6-Biologia de Microrganismos

Biologia de Microrganismos

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UNIDADE 1 INTRODUO MICROBIOLOGIA

Prof. Jos Soares do Nascimento

1. QUEM SO OS MICRORGANISMOS?

Os microrganismos so organismos microscpicos, impossvel de serem observados a olho nu (vrus 1nn, bactrias 1m, e fungos 100m de dimetro). Embora, alguns, em determinadas fases de seu crescimento atingem tamanho macroscpicos, a exemplo dos fungos conhecidos como cogumelos, que chega a formar um falso tecido. Quem so os microrganismos? Esta uma curiosidade comum para quem nunca deu ateno a estes seres microscpicos. Os mais estudados na Microbiologia so as bactrias, fungos, vrus e algumas algas (Figura 1). Alm destes, protozorios, helmintos, caros so estudados em Parasitologia.

Figura 1- Exemplos de microrganismos estudados em Microbiologia: 1. Vrus e 2. Bactrias (modelos didticos); 3. Fungos (fotografados in situ); 4. Algas (atravs de microscopia).

Fonte: NASCIMENTO, J.S. (2010)

2. OS MICRORGANISMOS SO SERES UBQUOS

Os microrganismos habitam os mais diversos locais. Esta propriedade denominada de ubiquidade. Habitam os diferentes ecossistemas, fazem parte da microbiota normal do corpo humano, dos animais e das plantas, aos milhes, em termos de quantidades. Entre estes organismos so estabelecidas relaes em diferentes graus de parasitismo, mutualismo e comensalismos. So tambm patgenos causadores de doenas e deteriorao de equipamentos e alimentos, quando no devidamente limpos ou mal armazenados, respectivamente.


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PERGUNTAS???

1. Em que partes de sua casa, voc acha que tem mais microrganismos e onde existem menos?

2. A galinha vem do ovo. E os microrganismos vm de onde?

3. MODO DE VIDA DOS MICRORGANISMOS

Todos os microrganismos so benficos de alguma forma. Entretanto, destes um total de 3% podem causar danos aos demais organismos. Neste sentido, os microrganismos so divididos em diferentes grupos, conforme o seu modo de vida, sendo estes alguns deles:

a) Saprbios (saprfitos): comensais ou decompositores de substncias orgnicas mortas; So tambm conhecidos como microrganismos recicladores. Entre estes, muitos podem desenvolver o parasitismo facultativo.

b) Parasitos: causam danos as clulas vivas de outros organismos. O parasitismo se manifesta em diferentes graus, desde o parasito obrigatrio ao hiperparasitismo. No parasitismo obrigatrio h uma completa dependncia do hospedeiro para a sua multiplicao; no parasitismo mltiplo sobrevive em vrios hospedeiros e no parasito facultativo existe outro modo de vida que o saprofitismo. J no hiperparasitismo ocorre parasitismo no mesmo grupo.

c) Simbiontes: estabelecem relaes em diferentes graus, desde as mais prximas (simbiose mutualstica, onde h interao morfolgica e fsica entre dois organismos, a exemplo dos lquenes e das micorrizas) at as mais antagnicas (tipo de relao onde um deles prejudicado em detrimento do outro).

FIQUE DE OLHO!!!

Alguns microrganismos so incapazes de causar doenas no hospedeiro, a exemplo da levedura Saccharomyces cerevisae. Os que so oportunistas podem causar doenas na dependncia do sistema imunolgico do hospedeiro. Outros se comportam de forma facultativa, ou seja, so saprfitos, porm, em determinadas condies tornam-se patgenos. Alm destes, existem os que so estritamente patognicos, onde a presena dele no hospedeiro est sempre associada doena, como a Nesseria gonorrhoeae, causadora da gonorreia.

Para ocorrer uma doena infecciosa necessrio algumas etapas importantes: a) Inculo: haver um nmero suficiente de microrganismos capaz de invadir o hospedeiro; b) Colonizao ou infeco: estabelecimento e multiplicao do microrganismo no local da

infeco. A entrada do patgeno/toxina no hospedeiro pode ocorrer diretamente na


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corrente sangunea ou nos rgos internos. Pode haver infeco endgena por microrganismos da prpria microbiota e exgena por patgenos adquiridos;

c) Intoxicao: o hospedeiro recebe o fator (ex. toxina) causal da doena, conhecida como intoxicao alimentar;

d) O microrganismo pode ser eliminado do hospedeiro por algum mecanismo de defesa e no causar a doena;

e) Doena infecciosa: quando o microrganismo passa a expressar seus fatores de patogenicidade (estrutural, enzimas ou toxinas) no hospedeiro, alterando a funcionalidade normal da clula, tecido ou rgos.

4. CLASSIFICAO DAS BACTRIAS As bactrias pertencem ao reino Monera segundo a classificao de Whittaker, em 1969.

Woese, em 1978, agrupa os organismos em domnios (Figura 2), seguindo a organizao filogentica (MURRAY, 2005). Sendo assim, h trs domnios: Eubactria (bactrias verdadeiras), Archea (bactrias de composio qumica e formas distintas, habitantes de ambientes extremfilos) e Eucaria (fungos, algas, protistas, plantas e animais).

Figura 2- Os trs domnios filogenticos, segundo Woese (1978).

Fonte: http://pt.wikipedia.org/wiki/%C3%81rvore_filogen%C3%A9tica


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UNIDADE 2 MEIOS DE CULTURA UTILIZADOS PELOS MICRORGANISMOS

1. INTRODUO Os microrganismos necessitam de uma variedade de substncias nutritivas capazes de

promover o seu crescimento. Esses elementos so necessrios para a sntese e para as funes normais dos componentes celulares. No ambiente, os microrganismos encontram os nutrientes nas formas de compostos orgnicos e/ou inorgnicos. Desta forma, podem desenvolver-se em meios inteiramente inorgnicos, outros em meios orgnicos ou mistos.

2. COMPONENTES DOS MEIOS DE CULTURA

Os microrganismos necessitam de fontes de energia, fontes de carbono, fontes de nitrognio, sais minerais, gua, fatores de crescimento (vitaminas e outras substncias). Estas substncias so fornecidas a partir de fontes orgnicas e/ou inorgnicas.

Como principio bsico, o meio de cultura deve ser o mais prximo das condies reais onde habita o microrganismo, para que este cresa satisfatoriamente. Existem microrganismos que crescem em diversos meio de cultura, outros crescem apenas em meios especiais. Sendo assim, no existe um meio de cultura universal, de forma que cada microrganismo tem suas exigncias nutricionais.

3. CLASSIFICAO DOS MEIOS DE CULTIVO 3.1. QUANTO CONSISTNCIA

Meio lquido: sem agente solidificante, apresentando-se como caldo. O meio distribudo em tubos de ensaio, erlenmeyers, balo; Mais utilizado para o crescimento massal ou provas bioqumicas, em fermentao industrial etc.

Meio semi-slido: adiciona-se uma pequena quantidade de agente solidificante (0,5 a 1% de gar). Apresenta uma consistncia intermediria, sendo distribudo em tubos de ensaio. Utilizado para o teste de motilidade, como exemplo.

Meio slido: contm maior quantidade de agente solidificante (1,5 a 2,0%). Apresenta uma consistncia slida e pode ser distribudo tanto em tubos de ensaio (meio inclinado), quanto em placas de Petri. Utilizado para diversas finalidades, sendo o meio indicado para observao da morfologia colonial. A substncia solidificante utilizada nos meios o gar, extrado de algas vermelhas

(Gelidium corneum alga marinha japonesa) a 80C com cido sulfrico diludo (H2SO4). Esse o agente solidificante mais usado, sendo considerado tambm o melhor, porque se funde temperatura de fervura e solidifica a 42-45C. Portanto, deve ser distribudo entre 50-60oC, antes de solidificar. O gar ainda um excelente agente gelatinizador porque no degradado por microrganismos, sendo um polmero composto principalmente por D-galactose, 3,6-anidro-L-galactose e cido D-glucurnico.


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3.2. QUANTO FUNO

Meios simples: meios de cultura, nos quais os componentes possuem todas as fontes de nutrientes requeridas pelos microrganismos mais comuns e menos exigentes nutricionalmente. Ex: gar nutriente ou caldo nutritivo.

Meios seletivos: promovem o crescimento de um determinado microrganismo em detrimento de outros, devido presena de substncias adicionadas ao meio de cultura ou a condio de cultivo. Alguns meios seletivos possuem corantes na sua composio, feniletanol e antibiticos, que inibem determinados grupos de organismos. Ex: gar MacConkey (contm sais biliares e cristal violeta para inibir o crescimento de bactrias Gram-positivas, permitindo, portanto, o crescimento de bactrias Gram-negativas); o meio de Chapman ou gar manitol possui alta concentrao de cloreto de sdio (NaCl 7,5%), para selecionar bactrias halfitas (vivem em alta concentrao de sal), adequado para o isolamento de Staphylococcus; o Meio Sabouraud muito utilizado no cultivo de fungos, devido sua composio desfavorvel para bactrias, em funo do pH e concentrao de acares; meio batata-dextrose-gar (BDA) acidificado que seletivo apenas para fungos em funo do pH.

Meios enriquecidos: meios convencionais enriquecidos com um ou mais componentes qumicos, que favorea o crescimento de determinados microrganismos numa populao mista. Meios mais indicados para microrganismos fastidiosos. Ex: gar-sangue e gar chocolate, ambos utilizados no crescimento de Streptococcus, Neisseria e Haemophilus.

Meios diferenciais ou indicadores: so utilizados para diferenciar microrganismos entre os vrios tipos que crescem numa mesma placa de Petri. Ex: meio gar MacConkey, alm de selecionar o grupo de bactrias Gram-negativas como visto por ser seletivo, permite uma diferenciao entre as mesmas pela produo de cido, baseada na utilizao da lactose presente no meio. Bactrias que utilizam lactose acidificam o meio e as colnias ficam na cor vermelha ou rosa, enquanto as demais no adquirem essa colorao. Meio de Chapman tambm um meio diferenciador, pois contm manitol. Quando a bactria utiliza esse polissacardeo como fonte de C o meio, originalmente vermelho, muda de cor para amarelo. Entre as espcies de estafilococos apenas S. aureus fermenta manitol.

Meios de transporte: estes meios conservam as caractersticas da amostra desde a coleta ao semeio final. Este meio muito utilizado para bactrias sensveis ao deslocamento, evitando, muitas vezes a inativao da bactria, em ambiente longe do laboratrio. Ex. meio Stuart.

Meio de manuteno: utilizado na manuteno de amostras de bactrias. So meios pobres em nutrientes, nos quais as bactrias no podem crescer muito, para evitar a formao de compostos txicos.

3.3. QUANTO NATUREZA

Natural: so preparados com base em produtos naturais, como: peptona, extrato de carne, soro, leite, folhas, frutos etc. Neste, a quantidade exata de cada nutriente no especificada.

Sintticos: so quimicamente definidos, onde a quantidade exata de cada nutriente ou elemento qumico conhecido, permitindo saber se um elemento em particular essencial para o crescimento de determinado microrganismo (fator de crescimento).

Mistos ou semi-sinttico: meios preparados com a mistura dos naturais com os sintticos.


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FIQUE LIGADO!!!

No existe um meio de cultura universal, ou seja, cada microrganismo tem sua exigncia.

A classificao dos meios de cultura tem fins meramente didticos. Como observado, um mesmo meio pode ter mais de uma funo.

PRTICA 1- ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS

1. Materiais:

Placas de Petri com meios de cultura (slido). Swab (zaragatoa) estril para coleta de microrganismos. gua esterilizada em tubo de ensaio. Bico de Bunsen

2. Procedimento:

Umedecer o swab na gua e preparar para a coleta de microrganismos; Selecionar o local especfico para coleta, sendo um da microbiota humana e outro do

ambiente; Coletar os microrganismos ao friccionar suavemente o swab sobre o local ou superfcie

de coleta. Colocar o swab de volta no tubo de ensaio; Com o bico de Bunsen aceso, prximo chama, abrir a placa de Petri e semear

suavemente, friccionando o swab sobre a superfcie do meio de cultura; Identificar o local de coleta e a data na tampa da placa de Petri; Incubar as placas em estufa durante 48h (36oC para as da microbiota humana e 25oC para

os do ambiente). As placas so incubadas invertidas, com a base para cima; Depois de incubadas, observar a morfologia colonial: diversidade, cor, tamanho, bordas,

consistncia etc. sem abrir a placa de Petri ou se abrir, sempre prximo ao bico de Bunsen.


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UNIDADE 3 MORFOLOGIA MICROBIANA

As bactrias apresentam uma morfologia simplificada, sendo a maioria em formas comuns: cocos, bacilos e espiralados e outras em formas especiais: quadradas e estreladas (Figura 3). Destas, as trs primeiras so as mais estudadas, pois compreende as bactrias de interesse na rea da sade e da indstria, sendo as mais comuns. As outras duas formas so de ocorrncia ambiental e so raramente notificadas.

Figura 3- Diversidade da morfologia bacteriana: 1. cocos, 2. bacilos, 3. vrgula, 4. rspirilo, 5. espiroqueta, 5. estrela, 7. quadrada, 8. Cocobacilo

1) 2) 3) 4)

5) 6) 7) 8) Fonte: TORTORA, FUNKE, CASE (2003).

De natureza unicelular, alguns destes procariotos podem, em determinadas condies ambientais, se agregar e formar pednculo frutificativo ou estruturas reprodutivas diferenciadas da clula vegetativa, a exemplo do que ocorre em Myxococcus fulvus e nos actinomicetos, que se assemelham aos fungos no padro de crescimento.

Os cocos so estruturas esfricas, medindo, em mdia, 0,5-3m de dimetro. Exemplo de cocos: Staphylococcus, Streptococcus, Micrococcus, Neisseria. Conforme o plano de diviso e as caractersticas genticas os cocos so agrupados em diversos arranjos caractersticos: a) diplococos: forma cocos aos pares; estreptococos: cocos em cadeia com trs ou mais clulas; c) ttrade: quatro clulas unidas entre si; d) sarcina: oito clulas em formato de cubo e, e) estafilococos: cocos em cacho de uvas (Figura 4).

Figura 4- Arranjos formados pelos cocos e bacilos.

Diplococo Estreptococo Ttrade Estafilococo Sarcina Fonte: NASCIMENTO, J.S. (2010)

Os bacilos so em forma de bastonetes, curtos ou longos, com dimetro mdio de 0,5m e comprimento varivel de 1m ou mais. Exemplo de bacilos: Escherichia, Psudomonas, Bacillus,


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Clostridium, Rhizobium, Agrobacterium, Nitrosomonas, Nitrobacter, Xanthomonas. Algumas bactrias apresentam-se na forma de bastonetes curtos, intermedirias entre cocos e bacilos, de aspecto ovide, denominadas de cocobacilo. Os bacilos apresentam apenas um plano de diviso, os quais formam os arranjos: a) diplobacilo: aos pares e; b) estreptobacilo: com trs ou mais clulas (Figura 5). Alm destes arranjos, alguns bacilos se apresentam em forma de letra chinesa e paliada (Corynebacterium). Muitos tambm no formam arranjos caractersticos, permanecendo isolados.

Figura 5- Arranjos formados pelos bacilos e os arranjos especiais do Gnero Corynebacterium.

Diplobacilo Estreptobacilo

Letra chinesa (caracteres)

Chinesa e paliada (bacilos paralelos) Fonte: NASCIMENTO, J.S. (2010)

As formas espiraladas compreendem: a) vibrio: bacilos curvos em forma de vrgula (Vibrio cholerae); b) espirilo: bastonete rgido de forma helicoidal; e c) espiroquetas: tambm helicoidal, porm com vrias espirais e flexvel, contendo filamento axial (Leptospira, Treponema). Os espiroquetdeos dividem-se ao meio e no formam arranjos caractersticos (Figura 6).

Figura 6- Bactrias espiraladas (espiroquetdeos).

Vibrio

Espirilo

Espiroqueta Fontes:

1. http://dhiez.files.wordpress.com/2008/05/cholera.jpg 2.http://www.steadyhealth.com/articles/user_files/11361/Image/Helicobacter%20The%20Bact

eria%20that%20Cause%20Ulcers.jpg 3. http://www.japantimes.co.jp/images/photos2008/nn20081021a8a.jpg


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SAIBA MAIS!!!

No ambiente, geralmente, os microrganismos se apresentam isolados.

A maioria das bactrias no forma agrupamentos tpicos. Se na observao microscpica aparecerem cocos isolados

e um ou mais em arranjo de dois a dois, trata-se de diplococos.


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UNIDADE 4 CITOLOGIA BACTERIANA

1.ESTRUTURAS ESSENCIAIS

As bactrias, por serem procariotos, apresentam uma organizao celular simplificada, sem organelas. A principal caracterstica ter o material gentico sem carioteca (Figura 7) e sem histonas, enquanto os eucariotos apresentam tais elementos. simplesmente constituda por uma parede celular, membrana citoplasmtica, citoplasma, material nuclear, ribossomos e as estruturas no essenciais tais como cpsula/glicoclice, flagelo, fmbrias, plasmdeos, endsporo e incluses. As estruturas essenciais so consideradas como sendo aquelas indispensveis multiplicao microbiana, enquanto as estruturas no essenciais so encontradas apenas em algumas bactrias e no interferem na multiplicao das mesmas. Uma exceo so os micoplasmas, que so desprovidos de parede celular, fugindo a regra da essencialidade.

Figura 7- Clula de procarioto, indicando as estruturas que compe a clula.

Fonte: MIMS et al. (1995), modificado.

1.1 PAREDE CELULAR

A maioria das bactrias apresenta parede celular, exceto micoplasmas, que so intracelulares. A parede celular varivel em sua composio qumica o que determina a existncia de grupos de bactrias, denominadas de Gram positivas, Gram negativas (Figura 8) e BAAR (bacilo lcool cido resistente), (Figura 9) entre as mais estudadas.

A parede celular um revestimento rgido que confere forma clula, maior resistncia s adversidades da presso osmtica e constitui-se uma estrutura antignica (antgeno O), que caracterizam e diferenciam tais bactrias.


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Figura 8- Parede celular de bactria: 1- Gram positiva, 2- Gram negativa

Fonte: MIMS et al. (1995), modificado.

Figura 9- Parede celular de micobactria (BAAR).

Fonte: ACTOR (2007), modificado.

As bactrias Gram positivas apresentam uma parede com vrias camadas de peptideoglicano (murena), composta por subunidades alternadas de N-acetilglicosamina (NAG) e N-acetilmurmico (NAM). Estas molculas so ligadas de forma cruzada por tetrapeptdeos conferindo maior rigidez a parede. Encontra-se ainda na parede o cido teicico constitudo por um carboidrato fosfato e um lcool (glicerol ou ribitol). A maioria dos cocos de importncia clnica (Staphylococcus, Streptococcus, Micrococcus, Enterococcus) Gram positiva, exceto Neisseria, Bordetella etc.


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A estrutura da parede clulas das bactrias Gram negativas mais complexa. Apresenta uma camada mais estreita de peptideoglicano e a membrana externa. O peptideoglicano localiza-se no espao periplasmtico, que compreende o espao entre a membrana externa e a membrana celular. A membrana externa um lipopolissacardeo (LPS), sendo a poro lipdica uma endotoxina comum a todas Gram negativas. A membrana externa tambm contm protenas integrais lipoprotenas, protenas de ligao e porinas. A maioria dos bacilos de importncia clnica (Escherichia, Samonella, Vibrio, Shigella, Pseudomonas etc) Gram negativa, exceto os gneros Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Lactobacillus.

A parede celular das micobactrias (Mycobacterium tuberculosis, M. leprae) constituda tambm de peptideoglicano, porm revestido por uma camada de cido miclico, o que torna esta parede impermevel entrada de corantes bsicos, denominadas de BAAR, por ser resistente a descolorao pelo lcool-cido, depois de coradas pela fucsina de Zehl-Neelsen. Esta bactria no se cora pela tcnica de Gram. tambm uma bactria muito resistente ao ressecamento e desidratao.

A parede celular das bactrias Gram positivas sensvel ao da lisozima encontrada na lgrima e do muco. Sensvel tambm aos antibiticos -lactmicos, conforme ser explicado na unidade correspondente.

1.2 MEMBRANA CITOPLASMTICA

A membrana plasmtica reveste o citoplasma, controlando o fluxo de entrada ou de sada de todas as substncias na clula, atravs das protenas de transportes. tambm responsvel pelo transporte de eltrons e a produo de energia. Apresenta constituio fosfolipdica, formando uma bicamada fluida bipolar, com ausncia de esteris, exceto para os micoplasmas (Figura 10). Na superfcie, a camada de fosfato hidroflica e internamente hidrofbica.

Na membrana existe ainda o mesossoma (Figura 7), que nada mais que uma invaginao da membrana, com funo importante durante o processo de multiplicao bacteriana, ao se ligar e separar os cromossomos durante a diviso celular.

Figura 10- Membrana citoplasmtica

Fonte: TORTORA, FUNKE, CASE (2003), modificado.

1.3 CITOPLASMA

O citoplasma constitudo por substncia aquosa, contendo protenas e enzimas. Destaca-se o material nuclear, os ribossomos e as incluses que esto imersos no citoplasma.

1.4 MATERIAL NUCLEAR

O material nuclear encontra-se disperso no citoplasma, constitudo de uma fita dupla, circular de DNA (Figura 7). Neste cromossomo esto contidas todas as informaes genticas


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essenciais. No contm histonas e no envolvido por membrana nuclear, ao contrrio das clulas eucariticas.

1.5 RIBOSSOMOS

Os ribossomos so protenas (RNA ribossmico ou rRNA) de aspecto granular, constitudos por duas unidades, responsveis pela sntese protica. So encontrados centenas a milhares deles dispersos no citoplasma, porm podem diminuir em quantidade, conforme a atividade da bactria.

As bactrias formam ribossomos 70S (Unidade Svedberg = velocidade relativa de sedimentao). No entanto, cada subunidade separada mede 50S e 30S (Figura 11).

PERGUNTAS???

1. Comparando a parede celular de uma bactria a uma parede de uma casa, o que representaria os tijolos, as armaes de arame e o reboco?

2. Qual a diferena entre os cidos teicico e lipoteicico?

3. Qual o mecanismo da colorao de Gram?

Figura 11- Ribossomos de procarioto.

Fonte: http://www.redeeduca.com.br/editor/assets/codon.jpg

2. ESTRUTURAS NO ESSENCIAIS

As estruturas no essenciais so aquelas que apenas algumas bactrias apresentam, consideradas no vital a sua multiplicao. Estas estruturas conferem bactria funes adicionais, importantes a sua sobrevivncia, interao com o hospedeiro e metabolismo.


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2.1 CPSULA OU GLICOCLICE

As bactrias secretam substncias denominadas de cpsula ou glicoclice que se acumulam externamente a parede celular (Figura 12). So substncias mucoides, viscosas, constitudas de polissacardeos, exceto no gnero Bacillus anthracis, que constitudo por cido poli D-glutmico (polipeptdeo).

Para ser considerada cpsula, o material mais organizado e mais fortemente aderido parede. J quando fracamente aderido e de natureza amorfa, denomina-se de glicoclice. Em ambos, estas substncias tm como principal funo ser uma estrutura antifagocitria. Atuam tambm como barreira contra a difuso de solutos, so substncias de reservas, aumenta a aderncia e a formao de biofilme. A formao de biofime favorece tambm a agregao das bactrias. A bactria Streptococcus mutans formadora de biofilme (glicoclice), propriedade importante na formao da crie dentria.

Figura 12- Cpsula bacteriana.


2.2 FLAGELO

Algumas bactrias possuem flagelos, constitudos por protena denominada de flagelina, os quais conferem motilidade. Esta estrutura constituda de um corpo basal (onde se insere at a membrana plasmtica), um gancho (rgido e com movimentos giratrios) e o filamento longo em forma de chicote (Figura 13).

Quanto distribuio de flagelos as bactrias so classificadas em: (Figura 14). a) Monotrquio: um flagelo em uma das extremidades; b) Anfitrquio: um flagelo em cada extremidade; c) Lofotrquio: dois ou mais flagelos em um dos polos; d) Peritrquio: flagelos em toda a superfcie.

Algumas espiroquetas (bactrias espiraladas, Ex. Treponema, Leptospira) possuem um flagelo diferenciado, denominado de filamento axial. Este filamento em forma de espiral, em torno da clula, revestido por uma bainha, possibilitando a bactria movimentar-se em forma de saca-rolha (Figura 15). A bactria com flagelo desloca-se de forma aleatria ou em funo de respostas a fototaxias ou a quimiotaxias.


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Figura 13- Partes do flagelo e insero deste na parede celular

Fonte: TORTORA, FUNKE, CASE (2003)


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Figura 14- Classificao quanto localizao dos flagelos

Fonte: TORTORA, FUNKE, CASE (2003).

PERGUNTAS???

1. As bactrias apresentam quimiotaxia e fototaxia?

2. Quando as bactrias se deslocam como muitos giros (ziguezagues), o que isso poderia significar?

3. D as funes das estruturas essenciais e das no essenciais?


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Figura 15- Localizao do filamento axial nos espiroquetdeos

Fonte: TORTORA, FUNKE, CASE (2003), modificado.

2.3 FMBRIAS E PILI

As fmbrias so pequenos filamentos proticos (protena pilina) semelhantes pelos em torno da parede celular (Figura 16). A funo das fmbrias de aderncia, favorecendo a colonizao do hospedeiro. A quantidade e a distribuio de fmbrias so bastante variveis.

Algumas bactrias apresentam uma fmbria especial, denominada de pili (pili sexual), pelo qual a bactria transfere cpias do plasmdeo para outras bactrias, durante a conjugao. mais longo que as fmbrias comuns, sendo codificado por um plasmdeo F ou plasmdeo conjugativo.

Figura 16- Bactrias com fmbrias (1) e com a fmbria conjugativa denominada de pili sexual (2)

Fonte: 1. http://media.photobucket.com/image/pili%20sexual%20bacteria/roland98/27-06-Pili.jpg 2. http://io.uwinnipeg.ca/~simmons/16cm05/1116/27-x1-ProkaryoteConjugation.jpg

2.4 PLASMDEO

Algumas bactrias no apresentam plasmdeos, enquanto outras podem apresentar um ou mais plasmdeos (Figura 7). So estruturas compostas por DNA de fita dupla, circular, com menos informaes genticas extracromossmico. Os genes contidos no plasmdeo conferem resistncia, produo de toxina, produo de enzima, fertilidade e outras propriedades. O


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plasmdeo autoreplicativo, independente da multiplicao da bactria. A bactria pode receber ou perder o plasmdeo sem danos clula.

2.5 ESPORO (ENDSPORO)

Algumas bactrias Gram positivas so capazes de formar endsporos, que so estruturas de resistncia quando estas se encontram em condies adversas. formado um endsporo por clula e quando ocorre lise da clula vegetativa, este liberado. Aps ser liberado da clula, passa a ser denominado de esporo, muito resistente ao calor (a fervura), substncias qumicas e radiao. Sobrevive no ambiente durante centenas de anos. Entre as bactrias mais conhecidas, os gneros Bacillus e Clostridium so formadores de endsporos. Nas condies adequadas, o esporo germina e d origem clula vegetativa, voltando ao seu metabolismo normal.

A esporulao ocorre, em laboratrio, nas culturas velhas dessas bactrias. Inicialmente, o DNA duplicado, ocorre separao da membrana e da parede, originando o endsporo. A posio do endsporo na clula auxilia na identificao da bactria, pode ser terminal, subterminal ou central. Em Clostridium, o endsporo mais espesso que a largura da bactria, deixando o bacilo em forma de raquete.

Os esporos podem ser corados por tcnicas especiais como a do verde malaquita, onde a suspenso de esporo aquecida por 5 minutos, cora-se de verde e a clula vegetativa em vermelho, pela fucsina (Figura 17). A estrutura do esporo formada pelo contedo nuclear, algumas protenas e o clcio que se liga ao cido dipicolnico produzido, importante para quando este voltar ao metabolismo, formando o cerne. Depois, revestido pela membrana interna, dupla camada de peptideoglicano (crtex) e uma capa externa de protena semelhante queratina (Figura 18). A reativao do esporo ocorre pela ruptura da capa externa, atravs de ao mecnica, calor ou outro fator estimulador, em presena de gua e nutrientes. O dipicolinato de clcio degradado e a clula vegetativa se reconstitui, voltando ao metabolismo normal com a entrada de gua e nutrientes.

Figura 17- Bactrias coradas pelo verde malaquita (endsporos) e a clulas vegetativas em vermelho.

Fonte: http://www.microbelibrary.org/microbelibrary/files/ccImages/Articleimages/Atlas_Endospore/Bacillus

%20species_Endospore%20stain_fig14.jpg


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PERGUNTAS???

4. Por que o esporo bacteriano mais resistente ao estresse ambiental?

5. Se uma suspenso das bactrias contendo Escherichia e Clostridium for fervida, qual delas sobrevive?

Figura 18- Diferentes estgios na formao do esporo bacteriano

Fonte: MADIGAN, MARTINKO, PARKER (2004).

2.6 INCLUSES

As incluses compreendem os depsitos de reserva, destacando-se os grnulos metacromticos (reserva de fosfato inorgnico), polissacardeos, lipdeos, enxofre, xido de ferro, vacolos de gs etc (Figura 7).

PRTICA 2: COLORAO DE GRAM 1. Introduo

A tcnica de colorao de Gram foi descoberta pelo fsico dinamarqus Christian Gram, em 1884. Esta colorao muito utilizada na bacteriologia permitindo a distino entre bactrias Gram positivas (prpura) e Gram negativas (rosa), sendo aplicada a maioria dos coco e bacilos. A


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diferena entre os dois tipos de clulas relaciona-se com a estrutura da parede celular das bactrias. Como a parede celular das bactrias Gram positivas formada por uma camada espessa de peptideoglicano, enquanto que a parede celular das Gram negativas formada por uma camada fina de peptideoglicano mais a externa lipopolissacardica. Ao ser corada e depois de aplicado um solvente (lcool) a Gram positiva permanece corada pelo corante cristal violeta, enquanto a Gram negativa descorada e corada posteriormente com fucsina, permitindo a diferenciao. O lcool dissolve o LPS da Gram negativa e o corante sai (Figura 19). J a Gram positiva por no apresentar lipdeos, mas uma camada espessa de peptideoglicano ser desidratada e reter o corante violeta de genciana.

Embora a maioria das bactrias possa ser corada por tal mtodo, algumas no o fazem satisfatoriamente, exigindo tcnicas especiais de colorao, a exemplo das micobactrias, nocardias, espiroquetas, micoplasma, riqutsias e clamdias.

Figura 19- Colorao de Gram: a. etapas da colorao; b. resultado observado na microscopia.

Fonte: TORTORA, FUNKE, CASE (2003).

2. Material

Placa de Petri contendo a cultura bacteriana recente, lminas de microscopia para preparao do esfregao, soluo salina ou gua estril, ala de platina, bico de Bunsen, bateria de corantes para o Gram.


283

3. Procedimento:

a) Preparao do esfregao: Observando as precaues de assepsia: desinfeco, antissepsia e flambagem; Limpar uma lmina de microscopia (passar algodo embebido em lcool); Quando se tratar de uma cultura em meio lquido: com uma ala de platina flambada,

mergulhar na cultura e coloc-la (pelcula do lquido) sobre a lmina espalhando-a para formar um esfregao fino e uniforme. Quando a cultura for slida: colocar uma gota de gua estril sobre a lmina com a ala de platina, tocar na colnia com a ala e suspend-la na gota de gua estril, espalhando suficientemente para obter um esfregao fino;

Deixar a lmina secar a temperatura ambiente; Fixar na chama do bico de Bunsen, cortando a chama por trs vezes.

b) Colorao: Cobrir o esfregao bacteriano com cristal violeta, por um minuto e verter o corante na

cuba; Cobrir o esfregao com soluo de lugol, por um minuto e retirar a seguir, lavando com um

filete de gua; Descorar o esfregao usando uma soluo de lcool acetona, rapidamente (10-15

segundos); Lavar com um filete de gua corrente, imediatamente; Cobrir o esfregao com a fucsina, por 30 segundos e desprezar o corante; Lavar com um filete de gua corrente; Secar com papel absorvente.

c) Observao na microscopia: Adicionar uma gotcula de leo de imerso sobre o esfregao (para concentrar os raios

luminosos e evitar a refrao); Selecionar a objetiva de 100x do microscpio e focalizar; Identificar o Gram, a morfologia da clula e o arranjo; Desprezar a lmina utilizada em frasco com desinfetante e limpar o microscpio

T NA WEB!!!

Assista vdeos sobre a colorao de Gram no yotube:

http://www.youtube.com/watch?v=30D1FUyTccU&feature=related http://www.youtube.com/watch?v=c6d7zOIP6Vo&feature=related http://www.youtube.com/watch?v=zLYIL4rjzEA&NR=1&feature=fvwp


284

UNIDADE 5 FISIOLOGIA MICROBIANA

1. NECESSIDADES NUTRICIONAIS

Os microrganismos esto agrupados conforme as suas necessidades nutricionais, de modo que foram, a princpio, divididos em autotrficos (capazes de sintetizar nutrientes a partir de elementos primrios) e heterotrficos (capazes de degradar compostos pr-formados para assimilar os nutrientes). As necessidades nutricionais dizem respeito s fontes de energia, luz, compostos inorgnicos e orgnicos, que so fornecidos aos microrganismos.

O cultivo de microrganismos importante em vrias reas da pesquisa, os quais podem ser cultivados in vivo (pela utilizao de clulas vivas ou cobaios) e in vitro (pela utilizao de meios de cultura inanimado). No cultivo so fornecidos fontes de carbono, fontes de nitrognio, sais minerais, fatores de crescimento e gua. Alm dos fatores nutricionais, so necessrios a temperatura, as condies de pH, potencial osmtico, aerao etc.

A assimilao dos nutrientes pelos microrganismos ocorre atravs de reaes enzimticas, que so liberadas no substrato, promovendo a decomposio (catabolismo ou decomposio) ou por vias metablicas de biossntese (anabolismo). Poucos so os microrganismos capazes de realizar a nutrio pela ingesto ou fagocitose.

As principais vias metablicas so: a) Glicoltica: processo anaerbio da oxidao da glicose (C6H12O6) at cido pirvico; b) Fermentativa: processo de obteno de energia pelo qual a molcula orgnica que est

sendo metabolizada no completamente oxidada, ou seja, no extrai todo o seu potencial energtico. Produtos: cidos actico e ltico, lcoois (etanol, metanol e butanol), cetonas (acetona) e gases (dixido de carbono e hidrognio molecular);

c) Respirao aerbia: processo de oxidao do piruvato, resultante da gliclise, a dixido de carbono e gua. Requer O2 como aceptor final de eltrons e muito mais eficiente na obteno de energia do que a via glicoltica ou a fermentativa;

d) Respirao anaerbia: os microrganismos so capazes de utilizar muitos outros aceptores finais de eltrons, como o sulfato em bactrias do gnero Desulfovibrio. Para isto, muitiplicam-se na ausncia de oxignio.

2. FATORES FSICOS IMPORTANTES AO CRESCIMENTO MICROBIANO

Os fatores fsicos necessrios ao crescimento microbiano incluem luz, temperatura, aerao, pH etc. Os microrganismos so classificados em diferentes categorias conforme estes fatores (Esquema 1):

2.1 QUANTO S FONTES DE ENERGIA E DE CARBONO

a) Fotolitotrficos ou fotoautotrficos: luz como fonte de energia e CO2 como fontes de carbono. Ex. bactrias fotossintetizantes (cianobactrias), bactrias sulfurosas prpuras (Chromatium) e bactrias sulfurosas verdes (Chlorobium);

b) Fotorganotrficos: luz como fonte de energia e compostos orgnicos (lcool, carboidratos, cidos orgnicos etc.) como fontes de carbono. Ex. bactrias verdes no sulfurosas (Chloroflexus) e bactrias prpuras no sulfurosas (Rhodopseudomonas);


285

c) Quimiolitotrficos: campostos inorgnicos (gs sulfdrico (H2S), enxofre elementar (S), amnia (NH3), gs hidrognio (H2), nitrato (NO3-), nitrito (NO2-) e ferro (Fe2+)) como fonte de energia e como fonte de energia e CO2 como fontes de carbono;

d) Quimiorganotrficos: campostos orgnicos como fontes de energia e de carbono. Ex. a maioria das bactrias, fungos e protozorios.

2.2 QUANTO AO PH

a) Acidfilos: crescimento timo em pH abaixo de 7; b) Mesfilos: crescimento timo em pH em torno de 7; c) Alcalfilos: crescimento timo em pH acima de 7.

2.3 QUANTO AERAO

a) Aerbios: crescem apenas em presena de oxignio livre; b) Anaerbios: crescem apenas na ausncia de oxignio livre; c) Microaerbios: crescem sob baixa tenso de oxignio livre; d) Anaerbios facultativos: so anaerbios, porm crescem em condies aerbias.

SAIBA MAIS!!!

Os fungos apresentam o pH timo em torno de 6, mas toleram pH entre 2 a 9.

As bactrias apresentam melhor crescimento a pH 7, com tolerncia entre 4 a 8.

As bactrias anerbias obrigatrias no produzem enzimas peroxidase e superxido dismutase, que elimina os radicais perxido e superxido do metabolismo oxigenativo. Portanto, as que no formam esporos, morrem em presena do oxignio.


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Esquema 1: Classificao dos microrganismos em relao s fontes de energia e de carbono.


2.4 QUANTO TEMPERATURA

a) Psicrfilos: timo crescimento a 10oC, porm toleram temperaturas entre -10oC a 20oC. Microrganismos tpicos de ambientes glaciais;

b) Psicrotrficos: timo crescimento a 20oC, porm toleram temperaturas entre 0oC a 30oC. Microrganismos tpicos de ambientes refrigerados;

c) Mesfilos: timo crescimento a 35oC, porm toleram temperaturas entre 10oC a 45oC. Microrganismos tpicos do ambiente e da microbiota humana e de animais;

d) Termfilos: timo crescimento a 60oC, porm toleram temperaturas entre 40oC a 70oC. Microrganismos tpicos de compostagem ou processos trmicos;

e) Extremfilos: timo crescimento a 90oC, porm toleram temperaturas entre 65oC a 110oC. Microrganismos tpicos de ambientes quentes (vulces, regies termais, giser).

2.5 QUANTO PRESSO OSMTICA

a) Hipotnicos: devido a menor concentrao de sais no meio, a bactria absorve lquidos em excesso, tornando a clula trgida;


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b) Isotnicos: a concentrao de sais no meio est em equilbrio com o do citoplasma bacteriano;

c) Hipertnicos: devido a maior concentrao de sais no meio, a bactria perde lquidos em excesso, ocorrendo plasmlise da clula.

3. CURVA NORMAL DE CRESCIMENTO BACTERIANO

3.1 CRESCIMENTO MICROBIANO

As bactrias crescem ou se multiplicam de forma assexual por fisso binria ou cissiparidade. Sendo assim, cada clula, em um determinado intervalo de tempo (tempo de gerao) originar duas clulas semelhantes clula de origem. Ocorre alongamento da clula, replicao do DNA, invaginao da membrana e da parede celular formando um septo separador. Algumas bactrias filamentosas (actinomicetos) formam brotamento originando clulas reprodutivas.

3.2. TEMPO DE GERAO

O tempo de gerao (TG) corresponde o tempo necessrio multiplicao bacteriana. Esse tempo varia conforme a espcie em questo e a fase de crescimento ou diviso celular (Figura 20). A Escherichia coli, uma bactria entrica, apresenta um TG de 20 minutos, enquanto Rhizobium sp., bactria fixadora de nitrognio, tem TG de 3-5 horas e o Mycobacterium tuberculosis, causador da tuberculose, tem TG superior a 18 horas. A fase de maior crescimento quando a bactria est adaptada ao meio e dispe de nutrientes e fatores ambientais necessrios ao crescimento. Em culturas velhas o crescimento praticamente nulo.

AREGAANDO AS MANGAS!!!

As bactrias Escherichia coli e Staphylococcus aureus so muitos comuns nas mos (pele e fossas nasais) e trato digestivo. Elas apresentam um tempo de gerao curto, em mdia, 20 minutos. Informe, quantas clulas bacterianas so formadas aps 8 horas de incubao (tempo que, as vezes, deixamos um alimento proteico, cozido ou cru fora da refrigerao, exposto contaminao por esses microrganismos).


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Figura 20- Clulas de bacilos em processo de diviso (1 e 2).

Fonte: 1.http://crv.educacao.mg.gov.br/sistema_crv/banco_objetos_crv/%7B9DBB39BF-442E-4C90-AB18-

C034F4FA9AEA%7D_0701_image002.gif 2.http://media.photobucket.com/image/divisao%20binaria/Oforhiahrage/Cpiadereplicaaobacterina.jpg

A partir do crescimento de cada clula, em sucessivas divises, originar colnias, com milhes de clulas. As colnias de bactrias apresentam aspectos mucoides, com formas, cor e tamanho variados (Figura 21).

Figura 21- Placa de Petri contendo colnias de bactrias.


3.3. CURVA NORMAL DE CRESCIMENTO BACTERIANO

A curva normal de crescimento microbiano representa o aumento da populao em um determinado perodo de tempo. Isto pode ser evidenciado, inoculando-se bactrias em meio lquido e realizando-se contagem do nmero de clulas periodicamente ao longo de um determinado perodo. Com isto, observa-se que a cultura passa por quatro fases distintas (Figura 22):


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Figura 22- Curva normal de crescimento bacteriano.


a) Fase lag: fase adaptativa ou de latncia, na qual a clula ativa intensamente seu metabolismo, porm no se multiplica. Esta fase bastante varivel conforme a espcie. Algumas levam horas e outras, dias;

b) Fase log: conhecida como fase logartmica, caracteriza-se pela fase de diviso constante das clulas, duplicando a populao a cada gerao. Denomina-se tambm de fase de crescimento exponencial, estabelecendo-se graficamente a representao de uma reta ascendente. Ocorre tambm uma intensa atividade metablica e as clulas so sensveis, pois esto em fase de formao dos componentes celulares. Caso seja renovado o meio de cultura sistematicamente, esta populao de bactria permanece na fase log sem passar fase seguinte;

c) Fase estacionria: fase em que o nmero de clulas novas sendo geradas diminui, equivalendo-se ao nmero de clulas destrudas pelo prprio metabolismo e escassez nutricional. Desta forma, a populao continua se multiplicando, mas no cresce, torna-se estvel e com alta competitividade por espao e nutrientes. Nesta fase, as bactrias capazes de formar esporos, iniciam este processo para se manterem viveis em fase mais crtica;

d) Fase de declnio: nesta fase, as clulas raramente se multiplicam. A populao decresce, pois as clulas entram em colapso, devido escassez nutricional e formao de substncias txicas. Algumas bactrias conseguem se manter vivel por longo tempo, mesmo nestas condies, outras so severamente afetadas e no mais se recuperam.

PRTICA 3: COLORAO DE ZIEHL-NEELSEN 1. Introduo

Os Bacilos lcool cido Resistentes (BAAR) so bactrias do gnero Mycobacterium, como, por exemplo, as espcies M. tuberculosis, M. leprae e M. bovis. A parede destas micobactrias possui uma espessa camada de lipdeos complexos (cidos miclicos) que evita a penetrao de diversos corantes. Por outro lado, quando o corante penetra na clula, ele


290

no pode ser removido com facilidade, mesmo com o uso de lcool cido, de onde surgiu a denominao BAAR.

Os bacilos da tuberculose so vistos como bacilos finos, retos, ligeiramente encurvados e geralmente isolados, corados em vermelho pela fucsina de Ziehl (Figura 23); j os bacilos da hansenase, agrupam-se em feixes denominados globias. So bactrias de difcil crescimento, pois se multiplicam lentamente, sendo que este no cresce in vitro.

Figura 23- Micobactrias coradas em vermelho pela colorao de Ziehl-Neelsen: 1 .Mycobacterium leprae; 2. M. tuberculosis

Fonte: 1. http://www2.bc.cc.ca.us/bio16/22_Resppictures.htm 2.http://www.craigleithhill.co.uk/images/Mycobacterium_tuberculosis_Ziehl-Neelsen_stain_02.jpg

O resultado da baciloscopia do escarro dado em cruzes e depende da quantidade de bacilos encontrados em 100 campos microscpicos observados. Assim obtm-se a mdia:

+ (menos de 1 bacilo por campo) ++ (1 a 10 bacilos por campo) +++ (mais de 10 bacilos por campo)

2. Material Lminas para preparao do esfregao, soluo salina, ala de platina, bico de Bunsen e

bateria de corantes para Ziehl-Neelsen.

3. Procedimento Preparar um esfregao a partir de escarro ou da cultura (semelhante ao utilizado no

Gram); Cobrir o esfregao com fucsina de Ziehl e aquec-la at emisso de vapores, mantendo o

aquecimento por 5 minutos (tendo o cuidado para no deixar o corante ferver, nem secar). O bacilo da tuberculose e o da hansenase s se cora aps o aquecimento;

Lavar com um filete de gua corrente; Descorar rapidamente com lcool-clordrico a 3% at que no se desprenda mais corante; Lavar com um filete de gua corrente; Corar com azul de metileno - 1 minuto; Lavar com um filete de gua corrente; Secar com papel de filtro; Colocar leo de imerso e observar na microscopia, com objetiva de 100x


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T NA WEB!!!

Assista o vdeo sobre a colorao de Ziehl-Neelsen para micobactrias, disponvel no yotube:

http://www.youtube.com/watch?v=PouIoydSiPM


292

UNIDADE 6 GENTICA BACTERIANA

1. GENOMA BACTERIANO

As caractersticas observadas nos microrganismos so controladas ou influenciadas pela hereditariedade. Sendo assim, caractersticas estruturais (morfologia), reaes bioqumicas (metabolismo), motilidade, capacidade de sobreviver em vrias condies ambientais, capacidade de interao com outros microrganismos etc., so repassadas entre as geraes.

O estudo sobre gentica importante, pois os microrganismos so seres com alta capacidade de mutao ao alterar o material gentico. As doenas e a atividade microbiana desenvolvida so dependentes do cdigo gentico.

As informaes genticas da bactria esto organizadas no genoma que o conjunto de genes de um organismo, sendo um gene um segmento de cido desoxirribonuclico (DNA) que codifica para a produo de uma protena.

DNA: composto por acar (pentose), radicais fosfatos e por sequncias de quatro bases nitrogenadas, ligadas por pontes de H, formando uma dupla hlice. So polmeros formados por unidades repetidas (nucleotdeos).

Nucleotdeo: uma base ligada a um acar e um ou mais fosfatos (Figura 24). Figura 24- Material nuclear bacteriano: detalhe da dupla hlice de DNA

Fonte: http://schools-wikipedia.org/images/646/64609.png (modificado).


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Tipos de bases: a) Purinas: Adenina (A) e Guanina (G); b) Pirimidinas: Citosina (C), Timina (T), Uracila (U)

O cromossomo bacteriano constitudo por uma nica molcula de DNA, fita dupla de aproximadamente 1mm de comprimento, enovelado, circular e semiconservativa (Figura 25). Todas as informaes essenciais clula esto contidas nessa molcula. Alm destas informaes, algumas bactrias que contm plasmdio trazem outras informaes no essenciais, com a mesma estrutura fsica do cromossomo, porm em menor quantidade de informaes. Os tipos de plasmdio so: F (sexual ou fertilidade), R (resistncia), V (virulncia), M (metablico) etc.

Figura 25- DNA bacteriano extravasado aps a ruptura celular

Fonte: http://www.scb.org.br/inspiracao/naturezaviva/imagens/28-1-a-Escherichiacoli.jpg

Outra caracterstica importante a existncia de elementos transponveis, com capacidade de movimentar-se de um local para outro no genoma, ou seja, ao longo da fita de plasmdio e deste para o DNA. So denominados de transposons, os quais so variveis. Os tipos de transposons conhecidos so estes:

a) Sequncia de insero (SI): tem somente um gene que codifica a transposase e locais de reconhecimento que so sequncias curtas, invertidas de DNA; Transposon (Tn): so maiores que as SI e carreiam outros genes, alguns conferindo

propriedades importantes ao microrganismo, como resistncia, antagonismo, sntese enzimtica etc. (Figura 26).

As informaes do DNA so transmitidas para um mRNA, sendo no rRNA onde ocorre a sntese protica e no tRNA se d o transporte das informaes, reconstituindo a nova fita de DNA.


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Figura 26- Transposon Tn: transposio de genes ao longo do cromossomo.


SAIBA MAIS!!!

A replicao do DNA ocorre em duas fases, sempre no sentido 5 para 3 (Figura 24), que corresponde a ligao do carbono na cadeia.

Consulte o captulo 8 do livro: TORTORA, G.J., FUNKE, B.R., CASE, C.L. Microbiologia, 6.ed. Porto Alegre: Artmed, 2003. p.208-237.

Para que ocorra a sntese proteica dois processos so determinantes: a) Transcrio: consiste na sntese de RNA, realizada por um complexo enzimtico, cuja

enzima chave a RNA polimerase, composta de vrias subunidades e que realiza a polimerizao do RNA a partir de um molde de DNA.

Etapas: Iniciao (promotora): AUG. Alongamento: UUA, UUG, CUU, CUC, CAC, GAA, GCC... (protenas). Trmino: UAA, UGA e UAG.

b) Traduo: processo que permite a informao gentica ser transformada em protena nos ribossomos. A leitura em codon (aminocido). As combinaes de bases formam os codons. Estes se associam aos anticodons dos tRNA de forma especfica, o que faz com que o aminocido carregado pelo mesmo seja acrescentado cadeia polipeptdica na ordem correta (Figura 27).


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Figura 27- Etapas da traduo e da transcrio na replicao do DNA.


2. VARIABILIDADE GENTICA MUTAO A variabilidade gentica diz respeito s alteraes ocorridas na sequncia de nucleotdeos

na molcula de DNA, sendo esta a principal fonte de mudana evolutiva. Produzem novos alelos nos organismos, alguns espontaneamente, outros como resultado da exposio radiao e substncias qumicas do ambiente.

A mutao considerada um fenmeno comum entre os microrganismos e tem carter evolutivo, apesar de ser danoso para os mesmos.

Algumas bactrias tm maior capacidade de mutao. Os tipos de mutaes so: Espontnea: falhas no mecanismo de replicao (1 para 105 a 108), tambm

denominada de mutao por deslocamento da fase de leitura, onde um ou alguns pares de nucleotdeos so suprimidos ou inseridos no DNA (Indel);

Induzida: ocorre pela exposio aos agentes mutagnicos (ioniza o DNA) Radiao (raios ultravioleta, raios X, raios gama): Anlogos de base (5 bromouracil, 2 aminopurina); Corantes, antibiticos, metais pesados, drogas, calor etc.

Mutaes pontuais envolvem um ou poucos pares de bases, onde estas so substitudas. So classificadas em (Figura 28):

Mutao de sentido trocado (missense): altera a protena formada; Mutao sem sentido (nosense): quando a alterao resulta em um cdon de

parada; Mutao silenciosa: tambm conhecida como mutao neutra, pois mesmo

alterando uma base, a protena no alterada.


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Figura 28- Tipos de mutaes pontuais


3. PROCESSOS DE TRANSFERNCIA DE GENES

Os microrganismos so capazes de transferir material gentico entre si, numa populao, sem que se caracterize um processo de multiplicao. Com a transferncia gnica, os microrganismos so capazes de adquirir informaes genticas referentes resistncia a drogas, s condies ambientais, sntese de enzimas, produo de toxinas etc.

A transferncia de genes pode ocorrer de trs formas conhecidas: a) Transformao bacteriana: fragmentos de genes de uma bactria destruda, porm viveis, so

captados por outra bactria. Desta forma, a bactria receptora, em estado competente (ocorrem alteraes fisiolgicas na parede celular e na permeabilidade da membrana para a entrada do fragmento de DNA), passa a possuir um genoma recombinante. Ex. de bactrias transformadas: Bacillus, Haemophilus, Neisseria, Streptococcus, Staphylococcus (Figura 29).

Figura 29- Transformao bacteriana

Fonte: http://scienceblogs.com.br/meiodecultura/tag/mutacao/


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b) Conjugao bacteriana: o material gentico transferido de uma clula para outra atravs de um pili conjugativo (pili sexual). Neste caso, as informaes transferidas so as contidas no plasmdio existente na bactria doadora. Como o plasmdio auto replicativo, uma cpia do mesmo transferido. As informaes contidas na cpia do plasmdio so para sntese de pili sexual (fator F = fertilidade) e outras informaes no essenciais, dependendo do plasmdeo transferido (Figura 30). Quando o fator F se integra ao cromossomo transforma-se em uma clula de alta frequncia de recombinao (Hfr). Somente a bactria Hfr pode transferir cpias ou partes do DNA. Ex. Escherichia coli.

c) Transduo: o material gentico transferido dentro de um vetor, um vrus conhecido como bacterifago ou fago, capaz de infectar bactrias (Figura 31). Ao infectar a clula bacteriana, o fago fixa-se a parede celular e injeta seu DNA na bactria. Uma vez infectada, o fago pode entrar no ciclo ltico ou no ciclo lisognico (Figura 32):

Ciclo ltico: o material gentico viral se replica no citoplasma bacteriano, libera enzimas lticas que fragmentam o DNA da bactria e ocorre a sntese protica de revestimento dos novos fagos. Nesse processo, fragmentos do DNA da bactria so envelopados juntamente com o DNA viral. Quando ocorre a lise da clula bacteriana, os bacterifagos so liberados e ao infectar novas clulas bacterianas, transmitiro o DNA da clula destruda.

Ciclo lisognico: conhecido tambm como fago temperado. Neste, o material gentico viral se insere no DNA bacteriano e permanece latente durante vrias geraes bacterianas. As populaes bacterianas formadas contm o genoma do bacterifago. Porm, fatores no determinados levam o fago a entrar no ciclo ltico, para poder haver a transferncia do material gentico para outra bactria. Sendo assim, a bactria infectada promove a replicao viral, este destri por lise a bactria e leva tambm o material gentico da bactria destruda, infectando uma nova bactria. Ex. Corynebacterium diphtheriae: toxina diftrica, Streptococcus pyogenes: toxina escarlatnica, Staphylococcus aureus: enterotoxinas, Escherichia coli: citotoxinas.


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Figura 30- Transformao bacteriana

Fonte: http://scienceblogs.com.br/meiodecultura/tag/transferencia-horizontal-de-genes/

PERGUNTAS???

1. O processo de conjugao uma das formas de multiplicao bacteriana?

2. O que diferencia a mutao pontual da mutao por deslocamento da fase de leitura?

3. Quais as propriedades de um plasmdeo?

4. Quando a bactria poder transferir tambm a cpia do DNA via fimbria conjugativa?


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Figura 31- Transferncia de material gentico por transduo

Fonte: http://scienceblogs.com.br/meiodecultura/tag/transferencia-horizontal-de-genes/

Figura 32- Tipos de transduo: 1. Ciclo ltico e 2. Ciclo lisognico.

Fonte: 1.http://static.howstuffworks.com/gif/virus-human-lytic.gif; 2. http://www.oralchelation.com/viewpoint/images/virus2.gif


300


Descubra como estes trs processos de transferncia gnica foram descobertos, baseados em que experimentao.


301

UNIDADE 7 ANTIMICROBIANOS

1. HISTRICO E IMPORTNCIA Os antimicrobianos so substncias produzidas por um organismo ou obtidas

sinteticamente, que destri ou inibe o crescimento dos microrganismos. A ao destas substncias qumicas d-se de forma seletiva sobre as clulas invasoras patognicas.

Documentos antigos indicam que preparaes de plantas e animais, po, queijo mofados, soja fermentada foram utilizados de forma emprica contra doenas infecciosas. Antes da era da microscopia (1674) por A. V. Leeuwenhoek, havia pouca esperana de cura entre os enfermos. A doena meningite causada por Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae ou Streptococcus pneumoniea apresentava 100% de letalidade e diminuiu para aproximadamente 2 a 10% aps a descoberta dos antibiticos.

Paul Ehrlich, em 1872, considerado o pai da quimioterapia, mdico alemo, estudou composto contendo arsnico para tratamento da sfilis. Recebeu o Prmio Nobel (1908) pela descoberta do SALVARSAN, um derivado arseniacal.

Alexandre Fleming, em1929, descobriu a penicilina, sendo o primeiro antibitico de utilidade clnica. Descoberto em 1928, permaneceu como curiosidade at 1939 e, em 1941, foi usado pela primeira vez em um policial de Oxford, com septicemia estafiloccica. Florey e Chain, em 1944, utilizaram cultura submersa de Penicillium, obtendo um rendimento de mil vezes mais na quantidade de penicilina produzida. Em 1959, passou-se a produzir as penicilinas semi-sintticas.

2. DETERMINAO DA AO DOS QUIMIOTERPICOS a) Concentrao inibitria mnima (MIC): concentrao que resulta em inibio de 99% dos

microrganismos (mnimo que deve atingir o stio de ao). Utilizam-se diluies seriadas de uma droga em contato com uma suspenso padronizada de bactrias, a concentrao inibitria mnima determinada a partir do tubo contendo a concentrao mais baixa do agente capaz de inibir o crescimento da bactria.

b) Difuso ou mtodo de Kirby-Bauer: mtodo que avalia a sensibilidade dos microrganismos a determinados antimicrobianos. Neste mtodo ocorre difuso no meio de cultura do antimicrobiano contido em discos de papel, resultando na formao de halo de inibio. um dos mtodos mais utilizados e fornece informaes importantes, embora no seja um dos mtodos mais avanados.

3. FAMLIAS DE DROGAS USUAIS E SUA AO SOBRE AS BACTRIAS

Penicilinas, cefalosporinas (-lactmicos): ligam-se as PBPs e enzimas responsveis pela sntese da parede celular;

Tetraciclinas: liga-se aos ribossomos 30S, impedindo o alongamento do polipeptdeo; Macroldeos: liga-se aos ribossomos 50S, impedindo o alongamento do polipeptdeo; Aminoglicosdeos: prprios para bactrias aerbias, liga-se ao ribossomo 30S interferindo

na sntese protica;


302

Fluoroquinolonas: inibe a replicao do DNA; Outros: trimetoprim-sulfametoxazol, uma combinao sinrgica de quimioterpicos que

interfere no metabolismo intermedirio, impedindo a sntese do cido flico; vancomicina inibe as ligaes cruzadas entre as camadas de peptideoglicano.

4. CLASSIFICAO DOS ANTIMICROBINOS a) Com base na origem:

Naturais (penicilina G e V). Semi-sintticos (aminopenicilinas). Sintticos (Sulfamidas).

b) Com base na ao biolgica: Bactericidas: ocasionam a morte da clula de forma direta. Ex. penicilinas, polimixinas,

quinolonas etc. Bacteriostticos: interfere na multiplicao dos microrganismos de modo a permitir que as

defesas do hospedeiro se encarreguem de destru-los. Ex. sulfonamidas, tetraciclinas etc.

c) Quanto ao espectro de ao: Espectro estreito: a droga atua sobre um menor nmero de espcies. Espectro amplo: a droga atua sobre um maior nmero de espcies.

Alguns exemplos: oxacilina contra Gram-positivos; aminoglicosdeo contra Gram-negativas; metronidazol contra anaerbios; ceftriaxona contra Gram positivos e negativos.

Quando se conhece a etiologia da doena devem-se prescrever sempre drogas de menor espectro, usar a de maior potncia e, se no surtir efeito, trocar o mais rpido possvel para uma de maior potncia.

d) Com base no mecanismo de ao: Antibiticos -lactmicos: inibem a formao da parede celular, ligando-se as protenas de

ligao (pontes peptdicas) na formao do peptideoglicano; Aumentam a permeabilidade da membrana, diminuindo, assim, a sua capacidade semi-

seletiva; Inibio da sntese de protenas atuando sobre o ribossomo, o que resulta em formao de

protenas aberrantes e interrupo da sntese protica; Inibio da sntese de cidos nuclicos: podem interferir no processo de transcrio ou

traduo. Inibio da sntese de metablitos: o uso de sulfanilamida, um anlogo do cido

paraminobenzico (PABA), que o precursor na formao do cido flico, impede que a enzima converta o PABA em cido flico.

5. CARACTERSTICAS DE UM ANTIMICROBIANO IDEAL

Ao bactericida; Espectro o mais especfico possvel; Menor MIC; Maior nvel no local da infeco;


303

Melhor comodidade posolgica; Compatvel com o estado clnico do paciente; Menos txico (toxicidade seletiva); Menor custo.

6. PRINCIPAIS MICRORGANISMOS PRODUTORES DE ANTIBITICOS Os microrganismos produtores de antibiticos so facilmente isolados do ambiente. Muitos

so bactrias filamentosas, a exemplo de Streptomyces sp. produtores de amfotericina B, cloranfenicol, clortetraciclina e tetraciclina, eritromicina, neomicina e estretpomicina. Entre os fungos produtores destacam-se Cephalosporium spp. (cefalosporina) e Penicillium spp. (penicilina).

7. RESISTNCIA AOS ANTIBITICOS A resistncia aos antibiticos pode ser intrnseca ou adquirida, na qual trs mecanismos se

destacam: a) Inativao ou destruio do antimicrobiano, a exemplo da produo de -lactamase por

bactrias que adquiriram resistncia a penicilina natural; b) Evitar que o antimicrobiano entre na clula c) Evitar que o antimicrobiano ligue-se ao stio alvo ou alterao do stio alvo, para que a

droga no desenvolva a ao; d) Bomba de efluxo: a droga entra e rapidamente eliminada e) Uso de uma via bioqumica alternativa.

As mutaes ocorridas exercem um papel importante, facilitando o microrganismo adquirir resistncia, assim como as formas de transferncia de genes, os plasmdios transferidos e a transposio de genes, a formao de biofilme.

SAIBA MAIS!!!

Como evitar o surgimento de resistncia? Evitar o uso indiscriminado de antibiticos que tm pouco ou

nenhum valor teraputico; Utilizar dosagens suficientemente altas de um antibitico

apropriado para dominar uma infeco rapidamente; Utilizar o antibitico pelo tempo recomendado; Utilizar uma combinao de antibiticos de eficincia

comprovada; Mudar para um antibitico diferente to logo um organismo

mostre sinais de resistncia.


304

PRTICA 4: ANTIBIOGRAMA

1. Introduo

O antibiograma um teste utilizado para avaliar a sensibilidade de uma bactria frente a diversos antimicrobianos. Este teste tem como finalidade orientar a terapia de modo que ela seja segura e eficaz.

Para se realizar um antibiograma, necessrio a obteno de uma cultura pura. A maioria dos microrganismos apresenta uma variao muito grande quanto sensibilidade, mostrando muitas vezes resistncia mltipla a diversos antimicrobianos. No indicado o teste de antibiograma quando o microrganismo isolado faz parte da microbiota normal ou quando o microrganismo for considerado um contaminante. Tambm no se faz para aqueles que apresentam menor capacidade de mutao.

Existem vrias tcnicas para realizar um antibiograma, onde a mais utilizada pela sua praticidade o de difuso utilizando disco de papel (mtodo de Kirby-Bauer). Baseia-se na inibio do crescimento de um microrganismo semeado na superfcie de um meio de cultura, onde se colocou discos de papel de filtro, impregnado com um antimicrobiano de concentrao padronizada. A leitura feita 18 a 24 horas aps a incubao, avaliando-se o dimetro do halo de inibio ao redor do disco. Os halos de inibio so medidos em mm e a medio feita no fundo da placa. Os resultados so comparados com os de uma tabela, onde esto relacionados os tamanhos dos halos indicando sensibilidade ou resistncia s drogas. Existem vrios fatores que podem interferir no resultado do antibiograma levando com frequncia a resultados falsos, entre estes podem ser citados:

Preparao imprpria do meio de cultura: o meio indicado para realizao do antibiograma o gar Mueller-Hinton. Para bactrias exigentes que no crescem satisfatoriamente neste meio utiliza-se o meio agar-sangue. As placas devem ser colocadas sob refrigerao (2-8C/12h), e antes do uso coloc-las em estufa a 37C para eliminar o excesso de umidade.

Discos fora de validade ou impropriamente estocados: os discos de antibiticos devem ser mantidos sob refrigerao (2-8C) e retirados um pouco antes do uso.

Inculo no padronizado: a suspenso bacteriana deve ser ajustada a aproximadamente 1,5x108UFC/mL com o auxlio da escala de MacFarland (tubo 0,5).

Leitura prematura do teste antes de 16 18h. Medio errada dos dimetros do halo de inibio. Uso de cultura contaminada.

2. Material

Cultura pura do microrganismo, placa de Petri contendo o meio Mueller-Hinton, swab, tubos com gua estril, discos para antibiograma, pina, becker com lcool 96o.

1. Procedimento

a) Fazer uma suspenso da bactria isolada com gua estril em tubo, obedecendo concentrao comparativa com o tubo 0,5 da escala de MacFarland;


305

b) Umedecer o swab com a suspenso de microrganismo e semear espalhando na superfcie da placa de gar Mueller-Hinton, em trs direes, para que toda a superfcie fique semeada; c) Colocar os discos de antibiticos com a pina pressionando-os levemente para que fiquem aderidos ao meio de cultivo; d) Levar as placas preparadas para a refrigerao durante 30 minutos; e) Incubar as placas na estufa 36oC durante 18 a 24h; f) Fazer a leitura, medindo-se o dimetro do halo formado e comparar com os dados da tabela; g) Interpretar os resultados.


306

UNIDADE 8 CONTROLE DE MICRORGANISMOS

1. IMPORTNCIA DO CONTROLE DE MICRORGANISMOS

O controle de microrganismos deve ser realizado para evitar a proliferao das espcies patognicas, o surgimento de doenas infecciosas, alm de evitar a deteriorao dos equipamentos e dos alimentos. Devem-se adotar medidas que no favorea a sua proliferao de forma indesejvel.

Os microrganismos apresentam graus de sensibilidade varivel, conforme o tipo e a forma. So capazes de formar estruturas de resistncia que suportam condies adversas, as quais outros seres, inclusive o homem, no suportaria.

O controle de microrganismos pode ser realizado por mtodos fsicos e qumicos. Entretanto, na escolha de um dos mtodos, devem-se considerar alguns aspectos importantes: se o mtodo selecionado eficiente, se no danifica ou interfere no material a ser esterilizado, a praticidade do mtodo, o custo, os danos ambientais ou nos materiais etc.

Os mtodos fsicos so os mais usuais, eficientes e seguros no controle de microrganismos. Porm, alguns materiais apresentam limitaes, de modo que no deve ser controlado por qualquer mtodo.

Para se entender o controle de microrganismos, necessrio compreender alguns termos relacionados, tais como:

a) Esterilizao: utilizao de um mtodo capaz de eliminar ou destruir todas as formas de vida existente no material ou no ambiente. Autoclave, filtro, raio x, forno de Pasteur, flambagem;

b) Desinfeco: utilizao de um desinfetante capaz de destruir as formas vegetativas patognicas ou inconvenientes, em material inanimado, porm com limitaes para destruir as formas de resistncia. Exemplo: lcool 70%, lcool iodado, cloro, clorofina, gua fervente;

c) Antissepsia: utilizao de um antissptico capaz de destruir as formas vegetativas patognicas ou contaminantes, em organismo vivo, porm com limitaes para destruir as formas de resistncia. Exemplo: lcool 70%, lcool gel, lcool iodado, clorexidina 1%, cepacol;

d) Degermao: utilizao de substncia capaz de solubilizar e eliminar as impurezas e juntamente com elas os microrganismos tambm so eliminados. Ex. sabonete, detergente;

e) Assepsia: utilizar um conjunto de medidas fsicas ou qumicas que possam evitar a presena, a entrada ou a proliferao de microrganismos.

2. MTODOS UTILIZADOS NO CONTROLE DE MICRORGANISMOS

2.1. MTODOS FSICOS

2.1.1. Calor: o calor pode ser mido no qual ocorre desnaturao de protenas ou seco promovendo a oxidao protica.


307

2.1.1.1. Calor mido: a) Calor mido sem presso:

gua em ebulio: gua a temperatura acima de 60oC por 30 minutos destri as formas vegetativas dos microrganismos, sem afetar as formas esporuladas. Alguns vrus (um dos tipos de vrus da hepatite) sobrevive at 30 minutos de fervura e alguns endsporos bacterianos resistem vrias horas.

Pasteurizao: processo utilizado para destruir os microrganismos patognicos sem importar os demais. Geralmente utilizado na pasteurizao do leite, alimentos, substratos. No leite, visa destruir as bactrias Mycobacterium bovis (tuberculose bovina), Coxiella burnett (febre Q) e os coliformes. A pasteurizao pode ser lenta 63oC durante 30 minutos; rpida 72oC durante 15 segundos. Convencionou-se chamar a tcnica temperatura ultra-elevada (UHT) como pasteurizao, realizada a 140oC por 1 a 3 segundos. No entanto, esta tcnica elimina praticamente todos os microrganismos, e foge, portanto, ao conceito de pasteurizao. Nos dois tipos de pasteurizao, aps o aquecimento o material submetido ao resfriamento para manter a populao microbiana restante sem se multiplicar e diminuir o metabolismo.

Tindalizao: consiste em ferver o material e manter a temperatura ambiente durante 24 a 48 horas e ferver pela segunda vez. Por essa tcnica possvel tambm ser eliminado os esporos de bactrias. Tcnica indicada para a preservao de conservas.

b) Calor mido com presso: o vapor sob presso a forma mais segura de destruir todas as formas de vida microbiana. A autoclave um equipamento indispensvel nos laboratrios de Microbiologia. A esterilizao ocorre com a temperatura a 121oC (1atm) durante 20 minutos, dependendo da natureza do material, do volume e da concentrao de microrganismos. Material com volume maior necessrio aumentar o tempo de esterilizao. O calor mido se propaga mais rapidamente, sendo este um dos mtodos mais rpidos de esterilizao para grandes volumes. necessrio que o ar seja substitudo pelo vapor mido no interior da autoclave, garantindo a qualidade da esterilizao. Alguns materiais no devem ser esterilizados em autoclave, como as substncias sensveis ao calor e a umidade (vitaminas, p, papel), materiais cortantes e substncias oleosas.

2.1.1.2. Calor seco: a) Flambagem: ao direta da chama do bico de Bunsen sobre agulha ou ala de

platina at esta ficar incandescente, tornando-a esterilizada;

b) Incinerao: combusto de material contaminado, bastante utilizado para material hospitalar como sacos, copos, bandagens, agulhas etc.

c) Forno de ar quente ou forno de Pasteur: equipamento no qual so acondicionados os materiais (vidrarias, papeis etc. devidamente embalados) e aquecidos a 170oC por 2 horas, obtendo-se a esterilizao. Temperatura mais baixa requer maior tempo de exposio: 160oC/3h, 120oC/16h. O calor seco necessita de temperatura mais alta e


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por tempo mais prolongado que a esterilizao pela autoclave, pois a propagao do calor no ar seco mais lenta.

2.1.2. Filtrao: passagem de lquido por um filtro com poros microscpicos (0,22m) com capacidade de reter os microrganismos. Os mais usados so os filtros de membrana (steres de celulose) permanentes ou descartveis. necessrio a utilizao de compressor para criar um vcuo na suco do lquido atravs do filtro. O mecanismo verificado neste mtodo a separao dos microrganismos do material a ser esterilizado. Alguns micoplasmas (menores bactrias, sem paredes) e vrus no so retidos no filtro. Entre os materiais a serem filtrados, destacam-se aqueles sensveis ao calor (enzimas, vacinas, antibiticos) Existe, ainda, os filtros HEPA (high efficiency particulate air), onde o ar filtrado, geralmente utilizado em salas de cirurgia e enfermarias de pacientes com queimaduras.

2.1.3. Radiao: mecanismo de ao ocorre por danos no DNA. Este mtodo apresenta limitaes, como tempo prolongado de exposio, alm disso, as radiaes no ionizantes (raios ultravioleta) so incapazes de atravessar superfcies, indicados para ambientes limpos e livres de equipamentos. J as radiaes ionizantes (raio X, raios gama) so penetrantes e mais eficientes. So bastante aplicados no controle microbiolgico de materiais de laboratrio (material descartvel, material cirrgico, dentrio, seringas), medicamentos e alimentos. As radiaes ionizantes devem ser utilizadas com equipamentos de segurana devido os efeitos causados nos operadores despreparados. A luz ultravioleta tambm cancergena exposio prolongada.

2.2. MTODOS QUMICOS

Os mtodos qumicos so menos utilizados que os mtodos fsicos com fins de esterilizao, pois a sua capacidade de esterilizao limitada, por serem txicos em altas concentraes, pela menor eficincia e requer tempo prolongado de exposio. Os mtodos qumicos so mais teis como desinfetantes e antisspticos. Segue indicaes sobre as principais substncias qumicas utilizadas (Quadro 1).

Quadro 1- Indicao sobre os principais agentes qumicos utilizados no controle microbiano. Agente Espectro

de ao Uso Modo de

ao Tempo de exposio

Desvantagem

lcoois (70%) Gram + Gram BAAR

Antissptico Desinfetante

Desnaturao protica e dissoluo lipdica

10-15 min. Menos ativo para esporos

Fenis Gram + Gram BAAR

Desinfetante Desnaturao protica

Efeito imediato

Corrosivo, ftido

Compostos quaternrios de amnio

Gram + BAAR


Alterao de membrana

10-30 min. No inativa esporos


309

Cloro Gram + Gram BAAR

Tratamento de gua

Inativao enzimtica e oxidante

Efeito imediato

Odor irritante No inativa esporos

Iodo Gram + Gram BAAR


Inativao enzimtica

Efeito imediato

Odor irritante No inativa esporos

Iodforo (iodo com

detergente)

Gram + Gram BAAR


Inativao enzimtica

Efeito imediato

Menor natidade contra esporos

Aldedos (gs)

Gram + Gram BAAR

Desinfetante Desnaturao protica

Mdio Longa exposio

Metais pesados

Gram + Gram

Antissptico

Inativao enzimtica

Efeito imediato

No elimina esporos e BAAR


T NA WEB!!!

Assista ao vdeo sobre o controle de microrganismos, no yotube:

http://youtu.be/Lfe5CYTzj7o http://youtu.be/rYfbTV2puhE

PRTICA 5: CONTROLE DE MICRORGANISMOS

1. Efeito do calor mido sobre o crescimento bacteriano: ao da gua fervente

a) Semear com ala de platina 0,5mL da suspenso de E. coli em um dos quatro quadrantes de uma placa de Petri com gar Mueller-Hinton. Colocar o tubo com a suspenso de E. coli em gua fervente por 5, 10, 15 e 20 minutos. Aps cada intervalo de tempo, realizar a semeadura em um dos quadrantes. Incubar as placas a 36oC/48h; b) Fazer o mesmo procedimento com uma cultura de Bacillus spp.; c) Interpretar os resultados.

2. Efeito do calor mido sobre o crescimento bacteriano

a) Ao de calor mido na forma de vapor sob presso: preparar uma suspenso de E. coli e outra de Bacillus spp. em tubo de ensaio; b) Semear em cada metade da placa com meio de cultivo (controle); c) Colocar as suspenses na autoclave temperatura de 121C por 15 minutos; d) Semear cada uma das suspenses no gar Mueller-Hinton; e) Incubar as placas a 36oC por 48h; f) Interpretar os resultados.


310

3. Efeito da ao de antisspticos sobre o crescimento bacteriano

a) Umedecer um swab estril em gua estril, esfregar na mo e semear em um dos quadrantes da placa de Mueller-Hinton; b) Umedecer um segundo swab em lcool iodado, passar na outra mo e aguardar um minuto para semear no segundo quadrante; c) Lavar as mos com sabo, umedecer outro swab em gua estril, passar na mo lavada e semear no terceiro quadrante da placa; d) Incubar as placas a 36oC por 48h; e) Interpretar os resultados.


311

UNIDADE 9 MICROBIOTA NORMAL DO CORPO

1. MICROBIOTA NORMAL

A microbiota normal refere-se a populaes de microrganismos que habita a pele e mucosas de pessoas e de animais saudveis. Esses microrganismos vivem como comensais, trazendo benefcios ao corpo. O corpo humano adulto possui em torno de 100 trilhes de microrganismos, sendo que antes do nascimento o feto estril.

2. COMPOSIO DA MICROBIOTA NORMAL A microbiota normal composta por:

Residente: composta por microrganismos, sempre presentes no referido local, em maior quantidade, ou que rapidamente se renova aps remoo. No removida com o banho, por exemplo.

Transitria: microbiota temporria, adquirida conforme o grau de exposio e que depois de removida no mais coloniza o stio. Esta microbiota facilmente removida com a lavagem das mos com o uso de sabonetes (degermao).

Entre os microrganismos que compe a microbiota normal, existem trs grupos distintos: Microrganismos estritamente patognicos: so aqueles que ao serem detectados esto

sempre associados patogenia. Ex. Micobacterium tuberculosis, vrus HIV; Microrganismos potencialmente patognicos: so comuns de serem detectados, porm

nem sempre associados com a patogenia. So considerados comensais, que em determinadas condies podem se tornar nocivo ao organismo humano. Ex. Staphylococcus epidermidis;

Microrganismos oportunistas: aqueles que so adquiridos, mas s desenvolve alguma patogenia se o organismo estiver debilitado. Ex. Candida albicans.

Na qualidade de comensal, os microrganismos desempenham funes importantes ao organismo, pois participam da digesto alimentar, produzem vitaminas (vitamina K), secretam substancias que impedem o crescimento de outros microrganismos, estabelecendo-se uma relao antagnica, ou relaes sinrgicas, por exemplo, uma populao precursora modifica o pH para uma populao sucessora. As interaes entre os microrganismos e entre hospedeiro e microrganismos so constantes e tanto podem resultar em aspectos positivos quanto malficos ao hospedeiro.

3. COMO SE ADQUIRE OS MICRORGANISMOS?

Os microrganismos so adquiridos a partir do nascimento, dos primeiros contatos com o mundo externo. Isso se d pelo processo respiratrio, pela ingesto de alimentos e gua, por contato direto, por vetores, desde o inicio at o final da vida (Figura 33).


312

4. COLONIZAO/DOENA A exposio do hospedeiro aos microrganismos pode ocasionar uma colonizao

transitria, colonizar de forma permanente ou ocasionar doena. As doenas infecciosas so ocasionadas pela presena direta do microrganismo no hospedeiro (infeco) ou simplesmente pela ingesto de toxinas (intoxicao).

FIQUE LIGADO!!!

Colonizao: a multiplicao do microrganismo no hospedeiro, mas no interfere com as funes normais do corpo.

Doena: doena infecciosa ocorre quando a interao entre microrganismo e o hospedeiro leva a um processo patolgico. Qualquer alterao na normalidade da clula se caracteriza como doena.

Infeco: entrada de microrganismos exgenos ou a multiplicao elevada dos que so residentes.

Intoxicao: ao de uma toxina, ingerida junto com os alimentos ou produzida pelos microrganismos aps uma infeco.

Figura 33- Formas de transmisso de microrganismos

Fonte: 1.http://2.bp.blogspot.com/_Rd7r9Y23g9A/Rx-UEyvZibI/AAAAAAAAABE/vSb4tBUY_n8/s400/c%C3%A3o.bmp; 2.http://3.bp.blogspot.com/_kv1uWWHayTQ/SVlleo4Va3I/AAAAAAAAZhA/lQAawwkL8_8/s400/espirro.jpg; 3.

http://oglobo.globo.com/fotos/2007/12/11/11_MVG_viv_carnes_3253.jpg; 4.http://3.bp.blogspot.com/_BY-iWkqQTyA/R3-ikGx1hCI/AAAAAAAAATo/0SQOn34v5AY/s400/aperto+de+m%C3%A3o+2.bmp; 5.http://br.geocities.com/insecta_tv/Musca-domestica.JPG;

6.http://www.meionorte.com/imagens/COL63Paciente-internada-no-HUT-morre-pouco-depois-de-receber-alta.-Parentes-de-pacientes-fazem-denuncias.jpg; 7.http://3.bp.blogspot.com/_-IUr8M7oFb4/R-e0Rt-XpDI/AAAAAAAAA0o/vF2ScjBIXD8/s400/arranhao.jpg.

5. REAS DO CORPO HUMANO COLONIZADAS POR MICRORGANISMOS

Os microrganismos so comumente encontrados na conjuntiva, mucosa nasal, mucosa oral, faringe, pele, intestino grosso, reto, uretra e rgos genitais. J o ouvido mdio e interno, msculos, bexiga, glndulas, tero, fgado, bao, crebro, rins devem ser livres de microrganismos.


313

As reas colonizadas por microrganismos so influenciadas por fatores de colonizao, de modo que a populao seja estvel. Cada grupo de microrganismo tem seu stio receptor. Assim, fora desse stio, pode no haver colonizao ou trazer danos ao hospedeiro. Por exemplo, bactrias intestinais que colonizam a mucosa vaginal podem ocasionar uma infeco urinria.

O corpo apresenta mecanismos prprios para evitar o crescimento excessivo dos microrganismos, por exemplo, alterao do pH, produo de enzimas lticas (lisozima na lgrima e no muco), acidez estomacal, a pele, os plos, o jato de urina etc. (Figura 34).


Descubra o que so prebiticos e probiticos e a relao de ambos com os microrganismos.

Figura 34- Locais colonizados pelos microrganismos e os fatores limitantes a uma colonizao normal.


Estudos tm mostrado que as doenas infecciosas mais comuns so as causadas por microrganismos da microbiota normal. Isso acontece devido: a transferncia de microrganismos de um stio para outro (ex. mos contaminadas na boca), diminuio da microbiota competitiva (exemplo: uso de antibiticos interfere na microbiota residente e outra populao pode se sobressair), em indivduos imunocomprometidos (exemplo: qualquer microrganismo pode se sobressair).


314

Cada microrganismo tem uma porta de entrada principal, como por exemplo: a) Membranas mucosas do trato respiratrio (nariz e boca): contrai microrganismos

causadores de pneumonia, tuberculose, sarampo etc. Microrganismos mais comuns na boca, orofaringe e nasofaringe: Peptostreptococcus, Veilonella, Actinomyces, Fusobacterium, Streptococcus, Haemophilus, Neisseria;

b) Trato gastrintestinal: so transmitidos pelos alimentos contaminados, gua e dedos. Esses microrganismos podem ser destrudos pelo HCl, enzimas do estomago, bile e enzimas do intestino delgado. Ex: microrganismos causadores de hepatite, febre tifide, clera, salmonelose etc. Microrganismos mais comuns no intestino: Lactobacillus, Streptococcus, Clostridium, Bifidobacterium, Enterococcus e ainda as enterobactrias e os bacterides. No intestino grosso pode ser encontrada mais de 1011 bactrias/g de fezes com bactrias anaerbias excedendo em mais de mil vezes as aerbias.

c) Pele: a pele ntegra uma barreira natural, na qual poucos microrganismos conseguem coloniz-la. Mas leses e escoriaes mnimas so suficientes para haver colonizao, a exemplo das doenas furnculo, impetigo, erisipela, ttano. Microrganismos comuns na pele: Staphylococcus, Micrococcus, Corynebacterium, Propionibacterium, Peptostreptococcus;

d) Via parenteral: ocorre colonizao aps puno, injeo, picadas, cortes, cirurgias, ferimentos etc.

e) Microbiota do aparelho urinrio: Lactobacillus, Streptococcus, Staphylococcus (coagulase negativa).

6. VANTAGENS E DESVANTAGENS DA MICROBIOTA NORMAL

As vantagens da microbiota normal consistem em impedir a colonizao de patgenos causadores de provveis doenas, produo de vitaminas e estimular o sistema imune. A desvantagem que esses microrganismos podem causar doenas em determinadas circunstncias.


315

UNIDADE 10 FATORES DE VIRULNCIA DAS PRINCIPAIS BACTRIAS PATOGNICAS

No processo infeccioso, necessrio uma srie de eventos, desde o estabelecimento da infeco ou multiplicao excessiva de bactrias endgenas at a expresso dos fatores de virulncia. Os fatores de virulncia esto relacionados a componentes estruturais (parede, cpsula, fmbrias, plasmdios, flagelo), as enzimas e as toxinas.

1. ENTRADA DO MICRORGANISMO

Ao infectar o hospedeiro, a bactria usa de mecanismos para se livrar das defesas do corpo. A existncia de leses, queimaduras, fibrose cstica, idade do hospedeiro, local infeccionado, quantidade de microrganismos etc., favorece o estabelecimento deste microrganismo. Cada microrganismo se utiliza de uma forma para poder chegar at o hospedeiro, conforme visto na unidade 9.

2. ADERNCIA E INVASO

Aps a entrada do microrganismo, necessrio que ocorra aderncia s clulas epiteliais ou endoteliais, atravs das fmbrias (Figura 35), produtoras de adesinas. Essas molculas de superfcie no patgeno se unem especificamente aos receptores de superfcie no hospedeiro (glicoprotenas ou lipoprotenas), evitando a remoo do microrganismo. Outros componentes celulares tambm exercem essa mesma funo, como o cido lipoteicico e outras protenas de superfcie. As bactrias invasivas podem, inclusive, invadir clulas de defesa para iniciar a infeco. Exemplos: Escherichia coli enteropatognica (EPEC) possui pili tipo 1 (D-manose-clulas epiteliais), que

promove adeso s clulas epiteliais do intestino delgado e destruio das vilosidades. O pili formador de feixes favorece a formao de microcolnias em um pedestal. A EPEC insere um receptor de intimina (Tir) na membrana da clula epitelial que funciona como receptor para a intimina de invaso.

Neisseria gonorrhoeae (causadora da gonorria) possui fimbrias tipo 4 (pilina), para aderncia s clulas do epitlio colunar no ciliado, depois ocorre uma adeso mais ntima ao epitlio mais profundo, com endocitose direcionada pelo patgeno. Somente aps essa aderncia, que ocorre a multiplicao dos microrganismos.


A bactria Mycobacterium tuberculosis no produz toxinas e enzimas como fatores de agresso ao hospedeiro. No entanto, causadora da tuberculose. Descubra como essa doena desenvolve-se no hospedeiro.


316

Figura 35- Bactrias que se utiliza das fmbrias como fator de virulncia: 1. Escherichia coli enteropatognica (EPEC) e Neisseria gonorrhoeae.

Fonte: 1.http://nursextine.files.wordpress.com/2008/11/escherichia_coli.jpg; 2. TRABULSI et al. (2004).

3. MULTIPLICAO DOS MICRORGANISMOS NO TECIDO Os microrganismos se multiplicam rapidamente aps ocorrer infeco, como uma forma

de vencer as clulas de defesa. Os que apresentam multiplicao lenta, a exemplo do Mycobacterium tuberculosis e M. leprae, utilizam-se de outros mecanismos para persistir. Estes apresentam uma parede celular rica em cido miclico, a qual minimiza os efeitos das clulas de defesa (colonizao intracelular) e a entrada de substncias nocivas na clula.

A partir da multiplicao, o microrganismo poder ocasionar uma doena localizada ou sistmica e produzir enzimas e toxinas como mecanismos de agresso ao hospedeiro.

4. CPSULA OU GLICOCLICE

Alguns microrganismos podem apresentar cpsula/glicoclice, que impede a fagocitose. Quando uma bactria patognica perde a cpsula, seu poder de virulncia diminui, alm desta bactria se tornar suscetvel lise.

Streptococcus pneumoniae (causador de pneumonia): forma cpsula. Streptococcus mutans (associado crie): forma biofilme em decorrncia do glicoclice.

5.COMPONENTES DA PAREDE CELULAR

A parede celular dos microrganismos apresenta particularidades em relao aos mecanismos de patogenicidade. Alguns componentes so antignicos, a exemplo do LPS (lipdeo A) das bactrias Gram negativas e do Peptideoglicano das Gram positivas. Alm destas, as micobactrias apresentam cido miclico.

Lipdeo A: endotoxina liberada pelas bactrias Gram negativas aps lise celular. So relativamente estveis, fracamente antignica, moderadamente txicas. Produzem febre e outros efeitos no hospedeiro.

cido teicico e lipoteicico: so ligantes as clulas epiteliais, em S. pyogenes. Protena M: uma cadeia protica comum em Streptococcus pyogenes, (adesinas). cido miclico: camada impermevel em Mycobacterium spp., que impede a entrada ou

sada de substncias. Peptideoglicano: semelhante endotoxina, sendo mais fracamente ativo, estimula a

produo de pirognio, comum as Gram positivas.


317

6.PLASMDEO E BACTERIFAGOS Muitas bactrias adquirem a capacidade de ser virulenta atravs do recebimento de um

plasmdeo, com informao gentica especfica ou ao serem infectadas por bacterifagos. Estes

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