a estimulação da glandula pineal.pdf

Camila Lopes Petrilli

Regulao da atividade da glndula pineal

por estimulao purinrgica

So Paulo

2012

Camila Lopes Petrilli

Regulao da atividade da glndula pineal

por estimulao purinrgica

So Paulo

2012

Dissertao apresentada ao

Instituto de Biocincias da

Universidade de So Paulo, para

obteno do Ttulo de Mestre em

Cincias, na rea de Fisiologia

Geral.

Orientadora: Prof Dr Zulma F.

S. Ferreira.

FICHA CATALOGRFICA

Petrilli, Camila Lopes

Regulao da atividade da glndula pineal por estimulao purinrgica/ Camila

Lopes Petrilli; orientadora Zulma F. S. Ferreira. So Paulo, 2012.

105 f.

Dissertao (Mestrado) Instituto de Biocincias da Universidade de So Paulo.

Departamento de Fisiologia.

1. Glndula Pineal. 2. Purinas. 3. Melatonina. I. Universidade de So

Paulo. Instituto de Biocincias. Departamento de Fisiologia. II. Ttulo.

COMISSO JULGADORA

Prof(a). Dr(a). Prof(a). Dr(a).

Prof. Dr.

Orientadora

iv

minha famlia e amigos.

v

No importa aonde voc parou...

Em que momento da vida voc cansou...

O que importa que sempre possvel e necessrio Recomear.

Recomear dar uma chance a si mesmo...

renovar as esperanas na vida e o mais importante...

Acreditar em voc de novo.

Sofreu muito nesse perodo?

Foi aprendizado...

Chorou muito?

Foi limpeza da alma...

Ficou com raiva das pessoas?

Foi para perdo-las um dia...

Sentiu-se s por diversas vezes?

porque voc fechou as portas at para os anjos...

Acreditou que tudo estava perdido?

Era o incio da sua melhora...

Pois ...

Agora hora de reiniciar...

Carlos Drummond de Andrade

No devemos ter medo dos confrontos...

at os planetas se chocam e do caos nascem as estrelas.

Charles Chaplin

vi

AGRADECIMENTOS

No me prendo a nada que me defina.

Sou companhia, mas posso ser solido...

Tranquilidade e inconstncia, pedra e corao.

Sou abraos, sorrisos, nimo, bom humor, sarcasmo, preguia e sono.

Msica alta e silncio.

Serei o que voc quiser, mas s quando eu quiser.

Clarice Lispector

Agradeo Deus, pois sem Ele, nada disso seria possvel.

Agradeo aos meus pais e ao meu irmo, pelo apoio incondicional e dedicao

nesta e em todas as etapas da minha vida.

minha av por ser meu exemplo enquanto trilho meu prprio caminho.

Aos meus tios, tias e primos pela presena constante, apoio e carinho

especialmente nos momentos difceis.

Aos meus amigos de faculdade Biu, Gabi, M, Nati, Nati Mackenzie e Z, por

estarem sempre comigo (mesmo que de longe) e compreenderem (na maioria das

vezes) a minha ausncia, durante a realizao deste trabalho.

Agradeo aos amigos que fiz na USP, Alex, Ceci, Nathi, Leopoldo, Bruno, Kelly,

Nathali, Danilo (Presuntinho), por todos os cafs e cervejas que tomamos juntos,

pelas conversas no corredor, por terem tornado mais feliz esta etapa da minha vida.

vii

Agradeo famlia LaboCrono: Adriessa, Alessandra, Cludia, Daiane, Erika,

Eliana, Marina, Luciana, Leila, Gabriela, Leticia, Eduardo, Pedro, Sanseray, Luis,

Dbora, Sandra, Edurardo (Mohamed), por terem sido sempre muito mais que

colegas de trabalho, por terem compartilhado comigo experincias, conhecimento,

alegrias, tristezas, por terem sido minha cabea quando quem falou mais alto foi meu

corao. Obrigada por tudo, sem vocs nada disso seria possvel.

Agradeo ao Marco meu melhor amigo, companheiro, parceiro de todas as

horas e namorado, por ter me aguentado e dividido comigo todos os momentos desta

caminhada.

Agradeo Dr Valerie Simonneaux do Laboratoire de Neurobiologie des

Rhythms em Estrasburgo na Frana, pelo auxlio na realizao de alguns ensaios.

Agradeo em especial Prof Dr Regina Pekelmann Markus por ter aberto as

portas do laboratrio para mim, pela compreenso, por me surpreender, instigar e

me ensinar a cada dia uma coisa nova.

Agradeo minha orientadora Prof Dr Zulma, pela oportunidade, pacincia,

confiana, respeito e principalmente por todos os ensinamentos profissionais e

pessoais ao longo destes anos.

Agradeo, por fim, o auxlio financeiro da FAPESP (2009/12307-8), CAPES e

CNPq, cuja contribuio foi fundamental para a realizao deste trabalho.

Sumrio

INTRODUO .................................................................................................................. 1

1. Sistema Purinrgico ........................................................................................................ 1

1.1 Perspectiva Histrica ............................................................................................ 1

1.2 ATP......................................................................................................................... 2

1.3 Receptores Purinrgicos ....................................................................................... 6

1.3.1 Receptores P1 ................................................................................................. 7

1.3.2 Receptores P2X ............................................................................................... 7

1.3.3 Receptores P2Y ............................................................................................... 9

2. Mecanismos moleculares de transduo de sinal de receptores purinrgicos ........ 12

2.1 Protena ativadora 1 (AP-1) ................................................................................ 12

2.2 Fator de transcrio nuclear kappa B(NF- B) .................................................. 13

3. Glndula Pineal ............................................................................................................ 15

3.1 Morfologia e Inervao da Glndula Pineal ..................................................... 16

3.2 Vias metablicas de sntese e degradao da melatonina ............................... 17

3.3 Controle da Sntese de Melatonina .................................................................... 21

3.4 Atividades Biolgicas da Melatonina ................................................................ 23

3.5 Receptores Purinrgicos na Glndula Pineal.................................................... 24

OBJETIVOS ....................................................................................................................... 30

MATERIAL E MTODOS ............................................................................................... 32

1. Animais ......................................................................................................................... 32

2. Drogas e Reagentes ...................................................................................................... 32

3. Preparo de Drogas ........................................................................................................ 34

4. Cultura de Glndula Pineal ......................................................................................... 35

5. Cultura de Pinealcitos ................................................................................................ 35

6. Dosagem de indolaminas por cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC) .... 37

7. Dosagem radioimunolgica de melatonina ............................................................... 37

8. Extrao de protena nuclear ....................................................................................... 38

9. Ensaio de Eletromobilidade em Gel (EMSA) ............................................................. 39

10. Ensaio de supershift .............................................................................................. 40

11. Extrao de RNA ................................................................................................... 40

12. Sntese da fita de DNA complementar (cDNA) por transcriptase reversa ....... 41

13. RT-PCR em tempo real .......................................................................................... 42

14. Ensaio de atividade enzimtica da AA-NAT ...................................................... 43

15. Ensaio de atividade enzimtica da HIOMT ........................................................ 44

16. Anlise dos resultados .......................................................................................... 44

RESULTADOS .................................................................................................................. 47

1. Efeito da estimulao purinrgica sobre a produo de NAS e melatonina

induzidas por isoproterenol em glndulas pineais em cultura .................................... 47

2. Efeito da estimulao purinrgica sobre a produo de melatonina induzida por

isoproterenol em pinealcitos .......................................................................................... 48

3. Mecanismo molecular envolvido na estimulao de receptores purinrgicos P2Y1

na glndula pineal............................................................................................................. 49

3.1 Protena Ativadora 1 (AP-1) ............................................................................... 49

3.2 Fator de transcrio NF- B................................................................................. 50

3.2.1 Decurso temporal ......................................................................................... 50

3.2.2 Estudo funcional - Efeito de PDTC sobre a produo de NAS e

melatonina induzida por isoproterenol ................................................................... 52

4. Expresso gnica das enzimas AA-NAT e HIOMT na glndula pineal de ratos ... 53

5. Atividade enzimtica das enzimas AA-NAT e HIOMT em pinealcitos isolados . 54

6. Efeito do antagonista seletivo A3P-5P sobre a produo de NAS e melatonina

induzida por isoproterenol .............................................................................................. 55

DISCUSSO...................................................................................................................... 59

CONCLUSES ................................................................................................................. 69

RESUMO ........................................................................................................................... 71

ABSTRACT ........................................................................................................................ 72

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ................................................................................ 73

SMULA CURRICULAR ................................................................................................. 87

ANEXOS ............................................................................................................................ 90

Lista de Abreviaturas

alfa

beta

[Ca2+]i concentrao intracelular de Ca2+

2-Cl-adenosina 2-cloroadenosina

2-ClATP 2-cloroATP

2MeSADP 2-metiltioADP

2MeSAMP 2-metiltio AMP

2MeSATP 2-metiltio ATP

5-HIAA cido 5-hidroxi-indolactico

5-HIAL 5-hidroxi-indolacetaldedo

5-HL 5-hidroxitriptofol

5-HT serotonina

5-HTP 5-hidroxitriptofano

5-MIAA cido 5-metoxi-indolactico

5-ML metoxitriptofol

A2P5P adenosina 2, 5-bifosfato

A3P5P adenosina 3, 5-bifosfato

A3P5PS adenosina 3'-fosfato-5'-fosfosulfato

AAAD aminocido aromtico descarboxilase

AA-NAT enzima arilalquilamina N-acetiltransferase

AC adenilil ciclase

ADP adenosina 5'difosfato

ADPS adenosina 5'-O-2-tiodifosfato

AFMK N1-acetil-N2-formil-5-metoxiquinuramina

Akt tirosina quinase e serina/treonina quinase

AMK N1-acetil-5-metoxiquinuramina

AMP monofosfato de adenosina

AMPc adenosina monofosfato cclico

AMP-PNP adenosina paranitrofenilfosfato

ANOVA anlise de varincia

AP-1 protena ativadora 1

ATP adenosina 5'-trifosfato

BAPTA 1,2-bis (O-aminofenoxi) etano-N, N, N', N'-cido tetraactico

bZIP zper de leucina bsico

CaMKII protena quinase dependente de calmodulina tipo II

CAT catalase

CRE elementos responsivos a AMPc

CREB protena ligante ao elemento de resposta do AMPc

CYP450 citocromo P450

DAG dicilglicerol

DNA cido desoxirribonuclico

EMSA ensaio de eletromobilidade em gel

E-NPPs ectonucleotdeo pirofosfatase/fosfodiesterase

E-NTPDases ecto-nucleosdeo-trifosfato-difosfohidrolases

epm erro padro da mdia

EPPO eosinilperoxidase

GMPc guanosina monofosfato cclico

HIOMT enzima hidroxindol-O-metiltransferase

HRP horseradish peroxidase

IB-MECA N6-(3-iodo-benzil)-5-(N-metilcarbamoil) adenosina

ICER repressor induzido por AMPc

IDO indolamina-2,3-dioxigenase

IKB protena inibitria kappa B

IKK protena quinase de IKB

IP3 trifosfato de inositol

ISO isoproterenol

IB protena inibitria kappa B

MAOB monoamina oxidase B

MAPKs protenas quinases ativadas por mitgenos

MPO mieloperoxidase

NAS N-acetilserotonina

NECA 5'-N-etilcarboxamidoadenosina

NF-B fator nuclear kappa B

NO xido ntrico

NPY neuropeptdeo Y

NSQs ncleos supraquiasmticos

NTPDase nucleosdeo-trifosfato-difosfohidrolases

PCR Reao em cadeia da polimerase

PDTC pirrolidina ditiocarbamato

PKA protena quinase dependente de AMPc

PKC protena quinase dependente de clcio

PLA foslolipase A

PLC fosfolipase C

PLD fosfolipase D

PPADS cido piridoxalfosfato-6-azofenil-2, 4'-disulfnico

PVN ncleo paraventricular

QR2 quinona redutase 2

RHD domnio de homologia Rel

RNAm cido ribonuclico mensageiro

RNS espcies reativas de nitrognio

ROS espcies reativas de oxignio

R-PIA (R)N6-fenilisopropiladenosina

STAT3 transdutor de sinal e ativador da transcrio 3

TAD domnio de ativao de transcrio

TPH triptofano-hidroxilase

TPOH enzima triptofano hidroxilase

UDP uridina-5'-difosfato

UTP uridina-5'-trifosfato

M e mM micromolar e milimolar, respectivamente

INTRODUO

INTRODUO 1

INTRODUO

1. Sistema Purinrgico

1.1 Perspectiva Histrica

O termo sistema purinrgico refere-se sinalizao celular desencadeada

por purinas e pirimidinas. Adenosina, adenosina 5'-difosfato (ADP) e adenosina

5'-trifosfato (ATP) so as molculas conhecidas como purinas e, uridina-5'-

trifosfato (UTP) e uridina-5'-difosfato (UDP) representam as pirimidinas. Uma

vez liberados, estes nucleotdeos interagem com receptores purinrgicos

especficos mediando diferentes eventos biolgicos, tais como:

neurotransmisso, contrao do msculo liso, resposta imunolgica, agregao

plaquetria, entre outros (Burnstock, 2006).

O conceito de purinas como molculas sinalizadoras extracelulares surgiu

em 1929 com a demonstrao realizada por Drury e Szent-Gyrgyi que o

nucleosdeo adenosina e o nucleotdeo monofosfato de adenosina (AMP),

extrados do msculo cardaco de roedores, podiam reduzir a contratilidade

cardaca, aumentar a dilatao arterial, reduzir a presso sangunea e inibir a

contrao intestinal. Em 1934, Gillespie foi o primeiro a apontar uma relao

entre a atividade das purinas e sua estrutura, demostrando que a desaminao

reduzia grandemente sua atividade, e que a remoo dos grupamentos fosfatos

da molcula influenciava, no apenas a potncia, mas tambm o tipo de

resposta, sendo que ATP induzia a um aumento da presso sangunea,

INTRODUO 2

enquanto adenosina produzia hipotenso. Esta foi a primeira indicao de que

adenosina e ATP atuavam de forma distinta, o que sugeria a existncia de

diferentes receptores para purinas. Contudo, a denominao receptores

purinrgicos s foi formalmente reconhecida em 1978, quando Burnstock

props a existncia de duas classes de receptores denominadas P1, em que a

adenosina o ligante natural e, P2 que reconhecem principalmente ATP, ADP,

UTP e UDP (para reviso Ralevic & Burnstock, 1998). Em 1985, Burnstock e

Kennedy, tendo como base ensaios farmacolgicos, estabeleceram a distino

entre dois tipos de receptores P2, denominados P2X e P2Y. Posteriormente, com

base em suas estruturas moleculares e mecanismos de ao, a classificao dos

receptores P2 foi consolidada em 1994 em uma importante reviso de autoria

dos pesquisadores Abbracchio e Burnstock (para reviso Burnstock, 2007b).

1.2 ATP

O ATP uma molcula de distribuio ubqua no sistema nervoso central

e perifrico e fundamental atividade celular. composto de trs fosfatos, um

acar e um anel de adenina (Figura 1). A ligao entre os dois ltimos grupos

fosfato uma ligao fraca e instvel. Quando quebrada, o ATP alterado para

ADP e um fosfato, liberando energia para ser usado em reaes celulares. ATP

uma molcula solvel e, portanto, facilmente transportada. A maior parte das

molculas do ATP sintetizada na mitocndria e difunde-se para o citoplasma

e para as membranas.

INTRODUO 3

Figura 1. Representao estrutural do ATP. O ATP composto de trs fosfatos, um acar e

um anel de adenina, quando a ligao entre os dois ltimos grupos fosfato quebrada, o ATP

convertido em ADP e um fosfato, liberando energia para ser usada no metabolismo celular.

Em condies metablicas normais a concentrao citoplasmtica de ATP

10 mmol/L. Este ATP citoplasmtico utilizado como fonte de energia em

eventos celulares que envolvem, por exemplo, a Na+/K+-ATPase, enzima

responsvel por manter o potencial de membrana em repouso; a Ca2+-ATPase,

responsvel pela homeostase de Ca2+ no citoplasma; vrias protenas quinases

envolvidas na transduo de sinal; H+-ATPase, presente na membrana da

vescula sinptica e responsvel por acidificar o lmen vesicular e gerar um

gradiente de prtons necessrio para a captao de neurotransmissores; eventos

de exocitose propriamente ditos; dentre outras (Sperlagh & Vizi, 1996).

Alm dos estoques citoplasmticos e mitocondriais, o ATP est presente

em todos os tipos de vesculas sinpticas nos terminais nervosos, podendo ser

armazenado de forma isolada ou juntamente com outros neurotransmissores

INTRODUO 4

como noradrenalina, acetilcolina e glutamato. Quando co-estocado com outros

neurotransmissores o contedo vesicular de ATP excedente em nmero de

molculas e, dependendo do tipo de vescula, as propores variam de 2:1 a

50:1, correspondendo a concentrao de ATP a cerca de 1-200 mM dentro da

vescula (Sperlagh & Vizi, 1996).

A liberao de ATP de muitas clulas uma resposta fisiolgica ou

fisiopatolgica como estresse mecnico, hipxia, trauma ou processos

inflamatrios (Burnstock, 2006). Alm das evidncias da liberao de ATP por

exocitose vesicular em clulas neuronais (Pankratov et al., 2007), estudos

tambm suportam a liberao vesicular de ATP em astrcitos (Bowser & Khakh,

2007) atravs da ao de lisossomos (Zhang et al., 2007). Mecanismos adicionais

da liberao de nucleotdeos incluem transportadores que ligam ATP, canais

acoplados conexina ou panexina, como, por exemplo, o P2X7, um subtipo de

receptor P2X ou canais de nions dependentes de voltagem (Sabirov & Okada,

2005; Scemes et al., 2007).

Aps a liberao, ATP e outros nucleotdeos sofrem rpida degradao

enzimtica, degradao esta, funcionalmente importante, uma vez que

metablitos do ATP atuam como ligantes fisiolgicos em vrios receptores

purinrgicos (Zimmermann, 2006). Vrias famlias de enzimas esto envolvidas

na hidrlise de ATP liberado para o meio extracelular: (1) ecto-nucleosdeo-

trifosfato-difosfohidrolases (E-NTPDases), das quais NTPDase 1, 2, 3 e 8 so

extracelulares; (2) ectonucleotdeo pirofosfatase/fosfodiesterase (E-NPPs); (3)

INTRODUO 5

fosfatases alcalinas e (4) ecto-5'-nucleotidases. A enzima NTPDase1 hidrolisa

ATP diretamente para AMP e UTP a UDP, enquanto a enzima NTPDase2

hidrolisa ATP a ADP. A enzima 5'-nucleotidase finaliza esta cascata ao hidolisar

o AMP a adenosina (Figura 2) (para reviso, Burnstock, 2006).

Figura 2. Representao esquemtica do sistema purinrgico envolvendo ATP, enzimas

de degradao e receptores. O ATP, liberado por exocitose vesicular do terminal nervoso

simptico, atua como cotransmissor em receptores purinrgicos P2X e P2Y. ADP e

adenosina so gerados atravs da atividade de ectonucleotidases ativando receptores P2Y

e P1 especficos. A liberao de ATP pode tambm ser efetuada via canais na membrana

celular evocando aes autcrinas ou parcrinas.

INTRODUO 6

1.3 Receptores Purinrgicos

Na tabela 1 apresentamos um resumo das caractersticas farmacolgicas e

mecanismos de transduo dos receptores purinrgicos.

Tabela 1 Caractersticas Farmacolgicas e Mecanismos de Transduo dos

Receptores Purinrgicos

Receptor P1 Receptor P2

Ligante endgeno

Adenosina

ATP ADP UTP UDP

Dinucleotdeos de adenosina

Subgrupo A P2X P2Y

Tipo de Receptor

Acoplados protena G:

Gs, Gq, Gi, Go Canal inico

Acoplados protena G: Gq/11, Gi, Gs

Subtipos A1, A2A, A2B, A3 P2X1-7 P2Y1, P2Y2, P2Y4, P2Y6,

P2Y11, P2Y12, P2Y13, P2Y14

Efetores IP3, Ca2+, AMPc Ca2+> Na+> K+ IP3, Ca2+, DAG

, AMPc

Agonistas

R-PIA CGS21680 IB-MECA

NECA

Seletivo P2X , -mATP , -mATP

Bz-ATP

No-seletivo ATPS

2MeSATP Ap4A

Seletivo P2Y

ADP 2MeSADP

ADPS UTP/UDP

Antagonistas XAC, CSC,

MRS 1067

Suramina, reativo azul. PPADS (receptor acoplado a PLC)

A3'P5'P, A2'P5'P, A3'P5'PS (P2Y1), 2MeSAMP (P2Y12)

Abreviaturas: R-PIA - (R)N6-fenilisopropiladenosina; CGS21680 2-p-(2-Carboxietil) fenetilamino-5-N-etilcarboxamidoadenosina; IB-MECA - N6-(3-iodo-benzil)-5-(N-metilcarbamoil) adenosina; NECA - 5'-N-etilcarboxamidoadenosina; XAC Congnero amino xantina; CSC - 8-(3-clorostiril) cafena; MRS 1067 - 3,6-dichoro-2'-isopropiloxi-4'-metilflavona; , -mATP - , -metileno adenosina 5-trifosfato; , -mATP - , -metileno adenosina 5-trifosfato; Bz-ATP benzoil ATP 2(3)-O-(4-Benzoylbenzoyl) adenosina 5-trifosfato; ATPS adenosina 5-O-(3-tio) trifosfato; 2MeSATP 2-metil(tio) adenosine- 5'- O- trifosfato;Ap4A - diadenosinetetrafosfato; ADP - adenosina 5'difosfato; 2MeSADP 2-metil(tio) adenosina 5difosfato; ADPS - adenosina 5-O-(2-tiodifosfato); UTP - uridina-5'-trifosfato; UDP -uridina-5'-difosfato; PPADS - cido piridoxalfosfato-6-azofenil-2, 4'-disulfnico; A3'P5'P - adenosina 3, 5-bifosfato; A2'P5'P - adenosina 2, 5-bifosfato; A3'P5'PS - adenosina 3'-fosfato-5'-fosfosulfato; 2MeSAMP 2 metil(tio) monofosfato de adenosina.

INTRODUO 7

1.3.1 Receptores P1

Os receptores P1 so receptores metabotrpicos, acoplados protena G,

cujo ligante endgeno a adenosina. Quatro diferentes subtipos de receptores

P1 foram clonados e caracterizados: A1, A2A, A2B e A3 e, como todos os

representantes da superfamlia dos receptores acoplados a protena G, estes

apresentam 7 segmentos transmembrnicos, o terminal amino voltado para o

meio extracelular e o terminal carboxil para o meio intracelular (Ralevic &

Burnstock, 1998; Burnstock 2007b). Estes diferentes subtipos se diferenciam pelo

tipo de protena G a que esto acoplados e pela transduo de sinais que

desencadeiam, sendo A1 e A3 ligados protena inibitria Gi/o e A2A e A2B

ligados protena estimulatria GS (Fredholm et al., 2001). Quando ativados, os

receptores A1 e A3 inibem a adenilil ciclase (AC), levando a uma diminuio no

monofosfato cclico de adenosina (AMPc) e um aumento na concentrao

intracelular de Ca2+ ([Ca2+]i), por uma via que envolve a ativao da enzima

fosfolipase C (PLC). Os receptores A2A e A2B por sua vez, levam a uma ativao

da AC, aumentando a concentrao intracelular de AMPc (Abbracchio et al.,

1995; Fredholm et al., 2001).

1.3.2 Receptores P2X

Os receptores P2X so protenas de membrana que formam canais inicos

na bicamada lipdica da membrana celular. Em resposta a agonistas, estes

canais permitem a passagem rpida, no-seletiva, de ctions de acordo com a

INTRODUO 8

seguinte permeabilidade inica: Ca2+>>Na+>K+. Dessa forma, a principal via de

sinalizao ativada por esses receptores o aumento da [Ca2+]i, que leva

despolarizao da membrana e ativao de diversas quinases intracelulares

como protena quinase dependente de clcio (PKC), protenas quinases ativadas

por mitgenos (MAPKs) e protena quinase dependente de clcio-calmodulina

tipo II (CaMKII) conferindo, ativao de receptores P2X, eventos

intracelulares complexos (Kles et al., 2008).

Os receptores P2X so conjuntos homomricos ou heteromricos de trs

subunidades proticas. At o momento, foram clonados sete subtipos de

receptores P2X (P2X1-7). Considerando que muitos desses receptores so

expressos na mesma clula, a formao de receptores heterotrimricos pode

produzir um grande nmero de complexo de receptores com caractersticas

farmacolgicas e funcionais diferenciadas (Ralevic & Burnstock, 1998; Roberts et

al., 2006).

A plasticidade funcional destes receptores pode ser tambm observada

atravs de sua interao com vrias macromolculas que podem modificar a

localizao, o trfego e a expresso destes receptores na membrana celular alm

de regular sua ativao, cintica de dessensibilizao e seletividade inica

(Kles et al., 2008).

INTRODUO 9

1.3.3 Receptores P2Y

Assim como os receptores P1, os receptores P2Y pertencem superfamlia

dos receptores acoplados protena G, e acoplam-se com protenas G dos tipos

Gq/11, Gs e Gi. Estruturalmente apresentam sete domnios transmembrnicos,

domnio amino-terminal constitudo de diversos stios de glicosilao e domnio

carboxi-terminal intracelular com diversos stios de ligao/fosforilao para

protenas quinases. Alguns resduos positivamente carregados nos domnios 3,

6 e 7 so cruciais para ativao do receptor por agonistas (Abbracchio et al.,

2006).

At o momento foram clonados em mamferos oito subtipos de receptores

P2Y (P2Y 1, 2, 4, 6, 11, 12, 13, 14). Estes nmeros indicam a ordem cronolgica em que

foram clonados. Os nmeros que faltam representam receptores que no

ocorrem em mamferos como o receptor p2y3 de aves, o receptor tp2y,

encontrado em peru e o receptor p2y8, expresso na placa neural de Xenopus

laevis ou receptores que possuem certo grau de identidade com os receptores

P2Y, mas que no respondem a nucleotdeos (p2y5, p2y7, p2y9, p2y10 e p2y15)

como o receptor inicialmente denominado p2y7 que atua como um receptor

para leucotrieno B4, mas no para nucleotdeos (para reviso Abbracchio et al.,

2006).

Segundo a diviso farmacolgica proposta por Abbracchio e

colaboradores (2006), os receptores P2Y podem ser subdivididos em: (I)

receptores que respondem preferencialmente aos nucleotdeos de adenina, ATP

INTRODUO 10

e ADP, incluindo os receptores P2Y1, 11, 12, 13; (II) receptores que respondem

preferencialmente aos nucleotdeos de uracila, UTP ou UDP, P2Y4 e P2Y6 em

humanos; (III) receptores de seletividade mista, que respondem igualmente ao

ATP e ao UTP, P2Y2; e (IV) receptores que respondem apenas a compostos de

uracila difosfato com aucares (UDP-glicose e UDP-galactose), como P2Y14.

Classicamente, os antagonistas mostram o seguinte perfil: suramina

antagoniza a maior parte dos receptores P2Y com exceo do receptor P2Y4;

PPADS (cido piridoxalfosfato-6-azofenil-2, 4'-disulfnico) um potente

antagonista apenas de receptores P2Y1; reativo azul 2 no efetivo no bloqueio

de receptores P2Y2 (tabela 1) (von Kugelgen, 2006).

No mecanismo de transduo, os receptores P2Y1, 2, 4, 6, 11 acoplados a

protena Gq/11 estimulam a enzima PLC, e levam formao de trifosfato de

inositol (IP3) e diacilglicerol (DAG), com subsequente mobilizao de [Ca2+]i; o

receptor P2Y11, acoplado protena Gi/0, estimula a enzima AC aumentando os

nveis de AMPc, enquanto os receptores P2Y12, 13, 14, por acoplamento protena

Gi/0, inibem a atividade desta enzima. Os receptores P2Y podem ainda ativar

fosfolipase A (PLA), fosfolipase D (PLD), MAPK, tirosina quinase e

serina/treonina quinase (Akt) (revisto por Franke & Illes, 2006).

Portanto, as respostas funcionais decorrentes da ativao de receptores

purinrgicos podem ser reguladas por uma srie de vias de mensageiros

intracelulares (Figura 3). Alteraes na translocao de fatores de transcrio

como AP-1 (protena ativadora 1), NF- B (fator nuclear kappa B), CREB

INTRODUO 11

(protena ligante ao elemento de resposta do AMPc) e STAT3 (transdutor de

sinal e ativador da transcrio 3) tm sido descritas (Burnstock, 2007a).

Figura 3. Representao esquemtica dos mecanismos de sinalizao purinrgica.

Nucleotdeos e nucleosdeos se ligam a receptores P1 e P2Y acoplados a enzimas efetoras

de transduo de sinal. A ativao destas enzimas leva gerao de segundos mensageiros

ou a estimulao de protenas quinases que regulam a expresso de genes alvo. As

respostas funcionais, portanto, podem ser reguladas por uma srie de vias de segundos

mensageiros, como por exemplo, via de ativao de adenilil ciclase (AC), fosfolipase C

(PLC), fosfolipase A (PLA), fosfolipase D (PLD), estimulando monofosfato de adenosina

cclico (AMPc), Ca2+, diacilglicerol (DAG), trifosfato de inositol (IP3) e xido ntrico (NO),

protena quinase ativada por mitgeno (MAPK), protena quinase dependente de clcio

(PKC), quinase serina/treonina (Akt) e protena quinase dependente de clcio-calmodulina

(CaMK). Alteraes na translocao de fatores de transcrio como AP-1, NF-kB, CREB e

STAT3 tm sido descritas. A ativao de receptores P2X com subsequente aumento da

[Ca2+]i pode resultar tambm na ativao das diversas quinases citadas (adaptada de

Burnstock, 2007a).

INTRODUO 12

2. Mecanismos moleculares de transduo de sinal de receptores

purinrgicos

2.1 Protena ativadora 1 (AP-1)

A protena ativadora 1 (AP-1) um complexo dimrico formado por

molculas das famlias Jun (c-Jun, JunB e JunD) e Fos (c-Fos, FosB, Fra1 e Fra2).

Os genes da famlia Jun so proto-oncogenes de resposta primria, induzidos

por estmulos extracelulares, como fatores de crescimento, hormnios e outros

mitgenos que, quando expressos, codificam para protenas nucleares com

atividade de fatores de transcrio (Ryseck et al., 1988). Tais genes, juntamente

com a famlia dos genes Fos codificam fosfoprotenas nucleares, que se

associam e formam o fator de transcrio AP-1.

Estas protenas tm em comum um domnio rico em resduos de leucinas

essencial para a dimerizao e ligao com o DNA, composto por sete

aminocidos que formam homodmeros jun-jun ou heterodmeros fos-jun, na

forma de -hlices, denominados zper de leucina bsico(bZIP). O complexo

AP-1 regula a transcrio de genes alvos, positiva ou negativamente,

dependendo da composio dos dmeros (Angel & Karin, 1991; Sassone-Corsi et

al., 1988).

Na glndula pineal de ratos o fator de transcrio AP-1 exibe um ritmo de

atividade in vivo temporalmente correlacionado com o ritmo de produo de

melatonina, sendo a atividade noturna do AP-1 cinco vezes maior que a

encontrada na fase de claro. Este padro de ativao tem sido tambm

INTRODUO 13

demonstrado em glndulas pineais em cultura estimuladas por noradrenalina,

onde o acmulo das protenas JunB e cFos tem sido demonstrado em extratos

nucleares de pineais aps estimulao tanto in vitro como in vivo (Carter, 1994).

2.2 Fator de transcrio nuclear kappa B (NF- B)

O fator de transcrio NF- B (do ingls, nuclear factor kappa B) composto

por uma famlia de protenas que possuem em comum uma sequncia de 300

aminocidos denominada de domnio de homologia Rel (RHD, do ingls, Rel

homology domain). Estas regulam a expresso de uma grande variedade de

genes, sendo uma via central na resposta imunolgica inata e adaptativa.

Atualmente, fazem parte da famlia Rel cinco subunidades que apresentam-se

como homo ou heterodmeros: p50 e p52 (p50 gerada atravs da clivagem de

p105, e p52 a partir da protena p100), que no possuem um domnio de

ativao de transcrio (TAD, do ingls, transcription activation domain), sendo

ento, responsveis pela inibio da transcrio de um gene; e Rel A (ou p65),

Rel B e c-Rel, que possuem este domnio e podem atuar positivamente sobre a

transcrio gnica (Hayden & Ghosh, 2008).

Quando inativos, os dmeros encontram-se no citoplasma associados a

uma famlia de protenas inibitrias, I B, que mantm o dmero do NF-B

sequestrado no citoplasma, impedindo sua translocao ao ncleo e sua

associao com o DNA (Hayden & Ghosh, 2008). Estmulos diversos induzem a

ativao de protenas quinase de I B (IKKs), que so quinases responsveis por

INTRODUO 14

fosforilar as molculas de I B e fazer com que estas sejam degradadas via

proteassoma, permitindo a translocao nuclear do dmero NF- B (Verma et al.,

1995; Hayden & Gosh, 2008).

A translocao nuclear de NF- B pode ser funcionalmente avaliada

atravs da utilizao de ferramentas farmacolgicas como pirrolidina

ditiocarbamato (PDTC), composto que impede a ligao do NF- B s regies

promotoras do gene aps a entrada no ncleo celular inativando-o (Ziegler-

Heitbrock et al., 1993; Wolchok et al., 1994; De Plaen et al., 2006; Jiang et al.,

2008).

Trabalhos de nosso grupo tm demonstrado o envolvimento da via NF- B

na sntese de melatonina pela glndula pineal de ratos. A glndula pineal

apresenta uma expresso constitutiva de dmeros p50/p50 de NF- B com um

ritmo de translocao nuclear, inverso ao da melatonina. Desta forma, durante a

fase de claro, os nveis constitutivos de NF- B so crescentes, sofrendo uma

queda brusca no incio da fase de escuro (Cecon et al., 2010). Uma vez que

p50/p50 no possui o domnio de transativao (Hayden & Ghosh, 2008), ele

atua como repressor da transcrio gnica o que explica seus baixos nveis

durante a noite, permitindo a produo de melatonina. De fato, a inibio do

NF- B constitutivo potencia a sntese de melatonina induzida por

noradrenalina em pineais em cultura (Ferreira et al., 2005). Contudo, em pineais

de ratos em cultura por 48 horas a presena dos dmeros de NF- B p50/p50 e

INTRODUO 15

p50/RelA foi encontrada, revelando o estado de ativao celular induzido pela

manipulao experimental (Carvalho-Sousa et al., 2011).

3. Glndula Pineal

A identificao da glndula pineal como um rgo distinto do crebro

remonta aos sculos III e IV aC. Galeno de Prgamo (130-200 DC) parece ter

sido o primeiro a descrever a localizao da pineal, no crebro humano,

caracterizando-a como uma glndula (anloga aos gnglios linfticos), e

nomeando-a konareion (conarium em Latim) por sua forma de pinha. O rgo foi

posteriormente denominado glndula pinealis, da glndula pineal. Vrias foram

as interpretaes do seu papel funcional, que incluem desde um esfncter

controlador do fluxo do esprito animal at a interpretao de Ren Descartes

(15961650) de sede da alma ou como o rgo de coordenao das funes

psicofisiolgicas do organismo (Arendt, 1995).

Presente em todos os vertebrados, a glndula pineal um rgo

neuroendcrino cuja produo hormonal classicamente controlada pelo ciclo

de iluminao ambiental caracterstico do dia e da noite. Esse controle tal que,

na enorme maioria das espcies estudadas (seja de atividade diurna, noturna ou

crepuscular), a produo de melatonina, hormnio produzido e liberado por

esta glndula, exclusivamente noturna e a magnitude e durao de sua

concentrao plasmtica est na estrita dependncia da durao da fase de

INTRODUO 16

escuro. Dessa forma, esta caracterstica de produo noturna da melatonina

fator decisivo para que o organismo possa prever e se adaptar s variaes

dirias e sazonais (para reviso Simmoneaux &Ribelayga, 2003).

3.1 Morfologia e Inervao da Glndula Pineal

O parnquima da pineal constitudo de diferentes tipos celulares. O tipo

celular mais abundante o pinealcito, clula produtora de melatonina. Outros

tipos celulares incluem astrcitos, de localizao proximal ao pednculo pineal

e micrglia, difusamente distribuda por todo o parnquima da glndula

(Meller & Baeres, 2002; Carvalho-Sousa et al., 2011; da Silveira Cruz-Machado

et al., 2012).

A glndula pineal de mamferos inervada por fibras de vrias origens,

sendo que a principal via reguladora do ritmo de produo de melatonina

uma via multissinptica que se inicia na retina. As informaes fticas captadas

pela retina atravs do fotopigmento melanopsina chegam aos ncleos

supraquiasmticos (NSQs), uma das estruturas anatmicas mais importantes na

gerao e manuteno de ritmos circadianos em mamferos, via fibras retino-

hipotalmicas e, a partir da, so transmitidas para a rea retro-quiasmtica do

ncleo paraventricular (PVN) do hipotlamo que se projeta direta ou

indiretamente, sobre a coluna intermediolateral da medula espinal (Provncio et

al., 2000). Esta, por sua vez, projeta-se sobre o gnglio cervical superior de onde

partem fibras simpticas que inervam a pineal (Klein & Moore, 1979). O

INTRODUO 17

principal neurotransmissor dessas terminaes simpticas a noradrenalina,

que estimula a sntese de melatonina agindo sobre os adrenoceptores e ,

presentes na membrana dos pinealcitos (Klein & Weller, 1970). Alm do

neurotransmissor noradrenalina, as terminaes nervosas simpticas liberam

neuromoduladores como o neuropeptdeo Y (NPY), ATP, entre outros (Schon et

al., 1985; Zhang et al., 1991; Mikkelsen & Mller, 1999; Mortani-Barbosa et al.,

2000).

A existncia de uma cotransmisso noradrenrgica-purinrgica na

glndula pineal foi funcionalmente evidenciada atravs de um ensaio que

permitiu acessar a importncia de ambos os transmissores (noradrenalina e

ATP) no metabolismo da glndula pineal. Sob estimulao eltrica transmural

dos terminais nervosos que inervam a pineal, a incubao com o antagonista

-adrenrgico propranolol, bloqueou completamente a produo de

N-acetilserotonina (NAS), precursor imediato da melatonina, enquanto os

antagonistas de receptores P2, PPADS e suramina, bloquearam parcialmente

esta produo, apontando para a relevncia fisiolgica do papel da

cotransmisso noradrenrgica-purinrgica neste sistema (Mortani-Barbosa et al.,

2000).

3.2 Vias metablicas de sntese e degradao da melatonina

A melatonina, hormnio mais conhecido da pineal, tem sua sntese

iniciada a partir do aminocido triptofano, proveniente da circulao, que

INTRODUO 18

hidroxilado pela enzima triptofano-hidroxilase (TPH) formando

5-hidroxitriptofano (5-HTP), o qual descarboxilado pela enzima aminocido

aromtico descarboxilase (AAAD), gerando assim a serotonina

(5-hidroxitriptamina 5-HT). A serotonina pode ser acetilada pela ao da

enzima arilalquilamina N-acetiltransferase (AA-NAT) originando a NAS, que

metilada pela enzima hidroxi-indol-O-metiltransferase (HIOMT) formando a

melatonina (Sugden et al., 1989; para reviso Simonneaux & Ribelayga, 2003).

Vrios componentes desta via, como serotonina, NAS e melatonina

apresentam grandes variaes circadianas, sendo secretados diretamente para a

circulao sangunea (Chattoraj et al., 2009; Carter et al., 2012).

A melatonina secretada gera diversos metablitos bioativos. Pelo menos

seis enzimas transformam melatonina em diferentes metablitos. A enzima

citocromo P450 (CYP450) converte melatonina a 6-hidroximelatonina e tambm

a metaboliza a N1-acetil-N2-formil-5-metoxiquinuramina (AFMK). Alm desta,

as enzimas indolamina 2,3-dioxigenase (IDO), horseradish peroxidase (HRP),

mieloperoxidase (MPO) e eosinilperoxidase (EPPO) tambm convertem

melatonina a AFMK. Pela ao da enzima arilamina formamidase (AFM) ou da

catalase (CAT), AFMK pode ser metabolizado outra amina biognica - N1-

acetil-5-metoxiquinuramina (AMK). A melatonina tambm substrato da

enzima melatonina deacetilase formando 5-metoxitriptamina (revisto por Tan et

al., 2010).

INTRODUO 19

Alm da transformao enzimtica, vias pseudoenzimticas e interaes

da melatonina com radicais livres tambm geram AFMK, AMK, ciclo-3-

hidroximelatonina, N-nitrosomelatonina e 2-hidroximelatonina tanto em

condies in vitro como in vivo (revisto por Tan et al., 2010).

Durante a fase de claro, na qual no h produo de melatonina, a

concentrao de serotonina no pinealcito regulada atravs da via da

monoamina oxidase B (MAO B). A serotonina sob a ao da MAO B

transformada em 5-hidroxi-indolacetaldedo (5-HIAL), e este, por sua vez, sob a

ao da enzima aldedo desidrogenase convertido em cido 5-hidroxi-

indolactico (5-HIAA) ou sob a ao da enzima lcool desidrogenase

transformado em 5-hidroxitriptofol (5-HL). Ambos podem ser O-metilados por

ao da HIOMT, formando respectivamente o cido 5-metoxi-indolactico (5-

MIAA) e metoxitriptofol (5-ML) (Klein et al., 1981) (Figura 4).

INTRODUO 20

TRIPTOFANO

5 - HTP

SEROTONINA

NAS

MELATONINA

lcool desidrogenase

Aldedo

desidrogenase

TPH

AAAD

AA - NAT

HIOMT

6-HIDROXIMELATONINA AFMK

6-SULFATOXIMELATONINA A MK

CYP450

5 - H IAL

5 - H IA A 5 - H L

5 - MIAA 5 - M L

MAO B

AFM/ CAT 5-MT

IDO/ CYP450/

HRP/ MPO/

EPPO

Figura 4. Vias Metablicas de sntese e degradao da melatonina. A sntese de melatonina

iniciada a partir do aminocido triptofano, que hidroxilado pela enzima TPH formando 5-

HTP, o qual descarboxilado pela enzima AAAD, gerando assim a serotonina, esta pode ser

acetilada pela ao da AA-NAT originando a NAS, que metilada pela HIOMT formando a

melatonina. A enzima CYP450 converte melatonina a 6-hidroximelatonina e tambm a

metaboliza a AFMK. As enzimas IDO, HRP, MPO e EPPO tambm convertem melatonina a

AFMK. Pela ao da enzima AFM ou da CAT, AFMK pode ser metabolizado AMK. A

melatonina tambm substrato da enzima melatonina deacetilase formando 5-MT. Durante a

fase de claro, a serotonina sob a ao da MAO B transformada em 5-HIAL, e este, por sua vez,

sob a ao da enzima aldedo desidrogenase convertido em 5-HIAA ou sob a ao da enzima

lcool desidrogenase transformado em 5-HL. Ambos podem ser O-metilados por ao da

HIOMT, formando respectivamente o cido 5-MIAA e 5-ML (adpatado de Simonneaux &

Ribelayga, 2003).

INTRODUO 21

3.3 Controle da Sntese de Melatonina

Na glndula pineal, a ativao dos adrenoceptores essencial para a

produo de melatonina. Adrenoceptores 1 possuem um ritmo dirio, de

modo que a maior densidade desses receptores na glndula pineal seja

encontrada na transio claro/escuro (Romero & Axelrod, 1974; Panger et al.,

1990). A noradrenalina liberada pela estimulao do terminal simptico na

glndula pineal na fase de escuro, ativa adrenoceptores 1 e 1 elevando a

[Ca2+]i e a concentrao de AMPc, respectivamente (Sugden et al., 1986). A

estimulao de adrenoceptores 1 potencia o efeito induzido pela estimulao

de adrenoceptores 1, mas no capaz de elevar sozinha os nveis de AMPc

(Chik et al., 1988).

O Ca2+ e o DAG ativam a PKC, potencializando o aumento do AMPc, pois

essa enzima pode fosforilar a AC ou a protena Gs, ativando-as. O AMPc e o

Ca2+ so fundamentais para o processo de ativao da enzima AA-NAT (Klein

et al., 1983; Chik et al., 1988; Sudgen et al., 1988). A AA-NAT, quando fosforilada

pela protena quinase dependente de AMPc (PKA), interage com a protena

14-3-3 formando um complexo protegido contra protelise proteassomal (Klein

et al., 2002).

Em roedores, o aumento do AMPc e, consequentemente, a ativao da

PKA fazem com que a subunidade cataltica da PKA fosforile o fator de

transcrio CREB. Este, por sua vez, se liga ao seu stio CRE (elementos

INTRODUO 22

responsivos a AMPc) na regio promotora do gene da aa-nat, induzindo a

transcrio seguida da traduo citoplasmtica da enzima (Klein, 2007).

Um dos mecanismos de regulao inibitria sobre a AA-NAT envolve a

sntese da protena ICER (repressor induzido por AMPc, do ingls, inducible

cAMP early repressor). Esta protena inibe a transcrio do gene da aa-nat

reduzindo a atividade desta enzima. Esse fator contribui para a queda da

atividade da AA-NAT que ocorre no fim da fase de escuro (Stehle et al., 1993).

Por sua vez, a atividade da enzima HIOMT no perodo noturno apresenta

um aumento de 1,5 vezes, enquanto o seu RNAm tem um aumento de 2 vezes

(Ribelayga et al., 1999a, b; Simonneaux & Ribelayga, 2003). O ritmo circadiano

do RNAm da HIOMT dependente da estimulao adrenrgica, atravs da

ativao do receptor -adrenrgico, e do aumento na concentrao de AMPc.

Contudo, o ritmo da atividade da enzima HIOMT parece ser dependente de

eventos ps-transcricionais, induzidos por neurotransmissores que aumentam a

concentrao intracelular de Ca2+ (Simonneaux et al., 1999).

Apesar de a glndula pineal ser considerada o principal local de sntese de

melatonina, diversos estudos tm mostrado que muitos tecidos e rgos extra-

pineais so capazes de sintetizar melatonina. Estes incluem retina (Iuvone et al.,

1983; Zmijewski et al., 2009; Mennenga et al., 1991; Iuvone et al., 2002; Tosini et

al., 2007), glndula de Harderian (Djeridane et al., 1998), glndula tireide de

rato (Kvetnoy, 1999; Garca-Marn et al., 2012), medula ssea (Tan et al., 1999;

Conti et al., 2000), trato gastro-intestinal (Huether et al., 1992; Huether, 1993;

INTRODUO 23

Bubenik, 2002), clulas epidrmicas (Slominski et al., 1996, 2002; Fischer et al.,

2008), ovrio (Itoh et al., 1999), testculos (Tijmes et al., 1996) e clulas

imunocompetentes (Carrillo-Vico et al., 2004, 2005; Pontes et al., 2006; Naranjo et

al., 2007).

A melatonina, advinda desta produo extra-pineal, tem sido envolvida

num amplo espectro de atividades biolgicas apresentando, portanto, atravs

de comunicaes autcrina e parcrina, um importante papel na coordenao

de eventos intracelulares.

3.4 Atividades Biolgicas da Melatonina

Alm de seu importante papel na transmisso da informao ftica

ambiental, a melatonina atua tambm, por exemplo, como antioxidante, na

modulao da interao clcio-calmodulina (Benitez-King et al., 1993); na

inibio da translocao nuclear de fatores de transcrio (Gilad et al., 1998;

Cecon et al., 2010); potencia a produo de interleucina 2 (IL-2), IL-6 e interferon

gama em linfcitos e moncitos humanos (Garcia-Maurio et al., 1997); entre

outros.

Como antioxidante, a melatonina possui capacidade tanto de sequestrar

diretamente radicais livres quanto de potenciar a atividade de enzimas

antioxidantes. Estes efeitos so gerados tambm por seus metablitos, AFMK e

AMK, molculas com maior atividade antioxidante do que a prpria

melatonina, capazes de reagir diretamente com molculas reativas como,

INTRODUO 24

espcies reativas de oxignio (ROS) e espcies reativas de nitrognio (RNS)

(para reviso Tan et al., 2007).

Seus efeitos so mediados atravs da atuao em receptores especficos

(MT1 e MT2) acoplados protena G que esto localizados na membrana

celular. Estes receptores podem estar acoplados a diferentes isoformas da

protena G, variando de acordo com sua localizao nas clulas e tecidos

(Dubocovich et al., 2005; Hardeland et al., 2009). A melatonina pode tambm

atuar em um receptor citoplasmtico, homlogo a enzima quinona redutase 2

(QR2), denominado MT3 (Nosjean et al., 2000), ou ainda por mecanismos

independentes de receptores, ou seja, diretamente com protenas citoslicas e

nucleares, j que possui alto coeficiente de partio leo-gua atravessando

facilmente as membranas celulares (Shida et al., 1994).

3.5 Receptores Purinrgicos na Glndula Pineal

A capacidade de pinealcitos em cultura gerarem adenosina a partir de

ATP extracelular sugeriu a presena de ectoenzimas e a existncia de um

sistema purinrgico funcional na pineal (Nikodjevic & Klein, 1989). Ensaios de

ligao com radioligantes adenosinrgicos em membranas de pineais de rato,

demonstraram a existncia de stios de ligao seletivos para estes receptores

nestas preparaes (Sarda et al., 1989).

Funcionalmente, as evidncias de um papel para a adenosina na fisiologia

da pineal foi demonstrada atravs do acmulo dos segundos mensageiros

INTRODUO 25

AMPc e monofosfato de guanosina cclico (GMPc) em pinealcitos de rato

estimulados com concentraes crescentes de adenosina e dos anlogos (R)N6-

fenilisopropiladenosina (R-PIA), 5'-N-etilcarboxamidoadenosina (NECA) e 2-

cloroadenosina (2-Cl-adenosina). A natureza estimulatria desta resposta, a

potncia relativa dos agonistas testados e o efeito de antagonistas seletivos

corroboraram o envolvimento do receptor A2B na pineal (Nikodijevic & Klein,

1989; Gharib et al., 1992).

Em glndulas pineais em cultura a estimulao de receptores de

adenosina pelo anlogo NECA aumentou o acmulo de AMPc de maneira

similar observada com a estimulao -adrenrgica por isoproterenol (ISO).

Esta resposta foi potenciada pela estimulao simultnea com ISO e NECA.

Enquanto os nveis de AMPc induzidos por ISO foram associados a um

aumento na atividade da AA-NAT e sntese de melatonina, o aumento dos

nveis intracelulares deste segundo mensageiro induzido pela estimulao do

anlogo NECA no aumentou a atividade da AA-NAT e nem os nveis de

melatonina (Nonaka et al., 1991). Contudo, em pinealcitos isolados, o anlogo

NECA (100 M) potenciou o efeito estimulatrio de ISO (3 M) sobre a

produo de melatonina pela pineal, efeito este bloqueado por antagonista

clssico de receptor para adenosina e consistente com a ativao de receptor A2B

(Nicholls et al., 1997).

In vivo, a administrao de ISO elevou a atividade da AA-NAT e sntese de

melatonina, contudo, a administrao do anlogo NECA no alterou nenhum

INTRODUO 26

destes parmetros analisados (Nordio et al., 1992) em contraste com outro

estudo no qual a administrao de NECA resultou em um aumento nos nveis

do precursor NAS e de melatonina 2 a 4 horas aps a administrao

intraperitoneal durante a fase de claro (Gharib et al., 1989).

A presena de receptores A2B e A3 foi tambm demonstrada em clulas

tumorais da pineal de ratos, onde o receptor A2B estaria acoplado positivamente

enzima AC e ao receptor A3 acoplado negativamente enzima AC e acoplado

a PLC (Suh et al., 2001). Estas clulas tumorais tambm possuem receptores

P2Y1 e P2Y2 acoplados PLC (Suh et al., 1997). Um acoplamento seletivo dos

receptores purinrgicos e adrenrgicos neste modelo tem sido sugerido, uma

vez que, a estimulao do receptor P2Y1 no apresentou nenhum efeito sobre o

acmulo de AMPc induzido por ISO, enquanto a estimulao do receptor P2Y2

levou inibio do acmulo de AMPc induzido por ISO (Suh et al., 2001).

A presena de receptores P2 em glndulas pineais de rato mantidas em

cultura foi caracterizada por nosso grupo. Em glndulas estimuladas com

noradrenalina, o aumento na produo de NAS, nas glndulas e nos meios de

incubao, foram potenciados por ATP e seu anlogo no hidrolisvel

adenosina paranitrofenilfosfato (AMP-PNP) de maneira dependente de

concentrao. Suramina, antagonista P2, bloqueou o efeito do ATP, mas no o

da adenosina, tambm testada neste estudo. Estes resultados constituram os

primeiros achados de que a glndula pineal de ratos possui receptores P2, que

INTRODUO 27

quando estimulados, potenciam a produo de NAS induzida por

noradrenalina, no tendo efeito por si s (Ferreira et al., 1994).

De acordo com a seletividade a agonistas e mecanismos de transduo

estes receptores foram caracterizados como receptores P2Y1. Os agonistas 2-

metiltio ATP (2MeSATP), 2-cloroATP (2-ClATP), adenosina 5'-O-2-tiodifosfato

(ADPS), ATP e ADP, mas no UTP, potenciaram a produo de NAS induzida

por noradrenalina de maneira dependente da concentrao. O agonista

2MeSATP no induziu o acmulo de AMPc, nem inibiu sua formao em

glndulas estimuladas por forskolin. A inibio da PLC pelo composto U73122

bloqueou o efeito potenciador do agonista 2-MeSATP, efeito no observado na

presena de seu anlogo inativo U73343. Finalizando esta caracterizao, o

efeito potenciador do agonista 2-MeSATP foi bloqueado na presena do

antagonista PPADS (tabela 1) (Ferreira & Markus, 2001).

As respostas funcionais da estimulao de receptores P2Y1 na pineal

tambm foram avaliadas atravs da tcnica de microfisiometria. Na presena do

quelante de Ca2+ BAPTA, a velocidade de acidificao extracelular induzida por

ADP inibida, bem como na presena dos antagonistas seletivos P2Y1,

adenosina 3, 5-bifosfato (A3P5P) e adenosina 3'-fosfato-5'-fosfosulfato

(A3P5PS) (Ferreira et al., 2003).

Deste modo, na glndula pineal de ratos, o ATP, coliberado com

noradrenalina do terminal nervoso simptico, potencia a produo do

precursor NAS de maneira dependente de concentrao, efeito este mediado

INTRODUO 28

por receptores P2Y1. A estimulao destes receptores ativa uma protena Gq

ligada estimulao da PLC, gerando IP3 e DAG. O IP3, atuando em seus

receptores no retculo endoplasmtico, induz a liberao do Ca2+ desses

estoques, tendo como consequncia um aumento da [Ca2+]i. O Ca2+ e o DAG

ativam a PKC, que potencia o aumento do AMPc j induzido pela estimulao

-adrenrgica. Este efeito pode ocorrer pela fosforilao da AC ou da protena

Gs. O Ca2+ tem um papel potenciador da sntese do AMPc intracelular tambm

por atuar atravs do complexo clcio/calmodulina na ativao da AC (Tzavara

et al, 1996).

Portanto, a participao do sistema purinrgico na fisiologia da glndula

pineal sugere um papel complexo para estas molculas. Tendo em vista a

existncia de relatos to conflitantes em relao regulao da produo de

melatonina, seu precursor NAS e os eventos intracelulares desencadeados,

buscamos nesta dissertao investigar os efeitos da co-estimulao purinrgica

sobre a produo de melatonina propriamente dita aprofundando esta

investigao sobre os mecanismos moleculares envolvidos na estimulao dos

receptores P2Y1 caracterizados na pineal.

OBJETIVOS

OBJETIVOS 30

OBJETIVOS

O objetivo geral deste trabalho foi avaliar a participao da estimulao

do receptor purinrgico P2Y1 sobre a produo de melatonina induzida pela

estimulao -adrenrgica. Para tanto, avaliamos:

A produo de melatonina e N-acetilserotonina em glndulas pineais em

cultura e em pinealcitos isolados estimulados com o agonista

-adrenrgico isoproterenol (0,1 M) na ausncia ou na presena de

concentraes crescentes do agonista ADP (0,01 mM - 1 mM);

O mecanismo molecular envolvido atravs da anlise da translocao

nuclear dos fatores de transcrio AP-1 e NF-B em glndulas pineais em

cultura estimulados com ADP (1 mM);

A expresso gnica e a atividade enzimtica das enzimas AA-NAT e

HIOMT envolvidas na biossntese de melatonina aps estimulao por

ADP (0,01 1 mM);

Estudo com o antagonista seletivo de receptores P2Y1- A3P5P

MATERIAL E MTODOS

MATERIAL E MTODOS 32

MATERIAL E MTODOS

1. Animais

Foram utilizadas ratos (Rattus novergicus) machos, da linhagem Wistar,

pesando entre 180 e 210g, provenientes do biotrio do Instituto de Biocincias

da Universidade de So Paulo. Os animais foram alojados em gaiolas de

polipropileno, mantidas em sala com temperatura e umidade controladas,

recebendo gua e rao ad libitum. O ciclo claro/escuro empregado foi o de

12/12 h (luzes acesas s 06h30 e apagadas s 18h30), sendo o horrio de acender

das luzes, considerado como Zeitbeger Time zero (ZT 0). Em todos os

experimentos os animais foram sacrificados por decapitao, em ZT 3, e as

glndulas pineais foram imediatamente colocadas em cultura ou armazenadas a

-80C. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com a aprovao

previa da Comisso de tica em Uso de Animais Vertebrados em

Experimentao (CEA) do Instituto de Biocincias (protocolo 106/2010, anexo

1).

2. Drogas e Reagentes

As drogas e reagentes utilizados esto listados a seguir, de acordo com a

procedncia.

Amersham Biosciences (Reino unido): [125I]-2-iodomelatonina.

Beker (Brasil): gua estril para injeo.

Bio-Rad (Richmond, CA, EUA): acrilamida; SYBR Green.


Calbiochem (Darmstadt, Alemanha): NP40 (Nonidet-P40)

Gibco BRL (Grand Island, NY, EUA): estreptomicina, glutamina,

penicilina.

Hoeschst (Brasil): cido ascrbico.

INRA (Frana): anticorpo originado de coelho especfico para melatonina

(R19540).

Invitrogem Life Technology (Carlsbad, CA, EUA): ditiotreitol (DTT),

fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF), dNTP mix, PCR 5x, Superscript III

RT, DNase I, T4 polinucleotdeo quinas, Primers (senso e antisenso) para

aa-nat (5'-AGCGCGAAGCCTTTATCTCA-3' e 5'-AAGTGCCGGATCTC

ATCCAA-3'), hiomt (5'-AGCGCCTGCTGTT CATGAG-3 e 5'-GGAGCG

TGAGAGGTCAAAG-3) e 14-3-3 (5'-TGATCGGGATCTGGTGTA-3' e

5'- TCCACCATTTCGTCGTATCG-3'); Primers (senso e antisenso) para

18S: (5-CGGCTACCACATCCAAGGAA-3 e 5-GCTGGAATTACC

GCGGCT-3).

Merck (Brasil): A3P-5P adenosina-3, 5-bifosfato; acetato de sdio;

cido ctrico; cido clordrico; cido perclrico; lcool etlico; EDTA (do

ingls, ethylenediaminetetracetic acid dissodium salt); metanol;

metabisulfito de sdio;

Perkin Elmer (Boston, MA, EUA): Easy TidesR Adenosine

5'- triphosphate, [-32P].


Promega (Madison, WI, EUA): oligonucletotdeo consenso para NF-B

(5'-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3'); AP-1 (5'-CGTTGATGAGTC

AGCCG GAA-3').

Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA): anticorpos para as

subunidades de NF-kB p50 (sc-114X); RelA (sc-109X).

Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, EUA): poli (dIdC) double strand;

glicerol; bisacrilamida (N'-methylenebisacrylamide); N-acetilserotonina

(NAS); melatonina (MEL); HEPES; meio de cultura BGJb; (-) arterenol

bitartarato de sdio (noradrenalina); corticosterona; isoproterenol

bitartarato de sdio; adenosine 5'-difosfato (ADP); Pirrolidina

ditiocarbamato (PDTC).

3. Preparo de Drogas

Solues estoque de NAS (1 mM) e melatonina (1 mM) foram preparadas

em 0,1 M de cido clordrico acrescido de 0,02% de metabissulfito de sdio e

0,02% EDTA dissdico. Os estoques permaneceram congelados a -20C at o

uso por um perodo inferior a 30 dias. No momento do uso os padres foram

diludos em cido perclrico 0,1 M acrescido de 0,02% de metabissulfito de

sdio e 0,02% de EDTA dissdico.

As solues estoque de isoproterenol (10 mM) foram preparadas em cido

clordrico 0,01 M. As diluies foram realizadas em soluo aquosa de cido

ascbico (50 mg/L).


As demais drogas utilizadas e listadas acima foram, quando necessrio,

diludas em gua deionizada purificada por sistema Milli-Q (Millipore ).

4. Cultura de Glndula Pineal

A cultura de glndulas pineais foi realizada segundo protocolo proposto

por Parfitt et al. (1976) e modificado por Ferreira et al. (1994). As pineais recm

removidas dos animais foram cultivadas em placas de cultura de 24 poos

(TPP), uma glndula por poo em 200 L de meio de cultura BGJb, pH 7,4,

acrescido de glutamina (2 mM), penicilina (100 U/mL) e estreptomicina

(100 g/mL) e mantidas a temperatura de 37C em atmosfera com 95% de

saturao de O2 e 5% de CO2 por 48 horas. O meio foi trocado aps 24 h. e no

momento anterior ao tratamento. Decorridas 48 h., as glndulas foram

submetidas estimulao e incubadas por 5 h. de acordo com os protocolos

experimentais. Aps o tratamento em cultura, as glndulas pineais foram

imediatamente armazenadas a -80C para posterior anlise da expresso gnica

das enzimas AA-NAT e HIOMT bem como da translocao nuclear dos fatores

de transcrio AP-1 e NF-B. Os meios de cultura foram armazenados a -20C

para posterior dosagem do contedo de NAS e melatonina.

5. Cultura de Pinealcitos

Os pinealcitos foram preparados conforme tcnica descrita por

Simonneaux et al. (1999). As glndulas pineais foram retiradas de grupos de

5-10 animais e colocadas em meio de dissociao contendo (mM): NaCl 137,3;


KCl 5; NaH2PO4 0,7; cido 2-[4-(2-hidroxietil)1-piperazinil]-etanosulfnico

(HEPES) 25; albumina fetal bovina (BSA, 1 g/L) e glicose

(1,8 g/L), pH 7,4. A seguir foram incubadas em meio de dissociao

modificado complementado com cistena (1mM), EDTA (0,5 mM), DNase 0,01%

e papana (2 U/mL). Este meio de dissociao modificado foi incubado

previamente por 10 min. a 37oC para ativao da papana com cistena. Aps a

primeira incubao, o sobrenadante com clulas dissociadas foi removido,

centrifugado (240 x g, 5 min.) e ressuspenso em meio contendo inibidor de

tripsina

(0,1 mg/mL), BSA (0,1 mg/mL) e DNase (0,01%). O tecido no dissociado foi

mais uma vez incubado com meio de dissociao fresco por mais 10 min. e

tratados como descrito at a completa dissociao. O pool de clulas dissociadas

foi finalmente centrifugado por 10 min. a 107 g e ressuspenso na densidade de

70000 clulas/mL em meio DMEM acrescido de penicilina (100 U/mL),

estreptomicina (100 g/mL) e soro fetal bovino (10%). As clulas dispersas

foram colocadas em placas e mantidas 37oC, 5% CO2, overnight. Decorrido este

perodo, os pinealcitos isolados foram submetidos estimulao e incubados

por 5 h. de acordo com os protocolos experimentais para a anlise da atividade

enzimtica das enzimas AA-NAT e HIOMT bem como do contedo de

melatonina.


6. Dosagem de indolaminas por cromatografia lquida de alta

eficincia (HPLC)

O contedo de NAS e melatonina presentes no meio de cultura foi

determinado por HPLC (Waters System, Milford, MA, EUA). O sistema

cromatogrfico foi composto por uma bomba Waters 1525 operada

isocraticamente em temperatura ambiente, uma coluna de fase reversa Resolve

C18 (partcula esfrica de 5 m; 3,9x150 mm) (Waters System, Milford, MA,

EUA) e um detector eletroqumico Waters 2465 operado em modo DC

(corrente contnua), controlado pelo programa computacional Empower

(Waters System, Milford, MA, EUA). A fase mvel para a dosagem de NAS

(acetato de sdio 0,1 M, cido ctrico 0,1 M, EDTA 0,15 mM e metanol 10% pH

3,7) e para a dosagem de melatonina (acetato de sdio 0,1 M, cido ctrico 0,1 M,

EDTA 0,15 mM e metanol 25%, pH 3,7) fluiu com fluxo de 0,95 mL/min. e 0,50

mL/min., respectivamente. O potencial do detector foi ajustado para +0,90 V

versus eletrodo de referncia Ag/AgCl. Para a realizao da anlise, 20 L do

meio de cultura ou de padres para cada analito foi injetado diretamente no

sistema cromatogrfico.

7. Dosagem radioimunolgica de melatonina

A concentrao de melatonina nos meios de cultura de pinealcitos

dispersos estimulados com isoproterenol (1 M) na ausncia ou na presena de

ADP (0,01 1 mM) foi determinada em duplicatas de 25 L utilizando

anticorpo especifico para melatonina produzida por coelho (R19540; diluio


final de 1/40000) e [125I]-2-iodo melatonina (Barassin et al., 1999). As amostras e

a curva padro foram incubadas com 200 L de anticorpo e 100 L do

hormnio marcado por 18 horas. A precipitao do anticorpo ligado foi feita

com a adio de 500 L de anticorpo anti-coelho (produzido por cabra) por 15

min. em gelo seguido de centrifugao por 15 min. (3000 x g; 4C). A

radioatividade foi quantificada por contador gama (Packard) e o limite de

sensibilidade do mtodo foi de 0,5 pg/tubo. As diluies foram todas feitas em

tampo de tricina 0,1 mol/L contendo 0,9% de NaCl e 0,01% de gelatina.

8. Extrao de protena nuclear

Para a extrao de protena nuclear, as glndulas pineais obtidas aps o

cultivo foram homogeneizadas individualmente em 100 L de tampo de lise

(HEPES 10 mM, KCl 10 mM, EDTA 0,1 mM pH 8,0, glicerol 10%, DTT 1 mM e

PMSF 0,1 mM) com auxlio de um homogeneizador e pistilo para tubo plstico

de 1,5 mL de volume. Em seguida, foram adicionados 7 L de NP40 (10%).

Aps breve agitao em vortex e incubao em gelo por 15 minutos, as

amostras foram centrifugadas (12000 x g; 1 min.; 4 C) e o sobrenadante,

correspondente a frao citoplasmtica do extrato, descartado. O pellet formado

foi ressuspenso em 50 L do mesmo tampo de lise e seguiu-se uma nova

centrifugao (12000 x g; 1 min.; 4C). Novamente o sobrenadante foi

descartado e as amostras foram ressuspensas em 20 L de tampo de extrato

nuclear (HEPES 10 mM, KCl 0,5 M, EDTA 1 mM pH 8,0, glicerol 10%,


DTT 1 mM e PMSF 0,1 mM). Aps incubao de 15 min. em gelo, sob agitao,

as amostras foram centrifugadas (20000 x g; 5 min.; 4C) e o sobrenadante

contendo o extrato protico nuclear foi transferido para um novo tubo e

armazenado a -20C. A quantificao do contedo de protena no extrato

nuclear foi realizada a 280 nm no espectrofotmetro ND-1000 (Nanodrop,

Wilmington, DE, EUA).

9. Ensaio de Eletromobilidade em Gel (EMSA)

Os extratos de protena (5 g) foram primeiramente incubados com

tampo de ensaio (Tris-HCl 10 mM pH 7,5, MgCl2 1 mM, NaCl 50 mM, DTT

0,5 mM, EDTA 0,5 mM pH 8,0, 4% glicerol e 1 g de poli (dIdC) por 20 min. a

temperatura ambiente, e em seguida adicionou-se 1 L de uma sonda de

oligonucleotdeo dupla-fita correspondente ao consenso para NF-B

(5'-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3', Promega, Madison, WI, EUA) ou

AP-1 (5'-CGCTTGATGAGTCAGCCGGAA-3'; Promega, Madison, WI, EUA)

marcada com o radioistopo 32P. Os extratos foram incubados com a sonda

(cerca de 30.000 c.p.m.) por 30 min. a temperatura ambiente. Em seguida,

adicionou-se 2L de tampo de corrida (Tris HCl 250 mM pH 7,5, 4% glicerol) e

as amostras foram aplicadas em gel de poliacrilamida no-desnaturante, 6% de

acrilamida: bisacrilamida (37,5:1). Aps a eletroforese (150 V, 1h. 30min.) em

tampo 0,25x de Tris-borato/EDTA (TBE), o gel foi seco a vcuo (Gel Dryer

Vacuum System Fisher Biotech, Wembley, Australia), exposto ao filme XAR-5


(Kodak , Rochester, NY, EUA) em cassete apropriado por 48 h. a -80C. Aps

esse perodo, o filme foi revelado por imerso em soluo reveladora (Kodak ,

Rochester, NY, EUA; 5 min.) e fixadora (Kodak , Rochester, NY, EUA; 10 min.).

As autoradiografias foram quantificadas atravs do software Image J.

10. Ensaio de supershift

As subunidades de NF-B presentes nos extratos nucleares de glndulas

pineais tratadas ou no com ADP (1 mM, 1 min.) foram identificadas atravs do

ensaio de EMSA. Foram utilizados 6 g de protena de um pool de 4 extratos de

cada grupo experimental. Neste ensaio foram adicionados anticorpos

especficos para subunidades de NF-B: RelA e p50 (1 g/mL, 45 minutos)

antes da incubao dos extratos com a sonda consenso para NF-B-32P. As

demais etapas que se seguiram foram realizadas conforme o protocolo de

EMSA descrito anteriormente.

11. Extrao de RNA

O RNA total de cada glndula pineal foi extrado utilizando-se 1 mL de

Trizol, seguido de 200 L de clorofrmio. Aps agitar manualmente

vigorosamente por 15 segundos, os tubos foram mantidos por cerca de 3 min. a

temperatura ambiente e centrifugados (12000 x g; 15 min.; 4C), separou-se a

fase aquosa que contem o RNA. O RNA foi precipitado com 400 L de

isopropranol por 10 min. a temperatura ambiente, seguido de centrifugao

(12000 x g; 10 min.; 4C). O sobrenadante foi removido, o pellet lavado duas


vezes com 500 L de etanol 75%, centrifugado (7500 x g; 5 min.; 4 C) e o

excesso de etanol evaporado a temperatura ambiente por cerca de 10 min. Aps

esse perodo, o material foi ressuspenso em 10 L de gua estril para injeo

(RNAse free) e tratado com DNase conforme instrues do fabricante.

Resumidamente, a cada amostra foi adicionado tampo 10x DNase I (1 L) e

DNase I (1 U/L). As amostras foram incubadas por 15 min. a temperatura

ambiente e, para inativao da DNase foi acrescentado EDTA (25 mM) seguido

de incubao a 65 C por 10 min. A concentrao de RNA foi determinada por

espectrofotometria, utilizando o espectrofotmetro ND-1000 (Nanodrop).

12. Sntese da fita de DNA complementar (cDNA) por

transcriptase reversa

A sntese de cDNA, a partir de RNA total (0,5 g) e random primer foi

realizada utilizando-se SuperScript III. A mistura de RNA, random primer

(50 ng) e dNTP mix (10 mM) foi incubada inicialmente a 65C por 5 min.

Imediatamente aps a incubao, foi transferido para cuba com gelo,

adicionando-se tampo PCR 5x (4 L), DTT (0,1 M) e Superscript III RT

(200 U/ L), finalizando um volume de 20 L. A mistura foi homogenizada e,

aps breve centrifugao, incubada por 5 min. a 25C, 50C por 55 min., sendo a

reao inativada a 70C por 15 min. O cDNA produzido foi utilizado nos

ensaios de PCR ou estocado a -20oC at o uso. Reaes na ausncia de

transcriptase reversa foram realizadas como controle negativo para avaliar

possvel contaminao genmica das amostras analisadas.


13. RT-PCR em tempo real

Para determinar a expresso gnica das enzimas AA-NAT e HIOMT, os

cDNAs construdos (1 L) foram incubados com os respectivos primers senso e

antisenso (300 nM) na presena de iQ SYBR GreenSupermix (mix 2x, 50% do

volume final; 12,5 L) que contm, dentre outras substncias, a iTaq DNA

polimerase. A expresso gnica da protena ribossomal 18S tambm foi

analisada, pelo mesmo procedimento, utilizando-se primers especficos (50 nM)

o que possibilitou a normalizao interna dos dados. Neste ensaio o fluorforo

SYBR Green intercala-se ao DNA dupla-fita formando um complexo capaz de

emitir fluorescncia. A reao em cadeia da polimerase, responsvel pela

amplificao da expresso dos genes alvos, foi acompanhada em tempo real

utilizando-se o aparelho iCycler (BioRad Laboratories). Os sete primeiros

minutos da etapa de desnaturao (95C) foram seguidos por 40 ciclos de

amplificao (10 seg. de desnaturao a 95C e 1 min. de anelamento e

elongao a 60C). Como uma forma de se averiguar a amplificao de

produtos inespecficos utiliza-se melting curves, as quais so feitas ao final do

experimento e analisadas para cada amostra. Durante essa fase, a temperatura

baixada 1C a intervalos de tempo determinados e o pico de fluorescncia

obtido em cada poo, numa temperatura que coincide com o Tm (do ingls,

melting temperature) do produto esperado. Produtos inespecficos formam picos

de fluorescncia em Tms diferentes na curva. Em todos os ensaios foram


includos controles negativos com gua e RNA de pineais que no foram

incubados com a transcriptase reversa.

Os primers (senso e antisenso) para aa-nat e hiomt utilizados foram,

respectivamente: 5'-AGCGCGAAGCCTTTATCTCA-3', 5'-AAGTGCCGGAT

CTCATCCAA-3', 5'-AGCGCCTGCTGTTCATGAG-3', 5'-GGAAGCGTGAGA

GGTCAAAGG-3'. Os primers (senso e antisenso) para a 18S foram: 5'-CGGCTA

CCACATCCAAGGAA-3' e 5'-GCTGGAATTACCGCGGCT-3'. A concentrao

do RNAm foi calculada usando-se o valor do threshold cycle (Ct) da amplificao

dos genes alvo. A quantificao relativa foi feita pela formula 2-Ct onde Ct

representa a diferena entre os ciclos normalizada pela referncia interna (18S) e

um calibrador (glndulas no estimuladas por isoproterenol).

14. Ensaio de atividade enzimtica da AA-NAT

A atividade da enzima AA-NAT foi determinada por ensaio radiomtrico.

Os pinealcitos dispersos foram sonicados (4C) em 100 L de tampo de

fosfato de sdio (0,05 M; pH 6,8) contendo 0,35 mM de acetil coenzima A. 40 L

dos homogenatos foram incubados (37C por 20 min.) com triptamina (10 mM)

e (14C)-acetil coenzima A (10 mM; atividade especifica final de 44 mCi/mmol)

em um volume final de 80 L. O produto radioativo da reao

(14C N-acetilserotonina) foi extrado com 1 mL de clorofrmio gelado e

saturado com ar. As amostras foram colocadas em um recipiente de cintilao

por 18 horas, at que seu contedo evaporasse. Ao final, 3,5 mL de lquido de


cintilao foram adicionados aos tubos e a radioatividade de cada tubo foi

determinada em um contador (Beckman ).

15. Ensaio de atividade enzimtica da HIOMT

A atividade da enzima HIOMT foi tambm determinada por ensaio

radiomtrico. Os pinealcitos dispersos foram sonicados (4C) em 100 L de

tampo de fosfato de sdio (0,05 M; pH 7,9). 50 L do sobrenadante foram

ento incubados (37C por 30 min.) com N-acetilserotonina (1 mM) e 14C-S-

adenosyl-L-methionine (43,8 M; atividade especifica final de 52,7 mCi/mmol)

em um volume final de 100 L. A reao foi interrompida com a adio de 200

L de tampo de borato de sdio (12,5 mM; pH 10) e 1 mL de clorofrmio. Os

tubos foram ento centrifugados por 5 min. (13000 x g; 4 C) e o produto

radioativo da reao (14C melatonina) foi extrado com 800 L de clorofrmio.

As amostras foram colocadas em um recipiente de cintilao por 18 h., at que

seu contedo evaporasse. Ao final, 3,5 mL de lquido de cintilao foram

adicionados aos tubos e a radioatividade foi determinada em um contador

(Beckman ).

16. Anlise dos resultados

Os dados esto apresentados como mdia erro padro da mdia (epm).

A comparao entre dois grupos foi realizada atravs do teste t de Student e,

a comparao de mais de dois grupos atravs de anlise de varincia (ANOVA)

seguida pelo teste de Newman-Keuls. A probabilidade de 5% (p


considerada como diferenas significativas entre os grupos. Toda a anlise

estatstica foi realizada atravs do software GraphPad Prism verso 5.00

(GraphPad Software).

RESULTADOS

RESULTADOS 47

RESULTADOS

1. Efeito da estimulao purinrgica sobre a produo de NAS e

melatonina induzidas por isoproterenol em glndulas pineais

em cultura

Glndulas pineais em cultura foram estimuladas com o agonista

-adrenrgico isoproterenol (0,1 M, 5h) na ausncia ou na presena do

agonista seletivo para o receptor P2Y1, ADP (0,01 - 1 mM). Em glndulas

estimuladas com isoproterenol, estimulao purinrgica com ADP levou a um

aumento concentrao dependente da produo de NAS (Figura 5A), enquanto

a produo de melatonina foi reduzida (Figura 5B).

Figura 5. Curva concentrao-efeito ao ADP (0,01 1 mM) na produo de NAS (A) e

melatonina (B) nos meios de incubao de glndulas estimuladas com isoproterenol (ISO,

0,1 M). Os dados representam media epm de 7 - 8 glndulas por ponto, obtidos de 3

culturas diferentes.

-5 -4 -30

20

40

60

80

100

ADP log (M)

NA

S (

ng

/20

0 m

L)

ISO 0.1 mM

-5 -4 -320

40

60

80

100

ADP log (M)

ME

LA

TO

NIN

A (

ng

/20

0 m

L)

ISO 0.1 mM

AA B

RESULTADOS 48

2. Efeito da estimulao purinrgica sobre a produo de

melatonina induzida por isoproterenol em pinealcitos

A produo de melatonina foi tambm avaliada em pinealcitos isolados

estimulados com isoproterenol (ISO, 1 M) na ausncia ou na presena de ADP

(0,01 - 1 mM) por 5 horas.

Em pinealcitos dispersos, o tratamento com ADP (0,01 1 mM) tambm

levou inibio da produo de melatonina de maneira dependente de

concentrao em clulas estimuladas com isoproterenol (Figura 6) assim como

observado anteriormente em glndulas em cultura.

Figura 6. Efeito da estimulao purinrgica sobre a produo de melatonina em

pinealcitos isolados. Os pinealcitos foram estimulados com isoproterenol (ISO, 1 M) na

ausncia ou presena de ADP (0,01 1 mM) por 5 horas. Valores representam mdia epm;

n = 3-4 poos por ponto.

-5 -4 -30

5000

10000

15000

20000

ADP log [M]

ME

LA

TO

NIN

A (

pg/2

00

mL

)

ISO 1 mM

RESULTADOS 49

3. Mecanismo molecular envolvido na estimulao de receptores

purinrgicos P2Y1 na glndula pineal

Considerando a grande diversidade de transduo de sistemas operados

por receptores purinrgicos e a presena constitutiva dos fatores de transcrio

AP-1 e NF-B na pineal (Carter, 1997; Cecon et al., 2010), investigamos o

mecanismo molecular dos efeitos da estimulao dos receptores P2Y1 em

extratos nucleares de glndulas pineais estimuladas com ADP (1 mM) atravs

da tcnica de EMSA. A via do fator de transcrio NF-B foi tambm

funcionalmente avaliada atravs da utilizao de pirrolidina ditiocarbamato

(PDTC - 12,5 M), inibidor da atividade do NF-B, em glndulas em cultura

estimuladas com ADP (1 mM).

3.1 Protena Ativadora 1 (AP-1)

A anlise do fator de transcrio AP-1 foi realizada em extratos nucleares

de glndulas pineais em cultura estimuladas com ADP (1 mM) por diferentes

tempos (0,5 - 5 min.). A anlise quantitativa do filme auto-radiogrfico exposto

ao gel obtido no ensaio das amostras submetidas tcnica descrita de EMSA,

revelou um aumento significativo na translocao nuclear do fator de

transcrio AP-1 0,5 minuto de estimulao, sendo o aumento mximo

detectado aps 1 minuto, mantendo um plat de translocao at 5 minutos,

tempo mximo utilizado neste estudo (Figura 7).

RESULTADOS 50

Figura 7. Decurso temporal da translocao nuclear do fator de transcrio AP-1 em extratos

nucleares de pineais em cultura estimuladas com ADP. Glndulas pineais de ratos cultivadas

por 48 horas foram estimuladas com ADP (1 mM) nos tempos 0,5, 1, 2 e 5 min. Os valores

representam mdia epm do 3-4 glndulas por ponto. *p

RESULTADOS 51

Figura 8. Decurso temporal da translocao nuclear de complexos NF-B p50/p50 e

p50/RelA em extratos nucleares de glndulas pineais em cultura estimuladas com ADP.

Glndulas pineais de ratos cultivadas por 48 horas foram estimuladas com ADP (1 mM)

nos tempos 0,5, 1, 2 e 5 min. A Gel representativo de EMSA caracterizando os complexos

p50/p50 e p50/RelA identificados atravs de supershift (SS) na presena de anticorpos

especficos. B - Anlise grfica atravs do Programa Image J mostrando a banda de retardo

(SS) correspondente s subunidades testadas. C - Gel representativo de EMSA de extratos

nucleares de pineais estimuladas por ADP nos tempos 0,5. 5 min. D - Anlise

densitomtrica do decurso temporal da translocao nuclear dos complexos

NF-B/DNA em pineais estimuladas por ADP nos tempos especificados. Os valores

representam mdia epm de 7 glndulas por ponto.

RESULTADOS 52

M

ISO 0

,1

M

ISO +

PDTC

12,

5 1 m

M

ISO +

ADP

ISO +

PDTC

+ A

DP

0

20

40

60

80

100

* *

NA

S (ng/2

00

L)

M

ISO 0

,1

M

ISO +

PDTC

12,

5 mM

ISO +

ADP

1

ISO +

PDTC

+ A

DP

0

20

40

60

80

**

ME

LA

TO

NIN

A (ng/2

00

L)

3.2.2 Estudo funcional - Efeito de PDTC sobre a produo de NAS e

melatonina induzida por isoproterenol

Para verificar o envolvimento do NF- B sobre a produo de NAS e

melatonina, avaliamos o efeito do inibidor da atividade da via do NF- B, PDTC

sobre a produo destas indolaminas induzida por isoproterenol. Glndulas

pineais em cultura foram previamente incubadas com PDTC (12,5 M) por 30

min. e ento com isoproterenol (0,1 M) na ausncia ou na presena de ADP

(1 mM) por 5 horas. Como observado anteriormente, a estimulao purinrgica

de glndulas pineais em cultura com ADP, levou a uma potenciao da

produo de NAS, induzida por isoproterenol, e a uma inibio da produo de

melatonina. Estes efeitos observados sobre o contedo de NAS e de melatonina

no foram alterados em glndulas pr-tratadas com PDTC (Figura 9).

Figura 9. Efeito de PDTC sobre o contedo de NAS e melatonina nos meios de incubao

de glndulas estimuladas com isoproterenol na ausncia e na presena de ADP.

Glndulas pineais em cultura foram pr-tratadas com PDTC (12,5 M, 30 min.) e

estimuladas com isoproterenol (ISO, 0,1 M), na ausncia e na presena de ADP (1 mM) por

5 horas. Os dados representam media epm de 4 glndulas por ponto. * p

RESULTADOS 53

4. Expresso gnica das enzimas AA-NAT e HIOMT na

glndula pineal de ratos

A seguir avaliamos a expresso do RNAm das enzimas AA-NAT e

HIOMT na glndula pineal de ratos atravs da tcnica quantitativa de RT-PCR

em tempo real. Uma curva de diluio de cDNA revelou a alta eficincia de

amplificao das reaes (dados no mostrados), sendo 18S o gene housekeeping

de escolha.

Glndulas pineais cultivadas por 48 horas foram estimuladas com

isoproterenol (0,1 M), na ausncia e presena de ADP (0,01 1 mM), por 5

horas. O tratamento com ADP no foi capaz de alterar a expresso de aanat

(Figura 10A) e hiomt (Figura 10B) quando comparado ao grupo tratado com

isoproterenol.

Figura 10. Efeito da estimulao purinrgica sobre a produo dos transcritos aa-nat e hiomt.

Glndulas pineais em cultura estimuladas com isoproterenol (ISO, 0,1 M) na ausncia e na

presena de ADP (0,01 1 mM) por 5 horas tiveram a quantidade do RNAm dos genes aa-nat e

hiomt determinados por RT-PCR em tempo real. Os valores foram normalizados a partir de

glndulas no estimuladas (basal). A - Produo do transcrito aa-nat. B- Produo do transcrito

hiomt. Os valores representam media epm, n = 7-8 glndulas por ponto.

-5 -4 -30

20

40

60

80

100

ADP log (M)

RN

Am

aa

-na

t

(U

nid

ad

es a

rbitr

ria

s s

ob

re b

asa

l)

ISO 0,1 mM

-5 -4 -3

0.0

2.5

5.0

ADP log (M)

RN

Am

hio

mt

(U

nid

ad

es a

rbitr

ria

s s

ob

re b

asa

l)

ISO 0,1 mM

A B

RESULTADOS 54

5. Atividade enzimtica das enzimas AA-NAT e HIOMT em

pinealcitos isolados

A atividade das enzimas AA-NAT e HIOMT foi ento avaliada em

pinealcitos isolados, funcionalmente validados pela produo de melatonina

como apresentado no tem 2, e estimulados por 5 horas com isoproterenol

(1 M) na ausncia ou presena de ADP (0,01 - 1 mM). Os produtos radioativos

dos ensaios de atividade enzimtica das enzimas AA-NAT

(14C-N-acetilserotonina) e HIOMT (14C-melatonina) foram determinados por

contador . O tratamento com ADP no foi capaz de alterar a atividade da

enzima AA-NAT quando comparado com o grupo tratado com isoproterenol

(Figura 11A), bem como a atividade da enzima HIOMT (Figura 11B).

Figura 11. Efeito da estimulao purinrgica sobre a atividade das enzimas AA-NAT e

HIOMT. Glndulas pineais em cultura estimuladas com isoproterenol (ISO, 1 M), na ausncia

ou presena de ADP (0,01 1 mM) por 5 horas. A - Atividade enzimtica da AA-NAT. B -

Atividade enzimtica da HIOMT. Os valores representam a mdia epm; n = 3-4 poos por

ponto.

-5 -4 -3200

300

400

500

600

ADP log [M]

AA

-NA

T p

M/p

oo

l/h

ISO 1 mM

-5 -4 -310

15

20

25

30

ADP log [M]

HIO

MT

pM

/poo

l/h

ISO 1 mM

A B

RESULTADOS 55

6. Efeito do antagonista seletivo A3P-5P sobre a produo de

NAS e melat

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a estimulação da glandula pineal.pdf