constituído por substânciastermolábeis e/ou termoestáveis; e que tem como função a
eliminação de um agenteestranho pela ativação de mecanismos inespecíficos, que se constitui de:
Fagocitose - quando algumas proteínas ativadas do complemento unem-se
bactérias, opsonizando-as para ingestão pelos fagócitos portadores de
raceptores do complemento;
Reação inflamatória - quando os pequenos fragmentos de proteínas
promovem eventos vasculares e recrutam fagócitos ao local da atividade
inflamatória.
Lise - quando uma vez desencadeada a cascata, os componentes terminaisdo complemento lesam
certas bactérias, vírus e células com a formação deporos na membrana celular.
Além dessas três funções, o sistema complemento também é responsávelpela depuração imune,
que consiste na remoção de complexos imunes da circulaçãono baço e no fígado. Este sistema, com cerca
de 30 proteínas ou mais, interage porativação enzimática. O complemento pode agir sozinho ou com Ac e
são conhecidas3 vias, a clássica, a alternativa e a via das lectinas. A via clássica é ativada porcomplexos
imunes, enquanto as vias alternativa e das lectinas são ativadas pormicrorganismos. Todas as vias de
ativação convergem para uma etapa final de reação
em cadeia denominada sequência comum
ENSAIOS IMUNOENZIMÁTICOS – ELISA
Os estudos preliminares que tornaram passíveis de execução os métodosimunoenzimáticos foram
realizados, simultaneamente, em 1966, por Nakane e Pierce, nos Estados Unidos, e por Avrameas e Uriel,
na França, com autilização da peroxidase (horseradishperoxidase - HRP) para a confecção de conjugados
proteicos, tendo como precursor o processo de marcação deproteínas com corantes fluorescentes, criado
por Coons, em 1941.
Em 1971, dois grupos de pesquisadores, um holandês, formado porVan Weemen e Schurs, e um sueco,
formado por Engvall e Perlmann, idealizarame introduziram, pioneiramente, o método imunoenzimático
para detecçãoe quantificação de antígenos ou anticorpos específicos. Estes grupos observaramque
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proteínas poderiam ser imobilizadas em uma superfície sólida depoliestireno e a reação imune, ser
revelada pela formação de produtos coloridosda reação enzima-substrato, na presença de um componente
doador deelétrons, denominado cromógeno.
O método ELISA, quando efetuado em ótimas condições (enzimasaltamente ativas, antígenos puros,
substratos de alta qualidade, anticorpo econjugado), apresenta sensibilidade semelhante ao
radioimunoensaio, com avantagem de não ser necessário utilizar material radioativo. Entretanto,
essemétodo apresenta algumas desvantagens, pois alguns substratos usados nessas reações são
teratogênicos e a presença de enzimas endógenas interferem nosresultados quando se usa células inteiras
como antígenos.
A reação é desenvolvida frequentemente em placas plásticas demicrodiluição (suporte), contendo séries de
orifícios, onde são depositados osimunorreagentes, antígenos ou anticorpos, dependendo do objetivo do
método.
O processo de revestimento da placa com o imunorreagente adequadodenomina-se sensibilização. Para
sensibilizar a placa deve-se tratar oimunorreagentecom solução alcalina, deixando-o com carga efetiva
negativa, eassim promover, passivamente, a adsorção à placa por interações eletrostáticas (forças
coulômbicas), as quais ocorrem em virtude das cargas positivas dopoliestireno ou polivinil
(polyvinylchloride - PVC) utilizado para confeccioná-las. Além das placas de microdiluição de 96 cavidades,
também são utilizadosoutros suportes, entre os quais, esferas de sefarose, esferas de poliestireno oude
PVC, ou tubos de poliestireno ou PVC, que possibilitam a adsorçãoadequada da maioria dos
imunorreagentes.
As etapas de lavagem das placas de microdiluição interpõem-se às demaisetapas de execução do método e
servem para retirar excessos de imunorreagentesnão ligados. Podem ser usados procedimentos manuais
ou automáticos, que vãodesde o uso de jorradeiras contendo a solução de lavagem, ou de pente
multicanaladaptado a um sistema de vácuo (lavadora semiautomática), até a utilização delavadoras de
placas automáticas, que reduzem o tempo de realização do teste eproporcionam maior uniformidade ao
processo.
O revestimento da superfície interna da placa de ELISA, pelo menosno plano teórico, não é absoluto e,
portanto, algumas regiões permanecemlivres de ligação. espaços devem ser ocupados com qualquer
moléculaalheia ao sistema reacional, no sentido de reduzir, ou mesmo evitar, a ligaçãoinespecífica, não
imune, de componentes da amostra, geradores de reaçõesindesejáveis que possibilitam falsas
interpretações. A cobertura destes espaçosvazios é chamada de bloqueio. Entre as proteínas mais
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empregadas nesta etapadestacam-se a soro albumina bovina (BSA), a ovalbumina e a caseína, além deum
complexo proteico, como o soro de cobaia.
Dependendo do material a ser pesquisado, pode-se conjugar antígenoscom enzimas (Ag-E) e anticorpos ou
anti anticorpos com enzimas (Ac-E).
Enzimas são macromoléculas de natureza proteica, com função biológicade alto poder catalítico de
reações químicas e elevada especificidade aosubstrato correspondente. As mais usadas nestes testes são a
fosfatasealcalina e a peroxidase.
Para revelar a presença da enzima no complexo formado, utiliza-se umasolução reveladora, que consiste
em um tampão adequado, onde se adicionamo substrato correspondente à enzima conjugada e um
componente doador deelétrons (cromógeno). A enzima conjugada quebra o substrato e seus
produtosatuam no cromógeno, alterando a coloração do sistema .
Esquema do ensaio imunoenzimático ELISA indireto,para pesquisade anticorpos específicos
A leitura da reação em condições de trabalho de campo pode ser feitade forma visual, simplesmente pela
observação da alteração da coloração. Emcondição laboratorial utiliza-se espectrofotômetro apropriado
para leitura dosorifícios das placas, que transforma a intensidade de cor em números. Quantomaior a
leitura, maior será a concentração de enzima conjugada e,consequentemente, maior será a concentração
da substância pesquisada emtécnicas não competitivas.
O método ELISA pode ser classificado de acordo com sua atividadede amplificação, ou seja, por métodos
diretos não competitivos, ou baseados em sua atividade moduladora, que são métodos competitivos.
O ELISA direto é mais usado em imuno-histoquímica. Seu fundamentoconsiste na utilização de anticorpos
primários marcados com enzima, que se combinam especificamente aos antígenos presentes em cortes
histológicos. Aaplicação da solução reveladora destaca o material pesquisado.
O ELISA indireto é empregado para a pesquisa de anticorpos, ondeamostras de soro ou plasma são
colocadas para reagir com antígenos imobilizadosem uma fase sólida (placas de ELISA). Posteriormente, são
revelados comauxílio de conjugado enzimático específico levando a formação de um produtocorado ao agir
sobre substratos cromogênicos. Para pesquisa de antígenospresentes em material biológico, a amostra é
posta para reagir com anticorposespecíficos imobilizados na fase sólida.
O ELISA competitivo consiste na pesquisa de antígeno, onde oanticorpo é mobilizado na fase sólida e o
antígeno correspondente compete com uma quantidade padronizada e marcado para sítios de combinação
disponível. Nesse caso, a redução da reação indica maior quantidade de antígenona solução. Para pesquisar
anticorpos, o antígeno é imobilizado e poderá seligar ao anticorpo da amostra ou ao já conhecido e
marcado (conjugadoenzimático), para, assim, decrescer a intensidade de coloração da reação. Emambos os
métodos competitivos (Figura 30), dois procedimentos podem serseguidos: a competição simultânea, cujo
antígeno ou anticorpo marcado éadicionado junto com a amostra; ou a saturação sequencial, onde o
antígenoou anticorpo é adicionado primeiro, seguido de uma incubação com oimunorreagente marcado.
WESTERN BLOT – WB
A técnica de Western Blotting, também chamada de immunoblottingou imunoeletrotransferência, é uma
ferramenta de grande utilidade para acaracterização de antígenos, ou para pesquisa de anticorpos
específicos paraum determinado componente antigênico.
A técnica de WB baseia-se numa combinação de três métodos muitoaplicados em biologia molecular: a
separação de macromoléculas através deeletroforese em gel de poliacrilamida, na presença de duodecil-
sulfato desódio (SDS-PAGE); sua transferência eletrolítica para membranas (geralmentede nitrocelulose); e
o ensaio de revelação, utilizando anticorpos ou proteínaA, marcados por enzimas, radionuclídeos,
fluorocrômos, metais coloidais oucomplexobiotinina-avidina-peroxidase.
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Assim, as proteínas de um dado antígeno são separadas, transferidaseletroliticamente para membranas de
nitrocelulose e postas a reagir com anticorposmarcados. No final, a reação antígeno-anticorpo é revelada
por meio deimunocomplexos formados com proteínas definidas, e facilmente identificadaspelos seus pesos
moleculares característicos.
A origem do nome Western Blotting partiu de uma brincadeira acadêmicabaseada no nome Southern, do
autor de um método de eletrotransferênciade fragmentos de ácidos nucleicos (DNA), que recebeu o nome
de SouthernBlot. Pouco tempo mais tarde, Alwine e cols conseguiram fazer uma adequação na técnica de
Southern Blotting, que se consistiu na eletrotransferência deácido ribonucleico (RNA), o qual, por sua vez,
foi analisado através desondas de DNA. Assim, seguindo o princípio da brincadeira inicial,
resolveusechamar a nova técnica de NorthernBlotting. Pouco mais tarde, em 1979,Towbin, Staehelin e
Gordon desenvolveram o método de eletrotransferênciade proteínas. Para seguir a já então tradicional
forma de referir-se ao métodoresolveu-se batizar a nova técnica de Western Blotting.
A razão para transferirem-se proteínas, a partir de um gel de poliacrilamidapara uma membrana sintética,
está na possibilidade de manuseio contínuo do material para análise, além de se poder trabalhar com
vários reveladores aomesmo tempo, ou com sondas de elevado peso molecular, uma vez que
apoliacrilamida não é um material muito adequado para que moléculas de grandetamanho sejam
difundidas.
As membranas mais utilizadas para o blotting são derivadas danitrocelulose. Apesar disso, elas são frágeis e
apresentam uma baixa capacidadede ligação às macromoléculas eletrotransferidas. As membranas de
nylonsão muito mais resistentes e ligam-se muito fortemente às proteínas. Suacapacidade de ligação é seis
vezes maior que a das membranas de nitrocelulose.
Sua limitação está relacionada a não impregnação por corantes, comumenteempregados na revelação de
proteínas (azul de Comanssie e negro de amido), e à grande quantidade de reações inespecíficas,
requerendo, assim,um bloqueio muito bem feito antes de se desenvolver o ensaioimunoenzimático para a
revelação do Western Blotting.
Outro aspecto muitoimportante é a porosidade da membrana. Recomenda-se a utilização demembranas
com 0,45mm para o uso genérico e com diâmetros bastantemenores 0,2mm para estruturas proteicas, com
pesos moleculares inferioresa 20 kDa. As melhores membranas, embora sendo bastante caras, são asde
difluoreto de polivinilideno (PVDF). Elas combinam a excelente capacidade ligante e a resistência mecânica
à manipulação necessária para a elaboração das fitas, contendo proteínas eletrotransferidas.
Teste imunocromatográfico
O dispositivo de imunocromatografia é composto de uma membranaporosa de celulose modificada e
membranas absorventes acessórias de fibra devidro, contendo os elementos de reação, ajustadas em um
invólucro plásticoapropriado com uma janela para se acrescentar a amostra de teste e outra paraleitura do
resultado da reação. O princípio de funcionamento do testeimunocromatográfico baseia-se na reação
específica antígeno-anticorpo e seconstitui por uma fase sólida (membrana porosa), onde estão
imobilizadoselementos de captura, e por uma fase móvel, onde estão suspensos o conjugado(que pode ser
a proteína A, ligada ao ouro coloidal ou outros conjugadosdisponíveis) e a molécula alvo da amostra.
A fase móvel migra sobre a fase sólida por efeito de capilaridade,conduzindo o complexo formado entre a
molécula alvo e o conjugado, que,por sua vez, será retido na linha de captura da fase sólida, formando
umcomplexo macromolecular colorido visível ao olho humano. Caso a amostranão contenha a molécula
alvo, esta linha de reação não se formará. Umasegunda linha de reação, denominada linha de controle, se
forma pela capturado conjugado livre, que permite a confirmação da migração da fase móvel
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Imuno-histoquímica
A imuno-histoquímica (IHQ) reúne a interação antígeno anticorpo invitro, técnicas histológicas e reações
químicas, em um método que permitedetectar diferentes estruturas de tecidos, revelados por diversos
tipos de processosde visualização. É utilizada no diagnóstico anatomopatológico de váriasdoenças
degenerativas ou parasitárias, bem como na identificação de estruturas normais em estudos de histologia
básica. As técnicas de IHQ permitem alocalização de proteínas nas células de uma seção de tecido, fixados
em formolou incluído em blocos de parafina. Existe, atualmente, a disponibilidade de umnúmero crescente
de anticorpos para uso em IHQ, o que vem possibilitadouma maior precisão diagnóstica.
Existem dois tipos de técnicas de imuno-histoquímica:
Técnica direta- Os anticorpos primários são ligados a um marcadorapropriado, e o corte de tecido,
que contém antígenos específicos,é incubado com o anticorpo durante algum tempo. Após a
interaçãoentre os anticorpos e as proteínas, os anticorpos que não se ligaram são removidos por
lavagem. Dependendo do marcador utilizado, aleitura da reação será realizada pela microscopia
adequada; paramarcadores fluorescentes, por exemplo, o corte é observado pormicroscopia de
imunofluorescência, enquanto para outros marcadores,utiliza-se a microscopia ótica convencional.
Técnica indireta- Nesta técnica, se utiliza o anticorpo primárioespecífico para uma determinada
proteína e para o anticorpo secundário, uma anti-imunoglobulina marcada que reconhece
oanticorpo primário. O corte de tecido é incubado com o anticorpoespecífico para determinada
proteína. Depois de lavado, é incubadocom o imunoconjugado, que se vai ligar ao anticorpo
primário.
Em seguida, há a observação por microscopia adequada, dependendodo marcador utilizado.A técnica de
IHQ pode também estar associada a um processoenzimático de coloração, como ao complexo avidina-
biotina-enzimacromógeno. O complexo é formado pela ligação de umamolécula de estreptavidina com
várias de biotina associadas a uma enzima(peroxidase ou fosfatase alcalina), que tem como função a
conversão deum cromógeno incolor em um produto final colorido. O cromógeno maisutilizado é o DAB
(diaminobenzidina), que confere cor marrom-ferruginosaao precipitado permanente.
O anticorpo marcado com a peroxidase pode se ligar a sítios teciduaisinespecíficos, prejudicando a
resultado do exame. A utilização de proteínas inertes alheias ao sistema reacional, tais como soro fetal
bovino, soro albuminabovina ou caseína, ao competirem com os sítios de ligação inespecíficos, reduzem a
reação inespecífica. A peroxidase endógena, encontrada em diferentestecidos, também pode mascarar
uma reação e deve ser inibida pelaincubação prévia do corte com peróxido de hidrogênio. A fosfatase
alcalinaestá amplamente distribuída nos tecidos humanos e é encontrada em altasconcentrações na
mucosa intestinal e nos túbulos proximais dos rins, entreoutros tecidos. A biotina endógena, assim como as
outras proteínas utilizadasna IHQ, também é encontrada em tecidos, particularmente no fígado, pulmão,
baço, tecido adiposo, glândula mamária, rim e cérebro. A atividade dabiotina pode ser suprimida pelo uso
de tampões alcalinos, pela pré-incubaçãocom avidina ou com leite desnatado.
A avidina é uma glicoproteína básica com PM de aproximadamente68 mil, obtida a partir da clara do ovo de
várias espécies de aves. A moléculade avidina é quadrivalente e simétrica, onde cada lado da molécula
contém umpar de receptores para a biotina. A estreptavidina, obtida a partir do Streptomycesavidinii,
possui ponto isoelétrico próximo ao neutro e mantém as propriedadesde ligação da avidina sem apresentar
prejuízos ao resultado final. O sistemaavidina-biotina permite a amplificação de sinal, pois muitas
moléculas de biotina podem se ligar a um anticorpo. E a adição da avidina marcada com
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corantesfluorescentes, ou com enzimas, resultam em uma amplificação da reação, facilitandoa visualização
do corte corado.
Preparação do tecido
Tipicamente, amostras podem ser tomadas, tanto de um tecido biológico quanto de uma cultura de células.
As amostras são resfriadas ou aquecidas rapidamente. Elas são homogenizadas por sonicação (quebra das
células por ondas sonoras de alta freqüência) ou por força mecânica. O resultante é a mistura homogênea
dos componentes da célula, e pode ser usado da forma que está ou sujeita a centrifugação em uma série de
passos para se isolar as frações do material citosóico (material do interior da célula externo ao seu núcleo)
e nuclear. Na amostra preparada é então quantificada, para que uma quantidade consistente de proteína
possa ser retirada de cada amostra diferente.
As amostras são fervidas de um a cinco minutos em uma solução tampão, contendo corante, um composto
sulfuroso e um detergente conhecido como dodecil sulfato de sódio (SDS). A ebulição e o detergente
desnaturam a proteína, desenovelando-a completamente. O SDS então cerca a proteína, deixando-a
coberta por uma carga negativa, e o enxofre impede a formação de pontes de dissulfeto na proteína.
Eletroforese em gel
As proteínas da amostra são separadas de acordo com o peso molecular usando-se a eletroforese em
gel. Géis têm várias formulações dependendo do laboratório, peso molecular das proteínas de interesse e
tampões disponíveis, os géis de poliacrilamida são os mais comuns. Desde que as proteínas caminham
apenas em uma direção ao longo do gel, as amostras são carregadas lado-a-lado em "valas" feitas no gel. As
proteínas são então separadas por massa em "bandas" dentro de cada canaleta. Uma canaleta é reservada
para um "marcador", ou ladder, uma mistura disponível comercialmente de proteínas de pesos
moleculares conhecidos.
Também é possível usar um gel 2-D que separa as proteínas de uma única amostra em duas dimensões e as
proteínas são separadas na primeira dimensão de acordo com o ponto isoelétrico (pH no qual elas têm uma
carga total igual a zero), e na segunda de acordo com seus pesos moleculares.
Transferência
A fim de fazer as proteínas acessíveis à detecção do anticorpo, elas são movidas do gel para uma
membrana de nitrocelulose ou de PVDF. A membrana é colocada face-a-face com o gel, e uma corrente
elétrica é aplicada entre grandes placas de cada lado, então as proteínas carregadas se movem do gel para
a membrana enquanto mantém a mesma disposição que continham no gel. Como resultado desse processo
de "borramento" (blotting em Inglês), as proteínas são expostas a uma fina camada para detecção (veja
abaixo). Ambas as variedades de membranas são escolhidas por suas propriedades de ligar proteínas não
especificamente (isto é, liga todas as proteínas igualmente bem). A ligação das proteínas à membrana é
baseada tanto em interações hidrofóbicas quanto em interações de cargas entre a membrana e as
proteínas. As membranas de nitrocelulose são mais baratas que as de PVDF, porém são mais frágeis e não
suportam bem a repetidas amostragens.
Bloqueio
Desde que a membrana foi escolhida por sua habilidade de ligar proteínas, passos precisam ser feitos para
impedir as interações não específicas entre a membrana e o anticorpo usado para a detecção da proteína
alvo. O bloqueio da ligação não específica é alcançado pondo-se a membrana em uma solução diluída de
uma proteína - tipicamente albumina de soro bovino (BSA) ou leite seco desnatado, com uma pequena
quantidade de detergente como Tween 20 ou carbono coloidal.
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Detecção
Durante o processo de detecção testa-se a membrana com anticorpos da proteína de interesse, e se liga
eles com uma enzimareveladora, a qual leva a uma mudança de cor ou sinal fotométrico. Por uma
variedade de razões, isto tradicionalmente toma lugar em processo de dois passos, embora existam
métodos de detecção de um passo disponíveis para certas aplicações.
Método de dois passos
Anticorpo primário:
Anticorpos são gerados quando uma espécie hospedeira ou uma cultura de células imunes são
expostos à proteína de interesse (ou a uma parte dela). Normalmente uma parte da resposta imune é
colhida e usada como ferramenta de detecção específica e sensível que se liga à proteína diretamente - por
isso anticorpo primário.
Depois de bloqueada a membrana, uma solução diluída do anticorpo primário (geralmente entre 0,5 e
5 microgramas/mL) é encubada com a membrana sobre leve agitação. Tipicamente, a solução é composta
de uma solução salina tamponada, e às vezes com BSA ou leite em pó. A solução de anticorpos e a
membrana podem ser seladas e incubadas juntas de 30 minutos a uma noite. Também podem ser
incubadas em diferentes temperaturas, com temperaturas mais altas sendo associadas com mais ligações,
tanto específicas à proteína alvo (o sinal) e não específicas (o ruído).
Anticorpo secundário
Depois de se enxaguar a membrana para remover o anticorpo primário não ligado, ela é exposta a
outro anticorpo, direcionado a porções espécies-específicas do anticorpo primário. Este é conhecido como
anticorpo secundário. Ele geralmente é ligado a biotina ou a uma enzima reveladora como por
exemplo fosfatase alcalina. Esse passo confere a vantagem de que vários anticorpos secundários se ligarão
a um anticorpo primário, providenciando um sinal intensificado.
Mais comumente, uma peroxidase - ligada secundariamente é usada em conjunção com um
agentequimioluminescente, e a reação produz fluorescência proporcionalmente à quantidade de proteína.
Um filme fotográfico é colocado contra a membrana, e exposta à luz da reação é criada a imagem dos
anticorpos ligados ao blot.
Com os procedimentos ELISPOT e ELISA, a enzima pode ser provida com uma molécula substrato
que será convertida pela enzima a um produto colorido de reação que será visível na membrana (veja a
figura acima com as bandas azuis).
Uma terceira alternativa é usar um marcador radioativo acoplada ao anticorpo secundário, por
exemplo marcando uma proteína capaz de se ligar ao anticorpo como a proteína A de Staphylococcus com
um isótopo radioativo de iodo. Desde que outros métodos são mais seguros, mais rápidos e mais baratos;
isto caiu em desuso.
Método de um passo
Historicamente, o processo de sondagem era feito em dois passos por causa da relativa facilidade em se
produzir anticorpos primários e secundários em diferentes processos. Isso dá aos pesquisadores e
corporações grandes vantagens em termos de flexibilidade, e adiciona um passo de amplificação ao
processo de detecção. Dado ao advento da análise em larga escala de proteínas e menores limites de
detecção, contudo, tem havido o interesse de se desenvolver sistemas de sondagem em um passo os quais
permitam o processo ocorrer mais rapidamente e com um menor material consumido. Isso requer um
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anticorpo sonda que reconheça tanto a proteína de interesse e que tenha uma marcação detectável
(sondas que estão freqüentemente disponíveis para seqüências proteicas conhecidas). A sonda primária é
incubada com a membrana de uma forma similar àquela do anticorpo primário do processo de dois passos,
e então está pronta para a detecção direta depois de uma série de passos de lavagem.
Depois das sondas não ligadas serem lavadas, o Western blot está pronto para a detecção das sondas
marcadas e ligadas à proteína de interesse. Em termos práticos, nem todos os Westerns blots revelam
proteínas em apenas uma banda da membrana. Aproximações de tamanho são tomadas pela comparação
das bandas coloridas àquelas do marcador ou ladder carregado durante a eletroforese. O processo é
repetido para uma proteína estrutural, como actina ou tubulina, que não devem mudar entre amostras. A
quantidade de proteína alvo é indexada à proteína estrutural para o controle entre grupos. Essa prática
garante a correção do total de proteína na membrana no caso de erros ou transferência incompleta.
Detecção colorimétrica
O ingenuo da detecção colorimétrica depende da incubação do Western blot com um substrato que reage
com a enzima reveladora (com a peroxidase) que é ligada ao anticorpo secundário. Isso converte o corante
solúvel em uma forma insolúvel de uma cor diferente que precipita próximo à enzima e então colore a
membrana de nitrocelulose. O desenvolvimento da mancha é então parado lavando-se o corante solúvel.
Os níveis de proteína são avaliados por densitometria (o quão intensa a mancha é) ou espectrofotometria.
Quimioluminescência
Os métodos de detecção quimioluminescentes dependem da incubação do Western blot com um substrato
que fluoresce quando exposto à enzima reveladora no anticorpo secundário. A luz é então detectada por
um filme fotográfico ou mais recentemente por câmeras CCD as quais capturam uma imagem digital do
Western blot. A imagem é analisada por densitometria, a qual avalia a quantidade de proteína colorida e
quantifica os resultados em termos de intensidade óptica. Novos softwares permitem uma análise mais
além da informação como a análise do peso molecular se padrões apropriados forem usados. A detecção
de quimioluminescência ampliada é considerada entre os métodos mais sensíveis para análise em blot.
Detecção radioativa
Marcadores radioativos não requerem substratos enzimáticos, mas em vez disso permitem a colocação de
filmes médicos de raios-Xdiretamente contra o Western blot, o qual exposto à sonda cria regiões escuras as
quais correspondem às bandas da proteína de interesse (veja a imagem à direita). A importância dos
métodos de detecção radioativa está declinando, porque são muito caros, apresentam riscos à saúde e à
segurança e a detecção quimioluminescente prevê uma alternativa mais útil.
Detecção fluorescente
A sonda marcada fluorescentemente é excitada por luz e a emissão da excitação é então detectada por um
fotosensor como uma câmera CCD equipada com filtros de emissão apropriados os quais capturam uma
imagem digital do Western blot e permitem uma análise mais além dos dados como a análise do peso
molecular e uma análise quantitativa do Western blot. Fluorescência é considerada entre os métodos mais
sensíveis para análise em blot.
Uma diferença marcante entre membranas de nitrocelulose e de PVDF diz relação à habilidade de cada
uma de suportar a revelação dos anticorpos e de reusar a membrana para sondas subseqüentes de
anticorpos. Enquanto existem protocolos bem estabelecidos disponíveis para a revelação de membranas de
nitrocelulose, a mais dura PVDF permite uma revelação mais fácil, e mais reuso antes do ruído de fundo
limitar os experimentos. Outra diferença é que, diferente da de nitrocelulose, a de PVDF precisa sem
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embebida emmetanol 100% ou isopropanol antes do uso. As membranas de PVDF também tendem a ser
mais densas e muito mais resistentes ao dano decorrido da manipulação normal.
O teste confirmatório de HIV emprega um Western blot para detectar o anticorpo anti-HIV na
amostra de soro humano. Proteínas de células conhecidas infectadas com o HIV são separadas
e "blotadas" em uma membrana como acima. Então, no soro a ser testado é aplicado o
anticorpo primário no passo de incubação; o anticorpo livre é lavado, e um anticorpo anti-
humano secundário é ligado, e uma enzima reveladora é adicionada. As bandas impregnadas
então indicam os anticorpos do soro dos pacientes marcados com o anticorpo anti-humano.
Um Western blot também é um teste definitivo para a doença da vaca louca.
Algumas formas do teste da Doença de Lyme empregam o Western blot.
GLOSSÁRIO DE IMUNOLOGIA
ADCC Citotoxicidade celular dependente de anticorpo. Lise de células-alvo
através da ação de anticorpos e neutrófilos, macrófagos ou células nulas.
Adjuvante Material que facilita a resposta imune normal.
Afinidade
Medida da força de ligação entre um sítio de combinação de anticorpo e
um determinante anti gênico. É calculado através da lei de ação das
massas e é expressa em litros de mol.
Aglutinação Ajuntamento de antígenos particulados tais como bactérias ou
eritrócitos pela ação de anticorpos.
Alérgeno Antígeno que estimula a produção de anticorpos reagínicos.
Alergia
Termo que atualmente engloba qualquer conseqüência adversa,
imunologicamente mediada, devido a exposição a antígenos, mas que
deveria ser restrita à descrição da hipersensibilidade imediata (Tipo I).
Aloenxerto Enxerto entre animais alogênicos. (O termo homoenxerto foi
anteriormente empregado neste sentido).
Alogênico Genéticamente diferente porém da mesma espécie.
Alotipo Determinantes antigênicos geneticamente controlados encontrados em
moléculas de proteínas dealguns indivíduos de uma espécie.
Anafilaxia
Forma de hipersensibilidade imediata (Tipo I) mediada pôr anticorpos
reagínicos e resultante da liberação aguda de agentes
farmacologicamente ativos por mastócitos ou basófilos. Pode ser lo cal
ou sistêmica.
Anergia Ausênsia de imunidade mediada por células (usualmente uma resposta
de hipersensibilidade tardia) em um animal que foi sensibilizado.
Animal gnotobiótico Animal que é estéril ou contaminado com uma população conhecida de
bactérias.
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Anticorpo
Imunoglobulinas formadas em resposta à introdução de material dentro
do corpo que é por ele reconhecido como estranho. Sua propriedade
característica é combinar-se com o material indutor (antígeno) em
condições fisiológicas.
Anticorpo bloqueador
Anticorpo não citotóxico, não fixador de complemento que, através do
revestimento de células, pode protegê-las contra a destruição mediada
por células.
Anticorpo reagínico Anticorpo que media a hipersensibilidade tipo I , isto é , IgE e algumas
subclasses de IgG.
Anticorpos citofílicos Imunoglobulinas que são capazes de se ligar a receptores celulares
devido a um sítio específico em sus região Fc.
Anticorpos homocitrópicos
Termo que inclui anticorpos citofílicos e todos os anticorpos que se ligam
especificamente a células na mesma espécie, como aquelas em que eles
são produzidos. Por convencão, o uso desse termo é restrito àqueles
anticorpos que se ligam a mastócitos ou basófilos e ediam a
hipersensibilidade tipo I, isto é, anticorpos reagínicos.
Anticorpos incompletos
A nticorposque , embora possam se ligar a partículas antígênicas, são
incapazes de agregá-las e provocar sua aglutinacão. É preferível o termo
anticorpos não aglutinantes. Estes podem ser detectados através de um
teste de antiglobulina.
Antígeno Material que pode provocar uma resposta imune.
Antígeno de
histocompatibilidade
Antígenos encontrados na superfície de células nucleadas característicos
de um indivíduo que provocam rejeição de aloenxerto e regulam as
repostas imunes.
Antígenos heterófilos
Determinantes antigênicos amplamente distribuídos e encontrados na
natureza, por exemplo, em bactérias, plantas e várias espécies de
animais.
Atopia
Termo usado para descrever a tendência herdada para desenvolver
hipersensibilidade imediata (Tipo I) encontrada em alguns seres
humanos e cães.
Auto-anticorpo Anticorpo dirigido contra determinantes antigênicos dos constituintes do
próprio animal.
Avidez
Termo confuso usado por alguns para descrever uma propriedade do
anticorpo que determina a velocidade com que ele reage com o
antígeno, mas usado por outros para se referir á força de combinação de
um antígeno.
Bacterina Preparação de bactérias mortas usada para imunização.
Blastogênese Produção de células em divisão.
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"Capping" Agregação de moléculas de membranas celulares a uma região restrita
da superfície de uma célula.
Carregador Molécula imunogênica à qual está ligado um hapteno.
Célula efetora Célula que realiza uma função especifica.
Célula matadora natural (NK) Célula linfóide mal definida encontrada em animais normais e capaz de
destruir células infectadas por tumores ou vírus.
Células K (killer) Linfócitos não-T e não-B que podem destruir células-alvo através da
citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC).
Células nulas Linfócitos aos quais faltam marcadores de superfície de células T ou B.
Clone População de células ou organismos idênticos provenientes de uma
única célula ou organismo precursor.
Complemento
Sistema de proteínas, razoavelmente complexo, ligado a enzima e auto
agregador que é ativado por vários fatores, em particular pela interacão
antígeno-anticorpo, e que resulta numa ampla variedade de
conseqüências biológicas tais como lise de menbrana celular e
opsonização.
Conglutinina
Constituinte do soro bovino, não relacionado com as imunoglobulinas,
que se combina com o terceiro componente fixo do complemento. Se
este C3 fixo é ligado a uma partícula como um eritrócito, então a
conglutinina fará o eritrócito se agregar, caracterizando uma reação
conhecida como conglutinação.
Doença auto-imune Doença causada por resposta imune dirigida contra os próprios tecidos
do animal.
Endotoxina Componente lipopolissacarídico da parede celular de bactérias gram-
negativas que possui atividade inespecífica.
Exotoxina
Proteínas solúveis secretadas por bactérias vivas ou liberadas pelo
citoplasma de organismos mortos e que têm um efeito tóxico específico.
São usualmente produzidas por organismos gram-positivos.
Facilitação Prolongamento da sobrevida de um aloenxerto ou a facilitação do
crescimento tumoral permitido pelos anticorpos bloqueadores.
Fagocitose
É o ato de comer realizado pelas células. O termo compreende vários
processos, inclusive quimiotaxia, aderência ingestão e digestão ede
partículas.
Fator reumatóide
Auto-anticorpo dirigido contra imunoglobulina normal. É encontrado em
muitas doenças auto-imunes, especialmente na artrite reumatóide e no
lúpus eritematoso sistêmico.
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Floculação Forma de reação de precipitação observada quando se usa soro eqüino
como fonte de anticorpo que dá o precipitado é relativamente restrita.
Gamaglobulina
O grupo de proteínas plasmáticas que tem a mais lenta mobilidade
eletroforética. É dentro deste grupo que os anticorpos (imunoglobulinas)
são encontrados.
Globulinas Proteínas precipitadas pela adição de um volume igual de solução
saturada de sulfato de amônio ao soro.
Hapteno
Molécula não protéica que pode se ligar a sítios específicos de
combinação de anticorpos mas não pode, pôr si só, iniciar uma resposta
imune.
Hemadsorção Agregação de eritrócitos à superfície de células animais, em meio de
cultura, após infecção por vírus.
Hemaglutinação Agregação de eritrócitos pôr anticorpo ou vírus.
Hemaglutinação viral É o agregamento de células vermelhas que ocorre em presença de certos
vírus como resultado na ligação de vírus e estas células.
Hibridoma Linhagem celular cultivada e formada pela fusão de células de mieloma
com células B produtoras de anticorpo.
Hipersensibilidade imediata
Hipersensibilidade mediada pôr anticorpos reagínicos em que a
administração de antígeno produz uma resposta detectável dentro de
segundos ou minutos.
Hipersensibilidade tardia.
Reação da pele a um antígeno injetado, mediada pôr células. Assim
denominada porque a reação não atinge a intensidade máxima até 24 a
48 horas após a administração do antígeno Um exemplo disso é a reação
de tuberculina.
Idiotipo
Variabilidade antigênica de uma população de moléculas de proteína
dentro de um animal. Esse tipo de variação é observado nas
imunoglobulinas e está associado a diferentes seqüências de
aminoácidos nos sítios de combinação de anticorpos.
Imunização
Em sentido escrito é a administração de antígeno a um animal com a
intenção de produzir imunidade protetora. Entretanto, atualmente vem
sendo comumente usada para descrever o procedimento para induzir
uma resposta imune.
Imunoconglutininas
Auto-anticorpos dirigidos contra o terceiro ou quarto componentes fixos
do complemento. Quando estes componentes do complemento são
fixados a partículas, a presença de conglutininas pode provocar sua
agregação. Isto é chamado anticonglutinação.
Imunógeno Substância que é capaz de suscitar uma resposta imune.
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Imunoglobulinas Classe de proteínas que possuem atividade de anticorpo.
Inibição da hemaglutinação Inibição da hemaglutinação viral mediada pôr anticorpo especifico contra
o vírus.
Interferons Grupo de proteínas de baixo peso molecular capaz de interferir na
replicação viral e de regular a atividade imune.
Isotipo
Variabilidade antigênica entre proteínas relacionadas, encontradas em
todos animais da mesma espécie. Pôr exemplo, as diferenças antígenicas
entre subclasses de imunoglobulinas são isotípicas.
Lectinas
Proteínas, usualmente de origem vegetal, que se ligam a
monossacarídeos específicos. A maioria das lectinas usadas em
imunologia estimula a proliferação de linfócitos quando se liga a
açucares de menbrana celular.
Linfocinas
Glicoproteínas obtidas de linfócitos, as quais controlam as atividades de
outras células. Deste modo elas servem para regular muitos aspectos das
respostas imunitárias..
Microrganismo patogênico Microrganismo que tem a capacidade de provocar doença
em animais susceptíveis.
Mieloma Tumor de plasmócitos.
Mitógeno Substancia que estimula a proliferação celular.
Monocinas São produtos protéicos de fagócitos mononucleares que influenciam as
atividades de outras populações celulares.
Opsonina Substância que se liga a partículas e facilita sua fagocitose.
Pinocitose Literalmente é o ato de beber realizado pelas células.
Prinofílico.
Corado em rosa pela pironina. A pironina tem afinidade pôr RNA e assim
detecta ribossomos no citoplasma celular. Uma vez que os ribossomos
estão associados com a síntese protéica, uma célula com citoplasma
pirinofílico é uma célula sintetizadora de proteínas
Precipitação
O agregamento de moléculas de antígenos solúveis pelos anticorpos para
produzir um precipitado visível. Este contém tanto antígenos como
anticorpos.
Premunição
Forma de imunidade observada nas infecções pôr protozoários e alguns
helmintos que depende da presença contínua do parasita. A
superinfecção é evitada enquanto os parasitas persistem no hospedeiro
mas a imunidade desaparece rapidamente após a eliminação do parasita.
Proteínas de Bence Jones Proteínas encontradas na urina de indivíduos com mieloma. Precipitam-
se na urina ao aquecê-la até cerca de 60ºC e redissolvem-se em
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temperaturas maiores. Estas proteínas são usualmente cadeias leves de
imunoglobulinas.
Prozona
Ausência da reação imunológica detectável em um sistema de teste na
presençã de baixas diluiçôes de anti-soro de alto título. Isto pode ser
devido a um largo excesso de anticorpo ou à inibição da aglutinação pelo
complemento ou anticorpo não aglutinante.
Quimera Animal que foi populado com sucesso, naturalmente ou artificialmente,
pôr células alogênicas.
Quimiotaxia Movimento de células ou organismos sob a influência de um estímulo quimico
externo. Este pode ser positivo ou negativo.
Reação anafilactóide Sindrome de choque aparentemente semelhante à anafilaxia mas que
não é imunológicamente mediada.
Reação de Arthus Reação inflamátória local mediada pôr complexo antígeno-anticorpo
(hiperssensibilidade Tipo III) na pele.
ReaçõesShwartzman
Reações tóxicas e endotoxinas bacterianas em que ocorre coagulação
intravascular local ou sistémica. A reação é precipitada pela ativaçâo da
via alternativa do complemento.
Resposta anaminéstica
Resposta imune secundária. Otermo é geralmente aplicado a uma
resposta secundária que ocorre após um tempo considerável depois da
primeira exposição ao antígeno.
Singênico Geneticamente idêntico.
Soro Fluido amarelo claro que surge quando o sangue se coagula e o coágulo
se contrai.
Sorotipo Suptipo dentro de um grupo de organismos que pode ser identificado
somente por técnicas sorológicas.
Teste de antiglobulina
Teste que emprega um anticorpo dirigido contra imunoglobulinas para
aglutinar partículas carregadoras de anticorpos não aglutinantes em sua
superfície. Também chamado teste de Coombs, segundo o veterinário
que o desenvolveu.
Teste de Coombs Veja teste de antiglobulina.
Teste de hemaglutinação
passiva Teste de hemaglutinação provocada pôr anticorpo dirigido
contra um antígeno artificialmente ligado à superfície de eritrócitos.
Pode também ser chamado de hemaglutinação indireta.
Título
Medida do número de unidades de anticorpo pôr unidade de volume do
soro. É usualmente expresso como a recíproca da diluição do soro no
último tubo em uma série de diluições crescentes que mostram o efeito
desejado.
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Tolerância Falha do sistema imune em responder a um antígeno específico.
Toxóide
É a modificação de uma toxina de modo que sus toxicidade é destruída
mas não sua imunogenicidade. Usualmente isto é conseguido tratando a
toxina com formaldeído.
Vacina autógena
Vacina preparada a partir de organismos causadores de doença num
indivíduo ou população e subsequentemente usada nesse mesmo
indivíduo ou população para estimular a imunidade, tendo em vista
auxiliar sua recuperação. Isto pode ser últil quando a imunidade é
altamente linhagem específica.
Vacina mista
Vacina contendo uma mistura de diferentes antígenos usada com a
intenção de promover imunidade contra vários microrgarnismos ou
toxinas através de uma única injecção. Pôr exemplo, as vacinas contra
cinomose canina, hepatite infecciosa e leptospirose podem ser
satisfatoriamente combinadas em vacina mista.
Vacinação A administração de antígeno (vacina) em u animal com intenção de
estimular uma resposta imune protetora.
Virulência Este termo é usado para quantificar a potência da produção de doença
pôr um microrganismo patogênico particular.
Xenoenxerto Enxerto entre indivíduos xenogênicos, isto é, indivíduos de espécies
diferentes.
BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
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