A microbiota humana e sua importância para a

saúde humanaLuis Caetano Martha Antunes, Ph.D.Pesquisador em Saúde PúblicaEscola Nacional de Saúde Pública Sergio AroucaFundação Oswaldo Cruzantunes@ensp.fiocruz.br2448-6886

Microrganismos: amigos ou inimigos?

• Doenças

• Infecções

• Mal-estar

• Sintomas

• Patogenicidade

= ??

O Pulso-Titãs

Peste bubônicaCâncer, pneumoniaRaiva, rubéolaTuberculose e anemiaRancor, cisticercoseCaxumba, difteriaEncefalite, faringiteGripe e leucemia…

Hepatite, escarlatinaEstupidez, paralisiaToxoplasmose, sarampoEsquizofreniaÚlcera, tromboseCoqueluche, hipocondriaSífilis, ciúmesAsma, cleptomania...

Reumatismo, raquitismoCistite, disritmiaHérnia, pediculoseTétano, hipocrisiaBrucelose, febre tifóideArteriosclerose, miopiaCatapora, culpa, cárieCãibra, lepra, afasia...

E o pulso ainda pulsa…

Microrganismos são em sua grande maioria inócuos ou benéficos

A microbiota humana

• Bactérias, arqueas, vírus, protozoários

• Podem ser comensais ou simbióticos

• Microbiota, microflora, flora, flora normal, microbiota anfibiôntica, microbioma

Conjunto de microrganismos que convive em harmonia com o hospedeiro, não causando

nenhum malefício

A microbiota humana

Um consórcio complexo de microrganismos

• 100.000.000.000.000 de células

• 1 Kg de bactérias

• 10x o número de células humanas

• 100x o número de genes humanos

• >200 gêneros, >1.000 espécies, >7.000 cepas

• Coletivamente a microbiota humana >35.000 espécies

A microbiota humana e sua diversidade

Kyrpides. 2009. Nat. Biotechnol. 27(7):627-632

Onde estão esses microrganismos?

• Cavidade oral

• Estômago

• Intestino delgado

• Intestino grosso

• Trato genito-urinário

• Trato respiratório

• Pele

• Olhos

Onde estão esses microrganismos?

Trato gastrointestinal70%

Outros30%

• Cavidade oral

• Estômago

• Intestino delgado

• Intestino grosso

• Trato genito-urinário

• Trato respiratório

• Pele

• Olhos

Onde estão esses microrganismos?• Distribuição heterogênea latitudinal

Sekirov et al. 2010. Physiol. Rev. 90:859-904

Onde estão esses microrganismos?

• Distribuição heterogênea longitudinal

Sekirov et al. 2010. Physiol. Rev. 90:859-904

Fatores determinantes de colonização

• Distribuição de nutrientes

• Concentração de oxigênio

• pH

• Sítios de ligação

• Presença de substâncias inibitórias (por exemplo, bile)

• Temperatura

• Disponibilidade de água

• Outras espécies (ou moléculas) presentes

De onde vem esses microrganismos?

• Colonização ocorre durante o parto

• Microbiota vaginal ≈ microbiota do recém nascido

• Cesariana x parto normal recém-nascidos tem microbiota distinta

• Estudos com gêmeos fraternos e idênticos microbiota da mãe é um fator determinante

Estabilidade da microbiota

• Primeiro ano de vida microbiota simples e “instável”

• Após primeiro ano estabilização, semelhante ao adulto

Sekirov et al. 2010. Physiol. Rev. 90:859-904

Microbiota x hospedeiro: co-evolução

• Microbiota e hospedeiro conviveram por milhões de anos adaptação mútua• Microbiota evoluiu para exercer efeitos no hospedeiro• Hospedeiro evoluiu para manipular a microbiota

• Transplante entre microbiotas de camundongos e peixes microbiota retorna à sua composição natural

• Estudos com animais “germ-free” vários efeitos de componentes da microbiota na fisiologia do hospedeiro

Quem são esses microrganismos?

Costello et al. 2009. Science. 326(5960):1694-1697.

Quem são esses microrganismos?

Costello et al. 2009. Science. 326(5960):1694-1697.

Quem são esses microrganismos?

Costello et al. 2009. Science. 326(5960):1694-1697.

Quem são esses microrganismos?

Costello et al. 2009. Science. 326(5960):1694-1697.

Fatores que influenciam a microbiota

Microbiota

Consequências

Estado nutricionalComportamento

Susceptibilidade a doenças

Dieta Exercício Remédios

Doenças locaisDoenças sistêmicas

Genética

Microbiota materna HigieneIdade

Estado hormonal

Modelos de estudo da microbiota

• Animais com microbiota manipulada

• Tratamento com antibióticos, prebióticos ou probióticos

• Introdução de espécies ou moléculas

• Monitoramento dos efeitos

Sekirov et al. 2008. Infect. Immun. 76(10):4726-4736.

Modelos de estudo da microbiota

• Animais “germ-free”• Obtidos através de cesariana• Mantidos em ambiente estéril• Microbiota completamente ausente

• Introdução de espécies (uma, duas, várias)

• Inoculação com moléculas

• Monitoramento dos efeitos

Papéis fundamentais da microbiota• Desenvolvimento do sistema imune

• Regulação energética• Degradação de carboidratos complexos• Ativação da assimilação de nutrientes• Síntese de vitaminas

• Proteção contra patógenos invasores• Competição por nutrientes• Competição por sítios de ligação• Produção de antibióticos• Produção de bacteriocinas

Desenvolvimento do sistema imune• Estudos com camundongos “germ-free”, sem microbiota

• Animais “germ-free”: • Número alterado de diversas células do sistema imune• Estruturas linfóides alteradas• Baço, linfonodos e Placas de Peyer mal desenvolvidos• Número de células B produtoras de IgA reduzido• Níveis de IgA e IgG secretadas reduzido• Perfil de citocinas alterado• Desenvolvimento de tolerância oral reduzido

• Efeito da microbiota é drástico mas não surpreende maior fonte de antígenos para o sistema imune

Regulação energética• Observação de que animais “germ-free” precisam

consumir mais calorias

• Microbiota metabolismo de fibras da dieta transformação em ácidos graxos fontes de energia

• Modulação da expressão de lipases importantes para o metabolismo de lipídios

• Modulação da absorção de ácidos graxos em adipócitos

Proteção contra patógenos invasores• Observações sobre o efeito de antibióticos na susceptibilidade a

infecções

• Colite pseudomembranosa:• Causada por Clostridium difficile• Tratamento com antibióticos de amplo espectro, clindamicina,

cefalosporinas

• Modelos animais:• Camundongos tratados com antibióticos• Aumento da susceptibilidade a infecções entéricas

Doenças associadas à microbiota

• Doenças locais• Doença inflamatória intestinal• Câncer• Colite pseudomembranosa

• Doenças sistêmicas• Obesidade• Diabetes• Alergia• Autismo

Doença Inflamatória Intestinal

• Inflamação descontrolada

• Lesões disseminadas pelo intestino

• Causa desconhecida

• Envolvimento da microbiota:• Microbiota aberrante em DII• Antibióticos controle dos sintomas• Reação imune excessiva a epítopos microbianos• Alta incidência de E. coli, Mycobacterium avium• Baixa incidência de Faecalibacterium prausnitzii

• Causa ou consequência?

Câncer• Gastrite úlcera carcinoma gástrico

• Originalmente stress, genética

• Infecção por Helicobacter pylori• Inflamação excessiva• Efeitos citotóxicos diretos• Metabolismo de nutrientes

• 50% da população mundial carreadora

• Carcinoma intestinal microbiota alterada

• Clostridium, Bacteroides, Bifidobacterium causadores

• Lactobacillus, Eubacterium protetores

Obesidade• Importância da microbiota para nutrição

• Camundongos geneticamente obesos redução de Bacteroidetes e aumento de Firmicutes

• Microbiota de humanos obesos e magros composição semelhante

• Camundongos obesos dieta microbiota “magra”

• Transplante de microbiota, animais “germ-free”:• Microbiota “obesa” animal obeso• Microbiota “magra” animal magro

• Microbiota “obesa” aumento de enzimas de degradação de carboidratos complexos

Autismo• Uso excessivo de antibióticos autismo tardio

• Anormalidades gastrointestinais comuns em pacientes autistas

• Sintomas de autismo reduzidos após tratamento com antibióticos e probióticos retornam após tratamento

• Clostridium spp. abundância 10X maior em autistas

• Antibióticos que não afetam Clostridium correlação doença

• Antibióticos que afetam Clostridium correlação cura

• Mecanismos em potencial:• Produção de neurotoxinas• Autoimunidade• Metabólitos tóxicos

Interações microbianas na microbiota humana

• Mecanismos pouco elucidados

• Uso de moléculas para modular outros componentes do sistema

• Uso de moléculas pequenas em sinalização intercelular• Hospedeiro microbiota • Microbiota hospedeiro• Microbiota patógenos• Patógenos microbiota• Patógeno hospedeiro• Hospedeiro Patógeno

Interações microbianas na microbiota humana

Sekirov et al. 2010. Physiol. Rev. 90:859-904

Técnicas de estudo da microbiota

• Métodos de cultivo e isolamento de microrganismos: • Plaqueamento de amostras em meio rico • Uso de meios seletivos• Uso de meios indicadores• Método mais clássico• Simples• Barato• Não diferencia espécies ou cepas

>80% da microbiota intestinal não pode ser cultivada!!!

Técnicas de estudo da microbiota• Cultivo de comunidades microbianas:

• Estudo do consórcio como um todo• Permite a manipulação da comunidade• Permite crescimento de alguns “não-cultiváveis”

Técnicas de estudo da microbiota• Métodos moleculares independentes de cultivo:

• Análise de DNA, RNA, proteínas ou metabólitos• Modernos• Podem ser complexos• Mais caros• Diferenciam espécies e cepas• Teoricamente 100% da microbiota pode ser analisada

• Sequenciamento total de rDNA 16S• Denaturing Gradient Gel Electrophoresis• Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism• Ribosomal Intergenic Spacer Analysis• Fluorescence In Situ Hibridization• Microarrays

• PCR quantitativo• Metagenômica• Metabolômica• Metaproteômica• Metatranscriptômica

Metagenômica

• Simples• Custo total alto• Custo por base baixo• Cobertura “ilimitada”

Comunidade microbiana

Loman et al. 2012. Nat. Rev. Microbiol. 10:599-606

Curiosidades: Controle hormonal

• Pílula contraceptiva uso de antibióticos diminuição da eficácia

• Mecanismos desconhecidos

• Uso de antibióticos destruição da microbiota desregulação hormonal

antibióticos

Antunes et al. 2011. Antimicrob. AgentsChemother. 55(4):1494-1503

Curiosidades: Transplante fecal

• Uso de antibióticos destruição da microbiota infecções oportunistas

• Infecção por Clostridium difficile colite pseudomembranosa• Difícil de tratar• Recorrente

O estudo da microbiota continua crescendo

Sekirov et al. 2010. Physiol. Rev. 90:859-904

• Novos microrganismos

• Novas moléculas: drogas anti-infecciosas, antibióticos, drogas imunomodulatórias…

• Novas curas!

O estudo da microbiota continua crescendo

Entendimento de SAÚDE e DOENÇA

Protection

Competition

Immune responsesDisease

Immune deve

lopment

Metabolism

COMMENSALS

HOSTPATHOGENS