A INTOXICAÇÃO POR ALUMÍNIO NOS DOENTES EM … · A INTOXICAÇÃO POR ALUMÍNIO NOS DOENTES EM HEMODIÁLISE - UMA PERSPETIVA HISTÓRICA - Monografia do 2.º Ciclo de Estudos Conducente

A INTOXICAÇÃO POR ALUMÍNIO NOS

DOENTES EM HEMODIÁLISE

- UMA PERSPETIVA HISTÓRICA -

Monografia do 2.º Ciclo de Estudos Conducente ao

Grau de Mestre em Análises Clínicas

Ana Isabel Magalhães Rodrigues

Trabalho realizado sob a orientação do

Professor Doutor Agostinho Almeida

Setembro 2012

ii

É autorizada a reprodução integral desta monografia apenas para efeitos de

investigação, mediante declaração escrita do interessado, que a tal se compromete.

A intoxicação por alumínio nos doentes em hemodiálise 2012

Mestrado em Análises Clínicas iii

Agradecimentos

Em primeiro lugar ao Professor Doutor Agostinho Almeida pela disponibilização do

tema, e pela prontidão com que aceitou orientar este trabalho.

Aos meus pais e irmão pelo apoio constante e incondicional.

A todos os meus amigos e colegas que durante estes meses sempre me incentivaram,

acompanharam e suportaram em todos os momentos.

Em especial, à Ana, à Eli, à Moniquinha, ao Gustavo e ao Zé.


Mestrado em Análises Clínicas iv

Resumo

O alumínio (Al) é um metal muito abundante na crosta terrestre. Por isso os seres

humanos estão em constante contato com ele. No entanto, não possui funções biológicas

conhecidas e, quando em excesso, leva a intoxicação, podendo nomeadamente causar

elevada morbilidade na população com doença renal crónica. Especialmente nos doentes

em tratamento por hemodiálise.

Nestes doentes, no passado, para além dos alimentos e da água ingerida, a exposição a

água para diálise contaminada com Al, os quelantes do fosfato e os antiácidos foram as

maiores fontes adicionais. Atualmente estas fontes foram praticamente eliminadas. As

principais complicações desenvolvidas nestes doentes eram demência de diálise, distrofia

óssea e anemia microcítica, complicações que em alguns casos levaram mesmo até à morte.

No entanto, desde os anos 80, com a substituição dos quelantes do fosfato contendo Al e

com a melhoria dos processos de purificação da água, a incidência destas complicações

diminuiu drasticamente.

Neste trabalho, e numa perspetiva histórica, é abordada a problemática da intoxicação

por Al no doentes em hemodiálise e destacado o importante contributo que a evolução das

técnicas instrumentais de análise, particularmente da espectrofotometria de absorção

atómica com atomização eletrotérmica, ao tornar possível a determinação fiável das

concentrações plasmáticas de Al, contribui para a resolução dos problemas associados à

sua sobrecarga nos doentes em hemodiálise.

Palavras chave: insuficiência renal crónica, hemodiálise, Al, fontes de exposição, efeitos

tóxicos.


Mestrado em Análises Clínicas v

Abstract

Aluminum (Al) is a very abundant metal in the earth’s crust. Therefore, humans are

permanently exposed to it. However, it does not have any known biological functions, and

excessive exposure leads to intoxication, increasing morbidity in patients with renal

disease, especially in those on hemodialysis.

In the past, the exposure to contaminated dialysis water, aluminium-based phosphate

binders and antacids have been the largest sources of Al contamination amongst these

patients, besides food and drinking water.

Nowadays these sources have been virtually eliminated.

The major complications for patients on hemodialysis were dialysis dementia,

osteodistrophy and microcytic anemia, which in some cases lead to death. However, since

the 1980’s, with the replacement of aluminum-based phosphate binders and the

improvement of water purification systems, the incidence of these complications has

greatly decreased.

This monograph addresses, in a historical perspective, the issue of Al intoxication in

hemodialysis patients and highlights the important contribution of the instrumental

analytical techniques evolution, particularly the development of graphite furnace atomic

absorption spectrophotometry. By making possible the reliable determination of serum Al

concentrations, it significantly contributed to solve the problems associated with its

overload in patients on haemodialysis.

Keywords: end stage renal disease, hemodialysis, aluminum, exposure sources, toxic

effects


Mestrado em Análises Clínicas vi

Índice

Índice de Figuras ..................................................................................................................... viii

Índice de Tabelas ....................................................................................................................... ix

Lista de Abreviaturas ..................................................................................................................x

1. Função Renal e Insuficiência Renal Crónica ......................................................................... 1

1.1 Função Renal ...................................................................................................................... 1

1.2 Doença Renal Crónica e Insuficiência Renal Crónica .................................................... 2

2. Diálise ..................................................................................................................................... 4

2.1 Tipos de Diálise e respetivas modalidades ..................................................................... 4

2.2 Hemodiálise ...................................................................................................................... 6

2.2.1 Acesso vascular nos doentes em HD ........................................................................ 6

2.2.3 Constituição da solução dialisante ........................................................................... 8

3. Alumínio ................................................................................................................................. 9

3.1 Absorção .......................................................................................................................... 10

3.2 Distribuição .................................................................................................................... 10

3.3 Metabolismo .................................................................................................................... 11

3.4 Excreção ........................................................................................................................... 11

3.5 Toxicocinética .................................................................................................................. 11

4. Fontes de contaminação por Al nos doentes em HD .......................................................... 12

4.1 Solução dialisante ............................................................................................................ 12

4.1.1 Um caso de intoxicação por Al de doentes em HD, em Portugal .......................... 16

4.2 Quelantes do fosfato para o tratamento da hiperfosfatémia........................................ 17

4.3 Outros medicamentos ..................................................................................................... 19

5. Efeitos tóxicos do Al nos doentes em diálise ....................................................................... 21

5.1 Demência de Diálise ........................................................................................................ 21

5.2 Osteosdistrofia renal ...................................................................................................... 23

5.3 Anemia ............................................................................................................................ 24

5.4 Perturbações nos níveis de elementos vestigiais.......................................................... 26

5.5 Stress Oxidativo e Inflamação ....................................................................................... 27

6.Tratamento da intoxicação por Al ....................................................................................... 29


Mestrado em Análises Clínicas vii

7. Técnicas usadas na determinação de Al ............................................................................. 30

7.1 Considerações gerais ...................................................................................................... 30

7.2 EAA-AE ........................................................................................................................... 30

7.3 ICP-MS ............................................................................................................................ 35

7.4 Controlo da contaminação ............................................................................................. 36

7.5 Determinação da concentração de Al na solução dialisante........................................ 37

8. Conclusão ............................................................................................................................. 38

9. Referências Bibliográficas ................................................................................................... 39


Mestrado em Análises Clínicas viii

Índice de Figuras

Figura 1. Diálise Peritoneal ........................................................................................................ 5

Figura 2. FAV (em cima) e PVA (em baixo) ............................................................................. 6

Figura 3. Hemodiálise .................................................................................................................7

Figura 4. Difusão (à esquerda) e Ultrafiltração (à direita) ...................................................... 8

Figura 5. Osmose e Osmose inversa ........................................................................................ 14

Figura 6. Sistema “amaciador” ................................................................................................. 14

Figura 7. Notícia no British Medical Journal (5 de junho 1993)

sobre o caso de intoxicação por Al na unidade de HD do Hospital de Évora ....................... 16

Figura 8. Aumento da absorção de Al pelo citrato ................................................................. 20

Figura 11. Tubos de grafite com aquecimento longitudinal e com

aquecimento transversal (THGA). *Plataforma de L’vov ...................................................... 32


Mestrado em Análises Clínicas ix

Índice de Tabelas

Tabela 1. Estadios da IRC .......................................................................................................... 3

Tabela 2. Modalidades de HD ................................................................................................... 4

Tabela 3. Modalidades da DP manual e da DP automatizada ................................................ 5

Tabela 4. Alguns valores "normais" de Al no soro publicados na literatura

bioanalítica até 1985(94) .......................................................................................... 34


Mestrado em Análises Clínicas x

Lista de Abreviaturas

AAN – Análise por ativação neutrónica

Al – Alumínio

ALA-D – Desidratase do ácido delta aminolevulínico

As – Arsénio

CVC – cateter venoso central

DP – Diálise peritoneal

DPCA – Diálise peritoneal contínua ambulatória

DPCC – Diálise peritoneal contínua cíclica

DPI – Diálise peritoneal intermitente

DRC – Doença Renal Crónica

EAA-AE – Espectrofotometria de absorção atómica com atomização eletrotérmica

EPO – Eritropoietina

FAV – Fístula arteriovenosa

FCF – Fator de crescimentos dos fibroblastos

FDA – Food and Drug Administration

Fe – Ferro

GPx – Glutationa Peroxidase

GSH – Glutationa reduzida

HD – Hemodiálise

ICP-MS – Inductively coupled plasma-mass spectrometry

ICP-AES – Inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry

IRA – Insuficiência renal aguda

IRC – Insuficiência renal crónica

KDIGO – Kidney Disease Global Outcomes

KDOQI – Kidney Disease Outcomes Quality Initiative

MDA – Malonildialdeído

Mn – Manganês

NKF – National Kidney Foundation

Pb – Chumbo

PTH – Paratormona

PVA – Prótese vascular arteriovenosa

rHuEPO – Eritropoietina recombinante

Se – Selénio

SOD – Superóxido dismutase


Mestrado em Análises Clínicas xi

STPF – Stabilized temperature platform furnace

TFG – Taxa de filtração glomerular

THGA – Transversely-heated graphite atomizer

VMA – Valor máximo admitido

Zn – Zinco


Mestrado em Análises Clínicas 1

1. Função Renal e Insuficiência Renal Crónica

1.1 Função Renal

Os rins são um par de órgãos vitais, fundamentais para a manutenção da homeostasia

dos fluídos do corpo humano.

A unidade funcional do rim é o nefrónio e cada rim possui cerca de um milhão destas

unidades.(1) Acontece que o rim não consegue regenerar novos nefrónios pelo que, com

algum distúrbio renal, doença, e mesmo o próprio envelhecimento, há uma diminuição no

número destas unidades funcionais.(2, 3)

Os rins possuem diversas funções de homeostasia (p. ex., a eliminação de produtos

metabólicos) e bioquímicas (p. ex., a reabsorção de glucose e aminoácidos). São os rins os

responsáveis pela formação da urina onde são eliminados diversos produtos indesejáveis,

sendo que diariamente os rins excretam entre 1,5-2,5 L de urina.(1, 2) De seguida

sintetizam-se algumas das mais importantes funções dos rins:

Os rins excretam produtos que já não são necessários e são tóxicos para o organismo,

como a ureia (resultante do metabolismo dos aminoácidos), a creatinina (resultante da

creatina muscular), o ácido úrico (proveniente dos ácidos nucleicos), e produtos finais da

degradação da hemoglobina (como a bilirrubina) e alguns metabolitos de várias hormonas.

É importante que estes produtos possam ser eliminados na mesma taxa com que são

produzidos. Os rins excretam também toxinas e outras substâncias exógenas, como

pesticidas, fármacos e aditivos alimentares, e/ou seus metabolitos.(2)

Os rins contribuem para o equilíbrio ácido base, juntamente com outros órgãos, como

os pulmões, e sistemas tampão naturalmente presentes nos fluídos corporais. Por exemplo,

o rim é o único órgão capaz de eliminar do organismo ácidos como o ácido sulfúrico e o

ácido fosfórico, produzidos no metabolismo das proteínas.

Para a manutenção da homeostasia corporal, a excreção de água e de eletrólitos deve

coincidir com a entrada dos mesmos. Se para uma dada substância a entrada exceder a

excreção, a sua quantidade no organismo vai aumentar, e vice-versa. A entrada de água e

de muitos eletrólitos no organismo é regulada pelos hábitos alimentares, requerendo-se

aos rins o ajuste das taxas de excreção para coincidir com essa entrada.(2) Elevadas

concentrações de produtos resultantes da atividade metabólica e excesso de água afetam

os tecidos, comprometendo em particular o sistema cardiovascular e o cérebro.(1)



Os rins têm ainda um papel importante na regulação da pressão arterial, pois eliminam

quantidades variáveis de água e sódio. Para o efeito, também contribuem, por exemplo,

através da secreção da renina, que catalisa a formação de produtos vasoativos

(angiotensina II).(2)

Por fim, quanto à sua função endócrina, os rins produzem três importantes hormonas:

eritropoietina (EPO), renina (referida acima) e calcitriol.(4) A secreção de EPO estimula a

produção de eritrócitos pelas células estaminais hematopoiéticas na medula óssea. Por

isso é comum que em pessoas com doença renal grave se desenvolva anemia como

resultado da produção diminuída de EPO.

Os rins regulam a produção da forma ativa da vitamina D, a 1,25-dihidroxivitamina D3

(ou calcitriol) através da hidroxilação da pró-vitamina na posição 1. A forma ativa da

vitamina D é essencial para a normal deposição de cálcio nos ossos e para a reabsorção do

cálcio no trato gastrointestinal.

É também reconhecida a importância dos rins no processo de gluconeogénese.(2)

1.2 Doença Renal Crónica e Insuficiência Renal Crónica

A doença renal crónica (DRC) é mais frequente nos países desenvolvidos, em

comparação com os países em desenvolvimento.(5) Qualquer indivíduo pode desenvolver

doença renal e em qualquer idade, no entanto, há fatores que predispõem para o

desenvolvimento deste tipo de doença: diabetes, hipertensão, fatores genéticos e a própria

idade (envelhecimento).(6)

A perda progressiva e irreversível de uma grande quantidade de nefrónios funcionais

leva a insuficiência renal crónica (IRC). Esta pode ocorrer devido a distúrbios nos vasos

sanguíneos, glomérulos, túbulos e trato urinário inferior. O mesmo se passa com a

insuficiência renal aguda (IRA).(7) A IRC é um problema que afeta entre 5 a 10% da

população mundial.(8) E tem-se verificado um aumento da prevalência tanto da DRC como

da IRC.(1, 5)

A perda de nefrónios funcionais requer que os restantes tenham de excretar mais água

e solutos. Logo, a diminuição do número de nefrónios funcionais tem como consequência

uma redução da taxa de filtração glomerular (TFG), ocorrendo assim uma maior retenção

de água e solutos.

As complicações mais frequentes da IRC são uremia (aumento da concentração de

ureia no sangue), anemia (devido sobretudo à diminuição da produção de EPO) e



osteomalacia (provocada pela diminuição da produção de vitamina D ativa e pela

hiperfosfatémia).

As causas mais comuns de IRC são diabetes mellitus, hipertensão, glomerulonefrite e

doença poliquística do rim. Existem, no entanto, outras causas como, por exemplo,

obesidade, amiloidose, infeções (pielonefrites, tuberculose renal), obstrução do trato

urinário por cálculos renais, hipertrofia da próstata e constrição uretral. (1, 7)

Quanto aos sintomas, muitos doentes não apresentam sintomatologia significativa até

estadios avançados da IRC, isto é, até o número de nefrónios funcionais cair para menos

de 70-75%. Na realidade, muitos eletrólitos são mantidos em concentrações séricas

normais até uma diminuição no número de nefrónios funcionais de 20-25%.(6) Abaixo

deste valor o funcionamento do órgão fica significativamente comprometido.(7)

No entanto, quando os doentes apresentam sintomas pode-se observar: fadiga, falta de

apetite, perda de peso, prurido, edema periférico, distúrbios do sono, acrescida

necessidade de urinar, especialmente à noite, cãibras musculares durante a noite,

problemas de concentração e pele desidratada.(6, 9, 10)

Para rastreio de doença renal, uma vez que esta se pode desenvolver sem sintomas, a

National Kidney Foundation (NKF) recomenda três testes simples: medição da pressão

arterial, pesquisa de albumina/proteínas na urina e cálculo da TFG, através da medição da

clearance da creatinina. A medição da ureia dá informação adicional.(4)

Na tabela seguinte estão representados os diferentes estadios da IRC segundo as

normas Kidney Disease: Improving Global Outcomes (KDIGO)(11), da NKF:

Tabela 1. Estadios da IRC

Estadio TFG (mL/min x 1,73 m2) Descrição

1 >90 Dano renal com TFG normal ou

aumentada

2 60-89 Dano renal com diminuição

moderada da TFG

3 30-59 Diminuição moderada da TFG

4 15-29 Diminuição acentuada da TFG

5 <15 Falência renal

Os doentes no estadio 5 necessitam de transplantação renal ou de tratamento dialítico

para sobreviverem.



2. Diálise

A diálise é um processo de depuração que tem como objetivo a remoção de resíduos

indesejados do sangue e a reposição dos equilíbrios hidro-eletrolíticos e ácido-base,

alterados nos pacientes com IRC.(1)

A primeira diálise (hemodiálise) bem sucedida da história da medicina foi realizada em

1945, por Wilhem Kolf, na Holanda. O paciente sobreviveu por mais de 6 anos.(9) No

entanto, a hemodiálise só passou a ser um tratamento comum nos anos 60.(12)

2.1 Tipos de Diálise e respetivas modalidades

Os dois principais tipos de diálise são a hemodiálise (HD) e a diálise peritoneal (DP),

sendo a primeira a mais usada.(9)

Ao longo dos anos tem-se procurado tornar os equipamentos de diálise cada vez mais

eficientes no sentido de minimizar os efeitos indesejáveis. Máquinas mais simples e

compactas tornaram mesmo mais viável o processo de diálise em casa. No entanto, a HD

continua a ser um tratamento complicado, que requer o acompanhamento e supervisão de

uma equipa especializada.(12)

Na tabela seguinte estão referidas as diferentes modalidades de HD(13):

Tabela 2. Modalidades de HD

Modalidades de HD

HD convencional

HD de alta eficácia

HD de alto fluxo

Hemodiafiltração

Hemofiltração

O outro tipo de diálise é a DP. É uma técnica de depuração extra-renal, que utiliza o

peritoneu como membrana dialisante.(13)

O peritoneu possui uma extensa superfície e uma vasta rede de vasos sanguíneos.

Muitas substâncias do sangue podem passar através do peritoneu para o interior da

cavidade abdominal. A solução dialisante é introduzida através de um cateter que penetra

através da parede abdominal até ao espaço peritoneal, no interior do abdómen (Fig. 1). O

cateter permite a passagem de aproximadamente 1,5-3 L de solução dialisante. Esta

solução deve permanecer no abdómen durante 2-4 horas para permitir e os resíduos



metabólicos presentes na circulação sanguínea passam lentamente para a solução

dialisante. Este processo é repetido várias vezes por dia para permitir uma boa remoção

das toxinas, água e eletrólitos.(9, 14)

Figura 1. Diálise Peritoneal(15)

Podem distinguir-se dois grandes grupos de DP(13):

Tabela 3. Modalidades da DP manual e da DP automatizada

DP manual DP automatizada

DP contínua ambulatória (DPCA) DP contínua cíclica (DPCC)

DP intermitente ou descontínua DP contínua cíclica de alta dose

DP intermitente noturna

DP intermitente (DPI)

Na DP manual as trocas de soluções dialisantes são feitas manualmente; no caso da DP

automatizada, a troca é efetuada recorrendo a máquinas cicladoras. Estas máquinas

desempenham várias funções, como drenar e infundir volumes exatos de solução

dialisante a ritmos programados, quantificar e registar os balanços hídricos e aquecer a

solução dialisante, que deve estar a 37 ºC.

Outro tipo de diálise é a diálise híbrida, em que são utilizadas quer modalidades da DP

quer modalidades de HD.(13)

Para este trabalho assume maior importância a HD. Por isso, este tipo de diálise será

abordado mais detalhadamente.



2.2 Hemodiálise

Para o processo de HD é necessário um equipamento próprio (máquina de diálise).

Esta realiza três tarefas essenciais: bombear o sangue e monitorizar o fluxo sanguíneo,

remover os resíduos do sangue e controlar a pressão sanguínea e a taxa de remoção de

fluídos do organismo.(12) Absolutamente indispensável para o processo é a solução

dialisante, a qual consiste num fluído que ajuda a remover os resíduos e o excesso de água

do sangue, pois possui uma composição química semelhante aos líquidos normais do

organismo.(4, 16) E é ainda necessário criar um acesso vascular no doente.

2.2.1 Acesso vascular nos doentes em HD

Para facilitar o acesso de forma repetida à circulação sanguínea, semanas ou meses

antes do início do tratamento é criada cirurgicamente uma anastomose direta (ligação

entre uma artéria e uma veia), criando-se, assim, uma fístula arteriovenosa (FAV). A

criação deste acesso torna mais fácil e mais eficiente a remoção e o retorno do sangue

ao organismo, com menos complicações.(12, 16)

A FAV deve ser considerada a primeira escolha, pois tem uma maior durabilidade e

acarreta menores complicações no que toca a infeções e formação de coágulos. No entanto,

quando os doentes não possuem vasos suficientemente fortes, existem outras

alternativas.(17) Entre essas possibilidades estão: a inserção de uma prótese vascular

arteriovenosa (PVA) (uso de um tubo sintético para ligar uma artéria e uma veia), que tem

uma cicatrização mais rápida mas uma elevada taxa de infeção; e o uso de um cateter

venoso central (CVC), que tem a vantagem de poder ser usado imediatamente. Este é útil

por exemplo quando é necessário aguardar pela cicatrização da PVA ou da FAV.(9, 13, 17) Na

Fig. 2 estão representadas quer a FAV quer a PVA.

Figura 2. FAV (em cima) e PVA (em baixo)(18)



Resumidamente, no processo de HD (Fig.3) o sangue sai por um tubo ligado à FAV e é

bombeado para o dialisador.

Dentro do dialisador, que funciona como um rim artificial, uma membrana

semipermeável seletiva separa dois compartimentos, um por onde circula o sangue e outro

por onde circula a solução dialisante. Estes circulam em direções opostas. A pressão no

compartimento da solução dialisante é mais baixa que a do compartimento do sangue,

permitindo assim que o líquido, os produtos residuais e as substâncias tóxicas do sangue

passem através da membrana que separa ambos os compartimentos.

Contudo, as células sanguíneas e as proteínas de grandes dimensões não passam

através dos pequenos poros da membrana.(16)

Figura 3. Hemodiálise(19)

O plasma é, assim, purificado dos resíduos à medida que estes passam do sangue para a

solução dialisante. Ao contrário dos túbulos renais, no entanto, a membrana de diálise não

consegue reabsorver sódio, potássio, glucose, e outras moléculas. Para que estas

substâncias permaneçam no sangue, são incluídas na solução dialisante, de modo a que

não haja um gradiente de concentração que favoreça a sua difusão através da membrana.

O sangue purificado é depois devolvido ao organismo.(9, 16, 20)

Durante a HD, o restabelecimento da composição normal do fluido intracelular e

extracelular do organismo é alcançado pelo transporte de solutos (como por exemplo a

ureia) do sangue para a solução dialisante, e pelo transporte de solutos (por exemplo

bicarbonato) da solução dialisante para a corrente sanguínea, através de um processo de

difusão (gradiente de concentração).

O eventual excesso de água é removido por ultrafiltração. Para o efeito, cria-se um

gradiente de pressão através da membrana usando uma bomba que aumenta a pressão no



compartimento sanguíneo, causando a passagem de água para o compartimento da

solução dialisante.

Os dois mecanismos que permitem a passagem de solutos de uma solução para outra

estão esquematizados na Fig. 4. Há difusão de solutos devido ao gradiente de

concentração química, e a ultrafiltração permite a eliminação do excesso de água, através

de uma membrana semipermeável.(1)

Figura 4. Difusão (à esquerda) e Ultrafiltração (à direita)(1)

2.2.3 Constituição da solução dialisante

A solução dialisante consiste numa solução de eletrólitos dissolvidos em água. Existem

diferentes tipos de soluções dialisantes disponíveis comercialmente. Uma solução típica

contém 130-145 mEq/L de sódio, 2-3 mEq/L de potássio, 2,5-3,5 mEq/L de cálcio e 100-

200 mg/dL de glucose, juntamente com magnésio e substâncias com poder tampão, para

manter o pH sistémico. O bicarbonato, sob a forma de pó seco, é adicionado

extemporaneamente, uma vez que é muito instável para poder estar já presente na

solução.(9) A sua adição permite a correção da acidose metabólica, que é uma complicação

da uremia. A glucose é adicionada com o intuito de prevenir a hipoglicemia.(21, 22)



3. Alumínio

Em pacientes submetidos a tratamento dialítico, a ausência de uma eficiente

eliminação renal, juntamente com o uso de quelantes de fosfato contendo alumínio (Al),

bem como o uso de soluções dialisantes contaminadas com este metal, podem levar a

acumulações de Al no organismo.(23, 24)

Pelo facto de a intoxicação por Al ser um problema importante nos doentes em diálise,

descreve-se de seguida o seu perfil toxicológico.

O Al corresponde a cerca de 8% (m/m) da massa da crosta terrestre, onde é o terceiro

elemento mais abundante, depois do oxigénio (47%) e do silício (28%), sendo o primeiro

entre os metais.(23-25)

É um elemento muito reativo, pelo que nunca é encontrado livre na natureza, antes

encontrando-se combinado sob a forma de hidróxidos, silicatos, fosfatos ou sulfatos(25-27)

Por ser um metal ubíquo, existem variadas fontes de Al a que o ser humano está exposto

diariamente. Algumas mais significativas são:

Exposição ambiental: O ser humano está continuamente exposto ao Al através do solo,

do ar e da água. No solo, as maiores concentrações devem-se a contaminação com

resíduos de indústrias, p. ex., resíduos da combustão de carvão ou da fundição de Al. Na

atmosfera, o Al é maioritariamente encontrado como aluminossilicatos na chamada

“matéria particulada” (partículas sólidas em suspensão no ar). Na água, as concentrações

de Al são baixas em águas naturais, mas podem ser bastante elevadas em áreas urbanas.

Um fator que contribui para o aumento da concentração de Al na água é a chuva ácida.(28)

Exposição através da dieta: Os alimentos possuem naturalmente Al, pois crescem em

solos que contêm este metal. O Al está também presente em muitos aditivos alimentares.

São mesmo os alimentos a principal fonte de exposição.(26) Foi estimado que cerca de 20%

da ingestão diária de alumínio terá origem no uso de utensílios domésticos feitos de Al (p.

ex., talheres, panelas).(28)

Exposição iatrogénica: A introdução do Al diretamente na corrente sanguínea através de

soluções dialisantes com elevadas concentrações de Al (como acontece nos doentes em

tratamento dialítico), a administração de elevadas doses de quelantes de fosfato contendo

Al na sua composição e os antiácidos são as mais importantes causas de sobrecarga de Al

devida a medicação.



Exposição ocupacional: A exposição ocupacional (i.e. no ambiente de trabalho) ao Al é

inevitável devido ao seu amplo uso em variadas indústrias. A exposição é mais intensa em

trabalhadores de refinarias de Al e em indústrias que utilizem o metal.(28)

3.1 Absorção

Diariamente, o ser humano ingere pequenas quantidades de Al, cerca de 4-5 mg através

dos alimentos e entre 10-1000 g/L pela ingestão de água.(29) Mas o organismo humano

possui barreiras como a pele, pulmões e trato gastrointestinal que limitam grandemente a

sua absorção sistémica, pelo que o Al é pouco absorvido depois de exposição oral,

inalatória ou dérmica.(26)

Em particular, a absorção a nível do trato gastrointestinal é bastante baixa (0,1%), mas

existem componentes da dieta que complexam o Al, podendo aumentar ou diminuir a sua

absorção.(28) Por exemplo, na presença de fosfato, a absorção de Al é inibida, assim como

na presença de hidróxido de Al há inibição da absorção de fosfato.

Outro exemplo é a ligação do Al a compostos orgânicos de baixo peso molecular,

predominantemente o citrato, o que aumenta a sua absorção.(25)

O principal mecanismo de absorção do Al é provavelmente a difusão passiva através de

vias paracelulares.(26)

3.2 Distribuição

O Al acumula-se em diferentes extensões em vários tecidos, incluindo pulmões, fígado,

baço, osso, coração, músculo, cérebro e glândulas paratiroideias.(30, 31) O tecido ósseo é um

dos locais preferenciais de acumulação de Al, principalmente em áreas do osso

metabolicamente ativas.(26)

No sangue, aproximadamente 10% do Al encontra-se nos eritrócitos. Os níveis normais

de Al no plasma são aproximadamente de 1–3 μg/L. Aqui, cerca de 90% do Al encontra-se

ligado à transferrina, isto é partilha com o ferro (Fe) a sua proteína transportadora.

Existem recetores desta proteína em muitos tecidos, e é a densidade destes recetores que

influencia a distribuição do Al no organismo. A entrada de Al nos órgãos e tecidos é

relativamente lenta e, como referido, dependente da transferrina.(26)

Os restantes 10% do Al plasmático estão associados com o citrato.(26, 32)

No interior das células, o Al acumula-se nos lisossomas, núcleo celular e cromatina.(28)



3.3 Metabolismo

O Al pode existir no organismo sob diferentes formas. Pode existir como iões livres

(catiões trivalentes), mas facilmente se liga a outras moléculas, formando complexos. Pode

ligar-se a nucleótidos, aminoácidos, ácidos orgânicos, fosfatos, e formar complexos de

baixo peso molecular, estáveis, metabolicamente ativos, principalmente os complexos

apolares. Pode formar complexos com macromoléculas, por exemplo aminoglicosídeos ou

proteínas, que são metabolicamente menos ativos que os anteriores. Pode também formar

complexos irreversíveis com macromoléculas, que são muito estáveis.(26)

3.4 Excreção

Em pessoas saudáveis, o Al que é absorvido pelo trato gastrointestinal é eliminado

pelos rins, através da urina, e em menor extensão pela bile.(26, 33) Os níveis de Al na urina

em indivíduos saudáveis são normalmente baixos, inferiores a 10 g/L.

Como se referiu, grande parte do Al presente na dieta está sob a forma insolúvel e não

absorvível.(23) O Al não absorvido é eliminado pelas fezes.(26)

3.5 Toxicocinética

Apesar de o ser humano se encontrar continuamente exposto ao Al, não lhe é atribuída

utilidade nos sistemas biológicos. Pelo contrário, este metal é tóxico para as plantas, para

muitos animais aquáticos e para os seres humanos.(23, 25, 28)

A toxicocinética do Al depende do tipo de complexos em que se encontra presente. Se o

Al estiver sob a forma de um complexo de elevado peso molecular, por exemplo com a

transferrina, não é filtrado nos glomérulos, e não é excretado. O contrário acontece

quando o Al se encontra sob a forma de complexos de baixo peso molecular.(26)



4. Fontes de contaminação por Al nos doentes em HD

4.1 Solução dialisante

Como anteriormente referido, a solução dialisante resulta da mistura (diluição) do

concentrado polieletrolítico (comercial) com água de abastecimento municipal

devidamente tratada/purificada (na unidade de diálise).

A contaminação da solução pode ter origem nas duas fontes. No entanto, a

contaminação da água usada no tratamento por HD com Al foi desde sempre apontada

como a principal responsável pela encefalopatia, anemia e osteodistrofia observada nos

doentes em diálise.(24)

A água funciona como a principal via de contaminação porque os doentes em HD não

estão apenas expostos à água de consumo que ingerem, mas a uma elevada quantidade,

entre 300-400 L por semana, de água usada na preparação das soluções dialisantes. E

enquanto a água ingerida atinge a corrente sanguínea apenas após a passagem pela

mucosa gastrointestinal, que é altamente seletiva e grandemente impede a absorção de Al,

a solução dialisante entra em contacto praticamente direto com a corrente sanguínea,

apenas tendo a separá-las uma membrana artificial semipermeável.(21, 22)

O Al na água, a pH neutro, predomina sob a forma de complexos e é altamente

insolúvel (podendo ser filtrado). Mas por ser anfotérico, pequenas variações de pH podem

aumentar a concentração de Al dissolvido. E o aumento da concentração de Al na água, e

consequentemente na solução dialisante com ela preparada, faz com que exista um

gradiente de Al “difundível” para o compartimento sanguíneo. O balanço de Al na HD

depende então de fatores como o tipo de membranas de diálise (superfície e espessura),

pH da solução dialisante e, principalmente, da concentração de Al nessa mesma solução

dialisante.(24, 34, 35)

Desde a década de 70 que se começou a relacionar a intoxicação por Al com a

contaminação por este metal da água usada na HD. Alguns episódios concretos

permitiram ter evidências diretas desta associação.

Por exemplo, em 1976, em Heindoven, na Holanda verificou-se uma relação direta

entre a concentração de Al presente na água usada para a preparação da solução dialisante

e a demência de diálise. Parte da água usada para preparar a solução dialisante era água

da rede de abastecimento público, enquanto outra parte era obtida de uma caldeira

própria do hospital. Na caldeira, haviam sido colocados ânodos de Al, com o objetivo de

evitar a corrosão. Acontece que os ânodos de Al, que pesavam cerca de 32 kg, tinham-se

desintegrado por completo em dois anos. Como resultado, a concentração de Al nas



soluções dialisantes era extremamente elevada. Noutras unidades de diálise da mesma

cidade, em que a preparação da solução dialisante era semelhante mas em que as caldeiras

não possuíam ânodos de Al, não tinham ocorrido casos de demência de diálise.(36)

No ano seguinte, em 1977, Platts e colaboradores(37) registaram uma elevada

prevalência de demência de diálise e fraturas espontâneas em doentes em HD. Notaram

que a distribuição geográfica deste problema era desigual e decidiram investigar as águas

de abastecimento. Observaram então, que a água usada nos pacientes que desenvolveram

fraturas ou encefalopatia possuía menores concentrações de cálcio e flúor, e elevadas

concentrações de Al e manganês (Mn) por comparação com as concentrações destes

mesmos elementos na água utilizada em pacientes que não desenvolveram estas

complicações.

Verificaram igualmente que os pacientes com múltiplas fraturas tinham realizado HD

com água que possuía maior concentração de Al e Mn que aqueles que possuíam apenas

uma fratura. Os autores não culpabilizaram o Al administrado oralmente, porque somente

alguns pacientes estavam em terapêutica com quelantes do fosfato contendo Al.

Concluíram, no entanto, que algum contaminante presente na água era provavelmente

responsável pelo desenvolvimento da demência de diálise e pela osteodistrofia.

Propuseram então que nas zonas em que a água possuísse elevadas concentrações de Al

fossem usados desionizadores para o seu tratamento. Após a introdução destes

dispositivos, Ward e colaboradores(24) verificaram que a percentagem de doentes em HD

que desenvolvia osteomalacia era menor relativamente aqueles que usavam simplesmente

água “amaciada”, não desionizada, da mesma fonte.

Ward e colaboradores observaram que o processo de desionização, mais propriamente

o processo de osmose inversa, era muito eficiente na remoção do Al da água de

abastecimento público.

O princípio básico da osmose inversa (Fig. 5) consiste em forçar a água a passar através

de uma membrana que é tão espessa que apenas as moléculas de H2O e iões passam.

Assim, tanto do ponto de vista químico como do ponto de vista microbiológico, com uma

membrana de osmose inversa pode ser produzida água pura.(38) Esta membrana remove

praticamente todos os compostos orgânicos e 90-99% dos iões. São necessárias pressões

de 10-70 bar para o processo de purificação ocorrer eficazmente. Esta técnica requer

menos energia que um processo de destilação e possui a mesma eficiência que uma resina

de troca iónica.(39)



Figura 5. Osmose e Osmose inversa(39)

A introdução de módulos de osmose inversa foi pois um passo fundamental para a

obtenção de água apropriada para a preparação da solução dialisante, já que até então os

processos de purificação da água eram inexistentes, ou bastante rudimentares. Aliás,

quando o tratamento hemodialítico foi introduzido eram comuns episódios de

contaminação química, como é exemplo a chamada “síndrome da água dura”.(22) Esta

síndrome era devida a elevadas concentrações de cálcio e magnésio na água, que

provocavam episódios de vómitos, letargia e fraqueza muscular nos pacientes durante as

sessões de HD.

Assim, ao contrário do que aconteceu até a década de 70, em que se acreditava que a

água potável servia para a HD, nos anos 80 era já claro que a causa mais importante da

toxicidade epidémica do Al era a contaminação por este metal da água utilizada para a

preparação da solução dialisante.(36)

O equipamento de tratamento de água numa unidade de diálise, antes dos anos 70,

consistia simplesmente em filtros de sedimentação (remoção de partículas), filtros de

carbono ativado (adsorviam a matéria orgânica dissolvida) e “amaciadores” (Fig. 6) (para

evitar a síndrome da água dura).(38)

Figura 6. Sistema “amaciador”(39)



Mas como tem vindo a ser referido, tornava-se evidente que a água usada para

tratamentos hemodialíticos precisava de satisfazer requisitos e padrões de qualidade

específicos, para prevenir episódios de intoxicação/toxicidade, quer na IRA quer na IRC.(39)

Atualmente todas as unidades de diálise possuem um sistema de tratamento de água

para HD. Com este sistema pretende-se garantir um grau de purificação da água para

preparação da solução dialisante que respeite os padrões definidos. Este sistema tem

também como objetivo garantir sempre condições de caudal e pressão previamente

estabelecidas.

O sistema de tratamento referido inclui um tanque de sedimentação, grupo

hidropressor, sistema de cloragem, filtro de sedimentação, descalcificador, filtro de carvão

(para remoção de compostos halogenados, inorgânicos e orgânicos de baixo peso

molecular), filtro de partículas (“cartuchos”), módulos de osmose inversa e um sistema de

distribuição da água tratada. É opcional que as unidades de diálise possuam um tanque

com a água tratada.

Segundo o mais recente Manual das Boas Práticas em Diálise (2011), o valor máximo

admitido (VMA) de Al na água usada para diálise é de 4 g/L. E a monitorização da água

para HD relativamente ao conteúdo de Al deve ser realizada trimestralmente.(13)

Importa referir que o Al é intencionalmente adicionado no próprio tratamento da água

de abastecimento público. Atualmente as etapas de tratamento de água municipal incluem

processos como pré-filtração (remoção de partículas em suspensão), clarificação (para

reduzir a turvação), desinfeção e ajuste do pH.(39) O Al é usado na forma de sais de Al,

como os sulfatos, funcionando como “coagulante” no processo de clarificação, isto é, estes

sais são adicionados para provocar a coagulação/floculação das partículas coloidais em

suspensão, originando precipitados que possam ser eliminados por filtração, ficando a

água mais límpida e adequada ao consumo. No entanto, parte do Al adicionado fica em

solução e faz parte do Al residual presente na água de consumo.(40-42)

Em síntese, o desenvolvimento de sistemas mais sofisticados para a purificação da água

(osmose inversa) minimizou significativamente a possibilidade de intoxicação por Al

através da via parenteral em pacientes em HD.(30) A monitorização periódica das águas

que abastecem as unidades de diálise é importante, uma vez que as próprias variações

sazonais alteram as concentrações de Al na água, tal como alteram a necessidade de

adicionar mais ou menos sais de Al para a sua “clarificação”.(23)



4.1.1 Um caso de intoxicação por Al de doentes em HD, em Portugal

Um caso de intoxicação grave por Al ocorreu em Portugal, em 1993, na Unidade de

Hemodiálise do Hospital Distrital de Évora, e de que resultou a morte de vinte e cinco

pessoas. O mau funcionamento das membranas, juntamente com o elevado teor de Al na

água (devido a seca verificada nessa altura no Alentejo e à consequente maior necessidade

de adicionar sais de Al para o seu tratamento) foram as causas apontadas.

Este ocorrência teve um grande impacto mediático, inclusive na literatura médica (Fig.

7), pois nesta altura já eram bem conhecidos os efeitos da intoxicação por alumínio e a

absoluta necessidade da purificação da água usada para HD.

Figura 7. Notícia no British Medical Journal (5 de junho 1993) sobre o caso de intoxicação por Al na

unidade de HD do Hospital de Évora



4.2 Quelantes do fosfato para o tratamento da hiperfosfatémia

A IRC leva a uma perda progressiva da capacidade do rim de excretar o fosfato, de

produzir a forma ativa de vitamina D (a 1,25-dihidroxivitamina D3) e de manter a

homeostasia do cálcio. O aumento dos níveis séricos de fosfato (hiperfosfatémia) e a

diminuição dos níveis de vitamina D levam a um aumento dos valores da paratormona

(PTH), conhecido como hiperparatiroidismo secundário, e a um aumento no fator de

crescimento dos fibroblastos 23 (FCF 23). Estes dois últimos são reconhecidos pelo seu

papel na osteodistrofia renal.(43, 44)

No hiperparatiroidismo secundário (HPTS) associado à insuficiência renal crónica

observam-se alterações quer endocrinológicas, quer do metabolismo fosfo-cálcico e da

própria remodelação óssea, que resultam do aumento da secreção de PTH (i.e.

hiperativação das glândulas paratiroideias).(45)

O problema da hiperfosfatémia foi reconhecido muito cedo na história da diálise. A

calcificação vascular (devido à deposição de fosfato de cálcio nas paredes dos vasos

sanguíneos) e de tecidos moles podia ser facilmente visualizada através de exame com

raios X.(36)

A preocupação com a hiperfosfatémia deve-se ao facto de esta estar associada ao

desenvolvimento de doença cardiovascular, e consequentemente ao aumento da

mortalidade nos doentes em diálise.(43) É então fundamental a monitorização das

concentrações séricas de fosfato nos doentes com IRC. Para o tratamento da

hiperfosfatémia em geral, uma vez que o fósforo é proveniente da dieta (principalmente

das proteínas), recomenda-se uma dieta restrita em fósforo. Mas uma vez que nos doentes

em diálise esta restrição não é suficiente, recorre-se ao uso de quelantes do fosfato, como o

hidróxido de alumínio e o carbonato de cálcio, de modo a inibir a absorção gastrointestinal

do mesmo.

Nos anos 70 a administração destas duas substâncias aos doentes em HD era uma

prática universal.(36) O hidróxido de alumínio era tido como padrão neste tratamento, por

ser muito eficiente. No entanto, o seu uso prolongado começou também a ser associado à

acumulação de Al e à toxicidade já referida (encefalopatia, osteomalacia, anemia

microcítica e miopatia). No início dos anos 80, houve então uma limitação do uso deste

agente, ou mesmo a sua abolição. Atualmente o hidróxido de alumínio é utilizado apenas

por muito curtos períodos de tempo.(36, 46)

Surgiram então, como alternativa aos quelantes do fosfato contendo Al, os sais de cálcio

(carbonato de cálcio e acetato de cálcio). O carbonato de cálcio controlava eficazmente a



hiperfosfatémia, ainda que sendo menos eficaz que o hidróxido de alumínio. No entanto, o

seu uso podia levar a fenómenos de hipercalcémia. Efetivamente, o carbonato de cálcio

possui uma proporção elevada de cálcio elementar (40%). Quando administrado em doses

elevadas, ou quando é administrado com vitamina D (que aumenta a sua absorção

gastrointestinal) pode levar a um aumento da concentração sérica de cálcio. O uso de

soluções de diálise com elevadas concentrações de cálcio também contribui para este

fenómeno.

O acetato de cálcio apareceu depois como alternativa ao carbonato de cálcio. Possui

uma menor percentagem de cálcio elementar (25%), era bem tolerado e diminuía

significativamente e mantinha os níveis de fósforo sérico e o produto cálcio x fosfato (Ca x

P). No entanto, a ocorrência de hipercalcémia estava associada tanto ao carbonato como

ao acetato de cálcio. E a hipercalcémia em doentes em diálise era preocupante pois estava

associada a progressivas calcificações vasculares, contribuindo para o aumento da

mortalidade destes doentes.(46) Com o aumento das concentrações de cálcio, aumenta

também o produto Ca x P, e quando este produto excede os 55 mg/dL há um risco elevado

de calcificação ectópica (calcificação fora do tecido ósseo).(47)

Sendo assim, também eram necessárias alternativas a estes quelantes de fosfato

contendo cálcio. Durante vários anos estudaram-se sais de magnésio (hidróxido e

carbonato de magnésio), mas estes não se revelaram muito eficazes e exigiam ajustes nas

soluções dialisantes relativamente à concentração de magnésio.(46)

Depois surgiu o cloridrato de sevelâmero, um polímero quelante do fosfato que não

contém nem alumínio nem cálcio. Disponível em Portugal desde 2000, reduz os níveis

séricos de fósforo sem afetar os valores de cálcio. No entanto, o tratamento com este

agente quelante está frequentemente associado a distúrbios gastrointestinais,

nomeadamente flatulência.(48)

A primeira formulação de sevelâmero a ser aprovada continha o hidrocloreto de

sevelâmero. Seguiu-se depois o carbonato de sevelâmero,(47) desenvolvido com o intuito de

fazer baixar os níveis de fosfato sem o risco de agravar a acidose metabólica associada ao

hidrocloreto de sevelâmero e a consequente necessidade de monitorizar alterações nas

concentrações séricas de cloreto e bicarbonato.(44, 49)

Posteriormente, para tratamento da hiperfosfatémia nos pacientes em diálise, foi

aprovado pela FDA (Food and Drug Administration) o carbonato de lantânio (está

aprovado em Portugal desde Julho de 2005). O carbonato de lantânio é pouco solúvel,

mas no ambiente ácido do estômago e na parte superior do intestino delgado, dissocia-se

de modo a deixar o ião lantânio (La3+) disponível para a ligação ao fosfato.



O carbonato de lantânio mostrou ser tão eficaz como o hidróxido de alumínio e mais

eficaz que os compostos anteriormente referidos na quelatação do fosfato.(46) No entanto, é

possível que o seu uso a longo prazo possa ter alguns efeitos tóxicos.(36)

De qualquer modo, estes dois últimos quelantes de fosfato (cloridrato de sevelâmero e

carbonato de lantânio) não contêm nem cálcio nem alumínio e são eficazes na diminuição

dos níveis de fosfato. A principal desvantagem é o seu custo mais elevado, pelo que não

têm ainda um uso alargado em alguns países.(50)

Em síntese, os quelantes de fosfato baseados em cálcio têm uma boa eficácia e são os

mais usados na prática clínica. No entanto em pacientes com reduzida ou ausente função

renal, pode ocorrer calcificação extra-óssea.(51, 52) Existem então quelantes do fosfato que

não contêm cálcio que são eficazes na diminuição nos níveis de fosfato, como é o caso do

carbonato de lantânio. Após um ano de tratamento, o La3+ tende a acumular-se, mas os

efeitos da sua acumulação crónica ainda não estão bem entendidos. Por isto, é necessária

mais investigação neste campo, para definir bem o perfil risco-benefício dos diferentes

quelantes do fosfato.(44)

4.3 Outros medicamentos

Apesar dos quelantes de fosfato contendo Al serem atualmente pouco utilizados,

existem outros medicamentos que podem provocar toxicidade devido à presença de Al,

nomeadamente, antiácidos, analgésicos, vacinas, agentes anti-diarreicos e sucralfato

(protetor da mucosa gástrica).(53) A utilização deste último é desaconselhada em indivíduos

em diálise. E em doentes com DRC deve ser administrado cautelosamente devido ao risco

de acumulação de Al.

Nas vacinas o alumínio é comummente usado como adjuvante sob a forma de

hidróxido de Al, fosfato de Al ou alúmen (KAl(SO4)2·12H2O).(54)

Alguns estudos realizados por Froment e colaboradores(36) revelaram que o citrato de Al

é muito mais solúvel a um pH fisiológico do que o hidróxido de Al ou o cloreto de Al. A

elevada solubilidade do citrato de Al reforça a absorção gastrointestinal do Al (Fig. 8),

sendo este facto responsável por valores elevados de Al no soro e consequente

sintomatologia neurológica em pacientes que tomavam suplementos contendo citrato. O

citrato foi então substituído pelo bicarbonato no tratamento de acidose urémica. Para

além do citrato, também o lactato e o ascorbato facilitam a absorção gastrointestinal do

Al.(27)



Figura 8. Aumento da absorção de Al pelo citrato

Existe igualmente a preocupação de que algumas soluções de nutrição parenteral

possam estar contaminadas com Al.(53) O mesmo se aplica a soluções de administração

parenteral em grande volume (“soros”).

Há ainda estudos que demonstraram que os doentes em diálise que recebiam

terapêutica injetável, como ferro, insulina ou EPO, três das substâncias mais

frequentemente administradas a doentes em diálise, tinham níveis de Al plasmáticos

superiores aos que não recebiam essa terapêutica.(55)

http://46.4.230.144/web/UpToDate.v19.2/contents/f10/30/11219.htm



5. Efeitos tóxicos do Al nos doentes em diálise

Como destacado atrás, no passado as principais fontes de intoxicação pelo Al nos

doentes em diálise eram as soluções dialisantes contaminadas, os quelantes de fosfato

contendo Al e os antiácidos. Atualmente estas fontes foram quase totalmente

eliminadas.(56, 57)

Como também já foi referido, o Al é excretado essencialmente pelo rim. Logo os

doentes com DRC podem sofrer acumulação com consequente intoxicação pelo metal.

Os principais sinais e sintomas da intoxicação alumínica são a anemia hipocrómica

microcítica, a neurotoxicidade aguda, demência de diálise e a doença óssea relacionada

com o Al (osteomalacia ou doença óssea adinâmica).(30)

5.1 Demência de Diálise

Em 1972, Alan Alfrey e colaboradores relataram detalhes de um síndrome neurológico

progressivo e fatal que havia ocorrido em alguns pacientes em tratamento por HD há

alguns anos.(24)

Alfrey constatou que os pacientes em tratamento na sua unidade em Denver, Colorado,

EUA, frequentemente morriam depois de 3-7 anos em diálise devido ao desenvolvimento

de uma severa encefalopatia caracterizada por sintomas como disartria, disfasia, demência,

mioclonia, convulsões, ataxia e perda de memória. Nos doentes com esta patologia era

possível detetar um pico “padrão” no eletroencefalograma.(36, 58, 59)

Alfrey, o primeiro a descrever esta encefalopatia, estava convencido de que a mesma

resultava de uma intoxicação. Realizou então uma extensa pesquisa de toxinas, incluindo

metais pesados, no sangue destes doentes. Chegou a relatar que os pacientes com

encefalopatia possuíam uma ligeira acumulação de estanho ou uma deficiência em rubídio.

Mas finalmente em 1976 Alfrey demonstrou que muitos pacientes em diálise, que

acabaram por morrer devido à encefalopatia grave, possuíam elevadas concentrações de Al

nos seus tecidos.(36, 59) Em particular, encontrou um elevado conteúdo de Al no cérebro,

músculo e tecido ósseo dos doentes afetados.(24)

Foi então introduzida uma denominação para esta encefalopatia: “demência de diálise”.

Alfrey constatou que a causa da demência de diálise era a acumulação de Al na substância

cinzenta do cérebro (córtex cerebral).(60)

Inicialmente este síndrome neurológico foi atribuído ao Al administrado oralmente,

mas essa hipótese não explicava porque é que o uso de quelantes do fosfato contendo Al



era uma prática universal e a demência de diálise estava confinada a algumas unidades de

diálise. Estudos posteriores mostraram que a toxicidade severa havia sido causada

primariamente pela excessiva exposição ao Al através das soluções dialisantes, mais do

que ao uso de agentes quelantes contendo Al.(58, 61)

No final dos anos 70 (1978), acreditava-se já que a contaminação com Al das águas

usadas para preparar as soluções dialisantes era a causa provável da demência de diálise.

Mais, reconhecia-se já que a intoxicação alumínica não estava confinada apenas ao

sistema nervoso, antes seria também causa de doença óssea e de um agravamento da

anemia.(62)

Mais tarde, em 1993, Alfrey identificou dois tipos de neurotoxicidade: aguda e clássica.

A neurotoxicidade aguda é causada por elevados níveis de Al na solução dialisante, pela

ingestão em conjunto de quelantes de fosfato contendo Al e de citrato, ou pelo aumento

rápido da concentração de Al no soro após tratamento com desferroxamina (DFO).

Rapidamente são visíveis sintomas como confusão mental, fortes convulsões, coma e

morte. Os níveis plasmáticos de Al ultrapassam tipicamente 500 μg/L.

O tipo clássico/crónico de neurotoxicidade resulta da intoxicação crónica através da

exposição oral ou parenteral ao Al. Os sintomas vão aparecendo gradualmente, podendo

também acabar em morte. Ocorre mais ao fim de 3-7 anos em hemodiálise.(26)

O mecanismo pelo qual o Al exercia os seus efeitos neurotóxicos não era conhecido,

mas havia uma proposta de que o Al atuava inibindo a enzima diidropteridina redutase. A

inibição desta enzima faria diminuir o conteúdo de tetrahidrobiopterina (a diidropteridina

redutase catalisa a redução da 6,7-diidropteridina a 5,6,7,8-tetraidropteridina), de tirosina

(que resulta da hidroxilação da fenilalanina pela fenilalanina hidroxilase, na presença de

tetrahidrobiopterina, que atua como co-fator) e de neurotransmissores (a tirosina é

percursora na biossíntese de L-dopa, dopamina e noradrenalina). A neurotoxicidade do Al

também poderia envolver alterações nas principais enzimas pós-sinápticas da

neurotransmissão colinérgica.(63)

Observou-se ainda que o Al inibe o transporte de colina nos eritrócitos e diminui a

atividade da colina acetiltransferase no tecido nervoso.(24, 25)

Mais recentemente verificou-se que a exposição a elevados níveis de Al está associada

com alterações no sistema nervoso central (SNC), na forma de emaranhados

neurofibrilares e placas de proteínas beta amilóide. Em ratos, observou-se que a exposição

crónica ao Al resulta na hiperfosforilação de neurofilamentos e na rutura de microtúbulos,

(o que pode ser um possível mecanismo de neurotoxicidade).



De notar que atualmente se considera que a acumulação de Al estará associada a outras

neuropatologias para além da encefalopatia de diálise, como a Doença de Alzheimer e a

Doença de Parkinson.(25)

A demência de diálise acaba por desaparecer por completo quando são introduzidos

controlos rigorosos da qualidade da água, com a remoção do Al e outros elementos

vestigiais, conseguida com a utilização de sistemas de osmose inversa. Este problema

desapareceu mesmo em países em que os quelantes de fosfato contendo Al continuam a

ser usados.(36)

5.2 Osteosdistrofia renal

A osteodistrofia renal pode ocorrer nos doentes em HD como resultado do

hiperparatiroidismo secundário. No entanto, também a acumulação do Al no tecido ósseo

pode ser a causa dessa osteodistrofia.

O Al afeta o desenvolvimento do osso através de vários mecanismos: 1) age diretamente

no osso por induzir deficiência de fosfato (devido à sua ligação ao mesmo); 2) compromete

a absorção de cálcio pelo osso e interfere com a normal proliferação dos osteoblastos; 3)

diminui a conversão da 25-hidroxivitamina D, a principal forma de vitamina D circulante,

na sua forma ativa, 1,25-diidroxivitamina D3, ao inibir a enzima 25-hidroxivitamina D-1

alfa-hidroxilase.(57)

Indiretamente, ao depositar-se nas glândulas paratiroideias, o Al inibe a secreção e

libertação de PTH(23, 64), produzindo doenças ósseas de baixo turn-over (osteomalacia e

doença óssea adinâmica), com depósitos do metal visíveis histologicamente.(64)

Os pacientes com suspeita clínica de doença óssea relacionada com o Al devem realizar

o teste da DFO. Este teste funciona como um método de estimativa indireta do conteúdo

tecidual e ósseo de Al. É útil principalmente para pacientes que recorrem a tratamento

contínuo com quelantes de fosfato contendo Al ou que estejam expostos a outras fontes de

Al.(23)

Caso o resultado do teste da DFO seja negativo, deve-se realizar uma biopsia óssea. É

considerada intoxicação por Al quando pelo menos 20% da superfície óssea trabecular

está coberta de Al.(30)

Deve realizar-se também uma coloração histológica com o corante solocromo-azurina,

seguida de uma coloração de Perls, para afastar a possibilidade de presença de depósitos

de ferro.(30)



Em Portugal, para controlo da osteodistrofia renal nos doentes em HD a aluminemia

deve ser avaliada pelo menos uma vez por ano, e trimestralmente nos doentes que tomem

quelantes de fosfato contendo Al. A avaliação da fosfatemia e da calcemia é efetuada todos

os meses. A avaliação da PTH é realizada trimestralmente. O Diretor Clínico deve ainda

selecionar um marcador de calcificação vascular para avaliar anualmente.(13)

A osteomalacia que tenha como fator etiológico um excesso de Al não responde ao

tratamento com vitamina D ou os seus metabolitos ativos. Este tipo de osteomalacia

normalmente ocorre em doentes em diálise, mas excecionalmente pode ocorrer também

em pacientes que não estejam em diálise.(24)

5.3 Anemia

A anemia é definida como uma diminuição na concentração de hemoglobina no sangue

para baixo dos valores de referência para o sexo e idade.(65) Os valores de hemoglobina

mais frequentemente considerados para definir anemia são os da Organização Mundial de

Saúde (OMS). De acordo com os mesmos, considera-se anemia, no sexo feminino, quando

os valores de hemoglobina são <12,0 g/dL (ou o hematócrito é <37%) e, no sexo masculino,

quando os valores de hemoglobina são <13,0g/dL (ou o hematócrito é <39%).(66)

Os pacientes com falência renal grave quase sempre desenvolvem anemia. A mais

importante causa deste desenvolvimento é a diminuição da secreção renal de

eritropoietina (EPO), a hormona responsável por estimular a medula óssea a produzir

eritrócitos. Quando os rins estão gravemente lesados, não estão aptos para produzir a

quantidade adequada de eritropoietina, o que leva à diminuição no número de

eritrócitos.(7)

Nos doentes em HD, a produção insuficiente de EPO e a resposta reduzida à mesma

estão frequentemente combinadas com uma deficiência absoluta ou funcional de ferro.(67)

Nestes doentes, para avaliação a gravidade da anemia, deve ser efetuado um hemograma

pelo menos uma vez por mês. E, trimestralmente, devem ser avaliadas as reservas de ferro:

taxa de saturação da transferrina e a ferritinemia.(13)

A deficiente capacidade de resposta à eritropoietina é atribuída a má nutrição,

inflamação e/ou acumulação de recetores antagonistas, achados comuns nos doentes com

IRC em HD. A deficiência de ferro ocorre como resultado de deficiente absorção deste

metal no trato gastrointestinal e perdas de sangue durante a hemodiálise.(67) Por estes

motivos as reservas de ferro podem estar significativamente mais baixas nos doentes em

HD.(68, 69)



A anemia que estes doentes desenvolvem é na maioria dos casos normocrómica e

normocítica. O tratamento consiste habitualmente na administração de suplementos de

ferro e de eritropoietina recombinante humana (rHuEPO). No entanto, a terapia oral com

ferro não é suficiente para conseguir manter as reservas deste metal, e torna-se necessário

o tratamento intravenoso.(67)

Como já referido, o tratamento hemodialítico pode levar a intoxicação por Al, o que fará

desenvolver uma anemia característica nos doentes em HD. A intoxicação por Al foi

associada aos sinais de anemia no final dos anos 70.(70) Nesta altura, Elliot e MacDougall(71)

reportaram pela primeira vez uma anemia microcítica severa, hipocrómica ou

normocrómica, não ferropénica em pacientes com demência de diálise. Na mesma altura,

num estado realizado em Edimburgo, Escócia, verificou-se que os valores de Hb nos

doentes com demência de diálise diminuíram durante o ano anterior ao aparecimento dos

sintomas neurológicos. Esta queda no valor de Hb também se observava em pacientes com

muito elevadas concentrações séricas de Al. Como justificação admitia-se que o Al poderia

exercer efeitos inibitórios sobre algumas enzimas implicadas na biossíntese do heme. (62)

A anemia, caracteristicamente microcítica, ficou pois apontada como um possível sinal

de aviso de intoxicação por Al desde que neste estudo precedeu a demência de diálise e a

encefalopatia.(59)

Posteriormente foram reportados outros casos com a mesma descrição de anemia

induzida pelo Al. Todos os pacientes possuíam elevados níveis séricos de Al e mais de

metade possuíam depósitos de Al nos macrófagos da medula óssea.(72, 73) Verificou-se que a

anemia era reversível quando era removido o Al existente na solução dialisante, ou era

feita uma quelatoterapia com DFO, pelo que o Al foi apontado como o agente etiológico

responsável por esta anemia característica.

No final dos anos 80, não se conhecendo o mecanismo através do qual o Al provocava a

anemia, foram colocadas várias hipóteses. Pensava-se que o Al poderia diminuir a síntese

do heme, inibindo enzimas como a ferroquelatase ou a uroporfirina descarboxilase.

Admitia-se também que o Al pudesse interferir no metabolismo do ferro, e os estudos

realizados sobre os níveis da desidratase do ácido delta aminolevulínico (ALA-D) eram

ainda inconclusivos. No entanto, de estudos in vitro, sabia-se que o Al inibia a eritropoiese

através de um mecanismo dependente da disponibilidade da transferrina para se ligar ao

Al.(71)

Atualmente sabe-se que o potencial do Al como agente etiológico em complicações

hematológicas está intimamente relacionado com as reservas de ferro. A transferrina,

proteína transportadora do ferro, funciona como primeira proteína a que o Al se liga,



contando com mais de 90% de todo o Al ligado, como anteriormente referido.(57)

Mladenovic demonstrou que era necessária a presença de transferrina para que a

toxicidade do Al se manifestasse, já que este isoladamente, mesmo em grandes

quantidades, não afeta a maturação da célula eritróide.(71) Assim, a eritropoiese pode ser

bloqueada através de mecanismos que envolvem a interferência do Al com a homeostasia

do Fe(74-76), alterações nas enzimas de biossíntese do heme(77) e/ou desrregulação na

expressão do recetor da eritropoietina.(78) O Al afeta quer os progenitores eritroides quer

os eritrócitos.(70)

5.4 Perturbações nos níveis de elementos vestigiais

Para além da sobrecarga de Al, nos doentes em diálise podem ocorrer outros

desequilíbrios em termos de elementos vestigiais.(53, 79) Tais desequilíbrios devem-se à

reduzida função renal; à proteinúria (leva à perda de elementos que se encontram ligados

a proteínas); alterações na absorção gastrointestinal (devido por exemplo à alteração do

metabolismo da vitamina D); e ao próprio processo de diálise (p. ex., contaminação da

solução dialisante).(79) Assim, alguns elementos podem ficar em défice, outros em excesso.

O estudo e correção destes desequilíbrios é importante pois eles podem contribuir

significativamente para a morbilidade e mortalidade observada nos doentes em HD.

Tonelli e colaboradores(61) demonstraram que, comparando com grupos controlo

saudáveis, os pacientes em diálise possuíam níveis mais baixos de zinco (Zn) e selénio (Se),

dois elementos essenciais, e níveis aumentados de elementos vestigiais tóxicos, como o

chumbo (Pb) e o arsénio (As).

A deficiência de Zn está associada a complicações como retardamento da cicatrização

de feridas e deficiência da resposta imune, o que contribui para o aumento do risco de

infeção observado nos doentes em HD. Este défice pode também conduzir a anorexia,

alterações do paladar e perturbações da função cognitiva.

Níveis baixos de Se estão associados com hipertensão, insuficiência cardíaca e doença

coronária na população normal. Deficiências graves estão associadas com cardiomiopatia

(doença de Keshan).(53) Deficiência moderada de Se aumenta a suscetibilidade ao stress

oxidativo, relevante nos doentes em diálise, em que o stress oxidativo é comprovadamente

elevado.(61)

Estas alterações nos níveis de elementos vestigiais também são influenciadas pelas

concentrações plasmáticas de Al. Guo e colaboradores(80) verificaram uma correlação entre



o aumento das concentrações plasmáticas de Al e a diminuição das concentrações de Fe,

Zn e Se.

Uma explicação para esta correlação é o facto de metais como Zn, Al e Se se

encontrarem ligados à metalotioneína, que regula a absorção intestinal e renal destes

metais. Quando há um excesso de Al, pode haver interferência com a capacidade da

metalotioneína se ligar ao Se ou ao Zn.(80) Assim, a sobrecarga de Al é acompanhada da

redução das concentrações de Fe e Zn, e indução de dano oxidativo no tecido cerebral.(81)

Estas interações entre o Al e os metais essenciais Fe, Zn e Se podem resultar em

alterações na atividade de enzimas antioxidantes como a superóxido dismutase (SOD)

(uma enzima dependente do Cu e do Zn), catalase (dependente do Fe) e a glutationa

peroxidase (GPx) (dependente do Se).(80)

5.5 Stress Oxidativo e Inflamação

O stress oxidativo é um processo bioquímico que tem como resultado a formação de

espécies reativas de oxigénio na cadeia transportadora de eletrões. Isto é possível por

haver uma rutura entre os sistemas pró oxidante e antioxidante.(25)

Nos doentes com IRC, a elevada taxa de morbilidade e de mortalidade está associada a

complicações que incluem stress oxidativo, inflamação e resposta inflamatória

deficiente.(82, 83) O Al presente no soro, como referido atrás, pode interferir com a

distribuição de metais essenciais, provocando consequentemente stress oxidativo e

alterações na resposta inflamatória e no funcionamento do sistema imune nos doentes em

HD.(80) (70)

Guo e Wang(80) estudaram a relação entre as concentrações plasmáticas de Al e

variáveis como a concentração de antioxidantes, o stress oxidativo e o estado inflamatório

em doentes com IRC em HD e em grupos controlo (indivíduos saudáveis).

Em síntese, verificou-se que marcadores de stress oxidativo como o malonaldeído

(MDA) (marcador da peroxidação lipídica) e proteínas carboniladas (marcador do dano

oxidativo nas proteínas) estavam aumentados nos doentes em HD. Nestes doentes

também se verificava um aumento da atividade da enzima SOD e uma significativa

diminuição da GPx.

Nos doentes em HD foram ainda encontradas concentrações aumentadas de proteína C

reativa (indicador de má nutrição ou inflamação), aumento do fator de necrose tumoral

alfa (TNF-alfa) e dos níveis de interleucina 5 (IL5).



Por fim, neste estudo observaram-se correlações negativas entre os níveis plasmáticos

de Al e de Se, Zn, Fe, betacaroteno, vitamina C, vitamina E e GSH.(80)

Importa destacar que esta associação entre a concentração plasmática de Al e o estado

do sistema antioxidante apenas foi evidenciada nos últimos anos. É por isso importante

continuar a tentar perceber o mecanismo concreto pelo qual o Al pode ser responsável por

respostas alteradas nos doentes em HD.



6.Tratamento da intoxicação por Al

Para o tratamento da intoxicação por Al em doentes em diálise as normas da Kidney

Disease Outcomes Quality Iniative (KDOQI) recomendam a DFO.(50)

Até aos anos 60 apenas se conhecia a utilidade da DFO para tratamento da

hemocromatose (sobrecarga de Fe). A introdução nos anos 80 da DFO como agente

quelante para tratamento da intoxicação por Al foi um passo muito importante, pois até

então a demência de diálise era invariavelmente fatal.(84).

A DFO é uma sideroamina natural obtida a partir da bactéria Streptomyces pilosus. É

geralmente usada sob a forma de sulfonato metano de desferrioxamina. A DFO forma com

o Al complexos hidrossolúveis ultrafiltráveis (aluminoxamina) que são removidos na

diálise.(30, 85)

A dose a administrar é de 5 mg/kg/semana. Esta é a dose padrão de acordo com as

normas KDOQI.(50) Se os níveis de Al forem inferiores a 300 ng/ml, efetua-se na última

hora da sessão hemodialítica uma infusão intravenosa (IV) lenta. Para níveis de Al

superiores a 300 ng/ml faz-se uma perfusão lenta nas 5 horas antecedentes à sessão

hemodialítica.(86)

Como atrás já foi referido, a DFO também se usa para diagnóstico da intoxicação por Al.

A administração de DFO permite evidenciar uma eventual sobrecarga de Al no osso,

comparando os valores do Al sérico antes e 40 horas após a injeção de DFO.(86)



7. Técnicas usadas na determinação de Al

7.1 Considerações gerais

Os métodos espectroscópicos podem ser divididos em dois grandes grupos:

espectrometria atómica ótica e espectrometria de massas atómicas.(88)

Para determinação da concentração sérica de Al, atualmente a generalidade dos

laboratórios recorre a: 1) Espectrometria de absorção atómica com atomização

eletrotérmica (EAA-AE); 2) Espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado

(ICP-MS).(87) Por este motivo, estas duas técnicas serão destacadas e detalhadamente

descritas.

7.2 EAA-AE

A espectroscopia atómica é usada tanto em determinações quantitativas como

qualitativas de mais de 70 elementos e permite detetar quantidades na ordem dos mg/L

(ppm) ou na ordem dos g/L (ppb) consoante o processo de atomização usado.(88)

Na espectroscopia atómica, a determinação das espécies elementares é feita no estado

gasoso, no qual os átomos ou iões se encontram bem separados. A primeira etapa de todos

os procedimentos de espectroscopia atómica é pois a atomização, que é o processo no qual

uma amostra é convertida em átomos ou iões na fase gasosa.(88) Em EAA, para a

atomização das amostras são usados essencialmente dois sistemas: a chama e a câmara de

grafite.(88)

Para os átomos e iões na fase gasosa, a absorção ou emissão de radiação

eletromagnética (REM) decorre simplesmente de transições eletrónicas. Em EAA, o que

interessa medir é a quantidade de energia/radiação que é absorvida. Se a luz, com um

comprimento de onda () específico atingir um átomo que esteja no seu estado

fundamental, há absorção de luz por esse átomo, o que o promove a um estado excitado

(Fig. 9). Após alguns nanossegundos, o átomo volta ao estado fundamental (configuração

estável), transferindo o excesso de energia para outros átomos ou moléculas do meio.

Figura 9. Processo de absorção atómica



Aumentando o número de átomos existentes no trajeto da luz, aumenta também a

quantidade de luz absorvida, de acordo com a lei de Beer, que enuncia que a absorvância

(A) é diretamente proporcional à concentração (c) do analito responsável pela absorção e

ao percurso (b) da luz no meio absorvente (A = abc). Nesta equação a constante a é a

chamada absortividade do analito e é diferente consoante o comprimento de onda.(88, 89)

Assim, medindo a quantidade de luz absorvida por uma população de átomos de um

dado elemento, é possível determinar quantitativamente esse elemento na amostra.(88)

A história da espectrometria atómica começa com experiências realizadas por Joannes

M. Marci em 1648, através de observações do arco-íris.(90) Seguiram-se inúmeros estudos

visando conhecer o processo de emissão e absorção de energia radiante pelos átomos,

tendo Kirchoff e Bunsen, em 1860, conseguido descrever este processo usando uma

chama.(90) Após esta descoberta, a atenção recaiu sobre a emissão atómica, tendo passar a

ser através desta técnica que eram efetuadas muitas determinações de metais,

principalmente na indústria metalúrgica.(90)

Mas a espectrometria de absorção atómica (EAA) sofreu uma grande evolução nos anos

50 e 60 do século XX.(91) Foi no início dos anos 50 que Alan Walsh, um cientista

australiano, introduziu a EAA.(91) O primeiro espectrofotómetro de absorção atómica

comercial foi introduzido em 1959, o que desencadeou a utilização generalizada desta

técnica.(88) Com o desenvolvimento da mesma foi possível, por exemplo, passar a efetuar

de um modo rápido a determinação do cálcio e magnésio no soro sanguíneo humano,

determinações até então bastante complexas e demoradas.(91)

À medida que a utilização da EAA se tornava uma prática comum e se mostrava tão

promissora, o cientista russo Boris L’vov dedicou-se à melhoria e aperfeiçoamento do

processo de atomização, até então envolvendo apenas a atomização em chama. L’vov

introduziu um novo conceito, a atomização eletrotérmica, em 1959. Ele demonstrou que se

depositasse a amostra na superfície de um elétrodo de grafite e se de seguida o

introduzisse num tubo de grafite revestido com folha de tântalo e o aquecesse

eletricamente, a atomização da amostra resultava na formação de uma nuvem atómica

mais concentrada, o consumo da amostra era menor e conseguia-se uma muito maior

sensibilidade.(91) Ou seja, usando um “forno de grafite” aquecido eletricamente como

sistema de atomização (sistema para produzir os átomos a partir da amostra) era possível

conseguir uma redução muito significativa nos limites de deteção.(90)



Princípio da técnica de EAA-AE

Na sua versão atual, em EAA-AE a amostra é atomizada dentro de um pequeno tubo de

grafite colocado no compartimento da amostra do espectrofotómetro de absorção atómica,

entre uma fonte de luz e o detetor (Fig. 10). Através de um pequeno orifício existente na

parede do tubo é introduzido um pequeno volume de amostra (15-20 µL). Seguidamente o

tubo é aquecido por passagem de corrente elétrica (daí dizer-se que se trata de um sistema

de atomização eletrotérmica), segundo um programa sequencial de temperaturas, até o

analito se dissociar em átomos. Nessa fase é medida a absorção de luz pelos átomos

(absorção atómica), obtendo-se um sinal transiente, isto é, com a forma de pico.

Figura 10. Diagrama básico de um equipamento de EAA-AE

Atualmente estão disponíveis tubos de grafite com aquecimento transversal (THGA –

do inglês transversely heated grafite atomizer) que, ao contrário dos outros, aquecidos

longitudinalmente (Fig.11) permite a atomização da amostra num ambiente termicamente

mais homogéneo.

Figura 9. Tubos de grafite com aquecimento longitudinal e com aquecimento transversal (THGA).

*Plataforma de L’vov

Como se referiu, é necessário estabelecer um programa de aquecimento apropriado. O

qual tipicamente inclui uma etapa de secagem (evaporação do solvente da amostra), uma

etapa de pirólise (destruição da matéria orgânica e eliminação de muitos dos componentes

da matriz) e a etapa de atomização (Fig. 12). É importante referir que cada elemento

possui um programa de temperaturas específico, e que o comportamento eletrotérmico

desse elemento depende ainda da natureza da amostra.

*



Figura 12. Programa de temperaturas do forno de grafite em EAA-AE: etapas de secagem, pirólise e

atomização(92)

EAA-AE e a determinação do Al no soro

A determinação de Al no soro reveste-se de alguma dificuldade, uma vez que o soro é

uma matriz complexa: elevada concentração de aniões (principalmente cloreto), de catiões

(sódio, potássio, cálcio) e de proteínas (que pode originar acumulação de resíduos

carbonosos dentro do tubo de grafite).

Estas dificuldades puderam ser ultrapassadas através de sucessivos avanços na

tecnologia do forno de grafite (atomização eletrotérmica), em particular com a introdução

do conceito STPF (do inglês “stabilized temperature platform furnace”). Este conceito

agrega um conjunto de condições que devem ser usadas para garantir determinações livres

de interferências em atomização eletrotérmica. Entre estas destaca-se o uso de uma

plataforma (plataforma de L’vov), na qual a amostra é efetivamente depositada, e que visa

atrasar a atomização do analito o máximo possível até se alcançar o equilíbrio térmico no

interior do tubo de grafite, bem como a correção de background por efeito de Zeeman e o

uso dos chamados “modificadores de matriz”. Estes têm como principal função facilitar a

eliminação de interferências provocadas pela matriz (soro) e estabilizar termicamente o

analito para que se possam usar temperaturas de pirólise mais elevadas. No caso concreto

do Al, promovem a sua conversão a uma forma estável, evitando a sua perda como cloreto

volátil, facilitando ao mesmo tempo a eliminação do cloreto durante a pirólise.(93)

De resto nas determinações por EAA-AE procede-se com é habitual na generalidade

das metodologias analíticas. Primeiro são preparadas soluções padrão e obtém-se uma

curva de calibração. Depois, em idênticas condições são lidas as amostras. Para a

Secagem - evaporação do solvente

Pirólise - eliminação/destruição dos componentes da matriz

Atomização - formação de átomos livres do analito no estado de vapor (nesta etapa é feita a leitura da absorvância)



determinação de Al no soro as amostras não são injetadas diretamente, antes são

previamente diluídas com uma solução diluente/modificador químico. Uma solução

habitualmente usada para este fim é constituída por 0,1% (v/v) de HNO3, 0,01% (v/v) de

Triton X-100 (tensioativo) e 0,2% (m/v) de Mg(NO3)2.(94)

Tal como acontece para a generalidade das determinações em Análises Clínicas, foi

necessário estabelecer valores de referência (valores “normais”) para o Al no soro, de

modo a se poderem interpretar os casos de acumulação tóxica. Uma vez que a EAA-AE

apenas se tornou amplamente disponível a partir anos 70, até lá as determinações de Al no

soro eram realizadas usando outras técnicas, como a espectrometria UV/Vis, análise por

ativação neutrónica (AAN) ou a espectrometria de emissão atómica com plasma acoplado

indutivamente (ICP-AES, do inglês “inductively coupled plasma – atomic emission

spectrometry”). Na tabela 4 indicam-se valores que foram sendo publicados na literatura

como valores “normais” de Al no soro, os quais, sabemos hoje, eram na realidade muito

incorretos (muito elevados). Tal deve-se certamente a não terem sido tomadas as

precauções necessárias para evitar a contaminação das amostras. Aliás, se tal tivesse

acontecido, as concentrações de Al naturalmente presentes no soro não seriam

quantificáveis pelas técnicas então usadas, por insuficiente sensibilidade.

Tabela 4. Alguns valores "normais" de Al no soro publicados até 1985(95)

Ano Técnica |Al| mg/L

1960 UV/Vis 172

1962 ICP-AES 800

1964 ICP-AES 400

1970 EAA-AE 240

1970 AAN 1460

1971 ICP-AES 109

1972 EAA-AE 12

1972 AAN 72

1974 EAA-AE 38

1976 EAA-AE 14,2

1977 EAA-AE 6

1978 EAA-AE 28

1978 EAA-AE 3,7

1985 EAA-AE 2

Com o aparecimento da EAA-AE tornou-se possível determinar fiavelmente as

concentrações de Al no soro, uma vez que esta técnica, dotada de grande sensibilidade,



permitia a determinação de baixas concentrações deste metal (na ordem dos µg/L).

Consequentemente, tornou-se possível a monitorização dos doentes em HD e o

diagnóstico precoce da sobrecarga de Al, bem como estudar a etiologia, a prevenção e o

tratamento da intoxicação alumínica.(96)

A EAA-AE foi e é amplamente utilizada para a determinação de Al no soro. Não tem um

custo muito elevado, e permite determinar concentrações de elementos vestigiais usando

pequenos volumes de amostra (10-20 L) e com elevada seletividade e sensibilidade

(limites de deteção na ordem dos ng/L em muitos casos).(91) No entanto, é uma técnica de

análise monoelementar (permite determinar apenas um elemento de cada vez), é morosa

(a análise de uma amostra demora 5-6 minutos) e para além do problema da deterioração

do tubo de grafite (que pode causar algum “drift” e obriga à sua substituição periódica),

sofre de algumas interferências de matriz e de problemas de contaminação (embora este

não seja um problema intrínseco da técnica, antes resultado de se estarem a medir

concentrações muito baixas).(34, 87)

7.3 ICP-MS

Na espectrometria de massas atómicas é usado o movimento dos iões em campos

eletromagnéticos para os separar segundo a sua relação massa-carga. Para isso, é

necessário que os componentes da amostra sejam previamente convertidos em iões na

fase gasosa (em vez de átomos, como acontece em EAA). Nos sistemas de atomização de

elevada temperatura, como por exemplo um plasma, uma fração significativa dos átomos

produzidos é subsequentemente transformada em iões, normalmente iões positivos

monovalentes.

A versão mais corrente desta técnica é a ICP-MS. O plasma consiste num gás

(geralmente árgon), a elevada temperatura (6000-10000 K), extensamente ionizado (por

ação de um campo magnético), com uma elevada concentração de eletrões e iões. Em ICP-

MS combina-se então uma fonte de alta temperatura (o plasma, para produzir os iões)

com um espectrómetro de massa (para separar e quantificar esses iões).

Na análise de amostras líquidas, estas passam por um processo de nebulização antes de

serem levadas até ao plasma. Aí, ocorre uma sequência de quatro processos que termina

na produção dos iões: dessolvatação (evaporação do solvente), vaporização (passagem da

matéria da amostra para o estado gasoso), atomização (cisão das moléculas para originar

átomos) e ionização (perda de eletrões por parte dos átomos). Os iões formados passam

depois o espectrómetro de massa, onde são separados de acordo com a sua razão massa-

carga, sendo a concentração do elemento na amostra proporcional ao número de iões que



atinge o detetor. O tipo de espectrómetro de massa mais usado possui um dispositivo

chamado quadrupolo, que atua como se fosse um filtro de massa. O quadrupolo cria um

ambiente eletromagnético adequado a que apenas uma determinada relação massa-carga

(um determinado isótopo de um elemento) possa chegar ao detetor (Fig. 13).

Figura 13. Diagrama esquemático de um equipamento de ICP-MS

A comercialização de equipamentos ICP-MS em 1983 possibilitou aos laboratórios não

só passar a dispor de um instrumento com uma sensibilidade cinquenta a cem vezes

superior à da EAA-AE, mas que também sofria de menos interferências de matriz. Para

além disso a técnica de ICP-MS abriu a possibilidade de se fazer análise multielementar de

um modo bastante rápido.(99)

O elevado custo de aquisição do equipamento e os relativamente elevados custos de

operação são as principais desvantagens comparativas e o principal motivo que tem

impedido uma maior generalização da sua utilização.(34)

7.4 Controlo da contaminação

No passado, como já foi referido, a inexistência de técnicas adequadas, nomeadamente

em termos de sensibilidade, o facto de o Al ser um elemento ubíquo e ausência de

sensibilização para a necessidade de cuidados especiais na prevenção da contaminação das

amostras levou a que os resultados da determinação de Al no soro tivessem sido altamente

falseados. Como se compreende, as próprias condições de colheita e manuseamento da

amostra podem comprometer seriamente a qualidade dos resultados da determinação do

Al, uma vez que este se encontra presente no organismo, e em particular no plasma em

níveis vestigiais.(34) Por outro lado, encontra-se em elevados teores no meio ambiente

(água, poeira), pelo que é grande a possibilidade de contaminação das amostras.



Assim, na determinação sérica do Al são necessários alguns cuidados especiais. Em

primeiro lugar na preparação do doente. É importante que o paciente interrompa, sob a

supervisão do seu médico, a toma de alguns produtos, como suplementos nutricionais,

uma vez que estes podem causar interferência.

A colheita do sangue deve ser feita para tubos devidamente descontaminados

(preparados no laboratório) ou tubos comerciais certificados para o efeito.

Após centrifugação, o soro/plasma deve ser transferido para um tubo de transporte

igualmente devidamente descontaminado. Em tubos devidamente fechados, as amostras

podem ser conservadas à temperatura ambiente (por curto espaço de tempo). Caso

contrário, devem ser ou refrigeradas ou congeladas.

Atualmente é amplamente aceite que valores inferiores a 15 µg/L não têm qualquer

significado clínico (são valores “normais”). Depois, é indispensável ter sempre em

consideração que valores elevados podem dever-se simplesmente a uma contaminação da

amostra, pelo que deve ser repetida a análise, fazendo uma nova colheita. Uma

concentração Al de 50 µg/L é já considerada como indicadora de acumulação.(97)

7.5 Determinação da concentração de Al na solução dialisante

A determinação da concentração de Al nas soluções dialisantes é também um desafio,

pois é necessário determinar uma pequena concentração do metal no seio de uma solução

com elevada concentração de sais inorgânicos.(95) As soluções dialisantes têm uma matriz

complexa com elevados níveis de sódio, cálcio, magnésio e potássio, assim como cloreto,

acetato ou bicarbonato, lactato e glucose, o que faz com que sejam difíceis de analisar,

devido a interferências de matriz. (34)

Para a determinação da concentração de Al como contaminante nas soluções

dialisantes é recomendada a utilização de ICP-MS, pois não necessita de pré-concentração

da amostra (possui bons limites de deteção).(98)



8. Conclusão

Até aos anos 80 do século XX, a intoxicação por Al foi responsável por graves

complicações nos doentes em HD, nomeadamente demência de diálise, osteomalacia e

anemia, muitas vezes fatais.

A solução dialisante foi praticamente desde sempre reconhecida como a principal fonte

de exposição ao Al por parte dos doentes em HD. Os quelantes de fosfato contendo Al e

certos antiácidos eram apontados como outras fontes com significado.

Atualmente o problema da intoxicação alumínica nos doentes em HD está

grandemente resolvido. O aparecimento de sistemas de purificação de água com grande

eficiência na remoção de Al (osmose inversa) deu um forte contributo para este facto.

Um forte contributo para a resolução deste problema foi também dado pela evolução

das técnicas analíticas, com grande destaque para o aparecimento nos anos 70 da

espectrofotometria de absorção atómica com atomização eletrotérmica (EAA-AE). Até

então as técnicas disponíveis não dispunham da sensibilidade e especificidade adequadas

para se efetuar a determinação de Al no soro de modo fiável.

No sentido de proteger os doentes, a legislação continua a exigir a monitorização

periódica das concentrações séricas de Al nos doentes em HD. A técnica de EAA-AE e a

mais recente técnica de ICP-MS são as mais usadas para o efeito.

De um ponto de vista prático, o principal problema associado à determinação de Al no

soro é a grande possibilidade de haver contaminação das amostras. Efetivamente, trata-se

de determinar concentrações muito baixas, na ordem dos µg/L, sendo o Al, pelo contrário,

um elemento muito abundante no meio ambiente. A prevenção da contaminação das

amostras é atualmente o maior desafio para os analistas envolvidos na tarefa de

monitorização dos níveis séricos de Al nos doentes em HD.



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Relatório de Estágio

Laboratório de Análises Clínicas Dra. Susana Pinto

Ana Isabel Magalhães Rodrigues

Estágio orientado por: Doutora Susana Pinto

Janeiro-Abril 2012

Relatório de estágio 2012

Mestrado em Análises Clínicas ii

Agradecimentos

Ao Professor Doutor Franklim Marques e à Professora Doutora São José por terem

tornado este estágio possível.

À Dra. Susana Pinto, por ter aceite prontamente a orientação deste estágio.

À Dra. Inês Ribeiro, pela disponibilidade, pela transmissão de conhecimentos, pelo

apoio e ajuda constantes.

À Mariana e ao Miguel, pelo apoio, paciência e pelos sorrisos.

À Rita, pela companhia e amizade.

A todos os outros elementos do laboratório, e a todos aqueles que direta ou

indiretamente, me apoiaram e contribuíram para que este trabalho fosse avante.

Aos meus pais e irmão pelo carinho, pela confiança, e força…


Mestrado em Análises Clínicas iii

Índice Geral

Índice de Figuras .......................................................................................................................................v

Índice de Tabelas ..................................................................................................................................... vi

Lista de Abreviaturas e Símbolos .......................................................................................................... vii

Introdução ................................................................................................................................................. 1

Fase Pré Analítica, Analítica e Pós Analítica .......................................................................................... 2

Capítulo 1. Microbiologia ......................................................................................................................... 4

Condições de Assépsia ......................................................................................................................... 4

Meios de Cultura .................................................................................................................................. 4

1.1. Urina ............................................................................................................................................... 5

1.1.1 Exame bacteriológico de urina ............................................................................................... 5

1.1.2 Pesquisa de Antigénio Clamídia em Urina Masculina ......................................................... 11

1.1.3 Pesquisa de BK direto na urina .............................................................................................. 12

1.2. Fezes .............................................................................................................................................. 13

1.2.1 Exame bacteriológico de fezes .............................................................................................. 13

1.2.2 Exame parasitológico de fezes ............................................................................................... 15

1.3 Outros Produtos Biológicos .......................................................................................................... 15

1.3.1 Exsudado Auricular ................................................................................................................ 17

1.3.2 Exsudado Uretral ................................................................................................................... 17

1.3.3 Exsudado vaginal ................................................................................................................... 19

1.3.4 Expetoração ........................................................................................................................... 22

Controlo de qualidade no setor da Microbiologia ............................................................................ 23

Capítulo 2. Hematologia ........................................................................................................................ 25

2.1 Colheita de sangue venoso ........................................................................................................... 25

2.2 Hemograma .................................................................................................................................. 25

2.3 Esfregaço sanguíneo .................................................................................................................... 26

2.4 Contagem de reticulócitos ........................................................................................................... 27

2.5 Velocidade de sedimentação ....................................................................................................... 27

2.6 Estudo da coagulação .................................................................................................................. 28

2.6.1. Tempo de Tromboplastina Parcial ativada ou Tempo de Cefalina-Caolino ..................... 28


Mestrado em Análises Clínicas iv

2.6.2. Tempo de Protrombina ou Tempo de Quick e INR ........................................................... 29

2.7 Determinação de grupos sanguíneos .......................................................................................... 32

2.8 Prova de Coombs indireta ........................................................................................................... 33

2.9 Controlo de Qualidade no setor da Hematologia ....................................................................... 34

Capítulo 3. Serologia .............................................................................................................................. 35

3.1 Proteína C reativa ......................................................................................................................... 35

3.2 Teste VDRL e TPHA .................................................................................................................... 36

3.3 Fator reumatoide ......................................................................................................................... 37

3.4 Reação de Widal ........................................................................................................................... 37

3.5 Reação de Wrigth ......................................................................................................................... 38

3.6 Reação de Weil Felix .................................................................................................................... 38

3.7 Controlo de Qualidade no setor da Serologia ............................................................................. 39

Capítulo 4. Bioquímica........................................................................................................................... 40

4.1 Autoanalisador Olympus AU 600 ................................................................................................ 41

Avaliação da função hepática ......................................................................................................... 41

Avaliação da função renal .............................................................................................................. 43

Outros Analitos .............................................................................................................................. 46

4.2 Análise de Urina tipo II ............................................................................................................... 49

4.3 Sedimento urinário ....................................................................................................................... 51

4.4 Teste de gravidez na urina ............................................................................................................ 51

4.5 Pesquisa de sangue oculto ........................................................................................................... 52

4.6 Eletroforese de Proteínas Séricas................................................................................................ 52

4.7 Controlo de Qualidade no setor da Bioquímica.......................................................................... 54

Conclusão ................................................................................................................................................ 55

Referências Bibliográficas...................................................................................................................... 56


Mestrado em Análises Clínicas v

Índice de Figuras

Figura 1. Processo desde a chegada dos produtos até à separação pelos setores ................................. 3

Figura 2. Procedimento do Exame Bacteriológico de Urina .................................................................. 6

Figura 3. miniAPI ....................................................................................................................................10

Figura 4. Produtos biológicos estudados ............................................................................................... 15

Figura 5. Parâmetros obtidos de um hemograma ................................................................................ 25

Figura 6. Autoanalisador Coulter Hmx Hematology ........................................................................... 26

Figura 7. Test 1 THL ............................................................................................................................... 28

Figura 8. Option 4 Plus ........................................................................................................................... 31

Figura 9. Procedimento da pesquisa de proteína C reativa ................................................................. 35

Figura 10. Procedimento do teste VDRL. ............................................................................................. 36

Figura 11. Placa de microtitulação - TPHA ........................................................................................... 37

Figura 12. Procedimento do teste FR .................................................................................................... 37

Figura 13. Procedimento da Reação de Widal, Reação de Wrigth e Reação de Weil Felix ................ 39

Figura 14. Olympus AU 600 .................................................................................................................. 40

Figura 15. Elecsys (à esquerda) e cobas e 411 (à direita) ...................................................................... 40

Figura 16. Urisys 2400 ........................................................................................................................... 49

Figura 17. Resultado positivo e Resultado negativo ............................................................................. 52

Figura 18. Perfil electroforético normal ................................................................................................ 53

Figura 19. Microgel................................................................................................................................. 53


Mestrado em Análises Clínicas vi

Índice de Tabelas

Tabela 1. Meios de cultura utilizados neste laboratório ......................................................................... 4

Tabela 2. Bactérias responsáveis por infeção urinária ........................................................................... 5

Tabela 3. Características dos meios de cultura utilizados no exame bacteriológico de urina ..............7

Tabela 4. Características da Coloração de Zhiel Neelsen ...................................................................... 12

Tabela 5. Meios de cultura usados no exame bacteriológico de fezes .................................................. 14

Tabela 6. Características dos meios de cultura ...................................................................................... 16

Tabela 7. Bactérias da flora saprófita e patogénicas no ouvido externo .............................................. 17

Tabela 8. Exame bacteriológico do exsudado uretral ........................................................................... 17

Tabela 9. Bactérias da flora saprófita e patogénicas da uretra ............................................................. 17

Tabela 10. Exame bacteriológico do exsudado vaginal ......................................................................... 19

Tabela 11. Bactérias da flora saprófita e patogénicas no exsudado vaginal ......................................... 19

Tabela 12. Meios de cultura utilizados na pesquisa de Streptococcus do grupo B .............................. 21

Tabela 13. Exame bacteriológico da expetoração ................................................................................. 22

Tabela 14. Bactérias patogénicas na expetoração ................................................................................. 22

Tabela 15. Meio de Lowenstein-jensen (LJ-T)...................................................................................... 23

Tabela 16. Controlo de Qualidade realizado no setor da Microbiologia ............................................. 24

Tabela 17. Zonas e funções do Option 4 Plus ......................................................................................... 31

Tabela 18. Marcadores da função hepática ............................................................................................ 41

Tabela 19. Marcadores da função renal................................................................................................. 43

Tabela 20. Tipos de Diabetes ................................................................................................................. 47

Tabela 21. Tiras de teste – Urina tipo II ............................................................................................... 50


Mestrado em Análises Clínicas vii

Lista de Abreviaturas e Símbolos

A – Superfície corporal

ADP – Adenosina difosfato

ALP – Fosfatase alcalina

ALT – Alanina aminotransferase

AST – Aspartato aminotransferase

ATB – Antibiograma

ATP – Adenosina trifosfato

ATCC – American Type Culture Collection

BAAR – Bacilos álcool ácido resistentes

BK – Bacilo Koch

CE – Corpos elementares

CHE – Colesterol esterase

CR – Corpos reticulares

DHPN – Doença hemolítica perinatal

DPD – 5-diclorofenil-diazónio-tetrafluorborato

DPI – Doença pélvica inflamatória

EDTA – Ácido etilenodiamino tetracético

FR – Fator reumatoide

GB – Glóbulos brancos

GGT – Gama glutamiltransferase

GK – Glicerol quinase

GLDH – Glutamato desidrogenase

GOD – Glucose oxidase


Mestrado em Análises Clínicas viii

GV – Glóbulos Vermelhos

G6P-DH – glucose-6-fosfato desidrogenase

h – horas

Hb – Hemoglobina

HbA1c – Hemoglobina glicada

hcG – Gonadotrofina coriónica humana

HDL –High density lipoprotein

HK – Hexoquinase

HMMPS – N-(3-sulfopropril)-3-metoxi-5-metilanilina

Ht – Hematócrito

ID – Identificação

ITU – Infeção trato urinário

INR – International normalized ratio

ISI – International sensivity index

LDL – Low density lipoprotein

min – minuto

NAD – Nicotinamida adenina dinucleotídeo (estado oxidado)

NADH – Nicotinamida adenina dinucleotídeo (estado reduzido)

OMS – Organização Mundial de Saúde

PCR – Proteína C reativa

pNPP – p-Nitrofenilfosfato

pNP – p-Nitrofenol

POD – Peroxidase

PSO – Pesquisa sangue oculto


Mestrado em Análises Clínicas ix

rpm – rotações por minuto

sd – desvio padrão

STAPH – Staphylococcus

TFG – Taxa de filtração glomerular

TP – Tempo de protrombina

TT – Tempo de trombina

TTPa – Tempo de tromboplastina parcial ativada

UFC – Unidade Formadora Colónia

UNG – Uretrites não-gonocócicas

UPG – Uretrites pós-gonocócicas

UV – Ultravioleta

VDRL – Venereal Diseases Reference Laboratory

VS – Velocidade de sedimentação

TPHA – Treponema pallidum haemagglutination assay

ºC- grau Celsius



Introdução

O presente relatório descreve o estágio realizado no Laboratório de Análises Clínicas

Dra. Susana Pinto, em Gaia, entre Janeiro e Abril de 2012.

O Laboratório foi fundado em 1986, e é certificado pela NP EN ISO 9001, pelo Manual

das Boas Práticas Laboratoriais e pela Ordem dos Farmacêuticos.

Funciona como o laboratório central, uma vez que existem mais postos de colheita

(Espinho, Vila Meã, Vila do Conde (Posto de colheita e Santa Casa da Misericórdia), IC -

São Mamede Infesta e Alvites).

O laboratório possui também um protocolo com um centro de reprodução

medicamente assistida, portanto, efetua análises de alguns dadores de esperma e dadoras

de óvulos.

O laboratório executa análises nas áreas da Hematologia, Bioquímica, Microbiologia,

Imunologia, Serologia, Endocrinologia, Alergologia, Monitorização de Fármacos e

Toxicologia Clínica.

Na realização deste estágio foram contempladas as áreas da Bioquímica, Hematologia,

Microbiologia e Serologia.



Fase Pré Analítica, Analítica e Pós Analítica

Fase Pré analítica:

Esta fase inclui o Atendimento, Colheita, Manuseamento Distribuição e Conservação

das amostras, Conferência e Separação.

Manuseamento Distribuição e Conservação:

1- Transporte: O transporte das amostras das unidades de colheita para o laboratório

Central e deste para os laboratórios externos é efetuado em malas térmicas com

ambiente refrigerado, por pessoal e transporte afetos ao Laboratório Central.

2- Distribuição e Conservação: Todos os produtos entregues na receção ou colhidos

nas salas de colheitas, são enviados (devidamente codificados) para o setor de

“Conferência e separação”.

Conferência e separação

Objetivo: Definir o processo de conferência e separação do serviço desde a receção até

ao início da execução das técnicas.

Depois de terem sido introduzidos os dados dos utentes e respetivos ensaios a

realizar é emitido o diário de doentes.

É necessário verificar se todos os produtos colhidos na sala de colheitas, entregues

na receção ou enviados pelas unidades de colheitas, se encontram na bancada,

assim como as credenciais/pedidos.

Os produtos são colocados por ordem crescente de número da amostra.

Verificar, pelas credenciais se foram colhidos e entregues os produtos referentes a

cada um dos pedidos, assim como se o foram nos recipientes apropriados.

Se sobrar ou faltar algum produto ou se foi colhido em condições ou recipientes

inadequados, regista-se num caderno as faltas (colocando o número da amostra

em falta ou sobra).

A receção é avisada caso se considere que houve erro de colheita. Devolver as

credenciais à receção e tratar os produtos conforme o exigido para cada análise.

No seguinte fluxograma (Fig. 1) estão representadas as etapas desde a chegada dos

produtos dos postos de colheita, até ao momento da separação das amostras pelos

diferentes setores.



Figura 1. Processo desde a chegada dos produtos até à separação pelos setores

Após separação dos produtos, estes são então distribuídos pelos diferentes setores.

É necessário ter em conta:

Refrigerar os plasmas citratados até ao momento da análise;

Separar para tubos pequenos as amostras para o setor de Imunologia e para os

laboratórios externos. Se estes não forem processados no dia têm de ser

congelados;

Levar os tubos primários com os soros e as alíquotas para o setor da bioquímica;

Os pedidos de hemograma têm de ser processados no dia.

Fase Analítica:

Realização das técnicas analíticas: Com base nas listas de trabalho e nas

amostras/alíquotas (identificadas e separadas) as técnicas são efetuadas conforme

descrito nos respetivos procedimentos técnicos, tendo em consideração o controlo de

qualidade interno e externo.

Fase Pós analítica:

Esta fase inclui a emissão, validação biopatológica e entrega dos boletins analíticos.

Chegada dos produtos

Centrifugação dos soros e

plasmas citratados 15 min a 4500

rpm

Conferência Separação dos

produtos

Sangue total

Soro

Urina

Fezes

Plasma citratado

Urina 24 horas

Outros produtos



Capítulo 1. Microbiologia

No setor da Microbiologia, são estudados diferentes produtos biológicos. Sejam eles

urina, fezes, expetoração, exsudados vaginais e outros.

Neste setor são realizados essencialmente exames bacteriológicos, sendo que o produto

que é recebido mais frequentemente para este tipo de análise, neste laboratório, é a urina.

O exame bacteriológico, tem como objetivo o isolamento e identificação do agente

etiológico responsável pela infeção. Por isso, todas as culturas que são consideradas

positivas saem com a identificação da bactéria e respetivo antibiograma.

Condições de Assépsia

Na preparação dos meios de cultura e na manipulação das culturas de microrganismos

é importante ter em conta as necessárias condições de assepsia, de modo a que sejam

evitadas contaminações com outros microrganismos.

Neste setor, isso é conseguido através da utilização de um bico de Bunsen.

Meios de Cultura

Tabela 1. Meios de cultura utilizados neste laboratório

Meios de cultura preparados no Laboratório Meios de cultura adquiridos

Gelose CLED (Cistina-Lactose-Deficiente em Eletrólitos),

Gelose bílis-esculina-azida, Gelose Manitol Salt Agar

(MSA), Gelose MacConkey, Gelose Sabouraud

Cloranfenicol, Gelose Salmonella Shigella (SS), Gelose

desoxicolato-lisina-xilose (XLD), Muller Hinton, e caldo

de enriquecimento de tetrationato

Gelose Columbia + 5% de sangue de

carneiro (COS), Gelose Chocolate

Polivitex (PVX), Gelose Gardenerlla

(GAR), Meio de Lowenstein Jensen

(LJ-T), Meio de Todd-Hewitt e Gelose

Strepto B

De seguida, são referidas as diferentes amostras que processei durante o período de

permanência nesta valência.



1.1. Urina

1.1.1 Exame bacteriológico de urina

As infeções do aparelho urinário são uma das infeções mais frequentes no Homem. A

infeção urinária aguda é normalmente causada pela invasão do aparelho urinário por

bactérias da flora intestinal saprófita. As infeções agudas do aparelho urinário são

geralmente subdivididas em duas categorias: infeção do trato urinário (ITU) inferior, onde

a presença de bactérias se limita à bexiga (cistite), e do trato superior (pielonefrite), em

que é afetada a pélvis e o parênquima renal.(1, 2)

Na prática clínica é valorizada a presença de colónias em número superior a 105, na

urina do jato médio, conhecida como bacteriúria significativa.

Na tabela seguinte estão representadas as bactérias que são mais vezes causadoras de

infeção urinária.(3)

Tabela 2. Bactérias responsáveis por infeção urinária

Bactérias

Escherichia coli

Proteus spp

Klebsiella spp

Enterococcus spp

Pseudomonas aeruginosa

Staphylococcus aureus

Staphylococcus coagulase negativa

Durante a realização do estágio foi confirmada esta tendência, no entanto, foi possível

também isolar outras bactérias menos vezes causadoras de infeção urinária como por

exemplo, Citrobacter e Streptococcus do grupo D.

O procedimento do exame bacteriológico de urina realizado neste laboratório, está

descrito de uma forma sistematizada no seguinte fluxograma (Fig. 2).



Figura 2. Procedimento do Exame Bacteriológico de Urina

Na tabela seguinte, são referidas as características dos diferentes meios utilizados

habitualmente no exame bacteriológico de urina, e suas principais características.

Urina

Gelose CLED

Sem crescimento

Amicrobiano

Observação do crescimento de

colónias

UFC < 105

Desvalorizar

(excepto se for uma criança)

UFC >105

Infecção

Coloração Gram

Cocos Gram (+)

Gelose bílis-esculina-azida

ATB Muller Hinton

Gelose Manitol Salt Agar

Galeria ID 32 STAPH

Galeria ATB STAPH

Bacilos Gram (-)

Galeria ID 32 E

Galeria ATB UR 08 EU

Provas de orientação

Aerobiose, 37ºC, 24h



Tabela 3. Características dos meios de cultura utilizados no exame bacteriológico de urina

Meio de cultura Caraterísticas

Gelose CLED-D

(Cistina-Lactose-

Deficiente em

Eletrólitos)

Meio diferencial, não seletivo. A deficiência de eletrólitos inibe o

“swarming” dos Proteus e a lactose permite diferenciar os

fermentadores dos não fermentadores. As bactérias fermentadoras da

lactose originam colónias amarelas-pálidas e amarelas por acidificação

do meio. As não fermentadoras originam colónias verdes, azuis ou

incolores. Meio utilizado no isolamento de microrganismos urinários.(4)

Gelose bílis-

esculina-azida

Isolamento seletivo. Útil para a diferenciação dos enterococos e

estreptococos do grupo D. A hidrólise da esculina dos enterococos

provoca o aparecimento de um halo negro à volta das colónias. A

seletividade do meio em relação às bactérias Gram (-) é assegurada pela

azida sódica. A bílis inibe algumas bactérias Gram (+), excetuando os

enterococos.(5)

Gelose Manitol

Salt Agar

Isolamento dos estafilococos. Os microrganismos que fermentam o

manitol originam colónias amarelas. Esta característica é um critério de

orientação para a identificação de Staphylococcus aureus. O teor

elevado em cloreto de sódio limita o desenvolvimento de outras

bactérias.(6)

Gelose Mueller Hinton 2

Para o estudo da sensibilidade aos antibióticos e sulfamidas. Permite o

crescimento de bactérias não exigentes (enterobactérias, bacilos Gram

(-) não fermentadores, estafilococos e enterococos) garantindo o

mínimo de interferência dos componentes da fórmula no resultado do

antibiograma. A sua concentração em iões bivalentes é ajustada com o

fim de assegurar uma melhor precisão para determinar a sensibilidade

das pseudomonas aos aminoglicosídios, colistina e tetraciclinas. O seu

baixo teor em timina-timidina (elementos inibidores da atividade das

sulfamidas) diminui os fenómenos de crescimento à volta destes discos

e permite uma determinação precisa dos diâmetros de inibição.(7)

Provas de Orientação

Coloração de Gram

É uma coloração diferencial pois permite fazer a distinção entre bactérias Gram (+) e

Gram (-). A diferença entre os 2 tipos de células deve-se à estrutura da parede celular das

bactérias. A parede celular das bactérias Gram (+) é formada por um camada espessa de

peptidoglicano, enquanto que a parede celular das bactérias Gram (-) é formada por uma



camada fina de peptidoglicano, rodeada por uma camada externa de lipopolissacarídeos e

proteínas.

Na técnica de Gram utiliza-se primeiro um corante básico, cristal violeta, seguido de

um mordente, o lugol que aumenta a afinidade da célula para o corante, um agente

descolorante, o álcool a 96% que remove o corante, e finalmente um segundo corante

básico, a safranina.

As bactérias Gram (+) aparecem coradas com o corante primário (roxo) pois devido à

sua parede espessa de peptidoglicano resistem à descoloração, enquanto as bactérias

Gram (-) coram com a safranina (rosa), uma vez que o álcool solubiliza a camada externa

de lipopolissacarídeo e proteínas.

Teste da catalase:

A enzima catalase, produzida por algumas bactérias catalisa a conversão do peróxido de

hidrogénio em oxigénio e água(3) e protege o microrganismo dos efeitos tóxicos do

peróxido de hidrogénio formado no seu metabolismo ou produzido pelas células

fagocitárias.

Este teste tem como intuito a diferenciação entre Staphylococcus e Enterococus.

O procedimento do teste consiste em, com uma ansa, transferir a colónia em estudo

para uma lâmina de vidro. Adicionar uma gota de peróxido de hidrogénio e observar

imediatamente se existe ou não efervescência (Reação positiva).

Teste da oxidase:

Permite a deteção da enzima citocromo oxidase das bactérias. Esta enzima é

característica do género Neisseria e da maioria das espécies de Pseudomonas.

Este teste baseia-se na produção bacteriana de uma enzima oxidase intracelular. Na

presença de oxigénio e de citocromo C, esta enzima oxida o reagente fenilenodiamina,

para formar um composto colorido, o indofenol. O ácido ascórbico, incorporado no

reagente, age enquanto agente redutor para limitar a auto oxidação e melhorar a

estabilidade do reagente.(8)



Teste da coagulase:

A coagulase é uma das enzimas produzidas por estafilococos mais importantes. Entre

as espécies patogénicas para o Homem, só uma, o Staphylococcus aureus, a produz. Todas

as restantes são designadas coagulase-negativas ou não produtoras de coagulase.(3)

O procedimento do teste consiste em, num tubo com 0,5 ml de plasma humano

inocular uma colónia isolada da cultura em estudo e incubar a 37º C. Ao fim de 4h de

incubação e sem agitar o tubo, verificar se existe formação de coágulo (Reação positiva). A

ausência de coágulo às 4h implica a reincubação do tubo com leitura às 24h.

Prova da filamentação:

Permite fazer o diagnóstico presuntivo de Candida albicans.

O procedimento consiste em num tubo de vidro esterilizado colocar uma pequena

quantidade de soro humano. Fazer uma suspensão da levedura a analisar e colocar a 37ºC.

Observar ao microscópio até às 4h de incubação.

A formação de um tubo de filamentação indica que a prova é positiva.

Galerias de Identificação e Antibiogramas

Neste laboratório há disponíveis três tipos de galerias de identificação: ID 32 E, rapid

ID 32 E, ID STAPH. E três galerias de antibiograma: ATB UR EU (08), ATB PSEU EU (08),

ATB STAPH EU (08). Para a leitura e identificação destas galerias, é necessário um

densitómetro, e o miniAPI.

O miniAPI (Fig. 3) satisfaz 2 tipos de leitura: turbinefelometria e colorimetria. A

turbidimetria, é num sentido amplo, uma técnica em que se mede a turvação. Baseia-se no

facto de a turvação provocar a dispersão da luz. Mede-se a intensidade do feixe que

consegue atravessar a amostra e alcançar o detetor que está a 180º com o feixe de luz.

Neste caso esta medida é inversamente proporcional ao crescimento bacteriano. A

nefelometria é a medida da intensidade da luz que é dispersa numa determinada direção,

neste caso a luz que é dispersa a 30º e que é diretamente proporcional ao crescimento

bacteriano. Estas duas medidas permitem avaliar a densidade bacteriana no meio de cada

cúpula. Este tipo de leitura é efetuado em galerias de antibiograma.

Para as galerias de identificação, a leitura é colorimétrica. O miniAPI efetua para cada

cúpula uma medida de transmissão da luz em 4 regiões do espectro visível.(9)



Figura 3. miniAPI

Galerias de identificação:

A galeria ID 32-E é um sistema padronizado para a identificação das Enterobacteriacea

e outros bacilos Gram (-) não fastidiosos, utilizando 32 testes bioquímicos miniaturizados

e uma base de dados específica. Esta galeria compreende 32 cúpulas de testes que contêm

um meio reacional desidratado.(10)

Para a preparação do inóculo utiliza-se uma âmpola de API NaCl 0,85% Medium, 2 ml.

Deve-se colher uma ou várias colónias idênticas, e utilizar de preferência culturas recentes

(18-24h). Efetua-se então uma suspensão de opacidade equivalente a 0,5 MCFarland,

medida no Densitómetro DENSIMAT.

Após 24 horas de incubação, as reações são lidas no miniAPI.

A preparação e o princípio a efetuar no caso da galeria Rapid ID 32 E é o mesmo, no

entanto, este sistema padronizado para a identificação das Enterobacteriaceae dá o

resultado em apenas 4 horas.

A galeria ID 32 STAPH é um sistema padronizado para a identificação dos géneros

Staphylococcus, Micrococcus e géneros semelhantes, Rothia e Aerococcus

compreendendo 26 testes bioquímicos miniaturizados.(11)

Galerias de antibiogramas:

A galeria ATB UR EU (08) permite determinar a sensibilidade das Enterobacteriaceae

de origem urinária aos antibióticos em meio semissólido em condições muito próximas

das técnicas de referência de diluição em gelose ou de micro-diluição.

Esta galeria ATB UR (08) contém 16 pares de cúpulas. O primeiro par, sem antibiótico,

serve de padrão de crescimento. Os 15 seguintes contêm antibióticos com uma única ou

duas concentrações. A bactéria a testar é colocada em suspensão e depois transferida para



o meio de cultura e inoculada na galeria. O resultado obtido permite classificar a estirpe

como Sensível, Intermédia ou Resistente.(12)

As galerias ATB PSEU EU (08) e ATB STAPH EU (08), permitem determinar a

sensibilidade aos antibióticos, das Pseudomonas e Staphylococcus, respetivamente.

Para a realização destes antibiogramas é necessário preparar uma suspensão bacteriana

de 0,5 McFarland no Api Nacl 0,85 Medium, e transferir 10 L desta suspensão para o

ATB Medium, para posterior inoculação da galeria.

1.1.2 Pesquisa de Antigénio Clamídia em Urina Masculina

Neste laboratório, as pesquisas de antigénio Clamídia que foram requisitadas aquando

da realização deste estágio, eram de dadores de esperma, uma vez que o laboratório tem

um protocolo com o CETI.

A Chlamydia tracomatis é o principal agente de uretrites não gonocócicas (UNG) e de

uretrites pós-gonocócicas (UPG), podendo complicar-se no homem, com epididimite,

prostatite que têm, como contrapartida na mulher, cervicite, salpingite aguda, doença

pélvica inflamatória (DPI), entre outros.

No ciclo de crescimento, as clamídias alternam dois tipos de formações, estrutural e

funcionalmente diferentes: corpos elementares (CE) e corpos reticulares (CR), sendo estes

a forma de multiplicação e os primeiros a forma de resistência e de propagação.

São incapazes de se cultivar em meios de cultura bacteriológicos, multiplicam-se em

culturas celulares, dando origem a uma inclusão citoplasmática justa-nuclear, de acordo

com o ciclo complexo que possuem em exclusividade.(13)

Para a deteção de Antigénio Chlamydia na urina masculina usa-se o dispositivo para

teste rápido de Clamídia que é um teste para detetar qualitativamente o Antigénio de

Clamídia, utilizando um anticorpo específico.

Princípio do teste: Imunocromatografia em membrana. Neste teste, um anticorpo

específico do antigénio de Clamídia é coberto na região da linha de teste. Durante o teste, a

solução do antigénio extraído reage com o anticorpo de Clamídia que é coberto sobre as

partículas. A mistura migra para reagir com o anticorpo de Clamídia na membrana, dando

origem a uma linha colorida na região da linha de teste.(14)



1.1.3 Pesquisa de BK direto na urina

Trata-se de uma análise pouco requisitada. É pedida quando há suspeita de tuberculose

renal.

O agente etiológico da Tuberculose renal é o mesmo da Tuberculose pulmonar, o

Mycobacterium tuberculosis ou Bacilo de Koch (BK). A Tuberculose Renal é uma das

formas da doença extrapulmonar, e entre os diversos tipos de tuberculose, é a que

apresenta o maior tempo de latência. O tempo entre a primoinfecção e as manifestações

clinicas podem chegar até aos 20 anos.

O BK, ao invadir o rim, provoca lesões semelhantes às encontradas nos pulmões e

outros pontos do organismo. A lesão mais grave é a caverna tuberculosa, que determina a

destruição de importantes porções dos rins.

Exame direto – Coloração de Zhiel-Neelsen

O exame direto é de fácil execução, e rápido. No entanto, é de baixa sensibilidade uma

vez que são necessários cerca de 104 bacilos por mL de amostra para que sejam detetados.

Para além disso, não é específico para M. tuberculosis, porque deteta todos os bacilos

álcool-ácido resistentes (BAAR).

Estas bactérias são resistentes à coloração por variados corantes utilizados

comummente em bacteriologia, como o método de Gram. Por outro lado, uma vez coradas

resistem à coloração por soluções álcool ácidas sendo-lhes por isso atribuída a designação

de BAAR. Significa isto, que a coloração com um primeiro corante (fucsina), se mantém

após descoloração com solução álcool ácida não adquirindo as bactérias a coloração com

um segundo corante (azul de metileno). Embora, não seja patognomónica das

micobactérias a álcool ácido-resistência é uma característica muito importante em termos

de identificação laboratorial.(13)

Tabela 4. Características da Coloração de Zhiel Neelsen

Coloração

de Zhiel

Neelsen

Utilizada principalmente para o diagnóstico de

tuberculose, e outras micobacterioses (ocasionadas por

BAAR). Permite identificar os microrganismos que

possuem paredes celulares ricas em ácidos micólicos

(ceras) capazes de resistir à descoloração pela mistura

álcool-ácido, depois de coradas a quente pela fucsina.



Após coloração, a observação microscópica permite ver bacilos de 3 a 4 m de

comprimento aparecendo frequentemente “em paliçada”, no caso de resultado positivo.

1.2. Fezes

1.2.1 Exame bacteriológico de fezes

Neste laboratório, este exame tem como objetivo o despiste das bactérias patogénicas:

Salmonella e Shigella.

A salmonelose é adquirida normalmente, pela ingestão de alimentos e de água

contaminados ou por contacto fecal-oral. O reservatório de Salmonella typhi é o homem,

que é também o principal disseminador da febre tifoide na fase aguda da doença ou no

estado de portador assintomático.

A Shigella é um dos patogénicos entéricos responsável pela denominada desenteria

bacilar, ocasionando diarreias abundantes com sangue e muco. A shigelose é geralmente

transmitida ao homem por ingestão de água e alimentos contaminados pelo próprio

homem, sobretudo nos países desenvolvidos. A transmissão é feita, primariamente, pela

via fecal-oral direta, já que o homem é o principal reservatório da Natureza. É altamente

infeciosa e cerca de 102 células bacterianas podem causar doença.(13)

Para o isolamento fecal destas duas bactérias, neste laboratório, são utilizados os

seguintes 4 meios de cultura:



Tabela 5. Meios de cultura usados no exame bacteriológico de fezes

Meio de cultura Caraterísticas

Gelose XLD-D agar

Meio de isolamento seletivo e diferenciação destinado à pesquisa de

Salmonella e Shigella. As bactérias que possuem descarboxílase originam

colónias vermelhas por descarboxilação da lisina. As bactérias que

produzem H2S originam colónias com centro negro. As espécies que

fermentam um dos três açucares contidos no meio originam colónias

amarelas ou laranjas. A presença de colónias rosas ou vermelhas com ou

sem centro negro (colónias características) representa uma forte

presunção de Salmonella ou de Shigella. A inibição das bactérias Gram

(+) é obtida pela presença do desoxicolato de sódio.

Gelose SS agar

Meio de isolamento seletivo e de diferenciação destinado à pesquisa das

espécies de Samonella e Shigella. O meio permite evidenciar colónias que

fermentam a lactose e reduzem o tiosulfato (produção de H2S). Os

microrganismos que fermentam a lactose originam colónias rosas, os

outros colónias incolores. Os microrganismos que produzem H2S

originam colónias com centro negro. A presença de colónias incolores ou

ligeiramente coloridas com ou sem centro negro representa uma forte

presunção de Salmonella ou de Shigella. A inibição das bactérias Gram

(+) obtém-se pela mistura de sais biliares e de corantes.(15)

Caldo de

enriquecimento de

tetrationato

Meio de enriquecimento que tem como objetivo inibir o crescimento das

bactérias da flora saprófita.

Gelose Sabouraud

Cloranfenicol 2

Meio seletivo recomendado para a cultura e isolamento das leveduras e

dos fungos filamentosos a partir de colheitas polimicrobianas. A presença

de peptonas e de glucose favorece o desenvolvimento de fungos. O pH,

ligeiramente ácido, favorece o crescimento de fungos em relação ao

desenvolvimento bacteriano. A seletividade do meio em relação à maioria

das bactérias é assegurada pelo cloranfenicol.(16)

Procedimento: Semear as fezes nos 4 meios atrás referidos. Após 24h ler no meio de

XLD e SS o crescimento de bactérias da flora normal (Escherichia coli, Enterococcus,..). E

do meio de enriquecimento de tetrationato de sódio retira-se uma amostra para semear

nos meios XLD e SS. Verificar se nas primeiras 24h houve crescimento de bactérias

suspeitas, em caso negativo, incubar mais 24h.



1.2.2 Exame parasitológico de fezes

O exame parasitológico de fezes inicia-se com o exame macroscópico. É necessário

avaliar o aspeto da amostra, isto é, se tem aspeto normal ou se apresenta sangue ou muco.

Posteriormente, suspende-se uma pequena quantidade de fezes em soro fisiológico e no

microscópio ótico faz-se a pesquisa e identificação de ovos ou quistos de parasitas.

Durante a realização do estágio, os exames parasitológicos de fezes realizados

obtiveram todos resultados negativos.

1.3 Outros Produtos Biológicos

No seguinte fluxograma estão referidos os outros produtos biológicos estudados no

âmbito deste estágio:

Figura 4. Produtos biológicos estudados

Para o exame bacteriológico, os diferentes produtos são semeados nos seguintes

meios:

Gelose Columbia + 5% sangue de carneiro (COS)

Gelose Chocolate Polyvitex (PVX)

Gelose Manitol Salt Agar

Gelose MacKonkey

Gelose Saboraud Cloranfenicol 2

Gelose Gardnerella (se exsudado vaginal)

Para todos os produtos, faz-se uma lâmina para coloração de Gram

Se expetoração faz-se também uma lâmina para coloração de Zhiel Neelsen

Quando aplicável (exsudado vaginal, uretral) realiza-se um exame a fresco.

Produtos biológicos

Exsudado Auricular

Exsudado uretral

Exsudado vaginal

Expetoração Exsudado de ferida



Todos os meios são incubados em estufa a 37ºC, durante 24h (os meios de Gelose

Columbia + 5% de sangue de carneiro (COS), Gelose Chocolate Polyvitex (PVX) e Gelose

Gardnerella devem incubar em ambiente rico em CO2, colocando os meios dentro de uma

campânula com uma vela acesa). Na tabela seguinte, estão referidos os meios utilizados e

suas características1:

Tabela 6. Características dos meios de cultura

Meio de cultura: Características:

Gelose Columbia

+ 5% de sangue de

carneiro (COS)

Isolamento das bactérias exigentes. Deteção das hemólises. Esta gelose

contém uma mistura de peptonas particularmente adaptada à cultura

de microrganismos exigentes (Streptococcus, Listeria,…). A presença

de sangue de carneiro permite a expressão da hemólise que é um

critério de base da orientação da identificação bacteriana.(17)

Gelose Chocolate

Polyvitex (PVX)

Isolamento de bactérias exigentes como Neisseria, Haemophylus,

Streptococcus pneumoniae. É composto por uma base nutritiva

enriquecida com fatores X (hemina) e V (NAD) fornecidos pela

hemoglobina e pelo PoliVitex.(18)

Gelose

MacConkey

Isolamento seletivo de Enterobactérias. A gelose MacConkey com

cristal de violeta permite evidenciar a fermentação da lactose pela

viragem do vermelho neutro. Os microrganismos que fermentam a

lactose originam colónias rosas ou vermelhas, por vezes contornadas

por um halo de sais biliares. Os microrganismos que não fermentam a

lactose, originam colónias incolores ou ligeiramente bege. A

seletividade em relação às bactérias Gram (+) é proporcionada pelos

sais biliares e pelo cristal violeta.(19)

Gelose

Gardenerella

(GAR)

(para exsudado

vaginal)

Meio de isolamento seletivo destinado à deteção de Gardenerella

vaginalis a partir de colheitas genitais. A presença de sangue humano

facilita o crescimento da espécie procurada e permite a obtenção de

uma beta hemólise à volta das colónias. Os antibióticos presentes no

meio inibem a maioria das bactérias Gram (-) bem como das

leveduras.(20)

1 As características da Gelose Manitol Salt Agar e da Gelose Saboraud Cloranfenicol 2 foram anteriormente referidas.



1.3.1 Exsudado Auricular

A otite externa caracteriza-se por um processo inflamatório da pele do canal auditivo

externo(21), sendo que, a otite externa aguda é maioritariamente causada por infeções

bacterianas. O canal auditivo externo tem um pH de cerca de 6,9 que possibilita a

presença de uma flora saprófita, que protege o canal auditivo externo contra outros

microrganismos patogénicos. Na seguinte tabela estão representadas, não só as bactérias

da flora saprófita, como também as bactérias patogénicas, sendo que, a Pseudomonas

aeruginosa apresenta-se como a mais comum na infeção do ouvido externo.(22)

Tabela 7. Bactérias da flora saprófita e patogénicas no ouvido externo

Bactérias flora saprófita Bactérias patogénicas

Staphylococcos epidermidis,

Micrococcus, Corynebacterium

Pseudomonas aeruginosa, Staphylococos

aureus, Proteus, Escherichia coli entre outras

1.3.2 Exsudado Uretral

Tabela 8. Exame bacteriológico do exsudado uretral

Tabela 9. Bactérias da flora saprófita e patogénicas da uretra

Flora uretral saprófita Bactérias patogénicas

Micrococcus, Staphlococcus coagulase

negativos, corynebacterium

Neisseria gonorrheae, Chlamydia

tracomatis entre outras

Ex

am

e

Ba

cte

rio

lóg

ico

Exame a fresco (Pesquisa de Trichomonas vaginalis)

Semear nos meios indicados

Coloração de Gram



Infeção por Neisseria gonorrhea no homem

A Neisseria gonorrhoeae é uma bactéria Gram-negativa, aeróbia, na forma de

diplococos “riniformes” ou “grãos de café”. Esses diplococos apresentam-se aos pares, com

faces côncavas adjacentes, ou seja, voltadas entre si.

No homem, a infeção inicial por Neisseria gonorrhea provoca uretrite aguda purulenta,

que se caracteriza por corrimento purulento, disúria e pode estender-se à próstata,

vesículas seminais, epidídimo e testículos.

Identificação: A coloração de Gram revela diplococos Gram negativo típicos, sendo

obrigatório alguns estarem dentro de polimorfonucleares. O teste da oxidase é positivo.

Em relação à fermentação dos carbohidratos, a Neisseria gonorrhea metaboliza apenas a

glucose oxidativamente.(13)

A coloração de Gram é um método muito sensível e específico em homens com uretrite

purulenta. No entanto, a sua sensibilidade é menor nos homens assintomáticos e nas

mulheres (sintomáticas ou assintomáticas).

Infeção por Trichomonas vaginalis no homem

O homem pode ter infeção por Tricomonas vaginalis pelo contato com parceira sexual

infetada.

A tricomoníase em homens pode ser classificada em três grupos: estado assintomático;

estado agudo, caracterizado por uretrite purulenta abundante; e doença assintomática leve,

clinicamente indistinguível de outras causas de uretrite.



1.3.3 Exsudado vaginal

1.3.3.1 Exame Bacteriológico

Tabela 10. Exame bacteriológico do exsudado vaginal

Tabela 11. Bactérias da flora saprófita e patogénicas no exsudado vaginal

Flora vaginal normal Bactérias patogénicas

Lactobacillus, Streptococcus agalactiae,

Staphylococcus coagulase negativos,

Corynebacterium, Leveduras

Gardenerella vaginalis, Neisseria gonorrhea,

Listeria monocytogenes, Clamydia tracomatis,

Mycoplasma hominis entre outras

Vaginose bacteriana por Gardnerella Vaginalis

A Gardnerella vaginalis é um bacilo Gram negativo. Pode ser detetado em colorações

de Gram, pois aderem às células epiteliais, dando origem às características “clue cells”.

Esta vaginose bacteriana ocorre quando há um desequilíbrio, que leva à diminuição de

Lactobacillus, e ao aumento de Gardnerella vaginalis.(3)

Infeção por Trichomonas vaginalis na mulher

A T. vaginalis infeta principalmente o epitélio escamoso do trato genital. A

tricomoníase apresenta grande variabilidade de manifestações patológicas, desde a

apresentação assintomática até um estado de severa inflamação (vaginite). Das mulheres

infetadas, entre 25% e 50% são assintomáticas.

Ex

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Ba

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ico

Exame a fresco (Pesquisa de Trichomonas vaginalis)


Coloração de Gram



Infeção por Neisseria gonorrhea na mulher

A infeção por Neisseria gonorrhea envolve o colo do útero, originando uma cervicite,

que se pode manisfestar por corrimento vaginal, dor abdominal baixa e/ou hemorragias e

mais raramente uretrite. Pode disseminar para as glândulas de Bartolini, trompas de

Falópio e ovários, assim como para a cavidade peritoneal (doença inflamatória pélvica) o

que ocorre em 10-20 % das mulheres com gonorreia.

A contaminação do feto aquando do parto pode conduzir a oftalmia neonatal.(13)

1.3.3.2 Pesquisa de Streptococcus do grupo B em exsudados reto-vaginais de grávidas

Os Streptococcus do grupo B são colonizadores do trato gastrointestinal superior e do

trato genitourinário.

Nos adultos, a colonização é frequentemente assintomática, sendo que cerca de 40%

das mulheres estão colonizadas com Streptococcus do grupo B. Contudo esta bactéria

pode ser responsável por septicémias e meningites em recém nascidos.(3)

No recém-nascido, a contaminação pode ocorrer “in útero” ou, mais frequentemente,

por inalação do líquido amniótico ou secreções vaginais durante o parto.

Por isto, a maior relevância, da infeção por S. agalactiae, são estes quadros graves de

septicemia e meningite das crianças durante os períodos neonatal e perinatal, além da

ocorrência de partos prematuros ou nascimentos de crianças de termo com baixo peso

corporal. Muitos recém-nascidos, principalmente prematuros, nascidos de mães

colonizadas por S. agalactiae, e provavelmente infetadas ainda, no útero podem estar

criticamente doentes ao nascer, tendo um prognóstico reservado e uma mortalidade de 15

a 20%. Os prematuros estão em risco porque possuem um nível baixo de anticorpos do

tipo IgG maternos e as suas reservas de neutrófilos são baixas.(13)

O rastreio realiza-se às 35-37 semanas, para evitar que a criança seja contaminada.

Caso depois do rastreio não haja tempo para tratar, devido a um parto pré-termo, prefere-

se fazer cesariana em vez de via baixa porque é na altura do parto que a criança é

contaminada.

Procedimento: Mergulhar a zaragatoa com o produto no meio de Tood-Hewitt e

colocar na estufa a 37ºC, durante 24horas. Após 24h, retirar do meio um pouco de



amostra e semeiar numa placa de Gelose STRB. Colocar na estufa a 37ºC, durante 24h. Se

ocorrer crescimento de colónias suspeitas faz-se uma identificação com Slidex Strepto B.

Na seguinte tabela, estão referidas as características dos dois meios utilizados nesta

pesquisa:

Tabela 12. Meios de cultura utilizados na pesquisa de Streptococcus do grupo B

Caldo Todd-

Hewitt +

Antibióticos

(TODD H-T)

Caldo de enriquecimento seletivo para os estreptococos do grupo B,

destinado à deteção dos estreptococos do grupo B na mulher grávida. A sua

composição favorece o crescimento dos estreptococos no seio de uma flora

polimicrobiana. Os antibióticos presentes no meio (ácido nalidíxico e

colistina) inibem a maioria dos microrganismos Gram (-) da flora

saprófita.(23)

Gelose Strepto B

ID (STRB)

Constituída por uma base nutritiva que associa diferentes peptonas, três

substratos cromogénicos e antibióticos. Estes componentes permitem

detetar o S. agalactiae através do aparecimento espontâneo de colónias

rosa pálido a vermelho. A maioria das outras espécies bacterianas e

leveduras não se desenvolvem neste meio ou não formam colónias

características.(24)

Identificação de Streptococcus a partir do Slidex

Os estreptococos beta-hemolíticos possuem antigénios específicos do grupo que

podem ser extraídos e identificados com antissoros.

O SLIDEX Strepto Plus é um teste de aglutinação de partículas de látex para a

identificação dos estreptococos A, B, C, D, F e G segundo a classificação de Lancefield. O

agrupamento das estirpes de estreptococos permitirá a orientação do tratamento

antibiótico.

Após cultura, as colónias isoladas de estreptococos são colocadas num tubo que contém

a enzima de extração.

O antigénio específico do grupo que se encontra na parede é extraído por uma enzima,

e de seguida é identificado por partículas de látex sensibilizadas por um anticorpo

antiantigénio de grupo dos estreptococos. Se o antigénio estiver presente, o reagente de

látex correspondente é aglutinado. Se o antigénio estiver ausente, o reagente de látex

permanece em suspensão homogénea.(25)



1.3.4 Expetoração

1.3.4.1 Exame bacteriológico:

Tabela 13. Exame bacteriológico da expetoração

Tabela 14. Bactérias patogénicas na expetoração

Algumas Bactérias patogénicas

Streptococcus pneumoniae, Moraxella catarrhalis

Haemophillus influenza, Pseudomonas aeruginosa

Klebsiella pneumoniae, Mycobacterium tuberculosis

Staphylococcus aureus, MRSA

1.3.4.2 Pesquisa de BK (Bacilo de Koch) direto e cultural

A Tuberculose é uma doença infeciosa causada por um grupo de bactérias estritamente

relacionadas que constituem o complexo Mycobacterium tuberculosis. Pode afetar

qualquer órgão ou sistema do corpo humano, sendo que a forma pulmonar é a mais

frequente (75%).

O reservatório natural do M. tuberculosis é o Homem, as portas de entrada são em 90%

o aparelho respiratório.

O M. tuberculosis possui uma parede celular que é extremamente rica em ácidos

micólicos com cadeias longas e ramificadas, o que, torna a superfície hidrofóbica, e

confere a estas bactérias propriedades importantes, não só em termos taxonómicos, como

também, na patogenia das respetivas infeções.

Ex

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Coloração de Gram

Coloração de Zhiel Neelsen



O tratamento laboratorial da expetoração inclui homogeneização, liquefação,

descontaminação e concentração. A descontaminação com hidróxido de sódio serve para

eliminar outras bactérias que possam estar presentes e que, por crescerem mais

rapidamente, impedem o crescimento daquelas. A concentração, feita por centrifugação,

tem como finalidade aumentar a sensibilidade do exame direto e do exame cultural.

Exame direto: Coloração de Zhiel Neelsen

Exame cultural: Semear em meio de Lowenstein-jensen (LJ-T) e incubar numa

posição horizontal durante uma noite a 37ºC e 4 semanas na vertical

Tabela 15. Meio de Lowenstein-jensen (LJ-T)

Meio de Lowenstein-Jensen (LJ-T)

Meio enriquecido com a presença de ovo, de

asparagina e de fécula, que favorece o

crescimento das micobactérias.(26)

Neste meio, as micobactérias desenvolvem-se, em geral, lentamente, sendo necessária

uma incubação prolongada, de 3 a 4 semanas para que se formem as colónias

características. As colónias de M. tuberculosis em meio de L-J aparecem rugosas e não

pigmentadas (colónias em “couve flor”).

As micobactérias têm exigências nutritivas particulares, pelo que não se desenvolvem

(ou fazem-no deficientemente) nos meios de cultura tradicionais utilizados habitualmente

para a maioria das outras bactérias.(13)

Controlo de qualidade no setor da Microbiologia

Meios de cultura (cada lote de novos meios)

Colocar uma placa de cada meio preparado devidamente identificada a 37ºC por 48

horas (a de meio adequado ao isolamento de fungos, durante 5 dias à T ambiente).

Exame macroscópico: observar se há crescimento bacteriano; observar eventual

desidratação (meios com ranhuras ou descolados da parede da placa devem ser

inutilizados), cor (comparar com lote anterior e se diferente tornar a determinar pH), e

transparência do meio (observar presença de turvação ou precipitado).

pH- verificar pH (pode variar +/- 2 do especificado pelo fabricante)

Reagentes e corantes



Utilização de microrganismos para visualizar reações positivas e negativas, de acordo

com a tabela 16.

Tabela 16. Controlo de Qualidade realizado no setor da Microbiologia

Teste Controlo

positivo

Resultado

previsto

Controlo

negativo

Resultado

previsto

Frequência

das provas

Gram

(lâminas)

Staph.

aureus

Microrganismos

púrpura

E.coli Microrganismos

avermelhados

Novos lotes e

depois de 15

em 15 dias

Água

oxigenada

Staph.

aureus

Revela

efervescência

- - Uma vez por

semana

Controlo de qualidade interno – Todos os meses a Biomérieux envia estirpes ATCC

(American Type Culture Collection) (Gram (+) e Gram (-)) para avaliar as galerias de

identificação e galerias de antibiograma.



Capítulo 2. Hematologia

2.1 Colheita de sangue venoso

A colheita de sangue venoso é realizada através de punção venosa. O sangue é colhido

diretamente para tubos de vácuo (Vacutainer) que contêm já a concentração correta de

anticoagulante. Os anticoagulantes mais utilizados são o ácido etilenodiamino tetracético

(EDTA) e o citrato trissódico. Ambos atuam por remoção do cálcio.

O EDTA é um anticoagulante sólido e é o mais indicado para contagens de células

sanguíneas. O citrato trissódico é líquido e é o anticoagulante mais utilizado nos estudos

da coagulação e das plaquetas.

Para a obtenção de um hemograma válido, é essencial que a colheita e o processamento

da amostra de sangue sejam feitos corretamente.

2.2 Hemograma

O hemograma é um dos exames complementares de diagnóstico de rotina. Inclui

determinações quantitativas e qualitativas das células sanguíneas: eritrócitos, leucócitos e

plaquetas. A amostra utilizada é o sangue total.

Figura 5. Parâmetros obtidos de um hemograma

HEMOGRAMA

Eritrograma

Nº GV

Ht

Hb

Índices hematimétricos

Morfologia eritrocitária

Leucograma

NºGB

Fórmula leucocitária

(% e absoluta)

Morfologia leucocitária

Contagem e morfologia plaquetária



Neste laboratório, o hemograma é obtido pelo autoanalisador Coulter Hmx hematology

(Fig. 6) da BECKMAN COULTER.

Figura 6. Autoanalisador Coulter Hmx Hematology

Este autoanalisador tem como princípio de funcionamento, a Impedância elétrica, que

foi desenvolvida por Wallace Coulter e baseia-se na quantificação dos impulsos gerados

pelas células ao passar por um orifício onde flui uma corrente contínua. Pelo facto de as

células sanguíneas não conduzirem bem a eletricidade, ao passar por esta pequena

abertura ocorre um aumento mensurável da impedância elétrica. Deste modo são

contadas e medidas as células, uma vez que o impulso é proporcional ao tamanho da

célula analisada.

Com este método são contados eritrócitos, e em diferente diluição após lise dos

eritrócitos contam-se os leucócitos e as plaquetas. É fundamental regular a intensidade da

corrente e o "limiar" de deteção para o tamanho da partícula a ser contada.(27)

2.3 Esfregaço sanguíneo

Neste laboratório, são realizados esfregaços sanguíneos quando:

Os resultados do hemograma estão alterados

Quando esse exame é requisitado

Se pretende estudar a morfologia do eritrócito ou dos diferentes leucócitos.

A análise citológica é uma parte importante na avaliação da doença hematológica.

Embora um diagnóstico específico possa ser sugerido com base em resultados obtidos por

métodos automáticos, algumas patologias têm uma contagem celular normal com



morfologia celular anormal. A coloração do esfregaço sanguíneo é feita com o kit de

coloração.

Esse Kit, tem como princípio a coloração de Wright. São corantes do tipo Romanovsky,

que possuem, a eosina, e o azul e azur de metileno. Sendo a eosina (laranja/róseo) um

componente ácido, cora os componentes básicos da célula (componentes acidófilos). O

azul de metileno (azul/roxo) e o azur de metileno (púrpura) coram os componentes

ácidos da célula (componentes basófilos).

2.4 Contagem de reticulócitos

Consiste na contagem de eritrócitos imaturos no sangue periférico. O seu número

encontra-se aumentado quando a produção medular de eritrócitos aumenta. A sua

contagem é útil para distinguir situações hipoproliferativas (p. ex. anemia ferropénica) e

hiperproliferativas (p. ex. anemia hemorrágica e hemolítica).

A coloração é feira recorrendo a um kit de coloração.

Os corantes azul de metileno e o azul brilhante de cresilo precipitam com o RNA.

Desde que o RNA dos reticulócitos desaparece, alguns dias depois eles entram na corrente

sanguínea. O número de reticulócitos é provavelmente o melhor e mais fácil indicador da

eritropoiese.(28)

2.5 Velocidade de sedimentação

A velocidade de sedimentação (VS) é um teste de rotina no estudo hematológico, apesar

de não ser um teste específico.

A amostra utilizada nesta determinação, é o sangue total.

É uma análise de rotina por se encontrar alterada em diversas situações, tais como

processos infeciosos e inflamatórios em atividade. É por isto um teste com valor

diagnóstico. Permite tanto estudar a evolução dos processos em que há alteração da VS

como estudar a resposta terapêutica.

Um aumento da VS, não é um fenómeno específico, mas é clinicamente útil em doenças

em que há aumento da produção de proteínas de fase aguda.

Neste laboratório, a VS é determinada pelo aparelho TEST 1 THL (Fig. 7) da ALI FAX, um

microfotómetro capilar, que tem como princípio da análise a fotometria capilar de fluxo

(análise cinética).



Figura 7. Test 1 THL

2.6 Estudo da coagulação

As provas de screening da coagulação têm interesse no estudo de alterações do

processo de coagulação. Para este estudo, a amostra a usar é o plasma citratado. O sangue

é então colhido para um tubo com o anticoagulante citrato trissódico, pois este preserva os

fatores de coagulação lábeis (fator V e fator VIII). A amostra tem de estar refrigerada.

Neste laboratório, são determinados, o tempo de tromboplastina parcial ativada, tempo

de protrombina e I.N.R..

2.6.1. Tempo de Tromboplastina Parcial ativada ou Tempo de Cefalina-

Caolino

O tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPa) é um teste de rastreio da coagulação

e estuda a via intrínseca (fatores XII, XI, IX, VIII,) e a via comum (fator X, V, protrombina

e fibrinogénio). As principais aplicações do TTPa são a deteção de deficiências congénitas

e adquiridas desses fatores, assim como a monitorização da terapêutica da heparina com

heparina não fracionada.

Observa-se o prolongamento do TTPa nos seguintes estados clínicos:

TTPa

TP

TT

•Estuda a via intrínseca e a via comum

•Estuda a via extrínseca e a

via comum

•Estuda a fase final da via

comum



Deficiências congénitas Deficiências adquiridas e estados

patológicos

Deficiência dos fatores: VIII, IX,

XI e XII

Deficiência do quininogénio de

alto peso molecular (fator

Fitzgerald)

Doença hepática

Coagulação vascular disseminada

Presença de inibidores da

coagulação

Tratamento com heparina ou

anticoagulantes orais

Princípio do teste: É adicionada às amostras de plasma uma mistura de cefalina

(substituto plaquetário) e de suspensão de caolino (ativador), que é incubada durante

exatamente 3 min a 37ºC. Isto dá início à ativação de contacto dos fatores XII e XI.

A adição subsequente de solução de cloreto de cálcio ativa o sistema de coagulação

endógena (intrínseco) originando a formação de fibrina. É medido o tempo decorrido

entre a adição de cloreto de cálcio e a formação de um coágulo de fibrina.(29)

2.6.2. Tempo de Protrombina ou Tempo de Quick e INR

A determinação do tempo de protrombina (TP) permite fazer o estudo da via extrínseca

e da via comum, ou seja, os fatores VII, X, V, II e o fibrinogénio.

Um aumento do TP é observado nos seguintes estados clínicos:

Deficiências congénitas Deficiências adquiridas e estados patológicos

deficiências dos

fatores II, V, VII, X

Insuficência hepática (cirrose, hepatite)

Tratamento com antagonistas de vitamina K

Hipovitaminose K: deficiência nutricional, perturbações

da adsorção ou do metabolismo da vitamina K (doença

hemorrágica do recém nascido, colestase ou tratamento

com antibióticos)

Fibrinólise

Coagulação intravascular disseminada

O tempo de protrombina é particularmente indicado para a monitorização da

terapêutica com anticoagulantes orais (varfarina) devido à sua sensibilidade relativamente

às variações de concentração dos fatores II, VII e X dependentes da vitamina K.



Princípio do teste: A adição de tromboplastina com cálcio ao plasma citratado inicia

a cascata de reações, da qual resulta a formação de um coágulo de fibrina. O tempo

decorrido até ao início da coagulação é comparado com o tempo determinado utilizando o

padrão normal. As atividades dos seguintes fatores de coagulação são medidas:

- Fator II (protrombina), V (proacelerina), VII (proconvertina), X (fator Stuart-Prower).

International Normalized Ratio (INR)

A utilização do International Normalized Ratio (INR) é recomendada para a avaliação

do TP na terapêutica com antagonistas da vitamina K em doentes hipocoagulados.

Vários estudos internacionais demonstraram que, na fase estável da terapêutica

anticoagulante oral, os resultados podem variar significativamente conforme a origem do

reagente de tromboplastina e o analisador utilizado na medição.

Para resolver este problema, a Organização Mundial de Saúde (OMS) introduziu um

procedimento de padronização válido para as tromboplastinas. Este procedimento produz

resultados que são independentes do reagente durante a fase estável da terapêutica

anticoagulante oral. Neste sistema, o rácio do TP é convertido no INR utilizando a

seguinte fórmula:

O valor ISI (International Sensivity Index) de uma tromboplastina específica é

determinado efetuando análises comparativas entre o reagente de tromboplastina a

padronizar e uma tromboplastina de referência internacional.

Os plasmas normais, assim como os plasmas procedentes de doentes submetidos a

terapêutica anticoagulante oral estável, são utilizados para determinar o valor ISI de

acordo com um esquema concreto e predefinido.(30)

O estudo da coagulação é efetuado no aparelho Option 4 Plus da Biomérieux (Fig. 8),

este possui uma zona com termóstato, dividida em 3 zonas (I,M,R).



Figura 8. Option 4 Plus

Tabela 17. Zonas e funções do Option 4 Plus

Zona Função

Zona I Incubação de amostras

Zona M Medição

Zona R Incubação dos reagentes

Princípo de funcionamento: A formação do coágulo é revelada através de um

fotodíodo que mede as variações de densidade ótica do meio reacional. A luz é emitida por

um fotodíodo que, emitindo uma luz intermitente, elimina a interferência com a luz

exterior. A rotação da esfera assegura a homogeneização do meio reacional e a ausência de

sedimentação no caso de usar reagentes específicos.

A modificação da densidade ótica causada pela adição de reagente desencadeia o início

das medições. Aliás, esta é precedida por um ajuste automático da luz incidente que torna

assim a medição independente das características óticas do meio reacional (reagente mais

plasma).

Em função da concentração em fibrinogénio do meio, a reação traduz-se pelo aumento

da densidade ótica (concentração forte em fibrinogénio) ou por uma diminuição da

densidade ótica, no caso contrário. Neste último caso, o papel da esfera para além da sua

ação de homogeneização, é revelar a fibrina formada, o que torna a solução mais clara.

Este sistema permite, portanto, detetar os coágulos mais finos (hipofibrinogenemias-

plasmas com uma grande concentração de heparina).(31)

Zona R Zona I Zona M



2.7 Determinação de grupos sanguíneos

Os dois grupos mais importantes são o sistema ABO e o sistema Rhesus. Relativamente

ao sistema ABO, a determinação do grupo sanguíneo consiste na identificação dos

antigénios existentes nos eritrócitos e que são geneticamente determinados por 3 genes,

respetivamente, os genes A, B e O.

Conforme a existência dos antigénios A e B, os eritrócitos são classificados

(fenotipicamente) como sendo do grupo A, B, AB ou O.

No soro de indivíduos de cada um dos grupos, existem anticorpos chamados naturais:

anti-A (em indivíduos do grupo B); anti-B (em indivíduos do grupo A); anti-A e anti-B (em

indivíduos do grupo O), sendo que os indivíduos do grupo AB não possuem os anticorpos

anti-A e anti-B no soro.

Grupo sanguíneo Aglutinogénios Aglutininas

A A Anti-B

B B Anti-A

O ausente Anti-A e anti-B

AB A e B ausente

O sistema Rhesus caracteriza-se pela existência de diferentes antigénios: C, D, E, c, d, e

e na membrana dos eritrócitos.

Neste laboratório, por ser um laboratório de rotina, faz-se apenas a identificação de Rh+

ou Rh-, isto é, se tem ou não antigénio D na membrana do eritrócito. Este sistema

caracteriza-se pela ausência de anticorpos naturais.(32)

Neste laboratório, a determinação de grupos sanguíneos é efetuada pela técnica em

tubo.

Assim, inicialmente, é preparada uma suspensão de eritrócitos, e posteriormente

adiciona-se uma gota da suspensão de eritrócitos a cada um dos tubos que possuem os

anticorpos: anti-A, anti-B e anti-D. Após centrifugação, observa-se a presença ou ausência

de aglutinação.

Na ausência de aglutinação no tubo com anti-D, faz-se sempre a pesquisa do fator D

fraco (variante Du) e do fator D parcial. Após incubação, adiciona-se soro de Coombs. A

confirmação da presença de aglutinação efetua-se por observação no microscópio ótico de

aglutinados de eritrócitos.



2.8 Prova de Coombs indireta

A prova de Coombs indireta consiste na pesquisa de anticorpos irregulares presentes no

soro.

Prova de Coombs indireta

Provas de compatibilidade transfusional

Pesquisa de anticorpos irregulares (grávida)

Pesquisa do fator D fraco e D parcial

Esta é uma prova que se realiza sempre em grávidas Rh-. Isto porque, durante a

gravidez, o tecido que separa os vasos placentares (onde circula sangue do feto) do espaço

interviloso (onde circula sangue materno) vai diminuindo de espessura, permitindo que as

trocas de sangue entre mãe e feto vão aumentando até ao termo da gestação. A partir da 6ª

semana de gravidez, quando o feto Rh+ começa a ter antigénio Rh em circulação, é

induzida a produção de anticorpos anti-D nas grávidas Rh-, ficando estas sensibilizadas.

Numa futura gestação, a consequência desta sensibilização será a doença hemolítica

perinatal (DHPN), situação responsável por uma morbilidade e mortalidade perinatal

significativa.

O procedimento consiste em adicionar 200 L de soro do doente e 100 L da solução

O+. Deixar a incubar em banho maria durante 60 min. De seguida efetuam-se 3 lavagens

dos eritrócitos e adiciona-se soro de Coombs (soro antiglobulina humana, de largo

espectro ou específico, aglutina eritrócitos sensibilizados por anticorpos).

A confirmação da presença de aglutinação efetua-se por observação no microscópio ótico

de aglutinados de eritrócitos.



2.9 Controlo de Qualidade no setor da Hematologia

Autoanalisador Coulter HMX

Diariamente, antes do início dos trabalhos, são utilizados os controlos Latron 1 e 2.

Estes permitem verificar se os parâmetros: volume, condutância e complexidade da célula

estão a ser medidos corretamente. O autoanalisador é novamente controlado, caso se

obtenha valores fora dos valores de referência.

São usados controlos de sangue 5C (níveis I, II, III): uma vez por dia, no início dos

trabalhos, alternando os níveis. Possui um nível normal e dois patológicos. É utilizado dois

meses por ano.

O Controlo de sangue 4 C: uma vez por dia, no inicio dos trabalhos – 1 nível normal.

Controlos de sangue – 4C e 5C

Fórmulas leucocitárias

Uma lâmina de um esfregaço sanguíneo é vista uma vez por semana por 2 observadores

diferentes.

Coagulação

Efetua-se um “pool” de plasmas normais para controlo das amostras. E para cada novo

lote de reagente faz-se uma curva de calibração, com plasmas de referência.



Capítulo 3. Serologia

Os testes de serologia mais vezes requisitados neste laboratório, são a pesquisa de

Proteína C reativa, pesquisa de fator reumatoide e o teste V.D.R.L. (Venereal Diseases

Reference Laboratory). No entanto, estão descritas de seguida também a Reação de Widal,

Reação de Wright e Reação de Weil Felix, que são requisitadas esporadicamente.

Para os seguintes testes serológicos, é utilizado o soro como amostra.

3.1 Proteína C reativa

A pesquisa de Proteína C Reativa (PCR) é efetuada através de um teste rápido de

aglutinação. A PCR está associada a infeções agudas, e a uma variedade de estados

inflamatórios. Existe uma correlação significativa entre os níveis séricos de PCR e o início

do processo inflamatório. A monitorização dos níveis desta proteína permite avaliar a

eficácia do tratamento e a recuperação do doente.

Princípio do teste: As partículas de látex são revestidas com anticorpos humanos

anti-PCR (anti-Proteína C Reativa). Quando se mistura a suspensão de látex com soro que

contenha níveis elevados de PCR, irá produzir-se uma aglutinação nítida num período

máximo de 2 min.(33)

O procedimento efetuado, está representado na Figura 9.

Figura 9. Procedimento da pesquisa de proteína C reativa

50 L soro + 1 gota de reagente

Aglutinação Pesquisa positiva

Sem aglutinação Pesquisa negativa



3.2 Teste VDRL e TPHA

O teste VDRL é um teste de floculação não específico para o diagnóstico de Sífilis

através da pesquisa de anticorpos (reaginas) no soro.

Princípio do teste: Quando existe ligação entre colesterol/cardiolipina/lectina no

reagente e os anticorpos reagina na amostra, ao fim de oito min, a aglutinação pode ser

observada sob a forma de manchas pretas.(34)

O procedimento do teste está representado na Figura 10:

Figura 10. Procedimento do teste VDRL

As amostras que apresentarem aglutinação no teste qualitativo devem ser seguidas do

teste semiquantitativo.

Para isso, são preparadas diluições sucessivas (1/2, 1/4, 1/8, 1/16…) em soro fisiológico.

O resultado é o correspondente à última diluição com aglutinação.

Podem ocorrer reações falsas positivas quando os doentes são portadores de outras

patologias que não a Sífilis (p. ex., Lúpus Eritematoso Sistémico, Artrite Reumatoide).

Sempre que um teste apresente um resultado positivo deve realizar-se um teste específico

para a confirmação da infeção por Treponema pallidum.

Neste laboratório, a confirmação é feita com um teste específico e sensível de

hemaglutinação passiva para a deteção dos anticorpos antitreponema pallidum no soro, o

TPHA (Treponema pallidum haemaglutination assay).

Princípio do teste: É constituído por eritrócitos de aves sensibilizados com

antigénios tratados com formol, o controlo com eritrócitos de aves (não sensibilizados),

diluente e um soro controlo. Quando as amostras positivas diluídas são misturadas com os

eritrócitos sensibilizados, os anticorpos reagem com os antigénios do eritrócito

sensibilizado provocando a aglutinação das células. As células formam um padrão

característico no fundo do poço da placa de microtitulação. Na ausência de anticorpos,

forma-se um botão compacto no fundo do poço (Fig. 11). (35)


Aglutinação Teste semi-quantitativo

Sem aglutinação Não reactivo



Figura 11. Placa de microtitulação - TPHA

3.3 Fator reumatoide

O fator reumatoide (FR) encontra-se no soro de doentes com artrite reumatoide e

acredita-se que seja constituído por anticorpos IgM dirigidos contra as imunoglobulinas

do doente.

É usado um teste rápido de aglutinação de látex em placa para pesquisa do FR no soro.

Princípio do teste: As partículas de látex são revestidas com gama globulina humana

altamente purificada. Quando a suspensão de látex é misturada com soro contendo níveis

elevados de FR, observa-se uma aglutinação nítida num período máximo de 2 min.(36)

O procedimento deste teste, está de seguida representado:

Figura 12. Procedimento do teste FR

3.4 Reação de Widal

Esta reação permite o diagnóstico laboratorial da febre tifoide (S. typhi) e paratifoide (S.

paratyphi A, B, C, D). Esta quantifica os anticorpos anti-O e anti-H, presentes no soro do

doente, por reação de aglutinação com suspensões antigénicas de Salmonella (AO, AH, BO,

BH, CO, CH e TO, TH).

A reação de Widal auxilia o diagnóstico da febre tifoide e paratifoide. Através de

suspensões homogéneas de bacilos tíficos e paratíficos “A” ou “B” colocadas em contacto

com o soro, diagnostica-se o agente específico causador da infeção.



Sem aglutinação Negativo

Resultado positivo



Empregam-se na reação de Widal, também os antigénios “O” somático e “H” flagelar

que lhe aumentam o valor diagnóstico. O soro dos doentes com febre tifoide contêm

anticorpos dirigidos contra os antigénios “O” e “H” de S. typhi ou de outras salmonelas

envolvidas no processo infecioso.

Neste laboratório, pesquisam-se anticorpos contra o Antigénio O e H de Salmonella

Typhi. E os Antigénios H da Salmonella paratiphy do grupo A e B.

Princípio do teste: As partículas de látex são revestidas com os diferentes antigénios

acima especificados. Quando o reagente é adicionado ao soro, e quando neste existem

anticorpos contra os antigénios é visível uma aglutinação ao fim de 2 min.

3.5 Reação de Wrigth

Nesta reação é efetuada a pesquisa de anticorpos específicos no soro contra Brucella

abortus.

O Homem contamina-se por contacto direto com o animal infetado ou por contacto

indireto, através do consumo de produtos lácteos, como o leite não pasteurizado, queijo

fresco feito com leite cru.(13)

Princípio do teste: As partículas de látex são revestidas com antigénios de Brucella

abortus. Quando o reagente é adicionado ao soro, e caso nele estejam presentes anticorpos

específicos para esses antigénios, uma aglutinação é visível ao fim de 2 min.

3.6 Reação de Weil Felix

A Reação de Weil Felix é um teste de aglutinação para o diagnóstico de infeções

provocadas por ricketsias. Não se usam antigénios de Rickettsiae pela dificuldade na sua

obtenção, mas as estirpes OX 2, OX 19 e OX K de Proteus vulgaris, uma vez que se

verificou que estas dão reação cruzada com os anticorpos anti-Ricketsiae.

Princípio do teste: As partículas de látex são revestidas com antigénios OXK, OX2 e

OX19 do Proteus. Quando o reagente é adicionado ao soro do doente, e quando nele estão

presentes anticorpos específicos contra estes antigénios, é visível uma aglutinação ao fim

de 2 min.(37)



O procedimento dos últimos três testes referidos está de seguida representado:

Figura 13. Procedimento da Reação de Widal, Reação de Wrigth e Reação de Weil Felix

Em caso positivo, utilizam-se menores volumes de soro, adicionando uma gota de

reagente. O resultado é o correspondente à última diluição com aglutinação.

3.7 Controlo de Qualidade no setor da Serologia

É efetuado um controlo positivo e um negativo em cada teste serológico.



Sem aglutinação < 1:20



Capítulo 4. Bioquímica

A maioria das análises do foro bioquímico, neste laboratório são efetuadas em

autoanalisadores, como o Olympus AU 600 (Fig. 14), Elecsys e cobas e 411 (Fig. 15).

Em todos, é utilizado um sistema de identificação dos tubos com código de barras,

sendo que, não é necessária programação manual.

Figura 14. Olympus AU 600

Figura 15. Elecsys (à esquerda) e cobas e 411 (à direita)

O soro é a principal amostra utilizada neste setor. Para ser obtido, a colheita de sangue

é feita para um tubo sem anticoagulante. Assim a cascata de coagulação é ativada. O soro

constitui a fração não celular do sangue do qual foram também removidos o fibrinogénio e

outras proteínas intervenientes na coagulação.

Os tubos utilizados na bioquímica possuem um gel, que após centrifugação separa o

coágulo (em baixo) do soro (em cima). Também é utilizada a urina como amostra, para a

determinação por exemplo, da microalbuminúria e clearance da creatinina.

A maioria das determinações bioquímicas são realizadas no autoanalizador Olympus

AU 600. Este utiliza métodos enzimáticos, cinéticos e colorimétricos nas medições.



São referidos, de seguida alguns analitos, a sua importância e princípio de medição.

4.1 Autoanalisador Olympus AU 600

Avaliação da função hepática

Para a avaliação da função hepática, são determinados quantitativamente no soro,

alguns analitos:

Tabela 18. Marcadores da função hepática

Aspartato aminotransferase (AST)

Alanina aminotransferase (ALT)

Fosfatase Alcalina (ALP)

γ-Glutamiltransferase (GGT)

Bilirrubina sérica total e direta

Albumina

Fosfatase Alcalina

A fosfatase alcalina (ALP) encontra-se em quase todos os tecidos do organismo, mais

concretamente em/ou nas membranas celulares.(38) Aumentos da atividade desta enzima

na doença hepática, ocorrem geralmente em resposta à colestase, que pode ser intra ou

extra hepática.(39)

Também podem ser encontrados níveis elevados de ALP em doenças primárias dos

ossos, nomeadamente osteomalacia, intoxicação por vitamina D e tumores ósseos

primários.

Esta enzima é determinada no autoanalizador Olympus através de um ensaio de cor

cinético.

Princípio do teste: A atividade da fosfatase alcalina é determinada através da

medição da taxa de conversão de p-Nitrofenilfosfato (pNPP) em p-Nitrofenol (pNP) na

presença de iões de magnésio e etilenodiamina como aceitador de fosfato a pH 9,8. A taxa

de aumento na absorvânica decorrente da formação de pNP é medida bicromaticamente a

410/480 nm e é diretamente proporcional à atividade de ALP na amostra.(38)



γ-Glutamiltransferase

A γ-Glutamiltransferase (GGT) existe em todas as células do organismo, exceto nas dos

músculos; contudo, a enzima existente no soro parece originar essencialmente do sistema

hepatobiliar.

A GGT aumenta acentuadamente nos casos de obstrução biliar intrahepática ou pós-

hepática, em doentes com hepatite infeciosa, fígado gorduroso, pancreatite aguda e

crónica e doentes medicados com drogas anticonvulsivas, nomeadamente fenitoína e

fenobarbital. Como os níveis elevados de GGT são registados em doentes com cirrose

alcoólica e na maioria dos soros de indivíduos que consumam grandes quantidades de

álcool, a GGT desempenha um papel na deteção do alcoolismo, lesões do fígado

provocadas pelo álcool e na monitorização de abstinência do álcool.

Esta enzima é determinada no autoanalizador Olympus através de um ensaio de cor

cinético.

Princípio do ensaio: A GGT catalisa a tranferência do grupo gama-glutamil do

substrato, gama-glutamil3-carboxi4-nitroanilido, para glicilglicina, produzindo 5-amino2-

nitrobenzoato. A alteração na absorvânca a 410/480 nm deve-se à formação de 5-amino2-

benzoato e é diretamente proporcional à atividade da GGT na amostra.(40)

Bilirrubina Direta e Bilirrubina Total

A bilirrubina é um produto resultante da quebra da hemoglobina. A porção do heme da

hemoglobina e de outras proteínas que contêm heme é removida e metabolizada em

bilirrubina.

A bilirrubina formada liga-se à albumina e é transportada para o fígado onde é

conjugada com ácido glucorónico (bilirrubina conjugada ou direta) para se tornar

solúvel e ser eliminada pelos canais biliares através do aparelho digestivo.(41) A bilirrubina

é um pigmento de cor amarela e o seu aumento faz com que a pele e mucosas tomem uma

coloração amarela por vezes intensa denominada icterícia.(39)

A icterícia pode ter origem:

Hemolítica: Aumento da destruição dos eritrócitos com consequente aumento

da produção de bilirrubina que ultrapassa a capacidade de conjugação e

metabolização do fígado fazendo elevar os níveis de bilirrubina não conjugada

(indireta) no sangue.



Hepatocelular: Imaturidade ou um défice congénito do sistema enzimático de

conjugação (doença de Gilbert), ou ainda secundário a infeções da célula hepática.

Colestática: Os canalículos biliares ficam bloqueados (cálculos, tumores...).

A obstrução do canal biliar ou as lesões da estrutura hepatocelular

causam aumentos dos níveis tanto da bilirrubina conjugada (direta) como da não

conjugada (indireta).

O autoanalisador Olympus, utiliza um método colorimétrico tanto para a determinação

quantitativa da bilirrubina direta, como para a determinação de bilirrubina total no soro.

Bilirrubina Direta

Princípio do teste: Um sal de diazónio estabilizado, 3,5-Diclorofenil-diazónio-

tetrafluorborato (DPD), liga-se diretamente à bilirrubina (conjugada) direta num meio

ácido para formar azobilirrubina. A absorvância a 570nm é proporcional à concentração

de bilirrubina direta na amostra.(42)

Bilirrubina Total

Princípio do teste: O sal DPD reage com a bilirrubina conjugada e com a bilirrubina

não conjugada na presença de um catalisador para formar a azobilirrubina. A absorvância

a 540 nm é proporcional à concentração de bilirrubina total. É efetuado um branco da

amostra separadamente para reduzir a própria interferência do soro.(41)

Avaliação da função renal

Para esta avaliação são determinados quantitativamente:

Tabela 19. Marcadores da função renal

Ureia

Creatinina

Clearance da creatinina

Microalbuminúria



Creatinina

A creatinina é um produto metabólico da creatina e fosfocreatina, que se encontram

ambos quase exclusivamente nos músculos. Por isto, a produção de creatinina é

proporcional à massa muscular e varia pouco de dia para dia.

As medições de creatinina são usadas no diagnóstico e tratamento de doenças renais e

revelam-se úteis na avaliação da função glomerular dos rins e na monitorização da diálise

renal.

A creatinina do soro varia em função da idade, peso corporal, raça e sexo do indivíduo.

Por vezes, é baixa em indivíduos com massa muscular relativamente reduzida, doentes

caquéticos, amputados e em pessoas de idade avançada. Um nível de creatinina no soro

que seria habitualmente considerado normal não exclui a presença de um quadro de

insuficiência renal.

A creatinina no soro, ou na urina, é determinada quantitativamente através de um

ensaio enzimático.

Princípio do ensaio: A creatinina é hidrolisada pela creatininase para formar

creatina. A creatina formada é hidrolisada pela creatinase para formar sarcosina e ureia. A

sarcosina oxidase catalisa a desmetilação oxidativa da sarcosina para formar glicina,

formaldeído e peróxido de hidrogénio. Na presença de peroxidase (POD), o peróxido de

hidrogénio formado reage por condensação de oxidação quantitativa com N-(3-

sulfopropril)-3-metoxi-5-metilanilina (HMMPS) e 4-aminoantipirina para formar um

pigmento azul. A concentração de creatinina é proporcional à alteração da absorvância a

600/700 nm.(43)

Clearance da creatinina

A clearance da creatinina permite avaliar a taxa de filtração glomerular (TFG). A

estimativa da taxa de filtração glomerular é calculada através da medição da concentração

de creatinina em urina de 24 horas e da sua concentração no soro.

TFG= çã

çã x 1.73 A

A- Superfície corporal



Microalbuminúria

O termo microalbuminúria indica uma taxa de excreção urinária de albumina de 30 a

300mg/dia.

O aparecimento de níveis baixos mas anormais de albumina na urina, não é detetado

em testes qualitativos convencionais (tiras de teste) para proteinúria. A microalbuminúria

é um marcador de risco estabelecido para a progressão da nefropatia na Diabetes Mellitus

e associa-se a mortalidade cardiovascular aumentada, não só em diabéticos, mas também

em indivíduos não diabéticos, acompanhando-se de um perfil de risco mais desfavorável.

A determinação quantitativa de albumina na urina é efetuada através de um teste

imunoturbidimétrico, em amostra de urina de 24h.

Princípio do ensaio: Quando uma amostra é misturada com tampão e solução

antissoro, a albumina humana reage especificamente com anticorpos de albumina anti-

humanos para produzir agregados insolúveis. A absorvância destes agregados é

proporcional à concentração de albumina na amostra.(44)

Ureia

A ureia é sintetizada no fígado como o produto final do metabolismo das proteínas e

dos aminoácidos. Por conseguinte, a síntese da ureia depende da ingestão diária de

proteínas e do metabolismo endógeno das proteínas. A maior parte da ureia produzida

durante estes processos metabólicos é eliminada por filtração glomerular, sendo que 40-

60 % volta a difundir-se no sangue, independentemente do caudal no túbulo proximal. A

redisseminação no túbulo distal depende do fluxo urinário e é controlada pela hormona

antidiurética.

Os níveis de ureia podem estar elevados devido a causas renais, nomeadamente

glomerulonefrite aguda, nefrite crónica, rim poliquístico, e necrose tubular.

As determinações de ureia e creatinina no soro são frequentemente realizadas em

conjunto no diagnóstico diferencial da função renal.

A ureia é determinada quantitativamente através de um ensaio UV cinético.

Princípio do teste: A ureia é hidrolizada na presença de água e urease para produzir

amónia e dióxido de carbono. O amoníaco produzido na primeira reação combina com 2-

oxoglutarato e NADH na presença de glutamato-desidrogenase (GLDH) para produzir

glutamato e NAD+. A redução de absorvânica de NADH por unidade de tempo é

proporcional à concentração de ureia.(45)



Outros Analitos

Glucose

Em jejum, os níveis de açúcar no sangue são controlados pelo fígado, que garante a sua

manutenção dentro dos limites exatos. A forma rápida e precisa em que os níveis de

açúcar no sangue no estado de jejum são controlados contrasta assinaladamente com o

aumento rápido do açúcar no sangue, que ocorre durante a ingestão de hidratos de

carbono.

A queda de glucose no sangue para um nível crítico conduz a disfunção do sistema

nervoso central. Tal se manifesta num estado de hipoglicémia, caracterizado por fraqueza

muscular, problemas de coordenação e confusão mental. As concentrações de glucose no

sangue revelam flutuações intraindividuais dependentes da atividade muscular e do

intervalo de tempo desde a ingestão de alimentos. Estas flutuações são ainda maiores

quando há descontrolo, tal como ocorre em vários estados patológicos nos quais a glucose

no sangue pode ser elevada (hiperglicémia) ou reduzida (hipoglicémia).

A medição de glucose no sangue é utilizada como ensaio de rastreio da diabetes

mellitus, quando existe suspeita de hiperglicémia, monitorização na terapia da diabetes

mellitus, avaliação do metabolismo dos hidratos de carbono, por exemplo na diabetes

gestacional, hepatite aguda, pancreatita aguda e doença de Addison.

A glucose é determinada quantitativamente no soro através de um ensaio UV

enzimático (método de hexoquinase).

Princípio do ensaio: A glucose é fosforilada pela hexoquinase (HK) na presença de

adenosina trifosfato (ATP) e de iões de magnésio para produzir glucose-6-fosfato e

adenosina difosfato (ADP). A glucose-6-fosfato desidrogenase (G6P-DH) oxida em

específico a glucose-6-fosfato para gluconato-6-fosfato com a redução concomitante de

NAD+ para NADH. O aumento na absorvância a 340 nm é proporcional à concentração de

glucose na amostra.(46)

Diabetes Mellitus

Na diabetes mellitus, a hiperglicémia ocorre com mais frequência como resultado de

uma insuficiência na quantidade ou eficácia da insulina. A diabetes mellitus pode ser:



Tabela 20. Tipos de Diabetes

Tipo 1 Destruição das células Beta do pâncreas, levando a insulinopenia

absoluta (autoimune ou idiopática).

Tipo 2 Ocorre predominantemente por insulinorresistência, com

insulinopenia relativa, ou por um defeito secretor predominante,

coexistindo, frequentemente ambas as alterações.

Diabetes

Gestacional

Caracterizada por qualquer grau de intolerância que aparece pela

primeira vez durante a gravidez.

Outros tipos

específicos de

Diabetes

Defeitos genéticos da célula pancreática, Endocrionopatias,

Defeitos genéticos na ação da insulina, etc.

Hemoglobina glicada (HbA1c)

A hemoglobina glicada (HbA1c) resulta da glicação não enzimática de grupos amínicos

livres no terminal N da cadeia beta de hemoglobina A0. O nível de HbA1c é proporcional

ao nível de glucose no sangue. Uma vez que a glucose permanece ligada ao eritrócito

durante o seu ciclo de vida, a medição de HbA1c fornece uma indicação da concentração

média diária de glucose no sangue durante os 2 meses anteriores.

Por conseguinte, a medição de HbA1c é considerada uma importante ferramenta de

diagnóstico na monitorização do controlo dietético e dos regimes terapêuticos durante o

tratamento da diabetes.

A HbA1c é determinada quantitativamente em sangue total, no autoanalisador

Olympus através de um ensaio de imunoinibição.

São determinadas as concentrações de HbA1c e hemoglobina total. A relação

HbA1c/hemoglobina total é expressa como uma percentagem de HbA1c (%HbA1c). O

ensaio para percentagem de HbA1c, implica a utilização de 4 reagentes: Hemoglobina total

R1, reagente anticorpo HbA1c R1, reagente aglutinador HbA1c R2, e Desnaturante de

hemoglobina (comercializado separadamente).

Princípio do ensaio: Numa fase de pré tratamento, o sangue total é misturado com

desnaturante de Hb numa solução diluída de 1:41 (500 L desnaturante + 5L sangue

total) e incubado durante um mínimo de 5 min à temperatura ambiente. Os eritrócitos são

fragmentados e a cadeia de Hb é hidrolisada através da protesae presente no reagente.



A Hb total é medida através da conversão de todos os derivados de Hb em hematina

alcalina na solução alcalina de um detergente não iónico. A adição de amostra de sangue

pré-tratada ao reagente de Hb total resulta numa solução verde, a qual é medida a 600nm.

A HbA1c é medida num ensaio de inibição de aglutinação de látex. Um aglutinador,

consistindo num polímero sintético contendo múltiplas cópias da porção imunorreativa

de HbA1c, provoca a aglutinação do látex revestido com anticorpos no HbA1c R1 e o

aglutinador no HbA1c R2 serão aglutinadas.

A aglutinação leva a um aumento na absorvância da suspensão. A presença de HbA1c

na amostra resulta numa diminuição da taxa de aglutinação da HbA1c R1 e do aglutinador

no reagente HbA1c R2. Por conseguinte, o aumento da absorvância é inversamente

proporcional à concentração de HbA1c na amostra. O aumento da absorvância devido a

aglutinação é medido a 700 nm.(47)

Colesterol

O colesterol é sintetizado de modo permanente em todo o organismo e é um

constituinte essencial das membranas celulares e das lipoproteínas e é igualmente um

percursor de importantes compostos biologicamente ativos como as hormonas esteroides,

sais biliares e vitamina D.

O colesterol é sobretudo transportado em 2 classes de lipoproteínas (LDL e HDL), as

quais desempenham um papel contraditório na patogénese das perturbações lipídicas.

Assim, a concentração de colesterol total proporciona apenas um valor de base que indica

se devem ser levadas a cabo mais investigações laboratoriais do metabolismo de

lipoproteínas (HDL, LDL e triglicerídeos).

O colesterol é quantificado no autoanalisador Olympus através de um ensaio

enzimático colorimétrico.

Princípio da reação: Os ésteres de colesterol são hidrolisados pela colesterol

esterase (CHE). A colesterol oxidase converte o colesterol em colesteno-3-ona produzindo-

se simultaneamente peróxido de hidrogénio (H2O2), o qual acopla oxidativamente com a

4-aminoantipirina e fenol na presença de peroxidase (POD), produzindo um cromóforo

(cor vermelha). O corante vermelho de quinoneimina pode ser medido

espectrofotometricamente a 540/600 nm, sendo proporcional à concentração de

colesterol na amostra.(48)

Para além do colesterol total, são também quantificados o HDL e o LDL colesterol.



Triglicerídeos

Na alimentação humana, os triglicerídeos são os ésteres de glicerol com maior

prevalência. A determinação dos triglicerídeos pode ser utilizada para o diagnóstico e

tratamento de doentes com pancreatite aguda e crónica, diabetes mellitus, obstrução biliar

extra-hepática e outras patologias que envolvam o metabolismo lipídico.

A determinação de triglicerídeos é efetuada através de um ensaio enzimático

colorimétrico.

Princípio do teste: Este ensaio baseia-se numa série de reações enzimáticas

conjuntas. Os triglicerídeos da amostra são hidrolisados através da combinação de lípases

microbianas, produzindo glicerol e ácidos gordos. Na presença da glicerol quinase (GK), o

glicerol é fosforilado através do ATP, originando glicerol-3-fosfato. O glicerol-3-fosfato é

oxidado pela glicerol fosfato oxidase (GPO) produzindo peróxido de hidrogénio (H2O2) e

dihidroxiacetona fosfato. O H2O2 formado reage com a 4-aminofenona e N,N-bis (4-

sulfobutil)-3,5-dimetilanilina, sal dissódico (MADB) na presença de peroxidase (POD)

originando o cromóforo, que é lido espectrofotometricamente a 660/800nm. O aumento

da absorvância é proporcional ao conteúdo de triglicerídeos na amostra.(49)

4.2 Análise de Urina tipo II

A análise de urinas tipo II é efetuada no aparelho Urisys (Fig. 16), usando tiras de teste.

Estas são utilizadas para a determinação de certos constituintes na urina indicativos de

alterações renais, urinárias, hepáticas e metabólicas.

Figura 16. Urisys 2400

O URISYS 2400 é um fotómetro de refletância totalmente automatizado para medições

semi quantitativas de tiras de teste de urina.(50)

Nas tiras de teste são analisados parâmetros como o pH, leucócitos, nitritos, proteínas,

glucose, corpos cetónicos, urobilinogénio, bilirrubina, sangue.



Na tabela seguinte são referidos os testes efetuados em cada tira e o seu princípio:

Tabela 21. Tiras de teste – Urina tipo II

Teste Princípio do Teste

pH

A zona de teste contém os indicadores de pH vermelho de metilo,

fenolftaleína e azul de bromotimol e reage especificamente com os iões de

H+. O valor mais comum é um pH entre 5,5 e 6.

Leucócitos

O teste revela a presença de esterases granulocitárias. Estas esterases

decompõem um éster indoxílico em indoxil, que reage com um sal de

diazónio produzindo um corante violeta. Em geral, a presença de

leucócitos na urina é sugestiva de infeção urinária.

Nitritos

A reação revela a presença de nitritos e, indiretamente, de bactérias

produtoras de nitritos na urina, através de uma coloração rosa-

vermelhada na zona de teste. Uma ligeira coloração rosa já indica

bacteriúria significativa.

Proteínas O teste baseia-se no princípio do erro proteico de um indicador de pH. A

reação é particularmente sensível à albumina.

Glucose

A determinação é baseada na reação específica da glucose-

oxidase/peroxidase (método GOD/POD). O teste é independente do pH e

da gravidade específica da urina e não é afetado pela presença de corpos

cetónicos. A presença de glicose na urina é um forte indício de que os

níveis sanguíneos estão altos. Valores elevados de glucose na urina, sem

elevados valores de glucose no sangue indicam doença dos túbulos renais.

Corpos

cetónicos

O teste baseia-se no princípio da prova de Legal. A sensibilidade para o

ácido acetoacético é superior à da acetona. Corpos cetónicos na urina:

ácido acetoacético, acetona e Beta-hidroxibutírico, aparecem em

determinados estados fisiológicos e patológicos. São derivados

principalmente do metabolismo dos ácido gordos tendo origem hepática.

Urobilinogénio

Um sal de diazónio estável reage quase instantaneamente com o

urobilinogénio, originando um corante azoico vermelho. A presença de

urobilinogénio na urina, é indicativa de alterações hepáticas.

Bilirrubina O teste baseia-se na ligação da bilirrubina a um sal de diazónio. Uma

coloração ligeiramente cor-de-rosa já constitui um resultado positivo, ou

seja, patológico.



Sangue/

Eritrócitos

A ação, semelhante á peroxidase, da hemoglobina e da mioglobina catalisa

especificamente a oxidação do indicador através do peróxido de

hidrogénio orgânico contido na zona de teste, originando uma coloração

azul- esverdeada.

Zona de

compensação

Esta zona branca, que não contém reagentes, permite uma compensação,

por parte do analisador, para a cor intrínseca da urina quando está a

avaliar os parâmetros relativos aos leucócitos, nitritos, proteínas, glucose,

corpos cetónicos, urobilinogénio e bilirrubina.

No Urisys 2400, os resultados são automaticamente calculados e posteriormente

impressos no relatório em termos de “normal”, “negativo”, “positivo” ou valores de

concentração. Tal como os resultados obtidos por comparação visual de cor, cada valor

impresso corresponde a um intervalo de concentrações definido.

4.3 Sedimento urinário

O exame a fresco do sedimento urinário permite verificar a existência de cristais ou

cilindros na urina, e fazer contagem de células presentes no sedimento. Permite também,

a observação de Trichomonas vaginalis (parasita) e de bactérias.

4.4 Teste de gravidez na urina

Para realizar o teste de gravidez em urina, neste laboratório recorre-se a um teste

rápido, qualitativo, de elevada especificidade e sensibilidade, para a determinação da

hormona hcG (gonadotrofina coriónica humana), um marcador para a gravidez em

amostras de urina.

A hcG é secretada através dos tecidos da placenta durante a gravidez, sendo depois

excretada na urina, aproximadamente, 20 dias após o último período menstrual.

Princípio do teste: Imunocromatografia em membrana. À medida que a amostra de

teste flui através da membrana, o conjugado coloidal dourado anti-hcG complexa com o

hcG da amostra. Este complexo move-se para o interior da membrana (região de teste)

onde é imobilizado pelo anti-hcG monoclonal que reveste a membrana, provocando assim

a formação de uma linha rosada que confirma um resultado positivo do teste. A ausência

desta linha rosada na região de teste indica um resultado negativo (Fig. 17).(51)



Figura 17. Resultado positivo e Resultado negativo

O conjugado que não reagiu e o complexo não ligado, se existirem, continuam a mover-

se ao longo da membrana e são finalmente imobilizados pelos anticorpos anti

camundongo que estão embebidos na região de controlo “C” formando uma linha rosada.

Esta linha de controlo serve para validar os resultados do teste.

4.5 Pesquisa de sangue oculto

É efetuada recorrendo a um teste rápido e específico para a deteção qualitativa de

hemoglobina humana em amostras de fezes.

A pesquisa de sangue oculto (PSO) nas fezes permite detetar indícios de distúrbios

gastrointestinais como o cancro do intestino ou hemorroidas graves.

O cancro intestinal é um dos tipos de cancro diagnosticado mais frequentemente e uma

das causas mais comuns de mortes relacionadas com cancro. A PSO permite detetar esta

patologia numa fase inicial do seu desenvolvimento.

Princípio do teste: Imunocromatografia em membrana. Ocorre uma reação de

anticorpos específicos que detetam a hemoglobina. A amostra de fezes que contém

hemoglobina reage com anticorpos monoclonais específicos que estão vinculados a

partículas de ouro. Este complexo espalha-se pela membrana e alcança a linha de teste (T),

que está pré-revestida por anticorpos anti-hemoglobina.(52)

O aparecimento de uma linha rosada na zona de teste indica que o teste é positivo, pelo

contrário, a ausência desta mesma linha indica que o teste é negativo.

4.6 Eletroforese de Proteínas Séricas

As proteínas do soro podem ser separadas por eletroforese em duas frações principais

sendo uma a fração de albumina e a outra constituída pelas globulinas, as quais se

diferenciam da albumina por apresentarem maior tamanho e peso molecular.

A separação é possível porque as proteínas possuem mobilidade específica quando

sujeitas a um campo elétrico.



As moléculas carregadas deslocam-se mais ou menos rapidamente dependendo da

carga, tamanho, forma, etc. Na Figura 18 está representado um perfil normal das

proteínas do soro.

Figura 18. Perfil electroforético normal

Neste laboratório a eletroforese de proteínas é realizada no aparelho Microgel (Fig. 19)

da INTERLAB.

Figura 19. Microgel

Princípio do teste: As proteínas são separadas a um pH alcalino (8.9) por

eletroforese de zona em placas de gel de agarose. Permite a obtenção de cinco bandas: a

albumina, e 4 globulinas (alfa1, alfa 2, beta e gama). Cada fração de globulina contém

diferentes proteínas. Quando a separação eletroforética das bandas está completa a placa

de gel de agarose é desnaturada, corada com amido black, descorada e seca. É feita uma

leitura por densitometria e os resultados são apresentados graficamente.(53)

A eletroforese de proteínas séricas é bastante útil na monitorização de pacientes por

longos períodos de tempo, quando existem alterações específicas nos níveis de

determinadas proteínas, como no mieloma múltiplo, síndrome nefrótico e cirrose por

exemplo.(54)

Neste laboratório, a eletroforese de proteínas é realizada entre uma a duas vezes por

semana, em conjuntos de 13 ou 26 pacientes. Os resultados obtidos são essencialmente,

perfis normais. Poderá no entanto dizer-se, que um dos perfis anormais mais encontrados



no âmbito deste estágio foi o perfil eletroforético do processo inflamatório, em que se

verifica um aumento das proteínas alfa-1 e alfa-2.

4.7 Controlo de Qualidade no setor da Bioquímica

Autoanalisador Olympus AU 600:

Precinorm e Precipath: são aceites valores compreendidos entre +1sd e -1sd das

cartas controlo do mês anterior (ou mudança de lote do controlo).

Entre +/- 1 sd e +/- 2 sd, aceitar apenas se aprovado pela Diretora Técnica.

Diariamente, são calibrados os ionogramas e antes do início dos trabalhos são

passados os controlos. Se os valores do controlo, se encontrarem fora dos limites +1sd e -

1sd, recorre-se à calibração.

Existe um calibrador universal, e calibradores para a hemoglobina glicada, para a

microalbuminúria, para a 5-NU, e para os ionogramas.

Amostra aleatória: repetir as análises de uma amostra (qualquer) da primeira série,

na última posição da ultima série.

Microgel:

As urgências são feitas normalmente em duplicado, e as repetições, servem de

termo de comparação



Conclusão

A realização deste estágio permitiu-me conhecer o funcionamento diário de um

Laboratório de Análises Clínicas.

Foi-me possível entender a importância e dinâmica das diferentes fases analíticas que

estão envolvidas no processo analítico. Também a passagem por diferentes valências me

permitiu entender a interligação que existe entre elas, e a sua importância ao relacionar

diferentes variáveis num boletim clínico.

Considero por isto, que a realização deste estágio foi uma mais valia na minha

formação quer académica quer pessoal.



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