AÇÚCAR PRÉ-TRATADO COM PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO ADIC

Estácio Jussie Odisi

SACARIFICAÇÃO ENZIMÁTICA DO BAGAÇO DA CANA-DE-

AÇÚCAR PRÉ-TRATADO COM PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO

ADICIONADO DE ÁLCALI OU CINZAS

Dissertação submetida ao Programa de

Pós-Graduação em Engenharia Quími-

ca da Universidade Federal de Santa

Catarina para a obtenção do Grau de

Mestre em Engenharia Química.

Orientador: Prof.ª Dra. Mara Gabriela

Novy Quadri

Coorientador: Prof. Dr. André Oliveira

de Souza Lima

Florianópolis

2013

Estácio Jussie Odisi

SACARIFICAÇÃO ENZIMÁTICA DO BAGAÇO DA CANA-DE-

AÇÚCAR PRÉ-TRATADO COM PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO

ADICIONADO DE ÁLCALI OU CINZAS

Esta dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de

“Mestre em Engenharia Química”, e aprovada em sua forma final pelo

Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química da Universidade

Federal de Santa Catarina.

Florianópolis, 28 de janeiro de 2013.

________________________

Prof. Ricardo Antônio Francisco Machado, Dr.

Coordenador do CPGENQ

______________________

Prof.ª Mara G. N. Quadri, Dr.

a

Orientadora

Banca Examinadora:

_______________________

Prof. Agenor Furigo Junior, Dr.

Membro

________________________

Prof. André O. Souza Lima, Dr.

Coorientador

________________________

Prof.ª Débora de Oliveira, Dr.ª

Membro

________________________

Prof. Marintho Bastos Quadri, Dr.

Membro

Anastácio, Marilete, Marilins e a mi-

nha bisavó Luiza (in memoriam).

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus e meus pais Anastácio e Marile-

te que são as luzes que iluminaram toda essa jornada de mestrado e vida.

A pimpolha da minha irmã Marilins, que apesar de falar muito, é

a minha xereta do coração. A minha bisavó Luiza que nos deixou no

meio desta caminhada, mas continua sempre presente através de seus

ensinamentos e no meu coração. Agradeço também toda minha grande

família por estarem sempre presentes.

A minha mestre e orientadora Mara Gabriela Novy Quadri que

além de uma dedicada orientadora têm sido a grande mãe do laboratório

sempre nos acolhendo.

Ao mestre André Oliveira de Souza Lima que incentivou toda es-

ta caminhada e esteve presente em todo processo de coorientação.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecno-

lógico (CNPq) pelo auxílio financeiro.

Aos professores membros da banca pela disponibilidade e pelas

correções feitas, que permitiram melhorar o potencial deste trabalho.

Ao pessoal dos laboratórios LASIPO (laboratório de Sistemas Po-

rosos – UFSC) e LGM (Laboratório de Genética Molecular - UNIVA-

LI), agradeço aos ensinamentos e companhia. O grande apoio do Tiago

Tolentino, Vivian Colonetti, Rômulo Rodrigues, Andressa Gilioli e a

grande amizade de Jônata Biehl e Felipe Avelar.

Aos grandes amigos Rogério, Priscila, Tiago, Marinho e Juninho

que sempre foram parte da minha casa em Florianópolis.

“Às vezes é preciso aprender a correr antes

de começar a andar”.

- Antonhy Edward Stark

RESUMO

Nos últimos anos tem surgido um grande interesse mundial no desen-

volvimento de tecnologias que consigam aproveitar resíduos lignocelu-

lósicos para obtenção de açúcares fermentescíveis. O bagaço da cana-

de-açúcar é o principal resíduo agroindustrial do Brasil. Por mais que o

bagaço seja empregado para geração de energia, grandes excedentes

continuam sem aplicação. No entanto, o bagaço apresenta uma natureza

recalcitrante, devido ao arranjo estrutural formado pelos seus compo-

nentes celulose, hemicelulose e lignina. Com isso, se torna necessário

uma etapa de pré-tratamento para desprender a lignina e hemicelulose

fazendo com que a celulose seja liberada e esteja acessível para as enzi-

mas celulases. Partindo desta premissa, este trabalho estudou o pré-

tratamento do bagaço da cana-de-açúcar para uma sacarificação enzimá-

tica eficiente. Para tanto, foram avaliados dois métodos de pré-

tratamento: um utilizando o peróxido de hidrogênio alcalino como um

processo padrão e outro utilizando o peróxido de hidrogênio suplemen-

tado com cinzas (objeto de estudo do presente trabalho). Para ambos

pré-tratamentos, foram determinados as melhores condições de execu-

ção através de planejamentos experimentais, avaliando as variáveis:

temperatura, concentração de H2O2, agitação, concentração de cinzas e

por fim o tempo reacional, obtendo como superfície de resposta o ren-

dimento de açúcares redutores liberados durante a hidrólise enzimática.

Posteriormente, foram realizadas análises de composição e identificação

de estruturas químicas e caracterização morfológica no bagaço antes e

após os pré-tratamentos. A melhor condição para o pré-tratamento com

peróxido de hidrogênio alcalino foi de 9,39% (v/v) H2O2, 46°C de tem-

peratura e agitação de 1,67 Hz por um período reacional de 40 minutos.

Já para o pré-tratamento com peróxido de hidrogênio suplementado com

cinzas, a condição de 6,32% (v/v) H2O2, 3,40% (p/v) cinzas, 60°C de

temperatura e agitação de 1,67 Hz por um período reacional de 2 horas

foi a condição adequada. O rendimento de açúcares redutores após 48

horas de hidrólise enzimática para o pré-tratamento com peróxido de

hidrogênio alcalino foi de 217,6 mg g-1

bagaço e de 179,9 mg g-1

bagaço

para o pré-tratamento com peróxido de hidrogênio suplementado com

cinzas, enquanto que para o bagaço não tratado foi de apenas 74,3 mg g-

1 bagaço, enquanto que o rendimento de glucose foi o mesmo para os

dois pré-tratamentos, mostrando que possuem a mesma eficiência. Am-

bos pré-tratamentos não apresentaram modificações significativas na

estrutura química do bagaço antes e após pré-tratamento. Além disso,

foi possível observar uma pequena desorganização física nas fibras do

bagaço. Ambos pré-tratamentos possuem a mesma eficiência no rendi-

mento de glucose, no entanto, o pré-tratamento com peróxido de hidro-

gênio alcalino apresenta formação de resíduos cáusticos envolvendo

uma etapa de lavagem dispendiosa e com geração de efluente, além de

promover parcial degradação da hemicelulose. Desta forma o pré-

tratamento com peróxido de hidrogênio suplementado com cinzas apre-

senta-se mais viável para uma aplicação amigável ao meio ambiente.

Palavras-chave: bagaço cana-de-açúcar, pré-tratamento, peróxido de

hidrogênio, cinza, celulases.

ABSTRACT

In the last years there is a worldwide emerging interest in the develop-

ment of technologies that are able to take advantage of lignocellulosic

residues to obtain fermentable sugars. The sugarcane bagasse is the

principal agroindustrial residue from Brazil. Although the bagasse is

used for power generation, large surplus remains still without applica-

tion. Its recalcitrant nature, due to the arrangement formed by the struc-

tural components cellulose, hemicellulose and lignin, makes necessary a

pretreatment step to release cellulose from lignin and hemicellulose

permitting, then, cellulase enzymes to access the molecules. This work

studied the efficiency of two pretreatments of the sugarcane bagasse in

promoting the enzymatic saccharification: one using alkaline hydrogen

peroxide as a standard process and another using hydrogen peroxide

supplemented with ash. For both pretreatments, the best operational

conditions were evaluated using experimental design. The variables

studied were temperature, H2O2 concentration, agitation, ash concentra-

tion and reaction time; the response variable was reducing sugars re-

leased during enzymatic hydrolysis. Modifications promoted on the

bagasse by the pretreatments were evaluated by analysis of chemical

composition, identification of chemical structures and morphological

characterization, before and after pretreatments. The best condition

found for the hydrogen peroxide alkaline pretreatment was 9.39% (v/v)

H2O2, 46°C temperature and stirring of 1.67 Hz for a reaction time of 40

minutes, and for hydrogen peroxide supplemented with ash pretreat-

ment, the best condition was 6.32% (v/v) H2O2, 3.40% (w/v) ash, 60°C

and 1.67 Hz stirring for a reaction time of 2 hours. The yield, expressed

in reducing sugars, after 48 hours of enzymatic hydrolysis for the alka-

line hydrogen peroxide pretreatment was 217.6 mg g-1

bagasse, and

179.9 mg g-1

bagasse for hydrogen peroxide ash pretreatment; the un-

treated bagasse gave 74.3 mg g-1

bagasse yield, whereas the yield of

glucose was the same for both pre-treatment, showing that have the

same efficiency. Both pretreatments showed no significant changes in

the chemical structure of the pulp before and after pretreatment. Moreo-

ver, we observed a small physical clutter in the fibers of bagasse. Both

pretreatments have the same efficiency in the yield of glucose, however,

pretreatment with alkaline hydrogen peroxide shows formation of caus-

tic residues involving an expensive step wash and worth generation of

effluent, besides promote partial degradation of hemicellulose, therefore

the pretreatment with hydrogen peroxide supplemented with ash appears

more feasible for implementation.

Keywords: sugarcane bagasse, pretreatment, hydrogen peroxide, ash,

cellulases.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Típico arranjo da parede celular de uma célula. .................... 6

Figura 2 - Associação dos componentes da parede celular. (1)

Esqueleto da cadeia de celulose, com a indicação do comprimento

da sua unidade estrutural básica, a celobiose; (2) Arranjo das cadeias

de celulose na formação da fibrila elementar; (3) Cristalito de

celulose; (4) Secção transversal da microfibrila da celulose,

mostrando cristalitos de celulose embebidos na matriz de

hemicelulose e protolignina. ................................................................. 8

Figura 3 - Representação esquemática de uma xilana de gramínea

mostrando al-guns grupos substituintes. Xyl = D-xilopiranose; Ara =

L-arabinofuranose; (4-Me)-GlcA = ácido (4-O-metil)-

Dglicopiranurônico; Ac = acetil; FA = ácido ferúlico; DDFA = ácido

desidroferúlico. .................................................................................... 9

Figura 4 - Estrutura dos fenilpropanóides que compõem a lignina:

(1) p-cumarílico, (2) coniferílico e (3) sinapílico. ............................... 11

Figura 5 – Produção dos principais países produtores de cana-de-

açúcar em 2010. ................................................................................. 12

Figura 6 - Depósito de bagaço (resíduo) de cana-de-açúcar em usina

de produção de álcool. ....................................................................... 13

Figura 7 - Efeito do pré-tratamento na acessibilidade das enzimas

celulases para realizar hidrólise. ......................................................... 14

Figura 8 - Mecanismo de hidrólise da celulose pelo complexo de

celulases do gênero Trichoderma. (Endos - endoglucanases; exosR -

exoglucanases atuando nos terminais redutores; exosNR -

exoglucanases atuando nos terminais não redutores; β-Gase – β-

glucosidases). .................................................................................... 22

Figura 9 - Bagaço utilizado para os ensaios de pré-tratamento. ........... 23

Figura 10 - Bagaço carbonizado (à esquerda) e cinzas (à direita). ....... 24

Figura 11 – Fluxograma da metodologia aplicada para determinação

da eficiência dos pré-tratamentos avaliados. ....................................... 30

Figura 12 – Influência da temperatura e do pH na atividade da

enzima β-glucosidase sobre o substrato PNP-G. ................................. 37

Figura 13 - Influência da concentração de glucono-delta-lactona na

atividade das enzimas β-glucosidase e exoglucanase sobre os

substratos PNP-G e PNP-C. ............................................................... 38

Figura 14 - Influência da temperatura e do pH na atividade da

enzima exoglucanase sobre o substrato PNP-C adicionado de 50 mM

de glucono-delta-lactona. ................................................................... 38

Figura 15 - Temperatura e pH ótimo da enzima endoglucanase. .......... 39

Figura 16 - Curvas de níveis do rendimento de ART liberados após a

hidrólise enzimática em função das condições de pré-tratamento de

concentração de H2O2 e temperatura, sob agitação de 1,67 Hz. Os

números sobre os contornos representam o rendimento de ART (mg

g-1

do bagaço). ................................................................................... 42

Figura 17 - Curvas de níveis do rendimento de ART liberados após a


temperatura e agitação, com a concentração de H2O2 em 5%. Os

números sobre os contornos representam o rendimento de ART (mg

g-1

do bagaço). ................................................................................... 43

Figura 18 - Curvas de níveis do rendimento dos ART liberados após

a hidrólise enzimática em função das condições de pré-tratamento de

temperatura e concentração de H2O2. Os números sobre os contornos

representam os ART (mg g-1

do bagaço). ............................................ 46

Figura 19 - Curvas de níveis do rendimento dos açúcares redutores

após a hidrólise enzimática em função das condições de pré-

tratamento de temperatura e concentração de H2O2. Os números

sobre os contornos representam o rendimento em ART (mg g-1

do

bagaço). ............................................................................................. 49

Figura 20 - Rendimento de ART em função do tempo do pré-

tratamento de peróxido de hidrogênio alcalino com 9,39%

concentração H2O2, 46°C de temperatura e 1,67 Hz de agitação. Foi

realizada uma hidrólise de 48 horas para cada tempo de pré-

tratamento. ......................................................................................... 51

Figura 21 - Curvas de níveis do rendimento dos ART após a


concentração de H2O2 e concentração de cinzas com a temperatura

mantida em 40 °C. Os números sobre os contornos representam os

ART (mg g-1

do bagaço). .................................................................... 55


hidrólise enzimática em função das condições de pré-tratamento de concentração de cinzas e temperatura com a concentração de H2O2

mantida em 5%. Os números sobre os contornos representam os

ART (mg g-1

do bagaço). .................................................................... 56



concentração de cinzas e concentração de H2O2 com a temperatura

mantida em 60 °C . Os números sobre os contornos representam os

ART (mg g-1

do bagaço). ................................................................... 59

Figura 24 - Rendimento de ART em função do tempo do pré-

tratamento com 6,32% (v/v) H2O2, 3,40% (p/v) cinzas, 60°C de

temperatura e 1,67 Hz de agitação. Foi realizada uma hidrólise de 48

horas para cada tempo de pré-tratamento. ........................................... 61

Figura 25 - Rendimento de ART e glucose após hidrólise enzimática

do bagaço. Pré-tratamento com H2O2 alcalino (vermelho); Pré-

tratamento com H2O2 suplementado com cinzas (verde) e Sem pré-

tratamento (azul). ............................................................................... 63

Figura 26 - Espectro de FTIR da amostra de bagaço da cana-de-

açúcar. ............................................................................................... 65


açúcar (vermelho) comparado com bagaço hidrolisado (púrpura). ....... 68


açúcar (vermelho) comparado com bagaço pré-tratado com H2O2

alcalino (azul) e com o bagaço pré-tratado submetido à hidrólise

enzimática (púrpura). ......................................................................... 69


açúcar (vermelho) comparado com amostra de cinza obtida pela

queima do bagaço (verde). ................................................................. 70


açúcar (vermelho) comparado com bagaço pré-tratado com H2O2

suplementado com cinzas (azul) e com o bagaço pré-tratado

submetido à hidrólise enzimática (púrpura). ....................................... 71

Figura 31 - Micrografia do bagaço da cana-de-açúcar submetido ao

pré-tratamento com peróxido de hidrogênio alcalino. A e B –

Bagaço sem tratamento. C e D - Bagaço pré-tratado com peróxido de

hidrogênio alcalino. E e F – Bagaço pré-tratado com peróxido de

hidrogênio alcalino e submetido à hidrólise enzimática. ...................... 73

Figura 32 - Micrografia do bagaço da cana-de-açúcar submetido ao

pré-tratamento com peróxido de hidrogênio suplementado com

cinzas. A – Bagaço sem tratamento. B - Bagaço pré-tratado com

peróxido de hidrogênio suplementado com cinzas. C – Bagaço pré-

tratado com peróxido de hidrogênio suplementado com cinzas

submetido à hidrólise enzimática. ....................................................... 74

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Métodos de pré-tratamento de materiais lignocelulósicos

para hidrólise enzimática. ................................................................... 16

Tabela 2 - Potencial de oxidação de diferentes oxidantes. ................... 17

Tabela 3 - Composição química (%) do bagaço da cana-de-açúcar. ..... 35

Tabela 4 - Quantificação dos principais metais das cinzas. .................. 36

Tabela 5 - Matriz do planejamento experimental fatorial 2³ completo

de pré-tratamento do bagaço da cana-de-açúcar com H2O2 alcalino, e

a superfície de resposta em ART liberados após 60 horas de

hidrólise enzimática. .......................................................................... 40

Tabela 6 - Analise de Variância (ANOVA) para o modelo sugerido a

partir do planejamento fatorial 2³ completo de pré-tratamento do

bagaço da cana-de-açúcar com H2O2 alcalino. .................................... 40

Tabela 7 - Efeitos e coeficientes de regressão do modelo sugerido a

partir do planejamento fatorial 2³ completo de pré-tratamento do

bagaço da cana-de-açúcar com H2O2 alcalino. .................................... 41

Tabela 8 - Matriz do planejamento fatorial 2² + configuração estrela

do pré-tratamento do bagaço da cana-de-açúcar com H2O2 alcalino e

a superfície de resposta em ART liberados após hidrólise enzimática

de 48 horas. ....................................................................................... 44

Tabela 9 - Analise de Variância (ANOVA) para o modelo sugerido a

partir do planejamento fatorial 2² + configuração estrela de pré-

tratamento do bagaço da cana-de-açúcar com H2O2 alcalino. .............. 45

Tabela 10 - Efeitos e coeficiente de regressão do modelo sugerido a

partir do planejamento fatorial 2² + configuração estrela de pré-


Tabela 11 - Matriz do planejamento experimental planejamento

fatorial 2² + configuração estrela de pré-tratamento do bagaço da

cana-de-açúcar com H2O2 alcalino, e a superfície de resposta em

ART liberados após hidrólise enzimática de 48 horas. ........................ 47

Tabela 12 - Analise de Variância (ANOVA) para o modelo sugerido

a partir do planejamento fatorial 2² + configuração estrela de pré-



partir do planejamento experimental 2² composto central de pré-


Tabela 14 - Matriz do planejamento experimental fatorial 2³

completo de pré-tratamento do bagaço da cana-de-açúcar com H2O2

suplementado com cinzas, e a superfície de resposta em ART

liberados após hidrólise enzimática de 48 horas. ................................. 53


a partir do planejamento experimental fatorial 2³ completo de pré-

tratamento do bagaço da cana-de-açúcar com H2O2 suplementado

com cinzas. ........................................................................................ 53


partir do planejamento experimental fatorial 2³ completo de pré-

tratamento do bagaço da cana-de-açúcar com H2O2 suplementado

com cinzas. ........................................................................................ 54

Tabela 17 - Matriz do planejamento experimental planejamento

fatorial 2² + configuração estrela de pré-tratamento do bagaço da

cana-de-açúcar com H2O2 suplementado com cinzas, e a superfície

de resposta em ART liberados após hidrólise enzimática de 48 horas. . 57


a partir do planejamento experimental planejamento fatorial 2² +

configuração estrela de pré-tratamento do bagaço da cana-de-açúcar

com H2O2 suplementado com cinzas. .................................................. 58


partir do planejamento experimental planejamento fatorial 2² +

configuração estrela de pré-tratamento do bagaço da cana-de-açúcar

com H2O2 suplementado com cinzas. .................................................. 58

Tabela 20 - Rendimento de ART e glucose liberados após 48 horas

de hidrólise enzimática em função do tipo de pré-tratamento. ............. 62

Tabela 21 - Composição química do bagaço da cana-de-açúcar após

o pré-tratamento. ................................................................................ 64

Tabela 22 - Valores e atribuições das bandas de FTIR. ....................... 67

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ABR Azul Brilhante do Remazol

ANOVA Análise de variância

ART Açúcares redutores totais

AZO-CMC Azo-CM-Celulose

C Concentração de cinzas

CMC Carboximetilcelulose

DNS 3,5–dinitrosalicílico

FTIR Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de

Fourier

LCME Laboratório Central de Microscopia Eletrônica

MEV Microscopia Eletrônica de Varredura

P Concentração de H2O2

PNP ρ-nitrofenil

PNP-C ρ-nitrofenil-β-D-celobiosídeo

PNP-G ρ-nitrofenil-β-D-glucopiranosídeo

T Temperatura

UFSC Universidade Federal de Santa Catarina

SUMÁRIO

1 CAPÍTULO 1: INTRODUÇÃO ..................................................... 1 1.1 IMPORTÂNCIA DO ESTUDO ............................................................... 1 1.2 OBJETIVOS ....................................................................................... 3 1.2.1 Objetivo geral.................................................................................. 3 1.2.2 Objetivos específicos ...................................................................... 3 2 CAPÍTULO 2: REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................. 5 2.1 BIOMASSA LIGNOCELULÓSICA ........................................................ 5 2.1.1 Composição química dos resíduos lignocelulósicos ....................... 6 2.1.1.1 Celulose ..................................................................................................... 7 2.1.1.2 Hemicelulose ............................................................................................. 8 2.1.1.3 Lignina ..................................................................................................... 10 2.1.1.4 Outros Extrativos ..................................................................................... 11 2.1.2 Bagaço da cana-de-açúcar ............................................................. 11 2.2 PRÉ-TRATAMENTO DE RESÍDUOS CELULÓSICOS ............................. 14 2.2.1 Método químico de pré-tratamento ............................................... 17 2.2.1.1 Pré-tratamento com peróxido de hidrogênio ............................................ 17 2.3 HIDRÓLISE ENZIMÁTICA ................................................................ 21 3 CAPÍTULO 3: MATERIAIS E MÉTODOS ............................... 23 3.1 SUBSTRATO ................................................................................... 23 3.1.1 Preparo do bagaço da cana-de-açúcar ........................................... 23 3.1.2 Preparo das cinzas do bagaço da cana-de-açúcar .......................... 24 3.1.3 Caracterização química ................................................................. 24 3.1.3.1 Determinação do teor de extrativos totais ................................................ 24 3.1.3.2 Determinação do teor de celulose ............................................................ 25 3.1.3.3 Determinação do teor de holocelulose ..................................................... 25 3.1.3.4 Determinação do teor de lignina de Klason ............................................. 26 3.1.3.5 Determinação do teor de cinzas ............................................................... 26 3.1.3.6 Quantificação de metais ........................................................................... 26 3.1.3.7 Identificação espectrométrica de compostos orgânicos ........................... 27 3.1.3.8 Caracterização morfológica ..................................................................... 27 3.2 ENZIMAS ........................................................................................ 27 3.2.1 Ensaios de atividade enzimática.................................................... 27 3.2.1.1 β-glucosidase ........................................................................................... 27 3.2.1.2 Exoglucanase ........................................................................................... 28 3.2.1.3 Endoglucanase ......................................................................................... 29 3.2.2 Condições ótimas de atividade da enzima..................................... 29 3.2.2.1 Determinação da temperatura ótima ........................................................ 29 3.2.2.2 Determinação do pH ótimo ...................................................................... 29 3.3 PRÉ-TRATAMENTO ......................................................................... 30 3.3.1 Pré-tratamento com peróxido de hidrogênio alcalino ................... 31 3.3.2 Pré-tratamento com peróxido de hidrogênio suplementado

com cinzas ..................................................................................... 31

3.3.3 Planejamento experimental e análise estatística dos dados .......... 31 3.4 HIDRÓLISE ENZIMÁTICA ................................................................ 32 3.4.1 Açúcares Redutores Totais (ART) ............................................... 32 3.4.2 Quantificação da Glucose ............................................................. 33 4 CAPÍTULO 4: RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................ 35 4.1 CARACTERIZAÇÃO DA MATÉRIA-PRIMA ........................................ 35 4.1.1 Bagaço da cana-de-açúcar ............................................................ 35 4.1.2 Cinzas do bagaço da cana-de-açúcar ............................................ 35 4.2 AVALIAÇÃO DAS CONDIÇÕES ÓTIMAS DAS ENZIMAS ..................... 36 4.2.1 β-glucosidase ................................................................................ 36 4.2.2 Exoglucanase................................................................................ 37 4.2.3 Endoglucanase .............................................................................. 38 4.2.4 Considerações .............................................................................. 39 4.3 PRÉ-TRATAMENTO COM PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO ALCALINO .... 39 4.3.1 Planejamento fatorial 2³ completo ................................................ 39 4.3.2 Otimização das condições de pré-tratamento ............................... 43 4.3.3 Cinética do pré-tratamento ........................................................... 50 4.4 PRÉ-TRATAMENTO COM PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO

SUPLEMENTADO COM CINZAS ........................................................ 52 4.4.1 Planejamento 2³ fatorial completo ................................................ 52 4.4.2 Otimização das condições de pré-tratamento ............................... 56 4.4.3 Cinética do pré-tratamento ........................................................... 60 4.5 CARACTERIZAÇÃO DAS MELHORES CONDIÇÕES DE PRÉ-

TRATAMENTO ................................................................................ 61 4.5.1 Quantificação dos açúcares liberados ........................................... 61 4.5.2 Composição química do bagaço pré-tratado ................................ 63 4.5.3 Identificação espectrométrica de compostos orgânicos ................ 64 4.5.4 Caracterização morfológica .......................................................... 72 4.5.5 Considerações finais ..................................................................... 75 5 CAPÍTULO 5: CONCLUSÕES ................................................... 77 6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................ 79 7 ANEXOS ........................................................................................ 91

1

1 CAPÍTULO 1: INTRODUÇÃO

1.1 IMPORTÂNCIA DO ESTUDO

Nos últimos anos tem surgido um grande interesse mundial no

desenvolvimento de tecnologias que consigam aproveitar a biomassa

lignocelulósica para obtenção de produtos. Entre as diferentes formas de

biomassa, os resíduos lignocelulósicos tem despertado grande interesse,

devido à disponibilidade em larga escala, o baixo custo na obtenção e

uma possível produção energética de forma ambientalmente correta

(LYND et al., 2005; BETANCUR; JUNIOR, 2010). Entre os resíduos

lignocelulósicos, o bagaço é aquele considerado como principal resíduo

agroindustrial brasileiro, sendo produzido em cerca de 125 kg de bagaço

seco por tonelada de cana-de-açúcar (ZANIN et al., 2000). Tendo em

vista que o Brasil produziu cerca de 700 milhões de toneladas de cana-

de-açúcar em 2010, somente neste ano 87,5 milhões de toneladas de

bagaço seco foram produzidos. Por mais que o bagaço seja empregado

para geração de energia servindo como combustível de caldeiras, ainda

grande excedente se encontra sem aplicação.

O bagaço da cana-de-açúcar é composto basicamente por celu-

lose, hemicelulose e lignina, representando cerca de 93% de sua massa

seca (ZANIN et al., 2000). A conversão desta celulose e hemicelulose

em açúcares monoméricos é um processo bastante estudado devido ao

grande potencial econômico que esta atividade oferece. Os açúcares

monoméricos resultantes da conversão podem ser utilizados para a ob-

tenção de produtos como etanol, polihidroxibutirato, vitamina C (ácido

L-ascórbico), ácido cítrico, ácido glucônico, ácido lático, ácido poliláti-

co, sorbitol e outros.

No entanto, o bagaço da cana-de-açúcar, assim como os demais

resíduos lignocelulósicos, apresenta uma natureza recalcitrante devido

ao arranjo estrutural formado pelos seus componentes celulose, hemice-

lulose e lignina. Esta recalcitrância faz com que as enzimas celulases

não tenham acesso à celulose para realizar uma degradação eficaz e

liberar os açúcares monoméricos. Uma conversão efetiva de bagaço da

cana-de-açúcar em açúcares monoméricos requer três passos sequen-

ciais: (1) redução do tamanho, (2) pré-tratamento e (3) hidrólise enzimá-

tica (ZHANG; LYND, 2004; ZHANG; HIMMEL; MIELENZ, 2006).

Sendo assim, o principal obstáculo e dificuldade tecnológica para a pro-

dução em escala industrial de produtos fermentáveis a partir de lignoce-

lulose é superar a recalcitrância natural destes materiais lignocelulósi-

2

cos, que deve ser hidrolisado por enzimas para produzir açúcares fer-

mentescíveis (WYMAN, 1999).

Partindo desta premissa, inúmeras técnicas de tratamento de

materiais lignocelulósicos têm sido descritas com a finalidade de des-

prender a lignina destes materiais liberando a celulose e hemicelulose

para uma posterior hidrólise enzimática obtendo açúcares monoméricos

de vasta aplicação econômica. Entre as técnicas já descritas na literatura,

pré-tratamentos físicos, físico-químicos, químicos e biológicos têm sido

utilizados (MOSIER et al., 2005; ALVIRA et al., 2010). O pré-

tratamento com peróxido de hidrogênio alcalino tem chamado atenção,

vistos os grandes rendimentos apresentados em trabalhos recentes

(MONTE; BRIENZO; MILAGRES, 2011; RABELO et al., 2011;

KARAGÖZ et al., 2012). Além disso, o peróxido de hidrogênio (H2O2)

tem a vantagem de não gerar resíduos, uma vez que se decompõe em

água e oxigênio, Sendo assim, não gera subprodutos que inibem a hidró-

lise enzimática. No entanto, sabe-se que a elevação do pH para valores

tão altos (normalmente 11,5) exige a adição de quantidades considerá-

veis de hidróxido de sódio, o que resulta na geração de resíduos cáusti-

cos impróprios para serem descartados no meio ambiente.

Devido ao problema apontado com o pré-tratamento com peró-

xido de hidrogênio alcalino, o presente trabalho estuda um processo de

pré-tratamento com peróxido de hidrogênio sem utilizar a hidróxido de

sódio para alcalinizar o meio. Cinzas provenientes do próprio bagaço

foram usadas para garantir uma oxidação eficiente do bagaço, uma vez

que o peróxido de hidrogênio, isoladamente, não tem poder para modifi-

car as estruturas lignocelulósicas envolvidas no processo de modo a

favorecer a hidrólise enzimática. Em comparação com outros métodos

químicos, este pré-tratamento tem como grande diferencial o fato de não

utilizar ácidos e álcalis fortes, resultando em um processo com baixa

carga de resíduos, e não degradando grande parte dos açúcares como

ocorre nos processos ácidos (YANG; WYMAN, 2008). Além disso, as

cinzas podem ser facilmente obtidas nas caldeiras da própria indústria da

cana-de-açúcar, fazendo com que desta forma até mesmo as cinzas das

caldeiras tenham aplicação, diminuindo ainda mais os resíduos gerados

pela indústria.

Sendo assim, este trabalho estudou o pré-tratamento do bagaço

da cana-de-açúcar para posterior hidrólise enzimática. Para tanto foram

avaliados dois métodos de pré-tratamento: um utilizando o peróxido de

hidrogênio alcalino como um processo padrão (GOULD, 1985) e outro

utilizando o peróxido de hidrogênio suplementado com cinzas. Para

ambos foram determinados as melhores condições de trabalho visando o

3

maior rendimento possível de açúcares na etapa de hidrólise enzimática;

foram ainda realizadas análises químicas e físicas para caracterizar as

possíveis formas que cada pré-tratamento atua sobre as fibras do bagaço.

1.2 OBJETIVOS

1.2.1 Objetivo geral

Caracterizar, avaliar e comparar os pré-tratamentos com peróxido de

hidrogênio alcalino e peróxido de hidrogênio suplementado com cinzas

para uma sacarificação enzimática eficiente do bagaço da cana-de-

açúcar.

1.2.2 Objetivos específicos

a) Determinar a composição e estruturas químicas do bagaço

da cana-de-açúcar antes e após pré-tratamentos;

b) Caracterizar a morfologia do bagaço da cana-de-açúcar antes

e após os pré-tratamentos.

c) Avaliar as condições ótimas de temperatura e pH das enzi-

mas utilizadas para hidrólise enzimática;

d) Estabelecer a melhor condição do pré-tratamento com peró-

xido de hidrogênio alcalino para obtenção de açúcares redu-

tores na hidrólise enzimática;

e) Otimizar a melhor condição para o pré-tratamento com pe-

róxido de hidrogênio suplementado com cinzas para obten-

ção de açúcares redutores na hidrólise enzimática;

f) Comparar a eficiência entre os dois pré-tratamentos através

da quantificação dos açúcares formados após hidrólise en-

zimática;

4

5

2 CAPÍTULO 2: REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Este capítulo apresenta a revisão bibliográfica referente aos temas

fundamentais para o entendimento do trabalho. Em seguida, são expos-

tas algumas considerações a respeito destes temas e as suas relações

com o trabalho.

2.1 BIOMASSA LIGNOCELULÓSICA

A biomassa de uma forma mais ampla se refere a qualquer tipo de

matéria orgânica oriunda de vegetais, animais, ou ainda de processos de

transformações naturais e artificiais (AGUIAR, 2010). Na grande maio-

ria a biomassa tem origem direta ou indireta no processo de fotossíntese

sendo, portanto, uma fonte renovável. Dentre as formas de biomassa

existentes, a biomassa residual de lignocelulósicos tem recebido uma

grande atenção nos últimos anos (LYND et al., 2005). São exemplos de

resíduos lignocelulósicos o bagaço da cana-de-açúcar, sabugo de milho,

farelo de cevada, palha de arroz, palha de trigo, casca de aveia, palha de

sorgo, palha de milho, semente de algodão, jornal, resíduos urbanos e

casca de soja (AGUIAR, 2010).

Os resíduos lignocelulósicos têm despertado grande atenção no

cenário de energias renováveis, devido à disponibilidade em larga esca-

la, o baixo custo na obtenção e uma possível produção energética de

forma ambientalmente correta (LYND et al., 2005; BETANCUR;

PEREIRA JR., 2010). Segundo Lynd et al. (2005), a produção de

energia e muitos ciclos de utilização baseada em biomassa celulósica

tem uma geração quase nula de gases do efeito estufa, quando conside-

rado todo seu ciclo de vida. No entanto, estes resíduos quando utilizados

de forma integrada e racional podem revolucionar outras indústrias além

do setor energético, assim como a de alimentos, forragens e produtos

químicos (LYND; WYMAN; GERNGROSS, 1999; BETANCUR;

PEREIRA JR., 2010). O desenvolvimento de tecnologias que processem

esta biomassa trará benefícios imensuráveis para países como o Brasil

que possuem uma extensa área de alta produtividade biológica

(BETANCUR; PEREIRA JR., 2010).

No Brasil, toneladas de resíduos lignocelulósicos são geradas

mensalmente, estes quando não são destinados à queima para geração de

energia, podem receber uma alocação incorreta, causando problemas

ambientais, como por exemplo, a lixiviação de rios pelo depósito do

bagaço da cana-de-açúcar, ou o despejo em estradas vicinais e mananci-

6

ais de água (LIMA; RODRIGUES, 2007). Portanto, um eficiente pro-

cessamento nestes resíduos, não somente traria grandes avanços econô-

micos aumentando a cadeia produtiva, como estariam colaborando para

uma destinação correta destes resíduos. Um exemplo de sucesso neste

sentido foi a iniciativa dos Estados Unidos, que tornou possível o apro-

veitamento de resíduos celulósicos para a produção de etanol a partir do

método de sacarificação do milho e dos seus subprodutos como a espiga

e o sabugo (MCALOON et al., 2000). Sendo assim, o que hoje se consi-

dera subprodutos ou substrato para queima, se gerenciados da forma

correta, podem apresentar muito mais benefícios devido à celulose pre-

sente em sua composição.

Embora existam as grandes vantagens que sustentam o emprego

de biomassa lignocelulósica para geração de energia, não existem tecno-

logias de baixo custo para vencer a recalcitrância desses materiais

(LYND; WYMAN; GERNGROSS, 1999; LYND et al., 2005).

2.1.1 Composição química dos resíduos lignocelulósicos

A biomassa lignocelulósica é composta por celulose, hemicelulo-

se e lignina, além de pequenas quantidades de outros extrativos (HAN et

al., 2003). Estes componentes estão dispostos na parede celular de uma

forma que as fibras de celulose ficam envolvidas em uma matriz amorfa

de hemiceluloses e lignina (Figura 1). Essa matriz amorfa age como uma

barreira natural impedindo o ataque de microrganismos e/ou enzimas,

além de tornar esses materiais estruturalmente rígidos e pouco reativos

(FENGEL; WEGENER, 2003).

Figura 1 - Típico arranjo da parede celular de uma célula.

Fonte: Adaptado de Yu, Lou e Wu (2007).

7

2.1.1.1 Celulose

A celulose consiste em um polímero linear com aproximadamen-

te 8000-12000 unidades de anidroglucose, ligadas entre si por poliliga-

ções β-(1-4) glucosídicas. O tamanho da molécula de celulose é nor-

malmente dado em termos do seu grau de polimerização, ou seja, o nú-

mero de unidades de anidroglucose presentes em uma única cadeia

(RAMOS, 2003). A ligação de duas moléculas de glucose forma a uni-

dade estrutural básica da celulose, a celobiose (MARTINS, 2005). A

ligação de várias celobioses consecutivas forma a cadeia linear da celu-

lose. Estas cadeias lineares se ligam fortemente umas as outras por for-

tes ligações de hidrogênio formando fibrilas elementares que podem

conter tanto regiões cristalinas como regiões amorfas (LYND et al.,

2002; RAMOS, 2003). Cada fibrila elementar é formada por 36 cadeias

lineares de celulose (LEHNINGER; NELSON; COX, 2008). Diversas

fibrilas elementares, com uma espessura média de 3,5 nm, podem se

associar formando cristalitos de celulose cujas dimensões dependem da

origem e do tratamento da amostra. Posteriormente, quatro desses agre-

gados cristalinos são unidos através de uma monocamada de hemicelu-

loses, constituindo estruturas de 25 nm que são envolvidas por uma

matriz amorfa de hemicelulose e protolignina. Esta associação resulta

em um composto natural chamado de microfibrila de celulose (Figura 2)

(RAMOS, 2003; MARTINS, 2005).

A celulose apresenta regiões cristalinas e amorfas. A região cris-

talina é altamente ordenada devido às numerosas ligações de ponte de

hidrogênio intra e intermolecular. Já a região amorfa é menos ordenada

e, portanto, as cadeias apresentam uma orientação randomizada. A pro-

porção entre as áreas cristalinas e amorfas variam de uma celulose para

outra e são expressas em índice de cristalinidade (percentagem da área

cristalina) (RAMOS, 2003). Alguns autores determinam que a celulose

amorfa é mais susceptível à hidrólise enzimática do que a celulose cris-

talina, devido a desordem da cadeia que gera uma maior área superficial

para o ataque das enzimas (PITARELO, 2007; ZHANG, 2008).

8

Figura 2 - Associação dos componentes da parede celular. (1) Esqueleto da

cadeia de celulose, com a indicação do comprimento da sua unidade estrutural

básica, a celobiose; (2) Arranjo das cadeias de celulose na formação da fibrila

elementar; (3) Cristalito de celulose; (4) Secção transversal da microfibrila da

celulose, mostrando cristalitos de celulose embebidos na matriz de hemicelulose

e protolignina.

Fonte: Ramos (2003).

2.1.1.2 Hemicelulose

As hemiceluloses, também conhecidas como polioses, são hete-

ropolímeros de plantas cuja natureza química varia de um tecido para

outro, assim como de uma espécie para outra (RAMOS, 2003). São

formadas por uma variedade de unidades monossacarídicas, como pen-

toses (D-xilose, L-arabinose e L-ramnose), hexoses (D-glucose, D-manose e D-galactose) e ácidos urônicos (ácido 4-Ο-metilglucurônico e

ácido galacturônico) (PITARELO, 2007). Estas unidades de pentoses,

hexoses e ácidos urônicos são unidos por ligações β-(1 → 4) com pontos

de ramificações (1 → 2), (1 → 3) e/ou (1 → 6) (ALMEIDA, 2009). O

9

grau de polimerização das hemiceluloses geralmente é baixo (média de

100-200) e a qualidade e quantidade de açúcares dependem do tipo de

parede celular e do organismo analisado (JEFFRIES, 1994). As hemice-

luloses são classificadas de acordo com os açúcares presentes na cadeia

principal do polímero: xilanas, glucomananas e galactanas (FENGEL;

WEGENER, 2003). Na Figura 3 é apresentada a estrutura química de

uma xilana de gramínea.

Figura 3 - Representação esquemática de uma xilana de gramínea mostrando al-

guns grupos substituintes. Xyl = D-xilopiranose; Ara = L-arabinofuranose; (4-

Me)-GlcA = ácido (4-O-metil)-Dglicopiranurônico; Ac = acetil; FA = ácido

ferúlico; DDFA = ácido desidroferúlico.

Fonte: McDougall et al. (1993).

As hemiceluloses estão estruturalmente mais relacionadas com a

celulose do que a lignina. As quatro fibrilas elementares que formam o

cristalito de celulose são agrupadas uma monocamada de hemicelulose,

sendo posteriormente circundadas em uma matriz contendo hemicelulo-

se e lignina (associadas entre si por meio de interações físicas e ligações

covalentes) (CARVALHO et al., 2009). Embora as hemiceluloses sejam

muito complexas, geralmente se apresentam em forma de bastonete,

com cadeias laterais dobradas para trás na cadeia principal por meio de

ligações de hidrogênio (RAMOS, 2003). Esta estrutura de bastonete

facilita sua interação com celulose e lignina, resultando em uma associ-

ação forte que dá grande estabilidade ao conjunto (LAUREANO-

PEREZ et al., 2005).

10

2.1.1.3 Lignina

Nos tecidos vegetais a lignina está geralmente combinada com a

hemicelulose, e constitui-se como o mais importante componente não-

carboidrato da biomassa lignocelulósica (HENDRIKS; ZEEMAN,

2009). Ela é depositada na rede de carboidratos da parede celular secun-

dária das plantas, durante o seu crescimento (RAMOS, 2003). Trata-se

de um heteropolímero amorfo que é principalmente formado pela poli-

merização dos álcoois hidroxicinamílicos: p-cumarílico (unidade p-

hidroxifenila), coniferílico (unidade guaiacila) e sinapílico (unidade

siringila) (Figura 4), que são unidos por diferentes tipos de ligações

(HENDRIKS; ZEEMAN, 2009). A propriedade física mais importante

desta macromolécula biológica é a sua rigidez, o que não só dá força ao

tecido da planta, mas também impede o colapso dos elementos de água-

condutores, o que por sua vez confere a planta o apoio estrutural, im-

permeabilização, e resistência contra o ataque microbiano e estresse

oxidativo (RAMOS, 2003). Este heteropolímero amorfo é também não-

solúvel em água e opticamente inativo (HENDRIKS; ZEEMAN, 2009).

Todas estas características conferem à lignina uma resistência muito

grande à degradação, sendo portanto, a substância protagonista em con-

ferir recalcitrância aos resíduos lignocelulósicos.

As madeiras moles, também chamadas de coníferas, possuem lig-

ninas que são quase exclusivamente compostas por resíduos derivados

de álcool coniferil (lignina-G), enquanto que as ligninas de madeira

dura, também conhecidas como folhosas, são derivadas de resíduos dos

álcoois coniferil e sinapil (ligninas-GS) (FENGEL; WEGENER, 2003;

MARABEZI, 2009). Em contraste, as ligninas derivadas de gramíneas

(como no caso a cana-de-açúcar) e plantas herbáceas contêm os três

precursores básicos: coniferil, sinapil e cumaril (ligninas-GSH)

(RAMOS, 2003; MARABEZI, 2009).

Devido ao grande interesse na obtenção de plantas que forneçam

maior facilidade nos processos de deslignificação, alguns estudos têm

sido focados para manipular as vias de biossíntese da lignina destas

plantas (CARVALHO et al., 2009). O processo de remoção da lignina é

uma etapa fundamental na indústria de celulose e papel, bem como na

nascente indústria de conversão da biomassa lignocelulósica.

11

Figura 4 - Estrutura dos fenilpropanóides que compõem a lignina: (1) p-

cumarílico, (2) coniferílico e (3) sinapílico.

Fonte: Amen-Chen, Pakdel e Roy (2001).

2.1.1.4 Outros Extrativos

Além da celulose, hemicelulose e lignina os materiais lignocelu-

lósicos possuem em sua composição vários extrativos orgânicos e uma

pequena quantidade de inorgânicos, tais como, potássio, sódio, cálcio e

outros que foram adquiridos como nutrientes durante o seu crescimento

(YU; LOU; WU, 2007).

Os extrativos orgânicos são compostos intermediários do metabo-

lismo vegetal, desempenhando papel de reserva energética e de proteção

ao vegetal contra ataque de insetos e microrganismos, muitas vezes

agindo como agente inibidor nos processos de conversão de biomassa

(FENGEL; WEGENER, 2003). São exemplos de extrativos: ácidos

graxos, ceras, alcalóides, proteínas, fenólicos, açúcares simples, pecti-

nas, mucilagens, gomas, resinas, terpenos, amido, glicosídeos, saponinas

e óleos essenciais (YU; LOU; WU, 2007; SILVA, 2009).

2.1.2 Bagaço da cana-de-açúcar

A cana-de-açúcar é uma planta originária da Ásia e foi introduzi-

da no Brasil no início do regime colonial para exploração da atividade

açucareira (BRANDÃO, 1985). Desde o início do plantio de cana-de-

açúcar, os cultivares passaram por diversas modificações que resultou

12

em várias espécies que se diferenciam em conteúdo de fibras e açúcar.

Segundo Daniels e Roach (1987) a cana-de-açúcar é uma espécie aló-

gama (fecundação cruzada), da família Gramíneae (Poaceae) tribo An-

dropogoneae, gênero Saccharum, onde se destacam as espécies S. offici-

narum Linneus, S. robustum Brandes e Jeswiet ex Grassl, S. barberi

Jeswiet, S. sinense Roxb., S.spontaneum Linneus e S. edule Hassk.

Como matéria-prima fundamental em diversas aplicações, a cana-

de-açúcar se apresenta como uma forte cultura de peso econômico, sen-

do que a partir dela é possível produzir álcool combustível e industrial,

aguardente, cera e ainda, pode ser consumida in natura e em pequenos

comércios de caldo de cana (PINTO, 2002). Vale ressaltar ainda que o

Brasil se apresenta como o maior produtor de cana-de-açúcar no mundo

(Figura 5), o que torna esta cultura uma das mais importantes do país.

Figura 5 – Produção dos principais países produtores de cana-de-açúcar em

2010.

0 200 400 600 800

Brasil

Índia

China

Tailândia

México

Paquistão

Colômbia

Filipinas

Austrália

Argentina

Milhão de tonelada

Fonte: Dados obtidos na Food and Agriculture Organization of the United

Nations (2012).

Em geral, os processos de aplicação da cana-de-açúcar supracita-

dos geram resíduos como o bagaço, a palha, a vinhaça, a torta de filtro e

as cinzas das caldeiras (BNDES; CGEE, 2008). No entanto, o bagaço é

o resíduo em maior quantidade, no qual chega a ser considerado o prin-

13

cipal resíduo agroindustrial brasileiro. Um simples balanço de massa

tomando com base em uma tonelada de caule de cana-de-açúcar, nos

mostra que são formados 750 L de suco de cana (utilizado para os pro-

cessos fermentativos) e 250 Kg de bagaço, que contém cerca de 50% em

umidade (ZANIN et al., 2000). A parte úmida deste bagaço além da

água é constituída basicamente de sacarose e outros açúcares fermentes-

cíveis. Mas por outro lado, restam 125 Kg de bagaço seco que contém

53,8 kg de celulose (43%), 31,3 Kg de hemicelulose (25%), 28,8 Kg de

lignina (23%) e 3% de grupos acetil em heteroxilanas (correspondendo a

4 Kg de ácido acético), 6 Kg de extrativos incluindo sacarose residual

(4%) e 3 Kg de cinzas (2%) (ZANIN et al., 2000). Na Figura 6 é ilustra-

do o contraste dos depósitos de bagaço de cana-de-açúcar frente às usi-

nas de álcool, onde este resíduo comumente é gerado.

Figura 6 - Depósito de bagaço (resíduo) de cana-de-açúcar em usina de

produção de álcool.

Fonte: Neto (2009).

Apesar deste resíduo apresentar um grande potencial para produ-

ção de combustíveis e produtos químicos, as suas atuais aplicações se

restringem à combustão para geração de energia nas usinas onde são

gerados (LIMA; RODRIGUES, 2007). Uma pequena fração é usada

14

para forragem de gado e outros animais, no entanto ainda há excedente

(ZANIN et al., 2000; BETANCUR; PEREIRA JR., 2010). Além disso,

com o aumento da produção de cana-de-açúcar, em resposta ao cresci-

mento da demanda global de etanol, mais bagaço estará disponível

(BALAT; BALAT, 2009; BETANCUR; PEREIRA JR., 2010).

2.2 PRÉ-TRATAMENTO DE RESÍDUOS CELULÓSICOS

O bagaço da cana-de-açúcar assim como os demais resíduos lig-

nocelulósicos, apresenta uma natureza recalcitrante devido ao arranjo

estrutural formado pelos seus componentes celulose, hemicelulose e

lignina. Como já visto no item 2.1, neste arranjo estrutural a celulose

encontra-se protegida pela hemicelulose e lignina. Esta recalcitrância faz

com que as enzimas celulases não tenham acesso à celulose para realizar

uma degradação eficaz (Figura 7). Uma forma de vencer esta recalci-

trância e proporcionar uma boa condição para atuação das celulases é a

utilização de métodos de pré-tratamentos nestes resíduos lignocelulósi-

cos.

Figura 7 - Efeito do pré-tratamento na acessibilidade das enzimas celulases para

realizar hidrólise.

Fonte: Adaptado de Taherzadeh e Karimi (2008).

15

Para que o pré-tratamento seja considerado eficiente ele deve redu-

zir a recalcitrância do material aumentando a acessibilidade das enzimas

ao polímero de celulose. No entanto, para ele se tornar viável ele precisa

ter propriedades que visam um alto rendimento e baixos custos de ope-

ração (YANG; WYMAN, 2008):

Rendimento elevado para uma diferente gama de materiais lig-

nocelulósicos;

Alta digestibilidade enzimática sobre os sólidos pré-tratados. O

material pré-tratado deve ter rendimento superior a 90% de

conversão (celulose para açúcares monoméricos) em menos de

cinco dias com uma preparação enzimática inferior a 10 FPU/g

celulose;

Não apresentar uma significativa degradação de açúcares. Evitar

que ocorra perda de açúcares provenientes da celulose e hemicelu-

lose;

Não gerar substâncias tóxicas que venham inibir a etapa de hidróli-

se enzimática e fermentação;

Não necessitar de processos de moagens e/ou trituração para re-

dução das partículas da biomassa, já que estes demandam muita

energia;

Operação em reatores de custo e tamanho moderado;

Mínima demanda de energia.

Os resíduos lignocelulósicos possuem alguns fatores que estão in-

timamente ligados a sua recalcitrância à hidrólise enzimática. São estes

fatores o índice de cristalinidade da celulose, o grau de polimerização da

celulose, a área superficial acessível, o tamanho da partícula, a espessura

da parede celular, a porosidade e a barreira de lignina juntamente com o

conteúdo de hemicelulose formado ao redor das fibrilas de celulose

(TAHERZADEH; KARIMI, 2008; ALVIRA et al., 2010). A cristalini-

dade sozinha não é capaz de impedir a hidrólise quando uma quantidade

suficiente de enzimas for utilizada, portanto, a soma de todos os fatores

deve ser levada em consideração (RABELO, 2007).

Neste sentido, com a finalidade de atender às propriedades de vi-

abilidade e os fatores relacionados à recalcitrância dos materiais ligno-

celulósicos, diversos tipos de pré-tratamentos já foram estudados. Eles

podem ser classificados em físico, químico, físico-químico e biológico,

de acordo com as diferentes forças ou energias consumidas durante o

processo de pré-tratamento (Tabela 1).

16

Tabela 1 - Métodos de pré-tratamento de materiais lignocelulósicos para hidró-

lise enzimática.

Método Processo Tipos de Mudanças

Físico Moagem e

Trituração;

Irradiação;

Alta temperatura.

Diminui o grau de polimerização

e a cristalinidade da celulose;

Aumenta a área superficial e o

tamanho dos poros da partícula.

Químico Bases;

Ácidos;

Gases;

Agentes oxidantes e

redutores;

Solventes para ex-

tração da lignina.

Aumenta a área superficial;

Diminui o grau de polimerização

e a cristalinidade da celulose;

Parcial ou quase completa degra-

dação da hemicelulose e desligni-

ficação.

Físico-

químico

Tratamento alcalino

associado à explosão

a vapor;

Moagem com trata-

mento alcalino ou

ácido.

Degradação da hemicelulose e

deslignificação;

Aumenta a área superficial e os

poros da partícula.

Biológico Fungos e

actinomicetos.

Degradação da hemicelulose e

deslignificação;

Aumenta a área superficial e os

poros da partícula;

Diminui o grau de polimerização.

Fonte: Rabelo (2007); Taherzadeh e Karimi (2008); Alvira et al. (2010).

Todos os métodos supracitados apresentam vantagens e desvan-

tagens referentes à sua eficiência e custo. Os métodos físicos são relati-

vamente ineficientes no aumento de digestibilidade da biomassa e os

biológicos apresentam um rendimento muito inferior aos demais. Os

processos físico-químicos apresentam baixa digestibilidade quando

comparados aos tratamentos simples (RABELO, 2007), e os métodos

químicos muitas vezes acabam formando inibidores para as enzimas na

etapa de hidrólise e fermentação (ALVIRA et al., 2010). Sendo assim,

foi escolhido como objeto de estudo um método químico de pré-

17

tratamento, optando por um composto com baixa ou nula geração de

resíduos inibidores.

2.2.1 Método químico de pré-tratamento

Existe uma grande variedade de métodos químicos de pré-

tratamento, compreendendo mecanismos diferentes de ação. Mas, de

uma forma geral, os métodos químicos conseguem deslignificar o mate-

rial sem degradar a cadeia celulósica, ocasionando apenas uma parcial

degradação da hemicelulose que está intimamente ligada à lignina, con-

tribuindo para uma diminuição no grau de polimerização e índice de

cristalinidade da celulose bem como em um aumento da porosidade do

material (TAHERZADEH; KARIMI, 2008).

Entre os pré-tratamentos químicos foi escolhido o método de oxi-

dação por peróxido de hidrogênio como alvo de estudo. O peróxido de

hidrogênio (H2O2) é um dos oxidantes mais versáteis que existe, além de

possuir um alto poder oxidante na sua forma natural (Tabela 2), ele pode

ser convertido em radical hidroxila (•OH) através de catálise, obtendo

um potencial de oxidação ainda maior. Além disso, o peróxido de hidro-

gênio não gera resíduos na biomassa, além de praticamente não formar

produtos secundários (RABELO; FILHO; COSTA, 2008; RABELO et

al., 2011). Com isso não interfere na etapa posterior de hidrólise enzi-

mática e fermentação (REYES; PERALTA-ZAMORA; DURÁN,

1998).

Tabela 2 - Potencial de oxidação de diferentes oxidantes.

Oxidante Potencial de oxidação (V)

Flúor 3,0

Radical hidroxila (OH-) 2,8

Ozônio 2,1

Peróxido de hidrogênio 1,77

Pergamato de potássio 1,7

Dióxido de cloro 1,5

Cloro 1,4 Fonte: Mattos et al. (2003).

2.2.1.1 Pré-tratamento com peróxido de hidrogênio

Na natureza a degradação efetiva da lignina é realizada por mi-

crorganismos que utilizam um grupo de enzimas oxidativas que são

capazes de oxidar subestruturas da lignina na presença de peróxido de

18

hidrogênio (ARANTES; MILAGRES, 2009). Além disso, o peróxido de

hidrogênio tem sido amplamente empregado como agente de deslignifi-

cação nos processos de branqueamento nas indústrias têxtil, de papel e

celulose, onde é usado como alvejante (GOULD, 1985; RABELO et al.,

2011).

O peróxido de hidrogênio, além de possuir um alto potencial de

oxidação e um bom desempenho nos processos de deslignificação, se

apresenta como um composto limpo, sendo que sua decomposição for-

ma apenas água e oxigênio (equação 2.1). Sendo assim pode ser consi-

derado, um agente promissor na utilização para pré-tratamentos de mate-

riais lignocelulósicos.

H2O2 H2O + O2 (2.1)

Segundo Gould (1985), a adição de hidróxido de sódio (NaOH)

nas soluções com peróxido de hidrogênio faz com que o pH aumente e

com isso, uma série de reações são desencadeadas levando à formação

de radicais hidroxilas (•OH). Estes radicais atacam os grupos hidrofíli-

cos dos materiais lignocelulósicos quebrando algumas ligações e pro-

movendo a oxidação da estrutura da lignina bem como a dissolução da

hemicelulose e lignina (RABELO, 2007).

Para um melhor entendimento das reações que atuam no processo

de pré-tratamento com peróxido de hidrogênio alcalino (peróxido de

hidrogênio adicionado de hidróxido de sódio) é necessário avaliar todas

as reações envolvidas na sua decomposição (GOULD, 1985).

Em pH alcalino, o peróxido de hidrogênio (H2O2) se dissocia e

forma o ânion hidroperóxido (HOO-):

H2O2 HOO- H

+ (2.2)

Com o pH a 11,5, o ânion hidroperóxido pode reagir com o H2O2

não dissociado para formar um radical hidroxila (OH) altamente reati-

vo e superóxido (O-2) como mostra a reação abaixo (equação 2.3).

H2O2 + HOO- OH + O

-2 + H2O (2.3)

Na ausência de outros reagentes, radicais hidroxílicos e superóxi-

dos reagem entre si formando oxigênio e água:

OH + O-2 H

+ O2 + H2O (2.4)

19

Então, a equação global das equações 2.3 e 2.4, formam:

H2O2 + HOO- H

+ O2 + 2H2O (2.5)

Analisando as equações 2.1 e 2.5, fica claro que o máximo de

oxigênio que pode ser envolvido na solução alcalina é igual à metade da

fração molar de peróxido de hidrogênio. Sendo assim, se outros com-

postos que reagem com radical hidroxila (OH) e/ou superóxido (O-2)

estiverem presentes, haverá uma competição na equação 2.4, podendo

ser observado uma redução do oxigênio na equação 2.5. Desta forma,

Gould (1985) descreve que o pré-tratamento com peróxido de hidrogê-

nio alcalino atua como agente oxidante da lignina.

O pH da solução de peróxido de hidrogênio influência na reação

de deslignificação de materiais lignocelulósicos. O estudo de Gould

(1984) avaliou o pré-tratamento por peróxido de hidrogênio alcalino em

resíduos agrícolas como palha de trigo e resíduos da colheita de milho, e

constatou que a deslignificação destes materiais ocorreu apenas nos

tratamentos com pH acima de 10,5 com a máxima deslignificação ocor-

rendo a pH 11,5 ou maior. Em pH 6,8 apenas 10-15% da lignina foi

solubilizada, com isso a digestibilidade da biomassa também foi baixa.

Segundo Rabelo et al. (2011), o peróxido de hidrogênio é um mé-

todo de pré-tratamento muito promissor para o bagaço da cana-de-

açúcar. Em estudo comparativo com o hidróxido de cálcio, o pré-

tratamento com peróxido de hidrogênio alcalino foi mais veloz (exigiu

uma hora a menos) e ocorreu em temperatura ambiente, além de ser

capaz de conduzir uma alta produção de glucose no processo final,

mesmo quando o bagaço não foi previamente moído e/ou peneirado. Isto

se explica pelo seu grande potencial oxidativo e o fato de não deixar

resíduos que venha a inibir a atividade das celulases na etapa de sacari-

ficação. Em seu estudo, a condição ótima de pré-tratamento foi de

7,35% de peróxido de hidrogênio, incubados a 25°C durante 1 hora.

Monte, Briezo e Milagres (2011) realizaram um pré-tratamento

no bagaço da cana-de-açúcar com peróxido de hidrogênio alcalino se-

guido de uma hidrólise enzimática adicionada de suco de abacaxi. A

melhor condição de pré-tratamento foi de com 60°C de temperatura, 2% de peróxido de hidrogênio e a 0,5% de sulfato de magnésio por um perí-

odo de 4 horas. Nestas condições, a remoção da lignina atingiu cerca de

70% e a de hemicelulose 36%. A remoção de lignina e hemicelulose do

bagaço pelo pré-tratamento com peróxido de hidrogênio alcalino clara-

mente produziu um substrato com características melhoradas para a

20

hidrólise enzimática por celulases, uma vez que foi atingida uma alta

conversão enzimática (63%) em um curto tempo de reação (24 h). No

entanto, a degradação do polímero hemicelulose não é vantajosa, sendo

que este carboidrato poderia ser reduzido a unidades monoméricas de

hexoses e pentoses.

Karagöz et al. (2012) utilizaram o pré-tratamento com peróxido

de hidrogênio alcalino na palha de colza para produção de etanol. A

condição ótima de pré-tratamento foi de 5% de peróxido de hidrogênio a

50°C durante 1 hora de incubação. Com esta condição, 5,73 g de etanol

foi obtida na fração líquida e 14,07 g de etanol foi produzido por co-

fermentação a partir da fração sólida do pré-tratamento. Com a adição

de 0,5 M de sulfato de magnésio durante o pré-tratamento melhorou o

processo de deslignificação, aumentando em 0,92% a produção de eta-

nol.

Outras tecnologias envolvendo o uso do peróxido de hidrogênio

para o pré-tratamento de materiais lignocelulósicos já foram desenvolvi-

das. Takagi (1987) descreve um método de pré-tratamento para substân-

cias lignocelulósicas utilizando uma solução aquosa de peróxido de

hidrogênio na presença do íon metálico Mn+2

. Segundo este autor, o íon

metálico ajuda no processo de oxidação liberando radicais hidroxilas

(•OH). Martínez-Huitle e Brillas (2009) descrevem que o peróxido de

hidrogênio é comumente ativado em efluentes ácidos com íons de Fe2+

agindo como catalisador (reagente de Fenton), e a partir deste processo

são liberados radicais hidroxilas (•OH), como forte oxidante de materi-

ais orgânicos. Lucas et al. (2012) utilizaram acetato de manganês para

catalisar a oxidação do peróxido de hidrogênio e promover a deslignifi-

cação de madeira. Esta madeira pré-tratada apresentou uma hidrólise

enzimática 20-40% superior a não tratada. Estas tecnologias possuem

em comum a utilização de metais para catalisar a liberação dos radicais

hidroxilas (•OH).

Referente à utilização do peróxido de hidrogênio em conjunto

com cinzas para promover o tratamento de materiais lignocelulósicos,

não existem trabalhos publicados. Sendo que este trabalho está em pro-

cesso de depósito do pedido de patente (Anexo 1), intitulada “Método

de pré-tratamento e hidrólise de materiais lignocelulósicos para obten-

ção de açúcares monoméricos” (QUADRI; ODISI; LIMA, 2012).

21

2.3 HIDRÓLISE ENZIMÁTICA

O processo de hidrólise da celulose à glucose envolve no mínimo

três grupos de celulases, que atuam de forma sinérgica e diferentemente

conforme o organismo e o substrato, podendo ser genericamente carac-

terizadas como: endoglucanases, exoglucanases ou celobiohidrolases e

β-glucosidases (LYND et al., 2002; ZHANG; HIMMEL; MIELENZ,

2006; CASTRO; PEREIRA JR, 2010; OGEDA; PETRI, 2010; ODISI et

al., 2012).

As endoglucanases (EC 3.2.1.4) iniciam a hidrólise da celulose

clivando de forma randômica as ligações β-1,4-glicosídicas internas da

estrutura amorfa da fibra celulósica, liberando oligossacarídeos de di-

versos graus de polimerização e, consequentemente, novos terminais,

sendo um redutor e um não redutor (CASTRO; PEREIRA JR, 2010).

Estas enzimas hidrolisam a celulose amorfa e celuloses modificadas

quimicamente (solúveis), como carboximetilcelulose (CMC) e hidroxie-

tilcelulose (MARTINS, 2005).

O grupo das exoglucanases é constituído por celobiohidrolase

(3.2.1.91) e glucano hidrolase (3.2.1.74). As glucano hidrolases são

capazes de liberar glucose diretamente da fibra celulósica (CASTRO;

PEREIRA JR, 2010). Já as celobiohidrolases agem de maneira progres-

siva em extremidades redutoras e não-redutoras da celulose, e possuem

maior afinidade por celulose insolúvel ou microcristalina, liberando

majoritariamente a celobiose, além de glucose e celotriose como produ-

tos (MARTINS, 2005; FERREIRA, 2010) Estas enzimas geralmente

sofrem inibição pelo seu próprio produto de hidrólise, a celobiose

(ZHANG; HIMMEL; MIELENZ, 2006).

As β-glucosidases (3.2.1.21) atuam nos resíduos de celodextrina e

celobiose hidrolisando-os a glucose (LYND et al., 2002; OGEDA;

PETRI, 2010). Assim como as celobiohidrolases, também é reportada

com a característica de sofrer inibição por seu produto de hidrólise.

O mecanismo sinérgico (Figura 8) das celulases faz com que a

velocidade de formação de produtos solúveis aumente significativamen-

te quando comparado à velocidade de ação isolada das enzimas

(SANDGREN; STÅHLBERG; MITCHINSON, 2005). No mecanismo

sinérgico exo-endo, as endoglucanases clivam randomicamente cadeias

na superfície da celulose, fornecendo numerosos sítios adicionais para

que as celobiohidrolases possam clivar (OGEDA; PETRI, 2010). Se-

gundo Bhat e Bhat (1997), o grau de sinergismo varia conforme o tipo

de celulose que é utilizada na hidrólise. Na presença de uma celulose

22

cristalina o sinergismo entre as endoglucanases e exoglucanases é alto,

no entanto, à medida que o índice de cristalinidade diminui o sinergismo

também diminui. Em derivados solúveis da celulose, como o CMC, o

sinergismo é muito baixo ou ausente.

Figura 8 - Mecanismo de hidrólise da celulose pelo complexo de celulases do

gênero Trichoderma. (Endos - endoglucanases; exosR - exoglucanases atuando

nos terminais redutores; exosNR - exoglucanases atuando nos terminais não

redutores; β-Gase – β-glucosidases).

Fonte: Adaptado de Zhang, Himmel e Mielenz (2006).

23

3 CAPÍTULO 3: MATERIAIS E MÉTODOS

Este capítulo apresenta, de forma detalhada, as metodologias pro-

postas para os pré-tratamentos e hidrólise enzimática do bagaço da cana-

de-açúcar, bem como a caracterização dos materiais envolvidos nestes

processos.

3.1 SUBSTRATO

3.1.1 Preparo do bagaço da cana-de-açúcar

O bagaço de cana-de-açúcar utilizado neste trabalho foi obtido

em comércio de caldo de cana na cidade de Florianópolis, SC. O bagaço

foi seco sob a luz solar durante um período de 3-4 dias até que perdesse

substancialmente sua umidade. Após a pré-secagem, o bagaço foi moído

em moinho analítico (Quimis - Q298A), sendo posteriormente lavado

com água destilada até ficar livre de açúcares proveniente do caldo.

Durante a lavagem foram realizadas diversas medidas de sólidos solú-

veis em refratômetro (Biobrix - 2 WAJ) até obter o valor de 0° Brix. O

bagaço foi seco em estufa a 50°C por 72 horas, e em seguida, foi manti-

do a temperatura ambiente por 24 horas e embalado em sacos plásticos

até o momento do uso.

Figura 9 - Bagaço utilizado para os ensaios de pré-tratamento.

24

3.1.2 Preparo das cinzas do bagaço da cana-de-açúcar

O bagaço foi seco sob a luz solar durante um período de 3-4 dias

até que perdesse substancialmente sua umidade. Após a pré-secagem, o

bagaço foi incinerado em um grande recipiente até ficar carbonizado. O

bagaço carbonizado foi levado para a mufla (600°C por 8 horas) e trans-

formado em cinzas. As cinzas foram armazenadas em tubos cônicos até

o momento do uso.

Figura 10 - Bagaço carbonizado (à esquerda) e cinzas (à direita).

3.1.3 Caracterização química

3.1.3.1 Determinação do teor de extrativos totais

Os extrativos totais foram determinados conforme a norma

TAPPI T 264 cm-97 (TAPPI, 1997). Esta metodologia foi empregada

também para eliminar os extrativos das amostras para análises posterio-

res. Os procedimentos práticos foram conduzidos em duas fases. Na

primeira foi realizada a extração em solvente orgânico e na segunda

extração em água.

A extração em solvente orgânico foi realizada em extrator Soxh-

let. Para tanto, foram utilizados 5 g de amostra seca e 200 mL de etanol-

tolueno (1:2 (v/v)). As amostras foram acondicionadas em um cartucho

confeccionado com papel de filtro e colocadas dentro da coluna do So-

xhlet. O solvente foi colocado em um balão de 500 mL, de massa seca

conhecida, sendo que o material foi extraído por 7 horas. O balão con-

tendo os extrativos e solventes foi levado a um evaporador sob vácuo e,

25

após a recuperação dos solventes, o balão com extrativos foi levado à

estufa (105 ± 2°C) até peso constante. O teor de extrativos foi calculado

com base na diferença de massas.

Para a extração com água, o material foi extraído em balão sob

refluxo por 7 horas, sendo utilizadas 5 g de amostra seca em 200 mL de

água. Após a extração, o material foi filtrado a vácuo em cadinho de

vidro sinterizado e separado para posterior análise. Após a extração, foi

separada uma alíquota de 25 mL para a determinação da massa de extra-

tivos totais. Esta alíquota foi colocada em uma placa de petri previamen-

te tarada e levada a estufa (105 ± 2°C) até peso constante. A partir da

diferença de massas foi calculada a quantidade de extrativos em gramas

contidos em 25 ml de solução.

Considerando a quantidade de extrativos encontrados nas duas fa-

ses, e a quantidade de amostras empregadas na extração, calculou-se o

teor de extrativos em percentagem (%).

3.1.3.2 Determinação do teor de celulose

O teor de celulose foi determinado segundo a metodologia de Ku-

rschner-Hoffner (BROWNING, 1967). Para tanto, foram empregadas 5

g de amostra livre de extrativos (item 3.1.3.1) com 125 mL de soluções

alcoólicas de ácido nítrico sob refluxo, durante quatro ciclos de 1 h.

Após cada ciclo, a solução de ácido nítrico alcoólica é removida e um

novo volume da solução é adicionado. A solução de ácido nítrico alcoó-

lico consistiu em misturar um volume de solução de ácido nítrico 65%

(m/m) com quatro volumes de etanol com 96% de pureza. No final dos

quatro ciclos, a celulose foi lavada, seca em estufa (105 ± 2°C) até peso

constante. O teor de celulose foi calculado pela diferença de massas.

3.1.3.3 Determinação do teor de holocelulose

A holocelulose (hemicelulose + celulose) foi determinada utili-

zando o método de clorito de sódio (BROWNING, 1967; MORAIS;

ROSA; MARCONCINI, 2010). Uma quantidade de 1 g de fibras foi

diluída em 60 mL de água destilada sob agitação magnética sob 70 ±

2°C durante 30 minutos. Depois do equilíbrio térmico, 1,5 g de clorito

de sódio e 2 mL de ácido acético foram adicionados. Este procedimento

foi repetido depois de 1 e 2 horas, resultando em 3 horas de reação. Por

fim, a massa resultante foi filtrada e seca em estufa (105 ± 2°C) até atin-

gir massa constante. O teor de holocelulose foi calculado pela diferença

26

de massas. O teor de hemicelulose foi determinado pela diferença da

holocelulose e celulose.

3.1.3.4 Determinação do teor de lignina de Klason

A quantificação do teor de lignina insolúvel de Klason foi deter-

minada de acordo com o método de Gomide e Demuner (1986). Para

tanto, 3 g de amostra livre de extrativos (item 3.1.3.1), foi tratada com

ácido sulfúrico 72% a 20°C por um período de 1 h sob agitação constan-

te. Após este período, a mistura foi diluída até uma concentração de 3%

em ácido sulfúrico e incubada em autoclave (118°C) por 1 h para pro-

mover a hidrólise total dos poli e oligossacarídeos. Posteriormente, a

mistura foi filtrada em cadinho de Gooch previamente tarado. O materi-

al retido foi lavado com água quente e seco em estufa (105 ± 2°C) até

peso constante. O teor de lignina foi calculado pela diferença de massas.

3.1.3.5 Determinação do teor de cinzas

O teor de cinzas da amostra foi determinado de acordo com a

norma Tappi 211 om-12 (TAPPI, 2012). Os cadinhos utilizados foram

previamente incubados em mufla a 575°C por 1 hora. Após este período,

foram adicionados 0,5 g de amostra e os cadinhos retornaram à mufla

(575 °C ) por 5 horas. A amostra calcinada foi transferida para um des-

secador para resfriar até atingir a temperatura ambiente e massa constan-

te. O teor de cinzas foi obtido pela diferença de massas.

3.1.3.6 Quantificação de metais

A quantificação de metais foi realizada pelo Laboratório de Es-

pectrometria de Massa e Atômica do Departamento de Química da

UFSC. As amostras foram pesadas, aproximadamente 130 mg, em fras-

cos de teflon, aos quais foram adicionados 5 mL de ácido nítrico bi-

destilado e 1 mL de peróxido de hidrogênio supra-puro. Os mesmos

foram fechados e levados ao micro-ondas (Milestone – MLS 1200) para

a digestão utilizando um programa de temperatura com quatro etapas -

250 Watts, 400 Watts, 650 Watts e resfriamento - de 5 minutos cada.

Em seguida, os vasos foram resfriados e adicionado 1 mL de ácido fluo-

rídrico bi-destilado, sendo os vasos fechados e submetidos novamente

ao mesmo programa do micro-ondas. Por fim, as amostras foram lidas

em Espectrômetro de Massa com Plasma Indutivamente Acoplado ICP-

MS (Perkin Elmer - NexION 300 D).

27

3.1.3.7 Identificação espectrométrica de compostos orgânicos

Para observar a ocorrência de modificações químicas na estrutura

das amostras de bagaço antes e após os pré-tratamentos e a hidrólise

enzimática foram realizadas análises de Espectroscopia de Infraverme-

lho com Transformada de Fourier (FTIR). Os espectros foram obtidos

em espectrômetro Shimadzu (IRPrestige-21), usando uma resolução de

4 cm-1

e 120 varreduras. Foram pesadas aproximadamente 3 mg de

amostra e preparadas em 300 mg de pastilhas de KBr (Sigma-Aldrich -

221864). As amostras de bagaço, com e sem tratamento, utilizadas para

a análise foram secas por liofilização. As análises foram realizadas no

Laboratório de Controle de Processos do Departamento de Engenharia

Química da UFSC.

3.1.3.8 Caracterização morfológica

Microscópio eletrônico de varredura (MEV) foi utilizado para ob-

servar as características morfológicas das estruturas lignocelulósicas do

bagaço. As amostras a serem observadas foram montadas sobre uma fita

adesiva condutora, em seguida foram recobertas com ouro utilizando o

aparelho SCD 500 da marca LEICA. Após este tratamento o material foi

observado no MEV (JEOL - JSM-6390LV) utilizando uma voltagem de

15 kV. Estes procedimentos foram conduzidos no Laboratório Central

de Microscopia Eletrônica (LCME) da UFSC.

3.2 ENZIMAS

Para os ensaios de hidrólise enzimática foram utilizadas as enzi-

mas comerciais de Aspergillus niger (Sigma-Aldrich - 22178). As in-

formações contidas na especificação do produto indicam a presença de

enzimas endoglucanase e exoglucanase, excluindo a presença da enzima

β-glucosidase. No entanto, ensaios prévios identificaram a presença das

três enzimas (endoglucanase, exoglucanase e β-glucosidase), e portanto,

esta formulação comercial foi utilizada como única fonte de enzimas.

3.2.1 Ensaios de atividade enzimática

3.2.1.1 β-glucosidase

A β-glucosidase foi avaliada pelo substrato cromogênico ρ-

nitrofenil-β-D-glicopiranosídeo (PNP-G, Sigma-Aldrich - N7006) se-

28

gundo a metodologia de Lima et al. (2009). A reação foi composta por

50 µL do substrato PNP-G (2 mM) e 50 µL da enzima comercial (2

mg/mL), ambos diluídos em tampão para manter o pH desejado. A rea-

ção foi incubada por 15 minutos na temperatura requerida. Posterior-

mente, a reação foi interrompida com 100 μL de Na2CO3 (1 M) e resfri-

ada em temperatura ambiente. Alíquotas de 100 μL foram avaliadas em

espectrofotômetro (Tecan – λ 405 ηm). A leitura foi comparada a uma

curva padrão de ρ-nitrofenil (PNP), nas concentrações de 0,125; 0,250;

0,375; 0,5; 0,75 e 1 mM. Todos os ensaios foram realizados em quatro

réplicas. Uma unidade de enzima (U) para o substrato PNP-G foi defini-

da como a atividade da enzima que catalisa a conversão de 1 µmol de

PNP em um minuto.

3.2.1.2 Exoglucanase

A exoglucanase foi avaliada pelo substrato cromogênico ρ-

nitrofenil-β-D-celobiosídeo (PNP-C, Sigma-Aldrich - N5759), segundo

Lima et al. (2009). Este substrato pode igualmente ser degradado pela β-

glucosidase, portanto, foi realizado um ensaio prévio adicionando dife-

rentes concentrações do açúcar Glucono Delta Lactona (Sigma-Aldrich -

G4750), para inibir a atividade da β-glucosidase sem inibir a exogluca-

nase. Foram realizados paralelamente ensaios com 50 µL do substrato

PNP-G (2 mM) e PNP-C (2 mM), contendo 50 µL da enzima comercial

(2 mg/mL) e diferentes concentrações de glucono-delta-lactona (10, 20,

30, 40, 50, 100, 150, 200, e 250 mM). As reações foram incubadas,

interrompidas e avaliadas em espectrofotômetro conforme item 3.2.1.1.

Foi escolhida a concentração que inibia quase que totalmente a atividade

da β-glucosidase sem afetar a atividade da exoglucanase.

Após estabelecida a forma de inibir a β-glucosidase, a reação foi

composta por 50 µL do substrato PNP-C (2 mM) adicionados de gluco-

no-delta-lactona na concentração ideal e 50 µL da enzima comercial (2

mg/mL), ambos diluídos em tampão para manter o pH desejado. As

reações foram incubadas, interrompidas e avaliadas em espectrofotôme-

tro conforme item 3.2.1.1. Todos os ensaios foram realizados em quatro

réplicas. Uma unidade de enzima (U) para o substrato PNP-C foi defini-

da como a atividade da enzima que catalisa a conversão de 1 µmol de

PNP em um minuto.

29

3.2.1.3 Endoglucanase

A enzima endoglucanase foi avaliada com substrato Azo-CM-

Cellulose (AZO-CMC, Sigma-Aldrich - 18693), segundo Lima et al.

(2005). Este substrato consiste em uma molécula de azul brilhante do

remazol (ABR) ligado à moléculas de CMC. A reação foi constituída de

100 μL de AZO-CMC (4 mg/mL) e 100 μL da enzima comercial (2

mg/mL), ambos diluídos em tampão para manter o pH desejado. A rea-

ção foi incubada por 30 minutos na temperatura requerida. Posterior-

mente, foram adicionados 50 μL de HCl (1M), procedendo-se a resfria-

mento em banho de gelo (10 min) para estagnar a reação. Posteriormen-

te, a reação foi centrifugada para precipitar o substrato não degradado

(3500 G, por 5 min). Alíquotas de 100 μL do sobrenadante obtido após a

centrifugação foram avaliadas em espectrofotômetro (Tecan – λ 595

ηm). A leitura foi comparada a uma curva padrão de ABR, nas concen-

trações de 50, 100, 150, 200, 250 e 300 mg/mL. Todos os ensaios foram

realizados em quatro réplicas. Uma unidade de enzima (U) para o subs-

trato AZO-CMC foi definida como a atividade da enzima que catalisa a

conversão de 1 µmol de ABR em um minuto.

3.2.2 Condições ótimas de atividade da enzima

As enzimas comerciais foram submetidas a ensaios para determi-

nar as condições ótimas de temperatura e pH. Para ambos, foram utili-

zados os procedimentos já descritos paras as enzimas β-glucosidase

(item 3.2.1.1), exoglucanase (item 3.2.1.2) e endoglucanase (item

3.2.1.3).

3.2.2.1 Determinação da temperatura ótima

Para determinação da temperatura ótima das enzimas comerciais

os ensaios com PNP-G, PNP-C e AZO-CMC foram diluídos em tampão

acetato (50 mM, pH 4,8). O tampão e as enzimas foram incubados sepa-

radamente por 10 minutos nas temperaturas avaliadas (10, 20, 30, 40,

45, 50 e 60 ºC), e em seguida foram misturados iniciando a reação na

temperatura desejada por um tempo determinado para cada enzima.

3.2.2.2 Determinação do pH ótimo

O pH ótimo das enzimas comerciais foram conduzidos com os

substratos PNP-G, PNP-C e AZO-CMC diluídos em tampões acetato

30

(50 mM) com diferentes pHs (3,6; 4,0; 4,4; 4,8; 5,3 e 5,65). Todas as

reações foram incubadas na temperatura ótima determinada na etapa

anterior (item 3.2.2.1).

3.3 PRÉ-TRATAMENTO

Foram avaliadas as condições ótimas e a eficiência de dois méto-

dos de pré-tratamento de material lignocelulósico utilizando o peróxido

de hidrogênio. O primeiro método consiste em um pré-tratamento com

peróxido de hidrogênio alcalino (item 3.3.1), e o segundo um pré-

tratamento com peróxido de hidrogênio suplementado com cinzas (item

3.3.2). Os pré-tratamentos foram avaliados de acordo com a concentra-

ção de açúcares redutores totais (ART) liberados durante a hidrólise

enzimática (Figura 11). Após o estabelecimento das condições ótimas de

cada processo, estes foram avaliados quanto às modificações físico-

químicas realizadas no bagaço.

Figura 11 – Fluxograma da metodologia aplicada para determinação da eficiên-

cia dos pré-tratamentos avaliados.

31

3.3.1 Pré-tratamento com peróxido de hidrogênio alcalino

O pré-tratamento com peróxido de hidrogênio alcalino foi reali-

zado em erlenmeyer (frasco de 125 mL), contendo 2% (p/v) de bagaço

de cana-de-açúcar e solução final no volume de 20 mL. A concentração

do peróxido de hidrogênio (H2O2), a temperatura e a frequência de agi-

tação foram estabelecidas de acordo com o planejamento experimental.

A solução foi alcalinizada com hidróxido de sódio (NaOH) até atingir

pH de 11,5. As reações foram incubadas por um período de 3 horas em

uma mesa agitadora orbital (Tecnal - TE421). Ao término da reação, o

líquido reacional foi descartado e o material sólido foi lavado com água

destilada até atingir pH neutro (7,0). Posteriormente, as amostras foram

levadas para a estufa e secas em uma temperatura de 60°C até atingirem

peso constante. Por fim, as amostras foram pesadas em balança analítica

e armazenadas em tubos cônicos e temperatura ambiente até o seu poste-

rior uso na etapa da hidrólise enzimática (item 3.4).

3.3.2 Pré-tratamento com peróxido de hidrogênio suplementado com

cinzas

O pré-tratamento com peróxido de hidrogênio suplementado com

cinzas foi realizado em erlenmeyer (frasco de 125 mL), contendo 2%

(p/v) de bagaço de cana-de-açúcar e solução final no volume de 20 mL.

A concentração do peróxido de hidrogênio, a concentração de cinzas

(proveniente da queima do bagaço – item 3.1.2) e a temperatura foram

determinadas de acordo com o planejamento experimental. As reações

foram incubadas por um período de 3 horas em agitação constante de

1,67 Hz em uma mesa agitadora orbital. Ao término da reação, o líquido

reacional foi descartado e o material sólido foi lavado com água destila-

da até atingir pH neutro (7,0). Posteriormente, as amostras foram leva-

das para a estufa e secas em uma temperatura de 60°C até atingirem

peso constante. Por fim, as amostras foram pesadas em balança analítica

e armazenadas em tubos cônicos e temperatura ambiente até o seu poste-

rior uso na etapa da hidrólise enzimática (item 3.4).

3.3.3 Planejamento experimental e análise estatística dos dados

Para a determinação das condições ótimas de pré-tratamento do

bagaço foram realizados planejamentos experimentais fatoriais 23 com-

pletos para ambos os pré-tratamentos. Para o pré-tratamento com peró-

32

xido de hidrogênio alcalino foram analisadas três variáveis: concentra-

ção do peróxido de hidrogênio (% (v/v)), a temperatura (°C ) e a fre-

quência de agitação (Hz). Para o pré-tratamento com peróxido de hidro-

gênio suplementado com cinzas foram analisadas as variáveis: concen-

tração do peróxido de hidrogênio (% (v/v)), concentração de cinzas (%

(p/v)) e a temperatura (°C ). A resposta analisada foi o rendimento da

reação, medido em teor de açúcares redutores totais (ART). Os resulta-

dos obtidos foram avaliados estatisticamente por uma Análise de Vari-

ância (ANOVA) utilizando um coeficiente de confiança de 95%

(p≤0,05).

3.4 HIDRÓLISE ENZIMÁTICA

As amostras de bagaço resultante das etapas de pré-tratamento

(itens 3.3.1 e 3.3.2) foram colocadas em erlenmeyer (frasco de 125 mL),

juntamente com 20 mL de tampão (Acetato de sódio, 50 mM, pH ótimo

da enzima - item 3.2.1.2), e em seguida foram adicionadas as enzimas na

concentração final de 2 mg/mL (Equivalente à 2 U/mL, sendo 1 U cor-

responde à quantidade de enzimas que libera 1 umol de glucose a partir

de carboximetilcelulose por minuto, a pH 5,0 e 37°C). Os erlenmeyers

foram vedados com parafilme para que não houvesse uma alteração

considerável do volume reacional e em seguida, foram incubados em

uma mesa agitadora orbital com rotação mantida a 2,5 Hz e temperatura

ótima das enzimas previamente determinadas (item 3.2.1.1).

Foram coletadas alíquotas de 500 μL durante a hidrólise enzimá-

tica em períodos de tempo pré-determinados (0, 6, 12, 24, 36, 48, 60

horas). As alíquotas foram fervidas a 100°C por 10 minutos, em termo-

bloco (Marconi – MA4004) para inativação das enzimas. Por fim, as

alíquotas coletadas foram aferidas quanto à quantidade de ART (item

3.4.1).

Ao final do tempo de hidrólise, o material hidrolisado foi lavado

com água destilada para remoção dos açúcares e enzimas aderidas e, em

seguida, foram secos a uma temperatura de 60°C e armazenados em

tubos cônicos e temperatura ambiente para posterior uso em alguma

análise, caso necessário.

3.4.1 Açúcares Redutores Totais (ART)

Os ART foram determinados pelo método do ácido 3,5–

dinitrosalicílico (DNS). O reagente de DNS foi preparado de acordo

com Miller (1959) e Ghose (1987). O DNS é um reagente não específi-

33

co, que reage com moléculas de cinco e seis carbonos. Foram pipetados

100 µL da amostra e mais 100 µL do reagente DNS em um microtubo

(1,5 mL). As reações de DNS foram conduzidas em um termobloco

aquecido a 100°C, durante 15 minutos. Em seguida, os tubos foram

estabilizados a 4°C durante 5 minutos. Posteriormente, 1 mL de água

destilada foi adicionado e mantido a temperatura ambiente. Por fim, 100

uL da reação foi transferida para uma microplaca (96 poços) e a absor-

bância avaliada em espectrofotômetro (Tecan – λ 540 ηm). Os resulta-

dos foram comparados com uma curva padrão de glucose em tampão

acetato (50 mM, pH 4,0).

3.4.2 Quantificação da Glucose

Para a quantificação da glicose foi utilizado um teste comercial

(Laborclin – Bioliquid Glicose), segundo Tietz (2006). Os ensaios são

baseados na atividade da Glucose Oxidase/Peroxidase que agem sobre a

glucose e modificam a cor do reagente de trabalho. Os procedimentos

práticos foram conduzidos de acordo com o manual do fabricante.

34

35

4 CAPÍTULO 4: RESULTADOS E DISCUSSÃO

Este capítulo apresenta os resultados obtidos dos processos de

pré-tratamento e da caracterização dos materiais envolvidos.

4.1 CARACTERIZAÇÃO DA MATÉRIA-PRIMA

4.1.1 Bagaço da cana-de-açúcar

O bagaço da cana-de-açúcar utilizado neste trabalho foi caracteri-

zado quanto à sua composição química (Tabela 3). De acordo com os

resultados obtidos, a quantidade de celulose, cinzas e extrativos é simi-

lar a outros estudos com bagaço (WYMAN, 1996; RABELO et al.,

2011; ZHAO; ZHANG; LIU, 2012). No entanto, o valor de hemicelulo-

se e lignina estão ligeiramente diferentes destes estudos. Rabelo et al.

(2011) encontraram 26,4 ± 0,2% de lignina e Wyman (1996) apresenta

25,2% de lignina, estes valores ligeiramente inferiores podem ser conse-

quência do tipo de amostra utilizada. Rabelo (2007) analisou frações de

bagaço com diferentes granulometrias, uma fração com o bagaço bruto

recolhido da moenda de cana e a outra fração com o bagaço bruto penei-

rado, restando apenas pequenas partículas. A fração que não foi peneira-

da mostrou um valor superior de lignina.

Tabela 3 - Composição química (%) do bagaço da cana-de-açúcar.

Componente Presente trabalho Wyman

(1996)

Rabelo et al.

(2011)

Celulose 41,6 ± 0,9 40,2 40,5

Hemicelulose 20,9 ± 0,8 23,8 22,9

Lignina 28,1 ± 0,3 25,2 26,4

Cinzas 3,7 ± 0,3 4,0 0,6

Extrativos 0,7 ± 0,2 4,4 1,6

4.1.2 Cinzas do bagaço da cana-de-açúcar

Foi realizada a quantificação de quatro metais presentes nas cin-zas do bagaço da cana-de-açúcar (Tabela 4). Estes metais foram analisa-

dos tendo em vista que no estudo de Lima et al. (2005), estes metais

atuaram como cofator enzimático, aumentando a atividade da enzima

endoglucanase. De acordo com os resultados obtidos, existe uma quan-

tidade superior dos metais Ca e Mg em comparação com Na e Mn. Esta

36

diferença é ocasionada pelo fato de que durante o processo de combus-

tão da biomassa alguns elementos das cinzas são facilmente volatizados,

como é o caso do Na e Mn, e outros em menor extensão como o Ca e

Mg (PITA, 2009).

Tabela 4 - Quantificação dos principais metais das cinzas.

Metais Concentração g/Kg de cinzas

Sódio (Na) 1,73 ± 0,01

Magnésio (Mg) 11,04 ± 0,06

Cálcio (Ca) 14,66 ± 0,06

Manganês (Mn) 2,98 ± 0,01

4.2 AVALIAÇÃO DAS CONDIÇÕES ÓTIMAS DAS ENZIMAS

As enzimas celulases (β-glucosidase, exoglucanase e endogluca-

nase) contidas na formulação comercial foram caracterizadas quanto às

suas condições ótimas de temperatura e pH, para que estas fossem em-

pregadas durante a etapa de hidrólise enzimática.

4.2.1 β-glucosidase

As condições ótimas de temperatura e pH da β-glucosidase foram

avaliadas sobre o substrato PNP-G. Na Figura 12 é possível observar

que a atividade máxima foi encontrada na temperatura de 45°C e em pH

4,0. As condições de pH ácido e temperaturas mesofílicas (40-60 °C )

são características comuns para enzimas β-glucosidases do organismo

Aspergillus niger. Dekker (1986) encontrou a mesma condição de pH

ótimo para as β-glucosidases de outra linhagem de A. niger, no entanto a

condição de temperatura ótima foi registrada entre 60-70 °C . O mesmo

acontece com Abdel-Naby, Osman e Abdel-Fattah (1999) que avaliando

três β-glucosidases de A. niger, encontraram o pH ótimo em 4,5 e as

temperaturas ótimas em 55 e 60 °C . O contraste das condições ótimas

de temperatura e pH das β-glucosidases de uma mesma espécie revelam

a importância desta etapa de caracterização.

37

Figura 12 – Influência da temperatura e do pH na atividade da enzima β-

glucosidase sobre o substrato PNP-G.

0 10 20 30 40 50 60 700

1

2

3

4

5

Temperatura (°C)

Ati

vid

ad

e E

nzim

áti

ca (

U/m

L)

3 4 5 60

1

2

3

4

5

pH

Ati

vid

ad

e E

nzim

áti

ca (

U/m

L)

4.2.2 Exoglucanase

A enzima exoglucanase foi avaliada a partir do substrato cromo-

gênico PNP-C. Para que o ensaio não fosse afetado pela atividade da β-

glucosidase que pode igualmente degradar este substrato (PARRY et al.,

2001), foi realizado um ensaio prévio, com diferentes concentrações de

glucono-delta-lactona, para verificar qual concentração é capaz de inibir

a atividade da β-glucosidase, mantendo uma boa atividade para exoglu-

canase. Conforme apresentado na Figura 13 na concentração de 50 mM

de glucono-delta-lactona, praticamente não é possível observar atividade

enzimática sobre o substrato PNP-G (específico para β-glucosidase),

indicando que a β-glucosidase encontra-se inibida. No entanto, nesta

concentração de 50 mM de glucono-delta-lactona é possível observar

atividade enzimática sobre o substrato PNP-C (degradado por β-

glucosidase e exoglucanase), indicando que a exoglucanase está ativa.

Em valores superiores de concentração de glucono-delta-lactona, a ati-

vidade sobre o PNP-C é diminuída, indicando que maiores concentra-

ções começam a inibir parcialmente a exoglucanase. Portanto, a concen-

tração de 50 mM de glucono-delta-lactona foi adicionada ao ensaio de

PNP-C para avaliação da influência da temperatura e pH na atividade

enzimática.

38

Figura 13 - Influência da concentração de glucono-delta-lactona na atividade

das enzimas β-glucosidase e exoglucanase sobre os substratos PNP-G e PNP-C.

0 10 20 30 40 50 100 150 200 2500

2

4

6PNP-G

PNP-C

Concentração de Glucono-Delta-Lactona (mM)

Ati

vid

ad

e E

nzim

áti

ca (

U/m

L)

De acordo com os resultados apresentados na Figura 14 é possí-

vel observar que a atividade ótima da exoglucanase ocorre nas mesmas

condições ótimas da β-glucosidase (45° C e pH 4,0). Estas condições de

temperatura e pH são comuns para enzimas de representantes do gênero

Aspergillus. Estes fungos geralmente habitam ambientes ácidos e com

temperatura mesofílica (OKADA, 1985), o que reflete em uma fisiolo-

gia adaptada para sobreviver nestas condições.

Figura 14 - Influência da temperatura e do pH na atividade da enzima exogluca-

nase sobre o substrato PNP-C adicionado de 50 mM de glucono-delta-lactona.

4.2.3 Endoglucanase

Para a avaliação da endoglucanase foi utilizado o substrato cro-

mogênico AZO-CMC. Esta enzima também apresentou suas condições

39

ótimas de atividade em 45°C de temperatura e pH 4 (Figura 15). As

mesmas condições foram encontradas em outros estudos com A. niger

(HURST et al., 1977; OKADA, 1985).

Figura 15 - Temperatura e pH ótimo da enzima endoglucanase.

4.2.4 Considerações

As enzimas celulases avaliadas (β-glucosidase, exoglucanase e

endoglucanase) apresentaram sua atividade superior nas mesmas condi-

ções de temperatura (45°C) e pH (4,0). Portanto, estas condições foram

utilizadas para realizar todas as etapas de hidrólise enzimática na avalia-

ção dos pré-tratamentos.

4.3 PRÉ-TRATAMENTO COM PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO ALCALINO

4.3.1 Planejamento fatorial 2³ completo

Para determinar as melhores condições de pré-tratamento com pe-

róxido de hidrogênio alcalino foi realizado um estudo avaliando a in-

fluência de três variáveis do processo, sendo elas, concentração de peró-

xido de hidrogênio (H2O2), temperatura e agitação do meio reacional

durante o pré-tratamento. Para tanto, foi realizado um planejamento

experimental fatorial 2³ completo com três repetições no ponto central,

utilizando as condições apresentadas na Tabela 5. Após o pré-

tratamento, o bagaço foi submetido à hidrólise enzimática por um perío-

do de 60 horas e os ART liberados foram quantificados. O pré-

tratamento mais eficaz foi encontrado utilizando as condições do ponto

central.

40

Tabela 5 - Matriz do planejamento experimental fatorial 2³ completo de pré-

tratamento do bagaço da cana-de-açúcar com H2O2 alcalino, e a superfície de

resposta em ART liberados após 60 horas de hidrólise enzimática.

Ensaio H2O2

(%)

Temperatura

(°C )

Agitação

(Hz)

ART

(mg g-1

)

1 3 (-1) 20 (-1) 0 (-1) 42,6

2 7 (+1) 20 (-1) 0 (-1) 65,3

3 3 (-1) 60 (+1) 0 (-1) 46,2

4 7 (+1) 60 (+1) 0 (-1) 24,2

5 3 (-1) 20 (-1) 3,33 (+1) 45,4

6 7 (+1) 20 (-1) 3,33 (+1) 71,1

7 3 (-1) 60 (+1) 3,33 (+1) 29,8

8 7 (+1) 60 (+1) 3,33 (+1) 9,2

9 5 (0) 40 (0) 1,67 (0) 76,2

10 5 (0) 40 (0) 1,67 (0) 74,2

11 5 (0) 40 (0) 1,67 (0) 75,4

Controle - - - 21,8

A influência dos fatores foi avaliada estatisticamente por

ANOVA a um nível de significância de 5% (Tabela 6). A partir do valor

do Teste F (597,8) para o modelo, que é muito maior do que o valor

tabelado (5,050) é possível concluir que o modelo descreve os dados de

forma significativa, a um nível de confiança de 95% (MONTGOMERY,

2006; ERIKSSON, 2008). Além disso, o modelo não apresenta evidên-

cias de falta de ajuste, uma vez que o valor do Teste F para a falta de

ajuste (2,265) é menor do que o valor tabelado (19,16).

Tabela 6 - Analise de Variância (ANOVA) para o modelo sugerido a partir do

planejamento fatorial 2³ completo de pré-tratamento do bagaço da cana-de-

açúcar com H2O2 alcalino.

Fonte de

Variação

Soma Qua-

drática

Graus de

Liberdade

Média Qua-

drática Teste F

Modelo 5400 5 1080 597,8 a

Resíduo 9,034 5 1,807

Falta de ajuste 6,980 3 2,327 2,265 b

Erro puro 2,055 2 1,027

Total 5409 10 a

F-tabelado5,5 5,05 b F-tabelado3,2 19,16

Máxima variação explicada = 99,96%

Máxima variação explicável = 99,83%

41

A Tabela 7 mostra os efeitos e os coeficientes do modelo de re-

gressão para a produção de ART; os efeitos significativos são aqueles

com valor de p≤0,05. Como o coeficiente de curvatura é significativo

mostra que o modelo não é linear. Os efeitos principais significativos

foram temperatura e agitação, sendo que ambos afetam negativamente o

rendimento. A seguir, são significativas as interações concentração de

H2O2 × temperatura (1*2), e temperatura × agitação (1*3), ambos tam-

bém com influência negativa sobre o processo. Os que possuem efeitos

não significativos foram concentração de H2O2 e interação de concen-

tração de H2O2 × agitação (1*3), para um nível de confiança de 95%. Os

coeficientes não significativos foram retirados do modelo.

Tabela 7 - Efeitos e coeficientes de regressão do modelo sugerido a partir do

planejamento fatorial 2³ completo de pré-tratamento do bagaço da cana-de-

açúcar com H2O2 alcalino.

Fator Efeito a Valor p Coeficientes

Média 41,72 0,000074 41,72

Curvatura 67,05 0,000419 33,52

(1) Concentração de H2O2 1,481 0,174721 0,7406

(2) Temperatura -28,72 0,000622 -14,36

(3) Agitação -5,702 0,015431 -2,851

1*2 -22,73 0,000993 -11,36

1*3 1,076 0,272179 0,5378

2*3 -10,00 0,005092 -5,002 a Os efeitos significativos são aqueles com valor de p≤0,05.

Na Figura 16 são apresentadas as curvas de níveis da produção de

ART em função da concentração de H2O2 e temperatura, com a agitação

mantida no ponto central (1,67 Hz). É possível observar que em baixa

concentração de H2O2 a influência da temperatura é pequena, mas, à

medida que a concentração de H2O2 é aumentada a influência da tempe-

ratura aumenta proporcionalmente. Quando a concentração de H2O2 e a

temperatura do pré-tratamento foram elevadas nas condições máximas

utilizadas no planejamento, o bagaço não se tornou susceptível à hidróli-

se enzimática. Esta combinação fez com que o bagaço se tornasse um

aglomerado de partículas, assumindo uma forma semelhante a uma pla-

ca. Sendo assim, quando submetido à hidrólise enzimática este bagaço

42

em forma de placa mostrou problemas de absorção de água, permane-

cendo um aglomerado, tendo sido observado evidente redução da área

superficial disponível ao ataque enzimático. Portanto, a melhor condição

de pré-tratamento para a hidrólise é encontrada com alta concentração

de H2O2 (7%) e baixa temperatura (20 °C ).

Figura 16 - Curvas de níveis do rendimento de ART liberados após a hidrólise

enzimática em função das condições de pré-tratamento de concentração de H2O2

e temperatura, sob agitação de 1,67 Hz. Os números sobre os contornos repre-

sentam o rendimento de ART (mg g-1

do bagaço).

3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0

Concentração H2O2 (%)

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Te

mp

era

tura

(°C

)

60

50

40

30

35

25

45

55

65

20

Na Figura 17 é apresentado o rendimento de ART em função da

temperatura e agitação, quando a concentração de H2O2 é mantida no

ponto central (5%). Neste caso, observa-se que a influência da agitação

é muito pequena, e que apenas uma baixa agitação é suficiente para

manter o processo em um maior rendimento.

43

Figura 17 - Curvas de níveis do rendimento de ART liberados após a hidrólise

enzimática em função das condições de pré-tratamento de temperatura e agita-

ção, com a concentração de H2O2 em 5%. Os números sobre os contornos repre-

sentam o rendimento de ART (mg g-1

do bagaço).

20 25 30 35 40 45 50 55 60

Temperatura (°C)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

Ag

itaç

ão

(H

z)

25

30

35

404550

55

De acordo com as Figuras 16 e 17 a melhor condição, entre as

avaliadas no planejamento para o pré-tratamento de peróxido de hidro-

gênio alcalino é de 5% de H2O2, 20°C de temperatura e agitação do

meio reacional mantida acima de 0,8 Hz. No entanto, o modelo apresen-

tado não é linear e o planejamento fatorial 2³ completo aplicado é ina-

propriado para determinar a curvatura do modelo (CALADO;

MONTGOMERY, 2003; MONTGOMERY, 2006; ERIKSSON, 2008).

Sendo assim, novos experimentos utilizando planejamentos adequados

para aferir a curvatura do modelo foram realizados para determinar as

condições ótimas.

4.3.2 Otimização das condições de pré-tratamento

Partindo dos resultados obtidos na etapa anterior (item 4.3.1), foi

realizado um planejamento fatorial 2² + configuração estrela para deter-

minar as condições ótimas de pré-tratamento. Como foi observado que

uma agitação acima de 0,8 Hz é o suficiente para manter um bom ren-

44

dimento, a agitação foi mantida em 1,67 Hz e apenas as condições de

temperatura e concentração de H2O2 foram reavaliadas. A melhor condi-

ção na etapa anterior foi tomada como ponto central para planejamento

fatorial 2² + configuração estrela (Tabela 8). Após o pré-tratamento, o

bagaço foi submetido à hidrólise enzimática por um período de 48 horas

e os ART liberados foram quantificados. Os pré-tratamentos mais efica-

zes foram encontrados nos ensaios 2, 4 e 8, onde a temperatura encon-

tra-se mais elevada.

Tabela 8 - Matriz do planejamento fatorial 2² + configuração estrela do pré-

tratamento do bagaço da cana-de-açúcar com H2O2 alcalino e a superfície de

resposta em ART liberados após hidrólise enzimática de 48 horas.

Ensaio H2O2 (%) Temperatura (°C ) ART (mg g-1

)

1 5 (-1) 15 (-1) 73,3

2 5 (-1) 35 (+1) 152,0

3 9 (+1) 15 (-1) 97,6

4 9 (+1) 35 (+1) 147,6

5 4,17 (-1,41) 25 (0) 104,0

6 9,83 (+1,41) 25 (0) 116,5

7 7 (0) 11 (-1,41) 88,3

8 7 (0) 39 (+1,41) 158,6

9 7 (0) 25 (0) 100,9

10 7 (0) 25 (0) 103,1

11 7 (0) 25 (0) 107,1

12 7 (0) 25 (0) 114,5

13 7 (0) 25 (0) 106,8

Controle - - 38,5

A influência da temperatura e da concentração de H2O2 foi avali-

ada estatisticamente pelo teste ANOVA com nível de significância de

5% (Tabela 9). De acordo com o Teste F, o modelo é altamente signifi-

cativo a um nível de confiança de 95%, sendo que o valor de 60,54 é

muito maior do que o valor tabelado (3,838). Além disso, o valor do

Teste F para a falta de ajuste (1,308) é menor do que o valor tabelado

(6,388), indicando que não existe evidência de falta de ajuste para o

modelo.

45


planejamento fatorial 2² + configuração estrela de pré-tratamento do bagaço da

cana-de-açúcar com H2O2 alcalino.

Fonte de

Variação

Soma

Quadrática

Graus de

Liberdade

Média

Quadrática Teste F

Modelo 7411 4 1853 60,54 a

Resíduo 244,8 8 30,60

Falta de ajuste 138,7 4 34,68 1,308 b

Erro puro 106,1 4 26,52

Total 7656 12

a F-tabelado4,8 3,838

b F-tabelado4,4 6,388



Os efeitos e os coeficientes do modelo de regressão para a produ-

ção de ART são apresentados na Tabela 10, os efeitos significativos são

aqueles com valor de p≤0,05, que são a concentração de H2O2 linear, a

temperatura linear e quadrática e a interação da concentração de H2O2

linear × temperatura linear (1L*2L). A concentração de H2O2 quadrática

não foi considerada significativa para um nível de confiança de 95%.

Tabela 10 - Efeitos e coeficiente de regressão do modelo sugerido a partir do




Média 106,4 0,000000 106,4

(1) Concentração de H2O2 (L) 9,372 0,047825 4,686

Concentração de H2O2 (Q) 4,181 0,352265 2,090

(2) Temperatura (L) 57,02 0,000002 28,51

Temperatura (Q) 17,37 0,004354 8,685

1L*2L -14,33 0,035904 -7,169 a Os efeitos significativos são aqueles com valor de p≤0,05.

A produção de ART em função da interação entre a concentração

de H2O2 e a temperatura é apresentada na Figura 18. É possível observar

claramente que a temperatura é o fator que exerce maior influência na

obtenção de ART, sendo que quanto mais alta a temperatura, maior a

46

concentração de açúcares formados. Em relação à concentração de H2O2

é possível ver a influência a temperaturas abaixo do ponto central; a

temperaturas maiores que a do ponto central esta influência é pratica-

mente inexistente.

Figura 18 - Curvas de níveis do rendimento dos ART liberados após a hidrólise

enzimática em função das condições de pré-tratamento de temperatura e con-

centração de H2O2. Os números sobre os contornos representam os ART (mg g-1

do bagaço).

4 5 6 7 8 9 10


10

15

20

25

30

35

40

Te

mp

era

tura

(°C

)

100

110

80

70

90

120

130

140

160170

150

De acordo com a Figura 18 a temperatura ótima para o pré-

tratamento está acima das temperaturas avaliadas, no entanto, foi visto

na Figura 16, que a temperatura de 60°C não se mostrou adequada para

um pré-tratamento eficiente. Sendo assim, um novo planejamento fato-

rial 2² + configuração estrela foi realizado para encontrar a melhor con-

dição de pré-tratamento. Foram mantidas as mesmas concentrações de

H2O2 e foram escolhidas novas condições de temperatura (Tabela 11). O

ensaio 8 apresentou o maior rendimento de ART, utilizando a tempera-

tura de 45°C e concentração de H2O2 em 9,83%.

47

Tabela 11 - Matriz do planejamento experimental planejamento fatorial 2² +

configuração estrela de pré-tratamento do bagaço da cana-de-açúcar com H2O2

alcalino, e a superfície de resposta em ART liberados após hidrólise enzimática

de 48 horas.

Ensaio H2O2 (%) Temperatura (°C ) ART (mg g-1

)

1 5 (-1) 38 (-1) 127,8

2 9 (+1) 38 (-1) 167,3

3 9 (+1) 52 (+1) 144,2

4 5 (-1) 52 (+1) 172,9

5 7 (0) 35 (-1,41) 137,8

6 7 (0) 55 (+1,41) 164,4

7 4,17 (-1,41) 45 (0) 143,6

8 9,83 (+1,41) 45 (0) 183,8

9 7 (0) 45 (0) 175,6

10 7 (0) 45 (0) 179,5

11 7 (0) 45 (0) 173,6

12 7 (0) 45 (0) 172,0

13 7 (0) 45 (0) 170,6

Controle - - 42,2

Na Tabela 12 é apresentada a ANOVA para o modelo que des-

creve a influência da temperatura e da concentração de H2O2 no rendi-

mento avaliado no planejamento experimental da Tabela 11. O Teste F

aponta que o modelo é significativo dentro do nível de confiança de

95%, já que o valor de F (46,90) é bem maior que o valor tabelado

(3,838). É possível observar também que não existe evidência de falta

de ajuste, uma vez que o valor de F (2,399) é menor do que o valor tabe-

lado (6,388).

48




Fonte de

Variação

Soma

Quadrática

Graus de

Liberdade

Média

Quadrática Teste F

Modelo 3801 4 950,2 46,90 a

Resíduo 162,1 8 20,26

Falta de ajuste 114,4 4 28,60 2,399 b

Erro puro 47,69 4 11,93

Total 3963 12 a




Na Tabela 13 são apresentados os efeitos e os coeficientes do

modelo de regressão para a produção de ART, os efeitos significativos

são aqueles com valor de p≤0,05; concentração de H2O2 linear e quadrá-

tica e a temperatura linear e quadrática. Já a interação da concentração

de H2O2 linear × temperatura linear (1L*2L) não foi considerada signi-

ficativa para um nível de confiança de 95%.


planejamento experimental 2² composto central de pré-tratamento do bagaço da



Média 174,2 0,000000 174,2

(1) Concentração de H2O2 (L) 14,93 0,001860 7,466

Concentração de H2O2 (Q) -25,33 0,000119 -12,67

(2)Temperatura (L) 31,29 0,000019 15,64

Temperatura (Q) -12,70 0,006322 -6,352


Na Figura 19 é apresentada a produção de ART em função da in-

teração entre a concentração de H2O2 e a temperatura. É possível obser-var que a condição onde a produção de ART é máxima se encontrada

entre as temperaturas de 42 e 50°C onde a concentração de H2O2 se

mantém entre 8 e 10%.

49

Figura 19 - Curvas de níveis do rendimento dos açúcares redutores após a hidró-

lise enzimática em função das condições de pré-tratamento de temperatura e

concentração de H2O2. Os números sobre os contornos representam o rendimen-

to em ART (mg g-1

do bagaço).

36 38 40 42 44 46 48 50 52 54

Temperatura (°C)

4

5

6

7

8

9

10

Co

nc

en

tra

çã

o H

2O

2 (

%)

140120 130150

160

170

180

O ponto de maior produção indicado pelo modelo é pode ser ob-

tido pela equação gerada pelo programa computacional Statistica (Equa-

ção 4.1). A solução do ponto otimizado, com maior rendimento de ART

foi obtida pelo mesmo programa apresentando o valor de temperatura

em 46,17°C e a concentração de H2O2 em 9,39%.

ART = - 590,6155 + 25,6824*P - 0,2585*P² + 38,7489*T - 1,5881*T² -

0,1932*P*T

(Equação 4.1)

Onde:

ART = Açúcares redutores totais (mg g-1

bagaço)

P = Concentração de H2O2 (%)

T = Temperatura (°C)

As condições ótimas obtidas diferem dos valores encontrados em

outros trabalhos. Rabelo et al. (2011) avaliaram o pré-tratamento com

peróxido de hidrogênio alcalino em bagaço da cana-de-açúcar e encon-

50

traram a condição ótima em 7,35% de H2O2 e 25°C de temperatura.

Estes valores estão um pouco distantes dos valores encontrados no pre-

sente trabalho. Em uma etapa anterior de planejamento experimental, foi

utilizada uma condição similar a destes autores (vide Tabela 8, ensaios

do ponto central), resultando em um rendimento de cerca de 40% inferi-

or ao obtido na condição ótima encontrada no presente trabalho.

Karagöz et al. (2012) avaliaram o pré-tratamento com peróxido

de hidrogênio alcalino em palha de colza e encontraram a condição óti-

ma em 5% de H2O2 e 50°C de temperatura. Neste caso a temperatura

esta próxima à encontrada neste estudo, já a concentração de H2O2 ficou

em 5% pelo fato de ter sido a maior concentração avaliada por estes

autores. Muito provável se fosse realizado um estudo mais aprofundado

como neste trabalho, estes autores teriam encontrado um valor superior

e que teria fornecido um rendimento maior.

Ainda referente ao pré-tratamento com peróxido de hidrogênio

alcalino em bagaço de cana-de-açúcar, Monte, Brienzo e Milagres

(2011) encontraram a condição ótima em 2% de H2O2 e 60°C de tempe-

ratura, contemplando uma conversão de celulose em açúcares redutores

de aproximadamente 60%. Estas condições ótimas de pré-tratamento são

diferentes das condições supracitadas, no entanto, durante este pré-

tratamento é adicionado sulfato de magnésio, e ainda ocorre a adição de

suco de abacaxi no processo de hidrólise enzimática. Este suco contém

enzimas xilanases que auxiliam na degradação da hemicelulose, consti-

tuindo uma condição diferenciada de hidrólise o que pode permitir tra-

balhar com uma condição ótima diferenciada de pré-tratamento.

4.3.3 Cinética do pré-tratamento

A partir das condições ótimas de concentração de H2O2, tempera-

tura e agitação foi realizado um novo experimento avaliando o melhor

tempo (0; 0,33; 0,67; 1; 2; 3; 5; 10; 15 e 24 horas) de pré-tratamento.

Após os respectivos pré-tratamentos em tempos diferentes, o bagaço foi

submetido à hidrólise enzimática por 48 horas e os ART liberados no

meio foram quantificados. Na Figura 20 é possível observar que com 40

minutos de reação de pré-tratamento obteve-se o melhor rendimento de

ART. É possível observar também que um maior tempo de pré-

tratamento acaba prejudicando a susceptibilidade do bagaço para as

enzimas.

51

Figura 20 - Rendimento de ART em função do tempo do pré-tratamento de

peróxido de hidrogênio alcalino com 9,39% concentração H2O2, 46°C de tempe-

ratura e 1,67 Hz de agitação. Foi realizada uma hidrólise de 48 horas para cada

tempo de pré-tratamento.

0 5 10 15 20 250

100

200

300

Tempo de pré-tratamento (h)

Açú

care

s r

ed

uto

res (

mg

g-1

)

Em geral, a maioria dos trabalhos que avaliaram as condições de

pré-tratamento com peróxido de hidrogênio alcalino não realizam um

estudo mais aprofundado com diferentes tempos, chegando então, a

obter valores até prejudiciais ao processo. Rabelo (2007), relata que nos

primeiros 45 minutos da reação do pré-tratamento alcalino ocorre uma

grande liberação de O2 devido a decomposição do peróxido, indicando

que grande parte do peróxido de hidrogênio está presente até este perío-

do. Como é observado na Figura 20, após duas horas de pré-tratamento

ocorre uma grande queda no rendimento de açúcares redutores liberados

na hidrólise, o que pode estar relacionado com uma degradação dos

polímeros celulose e hemicelulose. O pré-tratamento por um período

após a degradação completa do peróxido de hidrogênio, acaba se tor-

nando apenas um processo de pré-tratamento alcalino desencadeado

pelo NaOH, que age de forma agressiva solubilizando grande parte da

hemicelulose (ALVIRA et al., 2010), fazendo com que esta, não esteja

mais disponível na etapa de hidrólise enzimática. No caso de Rabelo et

al. (2011) e Karagöz et al. (2012) o tempo de 1 hora utilizado está bem

próximo ao encontrado e também não apresenta uma grande diferença

de rendimento. Já Monte; Brienzo e Milagres (2011) encontraram o

tempo de 4 horas como melhor condição. Comparado ao presente estudo

52

esta condição não é adequada para se obter um melhor rendimento. No

entanto, a explicação para tal condição, é que o menor tempo avaliado

por estes autores foi o de 4 horas.

4.4 PRÉ-TRATAMENTO COM PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO SUPLEMEN-

TADO COM CINZAS

4.4.1 Planejamento 2³ fatorial completo

Para determinar quais são as melhores condições de pré-tratamento

com peróxido de hidrogênio suplementado com cinzas foi realizado um

estudo avaliando a influência de três variáveis do processo, sendo elas,

concentração de peróxido de hidrogênio (H2O2), concentração de cinzas

(proveniente da queima do bagaço) e temperatura. Para tanto, foi reali-

zado um planejamento experimental fatorial 2³ completo com três repe-

tições no ponto central, utilizando as condições apresentadas na Tabela

14. Após o pré-tratamento, o bagaço foi submetido à hidrólise enzimáti-

ca por um período de 48 horas e os ART liberados foram quantificados.

Além dos experimentos do planejamento, foram inseridos dois experi-

mentos controle, sendo, um sem pré-tratamento e outro sem pré-

tratamento adicionado de cinzas na etapa de hidrólise, para verificar se a

presença de cinzas pode influenciar na quantidade ART liberados. Os

ensaios 4, 7, 8, 9, 10 e 11 foram os que apresentaram melhor rendimen-

to. Pode-se observar também que o controle 1, que possui cinzas na

etapa de hidrólise apresentou um resultado ligeiramente superior ao

controle 2, que não teve nenhuma forma de tratamento. Esta diferença

pode-se dar pela presença de metais nas cinzas atuando como cofatores

para as enzimas celulases, o que aumenta sua atividade (LIMA et al.,

2005). Como já visto no item 4.1.2, as cinzas utilizadas apresentam uma

quantidade considerável de metais Mg e Ca e também em menores

quantidades os metais Na e Mn.

53

Tabela 14 - Matriz do planejamento experimental fatorial 2³ completo de pré-

tratamento do bagaço da cana-de-açúcar com H2O2 suplementado com cinzas, e

a superfície de resposta em ART liberados após hidrólise enzimática de 48

horas.

Ensaio H2O2

(%)

Cinzas

(%)

Temperatura

(°C )

ART

(mg g-1

)

1 3 (-1) 1 (-1) 20 (-1) 89,0

2 7 (+1) 1 (-1) 20 (-1) 87,3

3 3 (-1) 5 (+1) 20 (-1) 92,0

4 7 (+1) 5 (+1) 20 (-1) 110,1

5 3 (-1) 1 (-1) 60 (+1) 72,5

6 7 (+1) 1 (-1) 60 (+1) 66,6

7 3 (-1) 5 (+1) 60 (+1) 105,8

8 7 (+1) 5 (+1) 60 (+1) 111,6

9 5 (0) 3 (0) 40 (0) 107,3

10 5 (0) 3 (0) 40 (0) 105,7

11 5 (0) 3 (0) 40 (0) 108,7

Controle 1 - 3 - 60,1

Controle 2 - - - 49,0

A influência dos fatores foi avaliada estatisticamente pelo teste

ANOVA com nível de significância de 5% (Tabela 15). O valor para o

Teste F do modelo (29,94) é maior que o listado (5,050), portanto, o

modelo gerado é significativo dentro do nível de confiança de 95%. O

valor do Teste F para a falta de ajuste (11,59) é um pouco menor do que

o valor tabelado (19,16), sugerindo que este modelo está ajustado.


planejamento experimental fatorial 2³ completo de pré-tratamento do bagaço da

cana-de-açúcar com H2O2 suplementado com cinzas.

Fonte de

Variação

Soma

Quadrática

Graus de

Liberdade

Média

Quadrática Teste F

Modelo 2398 5 479,7 29,94 a

Resíduo 80,10 5 16,02

Falta de ajuste 75,75 3 25,25 11,59 b

Erro puro 4,36 2 2,179

Total 2478 10 a




54

Os efeitos e coeficientes do modelo de regressão para a produção

de ART são mostrados na Tabela 16, os efeitos significativos são aque-

les com valor de p≤0,05. O modelo apresentado não é linear, pelo fato

do coeficiente de curvatura ser significativo. Os efeitos significativos

foram temperatura e concentração de cinzas, seguido pelas interações da

concentração de H2O2 × concentração de cinzas (1*2), e concentração

de cinzas × temperatura (1*3). Os que possuem efeitos não significati-

vos foram concentração de H2O2 e interação de concentração de H2O2 ×

temperatura (1*3), para um nível de confiança de 95%, sendo assim

estes coeficientes foram retirados do modelo.


planejamento experimental fatorial 2³ completo de pré-tratamento do bagaço da

cana-de-açúcar com H2O2 suplementado com cinzas.


Média 91,88 0,000001 91,88

Curvatura 30,73 0,001615 15,37

(1) Concentração de H2O2 4,081 0,068232 2,040

(2) Concentração de Cinzas 26,01 0,000386 13,01

(3) Temperatura -5,453 0,033525 -2,726

1*2 7,889 0,012452 3,944

1*3 -4,122 0,066655 -2,061

2*3 13,15 0,002896 6,574 a Os efeitos significativos são aqueles com valor de p≤0,05.

A Figura 21 mostra as curvas de níveis da produção de ART em

função da interação entre a concentração de H2O2 e concentração de

cinzas com a temperatura mantida no ponto central (40 °C ). É possível

observar que a concentração de H2O2 não apresenta muita influência no

modelo. Sua influência é identificada apenas quando existe a interação

com altas concentrações de cinzas, neste caso, observa-se que concen-

trações mais altas de H2O2 tornam o pré-tratamento mais eficiente, for-

necendo maior susceptibilidade ao ataque enzimático e formação de

ART. Já a concentração de cinzas apresenta grande influência, sendo

que quanto maior sua concentração durante o pré-tratamento, maior será

a conversão em ART. A melhor condição de pré-tratamento para a hi-drólise é encontrada com alta concentração de cinzas e alta concentração

de H2O2, dentro dos valores testados. O modelo apresentado sugere que

as concentrações de H2O2 e cinzas devem ser superiores às testadas.

55

Figura 21 - Curvas de níveis do rendimento dos ART após a hidrólise enzimáti-

ca em função das condições de pré-tratamento de concentração de H2O2 e con-

centração de cinzas com a temperatura mantida em 40 °C. Os números sobre os

contornos representam os ART (mg g-1

do bagaço).

3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0


1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

Co

nc

en

tra

çã

o d

e C

inza

s (

%)

90

95

100

105

85

80

O rendimento de ART em função da concentração de cinzas e

temperatura para a concentração de H2O2 no ponto central (5%) é apre-

sentado na Figura 22. A temperatura possui sua influência intimamente

ligada à concentração de cinzas, sendo que quando esta muda sua con-

centração a temperatura pode assumir um aspecto positivo ou negativo.

Para baixas concentrações de cinzas, uma baixa temperatura é a mais

indicada, sendo que com uma concentração de cinzas mais elevada, uma

temperatura mais alta é a condição adequada. Já a concentração de cin-

zas novamente apresenta grande influência, sendo que quanto maior a

sua concentração, melhor é o efeito do pré-tratamento. A melhor condi-

ção é com elevada temperatura e elevada concentração de cinzas. No-

vamente, as condições sugeridas como ótimas pelo modelo estão acima

dos valores testados, remetendo a necessidade de um novo experimento.

56


ca em função das condições de pré-tratamento de concentração de cinzas e

temperatura com a concentração de H2O2 mantida em 5%. Os números sobre os

contornos representam os ART (mg g-1

do bagaço).

1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0

Concentração de Cinzas (%)

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Te

mp

era

tura

(°C

)

909585

75

80100

110

O modelo proposto para este planejamento experimental mostra

que as três variáveis testadas possuem seus pontos ótimos acima dos

valores testados e, portanto novos experimentos devem ser realizados

com concentrações superiores. Além disso, o modelo não é linear, reme-

tendo à necessidade de se realizar novos experimentos utilizando plane-

jamentos adequados para aferir a curvatura do modelo (CALADO;

MONTGOMERY, 2003; MONTGOMERY, 2006; ERIKSSON, 2008).

4.4.2 Otimização das condições de pré-tratamento

Partindo dos resultados obtidos na etapa anterior (item 4.4.1), foi

realizado um planejamento fatorial 2² + configuração estrela para deter-

minar as condições ótimas de pré-tratamento. Foi observado que os

fatores avaliados (concentração de H2O2, concentração de cinzas e tem-

peratura) apresentam seu ponto ótimo acima da faixa avaliada. No en-

tanto, o equipamento de incubação utilizado possui sua temperatura

máxima em 60°C, sendo inviável realizar experimentos com faixas su-

57

periores. Além disso, esta condição máxima de temperatura é bastante

adequada tendo em vista que temperaturas maiores requerem gasto ex-

cessivo de energia, o que traria consequências indesejáveis para a filoso-

fia de um processo limpo. Sendo assim, foi avaliada apenas a concentra-

ção de H2O2 e de cinzas, com a temperatura mantida em 60 °C . As

condições limite utilizadas no experimento anterior foram utilizadas

como ponto central para planejamento fatorial 2² + configuração estrela

(Tabela 17). Após o pré-tratamento, o bagaço foi submetido à hidrólise

enzimática por um período de 48 horas e os ART liberados foram quan-

tificados. O pré-tratamento com maior rendimento foi encontrado no

ensaio 1. Tabela 17 - Matriz do planejamento experimental planejamento fatorial 2² +

configuração estrela de pré-tratamento do bagaço da cana-de-açúcar com H2O2

suplementado com cinzas, e a superfície de resposta em ART liberados após

hidrólise enzimática de 48 horas.

Ensaio Cinzas (%) H2O2 (%) ART (mg g-1

)

1 3 (-1) 5 (-1) 151,1

2 3 (-1) 9 (+1) 138,6

3 7 (+1) 5 (-1) 46,1

4 7 (+1) 9 (+1) 27,7

5 2,17 (-1,41) 7 (0) 132,6

6 7,83 (+1,41) 7 (0) 7,9

7 5 (0) 4,17 (-1,41) 123,4

8 5 (0) 9,83 (+1,41) 136,2

9 5 (0) 7 (0) 110,3

10 5 (0) 7 (0) 125,1

11 5 (0) 7 (0) 110,7

12 5 (0) 7 (0) 143,7

13 5 (0) 7 (0) 142,5

Controle - - 21,5

A influência da concentração de cinzas e da concentração de

H2O2 foi avaliada estatisticamente pelo teste ANOVA com nível de

significância de 5% (Tabela 18). De acordo com o Teste F, o modelo é

altamente significativo dentro do nível de confiança de 95%, sendo que

o valor de 72,86 é muito maior do que o valor listado (4,103). Além

disso, não existe evidência de falta de ajuste para o modelo, uma vez

58

que o valor do Teste F para a falta de ajuste (0,405) é bem menor do que

o valor tabelado (6,163).


planejamento experimental planejamento fatorial 2² + configuração estrela de

pré-tratamento do bagaço da cana-de-açúcar com H2O2 suplementado com

cinzas.

Fonte de

Variação

Soma

Quadrática

Graus de

Liberdade

Média

Quadrática Teste F

Modelo 25658 2 12829 72,86 a

Resíduo 1760 10 176,1

Falta de ajuste 694,9 6 115,8 0,435 b

Erro puro 1066 4 266,5

Total 27419 12 a F-tabelado2,10 4,103

b F-tabelado6,4 6,163



Na Tabela 19 são apresentados os efeitos e os coeficientes do

modelo de regressão para a produção de ART, os efeitos significativos

são aqueles com valor de p≤0,05. Os efeitos significativos foram a con-

centração de cinzas linear e quadrática. Já a concentração de H2O2 linear

e quadrática não foram significativas para um nível de confiança de

95%, assim como a interação da concentração de cinzas linear × concen-

tração de H2O2 linear (1L*2L).


planejamento experimental planejamento fatorial 2² + configuração estrela de

pré-tratamento do bagaço da cana-de-açúcar com H2O2 suplementado com

cinzas.


Média 126,46 0,000000 126,46

(1) Concentração de Cinzas (L) -98,06 0,000048 -49,03

Concentração de Cinzas (Q) -60,78 0,001399 -30,39

(2) Concentração de H2O2 (L) -3,199 0,781754 -1,599

Concentração de H2O2 (Q) -1,235 0,920369 -0,6175


59

Na Figura 23 são apresentadas as curvas de níveis para a produ-

ção de ART em função da interação entre a concentração de cinzas e

concentração de H2O2 durante o pré-tratamento. É possível observar

que, dentro das condições testadas, a concentração de cinzas é que tem a

grande influência sobre o pré-tratamento, sendo que a utilização de 3%

seria a melhor condição. Uma utilização excessiva de cinzas prejudica o

pré-tratamento.


ca em função das condições de pré-tratamento de concentração de cinzas e

concentração de H2O2 com a temperatura mantida em 60 °C . Os números sobre

os contornos representam os ART (mg g-1

do bagaço).

2 3 4 5 6 7 8

Concentração de Cinzas (%)

4

5

6

7

8

9

10

Co

nc

en

tra

çã

o H

2O

2 (

%)

140

140

120

100

80

60

20

40

É possível obter o ponto de maior produção de ART através da

equação gerada pelo programa computacional Statistica (Equação 4.2)

referente ao modelo. A solução do ponto otimizado, com maior rendi-

mento de ART foi obtida pelo mesmo programa apresentando o valor de

concentração de cinzas em 3,40 % (p/v) e a concentração de H2O2 em 6,32%.

60

ART = 44,2143 + 54,0467*C - 7,5981*C² + 3,2051*P - 0,1543*P² -

0,3687*C*P

(Equação 4.2)

Onde:

ART = Açúcares redutores totais (mg g-1

bagaço)

C = Concentração de cinzas (%)

P = Concentração de H2O2 (%)

No planejamento experimental fatorial 2³ completo foi obtido um

modelo que apontava a concentração de cinzas para um valor acima de

5%, no entanto, no planejamento fatorial 2² + configuração estrela o

valor calculado no modelo foi de 3,40%. Esta diferença pode estar liga-

da ao mecanismo de ação destas cinzas neste processo de pré-

tratamento. É importante lembrar que a cinza utilizada como suplemento

no pré-tratamento apresenta em sua composição diversos tipos de metais

(Tabela 4). Uma série de estudos mostra que alguns metais podem ser

utilizados como catalisadores para decompor o H2O2 gerando radicais

hidroxilas (OH), e então realizar deslignificação de materiais lignocelu-

lósicos (MARTÍNEZ-HUITLE; BRILLAS, 2009; CRESTINI et al.,

2010; LUCAS et al., 2012). Segundo Pita (2009), durante o processo de

combustão para a obtenção das cinzas alguns metais se volatilizam, uns

facilmente e outros em menor extensão. Com isso, é possível pressupor

que cada processo de queima do bagaço para formação de cinzas possa

gerar concentrações diferenciadas destes metais. Sendo assim, a concen-

tração de cinzas não responderia linearmente à concentração do metal

que poderia estar colaborando para a oxidação do H2O2.

4.4.3 Cinética do pré-tratamento

A partir das condições ótimas de temperatura e concentração de

cinzas e H2O2 foi realizado um novo experimento avaliando o tempo (0;

0,33; 0,67; 1; 2; 3; 5; 10; 15 e 24 horas) reacional de pré-tratamento.

Após os respectivos pré-tratamentos o bagaço foi submetido à hidrólise

enzimática por 48 horas. Os resultados são apresentados na Figura 24,

onde é possível observar que com 2 horas de reação obteve-se o melhor

rendimento de ART. O pré-tratamento em tempo maior acaba diminuin-

do a susceptibilidade do bagaço para as enzimas.

61

Figura 24 - Rendimento de ART em função do tempo do pré-tratamento com

6,32% (v/v) H2O2, 3,40% (p/v) cinzas, 60°C de temperatura e 1,67 Hz de agita-

ção. Foi realizada uma hidrólise de 48 horas para cada tempo de pré-tratamento.

0 5 10 15 20 250

50

100

150

Tempo de pré-tratamento (h)

Açú

care

s r

ed

uto

res (

mg

g-1

)

4.5 CARACTERIZAÇÃO DAS MELHORES CONDIÇÕES DE PRÉ-

TRATAMENTO

A partir das melhores condições identificadas nas etapas de pré-

tratamento foram realizados estudos comparativos de rendimento de

açúcares, composição e estruturas químicas e caracterização morfológi-

ca. A melhor condição para o pré-tratamento com peróxido de hidrogê-

nio alcalino foi de 9,39% (v/v) H2O2, 46°C de temperatura e agitação de

1,67 Hz por um período reacional de 40 minutos. Já para o pré-

tratamento com peróxido de hidrogênio suplementado com cinzas a

condição de 6,32% (v/v) H2O2, 3,40% (p/v) cinzas, 60°C de temperatura

e agitação de 1,67 Hz por um período reacional de 2 horas foi a condi-

ção adequada.

4.5.1 Quantificação dos açúcares liberados

Para quantificar os açúcares liberados foi realizada a etapa de pré-tratamento (peróxido de hidrogênio alcalino e peróxido de hidrogênio

suplementado com cinzas) seguida pela etapa de hidrólise enzimática.

Durante a hidrólise foram coletadas alíquotas nos tempos 0, 24, 36 e 48

horas. Estas alíquotas foram avaliadas quanto à quantidade de glucose e

62

ART, conforme resultados na Tabela 20 e Figura 25. A partir dos resul-

tados é possível observar que o pré-tratamento com peróxido de hidro-

gênio suplementado com cinzas apresenta um rendimento de ART muito

próximo ao pré-tratamento com H2O2 alcalino (cerca de 18% inferior).

No entanto, o rendimento de glucose que foi avaliado por um método

mais preciso não apresentou uma diferença significativa de acordo com

o teste de Tukey HSD (p≤0,05), demostrando que o rendimento dos dois

pré-tratamentos são equivalentes. Além disso, o pré-tratamento suple-

mentado com cinzas apresenta um grande potencial visto as suas carac-

terísticas favoráveis. A alcalinização do pré-tratamento com peróxido de

hidrogênio alcalino envolve uma grande quantidade de NaOH. Para

regular o pH a 11,5 em uma solução com 9,39% (v/v) de H2O2 são ne-

cessários em média 7,30% (p/v) de NaOH (GOULD et al., 1989;

MANZANO et al., 2000). Portanto, além de gerar uma grande quantida-

de de resíduos, o pré-tratamento com peróxido de hidrogênio alcalino

apresenta um gasto superior de reagentes, além dos 7,30% de NaOH,

são utilizados cerca de 30% a mais de H2O2. Em um reator com 10 m³

para a realização do pré-tratamento com peróxido de hidrogênio alcalino

seriam utilizados cerca de 775 L a mais de H2O2 (130 volumes) compa-

rado ao pré-tratamento suplementado com cinzas, bem como uma adição

de 730 Kg de NaOH para alcalinizar o pH em 11,5. Além disso, o pré-

tratamento suplementado com cinzas apresenta uma etapa de lavagem

mais reduzida, sendo que, com a utilização de cinzas o pH se mantém

em torno de 8,5. Com isso é possível observar que sua aplicação possui

vantagens de consumir uma quantidade inferior com reagentes químicos

(H2O2 e NaOH) e não operar em pH altos, formando resíduos altamente

cáusticos.

Tabela 20 - Rendimento de ART e glucose liberados após 48 horas de hidrólise

enzimática em função do tipo de pré-tratamento.

Pré-tratamento ART

(mg g-1

bagaço)

Glucose

(mg g-1

bagaço)

H2O2 Alcalino 217,6 ±8,5 13,9 ±0,5

H2O2 com Cinzas 179,9 ±9,6 12,2 ±0,5

Sem pré-tratamento 74,3 ±4,3 5,0 ±0,4

63

Figura 25 - Rendimento de ART e glucose após hidrólise enzimática do bagaço.

Pré-tratamento com H2O2 alcalino (vermelho); Pré-tratamento com H2O2 suple-

mentado com cinzas (verde) e Sem pré-tratamento (azul).

0 10 20 30 40 500

50

100

150

200

250

Tempo de hidrólise enzimática (h)

Açú

care

s r

ed

uto

res (

mg

g-1

bag

aço

)

0 10 20 30 40 500

5

10

15

Tempo de hidrólise enzimática (h)

Glu

co

se (

mg

g-1

bag

aço

)

4.5.2 Composição química do bagaço pré-tratado

O bagaço da cana-de-açúcar resultante de cada pré-tratamento

avaliado foi caracterizado quanto à sua composição química (Tabela

21). De acordo com os resultados obtidos é possível observar que após o

pré-tratamento com peróxido de hidrogênio alcalino a quantidade de

lignina (0,28 ±0,01 g) é muito inferior à do bagaço sem pré-tratamento

(1,4 ±0,01 g). Deste modo fica claro que este método atua desprendendo

a lignina do material lignocelulósico, fazendo com que ocorra a remoção

deste componente e deixando assim a celulose e hemicelulose disponí-

vel para hidrólise enzimática (GOULD, 1985). Resultados semelhantes

a este pré-tratamento são apontados por Rabelo et al. (2011), Monte,

Brienzo e Milagres (2011) e Karagöz et al.(2012). Já o método de pré-

tratamento suplementado com cinzas não foi tão eficaz no desprendi-

mento da lignina, sendo que ainda permanece metade da lignina perma-

nece na matriz vegetal. Por outro lado, após o pré-tratamento H2O2 alca-

lino foi observado uma perda de massa de aproximadamente 35% da

hemicelulose do bagaço sem tratamento, ao passo que no pré-tratamento

com H2O2 e cinzas, a perda foi de cerca de 10%. Este resultado revela

que o pré-tratamento alcalino age de modo mais agressivo, realizando

não somente o desprendimento da lignina como também degradando

parcialmente o polímero de hemicelulose. Este fato é relatado por Mon-

te, Brienzo e Milagres (2011), que apontam a perda de 36% de hemice-

lulose após este pré-tratamento alcalino. Cabe lembrar que o pré-

tratamento alcalino possui grande quantidade de NaOH em sua compo-

64

sição, reagente que também é utilizado para a deslignificação da madei-

ra e formação de polpa de papel na indústria de celulose (OGUNSILE;

QUINTANA, 2010), o qual é extremamente cáustico. Devido à grande

quantidade utilizada de NaOH este pré-tratamento apresenta os mesmos

problemas dos pré-tratamentos com as bases fortes, sendo eles, parcial

degradação de carboidratos e geração de resíduos cáusticos. Utiliza-se a

argumentação de que pré-tratamento com peróxido de hidrogênio alcali-

no é um processo limpo sem geração de subprodutos para etapa de hi-

drólise (MONTE; BRIENZO; MILAGRES, 2011; RABELO et al.,

2011; KARAGÖZ et al., 2012). No entanto, a enorme quantidade de

NaOH adicionada para regular o pH em 11,5 torna este processo prati-

camente mais cáustico que oxidativo.

Tabela 21 - Composição química do bagaço da cana-de-açúcar após o pré-

tratamento.

Sem Pré-

tratamento

Pré-tratamento

com H2O2 Alcalino

Pré-tratamento com

H2O2 e Cinzas

Massa (g) Massa (g) Massa (g)

Inicial 5,00 3,02 ±0,09 4,51 ±0,08

Celulose 2,08 ±0,04 2,01 ±0,1 2,03 ±0,04

Hemicelulose 1,05 ±0,04 0,70 ±0,05 0,96 ±0,07

Lignina 1,4 ±0,01 0,28 ±0,01 0,78 ±0,02

Cinzas 0,19 ±0,01 0,08 ±0,01 0,15 ±0,02

Extrativos 0,035 ±0,008

4.5.3 Identificação espectrométrica de compostos orgânicos

O espectro de FTIR para a amostra do bagaço da cana-de-açúcar

possui características semelhantes às de outros materiais lignocelulósi-

cos (Figura 26). É possível identificar uma grande banda na região

4000-3300 cm-1

, que aponta um estiramento O-H; uma banda na região

de 3000-2800 cm-1

indica um estiramento C-H em grupos metil e meti-

leno, e uma forte faixa de sobreposição com absorções fortes e discretas

na região de 1750-1000 cm-1

(OWEN; THOMAS, 1989; COLOM et al.,

2003; BODÎRLĂU; TEACĂ, 2009; MARABEZI, 2009; CIOLACU;

CIOLACU; POPA, 2011). A região de 1740-1730 cm-1

indica a presen-

ça de carbonila (C=O) livre. Embora todos os materiais complexos cons-

tituintes de materiais lignocelulósicos (incluindo os extrativos) possam

apresentar carbonilas livre, a hemicelulose é o que possui maior quanti-

dade destes grupamentos (OWEN; THOMAS, 1989), remetendo esta

65

banda à característica das xilanas (BODÎRLĂU; TEACĂ, 2009; YOON

et al., 2012), que podem estar presentes em grande quantidade. Este

aumento de carbonila (C=O éster) no pico 1740 cm-1

, absorção de C-H a

1380 cm-1

(-C-CH3), e estiramento -C-O- a 1260 cm-1

confirmou a for-

mação de ligações éster (SAIKIA et al., 1995; BODÎRLĂU; TEACĂ,

2009). Segundo Bodîrlău e Teacă (2009), a presença de uma banda em

1637 cm-1

indica a presença de ligações β-glucosídicas entre as unidades

de açúcar, portanto a queda entre 1633 cm-1

para 1649 cm-1

é um forte

indicativo da presença destas ligações. E ainda, a absorção da banda 898

cm-1

, aponta para um estiramento C-O-C presente nas ligações β-(14)-

glucosídicas (SINDHU et al., 2010; CIOLACU; CIOLACU; POPA,

2011). Já a lignina pode ser identificada nas bandas 1600 cm-1

, 1510

cm-1

e 1460 cm-1

, que indicam a presença de anéis aromáticos dos álco-

ois hidroxicinamílicos (p-cumarílico, coniferílico e sinapílico) que a

constituem (COLOM et al., 2003; BODÎRLĂU; TEACĂ, 2009;

MARABEZI, 2009). A banda em 800 cm-1

colabora com a presença da

lignina, sendo que esta banda faz referência ao estiramento C–H fora do

plano nas posições 2 e 6 de siringila e guaiacila, e em todas as posições

da unidade hidroxifenila (MARABEZI, 2009).

Figura 26 - Espectro de FTIR da amostra de bagaço da cana-de-açúcar.

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

70

80

90

1460

1510

2930

Tra

nsm

itâ

ncia

(%

)

Número de Ondas (cm-1)

3423

2358

1740

1600

1649

1260

1380 800

898

1062

66

A diferença de intensidade entre as bandas 1510 e 1600 cm-1

po-

de ser utilizada para diferenciar as ligninas de coníferas (alto teor de

grupos guaiacila) das ligninas de folhosas (teor de siringila maior que na

conífera), sendo que uma maior intensidade na banda 1510 cm-1

é carac-

terística de conífera (OWEN; THOMAS, 1989; COLOM et al., 2003;

FENGEL; WEGENER, 2003; MARABEZI, 2009). Comparando as

bandas existentes no bagaço é possível observar que a intensidade na

banda de 1600 cm-1

é maior indicando que as ligninas possuem maiores

quantidades de unidades siringila. No entanto, esta banda pode ser influ-

enciada pela presença de grupos C=O, íons carboxilato e carboidratos

(MARABEZI, 2009). Por fim, com uma comparação das bandas 1510

cm-1

e 1460cm-1

, é possível observar que a banda 1510 cm-1

é mais in-

tensa, o que se enquadra dentro dos padrões estabelecidos para uma

lignina-GSH (que possui os três álcoois precursores) (MARABEZI,

2009), que corresponde à lignina presente no bagaço de cana-de-açúcar.

(RAMOS, 2003; MARABEZI, 2009). Na Tabela 22 são apresentados os

valores e atribuições das bandas de FTIR característicos para materiais

lignocelulósicos.

67

Tabela 22 - Valores e atribuições das bandas de FTIR.

Banda cm-1

Atribuições Referências

3450-3400 Estiramento O-H. Bodîrlău e Teacă (2009);

Marabezi (2009);

Ciolacu, Ciolacu e Popa

(2011).

2933-2842 Estiramento C-H em grupos

metila e metileno.

2360-2350 Estiramento assimétrico da

molécula de CO2.

Fernandes (2005).

1740-1700 Estiramento da carbonila.

C=O não conjugada

Saliba et al. (2001);

Marabezi (2009).

1637 Presença de ligações β-

glucosídicas entre as unidades

de açúcar.

Bodîrlău e Teacă (2009).

1600 Vibração do anel aromático. Owen e Thomas (1989);

Colom et al. (2003);

Marabezi (2009).

1510 Vibração do anel aromático.

1460 Deformação assimétrica C-H,

em -CH3 e -CH2-.

1380 Absorção de C-H (-C-CH3) Saikia et al. (1995);

Bodîrlău e Teacă (2009).

1260 Estiramento -C-O-

1062 Deformações do C-H e C-O. Fengel e Wegener (2003);

Rana et al. (2010).

900-890 Estiramento C-O-C presente

nas ligações β-(14)-

glucosídicas

Sindhu et al. (2010)

Ciolacu, Ciolacu e Popa

(2011).

Yoon et al. (2012)

800 Estiramento C-H fora do

plano nas posições 2 e 6 de

siringila, guaiacila, e em to-

das as posições da unidade

hidroxifenila.

Bykov (2008);

Marabezi (2009).

68

A Figura 27 compara o espectro do bagaço com o bagaço após

hidrólise enzimática de 48 horas. Não foram observadas mudanças sig-

nificativas entre os dois espectros. Houve um pequeno aumento na ban-

da de 1740 cm-1

após a hidrólise, indicando uma maior presença de car-

bonilas livres, que deve ser proveniente dos terminais redutores forma-

dos após o ataque enzimático. Já a banda de 1649 cm-1

, teve sua intensi-

dade diminuída quando comparada com a banda de 1448 cm-1

. Como já

relatado, esta banda é característica de ligações β-glucosídicas

(BODÎRLĂU; TEACĂ, 2009) e, portanto, esta diminuição está associa-

da ao ataque enzimático que atua nestas ligações. É possível observar

também no bagaço hidrolisado, uma pequena diminuição de intensidade

da banda de 800 cm-1

que está relacionada com o estiramento C-H fora

do plano dos anéis aromáticos da lignina (siringila, guaiacila, e hidroxi-

fenila), o que sugere ter uma diminuição destes anéis aromáticos

(MARABEZI, 2009).

Figura 27 - Espectro de FTIR da amostra de bagaço da cana-de-açúcar (verme-

lho) comparado com bagaço hidrolisado (púrpura).

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

60

70

80

90

800

1740

1649

Tra

nsm

itâ

ncia

(%

)

Número de ondas (cm-1)

800

1448

1448

1649

1740

A Figura 28 apresenta os espectros de FTIR para amostras pré-

tratadas com peróxido de hidrogênio alcalino e após a hidrólise enzimá-

tica. As amostras pré-tratadas e hidrolisadas não apresentaram mudanças

significativas em comparação à amostra do bagaço. É possível identifi-

69

car apenas uma leve mudança de intensidade de algumas bandas, nas

quais, não se pode afirmar uma diminuição real destes componentes,

pois pode estar relacionada apenas com a homogeneidade e concentra-

ção no preparo das pastilhas de KBr. No entanto, é possível observar

que a banda formada na região de 1740-1720 cm-1

começa a reduzir sua

intensidade após o pré-tratamento alcalino e some quase que totalmente

após a hidrólise enzimática. Como visto anteriormente, esta região é

responsável pelo estiramento das carbonilas (C=O conjugada), e uma

diminuição destes grupamentos pode ser indício da diminuição de xila-

nas que compõe a hemicelulose (BODÎRLĂU; TEACĂ, 2009; YOON

et al., 2012).


lho) comparado com bagaço pré-tratado com H2O2 alcalino (azul) e com o

bagaço pré-tratado submetido à hidrólise enzimática (púrpura).

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

20

40

60

80

1740

Tra

nsm

itâ

ncia

(%

)


1740

1740

A partir da comparação dos espectros do bagaço com as cinzas

provenientes do bagaço (Figura 29), é possível ver algumas mudanças

significativas, como uma grande diminuição da banda de estiramento

O-H. (3423 cm-1

), e o desaparecimento da banda em 2930 cm-1

, que

indica a presença de grupos metil e metileno, além disso, um aumento

significativo da banda de estiramento assimétrico do CO2 (2358 cm-1

).

Na região de 1750-1000 cm-1

a amostra de cinzas apresenta uma quanti-

70

dade bem inferior de bandas. Esse tipo de modificação está associado ao

processo de combustão que praticamente volatizou quase que toda maté-

ria orgânica presente (PAULA, 2006; PITA, 2009). É possível também

observar que a banda em 1078 cm-1

, que é responsável pelas deforma-

ções do C-H e C-O, aumenta muito a sua intensidade indicando que

restou praticamente só compostos saturados. A região entre 800 e 400

cm-1

no espectro das cinzas apresenta diversas bandas intensas, as quais

indicam compostos de silício (SILVERSTEIN; WEBSTER, 2000), sen-

do que segundo Paula (2006) e Belini et al. (2012), a cinza do bagaço da

cana-de-açúcar é composta predominantemente por dióxido de silício.


lho) comparado com amostra de cinza obtida pela queima do bagaço (verde).

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

20

30

40

50

60

70

80

90

Tra

nsm

itâ

ncia

(%

)


2930

2358

1078

1649

3423

8001325

São apresentados na Figura 30 os espectros de FTIR para amos-

tras pré-tratadas com peróxido de hidrogênio suplementado com cinzas

e após a hidrólise enzimática deste pré-tratamento. As amostras pré-

tratadas e hidrolisadas não apresentaram mudanças significativas em

comparação à amostra do bagaço. É possível observar apenas que a

amostra pré-tratada apresenta um comportamento um pouco diferencia-

do do bagaço e da amostra hidrolisada pelas enzimas. No entanto, é

possível identificar que este comportamento é determinado pela influên-

cia das cinzas adicionadas para o pré-tratamento. Como por exemplo,

71

entre 900 - 400 cm-1

é possível verificar uma grande variação dos picos

quando comparado o bagaço com o bagaço pré-tratado e hidrolisado, no

entanto, estas mudanças são dadas pela presença das cinzas junto ao

bagaço, incorporando características de compostos de silício. Como

após a etapa de hidrólise parte desta cinza se perdeu, diminuindo a con-

centração, os traços possuem uma menor intensidade. Salvo a banda de

estiramento assimétrico do CO2 (2358 cm-1

) que aumentou a sua inten-

sidade após o pré-tratamento e continuou a aumentar na etapa de hidró-

lise. Como visto anteriormente (Figura 29), a banda de CO2 é caracterís-

tica na amostra de cinza.


lho) comparado com bagaço pré-tratado com H2O2 suplementado com cinzas

(azul) e com o bagaço pré-tratado submetido à hidrólise enzimática (púrpura).

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

30

45

60

75

90

2358

Tra

nsm

itâ

ncia

(%

)


Desta forma é possível observar que ambos os pré-tratamentos

aplicados (peróxido de hidrogênio alcalino e peróxido de hidrogênio

com cinzas) não apresentaram uma função que viesse a modificar signi-

ficativamente a estrutura química do bagaço. Apenas leves modificações

de intensidade e ausência da banda de carbonilas livres (C=O conjuga-

da) relacionada com a da diminuição de xilanas que compõe a hemicelu-

lose, no caso do pré-tratamento com peróxido de hidrogênio alcalino.

72

4.5.4 Caracterização morfológica

A análise de MEV do bagaço da cana-de-açúcar submetido ao

pré-tratamento com peróxido de hidrogênio alcalino (Figura 31) revela

que o pré-tratamento induziu alterações físicas na superfície do bagaço.

O bagaço não tratado apresenta fibras consistentes e lisas (Figura 31 – A

e B), quase que intactas. Já o bagaço pré-tratado apresenta a superfície

de suas fibras fragmentadas, as quais vistas com maior proximidade

pode-se notar alguns frisos e uma maior ocorrência de pequenas fissuras

(Figura 31 – C e D), provavelmente expostos pela remoção da lignina. E

por fim o bagaço hidrolisado apresenta as fibras desfiadas em unidades

menores - microfibrilas, uma aproximação nestas fibras revela uma

grande ocorrência de fissuras (Figura 31 – E e F), criando uma superfí-

cie que se assemelha a uma rede. Portanto, a partir destas micrografias é

possível ver que o pré-tratamento contribuiu para uma desorganização

física das fibras, proporcionando uma maior acessibilidade para as en-

zimas. Observações semelhantes em micrografias de pré-tratamento de

bagaço da cana-de-açúcar foram obtidas após a aplicação de ácido fór-

mico (SINDHU et al., 2010) e de pré-tratamentos com SO2 e CO2

(CORRALES et al., 2012).

A análise de MEV do bagaço da cana-de-açúcar submetido ao

pré-tratamento com peróxido de hidrogênio suplementado com cinzas

(Figura 32) revela que o pré-tratamento induziu alterações físicas na sua

superfície. Como já relatado, o bagaço não tratado apresenta fibras con-

sistentes, que se encontram lisas, quase que intactas. O bagaço pré-

tratado apresenta sua superfície desorganizada e com a presença de pe-

quenos fragmentos na cor branca sobre as estruturas lignocelulósicas, os

quais são as cinzas utilizadas no pré-tratamento. É possível ver a evolu-

ção de um aglomerado, que quando passa pelo pré-tratamento deixa a

estrutura parcialmente desorganizada, e após a hidrólise enzimática, este

aglomerado é praticamente desfeito.

73

Figura 31 - Micrografia do bagaço da cana-de-açúcar submetido ao pré-

tratamento com peróxido de hidrogênio alcalino. A e B – Bagaço sem tratamen-

to. C e D - Bagaço pré-tratado com peróxido de hidrogênio alcalino. E e F –

Bagaço pré-tratado com peróxido de hidrogênio alcalino e submetido à hidrólise

enzimática.

A B

C D

E F

74

Figura 32 - Micrografia do bagaço da cana-de-açúcar submetido ao pré-

tratamento com peróxido de hidrogênio suplementado com cinzas. A – Bagaço

sem tratamento. B - Bagaço pré-tratado com peróxido de hidrogênio suplemen-

tado com cinzas. C – Bagaço pré-tratado com peróxido de hidrogênio suplemen-

tado com cinzas submetido à hidrólise enzimática.

Comparando as micrografias dos dois pré-tratamentos (Figuras

31 e 32), observa-se que o pré-tratamento com peróxido de hidrogênio

alcalino é mais agressivo, e apresenta uma maior desorganização das

fibras lignocelulósicas. No entanto, a forma em que as fibras do pré-

tratamento com peróxido de hidrogênio alcalino estão dispostas se as-

semelha muito com a forma em que o bagaço tratado com NaOH se

encontra (REZENDE et al., 2011). Isto reforça a hipótese de que o pré-

tratamento com peróxido de hidrogênio alcalino, é basicamente um

tratamento caustico e oxidativo, sofrendo as mesmas consequências dos

tratamentos cáusticos com bases fortes, gerando resíduos de forte agres-

sividade frente aos materiais lignocelulósicos pré-tratados, o que ocasi-

ona a perda de carboidratos com parcial degradação de hemicelulose

(MONTE; BRIENZO; MILAGRES, 2011).

A

C

B

75

4.5.5 Considerações finais

O pré-tratamento com H2O2 e cinzas quando comparado com o

pré-tratamento com H2O2 alcalino, apresenta um rendimento um pouco

inferior de açúcares redutores, no entanto, apresenta o mesmo rendimen-

to de glucose após a hidrólise enzimática. Como o procedimento de

quantificação de glucose apresenta maior precisão, é possível afirmar

que ambos pré-tratamentos possuem a mesma eficiência em tratar o

bagaço da cana-de-açúcar para posterior hidrólise enzimática.

Através de análises de composição química, é possível observar

que o pré-tratamento com H2O2 alcalino se demonstrou mais eficiente na

remoção da lignina que o pré-tratamento com H2O2 e cinzas, no entanto,

este pré-tratamento degradou uma maior quantidade de hemicelulose,

apresentando um desperdício de carboidratos. As análises de identifica-

ção de estruturas químicas não apresentaram modificações significativas

nos grupos funcionais para os pré-tratamentos avaliados. Todavia, a

partir de uma caracterização morfológica foi possível identificar uma

leve desorganização nas fibras de bagaço após ambos pré-tratamentos,

sendo que no pré-tratamento com H2O2 alcalino a desorganização foi

mais intensa.

A partir do conjunto de resultados comparativos é possível verifi-

car que o pré-tratamento com H2O2 e cinzas se apresenta menos agressi-

vo e opera em condições mais amenas de pH do que o pré-tratamento

com H2O2 alcalino, mantendo a mesma eficiência.

76

77

5 CAPÍTULO 5: CONCLUSÕES

Do trabalho aqui desenvolvido e exposto anteriormente, pode-se

obter as conclusões apresentadas a seguir.

A formulação de enzimas utilizadas para etapa de hidrólise enzi-

mática deste trabalho apresentaram todas as celulases (endoglucanase,

exoglucanase e β-glucosidase) com uma atividade ótima na mesma con-

dição de temperatura (45°C) e pH (4,0).

Referente ao pré-tratamento com peróxido de hidrogênio alcalino,

a concentração de peróxido de hidrogênio e a temperatura influenciam

no processo, enquanto que a agitação não apresenta influência. O tempo

de reação também apresenta influência no processo de pré-tratamento,

sendo que um tempo reduzido ou excessivo pode prejudicar o processo.

A partir do modelo obtido das condições testadas, 9,39% (v/v) H2O2,

46°C de temperatura e agitação de 1,67 Hz por um período reacional de

40 minutos permitem obter o maior rendimento de açúcares redutores

após hidrólise enzimática. Este pré-tratamento é um método eficiente

para remoção de lignina do bagaço da cana-de-açúcar. Além disso, uma

combinação de alta concentração de H2O2 e temperatura de 60ºC duran-

te o pré-tratamento com peróxido de hidrogênio alcalino favorece a

formação de uma placa, tornando o bagaço da cana-de-açúcar pouco

susceptível à hidrólise enzimática.

No pré-tratamento com peróxido de hidrogênio suplementado

com cinzas, utilizando planejamento experimental, pode-se observar que

a variável que exerce maior influência foi a concentração de cinzas. A

partir do modelo obtido das condições testadas, 6,32% (v/v) H2O2,

3,40% (p/v) cinzas, 60°C de temperatura e agitação de 1,67 Hz por um

período reacional de 2 horas permitem obter o maior rendimento de

açúcares redutores após hidrólise. O pré-tratamento com peróxido de

hidrogênio suplementado com cinzas é um meio eficiente de tornar o

bagaço da cana-açúcar mais susceptível à sacarificação enzimática. Este

pré-tratamento apresenta após a hidrólise enzimática um bom rendimen-

to de açúcares redutores e uma concentração de glucose igual ao pré-

tratamento com peróxido de hidrogênio alcalino. E ainda, apresenta

condições favoráveis de consumir menor quantidade de reagentes e

trabalhar em condições de pH mais ameno, quando comparado com o

pré-tratamento com peróxido de hidrogênio alcalino.

O pré-tratamento com peróxido de hidrogênio suplementado com

cinzas e peróxido de hidrogênio alcalino praticamente não ocasionaram

modificações químicas no bagaço de modo a serem perceptíveis na es-

78

pectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier. No entan-

to, apresentaram uma leve desorganização física nas fibras do bagaço, as

quais puderam ser observadas via microscopia eletrônica de varredura.

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91

7 ANEXOS

Anexo 1 – Comprovante do depósito do pedido de patente “Método de

pré-tratamento e hidrólise de materiais lignocelulósicos para obtenção

de açúcares monoméricos”

Documents

AÇÚCAR PRÉ-TRATADO COM PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO ADIC