A vida sem microrganismos não seria possível! Abordagens ... · da diversidade microbiana Teresa Lino Neto ... Importantes no desenvolvimento de Engenharia Genética… … e utilizados

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Abordagens moleculares no estudo da diversidade microbiana

Teresa Lino Neto

[email protected]

Departamento de Biologia | Universidade do Minho

A vida sem microrganismos não seria possível!

1 – Importantes agentes decompositores

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Participação em diversos ciclos biogeoquímicos (ex: ciclo do azoto, entre outros)

2 – Importantes na reciclagem de nutrientes 3 – Elevada importância na saúde

- como causadores de diversos distúrbios

3 – Elevada importância na saúde

- como produtores de compostos farmacológicos (ex: antibióticos)

- Contribuindo para a normal fisiologia animal (ex: flora intestinal)

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4 – Elevada importância no sector alimentar

- Processos fermentativos para produção de alimentos

- Contaminação de alimentos

(desenvolvimento de medidas de controlo microbiológico)

2

5 – Importantes no desenvolvimento de Engenharia Genética…

… e utilizados em inúmeros processos Biotecnológicos

Infecção com Agrobacterium

Clonagem de DNA

6 – Elevada importância para a agricultura

- como causadores de diferentes patologias

- como agentes de controlo biológico de agentes patogénicos e de pragas

Infecçõesvirais

Infecçõesbacterianas Infecções

fungicas


- Pelo estabelecimento de associações simbióticas

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Micorrizas (planta-fungo)

Nódulos (planta-bactéria)


- Aumentam a disponibilidade de nutrientes

- Responsáveis pelo efeito supressor do solo

Como foram identificados os microrganismos?

1. Colheita de amostras

2. Cultura e isolamento em meios apropriados

3. Pesquisa de caracteres fenotípicos 3. Pesquisa de caracteres fenotípicos

Biomedical an d Life Sciences (2008) 93, 407-413

The EMBO Journal (2002) 21, 5448 - 5456

Características culturais

Aspectosmorfológicos

3

3. Pesquisa de caracteres fenotípicos

Estruturas reprodutoras

http://sharon-taxonomy2009-p3.wikispaces.com/file/view/

fungi/100274173/fungi

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Ensaios bioquímicos (testes de sensibilidade e metabolismo)

Teste API

Coloração Gram

Utilização de meios

selectivos

Que problemas podem surgir na identificação “tradicional” da diversidade microbiana?

Os métodos moleculares ultrapassam muitas destas

dificuldades

Apenas 1% dos microrganismos unicelulares são cultiváveis

- Os indivíduos têm primeiro de ser isolados e cultivados em laboratório

- Muitos ensaios bioquímicos só podem ser utilizados em microrganismos com crescimento rápido

- As características fenotípicas e bioquímicas dependem fortemente do ambiente (meio de cultura)

Fusarium oxysporum, em diferentes marcas de PDA

Ribossomas 70S

Subunidade maior 50S

Subunidade menor 30S

Pré-rRNA (30S)

RNA 16S (1541 nt)

RNA 23S (2904 nt)

RNA 5S (120 nt)

A técnica mais comum e simples é a amplificação de zonas variáveis do genoma, recorrendo às suas zonas estáveis

Procariotas

V1 V2 V3 V4 V6 V7 V8 V9

1,542 pb

Menos de 500 pb são hipervariáveis


Procariotas


Ribossomas 80S

Subunidade maior 60S

Subunidade menor 40S

Pré-rRNA (45S)

RNA 18S (1900 nt)

RNA 28S (4700 nt)

RNA 5S (120 nt)

RNA 5,8S (160 nt)

Eucariotas

4


EucariotasProcariotas

Fungos

Utilização de bases de dados contendo rDNA de microrganismos para identificação

≈ 100,000 sequências no

GenBank


GenBank


UNITE

A identificação baseada em sequências de DNA é rápida e eficaz, mas…

(A)Ainda não existe concordância no locus mais apropriado

(B)Ainda não existem bases de dados de qualidade controlada

(C) Ainda não estão definidos o número de nucleótidos variáveisque definem uma espécie

Para além de rDNA, outras sequências génicas podem ser utilizadas

β-tubulina

RPB2(RNA polimerase II)

Esta estratégia de identificação molecular está na base do “DNA barcoding” para avaliar a diversidade biológica

O género Coprinus pode serfacilmente reconhecido pelo

facto de as lâminas contendo osesporos se dissolverem num

fluído negro, logo após a maturação do esporos

Coprinus comatus

Coprinus bellulus

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A utilização de novas abordagens conduziram a novas classificações

A análise de DNA demonstrou que nem todospertencem ao mesmo género, muitos dos quais nemsequer pertencem à família Agaricaceae (mas sim à famíliaPsathyrellaceae)

Coprinellus heterothrix(=Coprinus heterothrix)

Coprinopsis picacea(=Coprinus picaceus)

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Coprinellus micaceus(=Coprinus micaceus)

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Diversidade Diversidade Diversidade Ecológica Genética de Organismo

Biomassa

Bio-regiões

Paisagem

Ecossistema

Habitat

Nichos

Populações

Populações

Indivíduos

Cromossomos

Genes

Nucleotídeos

Reino

Filo

Família

Género

Espécie

População

Individuo

Existem vários tipos de diversidade…

A diversidade envolve dois componentes:

- Variedade (quem/quais são?)

- Abundância relativa (quantos são?)

variedade genética variedade de espécies variedade de funções

Como pode ser avaliada a diversidade microbiana de um dado habitat?

Recolha da

amostra

Extração de DNA

PCR de 26S rDNAprimer fluorescente

Análise de múltiplos fragmentos (T-RFLP)

Digestão com enzima de

restriçãoElectroforese

capilar

Análise de múltiplos fragmentos (DGGE/TGGE)

Recolha da

amostra

Extração de DNA

PCR de 26S rDNA

Electroforese em condições desnaturantes



Redução da mobilidade electroforética de fragmentos parcialmente desnaturados

Os fragmentos desnaturam em diferentes locais do gel, parando a sua migração

Este tipo de gel (gel perpendicular)

permite determinar o tipo de gradiente a utilizar numa experiência

A amostra é aplicada em toda a extensão do gel

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A optimização do tempo de electroforese é efectuada pela aplicação regular da amostra num gel em gradiente

Zona de desnaturação

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Os fragmentos desnaturam em diferentes locais do gel, parando a sua migração

Amostras contendo uma mistura de fragmentos de 26S rDNA, podem ser analisadas simultaneamente

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6

Recolha da

amostra


Uma janela para o Universo Microbiano

Metagenómica


O poder da análise genética é aplicado a toda a comunidade

microbiana, evitando a necessidade de isolar

individualmente cada espécie.

Uma janela para o Universo Microbiano

Metagenómica

Sequenciação tradicional

> 20,000 clones BAC ≈ 100 kb

subclonado

cada BAC é fragmentado em porções de 2-3 kb

sequenciado

alinhado

O caso do projecto do genoma humano…

Consórcio público


sequenciado

alinhado

O caso do projecto do genoma humano…

Celera genomics

A tecnologia de “shotgun”

> 20,000 clones BAC ≈ 100 kb


The Scientist 2004, 18(18):44

Método de sequenciação de Sanger

Sequenciação tradicionalSequenciação efectuada em sequenciadores capilares

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DNA a sequenciar

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Sequenciação efectuada em sequenciadores capilares

Sequenciação pelo método de Sanger

Tecnologia de sequenciação de nova geração

• Utilização de técnicas de sequenciação massivas em paralelo (ex: plataforma 454, Solexa, SOLiD)

• Preparação mais directa das amostras a sequenciar

O DNA genómico é fragmentado (não há clonagem)

São ligados adaptadores

São seleccionados os fragmentos com ambos os adaptadores (A e B)


• Amplificação dos fragmentos a sequenciar por PCR de emulsão

É mantida uma proporção para que cada microesfera de agarose se ligue a uma única sequência de DNA

As microesferas são capturadas individualmente em micelas onde ocorre o PCR em emulsão

São seleccionados os fragmentos com ambos os adaptadores (A e B)


• Aplicação dos fragmentos nos poços da placa

Cada microesfera (28 µm) é capturada em poços (44 µm) na placa de sequenciação (PicoTiterPlate – PTP)

Pequenas esferas contendo os componentes da reacção são adicionados


• A polimerização ocorre no pirosequenciador (Roche/454 FLX)

Podem ser sequenciadas 400,000 sequências em paralelo


• O princípio da sequenciação

A sequenciação é realizada por ciclos TCAG

1 nt ligado = 1 PPi liberto

1 PPi liberto = 1 ATP produzido (acção da ATP sulfurilase)

1 ATP produzido = 1 oxiluciferina(acção da luciferase)

Degradação de dNTP não-incorporado por apirase

APS - adenosine 5´phosphosulfate

8


• O princípio da sequenciação

Recolha da

amostra


Extração de DNA

PCR de 26S rDNA

Sequência de todos os 26S rDNApresentes na

população microbiana


Sequência de todos os 26S rDNApresentes na

população microbiana

Bases de dados de sequências

Potencial identificação de todas as bactérias presentes

no habitat

A diversidade microbiana está actualmente a ser explorada em diferentes ambientes

No solo

No mar e no ar

Em animais e no homem

Ártico

Solos contaminados

Em plantas

Descargas de águas residuais

A diversidade recentemente descoberta do picoplankton (< 2µm) nos oceanos, elevou de forma surpreendente as

estimativas de diversidade dos microrganismos

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A proporção dos organismos ainda poderá sofrer alterações

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30 -

2007

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Agradecimentos

Paula Baptista (ESAB - IPB)

Sandra Chaves (Fac. Ciências da Universidade de Lisboa)

Ivo Oliveira (ESAB - IPB)

PTDC/AGR-AAM/099556/2008

Mestrado em Biologia Molecular, Biotecnologia

e Bioempreendedorismo em Plantas

Mestrado 3BP

Fisiologia Molecular de

Plantas

Biotecnologia e Bio-Empreendedorismo em Plantas Aromáticas e

Medicinais

UNIDADES CURRICULARESÁREA

CIENTÍFICAECTS

Biorreactores e Processos de Separação ENGBIO 6

Bioempreendedorismo G 6

Opção I /Cursos Avançados* BMP/BV 6

Opção II /Cursos Avançados* BMP/BV 6

Opção III /Cursos Avançados* QA 6

Mestrado 3BPUm mestrado – Dois perfis

UNIDADES CURRICULARES ÁREA CIENTÍFICA ECTS

Bioquímica e Fisiologia Molecular BMP 6

Metabolismo Secundário e Compostos Bioactivos BV 6

Biotecnologia Vegetal BV 6

Engenharia Genética de Plantas e Bioinformática BMP 6

Estratégia e Marketing de Biotecnologia G 6

* Pela frequência das opções, o aluno poderá escolher um percurso com um carácter mais biotecnológico e aplicado ou mais científico

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