Amigo

AG1{ADECIMENTOS

Ao Professor Dr.Srgio Miguel Zucas - Pessoa que

nos iniciou na vida acadmico-cientifica, a quem devemos o

lugar que hoje ocupamos.

Ao Professor Dr. Rui Curi Pela amizade nos

momentos mais dificeis, ateno, disponibilidade de seu

laboratrio, e sobretudo, pela orientao deste trabalho Bem

a qual no seria possivel sua execuo.

Ao professor Dr. Eduardo Kokubun

inestimvel pela discusso dos ~esultados e sugestes ao

trabalho.

Ao Marcos Barbosa Recco o amigo com quem

dividimos a autoria deste trabalho.

A Ivette de Almeida Dirani Pela ajuda

fundamental na coleta de dados.

Aos amigos do Laboratrio de Fisiologia Celular -

Pela discusso do trabalho e pelas "risadas" necessrias

para o desenvolvimento de um estudo srio.

l-INTRODUAO:

1.1 Fontes Energticas

No organismo, varias so as fontes energticas

existentes para atender a demanda metablica. Analisando o

complexo orgnico pela sua menor estrutura, -a clula,

veremos que esta, possui diversas vias produtoras de energia

para atender suas necessidades. A eficincia do organismo

torna-se evidente quando requisio energtica feita de

1

maneira rpida. Existe na clula pequenos estoques

energticos na forma de tri-fosfato de Adenosina (ATP). Esta

substncia ento fracionada, pela ao de enzimas (ATPase)

espalhadas pelo citoplasma celular(vide figura-i). A quebra

das ligaQes fosfato com a adenosina, promove a libera~o de

energia e a formao de dois compostos: difosfato de

Adenosina(ADP) e fosfato inorgnico. Esta situa~o permite

ao organismo imediata liberao energtica, porm com

pequeno rendimento; 1 moI de ATP fracionado rende 20.000

calorias (Junqueira & Carneiro 1987). Por sua vez, o ADP

pode ser ressintetizado a ATP pela degradao do comPqsto\

Creatina Fosfato (CP) que libera a energia necessria para

que um fosfato inorgnico seja incorporado ao difosfato de

Adenosina.

A ingesta alimentar promove libera~o de

nutrientes ao organismo. Por sua vez, estes chegam at as

Clulas onde ficam armazenados, para posterior fornecimento

de energia, como os carboidratos (estocados como glicognio)

e os lipideos(sob a forma de triglicerideos). Estes estoques

2

representam acmulo de energia sob forma estvel e

concentrada e acessvel em condies de jejum e de demanda

energtica aumentada. O rendimento energtico liquido da

degradao de um moI de glicose(gliclise) a dois d~

piruvato fornece, igualmente, 40.000 calorias. Porm, este

processo, denominado de gliclise anaerbica, gera

substratos para a usina celular(mitocondria). Os dois

moles de piruvato formados so ento degradados

completamente a C02 e H20, ge~ando por moI de glicose

aproximadamente 690.000 cal que corresponde a 36 moles de

ATP (Lehninger 1988).

A utilizao do piruvato como fonte energtica

ocorre no interior mitocondrial atravs da fosforilao

oxidativa. Neste processo participam como precursores

energticos no apenas os carboidratos mas tambm os cidos

graxos e os aminocidos. Pode-se dividir a fosforilao

oxidativa em trs etapas: l)produo de Acetil Coenzima A

(Acetil CoA) pela piruvato desidrogenase ou beta-oxidao

2)ciclo de Krebs e 3)sistema transportador de eltron~. O

ciclo de Krebs apresenta um rendimento final lquido de 2

moles de ATP e a cadeia de transporte de eletrons de 32

moles de ATP(Stryer 1988)(vide- figura-l).

/

Figura 1 - Vias de Fornecimento de Energia

0llC088

\

[iiJATPaS8

CITOPLASMA

,,"./

.... 2ATP

A.G.L.

CJ.J

.1.2-Tipos de Exercicio Fsico e Demanda Energtica

Durante a atividade fsica, as fontes energticas

utilizadas variam de acordo com a intensidade e durao do

4

esforo. Nos momentos iniciais do exerccio, ocorre

metabolizao das fontes energticas primrias ATP e CP. Com

o prosseguimento da atividade, passa a responder com maior

suprimento energtico a degradao dos carbo.idratos;

glicognio celular e glicose circulante (Hultman 1967). A

converso de um moI de glic05e circulante em 2 de piruvato

forma 2 de ATP, conforme j mencionado. Contudo, a converso

de 1 moI de glicose do glicognio a piruvato forma 3 de ATP,

pois esta g1icose no precisa ser fosforilada, resultando em

~conomifl. de 1 moI de ATP. Ef-lte pi. rllvato 8.0 Bel' convert i.eio

em acetil CoA, pela aco da piruvato desidrogenase, no

interior da matriz mitocondrial, d inicio ao processo

oxidativo final da glicose.

Como descrito anteriormente, a degradao da

glicose ou glicognio a piruvato no constitui forma

eficiente de produo de energia(ATP). Na fosforilao

oxlduLlvu, em fun80 dos processos aerbicos ocorre ~~ior\

utilizao dos cidos graxos livres (A.G.L.) (Ahlborg et aI

1974, Pirnay et a1 1977; Ravussin et aI 1979) que passam a

responder pelo maior aporte energtico nas atividades

fsicas de longa durao. Desta forma, as atividades de

longa durao e baixa intensidade utilizam a via aerbica

como principal fonte energAticA. Esta via possui como fonte

de substratos piruvato, aminocidos e cidos graxos livres

(Felig & Wahren 1975). Durante as atividades mais longas e

menos intensas, a degradao dos cidos graxos livres pela

Beta-oxidao preferivel pela maior eficincia na formao

de ATP (a degradao completa de um moI de palmitoil CoA at

C02 fornece 131 moles de ATP no total). A Beta-oxidao

ocorre no interior da mitocndria e fornece acetilCoA que,

atravs do ciclo de Krebs, libera C02. Entre os fatores que

controlam a utilizao dos cidos graxos, o transporte

. atravs da membrana mitocondrial de extrema importncia. A

carnitina atua ligando-se ao abilCoA formando o complexo

acil-carnitina. Com a ao da carnitina palmitoil

transferase, este complexo atravessa a membrana

mltocondrial(Rebouche & Paulson 1986). Assim, o fornecimento

reduzido de carnitina pode diminuir a utilizao de cidos

graxos pelos tecidos.

As atividades de curta durao e alta intensidade

apresentam, por sua vez, alteraes metablicas bem

distintas que as de longa durao e baixa intensidade.Nessas

atividades, a fonte energtica predominante a degradao

do glicognio muscular. O proceso glicolitico anaerbico, a\

via preferencial pela rapidez com que conseguem fornecer

energia e atender as solicitaes energticas imediatas da

clula muscular.

1.3-Diferenciaco dos TecJ.,ctos Musculares

Esquelticos.

Como citado por Keul et al(1972) j em 1678,

Lorenzini diferenciou as fibras musculares de coelhos em

brancas e vermelhas. Mais tarde, cerca de dois sculos aps,

Ranvier em 1873 e Grutzner em 1884, demonstraram que os

vertebrados possuem dois tipos extremos de fibras musculares

6

que foram denominadas de fibras musculares escuras(tnicas)

e plidas(fsicas). Estas apresentariam adaptaes

metablicas de acordo com o "treinamento" a que fossem

submetidos. Mais recentemente, Saltin et al (1977)

demonstraram existir trs tipos distintos de fibras

musculares. Estas fibras foram ento classificadas como:

l)fibra do tipo I(contrao - lenta), 2)fibra do tipo

IIA(contrao rpida oxidativa) , 3)fibra do tipo

IIB(contrao rpida - glicoltica). Saltin descreve ainda

as caracteristicas metRblicas especificas de cada uma como

demonstrado na tabela 1.

Como pode-se observar (vide tabela 1), as fibras

musculares do tipo I possuem caractersticas fundamentais

para a manuteno de esfros de longa durao e baixa

intensidade, devido a sua alta capacidade oxidativa e sua

baixa velocidade de contrao. Nessas as principais vias de

gt~ ru(..~u de enel'g.lu sto as decorrentes dos proce~SOB\

oxidativos mitocondriais. Desta forma, estas fibras possuem

grande capacidude de utilizar os cidos graxos livres devido

a sua elevada capilaridade e alto estoque de triglicerdeos.

De modo oposto, aS fi1::).ras do tipo IIE, que possuem uma alta

capacidade glicoltica e tambm alta velocidade de

contrao, PBt~n envnlvir1Rfl pm FI i". i v 1dw)eA de fllt.fI

intensidade e curta durao. A gliclise favorecida pela

alta capacidade glico11tica e alto estoque de glicognio. J

as fibras do tipo lIA possuem alta resposta adaptativa ao

esforo ou seja podem responder, quando solicitadas, de

modo semelhante s fibras do tipoI ou tipoIIB.

TABELA 1 -CARACTERISTICAS DAS FIBRAS MUSCULARES HUMANAS

7

Propriedade Tipo I TipoIIA TipoIIB

Velocidade de Lenta Rpida RpidaContrao

Capacidade Baixa tvloderacla AltaGlicolitica

Capacidade Alta Moderada BaixaOxidativa

Estoque de Moderado Moderado ModeradoGlicognio Alto Alto Alto

Estoque de Alto Moderado BaixoTriglicerideos

Capilaridade Boa Moderada Pobre

Modificado de Saltin et al(1977)

1.4-Fatores t1etabl iCQ.fLJlll.e-fte.S-ul..anL_AJ...adiBa-aQ

Exerccio Fisico '~""~. \

A fadiga ao exercicio pode ter sua ocorrncia em

vrios pontos do organismo. Segundo Edwards (1983), a fadiga

pode acontecer durante a atividade fsica a partir do

sistema nervoso central pela reduo da motivao e

consequente alterao no recrutamento das unidades motoras.

Na coluna espinhal pode ocorrer alterao da conduo dos

reflexos. J nas inervaes perifricas, a alterao na

conduo neuro-muscular provocaria no sarcolema modificao

do potencial de ao tendo como consequncia, desbalano de

NaT , KT e H20 no sistema tubular transverso. Ainda, a

alterao na excitao e a consequente modificao na

8

actina-miosina, nas pontes transversas e ne

ocorreriam -leses na

ativao e

implicados.

interao

no fornecimento de

Como resultado disto,

energia podem estar

sarc6meros, provocadas pelo calor, com consequente reduo

da fora. O efeito de todas estas alteraes levaria

instalao do estado de fadiga. - Desta forma, a fadiga pode

ocorrer como consequncia de eventos centrais e/ou

perifricos.

06 mecaniemOB perifricoB que levam fadiga foram

descritos por Sahlin (1986). Este autor descreve que a

reduo do pH intracelular causa reduo da glic6lise e

consequente diminuio da regenerao do ATP. Isto

provocaria aumento nas concentraes de ADP, reduo da

atividade da Na-K-ATPase, aumento da concentrao de KT

extracelular e finalmente fadiga muscular.

Percebe-se nitidamente' que o entendimento"'\dos

mecanismos causadores de fadiga bastante complexo. Estudos

de Bergstrom et aI (1967) e Hermansen et aI (1967)

demonstraram que possvel, atravs de manipulao

nutricional associada atividade fisica, aumentar a

quantidade de glicognio acumulada no msculo eBqueltico e

que este aumento causa elevao proporcional no tempo de

resistncia ao esforo. Esta manipulao nutricional

./

9

refere-se utilizao de dieta hiperproteica por periodo de

dois dias associada atividade fsica intensa e posterior

oferta de dieta rica em carboidratos por dois dias. O

intuito da primeira etapa, promover a reduo dos estoques

de glicognio muscular. Este fato, eleva a atividade da

enzima glicognio sintetase, que com a oferta aumentada de

glicose passa a sintetizar glicognio rapidamente. Isto

ocorre na segunda etapa quando os indivduos recebem a dieta

hiperglic1dica, com treinamento moderado. A resposta a esta

manobra nutricional e de atividade f1sica, a elevao dos

estoques de glicognio em aproximadamente 100%, com

proporcional elevao do tempo de resistncia ao esforo,

como j descrito anteriormente. Entretanto, os mecaniemoe

precisos que envolvem este efeito no foram esclarecidos.

Por exemplo, como o aumento do contedo de glicognio

muscular pode elevar a resistncia ao esforo se este no

a principal fonte energtica nas atividades fsicas de longa

durao? O contedo de glicognio muscular suficiente para

a manuteno de esforo moderado por aproximadamente 71

minutos (Newsholme & Leech 1988). Quais seriam, ento'\ os

mecanismos de utilizao do glicognio que garantiriam o

fornecimento energtico por longo perodo de atividade?

Como pode-se explicar os resultados obtidos por Lancha,

Bergstromproposta

Jr.et al(1986)

nutricional

que, utilizando

por

a mesma

et

manipulao

al(1967),

demonstraram que os teores de A.G.L. plasmticos esto

elevados aps dieta hiperglicdica, pr e ps-exerccio,

/

COlllPUl'itivi1111eIlLe iO(; va.1oreu du dieL hiperproteica? I:!: qUt~

10

isto ocorre Bem 8.1 terr.:iio da g.1 icemia (Simes et aI 1986)?

Se o aumento do glicognio muscular promove maior

resistncia ao esforo pela sua converso a acetil CoA,

porque ocorreria elevao dos nveis de A.G.L. quando da

dieta hiperglicidica?

1.5-AQQ.ectQs-Envolvidos na Euncionalidade do Ciclo

de_.Krebs no t1.llaQulo Egu.eltico ....

o glicognio degradado piruvato e este

posteriormente a acetil CoA. O acetil CoA condensa-se ao

oxaloacetato e forma citrato; reao catalisada pela citrato

sintase. O citrato, se no for metabolizado atravs do ciclo

de Krebs, inibe alostricamente a citrato sintase (Smith &

Williamson, 1971; Johnson & Hansford, 1975) e

fosfofrutoquinase (Underwood & Newsholme 1965; Dunaway &

Weber 1974; Tornheim & Lowenstein 1976; Newsholme et aI

1977; Uyeda 1979). Dessa forma, a gerao de citrato poderia

bloquear a utilizao de glicose e cidos graxos (Rennie &

Holloszy, 1977).\

O msculo esqueltico libera par a

corrente sangunea entre outras a glutamina que produzida

a partir de oxoglutarato (Newsholme & Leech 1988). Este fato

provoca o "escape" de metablitos do ciclo de Krebs e

aumenta o CCH1GUlllO dt~ citr'nl.o (vlt~ figur1-

12

A

importante no

cidos graxos

atividade da piruvato carboxilase no

msculo somente para a metabolizao dos

livres. J foi mencionado anteriormente que,

em vrios pontos do ciclo dos cidos tricarboxlicos, ocorre

escape" de seus produtos. Alm daqueles descritos outros

precisam ser mencionados. O citrato que pode permear a

membrana mitocondrial reagindo com a CoA e ATP no citossol;

catalisada pela citrato liase, formando acetil CoA. Este,

por sua vez, pode-se constituir em precursor da biossntese

de lpides. (ocorrncia pouco provvel durante o esforo).

Outro ponto de "escape" a converso de oxaloacetato

fosfoenolpiruvato (catalisada pela fosfoenolpiruvato

carboxiquinase) que, sob a ao da piruvato guinase, ser

convertido a piruvato (Curi 1988); e este alanina ou

lactato. Existe tambm o escape do ciclo de Krebs na

biossntese de glutamina conforme j mencionado. Esta

formada a partir do 2-oxoglutarato e da transaminao com

valina que forma o glutamato. Reagindo com a amonia, oriunda

da desaminao de leucina, o glutamato convertido

glutamina (Newsholme & Leech 1988). Este mecanismo atl'(ado

durante a atividade fsica de baixa intensidade e longa

durao (Rennie et aI 1981;Millward et aI 1982)

O sistema de lanadeira Aspartato/Malato

representa ponto de "escape" do ciclo de Krebs (vide figura-

2). Este mecanismo promove a remoo de aspartato e 2-

oxoglutarato do interior m\tocondrinl EHteH.

regio citoplasmtica, pela ao da

reagem, na

aspartato

aminotransferase dando origem ao oxaloacetato e glutamato. O

glutamato, por sua vez, permeia a membrana mitocondrial e

II

reage com o oxaloacetato,

aminotransferase, gerando

reiniciam o ciclo. O

novamente pela ao da aspartato

aspartato e 2-oxoglutarato que

oxaloacetato, formado na regio

citosslica, convertido a malato, pela ao da malato

deoidrogenase com consumo de NADH. O malato formado,

atravessa a membrana mitocondrial e novamente pela ao da

malato desidrogenase, convertido a oxaloacetato gerando

NADH. Este mecanismo considerado de extrema importncia

para a oxidao do NADH citoplasmtico(Crabtree & Newsholme

1972 Williamson et aI. 1973). Acreditamos,

particularmente, que este mecanismo deva ocorrer

principalmente durante o estado de recuperao da atividade

fsica. Entretanto, alguns autores sugerem sua ocorrncia

durante a atividade fsica de baixa intensidade (Wasserman

et aI 1986; Palma et aI 1989).

\\

Figura 2 - Lanadeira Aspartato - Malato

ndria

se

~rlalO

ato NAD~~

Ma/atoDesidrogenase

/ "aloacetato NADH~

,

Glutamato Glutamato

~ ~ar tato Aspart.'ansferase Amlnotran

" ~2-oxoglutarato 2-oxoglutarato

sma Mitoco

/Aspartato

Citopla

Am

NAD Malato

~Ms/ato

Desidro(/enase

/,NADH Oxaloacetat

~

,,/

;-,L::.,

tv1odificado de Newsholme and Leech 1988

Como consequncia dos escapes citados, a

atividade do ciclo de Krebs regulada pela quantidade de

seus prprios substratos. Assim, a partir do momento em que

ocorre reduo de seus substratos/produtos, sua velocidade

cai, diminuindo, com isto, o aporte energtico muscular de

origem oxidativa. Como consequncia, o mscu~ paSSB B

utilizar as fontes citoplasmticas para atender a demanda

energtica da atividade fisica., A produo de energia pelo

compartimento citoplasmtico basicamente representada pela

gliclise anaerbica gerando cido ltico. O cido ltico

formado dissocia-se em lactato e H+. O acmulo de H+ no

citoplasma celular e portanto a reduo do pH, inibe a

atividado da foafofrutoquinaae reduzindo a atividade da via

glico11tica. Este fato diminui o fornecimento energtico

celular provocando a interrupo da atividade fsica e

fadiga (Sahlin 1986). Para se opor a isto, seria necessria

a manuteno de grande quantidade de precursores metablicos

dos componentes do ciclo de Krebs. Como j mencionado

anteriormente, possvel que o glicognio alimente o

ciclo via converso de piruvato oxaloacetato. ~\\

2.HIPOTESE DO PRESENTE ESTUDO

15

de oxaloacetato (Newsholme

Os

precursores

aminocidos asparagina e aspartato so

e Leech 1988).

Possivelmerlte, o aumento no aporte desses aminocidos eleve

68 concentraes de oXBloBcetBto no interior da mitocondria.

Assim, haveria substrato suficiente para metabolizar o

grande volume de acetil CoA oriundo da oxidao dos A.G.L.

facilitada pela ao da carnitina. Reforando esta idia,

sabe-se que, os nveis de asparagina, aspartato e carnitina

circulantes so inferiores em ratos sedentrios quando

comparados com animais exercitados (Miller et aI 1987), o

que sugere estimulo da sntese destes no figado.Reforando

16

este raciocnio, temo-se (j'Lle os animais treinados e em

repouso possuem valores de asparagina, aspartato e carnitina

circulantes superiores aos seus pares treinados sacrificados

aps a atividade fsica (Miller et aI 1987).

A atividade da enzima aspartato aminotransferase,

que promove a sntese de oxaloacetato a partir de Bspartato,

estA aumentada no tecjdo muscular, quando fatores como

anmia e atividade fsica de longa durao esto presentes

(Ohira et aI 1987). Evidentemente, o aumento da atividade

das enzimas do sistema oxidatlvo, bem como da enzima

aspartato amiotransferase quando do estado anmico, difere

em muito da elevao provocada pela atividade fsica. Esta

caracteriza-se pela maior produo de ATP, via ciclo de

Krebs, 1Jara supr 11' a reduzida capac idade do si tema>, de\

transporte de eletrons, prejudicado a nvel de citocromo

pela ausncia de ferro (Johnson et aI, 1990). J durante a

atividade fisica, o aumento -das atividades das enzimas

oxidativas da-se pelo aumento da biogenese de mitocondrias

provocado pelos processos de esquemia e reperfuso

resu 1tanteR ciA (~ont rfl'o mURr" 1 'ir (Oh i rFl et, Fll

Johnson et aI 1990)

1:-:lR7 t~

~m vista das evidncias apresentadas, o

17

fornecimento suplementar de asparagina e aspartato deve

provocar aumento da quantidade de oxaloacetato no interior

mitocondrial, garantindo a alta atividade do ciclo de Krebs.

Por sua vez, o fornecimento adicional de carnitina

promoveria eleva~o no contedo intramitocondrial de acetil

CoA pelo aumento de transporte de A.G.L .. Assim, a

Bssocia~o destes fatores poderia contribuir para aumentar a

eficincia do sist.ema fornecedor de energia e

consequentemente da resistncia 60 esforo.

Para verificar se esta hiptese verdadeira, o

presente trabalho foi desenvolvido. o objetivo foi

determinar se a admini8tra~o cr6nica de uma solu~o

contendo carnitina, asparagina e aspartato promove maior

resistncia ao esforo de longa durao e baixa intensidade.

Os A.G.L. representam a mais importante fonte de energia no

exerccio de longa durao e baixa intensidade (Newsholme &

Start 1973). Entretanto, que fator'es limitariam a sua

nti lizao pe lo msculo, caufwncio exausto?

Alguns estudos realizados anteriormente tent~ram\

avaliar esta questo. Soop et aI (1988), trabalhando com

suplementao nutricional de carnitina (beta-hidroxy-gama-

trimetilaminobutirato), demonstraram que no ocorre melhoria

na performance nem alterao da fonte energtica utilizada

quando esta substncia administrada isoladamente. Da mesma

forma, Negro(1985) demonstrou n~o ocorrer aumento da

mobilizao de A.G.L. atravs da suplementao nutricional,

/

'lpp.rHlf:;. d(~ c,\t'nitin"I.l\nnim, , \ c; fi r n -i 1-, i n fi n i1 () f ()1'11 t-, (I r'

lR

limitante para a oxidao dos cidos graxos nessas

condies. Sahlin (1990) demonstrou que, em exerccios de

alta intensidade, o contedo muscular de acetilcarnitina

aumenta proporcionalmente com o aumento dos teores de

lactato e piruvato. Este fato sugere que a acetilcarnitina

desempenha o papel de "sequestrador" de acetil CoA (Harris

et aI 1987). Desta forma, a razo acetilcarnitina/carnitina

atuaria como reguladora das concentraes de acetilCoa/CoA

(Bieber 1988)

aumento no

. Pelos fatos apresentados, acredita-se que o

contedo de oxaloacetato no interior

mitocondrial, provocado pelo fornecimento suplementar de

seus precursores, promoveria elevao na atividade do ciclo

de Krebs. Esta aumentaria o consumo de acetil CoA. Assim o

fornecimento suplementar de carnitina com aspartato e

asparagina garantiria que o aporte de acetil CoA fosse

compatvel com a atividade elevada do ciclo de Krebs. Esta

a proposio dest;e estudo. As informaes bioqumicas

descritas esto apresentadas na figura 3.

GLICOONIO

BIOSSINTESE

DE LlPOEOS

I :>Vias citadas no texto

i

---~Vias da Proposico

CoTRATO c:=:::=;:>

OLUTAMINA

A.O.L.

CARNlffTINA

ASPARAGffNAASPARrATO

)

1 (P~~O~CETIL CoA

LACTATO~ ~ \ALANINA OXALOACETATO~

3-MATERIAL e METODOS

.3... 1 Animj s

Foram utilizados ratos machos albinos pesando 250g

20

provenientes do Instituto de Cincias Biomdicas - USP. Os

animais torlIl1 mantidos em grupos de cinco por gaiola (com

exceo dos animais da atividade espontnea) mantidos a

temperatura de 23C e pf~rlod(j c.l.aro/cucuro de l~Vl~horas. OB

animais foram alimentados com rao comercial (Nuvilab CR

I,Nuvital Nutrientes LTDA. Estrada da Ribeira 3001, Km 3,

Curitiba) de composio aproximda de 52% de carboidratos,

21% de proteinas e 4% de gorduras.

Os reagentes para a preparao dos tampes foram

obtidos da Reagen, So Paulo. Lactato Desidrogenase, NAD,

DTNB (5,5-Dithio-bis-2-nitrobenzoic acid), Triton X-I00,

Piruvato e Acetil CoA foram obtidos da Sigma Chemical, USA.

~ Suple~

experimentais: a) antes da natao para avaliar o efeito do

treinamento, b) aps uma hora de natao e c) no momento da

exausto.

~~A-H~tQ_~~dBnt~Q

Foram utilizados vinte animais, divid1dos em dois

grupos (C) e (S).Os dez animais de cada grupo foram

divididos em duas gaiolas. Cada gaiola(17cm de altura, 33cm

de largura e 44cm de comprimento) contendo cinco animais.

Estes animais foram mantidos nas condies experimentais

durante cinco semanas sem serem submetidos a treinamento,

apenas manuseados de modo semelhante aos animais treinados.

3.5 Atividade Espontnea

21

Os animais

gaiolas rotatrias

foram mantidos individualmente em

(Vieira et aI 1987) durante cinco

semanas. Esta condio permitiu ao animal desenvolver

atividade de baixa intensidade e durao prolongada.

;.LlLTrei~ll1.!.L~

Para adaptao ao meio liquido e ao sistema de

natao (Vieira et aI 1987), os animais foram exercitados

por cinco dias com sobrecargas crescentes at 5% do peso

corporal. Aps a primeira semana de adaptao, os animais

dos dois grupos(C e S) foram treinados por cinco semanas,

cinco dias por BAnlnno, dllrantA \1lnf\ h( )rA por c1la com a

sobrecarga de 5% do peso corporal. Os ratos treinados em

na taao fO!'lrnen1,ao l3lcr J f icac!os em repouso,

de nataQo e aps exausto. A natao foi

temperatura de 32C entre 11:00 e 13:00 horas.

22

aps uma hor.q

realizada na

;~ Determinaco do T~mpo de Ezausto

Foi considerado como exausto o animal que no

conseguia manter as narinas fora da gua. Neste momento, o

tempo de natao foi anotado e o animal sacrificado

imediatamente.

3...1LEr..Q.Q~l.i~t~.EZPJ~.r..1IDen.ta.l

Os animais foram sempre sacrificados entre 11:00 e

13:00 horaB (com exao dos animais do grupo exausto). O

sangue foi coletado para a determinao da glicose, cidos

graxos livres(A.G.L.) e lactato. O fgado, corao, e

msculos sleo e gastrocnmio(poro branca) foram removidos

para a determinao do glicognio e atividade mxima das

enzimas citrato sintase e piruvato carboxilase. Foi removido

o tecido adiposo epididimal para se estabelecer a relao da

massa adiposa com o peso corporal.

3.9 Tecido Adiposo Epididimal

O tecido adiposo" epididimal foi removido e

imediatamente pesado. Este tecido utilizado como indicador

do contedo total de lipides dos animais (Roclbell 1964). O

peso deste tecido foi dividido pelo peso corporal do animal,

obter o valor relativo em percentagem.

A glicose plasmtica foi determinada pelo mtodo

descrito por Dubowiski(1962), lactato pelo mtodo de Engle

e Jones(1978) e A.G.L. pelo mtodo de Falholt et .al(1973).

o glicognio muscular(sleo e gastrocnemio-poro

branca), heptico e cardaco foi extrado pela digesto dos

tecidos por 30 minutos em soluo de KOH 30% em banho

23

fervente. A extrao final foi obtida atravs da

precipitaQo com etano1 70% Am duas etapas. O glicognio foi

ento determinado com a mistura antrona e cido sulfrico

pelo mtodo descrito por Hassid e Abrahams(1957).

J.12 Atividades Mximas da Citrato Sntase e

Os tecidos (sleo, gastrocnemio, cardaco e

heptico) foram dissecados e congelados. Estes f~ram\

estocados em nitrognio lquido at as determinaes

enzimticas serem processadas. Os tecidos

foram entao homogeneizados utilizando equipamento

24

desenvolvido por Vieira et aI (1989). O meio de extrao

para a enzima citrato sintase(EC.4.1.3.7) consistiu de 50mM

de Tris-HCl e lmM de EDTA com pH final de 7.4. Para a enzima

piruvato carboxilase(E.C.6.4.1.1) o meio de extrao

consistiu de 50mM de Tris-HCl, 300mM de Sacarose e lmM de

EDTA com pH final de 7.4.

A mistura de ensaio para a citrato sintase

consistiu de: lOOmM de Tris-HCl, O,4mM de DTNB, Triton X-10a

1% e 15mM acetil CoA . A mistura de ensaio da piruvato

carboxilase consistia de: 400mM de Tris-HCl, lOOmM de

MgCI2, 4mM de DTNB, 50mM de ATP, 15mM de acetil CoA,200mM de

NaHC03, lOOmM de Creatino. fosfnLo e Triton X-100 1%.

A atividade mxima da citrato sintase foi

determinada baseada no fato de que a reao do acetil CoA

com o oxaloacetato forma citrato e CoA. O DTNB reage com a

CoA produzindo cor amarelada. A piruvato carboxilase foi

medida da seguinte maneira. A carboxilao do piruvato forma

oxaloacetato e este reage com acetil CoA, sob ao de

(~XCeABO de clLralo Binta8(~, tor'InB.ndo citrato e CoA. O~'l'NB

reage com a CoA dando cor amarelada. O complexo amarelo

formado pela reao do DTNB com a CoA absorvido em 412nm.

3.13 Anlise Estatstca

As diferenas estatsticas entre os grupos (C) e

(S) foram ca 1CII1 f:\OflA ut. i 1 i 7.l1nrln () 1,'1nt t rio St.lIdflnt p/H'H

p

4. Resultados

OB resultadoB que sero apresentados, esto ao

final deste captulo expressos sob a forma de grficos com

as mdias e devidas significncias o "Apndice" apresenta

os resultados em tabelas com as mdias, desvios padres e

significncias.

Os resultados

O"

4.1 Plasmticos

encontrados demonstram que a

glicemia dos animais submetidos as condies de: atividade

espontnea, treinados, natao~or uma hora e exausto, no

apresentaram diferenas significativas entre os grupos (C) e

(5). J os animais sedentrios do grupo (C) apresentaram

concentraes de glicose plasmticas maiores que o grupo

( 5) ( p

4.-. 2 GI i c

(p

28

treinauos, o gt'Upo (C) apresentou maior atividade desta

enzima em comparao ao c5) (p

aps natoo por umo hora e exaustos. J os animais

submetidos condio sedentria, o grupo (5) apresentou

L~9

maior peso relativo deste tecido

(p

Grfico 1 - Glicemia30

mo/lOOral180

100

140

120

100

80

00

40

20o

.........1. Allv.E ..-I_. Tlna"". " ...... 1 Ho.. E......_

'- - Control. ~ eupl....nt.o.o I

Grfico 2 - A.G.L...Eq/I

0.8

0.8

0.4

0.1

o ......... AUv .EopoIlta... Trw....... N.... 1H... 1__l-con11O.. !.\\\\l 8ujWmenme.o I

p

/

Grfico 4 - Glicognio Muscular.,..1IIDI~1OOm_..::.1I --,1.a

1.eUf.1

f

0..o.e0.40.1

o..... 1H...

I

1_ c-... L\\\1 -...... IrzJ c........ 111 .'-o _

."

31

........ ,.0.0.

Grfico 5 - GlicognioHeptico e Cardaco

1.:._=.=-....._:.:...... =_.:--"".--.:.:_:.....- ....1........ ,.0.0,

Grfico 6 - Citrato SintaseMuscular

ul1lOl/gl..ln.12-,----------------------,

10

8

8

..2

o........10 Allv.E......'-. T......... N...... 1 Ho.. E_1ao

32

_ Co.tr .

IE3 Co."''' &ui ...f'.\\'IJ 1.80..0lZ!lI 1........ I

Grfico 7 - atrato SintaseFgado e Corao

ul'IOI/gI..ln.80-,--=---=------------------,,--,

80

20

10

o

,_ Co Plgado

c:J Co Co_

p

Grfico 8 - Piruvato CarboxilaseMuscular

umollll/mkl.0.15 .....---==--------------------,

33

0..

0.3

0.2

0.1

o......... Alh.E.po....... r.......... N....... 1 Hor. E_tao

1

_ C_trola a..oO C_I..... eM"".

"'0.0-" ...0.01

lI\\\'l "Fila _.L _.

Grfico 9 - Piruvato CarboxilaseFgado e Corao

1-iU

.;.:mo:..:...II:...:":..-II_kl_,----------------,

o.a

o.e

0.4

0.2

o

1I\\\'l ..... LCor ...

-"'\

p

Grfico 10- Tecido AdiposoEpididimal

"1.6.----;=:=:::;;----------------~1.4

1.2

1

0.8

0.6

0.4

0.2

o

34

SedentrIo TreInados Natao 1 Hora Exausto

p

35

.Q.--LJ:J.I:llQ.Q._...h.S-eden t r i o

5 ..l.l Detel'JJJina{')es Plasmticas

Como observado no captulo anterior, o grupo (5)

apresentou maior concentrao plasmtica de A.G.L. e lactato

e menor de glicose que o grupo CC). Este fato sugere

aumento da utiliza~o dos A.G.L. pelos animais que .receberam

a suplementao. E sabido, que B glicose circulante

aumentada, reduz a utilizao dos A.G.L.(Bagby et aI. 1978).

Este fato demonstra que os animais que receberam aspartato,

asparagina e carnitina apresentaram maior consumo de A.G.L.

que o grupo (C). A utilizao de piruvato pela via oxidativa

regulada pelo contedo de acetil CoA celular, pois este

inibe a enzima piruvato desidrogenase (Newsholme & Leech

1988). A elevao plasmtica dos A.G.L. indica grande

utilizao deste no fornecimento energtico. Estes

resultados sugerem que, devido ao grande aporte de acetil

CoA 01' lunda dOf:l A. G. L. nOtl anJnw.lf:l do grupo (S), a piruvato

desidrogenase foi inibida, favorecendo a formao de lactato

que se apresentou em concentraes elevadas no plasm~ do

grupo (5) (vide tabela 2).

5.1.2 Glicognio

5.1.2.1 Muscular Esqueltico

OR remI1tados fmcontrad0s de glicognio muscular

demonstram que os animais do grupo (S) apresentaram maior

tecidos (gastrocnmio e s61eo). A diferen~a em favor do

grupo (5) tu L da ordem de 160% para () msculo sleo e de 20A~

36

para o gastrocnmio. Esta diferena observada entre os

tecidos nos animais do grupo (5) e justifica-se por ser o

sleo composto de fibras do tipo revide tabela 1) e

consequentemente alvo mais efetivo para a ao dos

aminocidos e carnitina suplementados. Este -aumento no

contedo de gJicognio refora a hiptese levantada no item

anterior de maior consumo de A.G.L e reduo da gliclise.

Na condio sedentria, sabe-se que a principal via

energtica utilizada a oxidativa (Passmore & Eastwood

1986). Isto favorece a utilizao dos A.G.L. nesta condio.

o aumento no contedo de acetil CoA reduz a quebra de

glicognio. Este fato foi demonstrado por Stanko et aI

(1990) que suplementaram a alimentao de atletas com

precursores de acetil CoA e verificaram aumento do contedo

de glicognio muscular. Assim, acredita-se que o aumento na

utilizao de A.G.L tenha, nos animais do grupo (S), elevado

o contedo de acetil CoA inibindo a degradao do glicognio

muscular para este fim. (vide tabela 3).

5.1.2.2 Cardaco e Heptico \\

Nos tecidos cardiaco e heptico no foi observada

diferena no contedo de glicognio entre os grupos. O

tecido cardiaco utiliza predominantemente os A.G.L. para o

fornecimento enrgtico. Nos animais suplementados a

utilizao dos A.G.L. pelo corao foi provavelmente

elevada, reduzindo o consumo de lactato por esse tecido

causando tambm aumento na concentrao de lactato

37

plamnfttlco nf':U Lf:~ grupo. E sabido que o corao constitui um

dos principais orgos que utilizam lactato circulante para o

fornecimento de energia. Este orgo possui a enzima lactato

desidrogenase sob a forma de sua isoenzima H, que converte o

lactato piruvato para posterior oxidao (Kaplan & Everse

1972). Com o aumento da utilizao dos A.G.L. nas clulas

cardiacas nos animais do grupo (5), o consumo de lactato

como fonte de acetil CoA ficaria inibido. Dest~ forma, o

lactato circulante estaria ainda mais elevado e, no interior

oxaloacetato, pela

celular, restaria

fornecimento de

a sua possivel utilizao

ao da

para o

piruvato

carboxilase nos tecidos oxidativos.

5.1.3 Atividade Enzimtica

5.1.3.1 Muscular Esqueltico

No foi observada diferena significativa entre os

grupos na atividade mxima da citrato sintase nos tecidos

musculares dos animais sedentrios(vide tabela 5) .

Provavelmente, o estado sedentrio no tenha induzido

alteraes quantitativas do sistema oxidativo nas cl~las

musculares. Entretanto, a atividade da enzima piruvato

carboxilase apresentou-se elevada em 80% no msculo sleo

dos animais do grupo (5) em ~omparao ao grupo (C)(Tabela

7). Este fato refora a hiptese levantada no item 5.1.2.2

onde pressupe-se gue o lactato formado no interior das

clulas de capacidade oxidativa elevada, foi possivelmente

./

utlizado para a sintese de oxaloacetato, pois o fornecimento

de acetilCoA deve ter sido suprido pelo aporte de A.G.L ..

38

5.1.3.2 Heptico e Cardiaco A atividade da

enzima citrato sintase apresentou-se reduzida no tecido

heptico dos animais do grupo (6). Acredita-se que isto

ocorreu pela reduo, observada, da piruvato carboxilase

para o mesmo tecido destes animaiA(tabelas 6 e 8). Os

resultados das atividades enzimticas para o tecido cardiaco

confirmam a hiptese levantada nos itens anteriores. A

enzima citrato sintase ap-r-esentou-se elevada, em

aproximadamente 60% no corao dos animais do grupo (6), em

comparao com o grupo (C)(Tabela 6). Este fato, juntamente

com a atividade aumentada da piruvato carboxilaee em

52%(Tabela 8), tambm no grupo(S), sugerem que os animais

deste grupo passaram a metabolizar acentuadamente os A.G.L.

como fonte de acetil CoA, deslocando assim o piruvato para a

sintese de oxaloacetato. A enzima piruvato carboxilase

estimulada pelo aumento de piruvato e de acetil CoA

(Newsholme & Start 1976). Desta forma, pode-se acreditar que

o fornecimento suplementar de asparagina, asparta'tp e\

carnitina tenha sido eficiente no fornecimento de

oxaloacetato garantindo o aumento da atividade da citrato

sintase nestes animais. Por sua vez, o maior aporte de

acetil CoA, favorecido pelo consumo de A.G.L., bem como a

disponibilidade de piruvato celula cardiaca, favoreceriam

o aumento da atividade da enzima piruvato carboxilase

encontrada neste tecido. Estes fatos conflitam-se com os

39

relatos de Randle et aI (1963) e Randle (1981).Estes autores

sugeriram que, com o aumento do consumo de A.G.L., ocorre

reduo da utilizao dos carboidratos(glicose e glicognio)

pela clula cardaca. Se neste caso isto ocorresse, seria de

se esperar que o contedo de glicognio estivesse mais

elevado no corao dos animais do grupo (S), o~ue no foi

observado em nossos resultados(Tabela 4). Acredita-se que o

aumento no consumo de A.G.L. pela clula cardaca, faz com

que ocorra elevao no contedo de acetil CoA, provocando

inibio da atividade da enzma piruvato desidrogenase

(Newsholme & Leach 1988), causando acmulo de piruvato.

Estes dois fatores, como j mencionado, promovem o estmulo

da enzima piruvato carboxilase, garantindo a elevao da

atividade da citrato sintase pela formao de oxaloacetato.

Desta maneira, o ciclo glicose-cidos graxos teria a sua

funcionalidade alterada quando o suprimento de oxaloacetato

para a clula estivesse elevado como no grupo (S). O maior

aporte de oxaloacetato remove acetil CoA com mais eficincia

e reduz o efeito inibitrio sobre a piruvato desidrogenase

Assim, como conseqncia, ocorre degradao de A)O.L.\

juntamente com a glicidica, provocando fornecimento

suplementar de energia pelo ciclo dos cidos

tricarboxilicos. Isto faz com que aumente as concentraes

de precursores para os "escapes" deste ciclo. Na condio

sedentria isto poderia ocorrer, por exemplo, no sentido da

biossintesB de lipides.

/'

:5.1.4 Tecido Adiposo '/!'pididilllal

40

o peso relativo do tecido adiposo

epididimal(Tabela-9) encontrados nos animais sedentrios,

apresentou-se 20% superior nos animais do grupo (S) em

comparao com (C). Este fato refora a idia levantada no

item anterior de que, pelo aumento das atividadeSo/da citrato

sintase(Tabela 6) e piruvato carboxilase(Tabela 8) no

corao dos animais do grupo (S), estes animais estariam

metabolizando conjuntamente A.G.L. (elevado no plasma dos

animais dOI grupo (S e glicognio, gerando maior produo

energtica e de precursores para sntese de outros

metablitos como os triglicerdeos do tecido adiposo.

~~tiyidddU-EBpQntnea

5.2.1 Dete!~inaes Plasmticas

Os resultados obtidos das dosagens de lactato,

A.G.L. e glicose mostraram-se semelhantes nos grupos (C) e

(S)(Tabela 2). A atividade fsica de intensidade moderada a

elevada (50 a 70% V02max.)promove euglicemia, no ocorrendo

o mesmo com os A. G. L. (Weber e't al 1990) . Desta f'x;-ma,\

quando os animais foram submetidos a atividade fsica, a

glicemia alterada do estado sedentrio tornou-se semelhante

entre os grupos (C) e (S). Este fato deve ter contribuido

para os resultados de lactato e A.G.L. encontrados.

5.2.2 Gllcognio

5.2.2.1 Muscular O contedo de glicognio

muscular no apresentou diferena significativa entre os

animais dos grupo (C) e (S) no msculo sleo(Tabela 3). No

msculo gastrocnemio, entretanto, o glicognio apresentou-se

elevado em 170% aproximadamente nos animais do grupo (S), em

comparao aos do grupo (C)(Tabela 3). Esta elevao pode

ser entendida por ser a atividade espontnea mobilizadora

das vias oxidativas. Isto promoveria maior atividade do

ciclo de Krebs e conseguentemente maior produo d~ citrato

41

e ATP pelas clulas musculares. Como j discutido

anteriormente, o aumento de citrato e ATP, promoveria

inibio da enzima chave da glrclise; EEK. Esta inibio

provocaria diminuio da degradao glicdica e,

consequentemente, aumento dos estoques de glicognio.

Segundo Saltin (1977) os msculos compostos de fibras do

tipo IIE (como o gastrocnmio poro branca) possuem maior

capacidade para a sntese de glicognio e seriam menos

exigidos nesse tipo de esforo fsico. Assim, seria de se

esperar que neste tecido, o aumento da atividade oxidativa

produtora de citrato, causasse a resposta inibitria da

degradao glicdica. Esta proposio foi comprovada pelos

resu 1 tados encontrados ('l'abe lH ~3). '\

5.2.2.2 - Heptico e Cardaco - O contedo de

glicognio heptico foi semelhante nos dois grupos(Tabela

4). J, no msculo cardiaco, os animais do grupo (C)

tiveram o contedo de glicognio elevado em 116% comparado

ao grupo (S)(Tabe1a 4). Pode-se analiBr estes resultados da

seguinte maneira. Os animais do grupo (S) possuam maior

/'

42

fornecimentu de Rubstratos para a slnteee de oxaloacetftto.

Com o conte0do de oxaloacetato elevado, o ciclo de Krebs

garantida pelo aumento

mitocondrial, devido ao

possui condies

atividade(Rowan &

das concentraes

favorveis para

Newsholme 1979),

de acetil CoA

o aumento de sua

efeito da carnitina, que favoreceria a beta-oxidao dos

cidos graxos. O aumento do contedo de acetil CoA passaria

a atuar como ativador da via de sntese de oxaloacetato pela

enzima piruvato carboxilase(Newsholme & Leech 1988). Pode-se

ento concluir que a reduo dos estoques de glicognio no

msculo cardaco deve-se possivelmente ao intenso "escape"

de piruvato para formar oxaloacetato, exigido pelo tecido,

na manuteno de alta atividade do ciclo de Krebs. Este fato

confirma a hiptese levantada no tem 5.1.3.2 onde se

discute a operacionalidade do modelo proposto por Randle et

aI (1963) e Randle (1981) para o ciclo glicose-cidos

graxos, que causaria inibio da degradao de glicognio

quando o COnfH.lmO de cidos graxos estivesse elevado.

5.2 . .) Atividade Enzm":it;ictl

5.2.3.1 Muscular - A atividade da enzima citrato

sintase apresentou-se 36% superior nos animais do grupo (5)

em comparao com os animais do grupo (C) no msculu

sleo(Tabela 5). No msculo gastrocnmjo, este aumento foi

da ordem de 24% em favor dos animais do grupo (5)(Tabela 5).

Os dados demonstram estar correta a hiptese levantada no

tem 5.1.3.1 onde se afirma que a semelhana na atividade

./

43

enzimtica entre os grupos deve-se pela no existncia de

estimulos externos(atividade fsica) suficientes para

aumentar a atividade oxidativa. Nos animais da atividade

espontnea, o aumento verificado demonstra que, quando a

atividade motora torna-se efetiva, ocorre a mobilizao dos

aminocidos para a ativao do c1(:10 de KrebB~'A atividade

fsica de baixa intensidade e longa durao promove aumento

da atividade das enzimas oxidativas bem como da enzima

aspartato aminotransferase responsvel pela sntese de

oxaloacetato a partir de aspartato (Cadefau et aI 1990). No

msculo gastrocnmio, o aumento da atividade da citrato

sintase nos animais do grupo (S)(Tabela 5) confirma a

hiptese de que a produo de citrato e inibio da via

glicolitica, justificaria a elevao do glicognio neste

tecidos.

J a enzima piruvato carboxilase apresentou-se

semelhante em ambos os grupos(Tabela 6). Provavelmente, o

aporte energtico exigido, pela atividade imposta, no

exigiu, destes tecidos, maior quantidade de oxaloacetto

oriundo de gJicose.

5.2.3.2 Cardaco e Heptico - No tecido heptico,

a atividade da enzima piruvatb carboxilase foi semelhante em

ambos os grupos(Tabela 8). Provavelmente pelo fato de que a

atividade fisica imposta no foi. suficiente para estimular a

formao de oxaloacetato a parti 1:' eis pi ruvat,o neste tec ido.

Nos animais do grupo (S), provavelmente ocorreu elevao no

contedo de oxaloacetato, pela converso a partir de

44

piruvato alm da produo deste pela desaminao da

asparagina e aspartato suplementado. Assim, o contedo

aumentado deste intermedirio do ciclo de Krebs estimularia

a atividade oxidativa.

No msculo cardaco, a atividade da enzima

piruvato carboxilase apresentou-se reduzida em 560% nos

animais do grupo (C) em relao ao grupo (S)(Tabela 8). Este

fato refora a hiptese levantada anteriormente de que, o

fornecimento adicional de precu~sores de oxaloacetato iriam

estimular a degradao das fontes energticas(A.G.L. e

Glicognio), confirmada pela reduo do glicognio cardiaco

(Tabela 4), aumentando assim o contedo de acetil CoA

disponvel na mitocondria. O aumento da acetil CoA eleva a

relao acetil CoA/CoA que por sua vez inibiria a atividade

da piruvato desidrogenase (Newsholme e Leech 1988). O

aumento de acetil CoA, bem como a disponibilidade de

piruvato, estimulariam a atividade da piruvato

carboxilase(Tabela 8), que, reciprocamente, estimulariam a

reao catalisada pela citrato sintase que apresent'lt-se\

elevada em 34% no fgado e 63% no corao dos animais do

grupo (S), em comparao ao (C)(Tabela 6).

5.3 Treinados

Este grupo difere dos demais exercitados(atividade

espontnea, natao por uma hora e exausto) por ter sido

sacrificado durante o periodo de recuperao, ou seja,

Iq.. r'ux\llll.ldillll l ;IlLtJ ~~U hUr'il~3

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8)

5. ,:J. 2 Glicognio

5.3.2.1 Muscular Esqueltico o contedo de

47

glicognio muscular no apresentou diferena entre (S) e (C)

em ambos os tecidos nos animais treinados(Tabela 3). O

estado de recuperao da atividade motora no causou a

mobilizao deste.

5.3.2.2 Cardiaco e Heptico o contedo deglicognio heptico no apresentou diferena entre os grupos

(5) e (C).(Tabela 4) Esta ocorrncia pode ser devida

atuao dos aminocidos suplementados no ciclo dos

nucleotldeos, tornando a disponibilidade destes, para o

sistema oxidativo, semelhante nos dois grupos. J o

glicognio cardiaco, apresentou-se reduzido em 142% nos

animais do grupo (5) em comparao ao grupo (C)(Tabela 4). E

sabido que, o tecido muscular cardiaco possui alta atividade

oxidativa. Desta forma pode-se acreditar que a ocorrncia do

deslocamento dos aminocidos suplementados para o ciclo dos

nucleotideos ou sistema de lanadeira aspartato/malato

provocaria, drstica reduo do contedo de oxaloacetato

para o grupo (S). Este sistema, promoveria ainda, aumen,o de

NAD reduzido no interior mitocondrial(vide figura 2). A

converso de piruvato a acetil CoA dependente de NAD

oxidado(Garland & Randle 1964 e Tsai et al 1973) . Assim

pode-se entender que os animais (S) passaram a utilizar

efetivamente as fontes citoplasmticas para o fornecimento

de energia palo, 8. formaeo dA ncetLL CoA oriundo de gli.cOEH':l

estava reduzida pela maior concentrao de NADH no interior

mitocondrial. Este sistema atuaria reduzindo a concentrao

de oxaloacetatomitocondrial e consequentemente a capacidade

de consumo de acetil CoA oriundo de A.G.L. resultando em

intensa degradao do glicognio cardaco.

5.3.3 Atividade Ilnzil11tica

5.3.3.1 Muscular Esqueltica - A enzima citrato

sintase apresentou atividade semelhante em ambos os grupos

no msculo gastrocnmio(Tabela 5), isto pode ser devido ao

48

envolvimento dos aminocidos - suplementados, como j

comentado, no ciclo dos nucleotideos, mais evidente nas

fibras do tipo IIE. A diferena de 30% na atividade da

citrato sintese nos animais do grupo (C) em comparao ao

grupo (S), no msculo sleo, pode ter ocorrido pela

quantidade aumentada de citrato formado e consequente

inibio desta enzima por acmulo de produto da reao de

condensao(Rowan & Newsholme 1979) (vide tabela 5).

Outra hiptese o desvio ocorrido em ambos os

msculos do grupo (S) dos aminocidos suplementados para o

hipteee tem-se que o

aietema lanudeira aSpal'tHtO/lmdl.:l to. Reforando'",eta

aumento substancial da atividade da

enzima piruvato carboxilase no msculo sleo(242%) e no

gastrocnmio(260%) nos animais do grupo (S) (Tabela 7). Isto

sugere a necessidade do msculo em sintetizar oxaloacetato a

partir de piruvato, provavelmente para compensar a reduo

do contedo de aspartato B aspRrRginR diponjvel para este

fim.

"

5.3.3.2 Heptica e Cardiaca

49

A atividade da

enzima piruvato carboxilase no foi diferente entre os

grupos no tecido heptico(Tabela 8). J no tecido cardaco,

esta enzima apresentou sua atividade reduzida em 43% no

grupo (S), em compara~o ao grupo (C)(Tabela 8). Este fato,

juntamente com a atividade reduzida da citrato sintase neste

grupo, ft'.lvurec(~u a pu::wibi J idade dE~ que o msculo cardiaco

mobilizaria o glicognio como fonte energtica no estado de

repouso.

.5 .4 ..N.at~o._IJmf.LH.o.r..a

5.4.1 Medidas Plasmticas

Os animais treinados submetidos a natao por uma

hora e sacrificados aps o esforo tiveram os resultados de

A.G.L., glicose e lactato, semelhantes, no apresentando

diferenas significativas entre os grupos (5) e (C)(Tabela

2) . Nota-se com estes resultados que -os animais que

receberam a suplementao tiveram a concentrao de lactato

circulante semelhante ao dos animais do grupo controle~ No\

item 5.3.1 foi discutido o contedo de lactato elevado nos

animais treinados do grupo (S) comparado ao grupo (C)(Tabela

2) . A concentrao elevada tJe lactato no grupo (C), nos

animais treinados em repouso, desapareceu quando estes foram

submetidos natao por uma hora(Tabela 2). Por sua vez,

no ocorreu alterao da concentrao plasmtica de lactato

nos animais do grupo (S), do estado de repouso para o

5.4.3 Atividade l!.!lzi111tica

5.4.3.1 Muscular - A atividade da enzima citrato

sintase apresentou-se similar, para o msculo gastrocnmio,

51

em ambos os grupos de animais treinados e, sacrificados aps

uma hora de atividade tisica(Tabela 5). O mesmo fal

verificado para a atividade da piruvato carboxilase no

msculo sJeo onde, nao foi encontrada diferew;a

significativa para os dois grupos (S) e (C)(Tabela 7). J no

msculo gastrocnmio, a enzima piruvato carboxilase

apresentou'atividade 56% superiDr nos animais do grupo (S)

em comparao ao (C)(Tabela 7). Apesar dos valores

encontrados nos animais suplementados serem superiores,

nota-se elevao de 220% na atividade desta enzima no (C),

quando comparados aos animais treinados do mesmo grupo,

contra a elevao de apenas 38% para os animais (S),

comparados a seus pares treinados (Tabela 7). Este fate

demonstra que o tecido em questo, nos animais do grupo (S),

metabolizou acenduadamente os aminocidos suplementados para

a sintese de oxaloacetato, limitando a sua sintese a partir

de glicose e atravs da piruvato carboxilase. J a\

atividade da enzima citrato sntase no msculo sleo

apresentou-se 35% superior nos animais do grupo (C) em

comparao ao grupo (S)(Tabela 5). Este fato mantm a

diferena observada no msculo sleo para a citrato sintase

nos animais treinados, Como demonstrado na tabela 7, os

anima1E] do grupo (C), APf~ urnA hOT'F1 dA nAr,fH;o, I1UlTlP,ntArFtrIl

em 214% a atividade da enzima piruvato carboxilase. Este

fato no ocorreu nos animais do grupo (S) que apresentaram a

52

mesma atividade em ambos os casos(Tabela 7). Desta maneira,

acredita-se que a natao por uma hora no tenha solicitado,

do msculo sleo, aumento da atividade oxidativa em ambos os

grupos, quando comparados com os animais treinados.

Entretanto, nota-se, um aumento da atividade >da piruvato

carboxilas8, guarida compara-se os animais aps uma hora de

nata~o com seus pares treinados do grupo (C)(Tabela 7).

Isto nos leva a crer que os animais deste grupo recorreram

em maior iproporo a via de sintese de oxaloacetato oriunda

de g11cideos, fato no observado nos animais do grupo

(S)(T&bela 7) que, provavelmente, utilizaram a via de

slntese a partir dos aminocidos suplementados.

5.4.3.2 Cardlaco e Heptico - O msculo cardiaco

no apresentou diferena significativa na atividade das

enzimas citrato sintase e piruvato carboxilase entre os

grupos (C) e (S)(Tabela 6 e 8). Este fato pode ser devido a

no alterao da atividade oxidativa deste tecido, como

consequncia da atividade imposta(natao por uma hora). No

tecido heptico, a enzima piruvato carboxilase', no\

apresentou diferen~a entre os grupos(Tabela 8). No entanto,

nota-se uma elevao da atividade da enzima citrato sintase

no figado dos animais do grupo (6) em torno de 30%(Tabela

6). Para explicar este resultado, olltros estudos precisam

ser desenvolvidos.

.5.......Q Exausto

5.5 ..Z Detel'JJJina6es plasmticas

Os animais submetidos a exausto apresentaram

valores gl icmlcos e de lactato lemelhantes entre os grupos

(C) e (S)(Tabela 2). Por outro lado, os valores encontrados

53

parA os A.G.L. plAflmflt.irofl dos nn"imnifl do gruJlo un est.

5.5.2.2 Cardlaco e Heptico o contedo de

54

glicognio cardiaco no apresentou diferena entre os grupos

(C) e (S)(Tabela 4). Esta ocorrncia deu-se, provavelmente,

por ser o estado exausto semelhante nos dois grupos,

diferindo apenas pelo mecanismo de instalao e,

consequentemente, o tempo de resistncia a eete esforo

(Edwards 1983). J no tecido heptico, os animais/do grupo

(S) apresentaram o contedo de, glicognio, ao final_ da

exausto, elevado em aproximadamente 60 % comparado ao dos

animais do/grupo (C)(Tabel 4), demonstrando maior capacidade

de manuteno do Slicognio heptico nessa condio.

5.5.3 Atividade EnziJlJdtica

5.5.3.1 Muscular Esqueltico Os animais

submetidos a exausto no apresentaram diferenas

significativas na atividade das enzimas citrato sintase e

piruvato carboxilase no msculo gastrocnmio(Tabelas 5 e 7).

No msculo s61eo, no ocorreu diferena significativa na

atividade da enzima citrato sintase entre os grupos (C) e

(S)( Tabela 5) . Jli a atividade da enzima piruyato\

carboxilase, apresentou-se 76% superior nos animais do grupo

(S).(Tabela 7). Este fato, refora a hiptese levantada no

item 5.5.2.1 de que a redua do contedo de glicognio, no

msculo sleo(Tabela 3), dos animais do grupo (S) comparados

ao grupo (C) e que esta devida a maior utilizao dos

glicideos musculares para a sntese de oxaloacetato. Este

fato seria favorecido pelo aumento da atividade da piruvato

jJ r' () V ii V e I Im~ Il Le , o aumellto na atividade da

5f:i

piruvato carboxilas8 permitiu, aos animais do grupo (S),a

manuteno da capacidade oxidativa por maior tempo o que

possibilitaria ao grupo suplementado suportar, por tempo

prolongado, a atividade fsica.

5.5.3.2 Cardaca e Heptica A enzima piruvato

ctlrboxi lHfw Ilo apresentou diferena significativa nos

tecidos cardiBco e heptico entre amhos os grupos(Tabela ).

No figado, no foi observada diferena significativa na

atividade da enzima citrato sintase entre os animais do

grupo(C) e (S)(Tabela 6). J no corao, a atividade desta

enzima apresentou-se elevada em 38% no grupo (S)(Tabela 6).

Este fato demonstra que os animais (S) tiveram maior

capacidade de ativao da citrato sintase no processo de

exausto, provavelmente, pelo maior aporte de oxaloacetato

favorecido

precursores.

pelo fornecimento suplementar de seus

6 - Discusso Geral dos Resultados

6.1 Determinaces plasmticas

Como demonstrado

\

na Tabela 1, os animais do gr~po

(8) apresentaram aumento do lactato e dos A.G.L. plasmticos

e reduo da glicemia comparado com o (C) na condio

sedentria. Esta diferena foi abolida nos ratos em

atividade espontnea, treinadofl e n,"ltaf.io por Um1.:l hora.

Entretanto, durante a exausto, os niveis de A.G.L. no

plasma voltam a ser superiores no grupo (S).

/'

A capta~o dos A.G.L. pelos msculos e pelo figado

depende da sua concentra~o plasmtica (Newsholme & Start

1976). Desta forma, nossos resultados sugerem que a

suplementao favoreceu a utilizao de A.G.L ..

Na condio sedentria, o aumento no fornecimento

de acetil CoA, posAivelmente, inibiu a atividade ~a piruvato

desidrogenase, aumentando a converso de piruvato lactato.

Como consequncia houve reduo da glicose sangunea e

aumento do lactato. Com a imposio da atividade fsica,

entretanto,; a capacidade do msculo em utilizar acetil CoA

foi aumentada, como demonstrado pelo aumento da atividade da

citrato sintase,que converte acetil CoA + oxaloacetato

citrato, e a diferena observada desapareceu. Os animais do

grupo (S), entretanto, aumentaram o tempo de resistncia ao

56

esforo, atravs da maior mobilizao de A.G.L .. A

importncia deste fato na manuteno da atividade fsica por

perodos mais prolongados precisa ser investigada.

fi.....2-.Cillc..QRfuQ

A suplementao de asparagina, aspartato\ e

carnitina marcadamente aumentara o contedo de glicognio

muscular na condio sedentria. A atividade espontnea

anulou o efeito da dieta no msculo sleo, reduziu no

corao e manteve no gastrocnmio. O contedo de glicognio

muscular no apresentou diferena entre os grupos nos

animais treinados, aps natac;:fio por urna hora e exausto.

Desta forma, apesar da suplementao aumentar o contedo de

./

gl icogim\ (J TlUU IllScuJO:"1, h d(~gr"idal~o deste durante o

exerciclo foi semeHwntE: emtre (C) e (S). No corao, o

glicognio no apresentou diferena entre os grupos nas

condies de sedentarismo e de exausto. Durante a atividade

espontnea e nos animais treinados, o glicognio cardaco

esteve elevado para o grupo (C). Estes dados 'permite-nos

acredi tal' que a suplement;ac,.:o alimentar provavelmente tenha

alterado o compo~tamento do ciclo glicose-A.G.L descrito por

Randle et aI (1963). Os dados sugerem que o fornecimento

57

extra de oxaloacetato ao -tecido cardiaco mobilize

acentuadamente o glicognio nos animais da atividade

espontnea e treinados. Quando estes animais foram

submetidos a esforo mais intenso (natao uma hora), a

resposta do glicognio cardaco foi alterada, passando este

a ser armazenado no miocrdio e desta forma voltando a

responder de acordo com o modelo proposto por Randle (1963).

Esta hiptese requer um estudo mais detalhado e suas estapas

esclarecidas. J o contedo de glicognio no fgado

apresentou-se de maneira semelhante em todas as condies

para ambos os grupos. "''', \\

o aumento do glicognio no msculo esqueltico do

grupo (8) na condio sedentaria deve ter ocorrido devido ao

ciclo glicose-A.G.L .. O aumento da utilizao dos A.G.L.

pelo msculo, provavelmente, elevou a produo de ATP e

citrato pelo ciclo de Krebs. Estes produtos da oxidao dos

cidos graxos livres podem ter inibido a atividade da PFK,

./

aumentando o disponibilidade de glicose-6 fosfato para a

sintese de glicognio.

6.3 Citrato Sintase

A atividade espontnea elevou a atividade da

enzima citrato sintase no msculo sleo dos animais do grupo

(S). Entretanto, nos animais treinados e aps uma hora de

natao, esta enzima teve sua atividade reduzida comparada

ao controle. A atividade mxima da citrato sintase no fgado

foi reduzida nos animais sedentrios e treinados e aumentada

nos animais mantidos na atividade espontnea e nos ratos da

natao por uma hora. Estes resultados da citrato sintase

atividade mxima no fgado no podem ser esclarecidos no

presente trabalho.

58

A suplementao de asparagina aspartato e

carnitina aumentou a capacidade de sntese de citrato no

msculo sleo sob condies aerbicas (atividade espontnea)

mas no foi efetiva em atividades mais intensas (natao com

5% do peso corporal de sobrecarga).

No corao a atividade da citrato sintase

apresentou-se mais elevada no grupo (5) nos r~tos,

sedentrios, em atividade espontnea e exausto. Estes dados

refletem a eficincia do aporte elevado dos precursores de

oxaloacetato para o miocrdio na ativao do sistema

oxidativo. Os animais em natao por uma hora no

apresentaram diferena na atividade mxima da citrato

sintas~ entre os grupos (5) e (C). J nos animais treinados

ocorreu reduo da atividade da citrato sintase no grupo

60

glicOliuc. 1\ t-tLivldude db piruvato carl:Joxilase foi maior no

cora~o do (5) para os animais sedentrios e atividade

espontnea. DestR forma, o fornecimento adicional de

precursores de oxaloacetato aumentou a capacidade do msculo

de produo de oxaloacetato como indicado pela atividade

da piruvato carboxilase. E possivel que a gera~o aumentada

de oxaloacetato estimule a atividade do ciclo de .krebs e a

produo de ATP; e isto, sabido, aumenta a atividade da

piruvato carboxilase (Rowan & Newsholme 1979). Estas

afirma~es requerem ainda mais investigaes para serem

comprovadas.

6.5 Tempo de Exausto

Os animais (5) nadaram por um periodo superior que

o grupo (C) at a exausto. Os valores obtidos em minutos

foram: 423.8 27.7 e 297.8 42.2 (mdia e erro padro)

para (5) e (C), respectivamente. Isto representou um aumento

de 42% em favor do grupo (5) com diferena significativa de

p

7. Concluses

A suplementao de asparagina, aspartato e

61

carnitina eleva a capacidade do msculo em utilizar os

A.G.L. e poupar o glicognio; como indicam os resultados de

glicemia, A.G.L., lactato e glicognio muscular. O contedo

de glicognio muscular apresenta-se estritamente relacionado

COIJI l. res lsLIlcia ao (~Sf(H'4'O de longl durao (Bergstrom et

aI 1967 e Hermansen et aI 1967). Assim, este resultado do

glicognio muscular, por si s demonstra que os animais (5)

possuem maior capacidade de - resistncia ao esforo

comparados ao controle.

A importncia do oxa~oacetato para os resultados

da exausto descritos, foi enfatizada pelo fato de, apesar

da suplementao de seus precursores(asparagina e

aspartato), ocorreu tambm aumento da atividade da enzima

produtora de oxaloactato a partir de piruvato; piruvato

carboxilase. Acredita-se que a resistncia ao esforo

aumentada pela elevao do glicognio muscular d-se pelo

maior fornecimento de oxaloacetato oriundo do glicognio

para a oxidao dos A.G.L .. Desta forma, a redu\ do\

glicognio torna o msculo inapto para metabolizar o

acetilCoA oriundo dos A.G.L. levando exausto.

Outros experimentos precisam ser realizados para

detalhar alguns pontos levantados neste ~studo. Certamente,

entretanto, os resultados aqui reportados contribuem para o

entendimento do controle do metabolismo perifrico para o

estabelecimento da exausto no exerccio fisico.

/'

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the glucoseexercising

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Tabe~as

"

68

APNDICE

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Tabela 2 - Determinaes plasmticas dos grupos controle(C)e Buplement{H.~fo (S) submetidos as seguintes condioes:sedentrio, atividade espontnea, treinados, natao 1 horae exausto. Os valores so apresentados por media desviopadro de 10 animais por grupo *(p

70

Tabela 3 - Contedo de glicognio muscular - gastrocnmio eeleo cio fI erllpOS controle (C) e suplementa(;:o (~;) Bubmetic!o('3as seguintes condies: sedentrio, atividade espontnea,treinados, natao 1 hora e exausto. Os valores soapresentados por media desvio padro de 10 animais porgrupo *(p

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Trd)cd.ll '1 CUlILedo de gU cugnio heptico e cnrdlaco dOBgrupos controle(C) e suplementao(S) submetidos asseguintes condies: sedentrio, atividade espontnea,treinados, natao 1 hora e exausto. Os valores soapresentados por media desvio padro de 10 animais porgrupo *(p

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Tabela 5 - Atividade mAxima da enzima citrato sintase notecido muscular gastrocnmio e sleo dos gruposcontro le (C) e suplemen tao (S) fiubmet.idos as seguinteE.\condies: sedentrio, atividade espontnea, treinados,natao 1 hora e exausto. Os valores so apresentados pormedia desvio padro de 10 animais por grupo *(p

'73

Tabela 6 - Atividade maXlma da enzima citrato sintase nostecidos heptico e cardiaco dos grupos controle(C) esuplementao(S) submetidos as seguintes condies:sedentrio, atividade espontnea, treinados, natao 1 horae exausto. Os valores so apresentados por media desviopadro de 10 animais por grupo *(p

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Tabela '7 Atividade mxima da enzima piruvato carboxilasenos tec ido(3 Oll.wculf.ll'el3 - gastrocnmio e sleo dos gruposcontrole(C) e suplementao(S) submetidos as seguintescondies: sedentrio, atividade espontnea, treinados,natao 1 hora e exausto. Os valores so apresentados pormedia + desvio padro de 10 animais por grupo *(p

, ,

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Tabela 8 -Atividade mxima da enzima piruvato carboxilasenos tecidos heptico e cardaco dos grupos controle(C) esuplementao(S) submetidos as seguintes condies:sedentrio, atividade espontnea, treinados, natao 1 horae exausto. Os valores so apresentados por media desviopadro de 10 animais por grupo *(p

Tabela 9 - Peso relativo do tecido adiposo epididimal dosgrupos controle(C) e suplementao(S) submetidos asseguintes condies: sedentrio, atividade espontnea,treinados, natao 1 hora e exausto. Os valores soapresentados por media desvio padro de 10 animais porgrupo *(p