A IMPORTÂNCIA DO LABORATÓRIO DEMICROBIOLOGIA NO DIAGNÓSTICO DAS

INFECÇÕES RELACIONADAS A ASSISTÊNCIA ASAÚDE

MARILETE LUIZA ZAGO TOEBEMT LABORATÓRIO – LACEN

NOVEMBRO-2010

Esta aula foi apresentada na Oficina de Capacitação para a utilização do Sistema Formsus na notificação dos

indicadores de Infecção Hospitalar ocorrida em 25 e 26/11/2010 em Cuiabá-MT e gentilmente cedida pela

autora para disponibilização no site da SES-MT.

IMPORTANCIA DO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA

Quadro infeccioso : agente biológico responsávelperfil de S / R aos antibióticos

Monitoramento do perfil microbiológico das bactérias dos ambientes (hospital)Ajuste do tratamento adequado para cada microorganismoUso racional de antimicrobianosUso racional de antimicrobianosPrevenção e controle da resistência microbiana em IRASCombate das infecções hospitalares de forma intersetorial (CCIH)Ação em vigilância epidemiológica: detectar e confirmar surtoRealizar cultura de vigilância. Ex: enterococosTransferências intra ou interinstitucional dos pacientes infectados/colonizadospor agentes multiresistentes

IMPORTANCIA DO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA

• Ajuda a reduzir o risco de morte dos pacientes por infecção hospitalar / por agravamento do quadro em uso de hospitalar / por agravamento do quadro em uso de antibioticoterapia inadequada

• Ajuda a reduzir a seleção de microorganismos multiresistentes em ambientes de tratamento intensivo, onde se encontram os pacientes mais críticos (UTIs, Unidades coronarianas...)

IMPORTANTE

O ambiente hospitalar é inevitavelmente um grande reservatório de microorganismos patógenos

e oportunistas, de modo que as infecções hospitalares podem ser adquiridas não apenas por pacientes, que apresentam maior susceptibilidade, pacientes, que apresentam maior susceptibilidade, mas também, embora com menos freqüência, por

visitantes e funcionários do próprio hospital.

A META DO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA

Testes microbiológicos com acurácia (cuidado, perfeição, exatidão) diagnóstica e com serviços de qualidade em custos reduzidos:

- insumos de qualidade

- controle de qualidade interno / externo

- resultados em tempo adequado

- qualificação profissional contínua

- coleta de amostras clínicas relevantes aos quadros clínicos investigado

EXAME MICROBIOLÓGICO

1-coleta da amostra (representativa)

2-cultivo microbiológico em meios adequados

3-gram da amostra, para orientar o cultivo e a abordagem médica inicial (morfologia, tamanho e reação aos corantes): médica inicial (morfologia, tamanho e reação aos corantes): recurso rápido que avalia a qualidade da amostra clinica e o andamento do cultivo

4-antibiograma (TSA) para os isolados positivos

ETAPAS DO EXAME MICROBIOLÓGICO

FASE PRÉ ANALÍTICA

1-Amostra biológica representativa do processo infeccioso:

-local correto (evita contaminação de microbiota residente). Ex: ferida cirúrgica

-local correto (evita contaminação de microbiota residente). Ex: ferida cirúrgica

-porção adequada (parte mais representativa da amostra). Ex: Sangue, pus e muco nas fezes diarreicas

-momento certo (considerar curativo, antibioticoterapia em uso ou sua modificação...)

-volume correto (V insuficientes induzem a falso-negativo, não viabilizam todas as análises; amostra em 1 único swab para vários procedimentos)

-coletas com técnicas pré-estabelecidas, de forma correta

FASE PRÉ ANALÍTICA

2- Documentação da amostra correta: nome completo do paciente, idade, dia da coleta, hora se possível, uso ou não de antimicrobianos, responsável pela solicitação, especificação da amostra coletada, relato de intercorrencias, identificação da amostra...

3- Suspeita clinica do agente etiológico: influi na forma de 3- Suspeita clinica do agente etiológico: influi na forma de coleta e nos materiais usados

4- Acondicionamento e transporte correto da amostra: meios de transporte microbiológicos, temperatura adequada, tempo entre coleta e análise da amostra (amostras de centro cirúrgico, de PA, amostras de biópsia com formalina, em frascos não estéreis, manipulados...)

FASE ANALÍTICA

Procedimento analítico (técnico)

FASE PÓS ANALÍTICA

Expressão do resultado do exame laboratorial correlacionado

com a clínica.

BIOSSEGURANÇA,SEMPRE

Toda a amostra clinica é potencialmente infectante e deve ser

manuseada com cuidado, utilizando-se os equipamentos de

proteção individual (EPIs) preconizados pela biossegurança.

CRITÉRIOS PARA REJEIÇÃO DE AMOSTRAS

- identificação incorreta da amostra- material insuficiente para todos os testes microbiológicos- transporte inadequado: frascos com vazamento, não estéreis- não compatível com o sitio informado- não compatível com o sitio informado- amostra incompatível com os exames solicitados- amostras em solução de fixação (formalina)- swab único para múltiplos exames (gram, cultura)- swab seco, amostra ressecada- mais de uma amostra da mesma espécie coletadas no mesmo

dia e na mesma origem.

AMOSTRAS NÃO RECOMENDADAS

- swab de queimadura

- swab de ulcera de decúbito

- swab de abscesso perianal

- swab de lesão de gangrena

- swab de lesão periodontal- swab de lesão periodontal

- swab de ulcera varicosa

OBS: se necessário, colher como biópsia ou aspirado

Não processar: vômitos, material de colostomia, aspirado gástrico de RN,ponta de sonda vesical (flora da uretra distal), e secreção traqueal (poderefletir colonização local, incorreto para diagnostico de pneumoniashospitalares).

COLETA DAS PRINCIPAIS AMOSTRAS

1- CATETER

-Cultivo pela técnica de Maki (semiquantitativa)-Colonização? Infecção? > / < 15 UFC / ml-As regras de desinfecção para a retirada são as mesmasadotadas na introdução do cateter.

Fontes de infecção do sangue pelo cateter: central, periférico,arterial, umbilical...-pele ao redor da inserção-forame de entrada-disseminação hematopoiética por sitio distante-infusão contaminada

CATETER

Forma de coletar:

-coletar e enviar ao laboratório apenas os 5 cm próximos do

ponto de inserção (que estavam introduzidos na pele)ponto de inserção (que estavam introduzidos na pele)

-não usar tesouras embebidas em anti-sépticos

-enviar ao laboratório imediatamente, em frasco estéril, para

evitar que resseque; não utilizar meio de cultura de transporte

-o ideal é coletar a ponta do cateter junto de uma hemoculturavenosa

2- HEMOCULTURA

-ideal: hemocultura pareada quantitativa

(indicada para infecção sanguínea de cateter central)

procedimento caro e trabalhoso

-cultura concomitante: sangue do cateter com sangue-cultura concomitante: sangue do cateter com sangue

periférico e monitoramento contínuo (automação); a

hemocultura do cateter positiva antes da do sangue periférico

-coletas arteriais não são melhores que as venosas

-método de coleta e volume certo favorecem a recuperação doorganismo (2 a 3 hemoculturas, 20 min ou em 24 h)

HEMOCULTURA

A infecção da corrente sangüínea é uma das infecções

relacionadas aos serviços de saúde mais importantes. Alémda sua elevada freqüência ela acarreta morbiletalidade edificuldades quanto à troca ou manutenção do acessovascular.vascular.

HEMOCULTURA ( COLETA)

-preferencialmente antes do uso de antibióticos

-identificando os frascos com nome por extenso, data e hora de

coleta

-anti-sepsia previa das tampas dos frascos com álcool a 70%

-anti-sepsia do braço (local punção), com álcool 70% + PVPI -anti-sepsia do braço (local punção), com álcool 70% + PVPI 10% de forma circular, de dentro para fora

- sem anticoagulante (frasco comercial tem polietanolsulfonatode sódio-SPS)

-coletas venosas: melhores que as arteriais

-volume certo da amostra: beneficia o isolamento bacteriano

(10% do volume do frasco de sangue total)

HEMOCULTURA (COLETA)

-não refrigerar o frasco, incubar imediatamente (36-37 ºC)

-nº frascos à critério medico, conforme condição clinica dopaciente

3-“FERIDAS EM GERAL”, ABSCESSOS E EXUDATOS

-”FERIDAS”: termo inapropriado, correlacionar com sitioanatômico especifico – FERIDA DE...

-retirada das crostas secas superficiais: não representativa-retirada das crostas secas superficiais: não representativa

-margens e superfícies lavadas com soro fisiológico

-coletar pus das partes mais profundas: aspirar sempre quepossível, ou usar swab umedecido em soro fisiológico e commeio de transporte

-material seroso pós escarificação das bordas: útil ao cultivo

-não coletar pus emergente, superficial (impróprio)

“FERIDAS EM GERAL”, ABSCESSOS E EXUDATOS

-não coletar amostras ressecadas para cultivo

-ferida de queimadura: após debridamento de lesão; biopsia é-ferida de queimadura: após debridamento de lesão; biopsia épreferencial, em tecido profundo-3 a 4 mm (superfície écolonizada por microbiota do paciente e pode aumentardando infecção cutânea com bacteremia)

4-ESCARRO

-não é ideal para avaliar microbiologia do trato respiratório

-não deve conter saliva

-coleta pela manha, antes da alimentação-coleta pela manha, antes da alimentação

-não usar dentrificio ao escovar os dentes, mas água com vários bochechos.

-em suspeita de tuberculose coletar 3 amostras em dias consecutivos

-pode ser feita nebulização previa para induzir a coleta

5-LAVADO BRONCOALVEOLAR

-ótimo método para obter etiologia das pneumonias porventilação mecânica (ponto de corte entre colonização eventilação mecânica (ponto de corte entre colonização einfecção é de 100000 UFC/ml).

-coleta antes de biopsias de escovados para evitar sangue naamostra

-envio ao laboratório entre 30 min - 2 horas

6-FLUIDOS ORGANICOS ESTEREIS

Liquido pleural, ascítico, biliar, liquor, de articulações e outros

-coleta com anti-sepsia previa: álcool 70%, PVPI

-coleta feita pela equipe medica

-cultura com especificação: micológica, para micobacterias, para aeróbios...

MICROORGANISMOS CAUSADORES DE INFECÇÕES HOSPITALARES

Podem ser:

-multiresistentes: R a diferentes classes de drogas testadas noantibiograma (TSA)

Ex: Enterococcus spp R aos Glicopeptideos

Staphylococcus spp R/I para a VancomicinaStaphylococcus spp R/I para a Vancomicina

Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumanii eEnterobactérias R aos carbapenêmicos (imipenem,ertapenem, meropenem)

-microorganismos pan-resistentes (resistentes “in vitro” a todas as drogas testadas)

GRAM-NEGATIVOS, FERMENTADORES

-bacilos gram negativos (Enterobacterias): usam a fermentação dos açucares para obter energia

-possuem em comum reações bioquímicas que as identificam fenotipicamentefenotipicamente

-42 gêneros e mais de 100 espécies

-poucas são consideradas patogênicas (enteroinfecções)

-outras são oportunistas associadas em IRAS

-universalmente distribuídas em solo, plantas, água, e algumasno trato gastrointestinal , ex: klebsiella pneumoniae

-poucas delas são encontradas em nichos, ex, a Salmonellatyphi, apenas em humanos.

GRAM-NEGATIVOS, FERMENTADORES

-são responsáveis por: abscessos, pneumonia, meningites,septicemias, infecções em feridas, do trato urinário e do tratogastrointestinal-99% dos isolamentos de Enterobacterias em IRAS, são:

- Escherichia coli- predominam

- Klebsiella spp- predominam- Klebsiella spp- predominam

- Enterobacter spp- predominam

- Proteus spp

- Providencia spp

- Morganella spp

- Citrobacter spp

- Salmonella spp

- Shigella spp

- Serratia spp

-PLACA DE AGAR MAC CONKEY, COM COLONIAS LACTOSE + E LACTOSE –-LAMINA COM BACILOS GRAM NEGATIVOS-COLONIA MUCOIDE DE Klebsiella spp

MECANISMOS DE RESISTENCIA DAS ENTEROBACTERIAS

-intrínsecos: inerentes à bactéria

Salmonella spp R a cefens de 1ª e 2 ª geração, cefuroxima e aminoglicosídeos; Proteus mirabilis R a Polimixina, colistina, tetraciclina e nitrofurantoina

-adquiridos: por mutação, aquisição de plasmideo, e outros

plasmideo: moléculas de DNA que se replicam independentes do DNA cromossomico, mais veloz, contendo marcadores selecionáveis que conferem vantagens à célula bacteriana que os abriga, por exemplo, um gene que codifica enzima capaz de neutralizar determinado antibiótico ; quando têm

gene de transferencia, formam pili que transfere plasmideo.

MECANISMOS DE RESISTENCIA DAS ENTEROBACTERIAS

1-RESISTENCIA AOS BETA-LACTAMICOS: alteração do sitio de ligação (nas proteínas PBPs) das penicilinas, cefalosporinas, monobactamicos e carbapenens com a parede da bactéria . Raro nos bacilos gram negativos, mais comum nos cocos gram positivos.

2- ALTERAÇÃO DA PERMEABILIDADE DA MEMBRANA EXTERNA 2- ALTERAÇÃO DA PERMEABILIDADE DA MEMBRANA EXTERNA DAS BACTERIAS: perda das proteínas PORINAS, que são os canais de entrada dos beta-lactamicos ( exclusivo das gram negativas) e presença de bombas de efluxo, que jogam as drogas para fora da célula ( gram negativas e gram positivas)

3- DEGRADAÇÃO DE DROGAS PELA PRODUÇÃO DE BETA-LACTAMASES: enzimas que hidrolisam o anel beta-lactamico das drogas

AS BETA-LACTAMASES

ESBLs: -são beta-lactamases de espectro ampliado, plasmidiais

-encontradas em ambientes hospitalares e eventualmente, nos comunitários

-pesquisada em rotina para K. penumoniae, K. oxytoca e E. coli

independente do sitio de infecção

-pesquisada em isolados de Proteus mirabilis em sítios estereis, como sangue e liquor

-devem ser pesquisadas na forma de triagem (disco-difusão)

(discos de CTX, CRO, ATM, CAZ em distancias iguais do disco de AMC)

-devem ser confirmadas por inibição “in vitro” pelo ácido clavulânico

(discos de CAZ e CAZ+ CLAV com discos de CTX e CTX + CALV e a diferença entre halos das formas simples com as associadas e de =/> a 5 mm).

ESBL

BETA-LACTAMASES

KPC: -Klebsiella pneumoniae carbapenemase, gene plasmidial

-EUA-2001: bactéria que degradava também os carbapenemicos

-pode ser expressa por outras Enterobacterias devido ser plasmidial

-ver NOTA TECNICA ANVISA 01/2010 de 25/10/2010. Medidas para identificação, prevenção e controle de infecções relacionadas à assistência à saúde por microorganismos multiresistentes ( com tabela CLSI/ EUCAST)

-testar imipenem e meropenem em todas as cepas de K. pneumoniae de -testar imipenem e meropenem em todas as cepas de K. pneumoniae de internados ( desconsiderar o ertapenem)

-soltar OBS nos laudos, havendo suspeita em casos de R às duas drogas

-poderá ser enviada a cultura pura, crescida em Agar Nutriente ou Agar Mueller Hinton (TSA), em tubo pequeno de tampa rosqueável, ao Lacen-MT laboratório. Anexar documentos do paciente e laudo de microbiologia assinado.

-encaminhamento a um centro colaborador (FIOCRUZ) para teste molecular

-observar que a R a Imipenem e a Meropenem pode ser também expressa pela produção de enzimas que degradam carbapenêmicos denominada METALO-BETALACTAMASE alem da KPC (enzima zinco dependente).

BETA-LACTAMASES

AmpC: -beta-lactamase cromossômica, produzida pelo gene do mesmo nome

-ocorre nos generos Citrobacter, Enterobacter, Serratia, Morganella e em isolados de Proteus vulgaris

-enzima é induzida quando estas espécies são expostas aos beta-lactamicos

-elas hidrolisam as cefalosporinas causando falha terapeutica

-os cefens de 4ª geração e carbapenens são mais estaveis -os cefens de 4ª geração e carbapenens são mais estaveis

-a enzima é expressa após o uso de cefalosporinas de 1ª geração que apresentam R nas culturas subseqüentes.

NOTA: nas ESBL, o laudo do TSA é resistente a todas as cefalosporinas (1ª, 2ª, 3ª, 4ª geração, aos monobactamicos-aztreonam- e as penicilinas) ainda que no TSA “in vitro” seja S. Podem ser usados quinolonas, carbapenemicos e aminoglicosideos.

GRAM NEGATIVOS, NÃO FERMENTADORES

-bacilos ou cocobacilos gram negativos: não fermentam para ter energia, oxidam os substratos

-habitat: água, solo, soluções desinfetantes, leite cru, outros

-ambientes hospitalares: água torneira, respiradores, cateteres, -ambientes hospitalares: água torneira, respiradores, cateteres, anti-sépticos, e outros

-identificação complexa pela baixa atividade metabólica (lentos)

- são oportunistas numéricos e tem importância em: UTIs, pacientes com processos invasivos, unidades de queimados, infecção respiratória em paciente com FC (doença pulmonar obstrutiva crônica progressiva)

GRAM NEGATIVOS, NÃO FERMENTADORES

Generos principais: PseudomonasAcinetobacterComplexo BurkholderiaStenotrophomonas

-Psedomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii: mais isolados em hemoculturas e trato respiratório em pacientes internados.internados.

-menos isolados que as Enterobacterias, mas mais resistentes. -podem fazer septicemia/bacteremia e levar a morte.-gram: ferramenta auxiliar-prova da oxidase: ferramenta auxiliar imediata após o

crescimento-possuem alta R aos antimicrobianos, principalmente a R aos

carbapenemicos, devido as suas enzimas

- Bacilos gram negativos de Pseudomonas aeruginosa

- Placa de cultivo de Pseudomonas aeruginosa (pigmento de fluoresceina característico)

MECANISMO DE RESISTENCIA

-metalo-betalactamases-perda de porinas (proteínas presentes na membrana celular

externa lipopolissacaridica das bactérias gram negativas, que são canais usados especificamente para a entrada das drogas). As bactérias usam esta estratégia para aquisição de R.

EX: Assim, uma alteração na porina específica da membrana EX: Assim, uma alteração na porina específica da membrana celular externa de P. aeruginosa, pela qual o imipenem geralmente se difunde, pode excluir o antimicrobiano de seu alvo, tornando P. aeruginosa resistente ao imipenem

-bomba de efluxo (bombeamento da droga no espaço intracelular, para fora da célula, ao espaço extracelular)

MECANISMO DE RESISTENCIA

-Burkholderia cepacia tem R intrínseca a polimixina B

-Stenotrophomonas maltophilia é intrinsecamente R aos beta-lactamicos, inclusive carbapenemicos (imipenem), pois alem da beta-lactamase, tem baixa permeabilidade celular.

-O grande problema do ambiente hospitalar é a multi-resistencia hospitalar do Acinetobacter baumannii, alguns resistencia hospitalar do Acinetobacter baumannii, alguns sensíveis apenas à polimixina.

MECANISMO DE RESISTENCIA

COCOS GRAM POSITIVOS

ESTAFILOCOCOS: cocos gram positivos em pares e cachos

Eles estão relacionados a pneumonias, bacteremia (os mais isolados em ICS), infecções de pele e tecidos, ao uso de próteses e cateteres venosos, meningites, ou como colonizantes (transitórios ou persistentes em assintomáticos) em: diabéticos, usuários de cateteres de longa duração, usuários de drogas endovenosas e longa duração, usuários de drogas endovenosas e trabalhadores da saúde. Apresentam facilidade de disseminação em ambiente intra e inter hospitalar pela facilidade em sobreviver nestes meios.

-Staphylococcus aureus (coagulase positiva):

• coloniza 20 a 40% dos humanos (vias aéreas).

• Patógeno responsável por grande número de Infecções hospitalares e Infecções comunitárias, com alta R aos antibióticos.

-placa de Agar sangue com colônias de S. aureus hemolíticas-lamina de gram de S. aureus de cultivo-hemocultura com cocos gram positivos em cachos

COCOS GRAM POSITIVOS

Staphylococcus spp (coagulase negativa): tem tido R a oxacilina, induzindo o uso maior de vancomicina (Glicopeptideos) e induzindo o surgimento de clones mais R

Japão (1997): cepa VISA/GISA

EUA (2002): cepa VRSA (plasmideo de R para a vancomicina do Enterococo)

S. epidermidis (cateteres endovenosos, endocardites, próteses)

S. saprophyticus (vias urinarias femininas)

S. hominis (bacteremia de imunossuprimidos)

S. lugdunensis (endocardites)

S. haemolyticus (endocardite, sepse, peritonite)

MECANISMOS DE RESISTENCIA

-PENICILINAS: penicilinases degradam anel beta-lactamico

-OXACILINAS: alteração das proteínas (PBPs) no sitio de ligação da droga com a parede bacteriana. È comum nos MRSA (ORSA)

-GLICOPEPTIDEOS:

VISA/GISA: S. aureus com R intermediaria para a vancomicinaVISA/GISA: S. aureus com R intermediaria para a vancomicina

Espessamento da parede , impede ação da droga

VRSA/ GRSA: S. aureus com R para a vancomicina (raros)

Plasmideo carreador do gene de R a Glicopeptideos

-LINCOSAMINAS, MACROLIDEOS E ESTREPTOGRAMINA: efluxo ativo da droga e sua inativação

COCOS GRAM POSITIVOS

ESTREPTOCOCOS: cocos gram positivos em pares e cadeias

-Enterococcus spp: distribuídos na natureza, fazem parte da microbiota humana (trato gastrointestinal, pele, orofaringe, genitália, anus, e via hepato-biliar).

Em IRAS: infecção do trato urinário (infecção, colonização)Em IRAS: infecção do trato urinário (infecção, colonização)Infecção de corrente sanguíneaInfecção de sitio cirúrgico e intra-abdominalEndocardite bacteriana

E. faecalis, E. faecium, E. gallinarum, E. casseliflavus

ESTREPTOCOCOS

-enzimas para degradar beta-lactamicos e aminoglicosídeos

(para baixo e alto nível de concentração de gentamicina e estreptomicina)

-R para Glicopeptideos: cepas VRE por genes, o vanA, vanB e vanC que podem ser transferidos a outras bactérias(VRSA)

-Estreptococcus spp: relacionados principalmente às infecções de tato respiratório, pele, tecidos moles, sepse, endocardites e meningites.

-S. pneumoniae (pneumococo): tem na capsula que o envolve e é seu maior poder de virulência, protegendo-o de fagocitose e do sistema imunológico

ESTREPTOCOCOS

Importância clinica:

-homem é reservatório e hospedeiro exclusivo da espécie, no sistema respiratório

-taxa de isolamento em indivíduos saudáveis é de 20 a 40%. -isolado em líquidos normalmente estéreis, como sangue, -isolado em líquidos normalmente estéreis, como sangue, pleural, ascitico, sinovial e LCR, abscessos.

Não produz beta-lactamase, mas pode alterar as PBPs da parede celular e alterar/dificultar a ligação dos beta-lactamicos, como a penicilina.

ESTREPTOCOCOS

- S. pyogenes (grupo A) : toxinas virulentas que causam febre escarlatina e choque toxico. Podem causar doenças respiratórias, erisipela, endocardites, artrites, meningites e faringite com evolução para glomerulonefrite. Resistentes aos macrolideos.aos macrolideos.

- S. agalactiae (grupo B) causam sepse, meningite e infecções em neonatos.

- S. do grupo viridans participa da flora normal da cavidade oral, gastrointestinal, genitália, mas podem estar associados a endocardites em pacientes com próteses de válvulas, quando isolados em hemoculturas.

- Colônias de Streptococcus grupo A, Agar sangue (hemólise)- gram de estreptococos- isolado de Streptococcus pneumoniae (LCR) – LACEN MT

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