Ahai Aspectos Moleculares Lilian Castilho

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ANEMIA HEMOLTICA AUTO-IMUNE Aspectos moleculares

Dra. Lilian Castilho

Os mtodos moleculares mudaro a rotina dos laboratrios de Imunohematologia ???

HEMAGLUTINAO

Onde estamos falhando?Stainsby et al. Serious hazards of transfusion: a decade of hemovigilance in the UK. TMR 2006; 20:273-82 2623 casos (1996-2004) 10.2%- Reaes transfusionais hemolticas agudas (incompatibilidade ABO) 9.7%- Reaes transfusionais hemolticas tardias

HEMAGLUTINAO

Onde estamos falhando?Reaes transfusionais hemolticas tardias 8 mortes 53% anti-Jka/Jkb 38% anti-Rh 14% erros poderiam ter sido evitados melhorando a prtica laboratorial (Como melhorar?)

LIMITAES DA HEMAGLUTINAO Dificuldade na fenotipagem de pacientes politransfundidos com transfuso recente Dificuldade na fenotipagem de hemcias cobertas com IgG Dificuldade na identificao de ags variantes Dificuldade na identificao de ags de baixa e alta frequncia Limitao dos estoques de antgenosnegativos Impossibilidade de determinar zigozidade

LIMITAES DA HEMAGLUTINAO

O que fazer!

Zoom no DNA

Genotipagem!!!Resultados seguros nas situaes (AHAI) em que a hemaglutinao limitada

Anlise por DNA em pacientes com TDA positivoDificuldades na remoo do ac IgG Anticorpos monoclonais IgM ou monoclonais murinos no esto disponveis Anti-soros so fracamente reativos Antgeno sensvel ao tratamento de remoo da IgG

PROTOCOLOS DE GENOTIPAGEM PARA UTILIZAO NA CLNICA AS-PCR, PCR-RFLP, Multiplex

RHD D+/D-(D), D parcial, D fraco, Del, zigozidade RHD RHCE C/c, E/e, VS, variantes Rh C, E/e KEL K/k, Jsa/Jsb FY Fya/Fyb,GATA, Fyx

JK Jka/Jkb GYPB S/s; S-silencioso Dombrock Doa/Dob , HY, JO Diego Dia/Dib, Memphis II

PROTOCOLOS DE GENOTIPAGEM PARA UTILIZAO NA CLNICA Microarray- BeadChipTM , Bioarray Solutions Ltd

RHCE C/c, E/e KEL K/k FY Fya/Fyb,GATA, Fyx LW Lw a/Lw b CO Coa/Cob SC Sc1/2

JK Jka/Jkb GYPA M/N GYPB S/s, S silencing, Uvar DO Doa/Dob , Hy, Jo DI Dia/Dib LU Lua/Lub

RESULTADOS DE GENOTIPAGEM NA AHAI 2003-2006

Total de pacientes: 28Em 28 pacientes a genotipagem auxiliou na deduo do perfil antignico (Rh, Kell, FY, JK, Ss) e consequentemente na seleo de sangue fentipo compatvel Em 8 pacientes foi possvel diferenciar alo de auto Em 11 pacientes foi possvel identificar aloanticorpos aps adsores alognicas 8 pacientes foram genotipados como FYB-33 e puderam receber sangue Fy(b+)

RESULTADOS DE GENOTIPAGEM NA CLNICA CASO CLINICO 1-HISTRICO

Paciente feminina descendente de Africanos, 52 anos Transfuses prvias? Diagnstico: AHAI, Hb 6.8 Solicitado 2 unidades de sangue TDA positivo (IgG1) PAI positiva 2+ em AGH Painel positivo 2+ em AGH com todas as clulas, Autocontrole positivo

RESULTADOS DE GENOTIPAGEM NA CLNICA CASO CLINICO 1-GENOTIPAGEM

Silencing FY

ChipName

Sample WarnMsg

Fyx[Fy(b+w) No No 1 No No No

HgbS

Jo(a)

LWb

LWa

Dob

Cob

Fya

Doa

Coa

Lub

Fyb

Lua

Sc1

Sc2

Jka

Jkb

Dia

Dib

Hy

M

C

Cmmnt

K

N

e

k

E

HEA04961_1 HEA04961_2 HEA04961_3 HEA04961_4 HEA04961_5 HEA04961_6 HEA04961_7 HEA04961_8

A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8

+ + + + + -

+ + +

+ + + + + + + +

-

+ -

+ + + + + + + +

+ + + + -

+ + -

+ + + + + + +

+ + + + + + -

+ + + + +

+ + + + + -

S + -

c

s + + + + + + + +

+ -

+ + + + + + + +

+ + + + +

+ + + + + + + +

+ + + + + + + +

+ + + + + +

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-

+ -

+ + + + + + + +

+ + + + + + + +

-

+ + + + + + + +

-

+ ++ +

1

No No 1 2 2 1

No No 2

+

+

Fentipo da paciente: KFy(a (aJk(a+b (a+b- M+NLu(a (aO, Ro, K-k+, Fy(a-b-), Jk(a+b-), M+N-S-s+, Lu(a- b+), Hy+, Jo(a+), Di(a (aCo(a+b- Sc1,Do(a+b+), Hy+, Jo(a+), Di(a- b+), Co(a+b-), Sc1,-2

RESULTADOS DE GENOTIPAGEM NA CLNICA CASO CLINICO 1-CONCLUSO

Adsoro alognica com hemcias R0r, K-, Fy(a-), Jk(b-), S-

antiPaciente com anti-E, -K, -Jkb, -S Confirmao sorolgica com adsores seletivas (E- K- Jk(b S(bTransfuso fentipo compatvel (E-, K-, Jk(b-), S-) Fy(b+) e Fy(b+) Aumento nveis de Hb de 6.8 para 8.6 aps transfuso

RESULTADOS DE GENOTIPAGEM NA CLNICA CASO CLINICO 2-HISTRICO

Paciente masculino caucaside 64 anos Portador de AHAI, politransfundido Solicitado 2 unidades de sangue TDA positivo (IgG3) positiva/Auto AutoPAI positiva/Auto-controle positivo anti- autoAnticorpos identificados no soro: anti-D, auto-IgG Fenotipagem: K- Fy(a+b+),Jk(a+b+) (a+b+),Jk Fenotipagem: R1R2, K-, Fy(a+b+),Jk(a+b+) Provas de compatibilidade: incompatveis

RESULTADOS DE GENOTIPAGEM NA CLNICA CASO CLINICO 2- GENOTIPAGEM

Gentipo do paciente: RHD+, RH*Cc, RH*ee, RH*Cc, RH*ee, Cc ee

KEL*2/KEL*2, FY*A/FY*A JK*B/JK*B, GYPB*S/sFY A/FY A

GATA

normal,

100 pb

RHDCc

100 pb

100pb

RH ee

K2K2

JK B/JK B

S+

100 pb

s+

RESULTADOS DE GENOTIPAGEM NA CLNICA CASO CLINICO 2- GENOTIPAGEM

Genotipagem complementar RHD Fraco, RHD parcial

RHD Fraco: negativo RHD Parcial: positivo (D parcial categoria VI)100 pb DVI

RESULTADOS DE GENOTIPAGEM NA CLNICA CASO CLINICO 2- CONCLUSO

Adsoro alognica com hemcias R1r, K-, Fy(b-), Jk(a-)

antiAcs identificados no soro do paciente: anti-D, Jka KSangue selecionado para a transfuso: rr, K-, Jk(a Fy(b (a(bJk(a-), Fy(b-) autoAvaliao do significado clnico do auto-ac antes da transfuso

RESULTADOS DE GENOTIPAGEM NA CLNICA CASO CLINICO 3- HISTRICO

Paciente transfundido a cada 3 semanas com 2 unidades de concentrado de hemcias Histria de anti-c, -E, -K Servio de Hemoterapia do Hospital relata reatividade adicional Suspeita:anti-Jka

RESULTADOS DE GENOTIPAGEM NA CLNICA CASO CLINICO 3- INVESTIGAO SOROLGICA

Laboratrio de referncia confirma anti-c, -E, -K Autoanticorpo IgG tambm detectado Fenotipagem demonstra campo misto Por segurana o hospital seleciona unidades de hemcias c, E, K, Jk(a)

RESULTADOS DE GENOTIPAGEM NA CLNICA CASO CLINICO 3- GENOTIPAGEM/CONCLUSO

Genotipagem: RHD+, RH*C/C, RH*e/e, KEL*2/2, FY*A/B, JK*A/B Fentipo deduzido: R1R1, K-k+, Fy(a+b+), Jk(a+b+) Paciente no desenvolver aloanti-Jka 1 em 6 unidades so c, E, K 1 em 25 unidades so c, E, K, Jk(a)

RESULTADOS DE GENOTIPAGEM NA CLNICA CASO CLINICO 4- HISTRICO/GENOTIPAGEM

Paciente com sinais e sintomas de hemlise Transfundido com 2 unidades de concentrado de hemcias Identificado: anti-Jka; Jk(a+CM) Interpretao: reao transfusional [recebeu hemcias Jk(a+) em outro hospital] Genotipagem: JK*A/JK*A Interpretao: Jk(a+), autoanti-Jka (IgG3 hemoltico)

RESULTADOS DE GENOTIPAGEM NA CLNICA CASO CLINICO 5-HISTRICO/GENOTIPAGEM

Paciente com AHAI, O RhD+, TDA+ Histria transfusional:? Ac identificado no eluato e soro: anti-D Auto ou alo? Genotipagem: D fraco tipo 1 Interpretao: auto-anti-D (IgG1 no hemoltico) Sangue selecionado para transfuso: O RhD+

RESULTADOS DE GENOTIPAGEM NA CLNICA CASO CLINICO 6-HISTRICO

Paciente (O RhD-negativo) admitido no hospital com Hb de 4.5 g/L, 6 dias aps cirurgia e transfuso TDA positivo com C3; eluato negativo PAI: ac com fraca reatividade em PEG e LISSCoombs e reativo em papana Transfundido com hemcias O, Jk(b), Le(a) Hemlise aps transfuso

RESULTADOS DE GENOTIPAGEM NA CLNICA CASO CLINICO 6-HISTRICO/GENOTIPAGEM

Nenhum anticorpo contra drogas detectado Teste de Donath Landsteiner negativo Interpretao hemlise foi um resultado da transfuso! Fentipo deduzido do gentipo:S+s+, K, Fy(ab+), Jk(a+b) Campo misto na fenotipagem Fya demonstrou sobrevida de hemcias do doador na circulao do paciente

Importncia da genotipagem em pacientes com AHAIIdentificao de aloanticorpos Diferenciao entre alo e auto Selecionar hemcias fenotipicamente compatveis Preveno da aloimunizao Aumento da sobrevida das hemcias transfundidas

GENOTIPAGEM NA CLNICAGenotipagem de grupos sanguneos na clnica requer: Conhecimento em grupos sanguneos Experincia na interpretao das reaes de PCR utilizadas Obteno dos achados sorolgicos e da histria clnica do paciente antes de interpretar os resultados da genotipagem Conhecimento dos genes que codificam os antgenos de GS e suas formas variantes (fentipos e gentipos podem no correlacionar) na populao estudada

HEMOCENTRO UNICAMPLaboratrio de Biologia Molecular de Grupos Sanguneos19991999-Lab pesquisa protocolos moleculares na Imunohematologia clnica uso rotineiro quando resultados sorolgicos so questionveis ou duvidosos, duvidosos, fenotipagens no disponveis, disponveis, genotipagem pode auxiliar na recomendao da (auto/alo alo) conduta transfusional (auto/alo) integra o Consortium for Blood Group Genes (CBGG) participa de testes de proficincia (ISBT e NYBC)

Transfuso em pacientes com AHAI

? fazer O que ? azer f omo C

Significado clnico do autoac Investigao de aloanticorpos Fenotipagem Genotipagem

Fenotipagem eritrocitriaVantagens Tcnica simples e rpida No requer equipamento sofisticado Sensibilidade e especificidade

Desvantagens Valor limitado em pacientes recentemente transfundidos ou que apresentam teste direto da antiglobulina positivo 4+ (Auto IgG + C)

Genotipagem eritrocitriaVantagens Resultados seguros nas situaes (AHAI) em que a hemaglutinao limitada

Desvantagens Requer mais tempo na execuo Maior custo Fcil contaminao

ImunohematologiaFentipo Fen Gentipo Gen

+aglutinao DNA

Tcnicas moleculares: potencial para mudar a prtica na medicina transfusional