UNIVERSIDADE ESTADUAL DO OESTE DO PARANÁ

CENTRO DE CIÊNCIAS MÉDICAS E FARMACÊUTICAS

APOSTILA DE AULAS PRÁTICAS DE BIOQUÍMICA

ALUNO(A):.................................................................................... CURSO: FARMÁCIA SÉRIE: 1º ANO TURMA: 2013 Profa. Dra. Marli Terezinha Frana Cornelius

2ÍNDICE

1a AULA: Normas Para o Trabalho no Laboratório .............................................................................. 3

NORMAS PARA REDAÇÃO DO RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS DE BIOQUÍMICA .......... 6

2a AULA: Vidrarias e Manuseio de Material de Laboratório ................................................................ 8

3a AULA: Cálculos Bioquímicos e Preparo de Soluções .................................................................... 14

4a AULA: pH e Solução Tampão ........................................................................................................ 16

5a AULA: Verificação do Efeito da Solução-Tampão ......................................................................... 18

6a AULA: Titulação Potenciométrica de Aminoácidos ....................................................................... 19

7a AULA: Determinação do Ponto Isoelétrico da Caseína .................................................................. 21

8a AULA: Reações Qualitativas para Identificação de Aminoácidos ................................................... 22

9a AULA: Reações de Caracterização e Precipitação de Proteínas ...................................................... 25

10a AULA: Caracterização da Enzima Urease de Soja........................................................................ 28

11a AULA: Cinética Enzimática da Invertase I ................................................................................... 30

12a AULA: Cinética Enzimática da Invertase II ................................................................................. 32

13a AULA: Caracterização de Carboidratos - Reações Qualitativas .................................................... 33

14a AULA: Caracterização de Carboidratos – Reações de Reduções .................................................. 36

15a AULA: Diálise ............................................................................................................................. 38

16a AULA: Extração e Caracterização do Amido ............................................................................... 40

17a AULA: Testes Para Caracterização de Lipídeos ........................................................................... 42

18a AULA: Prática de Carotenoides ................................................................................................... 45

19a AULA: Cromatografia de Carboidratos ........................................................................................ 46

20a AULA: Identificação de Ácidos Nucleicos em Materiais Biológicos ............................................ 48

21a AULA: Espectrofotometria .......................................................................................................... 50

22a Aula: Seleção da Área Espectral = Espectro de Absorção ............................................................. 53

23a AULA: Preparo da Curva Padrão (Curva De Calibração) ............................................................. 54

24a AULA: Dosagem de Proteína no Soro .......................................................................................... 55

25a AULA: Determinação de Glicose no Sangue ................................................................................ 56

26a AULA: Dosagem de Triglicerídeos no Sangue ............................................................................. 58

27a AULA: Determinação de Cálcio Sérico ........................................................................................ 59

28a AULA: Determinação de Fósforo ................................................................................................. 60

29a AULA: Determinação de Magnésio no Soro ................................................................................ 62

Bibliografia ........................................................................................................................................ 64

31a AULA: Normas Para o Trabalho no Laboratório

O laboratório é um lugar privilegiado para a realização de experimentos, possuindo instalações de água, luz e gás de fácil acesso em todas as bancadas. Possui ainda local especial para manipulação das substâncias tóxicas, denominado capela, que dispõe de sistema próprio de exaustão de gases. O laboratório é um local onde há um grande número de substâncias que possuem os mais variados níveis de toxicidade e periculosidade. Este é um local bastante vulnerável a acidentes, caso não se trabalhe com as devidas precauções. As regras gerais de segurança em laboratório resultam de vários anos de esforços de pessoas preocupadas em tornar o trabalho no laboratório uma atividade segura, minimizando os riscos de acidentes. Para tirar o máximo de proveito delas, é necessário que todos os usuários as conheçam e as pratiquem, desde o primeiro instante em que pretenderem permanecer em um laboratório. São regras simples, fáceis de memorizar e de seguir. I. INSTRUÇÕES GERAIS PARA LABORATÓRIO

01) Lembre-se de que o laboratório é um lugar para trabalhos sérios e não para experimentos ao acaso.

02) Compareça pontualmente às aulas nos dias e nos laboratórios designados para sua turma. 03) É obrigatório o uso de JALECO DE MANGAS LONGAS, CALÇADO FECHADO e

CALÇA COMPRIDA para assistir as aulas práticas, sem essas condições o aluna NÃO PODERÁ ASSISTIR ÀS AULAS PRÁTICAS.

04) Os materiais desnecessários à prática (bolsas, pastas, celulares) devem ser mantidos fora das mesas de trabalho.

05) Os materiais necessários na bancada são: a Apostila de Aula Prática, lápis, caneta e borracha. Caso precisar de outro material será solicitado pelo professor.

06) É proibido fumar, comer e beber no laboratório. 07) Estudar previamente os roteiros de práticas e anotar as observações e resultados. 08) Realize somente os experimentos indicados ou autorizados. 09) Nunca prove uma droga ou uma solução. 10) Use somente o material e reagente que estiver sobre sua mesa, precisando de outros solicite ao

professor, técnico ou monitor. 11) Procure não desperdiçar nada. 12) Não jogue qualquer material sólido ou líquido (exceção água) na pia. 13) Ao lidar com vidrarias, proceda com cuidado para evitar quebras e cortes perigosos. 14) Não colocar os dedos ou as mãos na boca, no rosto ou em qualquer parte da pele durante as

aulas práticas. 15) O trabalho em grupo deve ser encarado com seriedade e não como oportunidade para

brincadeiras, todos precisam controlar a altura da voz para não perturbar as aulas nas salas vizinhas.

16) A seriedade e a ordem durante a realização dos experimentos são fundamentais para evitar acidentes.

17) Se ocorrer qualquer acidente (ferimento, queimaduras) ou quebra de materiais ou aparelhos chame imediatamente o professor.

18) Lembre-se que só você responde pela sua segurança.

4II. PRINCÍPIOS GERAIS DE TÉCNICAS A. Antes do Experimento: 1. Leia as práticas com antecedência para obter melhor aproveitamento das aulas. 2. Vista o avental (guarda-pó, bata). 3. Organize o seu campo de trabalho. 4. Verifique se o material está em condição adequada para uso (não utilize material de vidro trincado

ou quebrado). B. Durante o Experimento:

1. Não troque os reagentes de uma bancada para outra. 2. Leia duas vezes o rótulo dos frascos de reativos, antes de utilizá-los. Nunca utilize um reagente

que não esteja identificado ou rotulado. Na dúvida solicite ajuda do professor, monitor ou técnico.

3. Não manuseie sólidos e líquidos desconhecidos apenas por curiosidade. 4. Identifique imediatamente qualquer reagente ou solução preparada. 5. Para evitar contaminação das soluções:

- Antes de introduzir pipetas nas soluções, certifique-se de que estão limpas; - Use sempre uma pipeta para cada reagente; - Não troque as rolhas ou tampas dos frascos dos reagentes; - Nunca devolva a solução para o frasco estoque;

6. - Não use a mesma vidraria para medir substâncias ou soluções diferentes. 7. Nunca teste amostras ou reagentes pelo sabor. Não leve à boca qualquer reagente, nem mesmo

o mais diluído. 8. Para verificar o odor da substância, nunca leve o rosto diretamente sobre o frasco. Os vapores

devem ser abanados com uma das mãos em direção ao nariz, enquanto se segura o frasco com a outra mão.

9. Não leve a mão à boca ou aos olhos enquanto estiver manuseando produtos químicos ou biológicos.

10. Reagentes voláteis ou tóxicos devem ser manuseados na capela. 11. Nunca deixe ou abra frascos de líquidos inflamáveis (éter, álcool, acetona, benzeno, etc.), nas

proximidades de chamas. 12. Não circule no laboratório com frascos de álcool ou outros produtos voláteis e inflamáveis,

quando a chama do Bico de Bünsen estiver acesa. 13. Não pipetar com a boca, os ácidos concentrados e outras substâncias perigosas, use

pipetador ou pêra de sucção. 14. Se qualquer substância cair no chão ou na mesa, avise o professora, monitor ou técnico para ser

imediatamente lavado o local. 15. Não utilizar materiais escolares (lápis, caneta) para misturar substâncias. 16. Para preparar soluções de ácidos fortes (sulfúrico, clorídrico, nítrico, etc.), verter sempre o

ácido sobre água, nunca o inverso, porque provoca reação exotérmica violenta. Não aspire os vapores desprendidos por esses ácidos, são extremamente tóxicos.

17. Para o preparo das soluções alcalinas (NaOH, KOH, etc.) tome bastante precaução, pois a reação é exotérmica e corrosiva. Mantenha o frasco em banho de gelo para evitar quebras. Não aspire os vapores desprendidos por essas bases, são extremamente tóxicos.

18. Quando preparar soluções alcoólicas, o álcool e a água devem ser medidos separadamente e depois reunidos, porque há diminuição do volume final.

519. O material volumétrico vem calibrado com água e uma temperatura determinada, conforme

vem registrado (15°C, 20°C, 25°C). Estas vidrarias não podem ser secas em estufas a altas temperaturas.

C. Depois do Experimento: 1. Descartar os reagentes conforme recomendado em cada aula. 2. Lave os tubos e outros materiais utilizados. MANTER LIMPO TODO O MATERIAL É SUA

RESPONSABILIDADE. 3. Limpe e organize a bancada. 4. Fechar todos os bicos de gás e torneiras. 5. Lavar as mãos APÓS A AULA PRÁTICA.

III. CUIDADOS NO USO DE SUBSTÂNCIAS QUÍMICAS

1. Ao aquecer substâncias em tubo de ensaio, dirija a abertura deste para o lado em que não haja nenhum colega.

2. Nunca coloque o rosto muito próximo de um recipiente onde está ocorrendo uma reação química.

3. Nunca cheire diretamente qualquer substância. Mantenha o recipiente que a contém afastado do rosto e, com movimento das mãos, dirija os vapores desprendidos para o nariz.

4. Nunca prove qualquer substância utilizada ou produzida durante os experimentos. 5. Nunca adicione água a um ácido concentrado (reação violenta com produção de calor e

borbulhamento intenso), pois o ácido poderá atingir o seu rosto. Sempre despeje o ácido sobre a água pela parede o frasco ou tubo. Não aspire os vapores desprendidos.

6. Para o preparo das soluções alcalinas (NaOH, KOH, etc.) mantenha o frasco em banho de gelo para evitar quebras, pois a reação é exotérmica e corrosiva. Não aspire os vapores desprendidos.

7. Leia com atenção os rótulos dos frascos antes de usar seus conteúdos. 8. Não use quantidades exageradas de substâncias. Use sempre as quantidades indicadas no roteiro 9. Não misture substâncias ao acaso, mas somente de acordo com as instruções.

ACIDENTES NO LABORATÓRIO E SOCORROS DE URGÊNCIA

QUALQUER ACIDENTE QUE OCORRER NO LABORATÓRIO DEVE SER COMUNICADO AO PROFESSOR. QUEIMADURAS:

PELO CALOR: Aplicar gaze com óleo ou pomada para queimadura (Picrato de Butesina) ou leite de magnésia.

POR ÁCIDOS: Lavar o local abundantemente com água de torneira e a seguir aplicar algodão embebido em bicarbonato de sódio (NaHCO3) a 5%.

POR ÁLCALIS: Lavar o local abundantemente com água de torneira e a seguir aplicar algodão embebido em ácido acético a 1% ou ácido cítrico a 1%.

POR FENOL: Lavar o local abundantemente com água de torneira e a seguir com álcool, aplicando gaze com pomada.

CORTES: Remover objetos estranhos. Limpar com gaze seca. Aplicar mertiolato ou mercúrio cromo. Colocar atadura de gaze ou atadura adesiva.

6INTOXICAÇÕES: a) POR GAZES OU VAPORES:

Respirar ar fresco, afrouxar a roupa e repousar deitado.

b) POR SOLUÇÕES OU SÓLIDOS INGERIDOS: Provocar vômito por estímulo com o dedo, ou 10 mL de CuSO4 a 5%. Tomar leite de magnésia.

c) POR HIDRÓXIDO DE SÓDIO: Lavar a boca com água em grande abundância. Lavar a seguir com solução de ácido acético a 1% ou ácido cítrico a 1%. Se necessário ingerir ácido cítrico ou acético a 1%.

d) POR AMÔNIA: Se inalar, repousar ao ar livre, sem forçar a respiração.

LEIA SEMPRE O ROTEIRO DA PRÁTICA

ANTES DE ASSISTIR A AULA

NORMAS PARA REDAÇÃO DO RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS DE BIOQUÍMICA � Somente quem participar de TODA AULA PRÁTICA PODERA FAZER O RELATÓRIO. � O RELATÓRIO TEM QUE SER ESCRITO A MÃO E NÃO ULTRAPASSAR 5 PÁGINAS DE

PAPEL ALMAÇO. � Serão 25 relatórios cada um atribuído uma nota de 4,0 pontos (25 X 4 = 100,0). Quem fizer todos

relatórios de maneira correta ganhará 100,0 pontos para somar na nota da média da disciplina. � A forma para se redigir o relatório deve ser respeitada, uma vez que a avaliação do mesmo é feita

de acordo com esta orientação. Assim todo relatório devera conter os seguintes itens: CAPA:

Devera ter: Nome da UNIOESTE - Universidade Estadual do Oeste do Paraná; do Centro de Ciências Biológicas e da Saúde. Curso de Fisioterapia.

Relatório de aulas práticas de Bioquímica. Título da aula. Nome do aluno. Local/Data (d/m/a).

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Modelo de capa para relatório

UNIOESTE - UNIVERSIDADE ESTADUAL DO OESTE DO PARANÁ CENTRO DE CIÊNCIAS MÉDICAS E FARMACÊUTICAS

CURSO DE FARMÁCIA

Relatório de Aulas Práticas de Bioquímica.

Título da Aula Prática.

Ana Paula Dias Turetta

Cascavel 18/04/2013

OBJETIVOS: Colocar o(s) objetivo(s) da aula prática de forma clara e concisa. INTRODUÇÃO: Deve conter os fundamentos bioquímicos da metodologia empregada (aspectos

teóricos da aula prática encontrados na literatura). MATERIAIS E MÉTODOS: Descrever os procedimentos executados em laboratório incluindo todos

os reagentes, materiais e equipamentos utilizados. RESULTADOS E DISCUSSÃO: Colocar todos os dados obtidos (utilizar tabelas, caso julgue

necessário). Os gráficos serão aceitos em papel milimetrado. Comentar os resultados obtidos, discutir possíveis diferenças obtidas comparando como os dados da literatura. Responder as questões da apostila.

CONCLUSÃO: Comentar quais as conclusões da aula prática. Ser claro e objetivo nas conclusões. Esclarecer se os objetivos propostos foram atingidos ou não. BIBLIOGRAFIA: Colocar todos os livros e artigos consultados. Exemplos: ENRICONE, Délcia. et al. Planejamento de ensino e avaliação. 10.ed. Porto

Alegre: Sagra, 1984. 306 p. (Série Didática, 3) CARDOSO, Adauto Lucio. Visões da natureza no processo de constituição do urbanismo moderno. Cadernos IPPUR/UFRJ, Rio de Janeiro, v. 14, n. 1, p. 119-150, jan./jul. 2000.

± 3 linhas

±5 linhas

±5 linhas

±5 linhas

82a AULA: Vidrarias e Manuseio de Material de Laboratório

(RELATÓRIO) A – ANÁLISE QUALITATIVA E QUANTITATIVA

Nas análises qualitativas o pesquisador procura determinar a qualidade do material a ser analisado, ou seja, a detecção de substâncias específicas. Exemplo: Análise qualitativa de glicose na urina verifica-se ou não a presença de glicose na urina, não importando a quantidade em que ela possa aparecer. Em testes qualitativos pode-se usar vidraria de menor precisão, como por exemplo, pipetas graduadas, béqueres, erlenmeyers, provetas, que dão medidas aproximadas. Por outro lado, as análises quantitativas destinam-se à determinação, com maior precisão possível, da quantidade do material analisado. Nestes casos, interessa ao pesquisador obter a quantidade exata de uma determinada substância (glicose sanguínea), procurando evitar ao máximo, erros e interferências de outros compostos. Os materiais utilizados em análises quantitativas incluem aqueles de grande precisão, como pipetas volumétricas, balões volumétricos, buretas, que apresentam medidas mais exatas e permitem chegar o mais próximo possível dos valores reais. B – MATERIAL DE ROTINA NO LABORATÓRIO O estudante deve conhecer o material que será utilizado no laboratório, saber manipula-lo e ter conhecimento dos cuidados relativos à sua conservação. VIDRARIAS

Balão de fundo chato: Utilizado como recipiente para conter líquidos ou soluções, ou mesmo, fazer reações com desprendimento de gases. Pode ser aquecido sobre o tripé com tela de amianto.

Balão volumétrico: Podem ser de vidro comum ou pirex, com diversas capacidades. Medem um volume exato, a uma determinada temperatura, geralmente 20oC, podendo ser utilizados sem erro apreciável a 20o C ±8oC. Utilizados para o preparo de soluções. Por se tratar de vidraria volumétrica aferida, não o submetem as altas temperaturas.

Béquer: Geralmente de vidro pirex; diversas capacidades. São destinados a conter e não medir volumes e é de uso geral em laboratório. Serve para fazer reações entre soluções, dissolver substâncias sólidas, efetuar reações de precipitação e aquecer líquidos. Pode ser aquecido sobre a tela de amianto.

Bastão (ou baqueta) de vidro é um instrumento feito em vidro alcalino, maciço, utilizado em transportes de líquidos e agitação de soluções. Geralmente usado em conjunto com o béquer.

Erlenmeyer: Geralmente de vidro pirex; diversas capacidades. São destinados a conter volumes. Utilizado em titulações, aquecimento de líquidos e para dissolver substâncias e proceder reações entre soluções.

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Funil: De diversos diâmetros, com ou sem ranhuras. Usados para filtração simples ou na transferência de líquidos para recipiente de boca estreita.

Pipeta de Pasteur: Pipetas simples, não possuem abertura superior, apenas a inferior para entrada de líquido. Possuem na ponta um “balão” que quando pressionado expele o ar para fora. Daí mergulha-se a ponta no líquido e em seguida soltando o balão, trazendo o líquido para a pipeta. Geralmente são feitas de vidro ou plástico (descartáveis). Foi criada pelo médico francês Louis Pasteur em suas pesquisas.

Pipeta graduada: Utilizada para medir pequenos volumes. Mede volumes variáveis. Não pode ser aquecida. Deve ser lavada e enxaguada com água destilada logo após o uso, principalmente quando se medir líquidos viscosos.

Pipeta volumétrica: Usada para medir e transferir volume de líquidos. Não pode ser aquecida por possuir grande precisão de medida. Deve ser lavada e enxaguada com água destilada logo após o uso, principalmente quando se medir líquidos viscosos. Nota: Atualmente são muito utilizadas nos laboratórios as pipetas automáticas, que podem ter volumes variáveis e possibilitam a transferência de quantidades muito pequenas de líquidos, da ordem de microlitros.

Pipeta automática ou micropipeta: Micropipetas são aparelhos designados para a transferência de pequenos volumes (entre 0,2 a 5000 μl) com máxima precisão. A construção das micropipetas consiste em um corpo anatômico de polipropileno (autoclavável) equipado com um botão dispensador e um ejetor de ponteiras no topo, um indicador de volume na lateral e uma haste para encaixe de ponteiras descartáveis na parte inferior. Existem vários tipos de micropipetas:

- pipetas monocanal ou multicanal - pipetas com volume fixo ou com volume variável - pipetas com deslocamento de ar ou com deslocamento positivo

Proveta: Pode ser de vidro comum ou pirex com diversas capacidades. Serve para medir e transferir volumes de líquidos com precisão de até 0,5% (Mais preciso que um béquer ou erlenmeyer, porém menos preciso que a pipeta graduada). Não pode ser aquecida.

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Tubo de ensaio: De vidro pirex comum, de diversos tamanhos. Empregado para fazer reações em pequena escala, principalmente em testes de reação em geral. Pode ser aquecido com movimentos circulares e com cuidado diretamente sob a chama do bico de Bünsen. Quando aquecidos devem ser agitados continuamente para evitar borbulhamento intenso. Existem tubos especiais para centrífugas, utilizados em reações químicas, que formam substâncias insolúveis, e que necessita de uma precipitação rápida por meio de um centrifugador.

Bureta: aparelho utilizado em análises volumétricas para dispensar líquidos com grande exatidão. Pode-se livrar-se de quantidades de volume variáveis, devido às marcas de graduação e extensão.

Almofariz com pistilo: usado na trituração e pulverização de sólidos.

Cadinho: peça geralmente de porcelana cuja utilidade é aquecer substâncias a seco e com grande intensidade, por isto pode ser levado diretamente ao bico de Bünsen.

Cápsula de porcelana: peça de porcelana usada para evaporar líquidos das soluções.

Condensador: utilizado na destilação, tem como finalidade condensar vapores gerados pelo aquecimento de líquidos.

Dessecador: usado para guardar substâncias em atmosfera com baixo índice de umidade.

Vidro de relógio: peça de vidro de forma côncava. É usada em análises e evaporações. Não pode ser aquecida diretamente.

11 OUTROS EQUIPAMENTOS

Anel ou argola: usado como suporte do funil na filtração.

Balança digital: para a medida de massa de sólidos e líquidos não voláteis com grande precisão.

Bico de Bünsen: Possuem uma entrada de gás ajustável que permite regular a composição de mistura de gás com ar. Ao acender o bico de gás, ter o cuidado de não abrir a entrada de gás antes de ter a mão à chama para acendê-lo. É a fonte de aquecimento mais utilizada em laboratório, mas contemporaneamente tem sido substituído pelas mantas, chapas de aquecimento e banho-maria.

Estante para tubo de ensaio: é usada para suporte de os tubos de ensaio.

Garra de condensador: usada para prender o condensador à haste do suporte ou outras peças como balões, erlenmeyers etc.

Pinça de madeira: usada para prender o tubo de ensaio durante o aquecimento.

Pinça metálica: usada para manipular objetos aquecidos.

Pisseta ou frasco lavador: usada para lavagens de materiais ou recipientes através de jatos de água, álcool ou outros solventes.

Suporte universal: utilizado em operações como: filtração, suporte para condensador, bureta, sistemas de destilação etc. Serve também para sustentar peças em geral.

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Tela de amianto: suporte para as peças a serem aquecidas. A função do amianto é distribuir uniformemente o calor recebido pelo bico de Bünsen.

Tripé: sustentáculo para efetuar aquecimentos de soluções em vidrarias diversas de laboratório. É utilizado em conjunto com a tela de amianto.

C – MANIPULAÇÃO DO MATERIAL RECEBIDO Objetivo:

1. Medir soluções em pipetas graduadas, volumétricas e automáticas. 2. Medir volumes em balões volumétrico e provetas.

Materiais:

1. Béquer com água destilada; 2. Ponteiras para pipetas automáticas; 3. Recipiente para descarte de ponteiras; 4. Pipetas graduadas de 0,5, 1,0, 2,0, 5,0, e 10,0 mL; 5. Pipetas volumétricas; 6. Pipetas automáticas 7. Papel absorvente; 8. Pipetador ou pera de sucção; 9. Tubos de ensaios; 10. Estante para tubos de ensaio.

PROCEDIMENTO GERAL PARA USO DE PIPETAS Os cilindros graduados podem ser calibrados para conter (TC) ou para ceder (TD) o líquido. Se for calibrado para ceder, o cilindro na realidade conterá um volume ligeiramente maior do que o lido, para compensar a fina camada de líquido que fica nas paredes quando seu conteúdo é derramado. Portando pipetas com duplo risco ou marcadas TC são de sopro e as que possuem somente a tarja e um risco ou marcadas TD não devem ser sopradas pois isso já se considera na calibração do volume.

É importante, antes do início do trabalho, verificar se as pipetas estão limpas e livres de qualquer avaria. Quando usar uma pipeta (graduada ou volumétrica), coloque um pipetador adequado na parte superior do tubo de sucção. Nunca use a boca para encher as pipetas, e jamais coloque uma pipeta nos lábios, seja qual for o líquido que esteja sendo medido. Pipetagem com pipetas graduadas e volumétricas: 1. Acoplar o pipetador ou pera de sucção na pipeta. 2. Introduzir a pipeta na água destiladas. 3. Antes de medir o volume do líquido, lave a pipeta com uma pequena quantidade do líquido. 4. Encha a pipeta com o líquido, levando-o até 1 a 2 cm acima da marca da graduação. 5. Remover a pipeta da água destilada. 6. Com o auxílio de um papel absorvente, remova todo o líquido que aderiu à parte externa da haste

inferior. 7. Mantenha a pipeta na posição vertical e a marca no nível dos seus olhos.

13 8. Deixe o líquido escorrer lentamente até que a parte inferior do menisco fique na posição correta. 9. Encoste a ponta da pipeta na parte interna do recipiente de trabalho (tubo de ensaio, proveta ou

balão volumétrico) e deixe o líquido escoar. 10. Remova a pipeta e lave-a sob água corrente ou conforme recomendações específicas.

Pipetagem com pipetas automáticas:

1. Ajustar o volume a ser pipetado. 2. Colocar a ponteira indicada para a pipeta. 3. Pressionar o êmbolo da pipeta até a primeira trava e aspirar a amostra dentro da ponteira. 4. Pressionando o botão, ele funcionará como um êmbolo. Pressione até o primeiro estágio para

sugar o líquido e até o segundo para dispensá-lo. 5. Limpar com papel absorvente, tomando o cuidado de não tocar no fluido da ponta. 6. Levar a pipeta até o tudo de ensaio e apertar o êmbolo até o final para descartar o líquido. 7. Dispensar a ponteira utilizada e um recipiente. 8. Proceder à limpeza e à organização da bancada.

Questões: 1) Qual é a importância do conhecimento das vidrarias para o trabalho em laboratório? 2) Existe diferença entre pipetagem com pipeta graduada e volumétrica? 3) Discutir a confiabilidade na medida de cada um dos frascos utilizados.

14 3a AULA: Cálculos Bioquímicos e Preparo de Soluções

(RELATÓRIO) 1) Preparar uma solução de NaCl 0,9% (soro fisiológico) em um volume final de 50 mL. 2) Preparar uma solução de amido 1% em um volume final de 50 mL. Dissolver o amido com

aquecimento. 3) Preparar solução de frutose 1% em um volume final de 50 mL. 4) Preparar solção de maltose ou lactose 1% em um volume final de 50 mL. 5) Preparar solução de NaCl 2% em um volume final de 100 mL. 6) Preparar solução de NaCl 1% a partir de NaCl 2% em um volume final de 50 mL. 7) Preparar solução tampão de fosfato monobásico de sódio 100 mM (0,1 M) em um volume final de

200 mL. 8) Preparar 100 ml de solução tampão fosfato monobásico de sódio 50 mM a partir da concentração de

100 mM, pH 6,9. 9) Preparar solução tampão acetato de sódio 200 mM (0,2 M) pH 5,4 em volume final 100 mL. 10) Preparar NaOH 2 M em um volume final de 200 mL, diluir esta para concentração 1M em um

volume final de 100 mL. 11) Preparar uma solução de NaCl 0,9 %. 12) Preparar uma solução de sacarose 0,2 M. 13) Preparar uma solução de glicina 0,1 M. 14) Preparar uma solução de ácido aspártico 0,1 M. 15) Preparar uma solução de soro glicosado a 10% e 7,5%, 5%. Utilizar solução de glicose hipertônica

de 25% e 50%. 16) Qual o volume de H2SO4 18 mol/L necessário para preparar 500 mL de uma solução a 0,15 mol/L? 17) Dissolve-se 81 g de glicose (C6H12O6) em volume suficiente de água para se obter 500 mL de

solução. Qual é a molaridade da solução assim obtida? (C-12 H-1 O-16) 18) Qual é a massa de HNO3 que devemos dissolver na água para preparar 250 mL de solução 5 mol/L

desse ácido? (H-1 N-14 O-16) 19) Determinar a molaridade de uma solução de NaOH que foi obtida dissolvendo-se 60 g dessa base

em volume suficiente de água para se obter 350 mL de solução. (O-16 H-1 Na-23) 20) Qual é a massa de H2SO4 necessária para preparar 600 mL de solução 1,4 mol/L?(H-1 S-32 O-16) 21) Um laboratorista tem a sua disposição uma solução estoque de NaOH 2 mol/L e deseja preparar

500 mL de solução 1,5 mol/L. Qual é o volume de solução estoque que deverá tomar? 22) Em um recipiente há uma solução de NaCl de concentração 300 g/L. Desse recipiente é retirado

125 mL dessa solução. Qual é a massa de sal contida nessa porção retirada? 23) Em uma proveta é colocado 350 mL de uma solução de AgNO3 de concentração 200 g/L. A seguir

é adicionado 150 mL de água destilada. Qual é a nova concentração da solução assim obtida? 24) Num recipiente encontra-se 5 L de H2SO4de concentração 3,5 mol/L. Ao adicionarmos 2000 mL

de H2O, qual será sua nova molaridade? 25) Adicionou-se 100 mL de H2O a 400 mL de uma solução de salmoura 80 g/L. Qual será a

concentração da solução resultante? 26) Determinar a concentração em porcentagem de uma solução onde se dissolvem 5 g de soluto por

200 mL de solução. 27) Qual é o volume de água que devemos adicionar 600 mL de solução 2 mol/L de HCl para se obter

uma solução 1,5 mol/L desse ácido? 28) Numa solução de volume 400 mL de concentração 3 mol/L, foi adicionado 100 mL de H2O. Qual é

a sua nova molaridade? 29) Uma substância apresenta massa molecular = 500 g. Se 50 g dessa substância foi dissolvida para

200 mL de H2O, qual é a molaridade da solução assim preparada? 30) Como você expressaria em porcentagem uma solução de concentração 40 mg/2 L?

15 I - PREPARO DE SOLUÇÕES A PARTIR DE SUBSTÂNCIAS SÓLIDAS Para preparo de soluções proceda conforme esquema mostrado na figura abaixo. Prepare a solução indicada pela professora em balão volumétrico de 50 mL.

1 - Dissolver o sólido (usar cerca de 10 mL de água destilada). 2 - Transferir para o balão volumétrico. 3 - Lavar o béquer (executar três lavagens com aproximadamente 10 mL de água destilada cada uma) 4 - Lavar o funil e retirá-lo. 5 - Completar o volume do com água destilada até próximo o traço de referência do balão (utilize uma

pipeta Pasteur para acertar o menisco). 6 - Homogeneizar a solução.

16 4a AULA: pH e Solução Tampão

(RELATÓRIO)

1° Prática: Determinação colorimétrica de pH

Fundamentação: O método colorimétrico baseia-se no conhecimento dos pKs dos indicadores, os quais podem ser considerados como ácidos ou bases fracas. A dissociação de um indicador ácido em forma simplificada é a seguinte: A adição de ácido à solução de indicador aumenta a concentração de H+, reprime a dissociação do indicador e há predominância da cor ácida (cor A). A adição da base diminui a concentração de H+, a equação se desloca para a direita, produzindo mais indicador In- e predominância da cor básica (cor B). A cor do indicador é, portanto, uma função do pH da solução. Matematicamente, o pH é definido como o valor negativo do logaritmo (log) da concentração do íon hidrogênio:

sendo o intervalo mais eficiente de ação de um indicador, em torno de seu pK. Para determinar o pH de uma solução, adiciona-se algumas gotas de solução de um dos indicadores mencionados e compara-se a cor desenvolvida com a cor de uma série de tampões de pH conhecidos e contendo a mesma quantidade de indicador. Objetivo: -Conhecer a utilidade dos indicadores de pH; -Observar o efeito tampão de uma solução; -Determinar o pH. Procedimento: a) Colocar em tubos de ensaio identificados, 2 mL de substância a ser analisada (água de torneira,

água de sabão, vinagre, suco de limão e outras) b) Adicionar 2 gotas de cada indicador. Anotar a cor e verificar o pH c) Repetir as operações tantas vezes, quantas forem os indicadores a serem utilizados. Tabela: Indicadores com cor e zona de pH

1) Fenolftaleína 8,0 incolor- 10,0 vermelho 2) Metil orange 3,1 vermelho- 4,4 amarelo 3) Vermelho de metila 4,2 vermelho- 6,3 amarelo 4) Azul de bromofenol 3,1 amarelo- 4,7 azul 5) Azul de bromotimol 6,1 amarelo- 7,7 azul 6) Púrpura de bromocresol 5,4 amarelo- 7,0 púrpura 7) Verde de bromocresol 3,8 amarelo- 5,4 azul 8) Vermelho de clorofenol 5,1 amarelo- 6,7 vermelho

2a Prática: Uso de indicador universal Fundamentação: Indicadores universais são misturas de vários indicadores, a fim de abranger um intervalo mais amplo de pH. Este indicador abrange a faixa de pH 3,0 até 11,0 que são os seguintes: pH 3,0 ou < 3,0 = vermelho; pH 4,0 = alaranjado forte; pH 5,0 = laranja; pH 6,0 = amarelo; pH 7,0 = verde amarelado; pH 8,0 = verde azulado, pH 9,0 = azul; pH 10,0 = violeta; pH 11 ou > 11,0 = púrpura.

HIn In- + H+ ácido (cor A) base (cor B)

pH = pKIn + log. In-/HIn

17 Preparo do indicador universal: metil orange 0,05 g, vermelho de metila 0,15 g, azul de bromotimol 0,30 g fenolftaleína 0,35 g e álcool etílico a 65% 1 litro. Bateria de escala padrão de pH com uso do indicador universal

Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 tampão pH 3 (mL) 0,5 tampão pH 4 (mL) 0,5 tampão pH 5 (mL) 0,5 tampão pH 6 (mL) 0,5 tampão pH 7 (mL) 0,5 tampão pH 8 (mL) 0,5 tampão pH 9 (mL) 0,5 tampão pH 10 (mL) 0,5 água destilada (mL) 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 indicador universal (gotas) 3 3 3 3 3 3 3 3

Agitar bem os tubos e anotar as cores desenvolvidas. Esta bateria irá constituir a escala padrão de pH, para comparação. Prática: a) Adicionar cerca de 2 mL de cada substância a ser analisada (água de torneira, suco de limão,

refrigerante, vinagre, etc.) em tubos diferentes e identificados. b) Adicionar 5 gotas de indicador universal e agitar. c) Anotar a cor e verificar o pH com a bateria de escala padrão de pH.

3a Prática: Determinação potenciométrica do pH Fundamentação: Este é o método mais preciso para a determinação do pH. Usa-se, geralmente, o aparelho chamado potenciômetro que consiste de um eletrodo de vidro, um eletrodo de calomelano e um sistema para medida de voltagem. O potencial é dado pelo eletrodo de calomelano mercuroso em contato com solução saturada de KCl. O eletrodo de vidro compõe-se de um bulbo de vidro especial contendo HCl 0,1 N mais um fio de platina revestido de AgCl. Quando o eletrodo de vidro é imerso em uma solução de concentração hidrogeniônica desconhecida, cria-se um potencial entre as soluções interna e externa. Como a voltagem do eletrodo de calomelano é constante, a diferença de potencial entre os dois eletrodos é diretamente relacionada com a concentração de íons hidrogênio da solução desconhecida.

a) Determinem no potenciômetro os pHs do leite, suco de limão, suco de laranja, refrigerante, vinho, cerveja, água de torneira, água destilada, etc.

Abertura lateral para enchimento c/ tampa

Junção

Haste de prata recoberta com cloreto de prata (Ag/AgCl)

Eletrólito: HCl 0,1 M

Eletrodo de referência: calomelano mercuroso em solução saturada de KCl

Elemento sensor de pH

18 5a AULA: Verificação do Efeito da Solução-Tampão

(RELATÓRIO)

Procedimento: a) Utilizar à mesma bateria de escala padrão de pH. b) Preparar outra bateria de 4 tubos de ensaio e numerá-los de 1 a 4.

Tubos 1 2 3 4 Indicador universal (gotas) 3 3 3 3 Água destilada (mL) 5 4,5 5 4,5 Solução tampão pH 7,0 (mL) - 0,5 - 0,5 Anotar pH NaOH 0,1M (gotas) 1 1 - - Anotar pH - - Soprar o ar expirado com uma pipeta dentro da solução (segundos) 15 60 - - Anotar pH - - HCl 0,1 M (gotas) - - 2 2 Anotar pH - -

c) Continuar a adição de HCl ao tubo 4, gota a gota. Determinar quantas gotas de HCl devem ser adicionadas até que se obtenha a mesma coloração do tubo 3.

1. Analise os resultados de cada etapa do trabalho, faça um breve comentário e conclusão. 2. Discuta o possível efeito da solução tampão depois da adição de cada substância, com base nos

resultados obtidos. 3. Qual a função das soluções-tampão na prática? 4. Ao consideramos a necessidade de manutenção do pH sanguíneo pelo organismo, qual a

importância dos conhecimentos adquiridos nesta atividade prática?

19 6a AULA: Titulação Potenciométrica de Aminoácidos

(RELATÓRIO)

Objetivo: Estudar o fenômeno de dissociação por técnica potenciométrica Fundamentação teórica: Um aminoácido neutro apresenta dois grupos ionizáveis, o –NH2 e o –COOH. Em solução eles se apresentam dissociados, formando o íon dipolar.

A sua titulação ácido-base pode ser compreendida nos seguintes termos: A forma dipolar de um aminoácido neutro tem carga total nula. O pH no qual existe esta forma

é conhecido como pH isoelétrico (pHi) ou ponto isoelétrico (pI). O pI é a média aritmética dos 2 pKs, um anterior e outra posterior a forma isoelétrica. A forma dissociada de um aminoácido ácido, por exemplo, o ácido aspártico é a seguinte: Pela adição de ácido ou base ele vai adquirir as seguintes formas iônicas:

Portanto levarmos um mol de ácido aspártico do meio ácido para o alcalino necessitamos de 3 equivalentes químicos de base.

A forma dissociada de um aminoácido básico, por exemplo, a lisina é a seguinte:

Pela adição de ácido ou base ele vai adquirir as seguintes formas iônicas: Para levarmos um mol de lisina do meio ácido para o alcalino necessitamos de 3 equivalentes

químicos de base.

C

H

R COOH

NH3(+1)

C

H

R COO-

NH3(0)

C

H

R COO-

NH2(-1)

+H+

pK1

+OH-

pK2

C

H

NH3

R COO-

C

COO-

H3N H

CH2

COO-

C

COO-

H3N H

(CH2)4

NH3

C

COOH

H3N H

(CH2)4

NH3

OH-

H+

OH-

H+

OH-

H+C

COO-

H3N H

(CH2)4

NH3

C

COO-

H2N H

(CH2)4

NH3

C

COO-

H2N H

(CH2)4

NH2

(+2) (+1) (0) (-1)

C

COO-

H3N H

CH2

COOH

C

COOH

H3N H

CH2

COOH

OH-

H+C

COO-

H3N H

CH2

COO-

OH-

H+

OH-

H+C

COO-

H2N H

CH2

COO-

(+1) (0) (-1) (-2)

20 1. Titulação potenciométrica de um aminoácido neutro (Glicina 0,1 M) Procedimento: a) Pipetar 10 mL da solução de glicina 0,1 M (c/ HCl 0,1 M) em um copo de Becker. b) Retirar o eletrodo da solução e lavá-lo com água destilada, secar suavemente com papel

absorvente. c) Mergulhar o eletrodo num béquer c/ solução tampão de pH conhecido (pH 7,0) e em seguida com

(pH 4,0) e ajustar o aparelho ao pH dos tampões. d) Retirar o tampão, lavar o eletrodo com água destilada, secar com papel absorvente. e) Mergulhar o eletrodo de vidro na solução de glicina com cuidado, adicionar água destilada até

cobrir totalmente o bulbo do eletrodo (em torno de 10 mL). f) Misturar e proceder à primeira leitura do pH e anotar. g) Titular com NaOH 0,1 M, anotando os valores de pH para cada mL de soda adicionados. 2. Titulação potenciométrica de um aminoácido ácido (ácido aspártico ou ácido glutâmico 0,1 M

em HCl 0,1 M) a) Pipetar 10 mL de ácido aspártico ou glutâmico 0,1 M em um béquer. b) Repetir os itens de “b” e “f” da experiência anterior (01). c) E titular com NaOH 1 M anotar cada do os valores de pH para mL de soda adicionados.

3. Titulação potenciométrica de um aminoácido básico (lisina ou arginina 0,1 M em HCl 0,1 M) a) Pipetar 10 mL de ácido aspártico ou glutâmico 0,1 M em um béquer. b) Repetir os itens de “b” e “c” da experiência anterior (02).

Resultados: 1) Construir o gráfico da curva de titulação de cada aminoácido, tendo nas ordenadas (Y) pH e

nas abscissas (X) mL de NaOH adicionados. 2) Determinar os valores de pKs e ponto isoelétrico (pI), graficamente e comparar com os valores

encontrados nas bibliografias. 3) Apresentar as formas iônicas predominantes nestes pontos.

Tabela das propriedades e convenções associadas com os aminoácidos encontrados nas proteínas

Aminoácido Abreviação/ símbolo

Mr

Valores de pKa pI Índice de

Hidropatica1 Ocorrência

nas proteínas (%)2 pK1 (CO2H) pK2 (NH3+)

pKr

(grupo R) Grupos R alifáticos, não polares Glicina Gly G 75 2,34 9,60 5,97 -0,4 7,2 Alanina Ala A 89 2,34 9,69 6,01 1,8 7,8 Prolina Pro P 115 1,99 10,96 6,48 1,6 5,2 Valina Val V 117 2,32 9,62 5,97 4,2 6,6 Leucina Leu L 131 2,36 9,60 5,98 3,8 9,1 Isoleucina Ile I 131 2,36 9,68 6,02 4,5 5,3 Metionina Met M 149 2,28 9,21 5,74 1,9 2,3 Grupos R aromáticos Fenilalanina Phe F 165 1,83 9,13 5,48 2,8 3,9 Tirosina Tyr Y 181 2,20 9,11 10,07 5,66 -1,3 3,2 Triptofano Trp W 204 2,38 9,39 5,89 -0,9 1,4 Grupos R não carregados polares Serina Ser S 105 2,21 9,15 5,68 -0,8 6,8 Treonina Thr T 119 2,11 9,62 5,87 -0,7 5,9 Cisteína Cys C 121 1,96 10,28 8,18 5,07 2,5 1,9 Asparagina Asn N 132 2,02 8,80 5,41 -3,5 4,3 Glutamina Gln Q 146 2,17 9,13 5,65 -3,5 4,2 Grupos R carregados positivamente Lisina Lys K 146 2,18 8,95 10,53 9,74 -3,9 5,9 Histidina His H 155 1,82 9,17 6,00 7,59 -3,2 2,3 Arginina Arg R 174 2,17 9,04 12,48 10,76 -4,5 5,1 Grupos R carregados negativamente Aspartato Asp D 133 1,88 9,60 3,65 2,77 -3,5 5,3 Glutamato Glu E 147 2,19 9,67 4,25 3,22 -3,5 6,3

1 Umas escala combinada hidrofobicidade e hidrofilia grupos R; ela pode ser usada para medir a tendência de um aminoácido para procurar um ambiente aquoso (valores -) ou uma ambiente hidrofóbico (valores +).

2 Ocorrência média em mais de 1.150 proteínas.

21 7a AULA: Determinação do Ponto Isoelétrico da Caseína

Fundamento: Adiciona-se solução de caseína em um tubo contendo meios de pH decrescentes (de 5,9 a 3,5) e observa-se a turvação. O pH do meio em que ocorre máxima turvação representa o pI da proteína. Soluções:

1. Solução de caseína em solução 0,1 M de acetato de sódio: colocar em um frasco volumétrico de 50 mL 0,25 g de caseína pura, 20 mL de água destilada e exatamente 5 mL de solução de NaOH 1 M. Agitar até a dissolução completa da caseína, e, então adicionar exatamente 5 mL de ácido acético 1M. Completar o volume com água destilada.

2. Solução de ácido acético 1M. 3. Solução de ácido acético 0,1M. 4. Solução de ácido acético 0,01M.

Técnica: Numerar nove tubos de ensaio e transferir para os mesmos os volumes das soluções indicadas na tabela. Misturar a cada um dos tubos 1 mL da solução de caseína e agitar imediatamente.

Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 H2O destilada (mL) 8,38 7,75 8,75 8,50 8,00 7,00 5,00 1,00 7,4 Ácido Acético 0,01 M (mL) 0,62 1,25 - - - - - - - Ácido Acético 0,1 M (mL) - - 0,25 0,50 1,00 2,00 4,00 8,00 - Ácido Acético 1 M (mL) - - - - - - - - 1,6 pH 5,9 5,6 5,3 5,0 4,7 4,4 4,1 3,8 3,5 Turvação imediata Turvação após 30 min.

Verificar o grau de turvação eventualmente presente, logo após a mistura e 30 min. Depois. Inscrever os resultados na tabela por meio de sinais (+; ±; -). Observar em qual tubo ocorre precipitação máxima que corresponderá ao ponto isoelétrico da caseína.

22 8a AULA: Reações Qualitativas para Identificação de Aminoácidos

(RELATÓRIO) Objetivo: Identificar e caracterizar diferentes aminoácidos através de reações específicas. 1. Reação de Ninidrina

Fundamento teórico: A ninidrina é um agente oxidante que reage com grupos amino livres de aminoácidos, peptídeos e proteínas desde que o pH da solução esteja entre 4 e 8, dando origem a púrpura de Ruhemann, de cor arroxeada (a intensidade da cor é proporcional a concentração de aa livres). A reação também ocorre com aminas primárias e amônia, porém sem liberação de CO2.

Os aminoácidos (prolina e hidroxiprolina) também reagem com a ninidrina, porém neste caso,

por possuírem o grupo α-amino substituído obtém-se um produto de cor amarela.

Reativos: ninidrina 1% (é tóxica) ou ninidrina a 0,2% em tampão fosfato 7,0, solução de proteína (albumina, leite, clara de ovo), solução de aminoácidos 0,05 M (glicina, prolina, hidroxiprolina, etc.). Técnica.

Tubos Amostra/Concentração Volume (mL) Solução de ninidrina (0,2%) 1 Água destilada 1,0 1,0 mL 2 Glicina 0,05 M 1,0 1,0 mL 3 Prolina 0,05 M 1,0 1,0 mL 4 Hidroxiprolina 0,05 M 1,0 1,0 mL 5 Solução de proteína 1,0 1,0 mL

Aquecê-los em banho-maria 100 ºC por 3 minutos. Compare os resultados com o tubo 1. Anote os resultados e explique-os. Questões: 1) Em que se fundamenta a reação da ninidrina e que classes de substâncias reagem positivamente? 2. Reação Xantoprotéica

Fundamento teórico: As proteínas que possuem grupamentos fenil reagem com HNO3, formando nitro-derivado fortemente coloridos em meio alcalino. Os aminoácidos como a tirosina e triptofano dão teste positivo com o aparecimento de cor amarelo-alaranjado, o anel simples de benzeno da não tem capacidade de positivar a reação.

O

O

N C CO2H

R

H

O

O

OH

OH

O

O

O

O

O

H

N=CHR

O

O

N=

O

O

H

NH2

H2O RCHCO2H

NH2

ninidrina

O

O

CO2 H2O-+ R C

O

H

O

O

H

NH2

O

O

O+

azulpúrpura de Ruhermann

H2O

23 Reativos: HNO3 concentrado, NaOH 20%, solução de proteína (albumina, leite, clara de ovo), solução de aminoácidos 0,05 M (tirosina, triptofano, fenilalanina e glicina). Técnica.

Tubos Amostra/Concentração Volume (mL) HNO3 concentrado 1 Água destilada 1,0 1,0 mL 2 Glicina 0,05 M 1,0 1,0 mL 3 Tirosina 0,05 M 1,0 1,0 mL 4 Triptofano 0,05 M 1,0 1,0 mL 5 Fenilalanina 0,05 M 1,0 1,0 mL 6 Solução de proteína 1,0 1,0 mL

Ferver todos os tubos e acrescentar 3 mL de NaOH 20%. Anote os resultados e explique-os.

3. Reação de Millon

Fundamento teórico: Reação devido a presença do grupamento hidroxifenil (C6H5-OH) nas moléculas de proteínas e peptídeos. Reação positiva para tirosina com o aparecimento de cor avermelhada com ou sem precipitado. As proteínas são precipitadas pelos ácidos minerais fortes (HNO3) e pelo mercúrio, os quais com aquecimento apresentam uma coloração avermelhada. Com solução de aminoácidos, sob as mesmas condições produz somente uma coloração avermelhada. Reativo: Reativo de Millon (Hg + HNO3), solução de proteína (albumina, leite, clara de ovo), solução de aminoácidos 0,05 M (glicina tirosina e triptofano). Técnica.

Tubos Amostra/Concentração Volume (mL) Reativo de Millon 1 Água destilada 1,0 1,0 mL 2 Glicina 0,05 M 1,0 1,0 mL 3 Tirosina 0,05 M 1,0 1,0 mL 4 Triptofano 0,05 M 1,0 1,0 mL 5 Solução de proteína 1,0 1,0 mL

Aquecê-los em banho-maria 100ºC por 3 minutos. Compare os resultados com o tubo 1. Anote os resultados e explique-os.

C

COO-

HH3N

CH2

OH

C

COO-

HH3N

CH2

fenilalanina

tirosina

C

COO-

HH3N

C CH

NH

triptofano

24 4. Reação para Aminoácidos Sulfurados Fundamento teórico: O enxofre que nas proteínas se apresenta na forma de grupos sulfidrilas ou dissulfetos (cisteína e cistina), em meio alcalino e a quente liberam o enxofre que aparece na forma de sulfeto de sódio (Na2S). Este reage com acetato de chumbo (CH3COO)2Pb, formando o sulfeto de chumbo (PbS).

O enxofre da metionina não é lábil em meio alcalino. Um precipitado fino castanho ou preto, de

sulfeto de chumbo, indicará a presença de cisteína ou cistina. Reativos: NaOH 2,0 M, acetato de chumbo, solução de proteína (clara de ovo, leite, albumina), solução de aminoácidos 0,05 M (cistina, cisteína, 5 fios de cabelo, glicina e metionina). Técnica:

Tubos Amostra/Concentração Volume Reativo de

NaOH 2,0 M

Aquecer em banho-

maria 100ºC

Acetato de chumbo (CH3COO)2Pb

1 Água destilada 1,0 mL 1,0 mL 1 minuto 5 gotas ou 0,5 mL 2 Glicina 0,05 M 1,0 mL 1,0 mL 1 minuto 5 gotas ou 0,5 mL 3 Cisteína 0,05 M 1,0 mL 1,0 mL 1 minuto 5 gotas ou 0,5 mL 4 Cistina 0,05 M 1,0 mL 1,0 mL 1 minuto 5 gotas ou 0,5 mL 5 Metionina 0,05 M 1,0 mL 1,0 mL 1 minuto 5 gotas ou 0,5 mL 6 Fios de cabelo 5 fios 1,0 mL 1 minuto 5 gotas ou 0,5 mL 7 Solução de proteína 1,0 mL 1,0 mL 1 minuto 5 gotas ou 0,5 mL

Anote os resultados obtidos e explique-os. Cite os aminoácidos que contém enxofre, com suas respectivas fórmulas estruturais.

cisteína

cisteína

2H+ + 2e-

2H+ + 2e-

C

COO-

HH3N

CH2

S

C

COO-

H NH3

CH2

S

cistina

C

COO-

HH3N

CH2

SH

C

COO-

H NH3

CH2

SH

C

COO-

HH3N

CH2

S

CH3

metionina

C

COOH

HH2N

R

S

R

NaOH

Aminoácido com enxofre

Hidróxidode sódio

Na2S C

COOH

HH2N

R

Sulfeto de sódio

Aminoácido sem enxofre

(1)

Na2S

Sulfeto de sódio

(CH3COO)2Pb

Acetato de chumbo

PbSSulfeto

de chumbo

2CH3COONa

Acetato de sódio(2)

25 9a AULA: Reações de Caracterização e Precipitação de Proteínas

(RELATÓRIO) Objetivo: No final desta aula o aluno(a) estará familiarizado com as propriedades físico-químicas das proteínas, bem como com as técnicas de reações de identificação das mesmas. 1. Reação de Biureto: Fundamento teórico: O sulfato de cobre em meio alcalino reage com as substâncias que contêm duas ou mais ligações peptídicas dando um complexo de coloração característica (púrpura). O íon fornecido por uma solução diluída e alcalina de CuSO4 se complexa com os grupos (-NH) das ligações peptídicas. A intensidade da cor obtida é proporcional ao número de ligações peptídicas. Técnica:

Tubos Amostra/Concentração Volume (mL) Reativo de Biureto 1 Água destilada 1,0 1,0 mL 2 Glicina 0,05 M 1,0 1,0 mL 3 Solução de proteína (clara de ovo diluída) 1,0 1,0 mL

Agitar bem os tubos e observe os resultados obtidos e explique-os. 2. Reações de precipitação de proteínas

Objetivo: Verificar a influência dos sais, ácidos e solventes orgânicos sobre soluções de proteínas. 2.1 Reações de precipitação com desnaturação: Fundamento teórico: A exposição das moléculas proteicas a agentes como calor, extremos de pH, metais pesados, ácidos, detergentes, soluções concentradas de ureia, solventes orgânicos, radiações ultravioleta, etc., faz com que a maioria delas apresente modificações físicas conhecidas como desnaturação. O calor pode desnaturar a maioria das proteínas. Os ácidos como ácido pícrico, ácido tânico, ácido fosfotúngstico, ácido sulfossalicílico, podem precipitar as proteínas que possuem cargas positivas formando complexos insolúveis. Solventes orgânicos como o etanol, éter etílico e acetona abaixam a constante dielétrica das soluções aquosas de proteínas, diminuem também sua capacidade de solvatação, causando perda de solubilidade, as proteínas sofrem um ação desidratante. Em pH situado no lado alcalino do seu ponto isoelétrico, algumas proteínas combinam-se com cátions de metais pesados, como acetato de chumbo e nitrato de prata formando derivados proteicos insolúveis. Material e Reagentes:

• Solução de proteína (clara de ovo) sem diluir para item 1 e diluída 10x com salina (NaCl 0,9%) para itens 2, 3, 4 e 5

• Ácido tricloroacético a 10% • Acetato de chumbo a 5% ou nitrato de prata 0,1 M • Álcool etílico absoluto • Ácido pícrico

Cu++

HN

CO

R_CH

O=C

NH

R_CH

R

R

C O

R

NH

HC_R

C=O

NH

HC_R

R

H2O

H2O

26 Técnica:

Tubos

Amostra/Volume Procedimento/reagente Resultado

1 Proteína (clara de ovo in natura) – 2 mL

Aquecer em banho-maria100 ºC. Observar e concluir.

2 Solução de proteína diluída – 1 mL 1 mL de ácido tricloroacético Observar e concluir.

3 Solução de proteína diluída – 1 mL 1 mL de acetato de chumbo Observar e concluir.

4 Solução de proteína diluída – 1 mL 3 mL ou mais de álcool etílico (etanol)

Observar e concluir.

5 Solução de proteína diluída – 1 mL 1 mL de ácido pícrico Observar e concluir.

2.2 Reações de precipitação sem desnaturação:

Fundamento teórico: as proteínas podem ser precipitadas sem sofrer desnaturação em função do pH, força iônica, temperatura e propriedades dielétricas. Estas variáveis podem então ser usadas para separar proteínas em mistura, uma vez que cada proteína tem uma composição característica (quali e quantitativa) de aminoácidos que determina seu comportamento como um poli-eletrólito. A capacidade dos sais neutros de influenciar a solubilidade das proteínas é uma função de sua força iônica (precipitação por alteração de força iônica), depende tanto da sua concentração como da valência de cátions e ânions que formam o sal (números de cargas elétricas do sal).

Salting in ou solubilização por salificação: É a solubilização das proteínas pela adição de um

sal neutro de força iônica baixa. Em concentrações reduzidas, os sais aumentam a solubilidade de muitas proteínas. Os sais de íons divalentes, tais como MgCl2 e o (NH4)2SO4, são mais eficientes na solubilização por salificação do que os sais de íons monovalentes como NaCl e KCl. Os efeitos da salificação na solubilidade são ocasionados por alterações na tendência à ionização dos grupos R (cadeias laterais dos aminoácidos) dissociáveis da proteína.

Salting out ou precipitação por salificação: É a precipitação reversível das proteínas pela

adição de sal de força iônica elevada [MgCl2 e (NH4)2SO4]. Um dos fatores que promovem esse efeito é que a concentração elevada de sais pode remover a água de hidratação das moléculas proteicas, reduzindo, dessa maneira sua solubilidade, porém outros fatores podem estar envolvidos. Os precipitados proteicos resultantes da precipitação por salificação mantêm sua conformação nativa e podem ser dissolvidos novamente, em geral sem haver desnaturação. Consequentemente, a função da proteína pode ser recuperada após o término do processo e remoção do sal. O sal mais utilizado nessa técnica é o sulfato de amônio que, devido à sua alta solubilidade, permite a precipitação em soluções de elevada força iônica.

Qualquer que seja sua base física “salting in” e “salting out” são processos para a separação de misturas proteicas, uma vez que as diferentes concentrações de sais neutros. Material e Reativos:

• clara de ovo “in natura”. • cloreto de sódio 1 M • solução saturada de sulfato de amônio • pipetas tubos de ensaio, suporte para tubos, béquer, etc.

27 Técnica: a) Pipetar 3 mL de clara de ovo in natura em um pequeno béquer. Diluir com água destilada,

mexendo com um bastão de vidro, até notar o aparecimento do precipitado de globulinas. Juntar em seguida, uma solução de cloreto de sódio 1 M, gota a gota, até a redissolução do precipitado anterior de proteína não desnaturada. Esta redissolução se deve à restauração da força iônica original e corresponde ao fenômeno da “salting in”.

b) Da solução da clara de ovo na experiência anterior de “salting in”, pipetar 2 mL em um tubo de ensaio. Juntar a seguir 2 mL de solução saturada de sulfato de amônio e observar a formação de precipitado protéico, o que corresponde ao fenômeno de “salting out”. Pipetar a seguir 4 a 6 mL de água destilada a fim de recompor a força iônica anterior e como consequência, redissolver o precipitado. Questões: 1) Em que se fundamenta a reação de biureto e que grupos nas proteínas são responsáveis por esta

reação? 2) Qual a importância do biureto? 3) Fale sobre a solubilidade das proteínas. 4) O que determina a estrutura terciária das proteínas e de que forma os agentes desnaturantes

interferem com as mesmas? 5) Quais as formas iônicas que os aminoácidos podem assumir em solução (baseando-se no pH

das mesmas)? 6) Qual é a importância das reações de precipitação de proteínas por sais de metais pesados?

Explique o mecanismo da precipitação. 7) Explique os mecanismos que levam uma proteína a dissolver-se em um pequeno aumento da

força iônica da solução e os mecanismos que levam uma proteína a precipitar por um grande aumento da força iônica da solução.

28 10a AULA: Caracterização da Enzima Urease de Soja

(RELATÓRIO) Fundamento teórico: A urease é uma enzima que catalisa a hidrólise da ureia em amônia e dióxido de carbono. Reações:

Em meio aquoso: 2NH3 + 2H2O 2NH4OH

hidróxido de amônio

CO2 + H2O H2CO3 ácido carbônico

H2CO3 + 2NH4OH (NH4) 2CO3 + 2H2O

carbonato de amônio

A atividade da enzima pode ser verificada pela formação de carbonato de amônio, que é um sal de reação básica e cuja presença pode ser revelada por meio de um indicador ácido básico como o vermelho de fenol (VF), por exemplo (VF em meio básico = rosa; VF em meio ácido ou neutro = amarelo).

A urease existe em algumas bactérias e plantas e pode ser extraída com facilidade de soja. Objetivo: observar a atividade da enzima urease e a ação dos agentes desnaturantes sobre a enzima. Extração: pesar cerca de 15 g de farinha de soja e dissolver em 100 mL de água destilada. Deixar agitando durante 30 minutos. Filtrar com algodão. Desprezar o resíduo. O filtrado contém a urease. Conservar em baixa temperatura. Reativos:

Solução de urease, reativo de biureto; solução de ureia 1% em tampão fosfato 0,01 M; solução de tioureia em tampão fosfato 0,01 M; solução vermelho de fenol; solução de cloreto de mercúrio 5%; ácido nítrico concentrada.

Procedimento: 1) Reação do Biureto: Substâncias que contém duas ou mais ligações peptídicas dão reação de

Biureto positiva. O íon cúprico fornecido pela solução de CuSO4 se complexa com os grupos (-NH) das ligações peptídicas desenvolvendo coloração violeta. Teste: Tubo 1: 2 mL de água dest. + 10 gotas da solução de urease + 2 mL do reativo biureto.

Tubo 2: 2 mL de água destilada + 2 mL do reativo biureto. Agitar os tubos e comparar a cor nos dois tubos e concluir o resultado.

2) Reação de Heller: Esta reação baseia-se na precipitação de proteínas por ácido forte.

Teste: Tubo 3: Colocar 5 gotas de solução de urease e 2 mL de água destilada. Agitar. Manter o tubo inclinado e juntar pela parede 1 mL de ácido nítrico concentrado, sem agitar e de modo que se formem duas fases. Observar se houve formação de anel branco na interfase e concluir o resultado.

H2N

C

H2N

O + H2O CO2 + 2NH3 Uréase

UréiaDióxido decarbono

Amônia

Ureia

Urease

29 3) Teste de atividade da enzima: Neste teste utiliza-se o indicador vermelho de fenol que, passa de

cor amarela em meio ácido ou neutro, para cor vermelha em meio básico. Teste: Tubo 4: Colocar 3 mL de solução de ureia + 5 gotas de solução de urease.

Tubo 5: Colocar 3 mL de água destilada + 5 gotas de solução de urease. A ambos os tubos adicionar uma gota de solução vermelho de fenol. Agitar e colocar em banho-maria a 37 °C. Observar se há mudança de cor nos próximos 5 minutos. Concluir o resultado.

4) Desnaturação da enzima pelo calor:

Teste: Tubo 6: Colocar 2 mL de água destilada + 5 gotas de solução de urease. Agitar e colocar em banho-maria a 100 °C por 2 minutos. Em seguida adicionar 3 mL de solução de ureia e 1 gota da solução de vermelho de fenol. Misturar e aguardar 5 minutos em banho-maria a 37 °C. Observar se houve modificação de cor em relação aos tubos do Teste 3.

5) Inibição de enzima por meio de mercúrio:

Teste: Tubo7: Colocar 2 mL de água destilada + 5 gotas da solução de urease. Agitar e juntar 5 gotas de cloreto de mercúrio 5%. Agitar e adicionar 3 mL de solução de ureia + 2 gotas da solução de vermelho de fenol. Misturar e aguardar 5 minutos em banho-maria a 37 °C. Observar se houve mudança de cor em relação aos tubos do Teste 3.

6) Especificidade da enzima:

Teste: Tubo 8: Colocar 3 mL de sol. de ureia + 5 gotas de solução de urease. Tubo 9: Colocar 3 mL de tioureia + 5 gotas de solução de urease. A ambos os tubos adicionar 1 gota de solução vermelho de fenol. Agitar e manter em banho-maria a 37 °C. Observar se há mudança de cor nos próximos 5 minutos. Concluir o resultado. A tioureia é um composto com a seguinte estrutura.

Questões:

1) Qual é a reação catalisada pela urease? 2) Qual é a fonte de urease utilizada nos experimentos? 3) Como pode ser evidenciada a natureza proteica da enzima? 4) Explique o uso do indicador ácido-base vermelho de fenol no teste de atividade da enzima. 5) Explique o resultado obtido quando a enzima foi previamente fervida. 6) Explique os resultados obtidos no teste de sais de mercúrio e especificidade da enzima.

H2N

C

H2N

O

Uréia

H2N

C

H2N

S

Tiouréia

Ureia Tiureia

30 11a AULA: Cinética Enzimática da Invertase I

Invertase é uma enzima que catalisa a hidrólise da molécula da sacarose. A sacarose é um dissacarídeo formado por α-D-glicose e β-D-frutose, ligados por ligação glicosídica do tipo α1β2. Como ambas unidades de hexoses estão unidas pelo grupo redutor respectivo, a sacarose é um dissacarídeo não redutor. A ação da invertase sobre a sacarose ocasiona a hidrólise do substrato, liberando como produtos da reação a D-glicose e a D-frutose que são redutoras. Os açúcares redutores reduzem o reagente 3,5-dinitrosalicilato (DNS), produzindo uma coloração alaranjada que será tanto mais intensa, quanto maior for à concentração do açúcar redutor presente no meio de reação. A cor é lida em espectrofotômetro em 540 nm.

Isolamento da enzima invertase de levedura:

Pesar 50 g de levedura seca e suspender em 250 mL de bicarbonato de sódio 0,15 M e deixar em banho-maria a 37 ºC durante 24 horas com agitação ocasional. Centrifugar por 20 minutos a 3500 rpm. Desprezar o sedimento, coletando-se o sobrenadante que se apresenta de cor amarelo-avermelhada, o qual contém a enzima invertase na forma ativa, além das enzimas da via fermentativa. Conservando em geladeira a 4 ºC apresenta atividade enzimática por alguns meses. Para realizar os ensaios de cinética enzimática diluir o sobrenadante (1:100). 1) INFLUÊNCIA DO TEMPO NA AÇÃO DA INVERTASE Reativos: Invertase (0,1 mg/mL) Tampão acetato 0,05 M; pH 4,7 Sacarose 0,02 M Reativo 3,5 dinitrosalicilato Atenção: A enzima é sempre a última a ser adicionada. Fazer um gráfico em papel milimetrado: Tempo em minuto (abscissa X) X Absorbância (ordenada Y) e Interpretar os resultados.

Reativos/Tubos Branco 1 2 3 4 5 Tampão acetato 0,05 M pH 4,7 (mL)

- 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

Sacarose 0,02 M (mL) - 0,125 0,125 0,125 0,125 0,125 Invertase (mL) - 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 Tempo (min.) - 0 5,0 10 20 30 3,5 dinitrosalicilato (mL)

0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25

Incubação: 100 ºC durante 5 minutos

Água destilada (mL) 2,5 2,1 2,1 2,1 2,1 2,1 Leitura a 540 nm (Absorbância)

-

D-frutoseD-glicose

H

OH

H

OHH

OHH

OH

CH2OH

HO

14pH 4,7 25 oC

Invertase

OH

OH

H OHCH2OH

HO

H

HOH2C

52

Sacarose

H

OH

H

H

OHH

OH

CH2OH

HO

14

O52 OH

H OHCH2OH

HO

H

HOH2C

31 4) INFLUÊNCIA DE CONCENTRAÇÃO DA ENZIMA

Atenção: A enzima é sempre a última a ser adicionada.

Reativos/Tubos Branco 1 2 3 4 5 6

Tampão acetato 0,05 M pH 4,7 (mL)

- 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25

Sacarose 0,02 M (mL) - 0,12 0,12 0,12 0,12 0,12 0,12

Água destilada (mL) 0,62 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 -

Invertase (mL) - - 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25

Incubação: 25 ºC durante 5 minutos

3,5 dinitrosalicilato (mL) 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25

Incubação: 25 ºC durante 5 minutos Água destilada (mL) 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 Leitura a 540 nm -

Fazer um gráfico em papel milimetrado: Concentração da enzima em µg/mL (abscissa) X Absorbância (ordenada) e interpretar os resultados.

32

12a AULA: Cinética Enzimática da Invertase II (RELATÓRIO JUNTO COM CINÉTICA DA INVERTASE I)

3) EFEITO DO pH Atenção: A enzima é sempre a última a ser adicionada. Reativos/Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 Tampão acetato pH 2 (mL) 1,0 1,0 - - - - - - Tampão acetato pH 4 (mL) - - 1,0 - - - - - Tampão acetato pH 5 (mL) - - - 1,0 - - - - Tampão fosfato pH 6 (mL) - - - - 1,0 - - - Tampão fosfato pH 7 (mL) - - - - - 1,0 - - Tampão fosfato pH 8 (mL) - - - - - - 1,0 - Tampão bicarbonato pH 9 (mL) - - - - - - - 1,0 Sacarose 0,02 M (mL) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Água destilada (mL) 1,0 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 Invertase (mL) - 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

Incubação: 25ºC durante 5 minutos Dinitrosalicilato (mL) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Incubação: 100ºC durante 5 minutos Água destilada (mL) 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5

Leitura a 540 nm - * Zerar o aparelho com o tubo nº 1 Fazer um gráfico em papel milimetrado: Variação de pH X Absorbância (ordenada) e interpretar os resultados. 4) EFEITO DE CONCENTRAÇÃO DO SUBSTRATO Reativos/Tubos 1 2 3 4 5 6 Tampão acetato pH 4,7(mL) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Água destilada (mL) 1,4 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 Sacarose 0,02 M (mL) - 0,5 - - - - Sacarose 0,04 M (mL) - - 0,5 - - - Sacarose 0,06 M (mL) - - - 0,5 - - Sacarose 0,1 M (mL) - - - - 0,5 - Sacarose 0,2 M (mL) - - - - - 0,5 Invertase (mL) 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

Incubação: 25ºC durante 5 minutos Dinitrosalicilato (mL) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Incubação: 100ºC durante 5 minutos Água destilada (mL) 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 Leitura a 540 nm - * Zerar o aparelho com o tubo nº 1 Fazer um gráfico em papel milimetrado: Concentração do substrato em µg/mL (abscissa) X Absorbância (ordenada) e interpretar os resultados. Exercícios:

1. Descreva a reação enzimática da invertase. 2. Como se pode determinar a concentração dos produtos da reação catalisada pela invertase? 3. Qual o Km obtido para a invertase? Qual o seu significado? 4. Qual o pH ótimo determinado para a invertase? Qual o seu significado?

33 13a AULA: Caracterização de Carboidratos - Reações Qualitativas

(RELATÓRIO)

1. Reação de Molish A ação desidratante do ácido sulfúrico (H2SO4) concentrado, sobre moléculas de

monossacarídeos, provoca a formação do furfural (para pentoses) e 5-hidroximetilfurfural (para hexoses). Estes aldeídos podem condensar com α-naftol formando um produto de condensação de cor púrpura (anel). Esta reação é positiva para todos os carboidratos (mono-, oligo- ou polissacarídeo) livres ou combinados.

composto violeta

O C

O

H

OH

+ 2

furfural α-naftol

+ H2SO4 conc.

3 H2O

pentose(D-xilose)

CH2OH

H

OH

H

H

OHH

OHO

O

OH

CH

OH

O C

O

HHOH2C

OH

5-hidroximetilfurfural α-naftol

+ H2SO4 conc.

3 H2O

hexose(D- glicose)

composto violeta

O

OH

CH

OH

HOH2C

H

OH

OH

HH

OHH

OH

CH2OH

HO

+ 2

Portanto: Carboidrato furfural ou hidroximetilfurfural + α-naftol produto colorido (Molish) a) Reativos:

Ácido sulfúrico concentrado Reativo de Molish: 5 g de α-naftol em 100 mL de etanol

b) Técnica:

Em 4 tubos de ensaio marcados A, B, C e D colocar: Tubo A: 2 mL de solução de glicose 1% Tubo B: 2 mL de solução de sacarose 1% Tubo C: 2 mL de solução de amido 1% Tubo D: 2 mL de solução de água destilada

A cada tubo adicionar 2 gotas de reativo de Molish e misturar bem. Inclinar o tubo de ensaio e fazer escorrer pelas paredes do tubo, lentamente, 1 mL de ácido sulfúrico concentrado. Caso a reação seja positiva, na interfase da solução haverá formação de um anel púrpura, resultante da condensação do furfural ou do hidroximetilfurfural com o α-naftol. Explique os resultados.

H2SO4

34 2) Reação de Seliwanoff Esta reação é utilizada para diferenciar entre aldose e cetoses. As cetoses, por ação do HCl, originam um derivado furfúrico que se condensa com resorcinol produzindo um complexo de cor vermelha. Com as aldoses, somente um aquecimento prolongado, que transforma parte de glicose em frutose por epimerização, catalisada por HCl, pode simular um teste positivo. De modo geral, esta reação é positiva com as cetoses e negativa com as aldoses.

CH2OH

H

H

OH

OH

HCH2OH

OHO

+ HCl

3 H2O

5-hidroximetilfurfural resorcinol

+ 2

O C

O

HHOH2C HO OH

composto vermelho

O

CH

HOH2C

OH OH

HO OH

D-frutose(cetose)

a) Reativos:

Soluções de frutose, sacarose e glicose 1% Reativo de Seliwanoff: 0,5 g de resorcinol em 100 mL de etanol

HCl 8,4 M

b) Técnica: Em tubos de ensaios marcados A, B, C colocar: Tubo A: 1 mL de solução de frutose 1% Tubo B: 1 mL de solução de sacarose 1% Tubo C: 1 mL de solução de glicose 1% A cada tubo adicionar 1 mL do reativo de Seliwanoff. Aquecer em banho-maria fervente e marcar o tempo até o aparecimento de cor vermelha que indica a reação positiva. Explique os resultados.

3. Reação de Bial

Esta reação é especifica para pentoses e serve para diferenciar a pentose de hexoses. Pentoses quando aquecidas com HCl concentrado produzem furfural que se condensa com o orcinol. O produto resultante, em presença do sal férrico, adquire uma cor azul ou verde-azulada característica.

+ 2

HO OH

CH3pentose(D-xilose)

CH2OH

H

OH

H

H

OHH

OHO O C

O

H

furfural

+ HCl conc.

3 H2O

O

HO OH

CH3

CH

HO OH

CH3

composto verde[bis(3,5-dioxi-metil-fenil) furfuril-metano]

orcinol

b) Reativos:

HCl concentrado, xilose 1% . solução de glicose 1%, ribose 1%, solução de amido. Reativo de Bial: Orcinol 1,5 g + HCl conc., 500 mL + Cloreto Férrico 10% 30 gotas.

c) Técnica: Em tubos de ensaios marcados A, B, C colocar: Tubo A: 1 mL de solução de xilose ou ribose 1% Tubo B: 1 mL de solução de glicose 1% Tubo C: 1 mL de solução de amido

Adicionar 10 gotas do reativo de Bial. Misturar e aquecer em banho-maria fervente. O aparecimento de cor verde indica reação positiva. Explique os resultados.

35 4. Reação com Iodo

Este teste é utilizado para a pesquisa do amido, que em solução forma um complexo azul com o iodo. Este complexo sofre dissociação com aquecimento e torna-se a formar quando a solução é resfriada. a) Reativos:

Solução de amido 1%; Solução de glicose 1%, Solução de lugol (Iodo)

b) Técnica: Tubo A: 1 mL de solução de glicose 1% + uma gota de lugol Tubo B: 1 mL de solução de amido + uma gota de lugol

Observar o aparecimento de cor azul. Aquecer em banho-maria fervente. Observar. Resfriar o tubo em água corrente. Observar. Explique os resultados.

36 14a AULA: Caracterização de Carboidratos – Reações de Reduções

(RELATÓRIO) 1) Reação de Fehling (reação em meio alcalino) Diversos reativos são utilizados para demonstrar a presença de grupo redutor em açúcares. Justamente por possuírem grupo aldeídico livre ou grupo cetônico, os açúcares são capazes de se oxidarem em soluções alcalinas de íons de determinados metais (Cu, Bi, Hg, Fe, Ag). Todos os monossacarídeos se comportam como açúcares redutores. Com alguns dissacarídeos como a sacarose, isto não acontece por não possuírem grupo redutor livre. A reação de Fehling baseia-se no uso de soluções cuproalcalinas capazes de oxidarem o grupo aldeído e cetonas dos açúcares. O reativo de Fehling é fortemente alcalino e contém íons cúpricos formando um complexo íon cúprico tartarato de sódio e potássio. Nestas condições o cobre é reduzido por ação de açúcares redutores formando-se óxido-cuproso.

a) Reativos:

Soluções de carboidratos Solução de Fehling: Sol. A: CuSO4.............................35 g H2SO4..............................05 g Água dest.........................100 mL Sol. B: Tartarato K e Na............150 g NaOH 40%....................300 mL

Água dest.......................1000 mL b) Técnica:

Tubo Soluções Volume Reativo de Fehling (2 mL) 1A Solução de glicose 1% 2 mL 1 mL de sol. A + 1 mL de sol. B 1B Solução de lactose 1% 2 mL 1 mL de sol. A + 1 mL de sol. B 1C Solução de sacarose 1% 2 mL 1 mL de sol. A + 1 mL de sol. B 1D Solução de amido 1% 2 mL 1 mL de sol. A + 1 mL de sol. B

Misturar. Aquecer em banho-maria fervente. A reação é positiva quando há formação de um precipitado avermelhado de óxido-cuproso. Explique os resultados.

2) Reação de Benedict (reação em meio alcalino) É a reação de diferenciação entre açúcares redutores e não redutores. O reagente de Benedict é constituído por uma solução de CuSO4 e citrato de sódio. Esta solução, fortemente alcalina possibilita a formação de um complexo íon cúprico-citrato. Nestas condições o íon cúprico é reduzido pela ação de açúcares redutores, formando-se um precipitado de óxido-cuproso. As cores verde, amarela e vermelho refletem quantidades crescentes de açúcares redutores no meio de reação.

a) Reativos:

Soluções de carboidratos Solução de Benedict: Sol. A: Citrato de sódio (Na3C6H507.H2O)........173 g Carbonato de sódio (NaCO3).................90 g Água dest. quente (≅80 oC)....................600 mL

Dissolver os sais por agitação Filtrar e completar com água destilada até 850 mL

Sol. B: Sulfato de cobre (CuSO4).......................17,3 mL Água dest...............................................100 mL Dissolver por agitação. Colocar a Solução A em um balão volumétrico de 1.000 mL e adicionar lentamente a Solução B, com agitação constante. Completar com água destilada até a marca de 1.000 mL.

37 b) Técnica:

Tubo Soluções Volume Reativo de Benedict 2A Solução de glicose 1% 10 gotas 3 mL 2B Solução de frutose 1% 10 gotas 3 mL 2C Solução de sacarose 1% 10 gotas 3 mL 2D Solução de amido 1% 10 gotas 3 mL 5E Água destilada 10 gotas 3 mL

Misturar bem e aquecer (3 minutos) em banho-maria fervente. Deixar esfriar espontaneamente. Observar a cor e eventual formação de precipitado. Interpretar. O tubo “E” serve para testar o reagente de Benedict. A reação é positiva quando há formação de um precipitado, cuja coloração, varia de verde amarelado ao vermelhado. Explique os resultados.

3) Reação de Barfoed (reação em meio ácido)

Distingue monossacarídeos de dissacarídeos redutores, pela velocidade com que se forma óxido-cuproso a partir da reação entre o acetato cúprico e o carboidrato. Em meio ácido, predominam as cetônicas, em detrimento das enólicas, assim, os dissacarídeos redutores reagirão mais lentamente do que as oses, como consequência da maior estabilidade das formas moleculares mais complexas. Os dissacarídeos com um grupo aldeído livre, darão redução somente depois de prolongado aquecimento com o reagente.

a) Reativos: soluções de carboidratos; Reativo de Barfoed: Acetato de cobre 13,3g; água dest.

200 mL e ácido acético glacial 1,8 mL.

b) Técnica: Tubo Soluções Volume Reativo de Barfoed

3A Solução de glicose 1% 2 mL 2 mL 3B Solução de frutose 1% 2 mL 2 mL 3C Solução de lactose 1% 2 mL 2 mL 3D Solução de sacarose 1% 2 mL 2 mL

Aquecer em banho-maria fervente durante 1 minuto. Sob estas condições somente os monossacarídeos darão reação positiva com formação de óxido-cuproso. Explique os resultados.

Questões 1) Como podemos pesquisar açúcares redutores? 2) E qual o fundamento da Reação de Barfoed? 3) Porque a sacarose não é um açúcar redutor? 4) A lactose é um açúcar redutor? Justifique?

38 15a AULA: Diálise

(RELATÓRIO) A diálise é uma técnica usada para a separação tanto de moléculas grandes como de moléculas pequenas e depende do fato de que moléculas pequenas (até 15.000 de PM) passam livremente através de uma membrana, enquanto que as moléculas grandes (de PM mais elevado) ficam retidas. Cientificamente esta ponderação é muito simplificada, porque tanto grupos específicos como cargas existentes nas moléculas afetam a velocidade de difusão, particularmente com moléculas de tamanho intermediário. A velocidade de diálise também sofre influência pela temperatura, de tal forma que quanto mais elevada for à temperatura, maior será a velocidade da diálise. Em temperaturas elevadas a viscosidade do solvente é maior e a velocidade de difusão é aumentada. Por outro lado, muitas moléculas são sensíveis à temperatura, desta forma, a diálise de proteínas (enzimas) é geralmente executada em geladeiras. O solvente afeta a velocidade de diálise em diversas formas, necessitando portanto de uma escolha cuidadosa. Em geral, a velocidade de diálise é maior usando água como solvente, mas um controle cuidadoso da força iônica e pH são frequentemente necessários para estabilizar as moléculas sob investigação. A presença de sais reduz a velocidade de diálise, provavelmente, por alterar a forma e a carga da molécula. Qualquer reagente no solvente, que possa desnaturar as moléculas, também pode reduzir consideravelmente a velocidade de diálise. As membranas mais primitivas usadas para diálise são as tripas de porco. Atualmente, também são usadas membranas de celofane. Um comprimento suficiente e cortado, embebido em água e uma das extremidades é amarrada com um nó e o material a ser dialisado é colocado no interior do saco e sua extremidade superior é amarrada ou presa por um grampo ou pinça – o material é submetido à diálise. Depois de umedecido o saco de diálise pode ser reutilizado, porém torna-se susceptível ao ataque por microrganismos, devendo portanto serem conservados em água contendo traços de ácido benzoico.

REMOÇÃO DE MOLÉCULAS PEQUENAS Existem inúmeros exemplos durante isolamentos bioquímicos, onde a CONCENTRAÇÃO de sais ou outros materiais de BAIXO PM devem ser retirados ou diminuídos antes de executar um novo estágio de separação. Em tais casos, a diálise é o método mais conveniente. O saco de diálise contendo a mistura é colocado em um grande recipiente (béquer, cuba, etc.), contendo água ou solução tampão, e submetido à agitação magnética (dispensável). No caso de proteínas ou outras moléculas sensíveis, o sistema todo é colocado em geladeira ou câmara fria. O saco de diálise deve ser completamente enchido, caso contrário, a água penetra para o interior do saco por osmose, causando aumento no volume. Isto é em geral indesejável e deve ser evitado. EXPERIMENTO: PASSAGEM DE MOLÉCULAS ATRAVÉS DA MEMBRANA DE DIÁLISE

DIÁLISE X HIDRÓLISE ENZIMÁTICA PRINCÍPIO: O amido é constituído por dois polissacarídeos a AMILOSE e a AMILOPECTINA (PM de 50.000 e 1.000.000) os quais devido a seus elevados pesos moleculares, não passam através da membrana do saco de diálise. Hidrólise enzimática do amido: As amilases são enzimas que ocorrem na saliva e no pâncreas. Hidrolisam ligações glicosídicas do tipo α(1→4). Atuam no meio da macromolécula, produzindo na clivagem inicial, oligossacarídeos de seis ou sete unidades de glicose, que são posteriormente

39

degradadas a maltotriose e maltose. A ação prolongada da α-amilase salivar sobre a maltotriose produz maltose e glicose livre.

O curso da reação pode ser acompanhado pela degradação dos polissacarídeos (IODO) ou pelo aumento do poder redutor (ANTRONA ou BENEDICT). MATERIAIS: 1- Tubos de diálise 2- NaCl (0,1% tamponado com 0,02 M tampão fosfato, pH 6,8) 3- Amido solúvel (2%) 4- Saliva 5- Solução de Iodo (0,005 N em 3% KI, contendo 5% TCA) 6- Reativo de Antrona. 7-Tubos de ensaios: 18 MÉTODO: Preparar dois sacos de diálise (BRANCO, TESTE)

BRANCO: 5 mL da solução de amido + 4 mL de sol. tampão + 1 mL de água destilada TESTE: 5 mL da solução de amido + 4 mL de sol. tampão + 1 mL de saliva a) No tempo zero (adição da enzima) retirar imediatamente 1 mL do interior de cada saco

(BRANCO e TESTE) e teste com uma gota IODO. b) Colocar cada saco de diálise em um béquer contendo 50 mL de solução tampão. c) Repita a operação (tempo zero) para o saco de diálise BRANCO e TESTE retirando 1

mL, porém da solução tampão no béquer, externo ao saco de diálise e faça o Teste de IODO e BENEDICT.

d) Em intervalos de 5, 10, 15 minutos após o tempo zero, abra os sacos de diálise e retire 1 mL do líquido de dentro do saco (BRANCO e TESTE) e teste com BENEDICT.

e) Após 20 minutos, retire 1 mL (DENTRO E DE FORA DO SACO DA DIÁLISE) e teste com IODO, tanto para o saco de diálise TESTE como para o BRANCO.

f) Repita a operação, porém retirando 1 mL do líquido de diálise (fora) e teste com BENEDICT, tanto para o saco de diálise TESTE como para o BRANCO.

TESTE DE BENEDICT: A cada tubo adicionar 3 mL do reagente de Benedict. Misturar bem e aquecer (3 minutos) em banho-maria fervente. A reação é positiva quando há formação de um precipitado, cuja coloração, varia de verde amarelado ao vermelhado.

Teste com IODO/Tempo TI.0 TI.5 TI.10 TI.15 TI.20 BRANCO - Sol. dentro do saco dial. (BDI) 1 mL - - - 1 mL TESTE - Sol. dentro do saco dial. (TDI) 1 mL - - - 1 mL BRANCO Sol. fora do saco dial. (BFI) 1 mL - - - 1 mL TESTE - Sol. fora do saco dial. (TFI) 1 mL - - - 1 mL Teste de BENEDICT/Tempo TB.0 TB.5 TB.10 TB.15 TB.20 BRANCO - Sol. dentro do saco dial. (BDB) - 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL TESTE - Sol. dentro do saco dial. (TDB) - 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL BRANCO Sol. fora do saco dial. (BFB) 1 mL - - - 1 mL TESTE - Sol. fora do saco dial. (TFB) 1 mL - - - 1 mL

Questões:

1) Cite exemplos de patologias nas quais a diálise tem aplicação clínica.

AMILOSE

e /ou

AMILOPECTINA

Oligossacarídeos

MALTOTRIOSE+

MALTOSE+

GLICOSE

α-amilase salivar

370C

40 16a AULA: Extração e Caracterização do Amido

(RELATÓRIO) 01) EXTRAÇÃO DO AMIDO DA BATATA: - Homogeneizar uma batata de tamanho médio com 100 mL de água destilada em liquidificador. - Filtrar a suspensão em gaze dobrada, recolhendo o filtrado em um béquer. - Deixar o amido depositar no fundo do béquer durante 15 minutos. Depois de decorrido o tempo,

remover cuidadosamente o líquido sobrenadante, evitando a suspensão do amido. 02) PREPARO DE UMA SOLUÇÃO DE AMIDO: - Ao depósito de grãos de amido obtido na experiência 01, adicionando aproximadamente 10 mL de

água destilada fria. Misturar. A esta suspensão de amido, adicionar 100 mL de água fervente, lentamente e com constante agitação. A solução de amido deverá adquirir um aspecto opalescente. Caso não forme uma solução opalescente aquecer. Esta solução será utilizada para as reações de caracterização.

03) REAÇÕES DE CARACTERIZAÇÃO DO AMIDO: 3.A) Reação de Molish: Tubo A: 2 mL da solução de amido + 3 gotas do reativo de Molish e misturar.

Inclinar o tubo e deixar escorrer pela parede 2 mL de H2SO4 concentrado. Reação positiva: formação de um anel violeta na interfase.

3.B) Reação com o Iodo (lugol): Tubo B: 2 mL da solução de amido + 1 gota de lugol. Observar e anotar.

Aquecer o tubo, sem ferver, e anotar o efeito. Em seguida, esfriar o tubo em água corrente, observar e anotar o efeito.

3.C) Precipitação do Amido: Tubo C: 5 mL da solução de amido + 5 mL de solução saturada de sulfato de amônio.

Agitar fortemente e deixar em repouso por 10 minutos. Filtrar e pesquisar o amido pelo teste de iodo, separadamente no filtrado e no precipitado.

Tubo D: 2 mL da solução de amido + 10 mL de álcool etílico. Agitar. Filtrar e pesquisar o amido pelo teste de iodo, separadamente no filtrado e no precipitado. Reação positiva do iodo, nos filtrados, indica precipitação incompleta do amido.

Explicação teórica:

O amido encontra-se amplamente distribuído no reino vegetal, sendo encontrado em sementes, tubérculos, etc. Dentro das células encontram-se na forma de grânulos, estes diferem na forma de acordo com as diferentes fontes. Os principais constituintes do grânulo de amido são a amilose e a amilopectina, os quais diferem na estrutura molecular.

Estrutura química da Amilose unidas por ligações α-1,4

14 14 14H H

H

OHH

OH

CH2OH

HO

O...

H HH

OHH

OH

CH2OH

HO

O

H HH

OHH

OH

CH2OH

HO

O

H HH

OHH

OH

CH2OH

HO

...O O

14

α-1,4

41

Estrutura química da amilopectina com ligações α-1,4 e α-1,6 nas ramificações. - Solução de amido: o amido é insolúvel em água fria. Embora possua grupos funcionais polares

(OH), este polímero da glicose apresenta uma fraca polaridade, devido à complexidade de suas moléculas (cadeias longas e ramificadas).

- Reação com o iodo: neste caso, não ocorre uma reação química propriamente dita, entre o iodo e o amido. O amido adsorve o iodo, formando uma espécie de complexo bastante lábil. A consequente distribuição do iodo causa o fenômeno físico do aparecimento de coloração azul-intensa (amilose) ou violácea (amilopectina).

O complexo iodo-amilose se torna instável por ação do calor, mas se refaz ao esfriar. O

complexo de adsorção não se forma em meio alcalino, no qual os grupos polares do amido são bloqueados pelos íons hidroxilas presentes. Pela mesma razão, o complexo não se forma em meio alcoólico.

Exercícios

1. Qual é o princípio da reação de Molisch e o que acontece quando é aplicada a um polissacarídeo?

2. Por que ocorre a precipitação do amido quando, em solução aquosa, é tratado com etanol ou sulfato de amônio?

14 14 14H H

H

OHH

OH

CH2OH

HOH H

H

OHH

OH

CH2OH

HO

O

H HH

OHH

OH

CH2OH

HO

O

H HH

OHH

OH

CH2OH

HO

...O O

O

CH2

H HH

OHH

OHH

O

O...

H HH

OHH

OH

CH2OH

HO

O

H HH

OHH

OH

CH2OH

HO

O

H HH

OHH

OH

CH2OH

HO

...O O

14

α-1,4

14 14 14 14

α-1,4

α-1,6

42 17a AULA: Testes Para Caracterização de Lipídeos

(RELATÓRIO)

1) SAPONIFICAÇÃO DO TRIACILGLICEROL Os óleos e gorduras, quando tratados por soluções alcalinas concentradas, se hidrolisam,

produzindo glicerol e os sais alcalinos dos ácidos graxos que os constituíam (sabões). Técnica: - Em um tubo de ensaio grande, colocar 20 gotas de óleo vegetal e 10 mL de potassa alcoólica (5,0 ml de KOH 40% mais 5,0 mL de etanol). - Aquecer em banho-maria fervente durante 30 minutos. Nestas condições o óleo é saponificado, obtendo-se uma solução opalescente de sais de potássio de ácidos graxos (sabões) e glicerol. Usar esta solução na experiência seguinte. 2) SOLUBILIDADE Técnica: - Preparar uma série de 6 tubos de ensaio. Colocar 2 gotas de óleo de soja em todos eles. A seguir, acrescentar os solventes de acordo com a tabela abaixo:

Tubos Solventes (3 mL) Resultados * 01 água destilada 02 HCl 0,5 M 03 NaOH 0,5 M 04 etanol 05 éter etílico 06 clorofórmio

* após adicionar os solventes, agitar, observar e anotar o resultado. Resultado: (solúvel ou insolúvel) ESTABILIZAÇÃO DE UMA EMULSÃO Em presença de água, agitando, o óleo se torna finamente dividido, formando uma emulsão instável, não permanente. Logo se separa e flutua, ao ser deixado em repouso. As proteínas possuem zonas hidrófobas em sua estrutura, as quais podem fixar os lipídeos; e consequentemente estabilizam as emulsões. Em presença de soluções alcalinas, os ácidos graxos livres são neutralizados e os sais resultantes são agentes estabilizadores das emulsões dos óleos e gorduras em água este fenômeno é mais intenso em óleo rançoso. 3) VERIFICAÇÃO DA ACIDEZ EM ÓLEO OU GORDURA RANÇOSA

Os óleos e gorduras não muito purificados contém pequenas quantidades de ácidos graxos livres (palmítico, esteárico, oléico, etc.). Quanto maior for o grau de impureza destes lipídeos ou quanto mais tempo forem deixados em contato com o ar, à temperatura ambiente, maior será a quantidade de ácidos graxos livres. Daí, a reação ácido do óleo ou gorduras rançosas.

HC O CO R

H2C O CO R

H2C O CO R

triglicerídeo

+ 3 R_COO- K+

sal de ácido graxo

HC OH

H2C OH

H2C OH

glicerol

43 Técnica: Tubo 1: 2 mL de etanol + 2 gotas de NaOH 0,1 M + 1 gota de fenolftaleína. Observar. Adicionar óleo

rançoso gota a gota, até descorar. Contar o número de gotas adicionadas. Tubo 2: 2 mL de etanol + 2 gotas de NaOH 0,1 M + uma gota de fenolftaleína. Observar. Adicionar o

mesmo número de gotas de experiência anterior de óleo fresco. Observar, comparar e interpretar.

4) FIXAÇÃO DO IODO Os ácidos graxos insaturados caracterizam-se pela existência de uma ou mais duplas ligações na molécula, o que explica a sua maior reatividade. A dupla ligação pode adicionar oxigênio, hidrogênio e halogênios. O grau de saturação pode ser determinado na presença de iodo. Quanto maior o teor de ácidos graxos insaturados na composição, menor é a quantidade de iodo livre na solução que observado pela reação de amido do iodo.

R COOH + I2 R

COOH

I

I Técnica: 1) Numerar dois tubos de ensaio e proceder conforme a tabela abaixo:

Reagentes Tubo 1 Tubo 2 Óleo de soja fresco 5 mL - Água destilada - 5 mL Lugol 10 mL 10 mL

2) Aquecer em banho-maria fervente até o desaparecimento da cor. 3) Deixar esfriar em temperatura ambiente e adicionar três gotas de solução de amido. 4) Observar e comparar os resultados obtidos em ambos os tubos. 5) PROPRIEDADES DOS SABÕES -Repartir a solução de sabão obtida da Prática 1: 0,5 mL em 4 tubos de ensaio e realizar os seguintes testes: Tubo 1: abaixamento da tensão superficial - acrescentar 0,5 mL de água destilada e agitar a solução de sabão até formação de espumas. Tubo 2: liberação de ácidos graxos - adicionar, gota a gota, ácido acético concentrado, até o aparecimento de turbidez, resultante da liberação dos ácidos graxos que sobrenadam. Tubo 3: precipitação de sabões de cálcio insolúveis - adicionar, gota a gota, solução de CaCl2 a 10%, até o aparecimento de um precipitado branco de sabões de cálcio. Tubo 4: precipitação por excessivo de eletrólitos - adicionar um volume igual de solução saturada de NaCl. Observar a formação de um precipitado de sabão por excesso de eletrólitos.

44 EXPLICAÇÃO TEÓRICA:

- Abaixamento da tensão superficial: com a agitação da solução (sabão), as interações (pontes de hidrogênio) ficam mais sensíveis com isto às micelas penetram entre os mols de H2O fazendo com que haja um espaço maior entre elas, o ar penetra ocupando o espaço vazio, como ele é menos denso ele sobe e fica interagindo com a H2O e micelas. - Liberação de ácidos graxos: a turbeis observada é resultado da liberação dos ácidos graxos, os quais sendo insolúveis em água e menos densos, sobrenadam.

-Precipitação de sabões de cálcio: Os sais de ácidos graxos com cálcio formam um precipitado de sabões de cálcio insolúveis.

- Precipitação por excesso de eletrólitos: Os sais de ácidos graxos precipitam em presença de excesso de eletrólitos, devido ao efeito do íon comum, com diminuição da dissociação do sal.

REAGENTES: - Óleo de soja fresco - HCl 0,5 M; NaOH 0,5 M; NaOH 0,1 M - Etanol, éter etílico, clorofórmio, ácido acético concentrado - Solução de fenolftaleína - KOH 40%; CaCl2 10%; NaCl saturada (35%) Exercícios:

1) O que é lipídeo? 2) O que é ácido graco? 3) O que é um óleo? Dê exemplos. 4) Escreve a fórmula estrutural do ácido palmitoleico. 5) Escreva a reação de hidrólise alcalina de um triacilglicerol. 6) Por que se utiliza etanol na reação de saponificação? 7) Explicar a ação detergente dos sabões

CH3(CH2)14COO- K+ + CH3COOH ---------------> R1-COOH + CH3COO- K+ palmitato de potássio ácido acético ácido palmítico acetato de potássio

CH3(CH2)14COO-K+ + CaCl2

CH3(CH2)14COO-

CH3(CH2)14COO-

Ca+ + 2 KCl

palmitato de potássio cloreto de cálcio palmitato de cálcio cloreto de potássio (insolúvel)

palmitato de potássio cloreto de sódio palmitato de sódio cloreto de potássio

CH3(CH2)14COO-K+ + NaCl (sat.) CH3(CH2)14COO-Na+ + KCl

45 18a AULA: Prática de Carotenoides

(RELATÓRIO)

Introdução: Os carotenoides são substâncias coloridas presentes em diversos vegetais, que servem como precursores de vitamina A para muitos animais, incluindo o homem, sendo que a degradação enzimática de β-caroteno (carotenoide) gera 2 moléculas de vitamina A, segundo a equação:

Assim como outras substâncias orgânicas que contém duplas ligações, os carotenoides também são atacados por agentes oxidantes fortes, como o KMnO4, segundo a equação:

O KMnO4 apresenta cor bordô-escuro e é solúvel em água, enquanto que o MnO2 é marrom e insolúvel em meio aquoso. Sendo assim, a mudança de cor de bordô para marrom e a formação de um precipitado escuro, indicam que ocorreu reação do KMnO4 com materiais orgânicos oxidáveis. Procedimento:

1) Bater no liquidificador 1 cenoura média com 250 mL de água. Filtrar. O filtrado é a solução de cenoura.

2) Bater no liquidificador 1 tomate médio com 100 mL de água. Filtrar. O filtrado é a solução de tomate.

3) Misturar bem 10 mL de extrato de tomate com 50 mL de água. Filtrar bem. O filtrado é a solução de extrato.

4) Colocar 10 g de urucum em pó em um béquer, e acrescentar 30 mL de água. Agitar eventualmente e, após 20 minutos, filtrar. O filtrado é a solução de urucum.

Tubo KMnO4

(5mg/mL) mL Sol. de cenoura

(mL) Sol. de tomate

(mL) Sol. extrato de tomate (mL)

Sol. de urucum (mL)

1 1 - - - - 2 1 5 - - - 3 1 - 5 - - 4 1 - - 5 - 5 1 - - - 5

Anotar as observações e explicar.

β−caroteno

enzimas2

CH2OH

Vitamina A

3 R C C R` + 2 KMnO4 + 3 H2O

R`` R```

3 R C C R` + K2O + 2 MnO2

R`` R```

OH OH

46 19a

AULA: Cromatografia de Carboidratos (RELATÓRIO)

CROMATOGRAFIA EM PAPEL (Ascendente)

Fundamentação teórica:

A cromatografia é uma ferramenta de grande importância em trabalhos científicos, sendo útil devido à facilidade de separar e identificar misturas de difícil resolução. Na cromatografia em papel, utiliza-se um tipo de papel de filtro especial. Existem diversos tipos de papéis para cromatografia e podem ser obtidos comercialmente em espessuras variáveis. O mais comum deles é o WHATMAN. O papel em si, é constituído por um agregado de fibras de celulose. Estas fibras de celulose (polímero de glicose) estão dispostas em forma aproximadamente paralela e estão fortemente ligadas entre si em algumas regiões, através de pontes de hidrogênio o que gera na estrutura do papel, regiões de estruturas cristalinas e regiões de estruturas parcialmente amorfas. Nas regiões amorfas, a água e outros solventes hidrofílicos são adsorvidos pela celulose, o que conduz a formação de pools de líquidos. Objetivo: identificação qualitativa de carboidratos através da migração diferencial sobre uma camada delgada de adsorvente retido sobre uma superfície plana. Material: - Papel cromatográfico - Amostra: Soluções aquosas (10 mg/10 mL) de:

1. glicose 2. xilose 3. frutose 4. maltose 5. Mistura

- Revelador para carboidratos - Câmara cromatográfica - Tubos capilares Solventes: butanol normal/piridina/água (6:4:3). Técnica: 1. Cortar o papel cromatográfico com 16 a 24 cm. 2. Traçar com lápis uma linha de 2 cm da borda inferior. 3. Marcar sobre a linha traçada, pontos para a aplicação das amostras e padrões conservando entre

eles a distância de 2 cm. 4. Aplicar as soluções de carboidratos com tubos capilares. Secar com secador. A mancha não deve

exceder 5 mm de diâmetro. 5. Mergulhar o cromatograma em uma cuba contendo o solvente de corrida, tomando o cuidado para

que a altura do solvente não alcance a linha de aplicação das manchas. 6. Deixar que o solvente corra até 1 cm da extremidade superior do papel e marcar a linha de frente

do solvente com um lápis. 7. Retirar o cromatograma e deixar secar a temperatura ambiente. 8. Revelar com revelador de carboidratos 9. Identificar os carboidratos da mistura por comparação com os padrões. 10. Medir o Rf de cada substância.

47 Em cromatograma de papel e em camada delgada, usa-se como referência o Rf.

Rf = distância percorrida por uma substância distância percorrida por um solvente

O Rf é característico para cada substância, quando as condições forem estabelecidas. É utilizado para identificar os componentes de uma amostra. Nota: Evite contato com dedos na porção do papel que contém as amostras e os padrões. Temas de aplicação: 1) Quais as aplicações da cromatofrafia? 2) Qual a finalidade de calcularmos o Rf de cada amostra? 3) Qual a função de cromatografia numa mistura de amostras?

48 20a AULA: Identificação de Ácidos Nucleicos em Materiais Biológicos

(RELATÓRIO) Introdução Os ácidos nucleicos encontrados em diferentes frações celulares serão evidenciados num homogeneizado de tecido hepático, através de reações características para as pentoses que os compõe (Riboses e Desoxirriboses).

Os ácidos nucleicos são precipitados com Ácido Tricloroacético (TCA) a 20%, juntamente com as proteínas e posteriormente extraídos com TCA a 5%, a quente.

A hidrólise ácida branda dos ácidos nucleicos remove seletivamente todas as bases púricas (hidrolise de ligações N-glicosídicas entre pentoses e as base púricas) sem afetar as ligações N-glicosídicas entre as bases pirimídicas e as pentoses ou ligações de fosfodiéster do esqueleto nucleotídico. Portanto, pela hidrólise temos como produto os ácidos nucléicos sem bases púricas. Com este material parcialmente purificado, serão efetuadas as reações de caracterização. Reativos:

- TCA 20%; TCA 5%; Ácido Cítrico 2% - Reativo de difenilamina: Difenilamina...........................................1 g Ácido acético gl.......................................100 mL Ácido sulfúrico conc...............................2,75 mL

- Reativo de orcinol: Orcinol.....................................................0,2 g HCl conc.................................................60 mL Cloreto férrico 10%..................................0,2 mL Técnica 1. Preparo do Homogeneizado:

Colocar, em um gral de porcelana, aproximadamente 5 g de fígado finamente cortado. Adicionar 10 mL de ácido cítrico 2% e triturar com o auxílio de um pistilo até completa homogeneização.

2. Extração dos Ácidos Nucleicos:

a) Filtrar o homogeneizado obtido utilizando-se de gaze dobrado até 4 vezes. Em um tubo de centrífuga colocar 2 mL do filtrado e adicionar 1 mL de TCA 20%. Misturar e deixar de repouso por 15 minutos.

b) Centrifugar a 2000 rpm por 3 minutos, desprezar o sobrenadante e suspender o sedimento com 5 mL de TCA 5%. Aquecer em banho-maria por 10 minutos.

c) Centrifugar a 2000 rpm por 3 minutos. Retirar o sobrenadante coletando-o em tubo de ensaio. Este extrato deve conter todo o DNA e RNA.

C

C

C OHH

H H

C

CH2OH

OHH

H O

2-desoxiribose(açúcar do DNA)

CH O

C

C OHH

H OH

C

CH2OH

OHH

ribose(açúcar do RNA)

49 Reações de Caracterização a) Caracterização do DNA:

A 2-desoxipentoses ou derivados que apresentam grupamento aldeídicos livres, por hidrólise ácida branda, tais como apurino desoxiribonucleotídeo, reagem com a difenilamina, dando um produto de cor azul. Esta reação irá caracterizar indiretamente a presença de DNA no extrato em análise.

Técnica:

Tubo A: 1 mL do extrato de ácidos nucleicos + 2 mL do reativo de difenilamina Tubo B: 1 mL de água destilada+ 2 mL do reativo de difenilamina

Misturar e aquecer em BM fervente por 10 minutos. Esfriar e observar a cor azul no tubo A, característica da presença de desoxirribose.

b) Caracterização do RNA:

O RNA pode ser evidenciado pela reação com orcinol para pentoses. Como o reativo de orcinol é fortemente ácido, as ligações fosfodiéster e N-glicosídicas sofrerão hidrólise, liberando riboses na forma livre. As riboses formarão furfurais que irão condensar com orcinol, dando um produto de cor verde azulada que revela a presença de RNA no extrato.

Técnica: Tubo A: 1 mL do extrato de ácidos nucleicos + 2 mL do reativo de orcinol Tubo B: 1 mL de água destilada + 2 mL do reativo de orcinol

Misturar e aquecer em BM fervente por 10 minutos. Esfriar e observar a cor verde no tubo A, característica da presença de ribose.

Questões: 1) Equacione as reações que ocorrem com o DNA e RNA com a difenilamina e o orcinol. 2) Qual é o papel do T.C.A. no processo?

50 21a AULA: Espectrofotometria

(RELATÓRIO) FUNDAMENTOS A análise fotométrica é uma das maneiras mais usadas para determinar a concentração de soluções de compostos químicos ou biológicos. Ela é, talvez, o método mais comumente empregado nas análises químicas em laboratórios clínicos.

Fotometria é uma técnica de análise quantitativa que envolve a medida de intensidade de absorção de luz monocromática de um composto químico em solução. A absorção de luz pela matéria envolve a incorporação da energia contida no fóton da estrutura das moléculas absorventes. Quando isso acontece, as moléculas absorventes passam do estado fundamental (estado energético mais baixo) para o estado excitado (estado energético mais alto). Contudo, a duração do estado excitado normalmente é breve, e a molécula retorna ao estado fundamental libera energia na forma de calor.

O fenômeno de absorção implica que o conteúdo energético do fóton seja igual à quantidade de energia necessária para que a molécula ou átomo passe do estado fundamental para o excitado. Quando o conteúdo energético do fóton for maior ou menor do que a quantidade de energia necessária para o composto passar do estado fundamental para o excitado, o fenômeno de absorção não ocorre. Assim, deve-se utilizar um feixe de luz monocromática de comprimento de onda adequado, capaz de excitar o composto estudado.

Espectrofotômetros são instrumentos que medem a absorção de energia magnética radiante em soluções. Os espectrofotômetros utilizam prismas ou grades de difração para selecionar determinadas faixas do espectro (ultravioleta até 380 nm, visível 381-700 nm ou infravermelho acima de 700 nm).

A figura abaixo apresenta os componentes básicos de um espectrofotômetro.

1. Fonte de luz: capaz de emitir uma mistura de comprimentos de onda (lâmpada de tungstênio para luz visível e lâmpada de hidrogênio para luz ultravioleta).

2. Colimador ou dispositivo de focalização: transmite um intenso feixe retilíneo de luz. 3. Monocromador (prisma ou grade de difração): utilizado na resolução da radiação emitida pela fonte

luminosa em seus vários comprimentos de onda (λ). 4. Fenda: dispositivo para selecionar o comprimento de onda desejado. 5. Porta cubeta e cubeta: local apropriado onde se coloca a cubeta contendo a solução a ser medida. 6. Detector com célula fotoelétrica: utilizado para receber a energia radiante transmitida através da

solução e transformá-la em energia elétrica. 7. Medidor elétrico (galvanômetro): registra a intensidade de energia captada pelo detector e

apresentando-a ao operador sob forma de leitura de TRASNMITÂNCIA (T) ou ABSORBÂNCIA (A).

5-Cubeta com amostra

1-Fonte de luz 3-Monocromador (prisma ou grade de

difração)

2-Colimador 4-Seletor de λ (fenda)

6-Célula fotoelétrica

7-Galvanômetro

51 Quando um raio de energia radiante atravessa uma solução, a energia INCIDENTE (Io) será

sempre mais intensa que a energia EMERGENTE (I). Esta atenuação da intensidade da energia é atribuída a:

1) Reflexões nas interfaces entre o ar e a parede da cubeta e entre a solução e a parede da cubeta. 2) Dispersão por partículas presentes na solução. 3) Absorção da energia pela solução. Nas aplicações da fotometria, a absorção da energia (I) é o fator primário na redução da energia

incidente (Io). ABSORBÂNCIA: significa a relação logarítmica entre a ENERGIA INCIDENTE (Io) e a ENERGIA TRANSMITIDA (I) pela solução. TRANSMITÂNCIA: é a relação entre a energia transmitida (I) e a energia incidente (Io).

Se uma determinada solução não absorve energia, I e Io tem o mesmo valor e portanto I/Io será igual a 1. Conclui-se desse modo, que qualquer solução que absorva energia terá transmitância menor que 1 (porque I é, neste caso, menor que Io). Para evitar operações com decimais, recorreu-se ao artifício da multiplicação por 100. Assim quando I e Io são iguais, logo T = 1 + 100% LEI DE LAMBERT: estabelece que quando a energia radiante atravessa uma solução, a quantidade de energia transmitida diminui exponencialmente em relação ao aumento da espessura atravessada.

Assim: Io: intensidade da luz incidente I: intensidade da luz transmitida ε: Constante característica da solução 1: Espessura da camada atravessada pela luz.

Partindo da Lei de Lambert, BEER estabeleceu que: quando a energia radiante atravessa uma solução, a quantidade de energia transmitida diminui exponencialmente com o aumento da concentração da solução. Assim:

Io: intensidade da luz incidente I: intensidade da luz transmitida ε: constante característica da solução c: concentração da solução atravessada pela luz.

LEI DE LAMBERT-BEER: Combinando as equações 1 e 2 Substituindo-se a equação 1 em 3 teremos:

A = ε.l.c (eq. 4) onde: A = absorbância é definida pela reação seguinte: A = -log. I/Io, que por ser uma razão, não possui unidade (Io é intensidade de luz incidente; I é intensidade de luz transmitida); ε = absortividade molar (característico de cada substância), em L.(mol.cm)-1; l = caminho óptico (percurso da luz monocromática na solução), em cm; c = concentração da substância em mol/L.

A = logIo

I

T = I

Io

Log = ε.l (eq.1) Io

I

Log = ε.c (eq.2)Io

I

Log = ε.l.c (eq.3)Io

I

52 CURVA DE CALIBRAÇÃO: A principal finalidade de uma dosagem espectrofotométrica é avaliar quantidades. Portanto é extremamente importante efetuar uma rigorosa calibração, visando à obtenção de resultados exatos. SOLUÇÃO PADRÃO: É parte integrante da análise quantitativa no laboratório e usada nas dosagens de amostras de concentração desconhecidas. Uma solução padrão apresenta uma concentração exata de uma substância conhecida, que servirá como referência na determinação fotométrica de CONCENTRAÇÕES DESCONHECIDAS desta MESMA SUBSTÂNCIA. USO DE BRANCO: Quando usamos o BRANCO em fotometria, para estabelecer o zero de absorbância ou 100% de transmitância, estamos simplesmente usando um sistema para eliminar:

- Absorbância dos reagentes e das cubetas - Perdas por reflexões e refração - Compensação do efeito de lente produzido pelas cubetas redondas. Usamos ponto zero de ABSORBÂNCIA ou 100% TRANSMITÂNCIA, porque, desta forma

eliminaremos a necessidade de cálculos, pois neste ponto a energia incidente (Io) torna-se igual a 100. SELEÇÃO DA ÁREA ESPECTRAL = ESPECTRO DE ABSORÇÃO Quando realizamos uma medida fotométrica, devemos usar a faixa do espectro na qual a energia radiante seja ABSORVIDA AO MÁXIMO. O melhor processo para avaliar corretamente a região espectral para ser utilizada numa medida fotométrica é preparar uma curva ou espectro de absorção, onde obtém-se uma relação entre as absorbâncias e os respectivos comprimentos de onda. PROBLEMAS: erros de leitura.

a) Impurezas na amostra. b) Bolhas de gás, sujeiras na cubeta (parede), riscos nas paredes da cubeta.

Exercícios:

1. Qual a finalidade e o fundamento da técnica espectrofotométrica? 2. Determine a composição e defina a importância dos tubos branco e padrão na determinação da

concentração de um composto pela técnica espectrofotométrica.

53 22a Aula: Seleção da Área Espectral = Espectro de Absorção

(RELATÓRIO) Quando uma solução de um dado composto é submetida a leituras de absorbância ao longo de uma faixa de comprimentos de onda eletromagnética, passamos a ter informações referentes à capacidade do composto em absorver luz. Quando realizamos uma medida fotométrica, devemos usar a faixa do espectro na qual a energia radiante seja ABSORVIDA AO MÁXIMO. O melhor processo para avaliar corretamente a região espectral para ser utilizada numa medida fotométrica é preparar uma curva ou espectro de absorção, onde obtém-se uma relação entre as absorbâncias e os respectivos comprimentos de onda. A representação gráfica dos valores de comprimento de onda (λ) versus absorbância é denominado espectro de absorção. Como a interação da luz com a matéria depende da estrutura química dos compostos, o espectro de absorção é uma forma de caracterização que permite verificar qual a faixa de comprimento de onda em que um dado composto apresenta sua maior afinidade de absorção. ESPECTRO DE ABSORÇÃO DO COMPLEXO PROTEÍNA/BIURETO Procedimento Experimental: Determinação do λmáx do produto da reação de biureto Tubo A (amostra): 1,0 mL de padrão de albumina (1 mg/mL) + 4 mL de reagente de biureto Tubo B (branco): 1,0 mL de água dest. + 4 mL de reagente de biureto

Agitar e incubar os tubos por 10 min. a 37 oC. Transferir conteúdo dos tubos para cubetas do espectrofotômetro e ler as absorbâncias nos comprimentos de onda 400, 420, 450, 470, 500, 520, 550, 580, 600, 630, 650, 680 e 700 nm. Traçar um gráfico, colocando na abscissa (X) os comprimentos de onda [λ (nm)] e na ordenada (Y) às absorbâncias. Estabelecer qual é o λmáx do produto da reação de biureto.

λ (nm) 400 420 450 470 500 520 550 580 600 630 650 680 700 Abs.

Questão:

1. Qual a importância da determinação do espectro de absorção? 2. Conceitue: faixa de sensibilidade do método espectrofotométrico?

54 23a AULA: Preparo da Curva Padrão (Curva De Calibração)

EXECUÇÃO DE UMA CURVA DE CALIBRAÇÃO 1) Preparar uma série de padrões (concentração conhecida da substância que se quer quantificar) e

que cubram a faixa de trabalho desejada, ou seja a concentração mínima e a máxima possível de ser medida dentro da sensibilidade do método.

2) Verificar a absorbância de cada uma destas concentrações (da sol. padrão). Fazer as leituras usando o BRANCO APROPRIADO para acertar ZERO DE ABSORBÂNCIA ou 100% de TRANSMITÂNCIA. Usar também o COMPRIMENTO DE ONDA RECOMENDADO PELA LITERATURA OU O OBTIDO PELA CURVA DE ABSORÇÃO ESPECTRAL PREVIAMENTE REALIZADA.

3) Fazer gráfico em papel milimetrado, relacionando a absorbância (ordenadas) com as concentrações dos padrões (ou diluições dos padrões) na abscissa. Examinar os pontos obtidos e verificar se eles serão cobertos por uma linha reta, partindo da origem. Se isto não acontecer, traçar a curva de tal modo que se aproxime de todos os pontos obtidos. A curva não deve ser traçada ponto a ponto, mas sim por interpolação através dos pontos. Desta forma, mantendo-se o caminho óptico constante, a absorbância torna-se diretamente proporcional à concentração da substância no respectivo λmáx.

Nestas condições, podemos utilizar uma solução de concentração conhecida do composto a ser analisado (ou outra substância de características químicas semelhantes) para construir um diagrama de absorbância em função da concentração da substância em questão. Com este diagrama, denominada curva padrão, podemos medir a quantidade do composto em amostras de concentração desconhecida, pela simples medida de suas absorbâncias desde que, estas estejam nas mesmas condições utilizadas para a construção da curva padrão (mesmos reagentes, mesma temperatura, etc.).

Um exemplo de uma curva padrão:

Técnica:

Tubos Padrão mL (1mg/mL)

H2O dest.(mL)

Reagente de biureto (mL)

Absorbância Fator de

calibração (f) 1(branco) - 1,0 4,0 0,0 0,0

2 0,2 mL 0,8 4,0 3 0,4 mL 0,6 4,0 4 0,6 mL 0,4 4,0 5 0,8 mL 0,2 4,0 6 1,0 mL - 4,0

Deixar os tubos em repouso por 10 minutos antes de fazer a leitura. Leitura: 540 nm. Faça um gráfico e avalie o fator de calibração.

Fator de calibração (f) = concentração absorbância

Determinando a concentração da amostra pelo fator de calibração: Amostra [mg/mL] = f x Abs. Tudo 6 Concentração do padrão: 1 mg/mL

55

24a AULA: Dosagem de Proteína no Soro (RELATÓRIO)

Objetivo: Determinar a concentração de proteínas séricas utilizando-se a reação de biureto. Reagente: � Solução padrão: 1mg/mL de albumina bovina. Conservar ente 15 e 25 oC. � Reativo de biureto. � Amostra: soro ou plasma podem ser usados, mas prefere-se soro. Amostras hemolisadas não

devem ser analisadas. As amostras bem fechadas de soro são estáveis, por 1 semana à temperatura ambiente, e por 1 mês a 2 a 4 oC.

Método: Princípio: O cobre do reativo de biureto reage com as proteínas, em meio alcalino, formando um complexo cobre proteína de cor roxa, que absorve luz em 540 nm. A intensidade de cor produzida é proporcional ao número de ligações peptídicas que estão reagindo e, portanto, à quantidade de proteína presente. Aminoácidos e dipeptídios não reagem, mas tripeptídios, oligopeptídios e polipeptídios reagem e produz produtos de cor rosa a violeta avermelhada. Reação do biureto com a estrutura da proteína.

Cu++

HN

CO

R_CH

O=C

NH

R_CH

R

R

C O

R

NH

HC_R

C=O

NH

HC_R

R

H2O

H2O

Técnica: Diluir a amostra: Em um tubo de ensaio, pipetar 1,9 mL de água destilada e 0,1 mL do soro a ser testado (dil. 1:20).

Tubos Soro

(mL) Padrão de albumina

(1 mg/mL) H2O dest.

(mL) Reagente biureto

(mL) Absorbância

1(branco) - - 1,0 2,0 0,0 2(padrão) - 1,0 (mL) - 2,0 3(amostra) 1,0 - - 2,0

Deixar todos os tubos em repouso por 10 minutos. Efetuar a leitura em 540 nm. Cálculo

Amostra [mg/mL] = absorbância da amostra

absorbância do padrão X concentração do padrão [mg/mL]

Valores normais: 60 a 80 mg/mL. Resultados e conclusão: Compare o valor encontrado na sua dosagem com os valores de referência para dosagem de proteínas totais. Verifique se a concentração de proteínas totais está dentro da faixa de referência, se indica hipoproteinemia ou hiperproteinemia. E quais as principais causas de alterações dessas concentrações. Questões:

1. Quais as frações proteicas que compõem as proteínas totais? 2. Em quais líquidos biológicos podemos determinar proteínas totais?

56 25a AULA: Determinação de Glicose no Sangue

(RELATÓRIO) Método: Teste fotométrico enzimático: "GOD-POP". Objetivo: Determinar a concentração de glicose em uma amostra com concentração desconhecida, utilizando o método enzimático da glicose oxidase/peroxidase (GOD/POP).\ Indicação: A medição da concentração da glicose em soro ou plasma é principalmente usada no diagnóstico e monitoramento do tratamento de Diabetes Mellitus. Outras aplicações são na detecção de hipoglicemia neonatal, exclusão de células cancerígenas pancreáticas bem como na avaliação do metabolismo de carboidratos em varias doenças. Princípio: Determinação da glicose após oxidação enzimática pela glicose oxidase. O indicador colorimétrico é a Quinonimina, o qual é gerado a partir da 4-aminoantipirina e fenol pelo peróxido de hidrogênio sob ação catalítica da peroxidase (Reação Trinder -1969).

Reagentes: Reagentes prontos para uso. Padrão: 100 mg/dL (5,55 mmol/L) Amostra: Soro humano Cuidados e precauções: Este reagente possui azida sódica e é classificado pelas diretrizes aplicáveis da comunidade Européia como nocivo (Xn). Procedimentos para o teste:

Tubos Soro Padrão de glicose H2O dest. Reagente (mL) Absorbância 1(branco) - - 10,0 µL 1,0 0,0 2(padrão) - 10,0 µL - 1,0 3(amostra) 10,0 µL - - 1,0

Misturar, incubar por 10 min. a 37 oC. Fazer leitura em comprimento de onda de 500 nm

NN

NH2H3C

H3C POD+ 4H2O

2 H2O2 +

OH

+

glicose ácido glicônico

NN

NH3C

H3C

O

C

C

OH

C

C

C

CH2OH

H OH

H OH

HHO

H OH

+ O2

C

C

O-O

C

C

C

CH2OH

H OH

H OH

HHO

H OH

+ H2O2

GOD

fenolperóxido dehidrogênio

peróxido dehidrogênio

4-aminoantipirina quinonimina

57 Cálculo:

Glicose [mg/dL] = absorbância da amostra

absorbância do padrão X concentração do padrão [mg/dL]

Fator de conversão: Glicose [mg/dL] x 0,05551 = Glicose [mmol/L] Valores Normais:

[mg/dL] [mmol/L Recém Nascidos Cordão Umbilical 63 - 158 3,5 - 8,8 1 h 36 - 99 2,0 – 5,5 2 h 36 - 89 2,2 – 4,9 5-14 h 34 - 77 1,9 – 4,3 10-20 h 46 - 81 2,5 – 4,5 44-52 h 48 - 79 2,7 – 4,7 Crianças 1-6 anos 74 - 127 4,1 – 7,0 7-19 anos 70 - 106 3,9 – 5,9 Adultos Soro/Plasma 70 - 115 3,9 - 6,4

Resultados e conclusão: Compare o valor encontrado na sua dosagem com os valores de referência para dosagem de glicose. Verifique se a concentração de glicose está dentro da faixa de referência, se indica hipoglicemia ou hiperglicemia. E quais as principais causas de alterações dessas concentrações. Questão:

1. Em quais líquidos biológicos podemos determinar glicose?

58 26a AULA: Dosagem de Triglicerídeos no Sangue

(RELATÓRIO)

1) FINALIDADE: Teste enzimático e colorimétrico para o doseamento de triglicérides no soro ou plasma usando reagente líquido pronto para uso.

2) AMOSTRA: Soro humano

3) IMPORTÂNCIA CLÍNICA: A determinação dos triglicerídeos possui um vasto significado clínico, especialmente em se tratando de doenças coronarianas e arteroscleróticas. O doseamento é importante também para avaliação de quadros que envolvem diabetes mellitus, obstruções biliares, nefroses e vários outros distúrbios do metabolismo endócrino.

4) PRINCÍPIO DE TÉCNICA

A quantidade de Quinonimina formada (medida entre 500-550 nm) é proporcional à concentração de triglicérides na amostra analisada.

5) PROCEDIMENTO TÉCNICO

Tubos Soro Padrão(200 mg/dL) H2O dest. Reagente (mL) Absorbância 1(branco) - - 10,0 µL 1,0 0,0 2(padrão) - 10,0 µL - 1,0 3(amostra) 10,0 µL - - 1,0

Misturar suavemente e incubar 5 minutos a 37oC. Fazer leitura em comprimento de onda de 500 nm. 6) CÁLCULOS Para se determinar a concentração de triglicérides na amostra analisada, usar a seguinte fórmula:

Triglicérides em mg/dL = (Absorbância do teste/Absorbância do padrão) x 200 Pode-se alternativamente recorrer ao uso do fator de calibração para se determinar a

concentração de triglicérides na amostra analisada, porém, é recomendável a aferição ao menos diária deste fator por meio de padrão ou calibrador. 7) VALORES DE REFERÊNCIA Adultos: 40-200 mg/dL Crianças: 30-125 mg/dL 8) QUESTÕES:

a) Quais as fontes de triglicerídeos para o organismo? b) Discuta duas condições nas quais podemos alterar os níveis de triglicerídeos séricos.

+

peróxido dehidrogênio

HC O CO R

H2C O CO R

H2C O CO R

triglicerídeo

3 R_COOH +ácidos graxos

HC OH

H2C OH

H2C OH

glicerol

lipases+ ATP glicerolquinase

ADP +

+ O2

HC OH

H2C OH

H2C O P OH

OH

O

glicerol 3-fosfatodiihidroxiacetona fosfato

GPOC O

H2C OH

H2C O P OH

OH

O

+ H2O2

NN

NH2H3C

H3C + 2H2OPOD

OH

Cl

Cl

S

OO

OH+

4-diclorofenol sulfonato(DHBS)

4-aminoantipirina quinonimina

NN

NH3C

H3C

O

HC OH

H2C OH

H2C O P OH

OH

O

glicerol 3-fosfato

59 27a AULA: Determinação de Cálcio Sérico

(RELATÓRIO)

Ca-Color AA: Método colorimétrico direto para a determinação de cálcio sérico SIGNIFICADO CLÍNICO O cálcio é um elemento muito importante na maioria das reações da coagulação sanguínea e a regulação da excitabilidade das fibras musculares. Sua concentração em soro e urina está regulada pela ação de fatores tais como níveis de paratormônio, vitamina D e fósforo; observando-se variações fisiológicas devidas: idade, sexo, gravidez, atividade física, mudanças de estação (pela ação da luz solar). A hipercalcemia está relacionada com diferentes patologias: hipertireoidismo, neoplasias ósseas, intoxicação com vitamina D. A hipocalcemia associa-se com alterações tais como hipotireoidismo, deficiência de vitamina D e deficiência na absorção de cálcio. FUNDAMENTOS DO MÉTODO O cálcio reage com a o-cresolftaleína complexona (o-CPC) em pH 10,8 produzindo um complexo cor vermelho escuro que se mede em espectrofotômetro 570 nm.

o-cresolftaleína complexona

N

O

CO2H

CH3

HO

N

H3C

HO2C

HO2C CO2H

CO2H

REAGENTES FORNECIDOS Reagente de Cor: solução de o-cresolftalein complexona e 8-hidroxiquinolina. Tampão: solução de aminometil propanol (AMP), pH final 10,8. Padrão: solução de cálcio 10 mg/dL. AMOSTRA: Soro. PROCEDIMENTO Em três tubos de ensaio marcados B (Branco), P(Padrão) e A (Amostra) colocar:

Reagentes/Tubos B P A Água destilada 50 µL - - Tampão - 50 µL Amostra - - 50 µL Reagente único 2,0 mL 2,0 mL 2,0 mL Misturar, incubar 5 minutos a temperatura ambiente Absorbância em 570 nm -

CÁLCULOS DOS RESULTADOS:

Cálcio sérico [mg/dL] = absorbância da amostra

absorbância do padrão X concentração do padrão [mg/dL]

VALORES DE REFERÊNCIA: Soro: 8,5 - 10,5 mg/dL. RESULTADOS E CONCLUSÃO: Compare o valor encontrado na dosagem de cálcio com os valores de referência. Verifique se a concentração de cálcio sérico está dentro da faixa de referência, se indica hipocalcemia ou hipercalcemia. E quais as principais causas de alterações dessas concentrações.

60 28a AULA: Determinação de Fósforo

(RELATÓRIO) FINALIDADE Método para a determinação do Fósforo. Teste colorimétrico, somente para uso diagnóstico in vitro. ESPECIFICIDADE DIAGNÓSTICA

A homeostase do fósforo é mantida principalmente pela função renal, absorção intestinal, metabolismo ósseo e função da glândula paratireoide. O fósforo possui função na composição óssea, no equilíbrio ácido-básico, no metabolismo de gorduras e carboidratos, além de estar presente na formação de compostos como os ácidos nucleicos.

Podemos observar valores aumentados de fósforo nas seguintes condições: insuficiência renal (tuberculose renal, glomerulonefrite crônica, hidronefrose, pielonefrite), hipoparatireoidismo, excesso de vitamina D.

A diminuição do nível de fósforo provém de diversas causas como: hipovitaminose D (raquitismo, osteomalácia), ingestão de antiácidos, doenças do fígado, síndrome de Fanconi, hiperparatireoidismo, uso de diuréticos tiazídicos. PRINCÍPIO O fósforo inorgânico reage com molibdato em meio ácido, formando um complexo fosfomolibdato. A adição de uma solução alcalina permite que esse complexo seja reduzido pelo Ácido Ascórbico, dando origem a um novo complexo fosfomolibdato de cor azul. Paralelamente, as proteínas anteriormente precipitadas se dissolvem. REAGENTES Número 1 - Redutor - conservar entre 15 e 30 °C. Contém: Ácido ascórbico 55 mmol/L e estabilizante. Número 2 - Molibdato - conservar entre 15 e 30 °C. Contém: Molibdato de amônio 20 mmol/L. Número 3 - Reagente Alcalino - conservar entre 15 e 30 °C. Contém: Hidróxido de sódio 8 mol/L. Número 4 - Padrão - conservar entre 15 e 30 °C. Contém: Fósforo 5,0 mg/dL AMOSTRAS Soro obtido livre de hemólise, plasma colhido com heparina e urina de 24 horas. A amostra é estável por 7 dias entre 2 e 8 oC. O soro ou plasma devem ser separados até uma hora após a colheita, devido a liberação de fósforo hemático. A acidificação com HCl conserva a urina por 15 dias em temperatura entre 2 e 8 oC. DESCRIÇÃO DO PROCESSO TÉCNICA Marcar 3 tubos de ensaio: B (Branco), A (Amostra), P (Padrão) e proceder como a seguir:

Tubos Branco Padrão Amostra Água destilada 2,5 mL 2,5 mL 2,5 mL Amostra ----- ----- 100 μL Reagente No 4 ------ 100 μL - Reagente No 1 1 gota 1 gota 1 gota

Reagente No 2 1 gota 1 gota 1 gota

Homogeneizar bem e aguardar 2 minutos. Adicionar: Reagente No 3 2 gotas 2 gotas 2 gotas Absorvância ------

Agitar deixar em repouso por 5 minutos (cronometrar). Efetuar as leituras a 650 nm (640 - 670), acertando o zero com o tubo “B” (Branco). A reação de cor é estável por 5 minutos.

61 DESCRIÇÃO DOS CÁLCULOS Soro Fósforo ( mg/dL ) = Absorbância da amostra x 5 Absorbância do padrão LIMITAÇÕES DO PROCESSO O desenvolvimento de cor azulada no tubo Branco indica que a água utilizada é de má qualidade, devendo ser analisada com critério. CONTROLE INTERNO DE QUALIDADE

Deve ser prática rotineira do Laboratório Clínico o uso de soro controle para checar a precisão e exatidão das dosagens.

Deve ser de 5% o erro máximo permitido em relação aos valores pré-estabelecidos para os controles.

VALORES DE REFERÊNCIA Os valores de referência em mg/dL, para o presente método foram obtidos através da determinação de fósforo em populações sadias do sexo masculino e feminino. Soro Adultos........................2,5 a 4,8 mg/dL

NÚMERO DE TESTES 140 Testes/100 μL de amostra RESULTADOS E CONCLUSÃO: Compare o valor encontrado na dosagem de fósforo com os valores de referência. Verifique se a concentração de fósforo sérico está dentro da faixa de referência, se indica hipofosfatemia ou hiperfosfatemia. E quais as principais causas de alterações dessas concentrações. QUESTÃO:

1. Quais os hormônios responsáveis pela regulação dos níveis de fósforo?

62 29a AULA: Determinação de Magnésio no Soro

(RELATÓRIO) FINALIDADE

Método para a determinação do Magnésio. Teste colorimétrico, somente para uso diagnóstico in vitro. ESPECIFICIDADE DIAGNÓSTICA

O magnésio é um eletrólito encontrado principalmente nos líquidos intracelulares e ossos. Participa como cofator em vários sistemas enzimáticos, no metabolismo dos carboidratos, contração muscular, coagulação sanguínea e é indispensável na preservação da estrutura molecular do DNA, RNA e ribossomos.

Níveis de magnésio diminuídos no plasma estão associados com tetania, fraqueza, desorientação e sonolência, que refletem a deficiência do magnésio ionizado.

Quadros clínicos de convulsões associados à hipocalcemia e hipomagnesemia, atribuídos a um defeito seletivo de absorção intestinal do magnésio, acentuam a importância da dosagem deste íon em pediatria.

As causas mais frequentes de concentrações baixas de magnésio são: diarréia crônica, pancreatite aguda, alcoolismo, hepatite crônica, diabetes mellitus, hipoparatireoidismo, hipertireoidismo, hiperaldosteronismo. A hipermagnesemia, embora rara, pode ser registrada nos casos de insuficiência renal, desidratação grave, tratamento intensivo com sais de Magnésio. PRINCÍPIO DE AÇÃO Metodologia: Mann Yoe.

O corante de Mann e Yoe, em pH alcalino e em presença de magnésio desenvolve coloração vermelha. A intensidade de cor vermelha do complexo é proporcional à concentração de magnésio. O método não requer desproteinização, sendo mais sensível do que o método do Amarelo de Titan, permitindo assim o uso de somente 20 microlitros da amostra a ser analisada, o que torna esta técnica excelente para uso em pediatria. Além de sua simplicidade, o método não sofre interferência do Gluconato de cálcio. A presença de agentes tensoativos elimina a interferência de soros lipêmicos. REAGENTES Número 1 - Tampão - conservar entre 15 e 30 °C. Contém: Tetraborato de sódio 30 mmol/L e conservador. Número 2 - Reagente de Cor - conservar entre 15 e 30 °C. Contém: Magon sulfonado 2,8 mmol/L e solubilizante. Número 3 - Padrão - conservar entre 15 e 30 °C. Após o manuseio conservar entre 2 e 8 ºC para evitar evaporação. Contém Magnésio 2 mg/dL AMOSTRA: Soro obtido livre de hemólise. DESCRIÇÃO DO PROCESSO Marcar 3 tubos de ensaio: B (Branco), A (Amostra), P (Padrão) e proceder como a seguir:

B P A Reagente No1 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL Reagente No 2 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL

Homogeneizar bem Amostra - - 20 μL

Reagente No 3 - 20 μL - Absorbâncias em 500 nm -

63 CÁLCULOS

Magnésio [mg/dL] = absorbância da amostra

absorbância do padrão X 2

VALORES DE REFERÊNCIA Os valores de referência em mg/dL, para o presente método, foram obtidos através da

determinação de magnésio em populações sadias do sexo masculino e feminino. Soro ou plasma: 1,6 a 2,4 mg/dL Para converter os valores de mg/dL em mmol/L (SI) multiplicar por 0,41. RESULTADOS E CONCLUSÃO: Compare o valor encontrado na dosagem de magnésio com os valores de referência. Verifique se a concentração de magnésio sérico está dentro da faixa de referência, se indica hipermagnesemia ou hipermagnesemia. E quais as principais causas de alterações dessas concentrações. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1 - MANN, C. K. & Yoe, J. H.: Ann. Chem. 28:202, 1956. 2 - MANN, C. K. & Yoe, J. H.: Anal. Chim. Acta. 16:155, 1957. 3 - RICE, E. W. & LAPARA, C. Z.: Clin. Chim. Acta. 10:260, 1964. 4 -WEISSMANN, N. & PILEGGI, V. J. (1974) in Clinical Chemistry Principles and Techinics 2nd.

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Casa de São Paulo. Editora Atheneu, São Paulo, 2011.

3. COMPRI-NARDY, M.; STELLA, M. B.; OLIVEIRA, C. Práticas de laboratório de bioquímica e

biofísica. Uma visão Integrada. Editora Guanabara Koogam. Rio de Janeiro, 2009.

4. DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA. UFPR/PR. Bioquímica celular, APOSTILA, 1980.

5. DEPARTAMENTO DE QUÍMICA-CCE.UEL/PR. Apostila de prática de bioquímica, 1987.

6. DEPARTAMENTO DE FÍSICA E QUÍMICA. USP/Ribeirão Preto – SP. Práticas de bioquímica,

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8. MASTROENI, M. F.; GERN, R. M. M. Bioquímica práticas Adaptadas. Editora Athenue. São

Paulo, 2008.

9. NEPOMUCENO, M. F.; RUGGIERO, A. C. Manual de bioquímica – roteiros de análises

bioquímicas qualitativas e quantitativas. Editora Tecmedd. Ribeirão Preto – SP. 2004

10. REMIÃO, J. O. R.; SIQUEIRA, A. J. S.; AZEVEDO, A. M. P. Bioquímica: Guia de aulas práticas.

EDIPUCRS, 2003

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