PROCESSO FERMENTATIVO

PRINCIPAIS PARÂMETROS OPERACIONAIS

PARÂMETROS OPERACIONAIS

Agitação/

Aeração

Concentração

do inóculo

pH

Temperatura

Composição

do meio

NUTRIENTES

Classificação quanto a concentração mínima

Requerida para o crescimento ótimo

Macronutrientes

C, N, O, H, S, P,

Mg2+ e K+

Micronutrientes

Mo2+, Zn2+, Cu2+, Mn2+,

Fe2+, Ca2+, Na2+, vitaminas

e hormônios de

crescimento

Custos relevantes

C e N; O

NUTRIENTES Os oito elementos macronutrientes e funções fisiológicas

Elemento Funções fisiológicas e fração da massa seca de

Escherichia coli

Concentração

requerida (M)

Carbono Constituinte de material orgânico celular.

Freqüentemente fonte de energia – 50%

10-2

Nitrogênio Constituinte de proteínas, ácidos nucléicos e

coenzimas – 14%

10-3

Hidrogênio Material orgânico celular e água – 8% -

Oxigênio Material orgânico celular e água. Requerida para

respiração aeróbia – 20%

-

Enxofre Principal íon inorgânico na célula e cofator – 1% 10-4

Fósforo Constituinte de ácidos nucléicos, fosfolipídeos,

nucleotídeos e certas enzimas – 3%

10-4 – 10-3

Potássio Principal cátion inorgânico na célula e cofator para

algumas enzimas – 1%

10-4 – 10-3

Magnésio Cofator para diversas enzimas presente em

paredes celulares e membranas – 0,5%

10-4 – 10-3

MEIOS DE CULTURA

Composição dos Meios de Cultura

Meios sintéticos Meios Complexos

Composição química é

qualitativa

e quantitativamente

conhecida

Meios contendo um ou mais

produtos cuja composição

química não é

perfeitamente definida

PROCESSO FERMENTATIVO GENÉRICO

Preparo

do

Inóculo

Ar/Esterilização

Fermentação

Preparo do meio

de cultura/

Esterilização

Controle

Resíduos Sub-produtos Produtos

Processos de

Separação,

Purificação e

Tratamento

Fase de

Laboratório

Fase

Industrial

PREPARO DO INÓCULO

Inóculo: suspensão celular com concentração adequada para garantir a fermentação de um dado volume de mosto, em condições econômicas Volume do inóculo: 0,5 a 50% da capacidade útil do fermentador

Incubação

Incubação

Incubação

Cultura

pura

Volume de

meio = V1

Volume de

meio = V2> V1

Volume de

meio = V3> V2

Fase de

Laboratório

Fase

Industrial

Dornas

Volume de

meio = V4> V3

Volume de

meio = V5> V4

Representação Esquemática: Preparo do Inóculo

Curva Típica de Crescimento Celular em Batelada

A B C D E

m= m MAX m< m

MAX

m=0 m< m

MAX

m=0 m< m MAX

Tempo de Cultivo

Log

(nú

mer

o c

élu

las

viá

veis

/ m

l) F

A: fase de latência ou lag B: fase de aceleração C: fase log ou exponencial D: fase de desaceleração E: fase estacionária F: fase de declínio ou morte celular

m = (1/X) dX/dt

m - taxa específica de crescimento celular:

CRESCIMENTO CELULAR EM BATELADA: FASE LAG

Adaptação ao novo ambiente: reorganização dos constituintes

moleculares das células

Fatores que aumentam a duração da fase lag:

• inóculo com concentração celular reduzida;

• baixa concentração de nutrientes e de fatores de

crescimento no meio de cultura;

• inóculo com idade avançada.

Crescimento diáuxico: alterações metabólicas.

A fonte de carbono de mais fácil utilização (C1) reprime a

síntese de enzimas requeridas para o metabolismo da

fonte (C2).

tempo

log (no de

células)

utilização

da fonte C1

CRESCIMENTO CELULAR EM BATELADA: FASE LAG

CRESCIMENTO CELULAR EM BATELADA: FASE LOG

dX/dt = m X X: concentração celular

t: tempo de cultivo

m = mmax

td = (ln 2)/mmax

Período de crescimento balanceado:

• A composição média das células permanece aproximadamente constante;

• Formação de metabólitos primários;

• Crescimento celular independe da concentração de substratos.

Crescimento exponencial de primeira ordem:

Tempo de duplicação da biomassa (td):

A massa celular e o número de células aumentam

exponencialmente com o tempo

CRESCIMENTO CELULAR EM BATELADA: FASE DE DESACELERAÇÃO

Período de crescimento desbalanceado.

O stress induzido pela exaustão de um nutriente ou pelo

acúmulo de resíduos.

Reestruturação microbiana para aumentar a

sobrevivência em ambiente hostil.

CRESCIMENTO CELULAR EM BATELADA: FASE ESTACIONÁRIA

Não há crescimento celular líquido

Ocorre catabolismo de reservas celulares:

Produção de energia e novos blocos construtores

Fenômenos que podem ocorrer durante a fase estacionária:

• A massa celular mantém-se constante, com redução no número de

células viáveis.

• Lise celular, com redução no número de células viáveis. Produtos

da lise celular: nutrientes para as células viáveis remanescentes.

• Células metabolicamente ativas produzem metabólitos

secundários.

CRESCIMENTO CELULAR EM BATELADA: FASE DE DECLÍNIO OU MORTE CELULAR

A morte celular resulta da diminuição da concentração de nutrientes e do acúmulo de produtos tóxicos:

dN/dt = -k’ X

Forma integrada:

N = Ns e-k’t

onde: N: concentração de células viáveis

Ns: concentração de células viáveis no final da

fase estacionária

k’: constante da taxa de morte

PERFIS CINÉTICOS

Velocidades

Instantâneas

DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO CELULAR

Métodos Diretos: Determinação da

população total e/ou do número de células viáveis

Método de plaqueamento;

Medida da massa seca

DETERMINAÇÃO DA

CONCENTRAÇÃO DE CÉLULAS

MÉTODOS

Diretos: determinação da população total e/ou do

número de células viáveis (sujeitos a interferentes)

Indiretos : baseados na medida de consumo de

substrato e/ou na formação de produtos

DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO CELULAR

MÉTODOS DIRETOS

1. Método da Câmera de Neubauer ou Hemocitômetro

A suspensão celular, colocada em uma câmara de volume

conhecido, é observada no microscópio óptico.

- aplicável a meios de cultura sem outras partículas suspensas;

- pode-se usar corantes para se distinguir entre células vivas e

mortas (células totais e células viáveis);

- adequado para células não agregadas.

profundidade: 0,1 mm

1 mm X 1 mm X 0,1 mm = 0,1 mL

DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO CELULAR

Exemplo da Análise da Viabilidade Celular com o Auxílio de Corantes:

Avaliação de Mudanças Morfológicas Associadas à Morte Celular

Empregando Laranja de Acridina (LA) e Brometo de Etídio (BE)

Fundamento:

LA: capaz de penetrar no interior da

célula, independentemente da

integridade da membrana,

intercalando-se nas fitas duplas de

DNA e emitindo fluorescência verde.

BE: não é capaz de permear através

da membrana, penetrando somente

em células não viáveis. É capaz de se

intercalar com as bases das fitas

duplas de DNA, resultando em

fluorescência laranja.

Em verde: células viáveis

Em laranja: células apoptóticas

Fonte:

www.cmj.org/paper_journal/04/07/04/7c2.jpg

MÉTODOS DIRETOS 2. Método de Plaqueamento Placas de Petri com meio de cultura gelificado são usadas para

a contagem de células viáveis (capazes de se reproduzir)

~ 25 gerações colônia visível a olho nu

Células metabolicamente ativas podem não formar colônias

se o meio e as condições de cultura não forem adequados

Método adequado para bactérias e leveduras

MÉTODOS DIRETOS

3. Medida da Massa Seca

Aplicável a meios de cultura sem outras partículas

suspensas.

Centrifugação

Filtração

Secagem

80oC, 24 h

Determinação

rápida:

volume empacotado

Massa

seca

celular

DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO CELULAR

Monitoramento de componentes intracelulares:

DNA, proteínas, RNA, ATP, NADH E outros

Quantificação de substratos:

Oxigênio, fontes de carbono, fontes de nitrogênio

Quantificação de produtos:

Etanol e ácido lático (processos anaeróbios);

CO2 (processos aeróbicos);

H+ (queda no pH resultante do uso de amônio)

Monitoramento da viscosidade:

Aumento: Crescimento de micélios

Formação de polissacarídeo extracelular

Redução: substrato = polímero biodegradável

Métodos Indiretos: Baseados na medida de consumo de

substrato e/ou na formação de produtos

Caracterização dos Microrganismos

Na natureza: m.o. existem em culturas mistas

Determinação das características de um m.o. Cultura pura

População Microbiana - muitas espécies diferentes

Quais os tipos de m.o. presentes?

Isolamento – Enumeração – identificação

TÉCNICA DE ESGOTAMENTO POR ESTRIAS