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ADRIANA MANGUE ESQUIAVETO AUN
“ANÁLISE DAS ALTERAÇÕES MOLECULARES DOS GENES KCNJ11, ABCC8, INS E
GCK EM AMOSTRAS DE PACIENTES COM DIABETES MELLITUS NEONATAL”
CAMPINAS
2015
2
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Faculdade de Ciências Médicas
ADRIANA MANGUE ESQUIAVETO AUN
“ANÁLISE DAS ALTERAÇÕES MOLECULARES DOS GENES KCNJ11, ABCC8, INS E
GCK EM AMOSTRAS DE PACIENTES COM DIABETES MELLITUS NEONATAL”
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas
da Universidade Estadual de Campinas como parte dos
requisitos exigidos para obtenção do título de Mestra em
Ciências, na área de concentração Saúde da Criança e do
Adolescente.
Orientador: Profa. Dra. Sofia Helena Valente de Lemos Marini
Co-orientador: Profa. Dra. Maricilda Palandi de Mello
CAMPINAS
2015
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA
DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO ALUNO ADRIANA
MANGUE ESQUIAVETO AUN E ORIENTADA PELA PROFA.
DRA. SOFIA HELENA VALENTE DE LEMOS MARINI
__________________________
Assinatura da Orientadora
3
4
5
“... Não faças do amanhã
o sinônimo de nunca,
nem o ontem te seja o mesmo
que nunca mais.
Teus passos ficaram.
Olhes para trás...
mas vá em frente
pois há muitos que precisam
que chegues para poderem seguir-te.”
Charles Chaplin
6
À minha família
pelo apoio incondicional,
dedico.
7
AGRADECIMENTOS
Agradeço à minha orientadora Profa. Dra. Sofia, que me serve de exemplo de
mulher, mãe e profissional. Obrigada pelo apoio, pelos conselhos, pela paciência e pelas
advertências necessárias.
Agradeço à minha co-orientadora Profa. Dra. Maricilda, por tudo que significou e
significa na minha vida acadêmica. Agradeço imensamente por me acolher tão bem em seu
laboratório e pelas tantas coisas que me ensinaste até hoje, pessoal e profissionalmente
falando. Através das suas palavras calmas, do seu olhar sábio e atento, fui me acostumando
e me apaixonando pela vida nas bancadas. Tudo nesse trabalho que descrevo a seguir só se
tornou possível graças a sua presença firme e constante. Você é um ser humano
maravilhoso, professora! Posso te chamar de amiga?
Ao Dr. Gil agradeço por guiar e orientar minha vida profissional, por ser sempre tão
receptivo quando necessitei, por ter a palavra certa, no momento certo. Um mestre!
Obrigada!
À Fernanda, a quem honrosamente eu deveria me referir como Dra. Maria
Fernanda, mas sua humildade e o passar do tempo fizeram com que se perdessem as
formalidades. Obrigada pelo apoio ao desenvolvimento desse trabalho, pela ajuda imediata
sempre que precisei.
À Dra. Lília agradeço pela presença na minha banca de qualificação e pelos
conselhos que me deu naquela ocasião e em tantas outras que se seguiram.
A toda família CBMEG, meu Deus, amigos que conheci e que levarei pra vida
toda... Das antigas, Luli e Fer Soardi, por tanto que me ensinaram no dia a dia do
laboratório! À Mara (Marinha ou Maroca!), tão querida e tão generosa, agradeço por dividir
sua vida comigo, pessoal e acadêmica. Adoro ouvir suas explicações, compartilhar de suas
descobertas científicas. Já te disse o quanto te admiro e torço por você? À Helena
(Helenita), figura tão doce e tão firme, com quem tive o prazer e o encanto de conviver nos
últimos anos... É delicioso acompanhar suas conquistas! Obrigada pela companhia na
caminhada até aqui... Ficou mais suave e divertida com você ao meu lado! À Débora
querida, quem me deu a mão desde lá do comecinho, apoiou meus primeiros passos... E me
8
ensinou coisas tão simples mas tão essenciais na vida de laboratório, como uma professora
primária ensina o beabá ao seu aluno novato. Obrigada Dé! Ao Reginaldo e à Flávia (Regi
e Flor), obrigada pela companhia divertida, pelos tantos momentos deliciosos que
compartilhamos juntos. Que admiração tenho por vocês dois, como é feliz vê-los chegando
tão longe... À Cristiane (Cris), pela ajuda inestimável... E a todos os outros: Profa. Edi,
Sueli, Carol, Taci, Pam, Naty... Obrigada pela amizade!
Ao meu amor Marcos, companheiro de vida, obrigada pela paciência, pela
retaguarda... Obrigada por me compreender, por apoiar minhas decisões... Agradeço pela
família que construímos; pelos nossos tesouros Murilo, Luíza e Ricardo. Já te disse e
repito que amo ser feliz ao seu lado e que só assim serei feliz no futuro.
À minha querida avó Araci, minha rocha, meu porto seguro... Por tudo o que fez por
mim, pela sua torcida fiel e verdadeira. Sou abençoada por poder desfrutar da sua
companhia, de seus conselhos. Obrigada!
Aos meus pais, Madalena e Ricardo, meus amores, minha estrutura. Se surge uma
dúvida na minha vida, me viro pra vocês... e encontro sempre um olhar seguro, protetor,
que diz sutilmente “vai minha filha, se arrisca... que nós estamos e estaremos aqui, pro que
der e vier...” Amo vocês, e obrigada... Por tudo!
Aos meus irmãos Renata e Guto, agradeço pelo apoio, pela torcida e pela certeza de
que nunca estarei sozinha, pois tenho vocês comigo.
Aos meus sogros Gilda e Jacinto, agradeço por me acolherem como filha, por terem
aberto as portas do consultório para que eu iniciasse minha vida profissional, por me
apoiarem e me ampararem sempre que preciso... Vocês são demais! Tenho muita
admiração por vocês, como família e colegas de profissão.
Aos meus filhos amados, quero agradecer por preencherem a minha vida, por me
ensinarem diariamente a viver o amor mais puro e genuíno que o ser humano pode
conhecer... Vocês são a vida da minha vida!
A todos que contribuíram direta ou indiretamente para a realização desse trabalho.
9
RESUMO
O diabetes mellitus neonatal (DMN) é definido pelo surgimento de hiperglicemia
com necessidade de tratamento com insulina nos primeiros seis meses de vida. Entretanto,
nas crianças com hiperglicemia de início no primeiro ano de vida propõe-se que seja feito o
diagnóstico diferencial de diabetes mellitus tipo 1 (DM1) e DMN, especialmente através
das dosagens de autoanticorpos (anti-insulina, anti-IA2, anti-GAD e anti-ICA).
Dependendo do tempo de duração da doença, o DMN pode ser classificado em transitório
(geralmente de início na primeira semana de vida com regressão ao redor dos 18 meses de
idade, podendo recorrer na adolescência ou na vida adulta) e permanente (não entra em
remissão ao longo da vida). A origem do DMN é heterogênea e pode resultar de uma falha
no desenvolvimento pancreático, de uma diminuição da população de células beta-
pancreáticas ou de uma disfunção das células beta limitando a secreção de insulina. O
conhecimento de genes envolvidos na cascata do desenvolvimento pancreático e nos
aspectos relacionados à homeostase da glicose possibilitou entendermos os mecanismos
fisiopatológicos envolvidos na origem do DMN e de outros tipos de diabetes classificados
de diabetes monogênico, como o MODY por exemplo. Além disso, o diagnóstico
molecular trouxe benefícios para o seguimento desses pacientes, permitindo o
aconselhamento genético, norteando o prognóstico e até o tratamento em alguns deles.
Atualmente são conhecidos 21 genes responsáveis pelo DMN, sendo os mais comuns (em
termos de incidência) o gene KCNJ11 (30 a 50% dos casos), o gene INS (16%), o ABCC8
(13%) e mais raramente o gene GCK. Neste trabalho foi realizada a análise molecular dos
genes KCNJ11, ABCC8, INS e GCK em quatro pacientes diagnosticados com DMN, três
deles com a forma permanente (DMNP) e um com a forma transitória (DMNT). Não foram
encontradas mutações nos genes KCNJ11 e INS. O estudo molecular do gene ABCC8
identificou a mutação p.Phe577Leu, presente em heterozigose no único caso diagnosticado
com DMNT. A análise estrutural dessa mutação não foi realizada pois não há, até o
momento, proteínas com um grau confiável de similaridade que já tenham sido
cristalizadas. As análises de predição realizadas através das ferramentas computacionais
PolyPhen, SIFT e Align-GVGD confirmaram que se trata de uma mutação deletéria. O
estudo molecular do gene GCK confirmou a presença de duas mutações, p.Asn254His e
p.Arg447Gly, nos casos 1 e 2, configurando um genótipo de heterozigose composta. A
10
primeira foi herdada das mães dos pacientes, que são irmãs e que foram diagnosticadas com
MODY 2 enquanto a segunda mutação foi herdada dos pais dos pacientes, que são irmãos e
também foram diagnosticados com MODY 2. No irmão mais novo do caso 1 também foi
identificada a mutação p.Arg447Gly herdada do pai cujos exames laboratoriais
identificaram leve hiperglicemia de jejum (MODY 2). A análise estrutural das mutações
mostrou que ambas são bastante deletérias uma vez que comprometem a flexibilidade da
enzima glucoquinase, prejudicando sua função. As análises de predição (PolyPhen, SIFT e
Align-GVGD) também mostraram que ambas as mutações são potencialmente deletérias.
Dos quatro casos estudados, apenas em um (caso 4) não foi possível estabelecer a origem
molecular do DMNP; segundo a literatura, em 40% dos casos de DMN não é possível se
estabelecer o diagnóstico molecular.
11
ABSTRACT
Neonatal diabetes mellitus (DMN) is defined by the onset of hyperglycemia
requiring insulin therapy in the first six months of life. However, the differential diagnosis
between diabetes mellitus type 1 (DM1) and DMN in children with early hyperglycemia in
the first year of life is necessary by dosage of autoantibodies (IAA, Anti-GAD and ICA).
Depending on the duration of the disease, the DMN may be either transient (usually start in
the first week of life with regression around 18 months of age, may relapse in adolescence
or adulthood) and permanent (does not go into remission lifelong). The etiology of DMN is
heterogeneous and may result from a failure in pancreatic development, a reduction in the
pancreatic beta cell population, or a dysfunction of beta cells limiting insulin secretion. The
knowledge of genes involved in the cascade of pancreatic development and the aspects
related to glucose homeostasis allowed us to understand the pathophysiological
mechanisms involved in the origin of the DMN and other types of monogenic diabetes such
as MODY. In addition, molecular diagnosis has brought benefits to the follow-up of these
patients, allowing genetic counseling, guiding prognosis and improving treatment in some
of them. Currently, there are 21 genes known as responsible for DMN, and the most
common (in terms of incidence) are: KCNJ11 (30 to 50% of cases), INS gene (16%), the
ABCC8 (13%), and more rarely the gene GCK. In this work we performed a molecular
analysis of genes KCNJ11, ABCC8, INS and GCK in four patients diagnosed with DMN,
three of them with permanent (PNDM) and one with the transitory form (DMNT). There
were no mutations in KCNJ11 and INS genes. Molecular analysis of ABCC8 revealed the
heterozygosis for p.Phe577Leu mutation in the case diagnosed with DMNT. Structural
analysis for this mutation was not performed because there are not proteins with a reliable
degree of similarity that have already been crystallized. The prediction analyzes through
PolyPhen, SIFT and Align-GVGD computational tools confirmed that p.Phe577Leu is a
deleterious mutation. Molecular analysis of GCK gene confirmed the compound
heterozygosis for p.Asn254His and p.Arg447Gly mutations in cases 1 and 2. The first was
inherited from the mothers of the patients, who are sisters and were diagnosed with MODY
2, whereas the second mutation was inherited from fathers, who are brothers and were also
diagnosed with MODY 2. The younger brother of case 1, whose laboratory tests revealed
impaired fasting glycemia (MODY 2), also carries the p.Arg447Gly mutation. Structural
12
analysis for both mutations showed that they are quite deleterious since they compromise
the flexibility of the glucokinase enzyme, damaging its function. The prediction analysis
(PolyPhen, SIFT and Align-GVGD) have also shown that both mutations are potentially
damaging. Only one (case 4) out of four cases studied, did not have the molecular origin of
PNDM established; according to the literature, this can happen in 40% of cases.
13
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AF Activation Function
BSA Albumina Sérica Bovina
CBMEG Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética
DBD DNA Binding Domain
DMN
DMNP
DMNT
DM1
DM2
Diabetes mellitus neonatal
Diabetes mellitus neonatal permanente
Diabetes mellitus neonatal transitório
Diabetes mellitus tipo 1
Diabetes mellitus tipo 2
DMSO Dimetilsulfóxido
DNA Ácido Desoxirribonucléico
dNTP Desoxirribonucleotídeo Trifosfato
EDTA
G-6-P
Ácido Etileno Diamono Trifosfatado
Glicose-6-fosfato
HCl
HLA
Ácido Clorídrico
Antígeno de histocompatibilidade humana
Kb Kilo Bases
LBD Ligand Binding Domain
MgCl2 Cloreto de Magnésio
OMIM Online Mendelian Inheritance in Man
PB Pares de base
PCR Polymerase Chain Reaction
14
PDB Protein Data Bank
pH Potencial Hidrogênico
rpm
RCIU
tRNA
SNP
Rotações Por Minuto
Restrição de crescimento intrauterino
RNA transportador
Single Nucleotide Polymorphism
Taq Thermus Aquaticus
TBE Tris – Borato – EDTA
TE Tris – EDTA
Tm Temperatura Média
Tris Tris(hidroximetil)aminometano
15
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO 16
Características clínicas e moleculares 19
Diabetes mellitus Neonatal Transitório (DMNT) 19
Diabetes mellitus Neonatal Permanente (DMNP) 22
OBJETIVOS (Geral e Específico) 39
CASUÍSTICA E MÉTODOS 40
Casuística 40
Métodos 43
RESULTADOS E DISCUSSÃO 57
Achados moleculares no gene KCNJ11 57
Achados moleculares no gene ABCC8 59
Achados moleculares no gene GCK 63
Achados moleculares no gene INS 72
CONCLUSÕES 73
REFERÊNCIAS 75
ANEXOS 86
16
INTRODUÇÃO
Diabetes mellitus neonatal (DMN) é definido como o surgimento de hiperglicemia
com necessidade de tratamento com insulina nos primeiros seis meses de vida (3). É um
distúrbio raro com incidência estimada em um caso para cada 300.000 a 400.000 nascidos
vivos segundo Polak et al. (4), acometendo todas as raças e etnias. Alguns autores sugerem
o termo “diabetes mellitus congênito” como mais apropriado para definir a doença uma vez
que o período neonatal abrange somente os primeiros 28 dias de vida. Apesar disso, a
denominação diabetes mellitus neonatal ficou consagrada na literatura. Segundo Shield (5),
a primeira descrição clínica da doença foi feita por Kitselle em 1852, que a descreveu em
seu próprio filho.
A origem do DMN é heterogênea e pode decorrer de uma falha no desenvolvimento
pancreático (incluindo agenesia do pâncreas ou das ilhotas pancreáticas), de uma
diminuição da população de células beta-pancreáticas (por destruição ou por aumento na
sua apoptose), ou ainda por disfunção das células beta limitando a secreção de insulina.
Com o avanço no conhecimento de genes envolvidos tanto na cascata do desenvolvimento
pancreático como nos aspectos relacionados à homeostase da glicose tornou-se mais fácil
entender os mecanismos fisiopatológicos envolvidos na origem do DMN, tendo sido
identificados, até o momento, 21 genes responsáveis pela doença. Ainda assim cerca de
40% dos casos permanecem sem sua causa molecular esclarecida (6).
O DMN pode ser dividido em duas formas, de acordo com a duração da doença: a
forma transitória (DMNT), que se inicia geralmente na primeira semana de vida e regride
ao redor dos 18 meses de idade, podendo recorrer na adolescência ou na vida adulta (7); e a
forma permanente (DMNP), também de início precoce, mas que não entra em remissão
ao longo da vida (8). Baseado em dados publicados na literatura, estima-se que a forma
transitória corresponda a mais da metade (57%) do total de casos de DMN (TABELA 1)
(9).
17
Referência Num. Casos DMN Transitório DMN Permanente
von Muhlendahl et al. 1995 57 31 26
Babenko et al. 2006 73 44 29
Suzuki et al. 2007 31 16 15
Rica et al. 2007 20 11 9
Marquis et al. 2002 14 9 5
TOTAL 195 111 84
% 100 56,9 43,1
Clinicamente não é possível diferenciar se um lactente que desenvolveu diabetes
nos primeiros seis meses de vida será um tipo transitório ou permanente. Uma característica
comum das duas formas é a presença de baixo peso ao nascimento, dado esse observado
por von Muhlendahl e Herkenhoff em 1995 (10), num dos primeiros relatos na literatura de
pacientes com longo período de seguimento. Essa observação foi confirmada por diversos
outros autores com o passar dos anos, comprovando a importância da ação da insulina
como fator fundamental para o crescimento fetal (11). Nos casos de DMNT, entretanto, o
retardo de crescimento intrauterino (RCIU) parece ser mais pronunciado e está sempre
presente.
Metz et al. (12) avaliaram retrospectivamente 50 casos de DMN, dentre eles 21
casos de DMNP e 29 de DMNT. Eles puderam observar algumas diferenças nos dois
grupos: o RCIU estava presente em 74% dos casos transitórios e em 36% dos permanentes,
sendo que nos casos transitórios o comprometimento tanto do peso como do comprimento e
do perímetro cefálico ao nascimento era significativamente maior. Ademais, o
aparecimento da hiperglicemia foi mais precoce nos casos transitórios, em média aos seis
dias de vida, enquanto nos casos permanentes o diagnóstico foi ao redor dos 27 dias. Outra
TABELA 1: Resumo de dados de estudos já publicados a respeito da incidência de diabetes mellitus
neonatal transitório versus permanente. Adaptado de Aguilar-Bryan et al. (7)
18
diferença notada entre os dois grupos refere-se à dose de insulina ao início do tratamento
que foi significativamente menor nos casos transitórios. Embora os dados apresentados
sejam estatisticamente significantes, os próprios autores reforçam que muitas vezes eles se
sobrepõem, e que o diagnóstico diferencial entre as duas formas de diabetes neonatal não
pode ser feito baseado em achados clínicos.
O diagnóstico molecular de DMN tem papel fundamental não só no contexto do
diagnóstico clínico, mas também para fins de seguimento, de prognóstico, de
aconselhamento genético e até para fins terapêuticos (9).
O principal diagnóstico diferencial para o diabetes mellitus neonatal é o diabetes
mellitus tipo 1 (DM1). Embora a presença de autoanticorpos (anti-insulina, anti-IA2, anti-
GAD e anti-ICA) seja uma característica do DM1 [aqui considerado como a forma
poligênica autoimune clássica, também conhecido com DM tipo 1A(13)], deve-se levar em
conta que de 4 a 7% dos casos de DM1 recém diagnosticados são autoanticorpos negativos
tal como os casos de DMN, não sendo este, portanto, um parâmetro para diferenciar as duas
formas, especialmente naqueles diagnosticados após 6 meses de vida (14). Num estudo
retrospectivo envolvendo 111 pacientes diabéticos diagnosticados no primeiro ano de vida,
Iafusco et al. (15) buscaram identificar marcadores que pudessem diferenciar os casos auto-
imunes dos não auto-imunes. Inicialmente eles distribuíram esses pacientes de acordo com
a idade de aparecimento da doença e puderam notar dois picos de apresentação: um grupo
cujo diagnóstico se concentrou nos primeiros 3 meses de vida e outro grupo concentrado no
final do primeiro ano de vida, estabelecendo-se um cutoff em 180 dias de vida. Algumas
diferenças puderam então ser notadas entre os dois grupos:
O peso de nascimento dos pacientes incluídos no grupo dos diagnosticados
nos primeiros 6 meses de vida (chamarei de grupo 1) era significativamente
menor que no grupo cuja doença se manifestou entre 7 e 12 meses de vida
(grupo 2);
O estudo do genótipo HLA da classe II de risco para DM1 (que incluiu os
haplótipos de alto risco HLA DQB1 e DQA1) mostrou que o grupo 1
apresentava um perfil semelhante ao de indivíduos normais enquanto o grupo
19
2 apresentava um genótipo de alto risco tal qual o encontrado em indivíduos
com DM1;
A dosagem de autoanticorpos foi realizada em 26 dos 36 pacientes incluídos
no grupo 1 e destes apenas 4 apresentaram-se positivos (15,38%), sendo que
em um deles observava-se também enteropatia autoimune, sugerindo mutação
no gene FOXP3. No grupo 2, 20 dos 75 pacientes foram testados e dentre
eles, 13 (65%) demonstraram a presença de anticorpos (p<0.001).
Anos mais tarde, houve outro estudo europeu abrangendo 187 crianças portadoras de
diabetes permanente de 0 a 2 anos de idade que foram estudadas quanto ao perfil de
haplótipo HLA de risco para DM1 (16). Os achados foram semelhantes aos já então
publicados mostrando que a frequência de HLA da classe II de alto risco para DM1 é
significativamente diferente entre os pacientes com diabetes diagnosticados até os 6
meses de idade e aqueles diagnosticados após os 6 meses, sendo que no primeiro grupo a
distribuição desse genótipo de alto risco é similar ao da população normal. Concluiu-se,
portanto, que nas crianças portadoras de diabetes com necessidade de uso de insulina
manifestado nos primeiros seis meses de vida o diagnóstico de DM1 é improvável,
sugerindo-se o estudo molecular dos genes envolvidos no DMN, em especial o gene
KCNJ11.
1. CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS E MOLECULARES
1.1. Diabetes Mellitus Neonatal Transitório (DMNT)
A hiperglicemia característica do DMNT é resultado da redução ou da ausência na
produção de insulina durante a vida fetal e pode se estender por um período variável de
tempo na vida pós-natal. Em um estudo conduzido por Temple et al. (7) que avaliou 30
pacientes com DMNT, pode-se observar que a mediana da idade de aparecimento da
hiperglicemia foi de 3 dias, variando de poucas horas até 31 dias. A necessidade de uso
da insulina exógena variou de 4 a 60 semanas (média de 16 semanas). Quanto a
recorrência do diabetes, foi observado que 11 dos 18 pacientes (60%) com mais de 4 anos
de idade reapresentaram a doença, numa idade média de 14 anos (variação de 4 a 25
anos). Metz et al. (12) encontrou hiperglicemia permanente em 5 dos 7 casos de DMNT
após 8 anos de idade. Em ambos os estudos, o início da puberdade (período caracterizado
20
por aumento na resistência insulínica) e a presença de uma intercorrência clínica (como
uma doença aguda, por exemplo) foram considerados “gatilhos” para a recorrência da
hiperglicemia. Por isso recomenda-se que esses pacientes sejam seguidos a longo prazo,
durante a adolescência e início da vida adulta. Outro dado observado foi a dose de
insulina necessária para se atingir um bom controle glicêmico, que foram mais baixas que
as habitualmente usadas nos casos de DMNP ou nos pacientes com DM1.
Com o propósito de conhecer a função pancreática dos pacientes durante o período
de remissão, objetivando encontrar fatores que influenciaram a recorrência da doença,
Shield et al. (17) estudaram seis pacientes com DMNT, todos secundários a anomalias do
cromossomo 6. A glicemia de jejum e a concentração de insulina foram utilizadas como
ferramentas de avaliação da função da célula beta-pancreática. Observou-se que todos os
casos apresentavam função normal da célula beta-pancreática, sem evidência de
resistência insulínica, não tendo sido possível assim se estabelecer parâmetros que
possam sugerir recorrência.
Os mecanismos responsáveis pela falência das células beta-pancreáticas observada
no período neonatal, seguido de uma recuperação na primeira infância e da recorrência na
adolescência e vida adulta permanecem incertos. Clinicamente é possível supor que haja
uma variabilidade na produção e na secreção da insulina pelo pâncreas, sendo essa
variabilidade uma provável causa da doença. Sabe-se que o pâncreas não é um órgão
fisiologicamente estático e que as células pancreáticas estão constantemente passando por
degeneração e regeneração ao longo da vida (18). Em ratos, foi observado que pouco
antes do nascimento, novas ilhotas pancreáticas são formadas, e uma nova onda de
neogênese celular volta a acontecer próximo ao período de desmame (19). Acreditando
que processo semelhante ocorra em humanos, poderíamos assim explicar a resolução do
diabetes ao redor dos primeiros seis (em média três) meses de vida em crianças com
DMNT.
Um estudo em camundongos conduzido por Ma et al. (20) propôs avaliar o efeito da
superexpressão dos genes ZAC e HYMAI situados no locus do DMNT em humanos.
Neste estudo verificou-se que os camundongos transgênicos que superexpressavam os
genes apresentavam uma redução da massa de células beta pancreáticas intra-útero e que
21
posteriormente, no período neonatal, havia um aumento do número de células beta,
porém com conteúdo menor de insulina comparado aos animais controle. Nos animais
jovens foi observado um aumento significante no número de células beta, porém que não
se mantinha e evoluía com um grande declínio na vida adulta, levando à intolerância à
glicose.
Em relação à origem molecular, 70% dos casos são secundários a aberrações do
locus do DMNT, na banda 24 do braço longo do cromossomo 6 (6q24) (OMIM 601410),
que levam à perda da metilação e consequente superexpressão de dois imprinted genes aí
localizados, o ZAC/PLAGL1 e o HYMAI (21). Em termos simples, imprinting consiste na
haloexpressão de determinados genes através da adição de grupos metil, geralmente na
região promotora, prevenindo sua transcrição.
Segundo Arima et al. (22), o gene ZAC/PLAGL1, além de ser um gene supressor
tumoral, parece exercer papel mediador na proliferação e na apoptose das células beta
pancreáticas, contribuindo assim para a origem do DMNT. O gene HYMAI, por outro
lado, é responsável por gerar um RNA mensageiro cuja função permanece desconhecida.
Os três mecanismos responsáveis pela superexpressão dos genes ZAC/PLAGL1 e
HYMAI são:
1. Isodissomia uniparental paterna do cromossomo 6 (UPD6), ou seja, a
herança de duas cópias do cromossomo 6 sem a contribuição materna,
corresponde a 41% dos casos;
2. Duplicação do 6q24 do alelo paterno (29% dos casos);
3. Hipometilação da DMR (differentially methylated region - regiões que
apresentam diferentes padrões de metilação) do 6q24 do alelo materno (30%
dos casos) (23).
Defeitos de metilação podem afetar somente o locus 6q24 mas também podem
surgir como parte da síndrome de hipometilação generalizada, na qual outras características
clínicas estão presentes, tais como cardiopatias congênitas, malformações de sistema
nervoso central, entre outras (24). Em se tratando de um defeito de metilação exclusivo do
22
locus 6q24, não se observam diferenças clínicas dentre os casos de DMNT, independente
de qual dos três mecanismos que levaram a doença (7).
Dentre as outras causas responsáveis pelo DMNT (30% restantes) estão as mutações
nos genes KCNJ11 e ABCC8 (25), genes que codificam o canal de potássio da célula beta
pancreática; mutações no gene da insulina (INS) (26) e, mais raramente, mutações no gene
HNF1B (fator hepatocítico nuclear tipo 1 beta), gene que codifica o fator de transcrição tipo
2 (TC2) envolvido no desenvolvimento embrionário de órgãos como pâncreas, fígado e rins
e responsável pelo diabetes tipo MODY 5, de aparecimento mais tardio. Como os genes
KCNJ11, ABCC8 e INS também estão envolvidos na origem do DMNP, eles serão
discutidos mais detalhadamente a seguir.
1.2. Diabetes Mellitus Neonatal Permanente (DMNP)
Conforme exposto acima, define-se o diabetes mellitus neonatal permanente como o
surgimento de hiperglicemia nos primeiros seis meses de vida com necessidade de
tratamento por toda a vida. Alguns autores sugerem estender essa suspeita diagnóstica nas
crianças que apresentarem diabetes nos primeiros nove meses de vida, pelo fato de que até
essa idade a incidência de DM1 é baixa (27). O baixo peso de nascimento e a hiperglicemia
são os achados clínicos comuns às diversas causas de DMNP, sendo que esse fenótipo pode
variar de acordo com o genótipo de cada caso, e manifestações extra-pancreáticas podem
somar-se ao quadro clínico inicial, configurando síndromes (representam 10% dos casos de
DMNP) (28). Importante ressaltar que a presença de consanguinidade na família exerce
uma forte influência tanto na prevalência como na origem molecular do DMNP.
Até o momento 20 genes já foram descritos como responsáveis pela origem do
DMNP, cada um deles exercendo papel fundamental no desenvolvimento, na função ou na
sobrevivência das células beta-pancreáticas (TABELA 2) (29).
23
Gene Locus Herança Achados clínicos
Alterações no desenvolvimento pancreático
PDX1 13q12.2 Recessiva DMNP e agenesia pancreática
PTF1A 10p13-12.1 Recessiva DMNP, agenesia pancreática, hipoplasia/aplasia
cerebelar, disfunção respiratória central
Promotor
PTF1A
10p12.2 Recessiva DMNP, agenesia pancreática sem acometimento
de sistema nervoso central
RFX6 6q22.1 Recessiva DMNP, atresia intestinal, agenesia de vesícula
biliar
GATA6 18q11.1-
q11.2
Dominante DMNP, cardiopatia congênita, alterações de vias
biliares
GATA4 8p23.1 Dominante DMNP, agenesia pancreática, cardiopatia
congênita
GLIS3 9p24.3-p23 Recessiva DMNP, hipotireoidismo congênito, glaucoma,
fibrose hepática, cistos renais
NEUROG3 10q21.3 Recessiva DMNP, síndrome de malabsorção intestinal
NEUROD1 2q32 Recessiva DMNP, hipoplasia cerebelar, comprometimento
visual, surdez neurosensorial
PAX6 11p13 Recessiva DMNP, microftalmia, malformações cerebrais
MNX1 7q36.3 Recessiva DMNP, atraso desenvolvimento
neuropsicomotor, agenesia sacral, ânus
imperfurado
NKX2-2 20p11.22 Recessiva DMNP, atraso desenvolvimento
neuropsicomotor, hipotonia, baixa estatura,
surdez, constipação
continua
24
Gene Locus Herança Achados clínicos
Alterações na função da célula beta-pancreática
KCNJ11 11p15.1 Espontânea ou
dominante
DMNT/ DMNP, síndrome DEND (atraso no
desenvolvimento neuropsicomotor, epilepsia,
fraqueza muscular)
ABCC8 11p15.1 Espontânea,
dominante ou
recessiva
DMNT/ DMNP, síndrome DEND
GCK 7p15-p13 Recessiva DMNP isolado
SLC2A2
(GLUT2)
3q26.1-
q26.3
Recessiva Síndrome de Fanconi-Bickel: DMNP,
hipergalactosemia, disfunção hepática
Destruição da célula beta-pancreática
INS 11p15.1 Espontânea ou
dominante
DMNP isolado
EIF2AK3 2p11.2 Recessiva Síndrome de Wolcott-Rallison: DMNP,
displasia esquelética, disfunção hepática
FOXP3 Xp11.23-
p13.3
Recessiva ligada ao
X
Síndrome IPEX: DMNP, enteropatia autoimune,
eczema, hipotireoidismo autoimune, aumento de
IGE
IER3IP1 18q21.2 Recessiva DMNP, microcefalia, encefalopatia epilética
TABELA 2: Genes envolvidos na origem do diabetes mellitus neonatal permanente. Adaptado de Rubio
Cabezas et al. Pediatric Diabetes (2014)
25
A seguir, uma breve descrição do papel de cada um desses genes será exposta, com
ênfase à função dos genes que foram objetos desse estudo.
1.2.1 Alterações do desenvolvimento pancreático
Durante a embriogênese do pâncreas, diversos fatores de transcrição estão envolvidos
na regulação de genes capazes de promover a diferenciação das células embrionárias e o
desenvolvimento das células pancreáticas (30).
O comprometimento da função desses genes implicará em falha no processo de
formação do pâncreas, que será mais acentuado quanto mais precoce o gene desempenhar
função na vida embrionária, e tanto a função endócrina como a exócrina do pâncreas
poderá ser afetada. Esse conhecimento trouxe benefícios não só para o entendimento da
origem de alguns casos de diabetes neonatal como também tem sido essencial para o
desenvolvimento de terapias gênicas de substituição de células beta-pancreáticas (31).
Segue abaixo a descrição dos principais genes envolvidos na cascata da
diferenciação pancreática, cuja disfunção está associada ao aparecimento do diabetes
neonatal.
1.2.1A Gene PDX1/IPF-1 (proteína homeobox pancreática e duodenal 1/
fator promotor de insulina 1 – OMIM 600733)
O gene PDX1, também conhecido como IPF-1, é um gene regulador que exerce
papel central na cascata de desenvolvimento e diferenciação das células pancreáticas, tanto
endócrinas como exócrinas.
A importância do gene PDX1 no desenvolvimento pancreático tornou-se clara ao se
confirmar o diagnóstico de agenesia pancreática em uma criança portadora de uma mutação
p.Pro63Argfs*60) causada pela deleção de um único nucleotídeo, que leva à produção de
uma proteína inativa, impedindo o desenvolvimento do pâncreas (32). A criança era
homozigota para a mutação e foi tratada com insulina e enzimas pancreáticas. Um segundo
caso foi descrito cinco anos depois em um paciente portador de duas mutações em
heterozigose composta (p.Glu164Asp e p.Glu178Lys), que teve o diagnóstico de diabetes
com 12 dias de vida (33). Os autores conseguiram demonstrar que essas mutações reduziam
em mais de 70% a atividade da proteína, comprometendo assim a formação do pâncreas.
26
1.2.1B Gene PTF1 (fator de transcrição pancreático tipo 1, subunidade
alfa – OMIM 607194, 619069)
O gene PTF1 é expresso precocemente na embriogênese e codifica o fator de
transcrição pancreático 1 (PTF1), essencial no desenvolvimento e na manutenção do
pâncreas adulto, além de estar envolvido no desenvolvimento cerebelar.
Em ratos, a deleção do Ptf1resulta em óbito neonatal por agenesia pancreática e
cerebelar, fenótipo consistente com o encontrado em humanos (34).
A primeira descrição da doença foi feita por Hoveyda et al. (35) ao identificar em
três crianças de uma família de origem paquistanesa uma síndrome de herança autossômica
recessiva composta por DMN, restrição de crescimento intrauterino grave, microcefalia,
dismorfismos faciais, dificuldade respiratória e hipoplasia cerebelar. Na família havia
vários casos de diabetes de surgimento na terceira década de vida. Anos mais tarde, Sellick
et al. (34) descreveram uma segunda família caucasiana do norte europeu com os mesmos
fenótipos, e identificaram um novo locus para o DMN no braço curto do cromossomo 10
(10p13-p12.1) e selecionaram para estudo três genes presentes nessa região, PIP5K2A,
PTF1A e o CACNB2. Eles encontraram duas mutações (p.Arg296* e p.Pro236fsX270) no
gene PTF1A como causa para a doença. Ao exame de macroscopia e microscopia do tecido
pancreático realizado durante autópsia de um dos pacientes que evoluiu ao óbito não se
encontrou tecido pancreático, embora interessantemente os níveis circulantes de peptídeo C
e de insulina fossem baixos, porém detectáveis.
Recentemente, mutações em regiões promotoras do gene PTF1A foram descritas
como causa de agenesia pancreática isolada (36).
1.2.1C Gene RFX6 (fator de transcrição regulatório X – OMIM 612659)
Há dez anos, Mitchell et al. (37) descreveram uma síndrome caracterizada por
diabetes de início nos primeiros dias de vida secundário à hipoplasia pancreática, associado
à atresia intestinal, diarreia não responsiva à reposição de enzimas pancreáticas e
agenesia/hipoplasia de vesícula biliar. Esses achados foram descritos em cinco crianças,
dois irmãos fruto de pais consanguíneos, e outros dois, também irmãos, sem relato de
consanguinidade na família, além de um caso isolado fruto de fertilização in vitro com
27
óvulo doado. Em 2010, Smith et al. (38) identificaram em duas dessas crianças e em outras
três, mutações no gene RFX6, e comprovaram em ratos que as alterações encontradas nesse
gene reduziam a expressão de outros genes envolvidos na diferenciação das células
pancreáticas, atribuindo a ele um papel regulador fundamental na cascata de diferenciação e
desenvolvimento do pâncreas.
1.2.1D Gene GATA6 e GATA4 (fator de transcrição GATA6 e fator de
transcrição GATA4 – OMIM 601656 e 600576)
Os genes GATA6 e GATA4 codificam os fatores de transcrição GATA6 e GATA4
que estão envolvidos na embriogênese do pâncreas e do coração, principalmente. Em 1994,
Yorifuji et al. (39) descreveram pela primeira vez uma síndrome que englobava hipoplasia
pancreática e cardiopatia congênita em uma família japonesa, mas foi somente em 2012 que
Lango Allen et al. (40) elucidaram que a haploinsuficiência do gene GATA6 seria
responsável pelo quadro de agenesia pancreática, inferindo que as alterações nesse gene
sejam a causa mais comum de agenesia pancreática em humanos. As mutações no gene
GATA4 por sua vez sempre foram associadas a defeitos cardíacos, por codificar um fator de
transcrição envolvido primordialmente na embriogênese do coração. Em 2010, D`Amato et
al. (41) identificaram em uma criança de origem italiana nascida com defeito do septo atrial
e agenesia pancreática uma mutação em heterozigose no gene GATA4 e comprovaram que
a mutação comprometia o funcionamento da proteína, prejudicando sua ligação ao DNA.
Esse estudo foi o único na literatura até o momento a associar o gene GATA4 à origem do
DMNP, embora já seja conhecida a função desse gene como membro da rede que regula a
diferenciação embrionária do pâncreas.
1.2.1E Gene GLIS3 (fator de transcrição pertencente à subfamília GLIS –
OMIM 610192)
Taha et al. (42) descreveram pela primeira vez dois irmãos frutos de casamentos
consanguíneos que apresentavam restrição de crescimento intra-uterino grave, diabetes
neonatal por hipoplasia/agenesia pancreática, hipotireoidismo congênito, colestase com
fibrose hepática, glaucoma congênito, rins policísticos e dismorfismos faciais. Alguns anos
depois o mesmo grupo confirmou o diagnóstico molecular dessa família e de outras duas
famílias consanguíneas que apresentavam fenótipo semelhante, porém mais heterogêneo
28
(43). Eles encontraram mutações no gene GLIS3, um fator de transcrição que é expresso
nas primeiras etapas do desenvolvimento embrionário, em especial na diferenciação da
tireoide, olhos, rins, fígado e pâncreas, onde parece comprometer mais a função das células
beta-pancreáticas que outros tipos celulares do órgão.
1.2.1F Gene NEUROG3 (fator de transcrição neurogenina 3 – OMIM
604882)
O gene NEUROG3 faz parte do complexo grupo de fatores de transcrição envolvido
na embriogênese pancreática e, nesse caso em particular, também no desenvolvimento e
função das células enteroendócrinas (44). O primeiro caso que descreve mutação no gene
NEUROG3 foi num paciente com diarreia congênita secundária à ausência de células
enterointestinais (visto à biópsia de intestino) e que aos nove anos apresentou hiperglicemia
com necessidade de tratamento com insulina. Anos mais tarde mutações nesse gene
também foram encontradas em outros dois pacientes com diabetes neonatal, em associação
com diarreia malabsortiva crônica, comprovada em biópsia intestinal ser secundária a
ausência de células enterointestinais (45, 46).
1.2.1G Gene NEUROD1 (fator de transcrição bHLH [basic helix-loop-helix]
– OMIM 601724)
NEUROD1 é outro fator de transcrição expresso amplamente tanto no
desenvolvimento como na manutenção das células beta-pancreáticas, e mutações em
heterozigose nesse gene foram identificados em pacientes com MODY (47). Em 2010,
Rubio-Cabezas et al. (48) estudaram 44 pacientes com DMNP de origem não conhecida e
identificaram em dois casos mutações em homozigose no NEUROD1,que gerava uma
proteína truncada sem seu domínio de ativação. Nesses casos, o diabetes surgiu aos dois
meses de vida, e estava associado à hipoplasia cerebelar, surdez neurossensorial, atraso no
desenvolvimento e comprometimento visual.
1.2.1H Gene PAX6 (fator de transcrição paired box gene – OMIM 607108)
O gene PAX6 tem sua função bem conhecida como fator de transcrição envolvido
na embriogênese ocular. Com os avanços no entendimento da rede que controla o
desenvolvimento pancreático, o gene PAX6 também foi identificado como peça importante
29
dessa cascata de diferenciação (49). Baseado nesse conhecimento, Yasuda et al. (50) se
propuseram a estudar pacientes com aniridia e diagnóstico molecular de mutações em
heterozigose no gene PAX6, cujas famílias apresentavam histórico da associação de aniridia
com diabetes. Um total de seis pacientes foi submetido a teste de intolerância oral à glicose
e cinco deles apresentavam intolerância à glicose, fazendo supor assim que as alterações
encontradas no gene PAX6 seriam corresponsáveis pela alteração no metabolismo da
glicose além da aniridia. Anos mais tarde, Solomon et al. (51) descreveram duas mutações
em heterozigose composta (p.Arg38Trp e p.Arg240*) no gene PAX6, em um lactente filho
de pais não consanguíneos com anomalias cerebrais múltiplas, microftalmia e diabetes
neonatal, e em ambas as famílias materna e paterna havia descrição de oftalmopatias
(aniridia, catarata, cegueira). Esse foi o único caso descrito na literatura da associação entre
diabetes neonatal e mutações no PAX6.
1.2.1I Gene MNX1 (motor neuron and pancreas homeobox protein 1/ também
conhecido como homeobox HB9/HLXB9 - OMIM 142994)
No início da década de 90, o gene MNX1 (até então chamado de HB9) foi
identificado como um fator de transcrição envolvido na diferenciação do tecido linfoide e
também do tecido pancreático (52). Suas alterações inicialmente foram descritas como
responsáveis pela síndrome de Currarino, composta pela tríade agenesia sacral parcial,
teratoma pré-sacral e anomalias anoretais (53). Em 2013, buscando encontrar o diagnóstico
molecular de uma criança que apresentou diabetes com 17 dias de vida, filha de pais
consanguíneos, Bonnefond et al. (54) desenharam um estudo baseado no mapeamento da
homozigosidade, através da análise do DNA genômico da criança e de seus pais. Eles
encontraram 17 regiões de alto grau de homozigosidade no DNA dos pais, e dentre os mais
de 800 genes contidos nessa região, escolheram estudar o gene GATA6 e o gene MNX1, por
seus papéis já serem conhecidos na embriogênese pancreática. Finalmente ao sequenciá-los,
a mutação p.Phe272Leu foi identificada no gene MNX1, configurando o primeiro caso de
DMNP e mutação no MNX1 descrito na literatura.
1.2.1J Gene NKX2-2 (homeobox gene NKX2-2 - OMIM 604612)
Data do início da década de 90 o conhecimento do papel do gene NKX2-2 como fator
de transcrição envolvido no desenvolvimento e na maturação das células beta-pancreáticas
(55). Estudos em ratos nos quais a expressão do gene NKX2-2 foi anulada demonstraram
30
que os animais apresentavam células beta no tecido pancreático, porém as mesmas não se
diferenciavam e não produziam insulina (56). Além disso, esse modelo mostrou que os
animais knockout não expressavam o gene da insulina, conferindo ao gene NKX2-2 também
um papel de regulador upstream do gene da insulina. Recentemente, Flanagan et al. (57)
descreveram três pacientes com mutações no gene NKX2-2 que apresentaram diabetes na
primeira semana de vida associado a um importante atraso no desenvolvimento
neuropsicomotor, hipotonia, comprometimento visual e auditivo, fenótipo esse semelhante
ao encontrado em ratos knockout para o gene NKX2-2.
1.2.2 Alterações na função da célula beta-pancreática
A secreção da insulina pelas células beta-pancreáticas está vinculada à glicemia sérica
e são várias as proteínas envolvidas no mecanismo de homeostase da glicose. Mutações em
quatro genes expressos nas células beta-pancreáticas têm sido relacionadas ao quadro de
hipoinsulinemia (às vezes também relacionados ao fenótipo oposto: hiperinsulinemia,
levando a hipoglicemia) e o conhecimento da função desses genes auxiliou a compreensão
dos mecanismos envolvidos no controle da secreção de insulina.
A glicose é o secretagogo mais importante da célula beta-pancreática. O aumento dos
níveis de glicose na corrente sanguínea resulta em aumento do seu transporte para o interior
das células beta através de difusão passiva, pela ação da proteína de membrana denominada
GLUT2. No ambiente intracelular, a glicose é fosforilada à glicose-6-fosfato (G-6-P) pela
enzima glucoquinase, e a G-6-P será convertida à piruvato pelo mecanismo de glicólise. O
piruvato formado no citoplasma será transportado à mitocôndria onde será convertido em
acetil-CoA, que entra no ciclo de Krebs resultando em aumento do ATP e consequente
aumento da fração ATP/ADP no citoplasma. Essa relação ATP/ADP aumentada provoca o
fechamento dos canais de potássio e consequente despolarização da membrana celular, que
abre canais de cálcio, sensíveis à voltagem. O aumento do influxo de cálcio para a célula
beta desencadeará a exocitose da insulina (FIGURA 1).
31
1.2.2A Gene KCNJ11 (codifica a subunidade Kir6.2 [inwardly rectifying
potassium channel] do canal de potássio sensível ao ATP – K+
ATP da célula beta-
pancreática) (OMIM 600937)
Os canais de potássio sensíveis ao ATP (K+
ATP) estão presentes em diversos tipos
celulares onde desempenham a função de regular o fluxo de potássio através da membrana
plasmática, modificando a atividade elétrica da membrana e interferindo no metabolismo
celular (58). Sua estrutura na célula beta-pancreática é de um composto octamérico
formado por quatro subunidades internas que formam um poro central conhecidas como
subunidades Kir6.2 (inwardly rectifying potassium channels), envoltas por quatro
subunidades regulatórias chamadas SUR1 (sulphonylurea receptor) e sua função, como
exposto acima, é promover a liberação da insulina de acordo com a concentração de glicose
no sangue.
A subunidade Kir6.2 é composta de duas porções transmembrana (M1 e M2)
dispostas entre alças extracelulares constituídas de sequência de peptídeos GFG,
FIGURA 1: Ilustração do papel da glicose no controle da insulina nas células
pancreáticas. Estão destacados em vermelho os genes envolvidos na
secreção da insulina. Adaptado de Florez et al. (1).
32
responsáveis pelo transporte seletivo de potássio (K+
selectivity filter) (59). Essa estrutura é
altamente seletiva ao íon K+. Na porção intracelular do Kir6.2 encontra-se o sítio de ligação
ao ATP que exerce efeito inibitório sobre o canal (FIGURA 2).
Inagaki et al. (60) foram os primeiros a descrever em 1995 o gene KCNJ11 como
responsável por codificar a porção Kir 6.2 do canal de K+
ATP. Um ano depois, Thomas et al.
(61) descreveram pela primeira vez uma mutação inativadora no KCNJ11 em uma criança
com hipoglicemia hiperinsulinêmica. Em 2000, Koster et al. (62) desenvolveram ratos
transgênicos que não expressavam a porção aminoterminal do Kir6.2, porção essa que já
era conhecida pelo papel chave na abertura e fechamento do canal (processo denominado
gating). A deleção resultava em canais que permaneciam continuamente abertos pela
sensibilidade reduzida ao efeito inibitório exercido pelo aumento no ATP. Esses animais
apresentavam hiperglicemia grave, com hipoinsulinemia e cetoacidose aos dois dias de
vida, morrendo com cinco dias de vida.
Baseados nesses conhecimentos, Gloyn et al. (63) se dispuseram a estudar 29
crianças com DMNP através da análise do gene KCNJ11. Eles encontraram mutações
ativadoras no KCNJ11 em 10 delas e, além disso, puderam observar que haveria uma
relação genótipo-fenótipo dependendo da localização das mutações. Naqueles casos onde o
quadro clínico baseava-se no diabetes neonatal isoladamente, as mutações estavam
localizadas em resíduos situados próximo ao sítio de ligação ao ATP ou nas interfaces entre
FIGURA 2: Representação esquemática da sub-unidade Kir 6.2 do canal de K+
ATP
constituído por duas porções transmembrana (M1 e M2) e um grande domínio
citoplasmático onde está o sítio de ligação ao ATP. Retirado de Smith et al.
Expert Rev Mol Med. 2007 (58)
Citoplasma
33
as subunidades Kir6.2 ou entre Kir6.2 e o SUR1. Já naqueles quadros de diabetes associado
a achados neurológicos (denominado síndrome DEND: diabetes neonatal, atraso no
desenvolvimento, epilepsia), as mutações estavam localizadas em sítios distantes do
domínio de ligação ao ATP.
Desde então diversos outros autores descreveram mutações ativadoras no gene
KCNJ11 associadas ao diabetes neonatal, todas em heterozigose, e atualmente elas são
consideradas como a causa mais comum de DMNP (28).
O gene KCNJ11 está localizado no cromossomo 11p15.1, mesma localização do
gene ABCC8, e é composto de um único éxon que codifica 390 aminoácidos. Ambos estão
sob controle de uma região promotora comum, sendo regulados pelos mesmos fatores de
transcrição, incluindo o fator de transcrição Foxa2, o que permite que a expressão dos dois
genes seja associada (59).
1.2.2B Gene ABCC8 (codifica a subunidade SUR1 [sulphonylurea receptor]
do canal de potássio sensível ao ATP – K+
ATP da célula beta-pancreática) (OMIM
600509)
As subunidades SUR1 do canal de K+
ATP pertencem à subfamília de proteínas ATP-
binding cassete transporter (ABC) e, como dito acima, localiza-se na periferia do canal.
Sua estrutura é composta por 17 alças transmembrana dispostas em três domínios TMD0,
TMD1 e TMD2, cada um com 5, 6 e 6 alças, respectivamente, além dos domínios
citoplasmáticos de ligação aos nucleotídeos NBF1 e NBF2 e dos terminais N (extracelular)
e C (intracelular) (FIGURA 3).
FIGURA 3: Representação esquemática da sub-unidade SUR1 do canal de K+
ATP constituído por
três domínios transmembrana (TMD0, TMD1 e TMD2) e dois domínios
citoplasmáticos de ligação ao nucleotídeo (NBF1 e NBF2). Retirado de Smith et al.
Expert Rev Mol Med. 2007 (58).
34
Os domínios transmembrana do SUR1 têm a função de interagir com as
subunidades Kir6.2 (FIGURA 4), influenciando a abertura e fechamento do canal e
portanto o fluxo de K+ através dele. Em seu estado livre de ATP, os domínios NBF1 e
NBF2 do SUR1 têm a função de se ligar ao MgADP, levando à abertura do canal e
consequente inibição da secreção de insulina. As subunidades SUR1 possuem ainda sítios
de ligação a drogas com efeitos estimulatórios sobre o canal K+
ATP (como o diazóxido, que
impede a secreção de insulina) e drogas com efeito inibitório (como as sulfoniluréias, que
aumentam a secreção de insulina). O gene ABCC8, que está na região cromossômica
11p15.1 adjacente ao KCNJ11, é composto por 39 éxons que codificam 1582 aminoácidos.
Proks et al. (64) foram os primeiros a identificar uma mutação ativadora no ABCC8
como causa de DMNP em um paciente que apresentava síndrome DEND. Em seguida,
Babenko et al. (65) sequenciaram o gene ABCC8 de 34 pacientes com diabetes neonatal (16
com DMNP e 18 com DMNT) e encontraram mutações em nove deles, dos quais dois
tinham a forma permanente e sete a forma transitória. Estudando um grupo ainda maior de
pacientes com DMNP, Ellard et al. (66) puderam identificar em 16 dos 59 casos mutações
no ABCC8 e constataram que, diferentemente do que acontece nos casos de DMNP por
mutações ativadoras no KCNJ11, que estão em heterozigose, aqui houve casos com padrão
de herança tanto dominante como recessiva.
Extracelular
Intracelular
KIR6.2 SUR1
FIGURA 4: Representação esquemática das sub-unidades Kir6.2 e SUR1 do canal de K+
ATP.
Adaptado de Aschcroft, J Clin Invest. 2005 (2)
35
O fenótipo observado nos casos de DMN causado por mutações ativadoras no
ABCC8 é variado, semelhante ao que se observa nas mutações no KCNJ11, podendo
apresentar como a forma transitória, a forma permanente isolada ou ainda associada a
sintomas neurológicos (síndrome DEND). Atualmente, as mutações ativadoras no gene
ABCC8 são consideradas a causa mais comum de DMNT depois das alterações no
cromossomo 6 (9).
Um aspecto muito relevante a ser considerado nos casos de DMN secundário a
mutações nos genes que codificam o canal K+
ATP (KCNJ11 e ABCC8) diz respeito ao
tratamento. Considerando que o diabetes nesses casos é resultado de uma atividade
excessiva do canal K+
ATP e que o seu fechamento seria etapa fundamental na liberação da
insulina, a sulfoniluréia, droga com ação já estabelecida como inibidor do canal K+
ATP,
passou a ser considerada alternativa terapêutica à insulina. Embora a insulina seja a
primeira escolha num quadro clínico de descompensação metabólica provocado pela
hiperglicemia, muitos autores puderam comprovar a longo prazo que, na maioria dos casos,
o uso de hipoglicemiantes orais foi efetivo no controle glicêmico (67, 68).
1.2.2C Gene GCK (codifica a enzima glucoquinase) (OMIM 138079)
A fosforilação da glicose no sexto carbono transformando-a em glicose-6-fosfato é a
etapa inicial do processo de glicólise em todas as células e, na célula beta-pancreática,
resultará na liberação da insulina. Essa reação é catalisada pela família de enzimas
conhecida por hexoquinases, dentre as quais está a glucoquinase (ou hexoquinase tipo IV),
cuja estrutura e função difere do restante das enzimas da família. Nos mamíferos, a
glucoquinase tem ação no fígado e no pâncreas e, diferentemente das outras hexoquinases,
sua atividade catalítica aumenta à medida que aumentam os níveis de seu substrato, a
glicose, no sangue e seu produto, a G-6-P, por sua vez, não inibe sua ação. Por essas
características bioquímicas, Matschinsky et al. (69) desenvolveram um modelo matemático
para avaliar a taxa de fosforilação da glicose pela glucoquinase na célula beta e notaram
que, com apenas 25% do seu potencial de ação catalítica já se atingia o limiar para
liberação da insulina, conferindo à glucoquinase o importante papel de sensor de glicose.
36
O gene da glucoquinase foi descrito pela primeira vez em 1986 por Iynedjian et al.
(70); está localizado no braço curto do cromossomo 7 (7p15.3-15.1) e codifica a enzima
glucoquinase composta por 465 aminoácidos. Mutações inativadoras em heterozigose no
gene GCK levam a uma perda da função enzimática e, como consequência causam um
subtipo de diabetes tipo MODY, caracterizado por uma leve hiperglicemia, geralmente
diagnosticada na segunda década de vida e que usualmente não necessita tratamento (71,
72).
Em recente pesquisa no banco de dados online Human Gene Mutation Database
(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/gene.php?gene=GCK – data do último acesso: 21/01/2015),
são descritas um total 644 mutações no gene da glucoquinase, a grande maioria relacionada
ao fenótipo de diabetes tipo MODY (GCK-MODY). Njolstad et al. (73) foram os primeiros
a descrever duas mutações em homozigose no gene GCK (p.Met210Lis e p.Tre228Met) em
dois pacientes com diabetes neonatal que apresentavam deficiência total da glucoquinase,
hiperglicemia grave na primeira semana de vida e pronunciado comprometimento do
crescimento intrauterino. Esses dois casos eram oriundos de duas famílias, de origem
norueguesa e italiana, cujos familiares já tinham o diagnóstico de intolerância à glicose.
Esse estudo foi o primeiro a identificar que mutações no gene GCK em heterozigose
levavam ao fenótipo de MODY enquanto nas mutações em homozigose o fenótipo é o do
diabetes mellitus neonatal permanente.
Até o momento apenas 39 casos de DMNP por mutações em homozigose (38
pacientes) ou heterozigose composta (1 paciente) no gene GCK foram publicados na
literatura. Raimondo et al. (74) descreveram 30 pacientes nos quais encontraram 19
mutações em homozigose, sendo seis mutações novas, e apesar de dentre os 30 casos
apresentados quatro já terem sido relatados na literatura (75-78), trata-se do estudo com o
maior número de casos descritos até hoje. Além desses, outros 5 casos foram previamente
descritos por Njolstad et al. (73, 79) – esse último descreve o único caso reportado até
então de mutação em heterozigose composta, 1 caso descrito por Rubio-Cabezas et al. (80)
e outros 3 descritos por Bennett et al. (77).
37
1.2.3 Destruição da célula beta-pancreática
1.2.3A Gene INS (codifica a molécula de insulina) (OMIM 176730)
A molécula de insulina é uma cadeia peptídica produzida nas células beta-
pancreáticas originalmente como uma única molécula, a preproinsulina, composta por 110
aminoácidos, divididos em: peptídeo sinalizador na porção amino-terminal (com 24
aminoácidos), a cadeia B (com 30 aminoácidos), a cadeia A (com 21 aminoácidos) e o
peptídeo C, que faz a conexão entre a cadeia A e B (com 33 aminoácidos), além de 2
aminoácidos que são perdidos na síntese da insulina. No retículo endoplasmático a
preproinsulina sofre clivagem através da ação de enzimas proteolíticas, e então o peptídeo
sinalizador é removido dando origem à molécula de proinsulina. Em seguida, o peptídeo C
é removido, formando-se a molécula de insulina ativa. O gene da insulina está localizado
no braço curto do cromossomo 11 (11p15.5) e é composto por três éxons: um deles
responsável por codificar o peptídeo sinalizador, a cadeia B e parte do peptídeo C; outro
éxon codifica a segunda porção do peptídeo C e a cadeia A, e outro que não é traduzido
(81).
Stoy et al. (82) foram os primeiros a reportarem que mutações no gene da insulina
(INS) seriam causa de DMNP. Estudando 16 casos de DMNP foram encontradas 10
mutações em heterozigose; em 11 deles eram mutações de novo. Eles identificaram que as
mutações estavam presentes em aminoácidos cuja localização afetaria a clivagem ou o
“folding” (dobramento) da molécula de preproinsulina, impedindo a formação da
proinsulina e consequentemente da insulina. O acúmulo desses precursores levaria a um
estresse do retículo endoplasmático culminando em apoptose das células beta-pancreáticas.
A partir de então, outros grupos reportaram mutações no gene da insulina como
causa de DMNP em suas respectivas coortes, conferindo ao INS a segunda causa de DMNP
depois das mutações no KCNJ11 (6, 83, 84).
Um aspecto interessante observado pelo grupo de Stoy (82) foi a variabilidade de
apresentação dos casos. Embora a maioria tenha sido diagnosticada nos primeiros 6 meses
de vida, o pai de um dos probandos, portador da mesma mutação que seu filho, teve o
diagnóstico de uma forma leve de DM tipo 2 aos 30 anos de idade.
38
Desde a descrição de Stoy et al. (82) em 2007, muitas outras mutações foram
encontradas não só ao longo do gene da insulina como também em sua região promotora e
em suas porções não traduzidas (a saber: o éxon 1, a porção inicial do éxon 2 e a porção
final do éxon 3) (85), sendo algumas de herança autossômica dominante, outras recessiva.
Atualmente as mutações no gene INS estão associadas a três tipos de fenótipos, dependendo
de sua localização e de sua consequência sobre o mecanismo de produção da insulina ou
sobre a própria molécula de insulina em si: DMNP, DMNT e o diabetes de aparecimento no
adulto jovem, conhecido por INS- MODY ou MODY 10 ou ainda MIDY (Mutant INS-
gene-induced Diabetes of Youth) (86).
39
OBJETIVOS
Objetivo geral:
Identificar alterações moleculares nos genes KCNJ11, ABCC8, GCK e INS em
quatro indivíduos com diabetes mellitus neonatal.
Objetivos específicos:
1. Identificar alterações moleculares no gene KCNJ11, ABCC8, GCK e INS em
quatro crianças com diabetes mellitus diagnosticadas nos primeiros seis meses de
vida, sendo que em três o diagnóstico foi a forma permanente da doença e em um
a forma transitória;
2. Avaliar a presença de alterações moleculares no gene KCNJ11, ABCC8, GCK e
INS nos pais desses indivíduos e, em especial nas alterações do gene GCK, onde o
DMN tem herança autossômica recessiva.
40
CASUÍSTICA E MÉTODOS
1. CASUÍSTICA
A casuística deste trabalho foi composta por 4 pacientes portadores de diabetes
neonatal encaminhados ao ambulatório de Diabetes Pediatria do Hospital de Clínicas da
UNICAMP. Sendo que deles, 3 apresentavam a forma permanente da doença e um a forma
transitória.
Segue descrição sucinta dos casos clínicos, objetivos iniciais do estudo.
Os casos 1 e 2 são pertencentes à mesma família. Ambos são primos-irmãos, sendo
suas mães irmãs e os pais também irmãos (FIGURA 5). Durante os quatro primeiros anos
de vida eles foram acompanhados no serviço, de maneira pouco assídua. Pela dificuldade
de locomoção entre a cidade de origem (Piracicaba – SP) e o Hospital de Clínicas
(Campinas – SP), ambos foram encaminhados para seguimento em serviço especializado da
cidade (CADME – Centro de Atenção às Doenças Metabólicas).
FIGURA 5: Heredograma da família dos casos 1 e 2. Os quadrados com listras verticais simbolizam
a mutação p.Arg447Gli, GCK-MODY. Os círculos com listras horizontais simbolizam
a mutação p.Asn254His, GCK-MODY. As setas indicam os probandos. N/D significa
dados não disponíveis. Valores normais dos testes laboratoriais: glicemia de jejum: 75 a
99 mg/dl; peptídeo – C sérico: 0,8 a 4 ng/ml; hemoglobina glicada (A1c) – 3,9 a 6,1%
(19 a 43 mmol/mol).
41
Caso 1: RN sexo masculino, nascido a termo por parto normal, filho de pais não
consanguíneos e mãe HIV positivo sem tratamento. Gestação sem acompanhamento pré-
natal ocorrida na vigência de drogadição (tabagismo, álcool, cocaína e crack). Mãe fez uso
de AZT intra-parto. Seu peso ao nascer era de 1750 g (-2DP) e a estatura de 42 cm (–2DP),
mostrando um retardo de crescimento intra-uterino. Aos 26 dias de vida apresentou
hiperglicemia (780 mg/dl) sendo iniciada insulinoterapia que se mantém até os dias atuais.
Aos dois anos de idade foi feita a dosagem de peptídeo C que se mostrou inferior a 0,5
ng/ml (normal: 0,8 a 4, sendo a glicemia colhida em jejum na mesma amostra de sangue de
421 mg/dl), além das dosagens de autoanticorpos negativas. Segundo relato do responsável
pelo serviço onde atualmente ele é acompanhado, seu desenvolvimento neuropsicomotor
está adequado aos seus 10 anos de idade e seu controle glicêmico é regular (hemoglobina
glicada 8,3% - nl: 3,9 a 6,1). O irmão mais novo e seus pais são assintomáticos e na
investigação laboratorial realizada no nosso ambulatório, todos apresentaram glicemia de
jejum alterada (FIGURA 5).
Caso 2: RN sexo masculino, nascido a termo por parto cesária, após gestação sem
acompanhamento pré-natal ocorrida na vigência de drogadição (álcool, maconha, cocaína).
Seu peso ao nascer era de 1550 g (-2DP) e sua estatura 40,5 cm (-2DP) mostrando um
retardo de crescimento intra-uterino. Ao nascimento apresentou desconforto respiratório
com necessidade de suporte ventilatório. Evoluiu bem quando aos 29 dias de vida
apresentou piora do padrão respiratório associado à hipertermia, desidratação e
hiperglicemia (1400 mg/dl). Iniciada insulinoterapia que mantém até hoje, com 10 anos de
idade. Aos dois anos de idade foi realizada a dosagem de peptídeo C que foi inferior a 0,5
ng/ml (normal: 0,8 a 4, com glicemia dosada na mesma amostra de 342mg/dl) e dosagem
de autoanticorpos (anti-ICA, anti-GAD, anti-insulina) negativos. A informação obtida no
serviço que o acompanha é de que seu desenvolvimento neurocognitivo é adequado,
embora apresente um mau controle do diabetes (hemoglobina glicada 13% - nl: 3,9 a 6,1).
Filho de pais não consanguíneos, saudáveis, ambos apresentaram glicemia de jejum
alterada nos exames laboratoriais realizados durante seguimento em nosso serviço
(FIGURA 5).
42
Passados nove anos, sua mãe apresentou diabetes gestacional (em gestação fruto de
outra relação), sem necessidade de uso de insulina e que entrou em remissão. Não foi
possível a realização do estudo molecular nessa criança.
Caso 3: RN sexo masculino, filho único de pais não consanguíneos, nascido a termo
por parto cesária com peso de 2920 g e 49,5 cm de estatura. Sem intercorrências
gestacionais ou neonatais. Aos dois meses de vida apresentou quadro de pneumonia
acompanhado de hiperglicemia (700 mg/dl) sendo iniciada insulinoterapia (0,27 u/kg/dia).
A dose da insulina foi sendo progressivamente diminuída pois apresentava episódios
repetidos de hipoglicemia, culminando com sua completa suspensão com 1 ano e 3 meses
de idade. Tem dosagem de insulina e peptídeo C baixos (insulina: 2 uUI/ml – normal 6 a
28), peptídeo C inferior a 0,5 ng/ml - normal de 0,9 a 7,1), com dosagem de autoanticorpos
negativas. Mantém-se bem clinicamente e apresenta picos esporádicos de leve
hiperglicemia (150 a 180 mg/dl), na vigência de processos infecciosos, sem necessidade de
tratamento. Na última consulta, aos 9 anos de idade, apresentava desenvolvimento
neuropsicomotor adequado e até o momento não foi necessário reintroduzir o tratamento.
Sua última hemoglobina glicada é de 5,9% (3,9 a 6,1%) e suas glicemias de jejum variam
entre 70 a 100 mg/dl.
Caso 4: RN sexo masculino, filho único de pais não consanguíneos, nascido por
parto cesária a termo pesando 2860 g e 48,5 cm de estatura. Sem antecedentes gestacionais,
neonatais ou familiares de relevância. Já no primeiro dia de vida apresentou hiperglicemia
leve (110 mg/dl) sendo iniciada reposição insulínica. Tem dosagem de insulina e peptídeo
C baixos (insulina: 0,1 uUI/ml – normal 6 a 28), peptídeo C: 0,4 ng/ml - normal de 0,9 a
7,1), com dosagem de autoanticorpos negativas. Segue acompanhamento clínico e
laboratorial, mantendo uso constante de insulina. Apresenta bom ganho pôndero-estatural,
controle glicêmico regular (hemoglobina glicada 8,4% - nl: 3,9 a 6,1) e na última consulta
aos sete anos de idade apresentava desenvolvimento neuropsicomotor adequado.
43
2. MÉTODOS
A figura abaixo representa de uma forma geral as etapas utilizadas para a realização
deste trabalho.
FIGURA 6: Fluxograma ilustrando a metodologia empregada para a realização deste trabalho.
ClustalW
Swiss-Model
STING Millenium
PyMOL Viewer
Polyphen
SIFT
Align GV-GD
OEGE
Diagnóstico clínico dos pacientes
Extração do DNA a partir do sangue
periférico
Amplificação por PCR
Sequenciamento
Mutações novas
Análise in silico
44
2.1 Obtenção das amostras e extração de DNA genômico
As amostras de DNA genômico dos pacientes foram obtidas a partir de sangue total
periférico (aproximadamente 10 mL), colhido em tubos com 10% de anti-coagulante ácido
etileno diamino tetracético (EDTA).
2.2 Extração de DNA genômico a partir de sangue total periférico
Para extração de DNA foi empregado o método de lise com Proteinase K
padronizada no laboratório de Genética Molecular Humana – CBMEG (87). As etapas e as
soluções utilizadas seguem listadas a baixo:
Soluções:
Solução A [ ] final Solução B
(estoque 2X) [ ] final Solução C [ ] final
MgCl2 5 mM EDTA 20 mM Solução B 0,5 X
Sacarose 0,32 M NaCl 20 mM SDS 5%
Tris-HCl pH 8,0 10 mM Tris-HCl pH 8,0 20 mM Proteinase K 1 mg/mL
Triton X-100 1%
Etapas:
Para lise das hemácias foi adicionada solução A ao sangue coletado até completar o
volume de 50 mL, permanecendo no gelo por 30 minutos;
Centrifugou-se por 10 minutos a 2.000 rpm e 4 ºC;
O sobrenadante foi descartado e o precipitado (pellet) ressuspendido em 20 mL da
solução A. Esta etapa foi repetida até o pellet ficar livre de hemácias lisadas;
O pellet foi ressuspendido em solução B diluída em 1X;
Acrescentou-se 250 µL de solução C;
A mistura permaneceu overnight em incubação a 37 ºC;
45
No dia seguinte para a extração de DNA dos leucócitos foram adicionados 1,25 mL
de TE 1X (Tris-HCl 10 mM pH 8,0; EDTA 1 mM pH 8,0) e o mesmo volume final
de fenol saturado com Tris-HCl 10 mM pH 8,0;
Os tubos foram homogeneizados por inversão lenta durante 5 minutos;
Para separação e recuperação da fase aquosa (superior) o tubo foi centrifugado a
3.000 rpm por 15 minutos à temperatura ambiente;
Acrescentou-se à fase aquosa igual volume de fenol saturado com Tris-HCl 10
mM pH 8,0, e após leve agitação por 5 minutos foi centrifugado novamente;
A etapa foi repetida com a solução fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1), e
por último clorofórmio:álcool isoamílico (24:1);
Para precipitação do DNA, acrescentou-se 0,1 volume de acetato de sódio 3 M
pH 5,5 e 2,5 volumes de etanol absoluto gelado;
O DNA precipitado foi recuperado com auxílio de uma haste de plástico esterilizada
e lavado com etanol 70% para retirada do excesso de sal, e posteriormente
ressuspendido em TE 1X (200 a 500 µL).
A concentração de DNA foi obtida através de leitura de absorbância óptica a
em espectrofotômetro e a integridade do DNA foi verificada em eletroforese de gel de
agarose a 0,8%.
2.3 Amplificação do gene KCNJ11
O gene KCNJ11 possui um único éxon. Para facilitar seu estudo, optou-se por dividir o
gene em 8 fragmentos desenhando primers internos, conforme tabela a seguir. Estes
primers foram desenhados para amplificação do éxon e das regiões 5’ e 3’ que o
flanqueiam.
46
Fragmentos Seqüência dos primers (5' - 3') Tm (oC)
Tamanho
(pb)
Frag. 1 Sense CCGAAGGCCAGACAGGTG 60,2
504 Antisense AGGGCAGATCACTAGGTCAGG 59,9
Frag. 2 Sense GCCTCTCGGGTTCAAGCG 62,6 551
Antisense ACGTTGCAGTTGCCTTTCTTG 62,3
Frag. 3 Sense CCAGGTGGAGGTAAGGAAGAG 59,8 783
Antisense ACACGTAGCATGAAGCAGAGG 59,5
Frag. 4 Sense ATGTCCTTCCTGTGCAGCTG 59,5 741
Antisense GTCCTCCTCAGCTACAATGGG 60,4
Frag. 5 Sense CACCACCACCAGGACCTCG 62,4 635
Antisense GCACAGCTCTAGGGCCCAG 61,9
Frag. 6 Sense TCCCTGTCCTGAGCCATGG 62,2 764
Antisense GACAGGCAGGAGGTAGGCAG 61,1
Frag. 7 Sense GTGAGGGCTCTGTGGGCTG 62,0 743
Antisense AGCCAGGATTCGAACCCAG 61,2
Frag. 8 Sense GGGCACTCACCAGGCTTTG 62,3 733
Antisense AGTGGGTGGGCAAGTGCAG 62,5
2.4 Amplificação do gene ABCC8
A amplificação dos 39 éxons do gene ABCC8 foi realizada com primers específicos,
conforme tabela a seguir. Estes primers foram desenhados para amplificação dos éxons e
parte das regiões intrônicas (nos limites dos éxons), para verificação da região de splicing.
TABELA 3: Primers desenhados pelo software Gene Runner 5.0.80 Beta utilizados na amplificação do gene
KCNJ11.
47
Fragmentos Seqüência dos primers (5' - 3') Tm (oC) Tamanho(pb)
5'UTR
Sense GGTGGGCGCAAGCGTAG 54,1 553
Antisense AGCTGGTGTGCGAGTGCG 54,3
Ex 2 Sense GCCTTGGGGATCCTCATGTG 56,1
460 Antisense GGCCTGGGACTCACTTGCG 57,2
Ex 3
Sense GAAATTCAAGGCCTGGGCTG 56,2 355
Antisense CACCAGACTGTAAGCTCCATGAAG 55,3
Ex 4
Sense ACACACATGATGCACACACGTC 53 277
Antisense GCAGGACAGAGGCCAGAGC 53,9
Ex 5 Sense CAAGGTAGGGAGTGGTGAGAAG 52,4
428 Antisense CCTCACCAGCCTCAGTTTCC 53,2
Ex 6
Sense CACTCTGACCTGGCCATGG 52,3 341
Antisense GCGCATGTGTGAGGAGCC 53,4
Ex 7
Sense GTAATAATGATGGCCGTGGTCC 55,4 441
Antisense CCACTATCCCACACTGCCTTG 54,3
Ex 8
Sense GTGATGATGATGAGAATGATGATG 50,9 324
Antisense GGTACAGGCAAGCATGGAG 49,7
Ex 9-10*
Sense GCAGTTAGTTACCAGCCCAG 49,2 991
Antisense CCCGAGCTCTGACACCC 49
Ex 11
Sense GTCCAGCCACATCCACCC 51,6 659
Antisense GATGGGTGAATGTAATAATGTGTAG 50,5
Ex 12 Sense CACTGGACTGCGCTGCC 51,4
213 Antisense CAAATCTGGGCAGCCTGTC 52,2
Ex 13
Sense GACTGTGGGGATGATGAAGG 50,7 663
Antisense GGGACGGGATGGCCTC 51,4
Ex 14-15-16*
Sense GTGGGACTATACTTCAGGCC 47,7 973
Antisense GTTATTCAGTGGGACATGGG 48,7
Ex 17
Sense GGGTGCATCTGTCTGTCTGTC 50,8 221
Antisense CACTGGGCCCTGAGGATAC 51
Ex 18
Sense GTGATGGAAAGGCAATGGG 52 184
Antisense CAGCATTACCCACCCACAAG 52,5
continua
48
Fragmentos Seqüência dos primers (5' - 3') Tm (oC) Tamanho(pb)
Ex 19
Sense GCTCAGTATGCCTTTCCTCCC 54,8 125
Antisense GCCTGAGAGCACCCTGGAG 53,7
Ex 20 Sense GATTTCTACCAACTGCACCTCCC 56,4 337
Antisense GGGAGTGAGATGGCTGGGTG 56
Ex 21-22*
Sense AGCGGGAGGCCTATTAAAG 51 983
Antisense AGGCAGCCAGAGACCAGG 51,3
Ex 23
Sense CCACCATGCCTTTCCCTAC 51,4 574
Antisense GGGAAGGTCATAGGGTGGG 52,6
Ex 24
Sense GTGGATGAGCTGGTGGCC 52 353
Antisense GGGCACTAAGGACAGGAAGAC 52,1
Ex 25-26-27*
Sense CCCACCAACCATATATCCTG 49,1 954
Antisense GATGGGAAGACTAAGGCTCAG 50
Ex 28
Sense CAGGCCAGATGTCTACAAATTG 51,8 301
Antisense GGGAACCCAGCCTCAGAC 50,4
Ex 29 Sense GCACTCAAGTCTGGGCAAC 49,3 471
Antisense GGGCGGTGGAATAAGATG 49,5
Ex 30
Sense CAGCGGTAGCAGGTGGAG 50,4 321
Antisense GGGCCTTGGGACCTGAG 51,2
Ex 31
Sense CGGTGGCATGTCTGGG 48,3 375
Antisense GACACTAGGAGGACCACCAG 47,5
Ex 32-33*
Sense GAGCGCCCAGGTCAGC 50,2 1087
Antisense GGAGAGGAAAGATGGGCC 50
Ex 34-35-36*
Sense GCACACACACCCAGAGCTAG 49,7 954
Antisense CCAGGCTTCAGACTCCAAAC 50,9
Ex 37-38*
Sense CCCAAGCCATCCCATCTG 52,4 873
Antisense CCAGGCAAGCCCAGGG 53,1
Ex 39
Sense CCCACAGTGACAGGACATTC 48,7 496
Antisense CACAGGTAAGGAAGCAGGC 49,3
TABELA 4: Primers desenhados pelo software Gene Runner 5.0.80 Beta utilizados na amplificação
do gene ABCC8.
* Os éxons marcados são individualmente pequenos e próximos entre si, sendo possível
realizar a amplificação em um só fragmento.
49
2.5 Amplificação do gene INS
A amplificação dos 2 éxons do gene INS foi realizada com primers específicos,
conforme tabela a seguir. Estes primers foram desenhados para amplificação dos éxons e
parte das regiões intrônicas (nos limites dos éxons), para verificação da região de splicing.
2.6 Amplificação do gene GCK
O gene GCK é composto por 10 éxons; entretanto, existem mais 4 éxons que não
são traduzidos porém também foram estudados. Para sua amplificação foram criados
primers específicos, conforme tabela a seguir. Estes primers foram desenhados para
amplificação dos éxons e parte das regiões intrônicas (nos limites dos éxons), para
verificação da região de splicing.
Fragmentos Seqüência dos primers (5' - 3') Tm (oC) Tamanho (pb)
5'UTR e Ex 1
Sense CCAGGTGAGGGCTTTGC 49,8
787 Antisense GAGCGCCAGGAGCAGG 50,5
Ex 2
Sense CCGGCTGGAGATGGGTG 52,9 498
Antisense GGGAGAGCCACTGCATGC 52,5
TABELA 5: Primers desenhados pelo software Gene Runner 5.0.80 Beta utilizados na amplificação
do gene INS
50
Fragmentos Seqüência dos primers (5' - 3') Tm (oC) Tamanho (pb)
Ex 1*
Sense CCCAGCCATCCCATTACTAGG 63 784
Antisense ATTACATGTGAAACTGTGCCCG 62
Ex 2
Sense TCTTTGCCACCAGTCCCAG 60 745
Antisense CTGAGGCTCAAACAAACCATG 59,8
Ex 3*
Sense ACAAGGCTGAGGAATGGAAG 58,2 575
Antisense CCATGTGCCTCCTTCCAAG 59,7
Ex 4*
Sense AGCTCCGCCTCTCCCACTG 63,7 389
Antisense TGGAAGCAGGGCGTCAGG 63,5
Ex 5
Sense GCCCTCGGTGTGCAGATG 60,8 404
Antisense AACTGGCCCAAGTCGAGG 59,1
Ex 6
Sense CTCCTCCTCTTTGTAATATCCGG 61,7 417
Antisense TGTTCACCCAGGCCTCCAG 62,4
Ex 7
Sense AGTGGCCAGGTGTTGCAG 57,8 358
Antisense GGCCACAATTTGAATCCAG 57,3
Ex 8-9**
Sense GACAGGCCCTAGCACCC 48,7 618
Antisense GGTGAGGTGGATATGCAGC 49,2
Ex 10
Sense GACAAAGCAGAGACAGGCATG 59,6 441
Antisense TGGAGCTTACGAACGGATTG 60,3
Ex 11*
Sense GCTATCACTTGTTTACCACCTACTG 60 445
Antisense GCCAGAGCTTTAGAAATGTCAG 58,4
Ex 12
Sense GAGGGAAAGACGTGAACCAG 58,3 435
Antisense CCCTAGTTTCCCATCCCTG 58,2
Ex 13
Sense CTGGAGGCGAGGGCGG 56 872
Antisense GGACGAGAAGAGGACTACGAAATC 55,4
Ex 14
Sense GATTTCGTAGTCCTCTTCTCGTCC 55,4 902
Antisense CCCAGAATCACAAGCCACTCAG 56,1
Ex 14 int.**
Sense CAGCTTGACCAGACCTAGACC 50,3 560
Antisense GAGGAGCTGTCTGGAGGGC 52,8
TABELA 6: Primers desenhados pelo software Gene Runner 5.0.80 Beta utilizados na amplificação
do gene GCK.
* Os éxons marcados correspondem aqueles que não são traduzidos
** Os fragmentos dos éxons marcados são curtos e ficam próximos, sendo possível
realizar a sua amplificação conjunta.
** Trata-se de um único éxon muito longo, portanto foi necessário fragmentá-lo e
desenhar primers internos para sequenciamento.
51
De uma forma geral, para a reação de PCR, com um volume final de 50 l, foram
utilizadas as seguintes condições:
Volume dos reagentes: Ciclo:
H2O miliq --------------------------- 33,4 µL
Tampão 10X concentrado ---------- 5,0 µL
MgCl2 (50 mM) ---------------------- 1,5 µL
dNTP (2 mM) ----------------------- 5,0 µL
Primer sense (20 pmoles) ----------- 1,0 µL
Primer antisense (20 pmoles) ------- 1,0 µL
Taq DNA Polimerase --------------- 0,3 µL
DNA genômico --------------------- 2,0 µL
Quando necessário é usado 2,5 µL de DMSO
ou 0,3 µL de BSA.
95 ºC ---------- 5 minutos
95 ºC ---------- 1 minuto
Tm* ---------- 1 minuto**
72 ºC ---------- 1 minuto**
72 ºC ---------- 10 minutos
15 ºC --------- ∞
* Tm representa a temperatura média entre
os primers sense e antisense.
** De acordo com o tamanho do fragmento
este tempo pode se estender.
No entanto, houve casos em que a reação básica foi modificada para se obter melhor
especificidade e eficiência de amplificação.
2.7 Purificação dos produtos da PCR
Os fragmentos amplificados por PCR foram purificados com o Kit Wizard SV Gel
and PCR Clean-UP System (Promega) seguindo o protocolo fornecido pelo fabricante.
Após a purificação, as amostras foram quantificadas no equipamento Nanodrop 8000 -
Multi-Sample Micro-Volume UV-Vis Spectrophotometer (Thermo Scientific, USA).
30X
QUADRO 1: Condições utilizadas de forma geral nas reações de PCR.
52
2.8 Reação de Sequenciamento
Os sequenciamentos foram realizados com os próprios primers desenhados para a
amplificação dos fragmentos dos genes KCNJ11, ABCC8, INS e GCK.
As reações de sequenciamento foram realizadas utilizando o BigDyeTM
Terminator
Cycle Sequencing Kit V3.1 Ready Reaction (ABI PRISM/PE Biosystems) conforme
descrito abaixo:
Volume dos reagentes: Ciclo:
H2O miliq --------------------------- 5,4 µL
Sequencing Buffer (5X) ------------ 2,0 µL
Primer (5 pmol) --------------------- 1,0 µL
BigDye ------------------------------- 0,6 µL
Produto da PCR purificado -------- 1,0 µL
95 ºC ---------- 1 minuto
95 ºC ---------- 20 segundos
50 ºC ---------- 20 segundos
60 ºC ---------- 4 minutos
4 ºC --------- ∞
Dependendo do tamanho do fragmento amplificado, utilizou-se de 3 ng a 100 ng de
cada produto de PCR na reação de sequenciamento.
2.9 Purificação da reação de sequenciamento
Após a retirada da placa de sequenciamento do termociclador os seguintes passos
foram realizados:
Adicionou-se 2,5 µL de EDTA (125 mM) em cada poço, seguidos de 25 µL de
isopropanol 100% (Merck);
A mistura foi deixada à temperatura ambiente e na ausência de luz por 15 minutos
para precipitação do DNA;
Centrifugou-se à 13.000 rpm e 4 ºC por 35 minutos;
A placa foi invertida e o sobrenadante foi descartado, a fim de remover todo o
isopropanol;
26X
QUADRO 2: Condições utilizadas nas reações de sequenciamento.
53
Adicionou-se 30 µL de isopropanol 70% (Merck), e realizou-se uma nova
centrifugação por 10 minutos a 13.000 rpm e 4 ºC;
A placa foi invertida e o sobrenadante foi descartado;
A placa foi deixada à temperatura ambiente por cerca de 40 minutos e depois
colocada no termociclador por 3 minutos a 80 ºC para completar a secagem, em
seguida, foi estocada a -20 ºC.
O produto da reação de sequenciamento purificado foi ressuspendido em 10 µL de
Formamida Hi-Di (Applied Biosystem-Applera Corporation, Estados Unidos), para
posterior desnaturação a 94 ºC por 5 minutos.
A leitura das sequências foram obtidas por separação em eletroforese capilar no
sequenciador automático ABI PRISM 3500xL (ABI PRISM/PE Biosystems).
As sequências foram então analisadas e comparadas com as sequências de
referência de cada um dos genes KCNJ11 (ENSG00000187486), ABCC8
(ENSG00000006071), INS (ENSG00000254647) e GCK (ENSG00000106633) obtidas no
site www.ensembl.org. Para tal foram utilizados os programas Chromas Lite e CLC
Sequence Viewer 6.3 que são de distribuição gratuita.
2.8 Estudo in silico
Três métodos computacionais foram utilizados para avaliar o impacto da troca de
aminoácido na proteína para as mutações missense encontradas, indicando se esta alteração
seria prejudicial para sua função, e se contribuiria ou não para o fenótipo do indivíduo
afetado. Os programas usados foram: PolyPhen (Polymorphism Phenotyping)
(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/), SIFT (Sorting Intolerant From Tolerant)
(http://sift.jcvi.org/) e Align-GVGD (http://agvgd.iarc.fr/). O PolyPhen é utilizado para
predição do impacto funcional e estrutural de substituições de resíduos de aminoácidos em
proteínas; os valores calculados vão de 0 à 1,0, sendo que quanto mais alto este valor, mais
a substituição estudada é raramente (ou nunca) observada na família proteica, sendo
considerada mais deletéria (88). A precisão é de aproximadamente 81%, com uma taxa de
“falsos-negativos” e “falsos-positivos” de 31% e 9%, respectivamente(89, 90). A
54
ferramenta SIFT tem como função determinar o efeito funcional causado por substituições
de resíduos de aminoácidos nas proteínas, baseando-se no pressuposto que a evolução
proteica está correlacionada com a função proteica, mostrando a conservação de resíduos
de aminoácidos localizados em posições importantes para a função proteica; as
substituições que apresentam um valor de tolerância menor do que 0,05 são consideradas
intolerantes ou deletérias, enquanto que as que apresentam um valor maior do que 0,05 são
consideradas tolerantes. A precisão da ferramenta é de 60%, sendo que as taxas de “falso-
negativos” e “falso-positivos” registrada foram iguais a 31% e 20%, respectivamente (90,
91). Já o programa Align-GVGD é baseado nas diferenças químicas, de polaridade e de
volume molecular entre os aminoácidos trocados; dois valores são gerados, GD (Grantham
Difference) e GV (Grantham Variant), que predizem se a mutação de interesse está dentro
de um espectro deletério ou neutro. O critério de avaliação dos valores são os seguintes (92,
93):
Se GD = 0: a composição, polaridade e volume do aminoácido mutante estão
dentro da variação observada entre os alinhamentos, sendo considerada uma
mutação neutra;
Se (GV > 61.3) e (0 < GD < 61.3): ainda é considerada como uma alteração
conservativa, indicando ser uma alteração neutra;
Se (GV = 0) e (GV > 0): a posição onde está a mutação é 100% conservada,
sendo assim qualquer alteração neste local é considerada deletéria;
Se (0 < GV < 61.3) e (GD > 0): há uma pequena variação na conservação do
aminoácido na posição indicada, mas mesmo assim, está troca é considerada
como deletéria.
A partir dos cálculos desses valores (GV e GD), a troca é classificada também
dentro de classes (C0 – C65), sendo que quanto mais próximo de C65, mais deletéria é
considerada a mutação (FIGURA 7).
55
Para verificar a conservação da posição proteica onde houve a troca de aminoácido,
as sequências dos genes KCNJ11, ABCC8, INS e GCK humano normal e mutante foram
comparadas às sequências de outros mamíferos. As sequências foram obtidas através do
Uniprot (http://www.uniprot.org/) e os alinhamentos comparativos foram realizados através
do programa ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/).
As análises estruturais para algumas das mutações encontradas no gene GCK
também foram realizadas para melhor compreensão dos efeitos da troca de aminoácido na
enzima glucoquinase. A estrutura da GCK humana foi resolvida e depositada no PDB
(PDB ID: 4DCH – cadeia A (94). Assim, foi utilizada como base para a modelagem da
estrutura da proteína mutante no software Swiss-Model (http://swissmodel.expasy.org/)
para fins comparativos de estrutura. A visualização e manipulação das estruturas foram
realizadas através da interface gráfica gerada pelo programa de acesso STING Millennium
(www.cnptia.embrapa.br) e pelo programa PyMOL Viewer.
Para os polimorfismos encontrados, o do programa OEGE (Online Encyclopedia for
Genetic Epidemiology studies) acessado pelo site http://www.oege.org/software/hwe-mr-
FIGURA 7: Gráfico gerado no programa Aling-GVG obtido pelo site
http://agvgd.iarc.fr/classifiers.php. Cada mutação estudada é classificada dentro
de classes, sendo que quanto mais próximo de C65, mais deletéria é
considerada a alteração.
56
calc.shtml, foi utilizado para calcular se as frequências encontradas neste trabalho estavam
de acordo com as esperadas, e dentro do equilíbrio de Hardy-Weinberg.
57
RESULTADOS E DISCUSSÃO
1. Achados moleculares no gene KCNJ11:
No sequenciamento do gene KCNJ11, alguns polimorfismos já descritos na
literatura foram identificados em três, dos quatro pacientes estudados. Interessantemente, o
único paciente onde não foram encontradas alterações no gene KCNJ11 foi o caso 3,
diagnosticado com diabetes mellitus neonatal transitório. A definição de polimorfismo
difere de mutação, apenas na frequência alélica em que aparece (acima de 1% na população
é considerado polimorfismo), e apesar de nem sempre estar claro quais são os efeitos que os
chamados SNPs (em inglês: Single Nucleotide Polymorphisms) têm sobre a expressão
gênica e sobre a função proteica, eles não devem ser descartados, uma vez que podem ser
marcadores de suscetibilidade, contribuindo para o fenótipo apresentado no indivíduo.
1.1. Variação p.Lys23Glu (E23K na nomenclatura anterior) (rs5219):
A alteração p.Lys23Glu, determinada pela troca de uma lisina por um ácido
glutâmico no resíduo 23 que é resultado da troca c.67A>G foi encontrada em heterozigose
nos casos 1, 2 e 4.
Essa alteração foi inicialmente descrita por Hani et al. (95) que verificou uma forte
associação entre a variante p.Lys23Glu e DM2 em 72 indivíduos caucasianos. A partir dele,
muitos outros estudos, incluindo estudos de genoma humano (GWAS – genome-wide
association studies) em diferentes coortes confirmaram a correlação entre alterações no Kir
6.2, dentre as quais se destaca a variante p.Lys23Glu, e o DM2 (96).
Propostos a estudar o efeito que a variação p.Lys23Glu causaria no funcionamento
dos canais de Katp da célula beta-pancreática, Villareal et al. (97) desenharam um estudo
envolvendo indivíduos normais homozigotos da lisina ou do ácido glutâmico. Uma parte do
estudo envolveu 9 indivíduos denominados K/K (homozigotos da lisina) e 9 indivíduos
denominados E/E (homozigotos do ácido glutâmico) foram submetidos a teste de tolerância
oral a glicose (TTOG) e ao clamp euglicêmico-hiperinsulinêmico com o objetivo de avaliar
a secreção e a ação da insulina. Eles concluíram que os indivíduos K/K apresentavam uma
58
redução na secreção de insulina ao redor de 40%, tanto após o estímulo oral como
endovenoso. Apesar disso, os indivíduos apresentam resposta normal à sobrecarga de
glicose. Para os autores, esse fato se deu pelo aumento na sensibilidade à ação da insulina,
especialmente hepática. Os indivíduos então estariam propensos a desenvolver DM2
quando o aumento da sensibilidade à insulina não pudesse mais compensar a falha na sua
secreção, advinda da progressão no defeito na célula beta-pancreática.
Outra parte do mesmo estudo incluiu 461 indivíduos normais (não-diabéticos), dos
quais 216 eram E/E, 184 eram E/K (heterozigotos) e 61 eram K/K (homozigotos). Todos
esses indivíduos foram submetidos ao TTOG. Quando comparado aos indivíduos E/E, os
indivíduos K/K apresentaram uma redução na concentração de insulina e peptídeo-C além
de uma redução na resposta à secreção de insulina por diminuição na responsividade da
célula beta ao estímulo da glicose associado ao aumento tanto na sensibilidade como no
clearence da insulina. Foi constatado ainda que os indivíduos heterozigotos também
apresentavam menor resposta da célula beta, menos comprometida que os homozigotos
K/K.
1.2. Variação p.Ala190= (A190A na nomenclatura anterior) (rs5218):
A troca de uma timina por uma citosina modificando o códon padrão GCT por um
GCC (c.570T>C) é uma mutação silenciosa onde o aminoácido alanina no resíduo 190
permanece inalterado, o que não significa, contudo, que não haja dano na síntese proteica.
Essa troca foi encontrada em heterozigose apenas no caso 1. Segundo Shah et al. (98), a
alteração p.Ala190= no gene KCNJ11 mostrou produzir um número reduzido de proteínas
Kir6.2 em experimentos de transcrição e tradução realizados in vitro.
Assim como a variante p.Lys23Glu, a alteração p.Ala190= está associada ao DM2
em diversos estudos na literatura (99, 100), alguns deles mais recentes incluindo associação
com aumento do risco de hipertensão arterial (101).
59
1.3. Variação p.Val337Ile (V337I na nomenclatura anterior) (rs5215):
A variação p.Val337Ile foi identificada em heterozigose nos casos 1, 2 e 4, ou seja,
aqueles diagnosticados com DMNP. A troca se deu pela substituição do nucleotídeo
guanina por uma adenina na posição 1009 do cDNA (c.1009G>A). Tal como as variações
supracitadas, aqui também existem estudos de associação com DM2.
Segundo Koo et al. (102), as variações p.Lys23Glu e Val337Ile estão em
desequilíbrio de ligação (linkage desequilibrium), ou seja, a combinação desses dois alelos
ocorre mais frequentemente na população do que seria esperado pela formação aleatória de
haplótipos a partir de alelos baseados nas suas frequências. Eles concluíram que, na
população estudada (origem coreana), praticamente todos os haplótipos que contêm c.67G
também contêm c.1009A e que sua presença estava fortemente associada com DM2 e
hipertensão arterial.
Nos nossos casos, os três pacientes que apresentaram as alterações acima citadas
são DMNP e fazem uso constante de insulina. Torna-se difícil avaliar o impacto que esses
polimorfismos trazem na evolução da doença.
2. Achados moleculares no gene ABCC8:
2.1 Mutação p.Phe577Leu:
A mutação p.Phe577Leu foi identificada em heterozigose no caso 3, diagnosticado
com diabetes mellitus neonatal transitório. Os pais não são consanguíneos e também foram
estudados, verificando-se que a mutação foi herdada da mãe. A troca de uma timina por
uma guanina foi observada no éxon 12 na posição c.1731 (FIGURA 8).
60
FIGURA 8: Parte dos eletroferogramas obtidos no sequenciamento do éxon 12, mostrando
a substituição em heterozigose c.1731T>G, levando à mutação p.Phe577Leu
identificada no paciente 3 portador de diabetes mellitus neonatal transitório. A)
Sequência normal do éxon 12, a caixa vermelha ressalta a timina (T) na qual
ocorreu a troca. B) Sequência mutante do éxon 12, mostrando a troca em
heterozigose de T para G (K).
Esta mutação levou a uma troca de uma fenilalanina por uma leucina no resíduo 577
da proteína, localizado no primeiro domínio transmembrana (TMD0). Apesar de ambos os
aminoácidos serem hidrofóbicos e apolares, eles possuem estruturas diferentes,
especialmente pela presença de um anel aromático na fenilalanina, que está ausente na
leucina (FIGURA 9A). A característica aromática da fenilalanina lhe confere a capacidade
de interagir com outros resíduos aromáticos formando “stackings”, contribuindo para a
estrutura da proteína (103). Podemos supor assim que a perda desse anel aromático
decorrente da substituição pela leucina pode vir a alterar a função do canal SUR1.
Através de alinhamento no Clustal (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/),
pode-se verificar que a fenilalanina da posição 577 é altamente conservada entre os
vertebrados (FIGURA 9B).
61
FIGURA 9: A) Estruturas dos aminoácidos fenilalanina e leucina, os quais foram trocados
levando a mutação p.Phe577Leu. B) Alinhamento da fenilalanina da posição
577, mostrando sua conservação entre as espécies de mamíferos.
Usando as ferramentas computacionais PolyPhen, SIFT e Align-GVGD como
análises de predição para avaliar se a troca do aminoácido é prejudicial ou não, foram
obtidos os seguintes resultados:
PolyPhen = 0,998 - Considerada provavelmente deletéria
SIFT = 0 - Considerada deletéria
Aling-GVGD = GV = 0, GD = 21,82 e Classe C15 – Considerada pouco deletéria
Dos três programas utilizados, dois confirmaram que se trata de uma mutação
deletéria. Se somarmos esse dado ao fato do aminoácido fenilalanina na posição 577 ser
extremamente conservada entre as espécies, podemos inferir que a mutação encontrada
pode ser responsável pelo fenótipo apresentado pelo paciente. A mãe do paciente, também
portadora da mutação, não apresentou alterações glicêmicas até o momento. Há um relato
de que a tia materna (não obesa) apresenta diabetes desde os 15 anos de idade porém só
iniciou uso de insulina aos 43 anos (familiar não esteve disponível para estudo molecular).
62
Há na literatura estudos que descrevem uma variabilidade fenotípica para algumas
mutações no ABCC8. Klee et al. (104), por exemplo, descreveram uma família portadora da
mutação p.His863Tyr cujo caso índice havia sido diagnosticado com diabetes mellitus
neonatal aos 2 meses de idade e tanto o pai como o avô paterno permaneciam
assintomáticos até o estudo e, posteriormente ao diagnóstico molecular, foi então
constatado uma leve hiperglicemia de jejum em ambos.
A análise estrutural da mutação p.Phe577Leu não foi realizada pois não há, até o
momento, proteínas com um grau confiável de similaridade que já tenham sido
cristalizadas. Segundo Hollenstein et al. (105), isso se deve ao fato dos domínios
transmembranas variarem consideravelmente entre as espécies, tanto na sequência primária
como no comprimento, na arquitetura e no número de hélices. Embora Babenko et al. (65)
tenham descrito uma mutação decorrente da troca de uma leucina por uma valina no
resíduo 582 (ou seja, localizada a apenas cinco aminoácidos de distância da mutação
descrita neste estudo) como causa de diabetes mellitus neonatal transitório, o modelo usado
para a análise estrutural já está descontinuado do banco de dados (http://www.uniprot.org/)
por sua baixa identidade com a proteína humana.
2.2 Variação p.Ser1369Ala (S1369A na nomenclatura anterior) (rs757110):
A variação p.Ser1369Ala foi encontrada em heterozigose no caso 4, com DMNP.
Essa variação é citada em diversos estudos como um haplótipo que predispõe ao diabetes
tipo 2, quando em associação com a variação p.Lys23Glu do gene KCNJ11 (também
encontrada no paciente em questão). Segundo Hamming et al. (106), cerca de 95% dos
indivíduos que possuem dois alelos K23 no gene KCNJ11 possuem também dois alelos
A1369 no ABCC8, sendo esse estado homozigótico fundamental para a associação com o
DM2.
A serina na posição 1369 está situada no segundo domínio de ligação ao DNA
(NBD2) do SUR1, formando parte da região sensível ao MgATP e MgADP, fundamental
na regulação da atividade do canal de KATP e consequente liberação de insulina. Fatechi et
al. (107), utilizando modelos de canais de KATP recombinantes contendo o haplótipo
E23/S1369 e o haplótipo de risco K23/A1369 puderam notar através de técnicas
63
bioquímicas e eletrofisiológicas que os canais contendo K23/A1369 apresentavam uma
diminuição da sensibilidade do canal ao MgATP resultando em aumento da atividade basal
do canal de KATP, mesmo em concentrações fisiológicas de MgATP. Eles provaram ainda
que a variação A1369 compromete mais a sensibilidade do canal ao MgATP que a variação
K23 do gene KCNJ11, propondo assim que a presença dessa alteração estaria mais
envolvida, quando associada a outros fatores predisponentes, à gênese do diabetes tipo 2.
No nosso caso não é possível inferir qual a contribuição desse achado na origem da
doença, uma vez que: (1) ele é heterozigoto para ambas as variações e (2) as alterações
decorrentes dessas trocas pontuais de aminoácidos não ocasionariam um déficit tão
pronunciado na secreção de insulina como a que ele apresenta.
3. Achados moleculares no gene GCK:
3.1 Mutação p.Asn254His (CM096878):
A mutação p.Asn254His foi encontrada em heterozigose nos casos 1 e 2,
pertencentes a uma mesma família e também em suas respectivas mães, que são irmãs. A
troca de uma adenosina por uma citosina ocorre no éxon 7 na posição c.760, resultando na
substituição de uma asparagina por uma histidina no códon 254 (FIGURA 10).
FIGURA 10: A) Parte do eletroferograma obtido no sequenciamento do éxon 7, mostrando a substituição em heterozigose
c.760A>C, levando à mutação p.Asn254His identificada nos casos 1 e 2, com diabetes mellitus neonatal
permanente, e em suas respectivas mães, que são irmãs. A caixa vermelha ressalta a troca A>C (M). B) Estruturas
dos aminoácidos asparagina e histidina, os quais foram trocados levando a mutação descrita.
B A
64
Para entender o dano que essa troca de aminoácidos poderia causar à atividade da
enzima fez-se necessário conhecer sua estrutura e seu funcionamento. De acordo com
Kamata et al. (108), responsáveis pela cristalização da estrutura da glucoquinase humana,
sabe-se que a enzima GCK é constituída por dois domínios (pequeno e grande domínio),
entremeados por uma fenda, onde se liga a glicose. Em seu estado inativo, ou seja, sem a
presença da glicose, a enzima se mantém estruturalmente em uma forma super-aberta, com
o pequeno domínio e o grande domínio bem distantes um do outro. Além deles, outras duas
estruturas também exercem papel importante no funcionamento da enzima: a 5 e a 13
hélices, ambas localizadas no pequeno domínio (FIGURA 11).
FIGURA 11: Desenho esquemático mostrando dois estados conformacionais da enzima glucoquinase: o estado
fechado, onde o pequeno e o grande domínio estão próximos um ao outro e as -5 e -13 hélices
estão envolvidas por eles no interior da fenda; e o estado super-aberto, onde há a rotação do pequeno
domínio e a abertura máxima da fenda, sítio de ligação à glicose. Modificado de Kamata et al. (108).
65
Quando a glicose se liga à forma super-aberta (inativa) da enzima, ela passa para a
forma aberta e, na presença do ATP, ocorrerá uma maior aproximação dos dois domínios,
sendo esse seu estado fechado, considerado o estado ativo. Completada a reação de
fosforilação da glicose em glicose-6-fosfato (G6P), a glucoquinase retorna ao seu estado
aberto, liberando G6P e ADP. Todo esse processo é conhecido como ciclo catalítico lento.
Se no momento em que a G6P e o ADP são liberados outra molécula de glicose se ligar à
enzima, o processo catalítico é reiniciado, dando início ao ciclo catalítico rápido. Caso
contrário, a enzima volta o seu estado super-aberto ou inativo (FIGURA 12). Para que isso
ocorra é fundamental a liberação da hélice 13 (em conjunto com a hélice 5 que a
acompanha) do pequeno domínio seguido pelo afrouxamento da região de conexão,
permitindo uma maior rotação da enzima e seu retorno ao estado super-aberto (109).
FIGURA 12: Esquema mostrando a glucoquinase em seus três estados conformacionais e seus dois ciclos
catalíticos. Retirado de Kamata et al. (108).
66
Nota-se dessa forma que a flexibilidade da enzima é essencial para que ela execute
sua função, a fosforilação da glicose.
Ao avaliarmos a distribuição dos aminoácidos ao longo da enzima, no que diz
respeito ao sítio de ligação com a glicose (inserido na fenda entre os dois domínios – deep
cleft), identificamos que ele é composto pelos resíduos Glu256 e Glu290, no grande
domínio; pelos resíduos Tir168 e Lis169 no pequeno domínio e ainda pelos resíduos
Asn204 e Asp205 na região de conexão entre eles.
Percebemos que o resíduo 254, onde ocorreu a mutação p.Asn254His, está
localizado no grande domínio da enzima, no interior da região de fenda e a apenas dois
resíduos de distância do Glu256, fundamental para a ligação da glicose.
A análise estrutural dessa mutação foi realizada usando o PDB: 4DCH – cadeia A
como molde. Foi possível verificar que a asparagina do resíduo 254 (N254) estabelecia
contatos internos através de pontes de hidrogênio com o ácido glutâmico do resíduo 256
(E256), com a asparagina do resíduo 231 (N231) e com a leucina do resíduo 58 (L58)
(FIGURA 13A/B).
B
FIGURA 13: A) Análise estrutural da glucoquinase mostrando a proteína normal, com a asparagina no resíduo 254 e
seus contatos com os aminoácidos E256, N231 e L58. As linhas tracejadas representam a distância
entre cada aminoácido em Ångström (Å).
B) Gráfico de contatos internos (fornecido pelo programa STING Millenium) mostrando essas
interações: as linhas azuis e a linha branca simbolizam as pontes de hidrogênio.
A
67
Na proteína mutante, a histidina no resíduo 254 (H254) deixa de interagir com o
resíduo N231, mantém o contato com o resíduo L58 e adiciona quatro novos contatos
através de interações hidrofóbicas: com a cisteína do resíduo 233 (C233), com a valina do
resíduo 207 (V207), com a asparagina do resíduo 204 (N204) e com a treonina do resíduo
60 (T60). Além disso, cria uma interação aromática com a lisina do resíduo 459 (K459) e
troca o contato com o ácido glutâmico do resíduo 256 (E256), que antes era estabelecido
por uma ponte de hidrogênio e agora passa a ser uma interação por atração de cargas
(FIGURA 14A/B).
FIGURA 14: A) Análise estrutural da glucoquinase mostrando a proteína mutante, com a histidina no resíduo 254,
que perde seu contato com o aminoácido N231, mantém a interação com L58 através de ponte de
hidrogênio e cria cinco novos contatos: C233, V207, N204, T60 e K459. Com E256, o contato se
mantém porém passa a ser por atração de cargas. As linhas tracejadas representam a distância entre
cada aminoácido em Ångström (Å).
B) Gráfico de contatos internos (fornecido pelo programa STING Millenium) mostrando essas
interações: a linha branca simboliza as pontes de hidrogênio, as linhas roxas representam interações
hidrofóbicas, a linha verde simboliza interação por atração de cargas e a linha cinza representa ligação
aromática.
A B
68
Como resultados dos programas de análise de predição PolyPhen, SIFT e Aling-
GVGD obtivemos:
PolyPhen = 0,986 – Considerada deletéria
SIFT = 0 - Considerada deletéria
Aling-GVGD = GV = 0, GD = 68,35 e Classe C65 – Considerada deletéria
Os três programas confirmaram que se trata de uma mutação deletéria indicando que
provavelmente é causadora do fenótipo dos pacientes.
Se levarmos em consideração as alterações estruturais, podemos acreditar que a
mutação descrita compromete o potencial de fosforilação da glucoquinase:
1) Por afetar o sítio de ligação à glicose: o resíduo 254 está a justamente nessa
região, em contato com o ácido glutâmico no resíduo 256 (aminoácido
fundamental para a ligação com a glicose) sendo que na proteína normal esse
contato é estabelecido por uma ponte de hidrogênio, passando a ser uma
interação por atração de cargas na proteína mutante. Outro dado diz respeito
ao contato com a asparagina no resíduo 204, outro aminoácido que constitui
o sítio de ligação com a glicose, que na proteína normal não interage com o
resíduo 254 e passa a interagir na proteína mutante.
2) Por comprometer a flexibilidade da enzima: quanto mais contatos internos
um aminoácido estabelece com outros, mais isso “enrijece” a proteína,
podendo atrapalhar sua movimentação e consequentemente a função
enzimática.
Dessa forma, postulamos que a mutação p.Asn254His é causadora do DMNP dos
casos descritos, especialmente por estar associado à mutação p.Arg447Gly, que será
descrita a seguir, constituindo um quadro de heterozigose composta. Nas mães,
heterozigotas simples, a mutação pode justificar sua glicemia de jejum alterada observado
na investigação laboratorial, configurando-as como portadoras de MODY 2.
69
3.2 Mutação p.Arg447Gly (rs193922281):
A mutação p.Arg447Gly foi encontrada em heterozigose nos casos 1 e 2, e em seus
respectivos pais, que são irmãos, além do irmão mais novo do caso 1. A troca de uma
citosina por uma guanina ocorreu no éxon 10 na posição c.1340, resultando na substituição
de uma arginina por uma glicina no códon 447 (FIGURA 16).
O resíduo 447 está localizado no limite da 13 hélice, que se estende do resíduo
Glu443 ao resíduo Ala460, na região C-terminal da glucoquinase, parte do pequeno
domínio (109).
A análise estrutural dessa mutação foi realizada usando o PDB: 4DCH – cadeia A
como molde. Foi possível verificar que a arginina do resíduo 447 (R447) estabelecia
contatos internos através de pontes de hidrogênio com a valina do resíduo 101 (V101) e
com a leucina do resíduo 451 (L451), além da tirosina do resíduo 215 (Y215) através de
interações aromáticas e hidrofóbicas (FIGURA 17A/B).
B A
Arginina Glicina
FIGURA 16: A) Parte do eletroferograma obtido no sequenciamento do éxon 10, mostrando a substituição em
heterozigose c.1340C>G, levando à mutação p.Arg447Gli identificada nos casos 1 e 2. A caixa vermelha
ressalta a troca C>G (S). B) Estruturas dos aminoácidos arginina e glicina, os quais foram trocados
levando a mutação descrita.
70
Na proteína mutante, a glicina no resíduo 447 (G447) deixa de interagir com os
resíduos V101 e T215, mantém a ponte de hidrogênio com L451 e cria uma nova interação
através de ponte de hidrogênio com a alanina no resíduo 450 (FIGURA 18A/B).
FIGURA 17: A) Análise estrutural da glucoquinase mostrando a proteína normal, com a arginina no resíduo
447, que estabelece contato com o aminoácido V101, com o aminoácido L451 e ainda com o
aminoácido Y215. As linhas tracejadas representam a distância entre cada aminoácido em
Ångström (Å).
B) Gráfico de contatos internos (fornecido pelo programa STING Millenium) mostrando essas
interações: as linhas branca e rosa simbolizam as pontes de hidrogênio, a linha roxa representa
interação hidrofóbica e a linha cinza representa ligação aromática.
B A
FIGURA 18: A) Análise estrutural da glucoquinase mostrando a proteína mutante, com a glicina no resíduo
447, que mantém contato com o aminoácido L451, perde as interações com os aminoácidos V101
e T215 e cria novo contato com o aminoácido A450. As linhas tracejadas representam a distância
entre cada aminoácido em Ångström (Å).
B) Gráfico de contatos internos (fornecido pelo programa STING Millenium) mostrando essas
interações: as linhas brancas simbolizam as pontes de hidrogênio.
A B
71
Como resultados dos programas de análise de predição PolyPhen, SIFT e Aling-
GVGD obtivemos:
PolyPhen = 0,998 – Considerada deletéria
SIFT = 0 - Considerada deletéria
Aling-GVGD = GV = 0, GD = 125,13 e Classe C65 – Considerada deletéria
Os três programas confirmaram que se trata de uma mutação deletéria e que
provavelmente é causadora do fenótipo dos pacientes.
Se levarmos em consideração as alterações estruturais, podemos acreditar que a
mutação p.Arg447Gly compromete o potencial de fosforilação da glucoquinase uma vez
que está localizada na hélice 13 que, como dito acima, tem papel crucial nas mudanças
conformacionais que ocorrem com a glucoquinase. Essa alteração, portanto pode justificar
o quadro de hiperglicemia de jejum encontrado na investigação laboratorial dos pais e do
irmão do caso 1, configurando-os como portadores de MODY 2. Nos pacientes, essa
alteração em associação com a mutação herdada das mães comprometeria ainda mais a
secreção de insulina, levando assim a um quadro hiperglicêmico mais grave, tal qual o
apresentado.
Mutações nesse resíduo (p.Arg447Gln e p.Arg447del29) já foram descritos por
outros autores em pacientes com MODY 2 (110). Recentemente, Capuano et al. (111)
descreveram a mutação em frameshift p.Arg447Glifs enquanto Shammas et al. (112)
descreveram a mutação missense p. Arg447Pro, ambos em indivíduos com MODY 2.
Até o momento, a mutação descrita nesse estudo em associação com a mutação
p.Asn254His configura o primeiro relato de diabetes neonatal permanente por mutação em
heterozigose composta no gene GCK na população brasileira, sendo a associação descrita
(p.Asn254His e p.Arg447Gly), no nosso conhecimento, também inédita na literatura
mundial.
Uma das razões que motivou esse estudo foi o benefício que o diagnóstico
molecular poderia trazer para o aconselhamento genético e para o tratamento, com a
possibilidade da mudança de insulina para hipoglicemiante oral. Embora essa conduta se
mostrou ser muito benéfica nos casos de diabetes neonatal permanente por mutações no
72
gene KCNJ11 e ABCC8, nos casos de DMNP por mutações no gene GCK os resultados da
mudança no tratamento não foram tão vantajosos (76, 77). Eles puderam constatar que o
uso de sulfoniluréia permitia apenas uma redução na dose da insulina, porém não era
suficiente para suspender seu uso.
A descoberta de mutações ativadoras e inativadoras no gene GCK e o conhecimento
de suas implicações no funcionamento da glucoquinase e no seu papel fundamental na
homeostase da glicose ajudou no entendimento bioquímico da ativação e regulação dessa
enzima (113). As mutações localizadas na hélice α-13 (como no caso descrito aqui), em
especial aquelas responsáveis pelo fenótipo oposto (hipoglicemia hiperinsulinêmica)
contribuíram para o desenvolvimento de drogas que tem como alvo justamente essa região
da enzima glucoquinase. Atualmente, alguns agentes farmacológicos conhecidos como
glucokinase activators (GKAs) tem sido testados e se mostraram eficazes em aumentar a
liberação de insulina e reduzir a produção de glicose hepática, sendo alvos potenciais no
tratamento do diabetes (114).
4. Achados moleculares no gene INS:
O sequenciamento dos dois éxons do gene da insulina foi realizado nos quatro casos
descritos, não tendo sido encontrada nenhuma mutação. Apenas no caso 4 foi encontrada a
variação rs689 (c.-23T>A), sem relação na literatura com o diabetes mellitus neonatal
permanente.
73
CONCLUSÕES
O estudo molecular dos genes KCNJ11, ABCC8, INS E GCK trouxe como
conclusões:
No sequenciamento do gene ABCC8 foi identificada a mutação
p.Phe577Leu, em heterozigose no caso 3, portador de diabetes mellitus
neonatal transitório e em sua mãe, que até o momento se desconhece ter
apresentado episódio de hiperglicemia. Essa mutação é inédita, sendo
descrita pela primeira vez nesse estudo.
No sequenciamento do gene GCK foram identificadas duas mutações: a
mutação p.Asn254His, presente nos casos 1 e 2 e também em suas
respectivas mães, que são irmãs; e a mutação p.Arg447Gly, presente
também nos casos 1 e 2, além de seus respectivos pais, que são irmãos, e no
irmão mais novo do caso 1. As mutações isoladas configuram um quadro de
heterozigose simples e levam ao fenótipo conhecido por uma hiperglicemia
leve de jejum, denominado MODY 2. As mutações somadas, em
heterozigose composta, levam a uma hiperglicemia grave, de início precoce,
o diabetes mellitus neonatal permanente.
O sequenciamento do gene KCNJ11 evidenciou algumas variações comuns
na população, em especial a variação p.Lys23Glu, que foi encontrada nos
casos 1, 2 e 4, mas que, pela severidade do déficit de insulina apresentada
nesses casos, não pode ser relacionada ao fenótipo.
No caso 4 não foi possível identificar a causa molecular, apesar de terem
sido estudados apenas quatro genes relacionados de DMNP (os mais
frequentes). De acordo com Rubio-Cabezas et al.(25), cerca de 40% dos
casos de diabetes mellitus neonatal permanecem sem diagnóstico genético,
na maioria deles não há manifestação clínica extra-pancreática, o que sugere
que ainda há genes a serem descobertos.
74
75
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86
ANEXOS
Genes
Variação
Caso
(diagn)
KCNJ11 ABCC8 GCK INS
p.Lys23Glu p.Ala190= p.Val337Ile p.Phe577Leu p.Ser1369Ala p.Asn254His p.Arg447Gly c.-23T>A
1
(DMNP) X X X X X
2
(DMNP) X X X X
3
(DMNT) X
4
(DMNP) X X X X
M1
(MODY 2) ND ND ND X
M2
(MODY 2) ND ND X
M3
X
P1
(MODY 2) ND ND ND X
P2
(MODY 2) ND ND X
I2
(MODY 2) X
QUADRO 1: Resumo das alterações moleculares encontradas nesse estudo. Os números 1, 2, 3 e 4 referem-se aos casos
descritos nesse trabalho; M1, M2 e M3 referem-se respectivamente às mães dos casos 1, 2, e 3; P1 e P2
referem-se aos pais dos casos 1 e 2; I2 refere-se ao irmão mais novo do caso 2. X: alteração encontrada em
heterozigose. ND: pais não disponíveis para estudo dos genes KCNJ11 e ABCC8.
87
ANEXOS
88
89
90
ANEXOS
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
ANÁLISE MOLECULAR DOS GENES KCNJ11, ABCC8, INS E GCK EM
PACIENTES COM DIABETES MELLITUS NEONATAL
Prezado voluntário,
Eu, Adriana Mangue Esquiaveto-Aun, médica pediatra e endocrinologista infantil,
aluna do programa de pós-graduação em Saúde da Criança e do Adolescente, sob orientação
da Profa. Dra. Sofia Helena Valente Lemos Marini, docente do departamento de pediatria da
FCM - Unicamp, venho solicitar sua colaboração no projeto de pesquisa cujo título está
citado acima.
Com esta finalidade, será proposto coleta de exame para estudo de DNA, os quais
serão obtidos na ocasião das coletas dos exames de rotina solicitados durante seguimento
ambulatorial. O estudo do DNA é um estudo laboratorial onde será avaliada a integridade
dos genes relacionados com o diabetes neonatal. Serão 4 os genes estudados: gene
KCNJ11, gene ABCC8, gene GCK e o gene da insulina. Todos esses genes já foram
estudados anteriormente por grupos no Brasil e do exterior e as publicações provenientes
desses estudos demonstram a importância e os benefícios desse diagnóstico molecular. Na
presença de mutações em algum desses genes, os demais familiares serão convidados a
participar do estudo, sem ônus. Será oferecido aconselhamento genético aos acometidos
pela mutação no gene GCK uma vez que se trata de uma doença autossômica recessiva
(25% de chance de ser passado de pai/mãe para filho). Os esclarecimentos quanto ao
aconselhamento genético serão feitos por mim e pela minha orientadora, no ambulatório de
Diabetes Infantil do hospital de clínicas da Unicamp, sempre que necessário.
Os estudos laboratoriais não interferirão na rotina de seguimento no ambulatório de
Diabetes Infantil e os mesmos serão realizados no Centro de Biologia Molecular e
Engenharia Genética da Unicamp.
91
Esclareço que a participação neste projeto é totalmente voluntária. Não haverá
qualquer prejuízo ao acompanhamento médico de seu filho, caso você ou ele não
concordem em participar.
Ressaltamos que os dados obtidos no estudo serão mantidos em sigilo e a família
será informada dos resultados assim que alcançados, ficando proposto a partir deles o
fornecimento de todas as informações necessárias ao aconselhamento genético e os
possíveis benefícios ou não advindos desse diagnóstico. Ressalto ainda, embasada na
literatura, que o diagnóstico de determinadas mutações nos genes KCNJ11 e ABCC8
permitem a mudança no tratamento do diabetes, de injetável com insulina para oral com
hipoglicemiante, melhorando a qualidade de vida de seu filho (a).
Acrescento que os dados obtidos poderão ser publicados em revistas ou congressos
científicos, em conjunto com os outros dados colhidos, sem, no entanto, haver a
identificação do paciente.
Sua participação não é obrigatória e você ficará livre para não participar ou para
desistir em qualquer momento da pesquisa, sem qualquer constrangimento.
Será mantido segredo das informações obtidas bem como o anonimato dos
participantes na pesquisa. As informações coletadas serão de uso exclusivo para publicação
científica, dos resultados da pesquisa. Não haverá pagamento em troca de sua participação
neste estudo.
Você receberá uma cópia assinada deste documento, que recomendamos que seja
guardada em local seguro.
Esse projeto foi aprovado pelo comitê ético (CEP) local (Rua: Tessália Vieira de
Camargo, 126 – Cidade Universitária - Campinas – SP - CEP 13083-887), que poderá
receber denúncias e/ou reclamações referentes aos aspectos éticos da pesquisa em questão
através do endereço acima, pelos telefones: (019) 3521-8936 ou 3521-7187 ou pelo e-mail:
[email protected]. Importante ressaltar que as dúvidas relacionadas a pesquisa (como
andamento, resultados) serão esclarecidas pela pesquisadora.
92
Campinas, ___/___/_____
Nome do paciente: ________________________________________________
Assinatura:_______________________________________________________
Responsável legal do (a) paciente: _____________________________________
Assinatura:_______________________________________________________
Responsável pela pesquisa
Adriana Mangue Esquiaveto-Aun
Fone: (19) 3521-1146 ou (19) 3521-7264
93
