ABA: Metabolismo e ABA: Metabolismo e mecanismo de ação.mecanismo de ação.

Cristina Filomena JustoCristina Filomena Justo

Fisiologia Vegetal AvançadaFisiologia Vegetal AvançadaLavras – MGLavras – MG 2005 2005

Introdução• A descoberta:

Dormina 1949, Paul F. Wareing, Inibidor de crescimento em gemas de batata e freixo

Abscisina II 1960, Frederick T. Addicott Aceleração da abscisão de folhas e frutos

Identidade química entre dormina e abscisina II.

Consagração do termo ÁCIDO ABSCÍSICO.

• Ocorrência:– Em todas as plantas vasculares,

na maioria dos tecidos vivos;– Em Briófitas, exceto hepáticas;– Em Fungos, como metabólito

secundário.

Introdução (2)

• Dormência de gemas e sementes;• Fechamento estomático;• Inibição do alongamento da raiz principal e

formação de raízes laterais;• Maturação de frutos;• Morte celular programada;• Senescência;• Síntese de proteínas de reserva em sementes;• Tolerância a stresses diversos (salinidade,

frio,...);• Tolerância a dessecação;• Tuberização, etc...

O ABA está relacionado com a indução de:

Funções

A estrutura molecular do ABA determina sua atividade fisiológica.

Introdução (3)

COOH

OH

O

15 Carbonos

Derivado isoprenóide

cistrans

IsômerosIntrodução (4)

• Ativo na maturação de sementes;• Inativo no fechamento estomático;• Presente nos produtos sintéticos.

Forma ativa de ocorrência natural

• Forma inativa conversível para a forma ativa [cis];• Não ocorre naturalmente;

Não ocorre conversão

Presente nos produtos sintéticos

Biossíntese do ABA

ABAABA

Via diretaRota do

mevalonato(fungos)

Via indireta

Rota do DOXP

(plantas)

DMAPP= dimetilalil pirofosfato

IPP= isopentenil pirofosfato

FPP= farnesil pirofosfato

GPP= geranil pirofosfato

GGPP= geranilgeranil

pirofosfato

Giberelinas

Etapas finais da síntese do ABA

Citossol

Xantoxal

C40

C15

NCED = 9-cis-epoxi-carotenóide dioxigenase

NCED

SDR

SDR = desidrogenase/

redutase de cadeias curtas

AOAO=

aldeído oxidase

Mutantes deficientes em ABA• Auxiliaram na

elucidação da via de síntese.

• Apresentam:

• Fenótipo murcho e/ou

• Viviparidade de sementes.

• Aplicação de ABA exógeno restaura fechamento estomático.

Catabolismo

ABA-β-D-glicose éster

Conjugação c/

monossac.

Desacelerado em caso de stress hídrico

Nova via de catabolismo

Zhou et al. (2004)

Não enzimático

?

• O neoPA foi detectado principalmente em sementes e plântulas.

• Ainda não se sabe o destino posterior do neoPA.

RNAm

Nova via de catabolismo (2)(Zhou et al. 2004)

•9´OH ABA tem efeito sobre indução dessa enzima

•O efeito do neoPA é fraco

Regulação do metabolismo

Formas inativas

Taxa de Biossíntese

NCED

ZEP

ABA-G

apoplasto -glicosidase

(+)-ABA-G

(+)-ABA

Transporte de ABA

Seiva bruta

• ABA livre

• ABA conjugadoSeiva elaborada

• ABA livre

• ABA conjugado

Sequestro e catabolismo no simplasto do mesofilo

Síntese no simplasto da raiz

Produção de formas conjugadas

Movimentação via simplasto e apoplasto

Carregamento do xilema

Biossíntese no mesofilo

Carregamento do floema via simplasto e apoplasto

Sauter et al. (2002)

Alcalinização da seiva bruta sob stress hídrico

ABA livre x conjugado

• O ABA conjugado é uma forma importante de transporte a longa distância (Sauter et al. 2002).

Transdução de sinal• A transdução de sinal depende da

existência de um receptor.• Identidade do receptor do ABA?

– Talvez seja um canal de cálcio,– Talvez ative uma GTPase.

• Localização do receptor?– Plasmalema ou citossol?– Núcleo celular?

• Há um receptor ou vários?– Existem diferenças de respostas aos enantiômeros.

• A busca pelo receptor do ABA não tem tido sucesso, mesmo com as técnicas de engenharia genética (Finkelstein et al. 2002).

Evidências da localização intracelular

do receptor

ABA “encaixotad

o”

UV

Microinjeção

(Allan et al. 1994; Schwartz et al. 1994)

Não descarta a possibilidade do ABA ligar-se a um receptor na plasmalema “pelo lado de dentro”.

Evidências da localização do receptor na plasmalema

• O ABA é incapaz de atravessar a plasmalema em pH 8, mas ainda ocorre fechamento estomático parcial (Anderson et al. 1994), portanto o ABA teria de agir “pelo lado de fora”.

• Ligação do anticorpo JIM19 a glicoproteínas na membrana plasmática é inibida competitivamente pelo ABA (Desikan et al. 1999).

• Acúmulo de ABA no apoplasto das células guarda resulta em fechamento estomático (Zhang e Outlow 2001).

Finalmente localizado o receptor do ABA?

• bio-ABA e novas técnicas:– citometria de fluxo (FCM);– microscopia laser confocal (CLSM).

Yamazaki et al. (2003)

Composto fluorescente

Fluorescência com bio-ABA

Protoplastos isolados de células guarda;

O bio-ABA ligou-se à plasmalema;

O receptor forma “clusters”;

103 a 104 receptores por protoplasto.

Yamazaki et al. (2003)

O bio-ABA tem ação fisiológica.

Yamazaki et al. (2003)

• O bio-ABA foi reconhecido pelo provável receptor e ocorreu transdução de sinal.

Inibição competitiva pelo ABA

Yamazaki et al. (2003)

• Provável receptor reconhece o ABA .

Natureza química do receptor?

Proteinase K causou redução da ligação do bio-ABA.

Yamazaki et al. (2003)

Inibidor da proteinase ou uso de proteinase denaturada resultaram em aumento da ligação do bio-ABA

Seqüência de aminoácidos do provável receptor do ABA

(Razem et al. 2004)

• Essa proteína recebeu o nome de ABAP1

• Tem um domínio WW similar à proteína de controle da floração (FCA) em Arabidopsis.

A proteína ABAP1• Foi obtida da fração microssomal da camada de aleurona de cevada. É uma proteína de membrana? Embora seja rica em aminoácidos hidrofílicos. • 52 kDa (Razem et al. 2004) X 42 kDa da epiderme de folhas de “broad bean” (Zhang et al. 2002). Seriam receptores diferentes nas duas espécies ?• ABAP1 não se expressa em folhas de cevada. Múltiplos receptores na mesma planta?

3H-(+)-ABA.

Razem et al. (2004)

A proteína ABAP1

Razem et al. (2004)

• Liga-se ao isômero natural do ABA de acordo com o pH.

Um modelo para o

receptor do ABA

•Talvez seja um canal de cálcio

Mensageiros secundários

• ADP ribose cíclico (cADPR) (Schroeder et al. 2001).

• O fosfolipídio esfingosina-1-P (SIP)• O inositol tri-fosfato está envolvido com

a ativação de canais de íons.

• H2O2 e o óxido nítrico estão envolvidos na sinalização do ABA (Desikan et al. 2003).

• O nível de Ca2+ no citossol afeta a abertura estomática.

Schroeder et al. (2001)

cADPR = ADP ribose cíclico

PLC = fosfolipase C

InsP3 = inositol trifosfato

Ca2+ exerce feedback positivo

Mensageiros secundários envolvidos no fechamento estomático induzido pelo ABA

SV = canais de liberação de lenta de Ca2+ vacuolar

Uma proteína de membrana com Ca2+ “binding motifs”; Ativada por G proteínas (GTPases); Codificada pelo gene rbohA (respiratory burst oxidase homolog A);

Um gerador de mensageiro secundário?

• NADPH oxidase

Keller et al. (1998)

NADPH + O2 NADP++O2-+

H+

O2- H2O2 •Stress

oxidativoTalvez relacionada com a resistência a patógenos.

105 a 108 kDa;

G proteínas na transdução de sinal

• Uma GTPase (AtRac1) que se expressa preferencialmente em células-guarda.

• Essa enzima é inibida pelo ABA.

Lemichez et al (2001)

Adição de ABA

Transdução de sinal em

cascata• As MAP

quinases estão envolvidas na transdução de sinal em várias vias hormonais.

• São também ativadas por fosforilação (MAPKK)

Membrana

Adaptado de Morris (2001)

Respostas induzidas pelo ABA• Rápidas

– Movimentos estomáticos• Lentas

– Expressão gênica:• Indução do acúmulo de reservas em

sementes;• Indução de dormência;• Indução da tolerância à dessecação;• Inibição da expressão de enzimas hidrolíticas; • Aumento da tolerância ao stress (hardening).

Respostas rápidas: Canais de íons envolvidos nos movimentos estomáticos

Schroeder et al. (2001)

• Canais de Ca2+

• Canais de ânions (S e R)

• Canais de K+ out

• Canais no tonoplasto (VK e FV)

Indução do fechamento

Inibição da abertura

Indução do Fechamento

Inibição da abertura• Bomba de H+

• Canais de K+ in

O ABA e o citoesqueleto

• O ABA induz a desorganização dos filamentos de actina nas células guarda.

• O processo é mediado pelo cálcio citoplasmático, por quinases e fosfatases.

Hwang & Lee (2001)

• Resultando em fechamento estomático.

Actina no fechamento estomático

Lemichez et al. (2001)

• Combinou-se proteínas fluorescentes com a actina e a tubulina.

• A adição de ABA resulta em desorganização dos filamentos de actina e os estômatos fecham-se.• Os mutantes abi1 não apresentam alteração do citoesqueleto em resposta ao ABA.

• A GTPase (AtRac1) está envolvida nessa resposta.

Respostas lentas

• Promotor dos genes• ABRC = “ABA responsive complex”

– ABRE = “ABA responsive element”– CE = “coupling element”

Seqüência consenso

Seqüência consenso

• Estas seqüências estão localizadas upstream em relação às seqüências codificadoras; • São reconhecidas por fatores de transcrição.

Genes ABA - responsivos

Mutações dirigidas

• Descobriu-se dois segmentos na região do promotor dos genes que são importantes para esse reconhecimento:– ABRE e – CE.Shen & Ho (1995)

•Realizadas para compreender a seqüência de nucleotídeos necessária para o reconhecimento pelos fatores de transcrição responsivos ao ABA

Super- expressão

em resposta ao ABA.

Shen & Ho (1995)

Gene reporterPromoter

•Foram inseridas várias cópias da seqüência ABRE na região do promotor dos genes

•Quanto mais cópias maior a expressão

G-box• Ocorre em diversas regiões promotoras de genes responsivos a fatores ambientais (Shen & Ho 1995);

• Seqüência- consenso: ACGT.• Os elementos ACGT isolados não conferem responsividade direta ao ABA. A determinação da resposta depende da seqüência de nucleotídeos ao redor do ACGT que provavelmente interage com os fatores de transcrição (Velasco et al. 1998).

Tabela gbox e CE

Shen & Ho (1995)

ABRC x GARC

Box 2

W-box

Shen et al. (2001)

Fatores de transcrição (TF)• São “trans-acting proteins”;• Ligam-se a regiões específicas do DNA;• Reconhecem seqüências específicas de nucleotídeos;• Podem ser ativados por fosforilação (MAP quinases).• Vários TFs podem ser necessários antes do acoplamento da RNA polimerase (pol II).• Vários tipos de TFs já foram identificados em plantas.

Buchanan et al. (2001)

Leucine zipper

• São fatores de transcrição formados por duas subunidades protéicas.

• O aminoácido leucina está presente numa seqüência repetitiva e promove a interação entre as subunidades.

• Contém uma seqüência de aminoácidos básicos que interage com o DNA.

• Podem formar-se heterodímeros e homodímeros com especificidade diferente.

• Reconhecem as G-boxes responsivas ao ABA.

Exemplo:VP1

ABA e stress• O déficit hídrico

aumenta a produção de espécies reativas de oxigênio (NADPH oxidase).

• A super-expressão de alguns genes aumenta a resistência à seca e à salinidade.

• As LEA-proteínas conferem tolerância a dessecação em sementes, são induzidas pelo ABA e também podem ser expressas em tecidos vegetativos.

Arroz submetido a stress hídrico

Buchanan et al. (2001)

Arroz não-transformado

Linhagens com expressão

constitutiva do gene HVA1

Engenharia genética• Aumentar a sensibilidade ao ABA

com deleção do gene ERA1 , que exerce regulação negativa na sinalização do ABA (farnesil transferase).

• Reduzir o catabolismo do ABA para aumentar a tolerância à seca. – Como?

Schoereder et al. (2001)

Respostas independentes do ABA

Shinozaki & Yamaguchi-Shinozaki (2000)

“Genes de stress” não-responsivos ao ABA

Buchanan et al. (2001)

Fator de transcrição

Interação com outros sinalizadores

ABA x Etileno

Beaudoin et al. (2000)

Ação antagônica

ABA x GAABI 1

Ação antagônic

a(Proteína quinase)

Modelo para células de aleurona

VP1

(Proteína fosfatase 2C)

(Fator de transcrição)

(LEA proteínas)

Adaptado de Zentela et al. (2002)

ABA x Citocininas

• As citocininas reduzem a sensibilidade das células-guarda ao ABA (Radin et al. 1982).

• Efeito antagônico do ABA e citocininas na senescência foliar:– O ABA acelera,– As citocininas retardam.

ABA x Açúcares

Finkelstein & Gibson (2001)

• Os açúcares não são considerados hormônios, mas sinalizam o estado nutricional da planta;

• As respostas promovidas pelos açúcares podem ser sinérgicas ou antagônicas ao ABA;

• Glicose x sacarose, efeito similar ou antagônicos;

• Vários mutantes para sensibilidade aos açúcares tem sensibilidade ao ABA alterada (gin, sun, sis);

• Genes similares podem responder de modo similar aos açúcares e de modo diferente ao ABA.

• Os açúcares potencializam a sensibilidade ao ABA em células-guarda.

Análogos do ABA• Estrutura química

ABA metileno ABA acetileno

Adição de um grupo metil ao carbono 8´ dificulta catabolismo.www.abscisicacid.com

Análogos permanecem ativos por mais tempo.

Análogos do ABA (2)• Aplicação de análogos pode aumentar

a resistência ao stress hídrico.

(www.abscisicacid.com)

abóbora

conífera

Controle sob stress hídrico

10 dias após o tratamento

10-5 Molar

Controle

Análogos do ABA (3)

Yamazaki et al. (2003)

Uso de análogos do ABA

Perspectivas:• Aumentar a produtividade em áreas

marginais, sujeitas a stress hídrico;• Melhorar o desempenho de cultivos

comerciais;• Uso como herbicidas.

“O ácido abscísico exerce influência sobre quase todos os aspectos do crescimento e do desenvolvimento da planta em maior ou menor extensão. Sua ação ocorre através de uma complexa rede de sinalização celular. A produção e a ação do ABA é parte de uma rede de processos interativos que mudam continuamente em resposta aos sinais ambientais e endógenos.”

Em síntese:R

ock

(20

00

)

Obrigada !

cADPR (ADP ribose cíclico)

Grill & Himmelbach (1998)

cADPR

Sanches et al. (2004)