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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE FILOSOFIA, CIÊNCIAS E LETRAS DE RIBEIRÃO PRETO Atividade neuroprotetora e anticonvulsivante do composto FrPbAII isolado da peçonha da aranha Parawixia bistriata em ratos Wistar submetidos ao Status Epilepticus por pilocarpina. ALEXANDRA OLIMPIO SIQUEIRA CUNHA Ribeirão Preto, 2008

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE FILOSOFIA, CIÊNCIAS E LETRAS DE

RIBEIRÃO PRETO

Atividade neuroprotetora e anticonvulsivante

do composto FrPbAII isolado da peçonha da

aranha Parawixia bistriata em ratos Wistar

submetidos ao Status Epilepticus por

pilocarpina.

ALEXANDRA OLIMPIO SIQUEIRA CUNHA

Ribeirão Preto,2008

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Atividade neuroprotetora e anticonvulsivante do

composto FrPbAII isolado da peçonha da aranha

Parawixia bistriata em ratos Wistar submetidos ao

Status Epilepticus por pilocarpina.

Alexandra Olimpio Siqueira Cunha

Ribeirão Preto2008

Tese de Doutorado apresentada a Faculdade

de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão

Preto, da Universidade São Paulo para

obtenção do título de Doutor em Ciências

Área de concentração: Psicobiologia

Orientador: Prof. Dr. Wagner Ferreira dos

Santos

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Cunha, Alexandra Olimpio Siqueira

Atividade neuroprotetora e anticonvulsivante do composto FrPbAIIisolado da peçonha da aranha Parawixia bistriata em ratos Wistarsubmetidos ao Status Epilepticus por pilocarpina. Ribeirão Preto, SP120p.: 29cm

Tese de Doutorado apresentada a Faculdade de Filosofia, Ciênciase Letras de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo

1. Epilepsia Experimental 2. Venenos de Aranhas 3. Anticonvulsivantes

FICHA CATALOGRÁFICA

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Capa: Imunofluorescência para GFAP no hipocampo

de animais submetidos ao Status Epilepticus e tratados

com o composto FrPbAII isolado da peçonha da aranha

Parawixia bistriata

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Dedico este trabalho

Ao meu marido Aldo,

Aos meus filhos, Barbara, Mariana e Gabriel,

Aos meus pais, Fernando e Lurdinha.

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Agradecimentos

! A Deus, pela vontade, determinação, saúde, alegria e principalmente pelo leite das pedras de todos os dias.

! Ao meu marido Aldo, pelo amor e amizade, eternos....

! Aos meus pequenos tesouros, por me fazerem feliz todos os dias.

! Aos meus pais, pelo amor, carinho e ensino da Ética.

! Ao Prof. Wagner Ferreira, pela liberdade de criação, pelos conselhos (nem sempre ouvidos), pelo apoio durante quase 8 anos de convivência!

! Ao Prof Joaquim CoutinhoNetto da FMRP-USP, pela colaboração contínua e duradoura.

! Ao Prof Norberto Cysne Coimbra da FMRP-USP, pelo apoio logístico e discussões científicas sempre produtivas.

! Ao Prof Norberto Peporine Lopes FCFRP-USP, pela abertura do laboratório para isolamento dos compostos.

! Ao Prof Marcus Lira Brandão FFCLRP-USP, pelo apoio logístico e abertura do laboratório.

! À Prof Elisabeth Spinelli FFCLRP-USP, por ter me introduzido a maravilhosa área das Neurociências.

! Aos Profs Luiz Tadeu Moraes Figueiredo e Victor Hugo Aquino da Unidade de Virologia da FMRP-USP, pela utilização do microscópio de fluorescência.

! À minha grande amiga, Márcia, pela ajuda, apoio e orientação sempre disponíveis. Por me ouvir e chorar comigo todas as tristezas e fazer das quedas só um breve descanso...

! Às minhas queridas irmãs, Ludovica, Clarissa e Ana Luisa, por terem me ajudado tanto, tantas vezes. Por terem me ouvido chorar e me feito sorrir. Por nunca me esquecerem, apesar da distância.

! Aos meus queridos amigos do Laboratório de Neurobiologia e Peçonhas, por terem enchido a minha vida de risadas. Obrigada aos que estão: Zezim, Jú grande, André, Adriana, Érica, Helene, Cristina,

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Karina, Jú pequena, Silvia e Márcia Prévide. Obrigada aos que já foram: Lú, Andrea, Renato, Alessandra, Marcelo, Bruna e Zelinda.

! À minha querida mãe de Ribeirão, Nina, pelo apoio, por chorar comigo tantas vezes, pelo café, sempre aconchegante.

! Às minhas amigas de muitos anos, minha família de Ribeirão, por tudo o que fizeram e representam pra mim; Marina, Raquel, Fabíola e Karlinha. Não me esqueço vocês nunca.

! Ao amigo e técnico, Amauri, pela ajuda com a Histologia, por me ajudar com as minhas idéias malucas e pelas conversas sobre arte.

! Ao inesquecível amigo, Toninho, pelas conversas, apoio e pelo ensino das técnicas da Histologia, eletroforeses e colunas. Que Deus te dê sempre amparo e conforto e um descanso em paz.

! Ao pessoal de outros laboratórios, que sempre nos ajudam muito; Renê, Ruither, Pancinha, Vera e Sivia do laboratório do Prof Coutinho; Jorge, karina e Milene do laboratório do Prof Brandão; Gobbo do laboratório do Prof Norberto Lopes e Daoud do laboratório do Prof Coimbra.

! Ao técnico Tomaz do laboratório do Prof Norberto Lopes, pela ajuda incansável na purificação, no massa e pelos sustos.... muitos!

! Ao Zezim e a Jú por me ouvirem sempre e me ajudarem com tudo das imunos às compras de casa..e a Érica pelas cirurgias e ensaios.

! Ao meu genrinho, Thomas, por fazer a minha Barbara feliz.

! À Renata da Psicobio, por ajudar a entender as burocracias e cumprir os prazos, pela amizade de quase 10 anos. Felicidades pra você!

! Aos meus Professores do curso de Ciências Biológicas da FFCLRP-USP, pela participação na minha formação.

! A Universidade de São Paulo, pelo privilégio de estudar aqui por 10 anos!

! A Capes, pelo apoio financeiro

! Aos animais pelo sacrifício.

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Para ser grande, sê inteiro: nada

Teu exagera ou exclui.

Sê todo em cada coisa. Põe o que és

No mínimo que fazes.

Assim como em cada lago a lua toda

Brilha, porque alta vive

Ricardo Reis, Ode (1933)

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Resumo

Cunha, A.O.S. Atividade neuroprotetora e anticonvulsivante do composto FrPbAII

isolado da peçonha da aranha Parawixia bistriata em ratos Wistar submetidos ao Status

Epilepticus por pilocarpina. 2008. 120f. Tese de Doutorado Faculdade de Filosofia,

Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Ribeirão Preto, 2007.

A epilepsia do lobo temporal (ELT) acomete cerca de 70% dos pacientes com diagnóstico de epilepsia, sendo a manifestação mais comum da doença e a que mais apresenta casos de pacientes refratários. Apesar do potencial terapêutico dos compostos disponíveis, uma proporção considerável de pacientes não responde ao tratamento ou ainda apresenta intolerância aos efeitos adversos destas drogas. Desta forma, existe uma necessidade contínua de se buscar novas alternativas para o tratamento da ELT e de outras síndromes neurológicas importantes. Neste contexto, os venenos de artrópodes são fontes alternativas de compostos seletivos e específicos sobre sítios do tecido nervoso. À luz destes fatos, no laboratório de Neurobiologia e Peçonhas, isolou-se um composto linear, FrPbAII (174 Da), do veneno da aranha Parawixia bistriata, o qual atua inibindo os transportes de GABA e de glicina e cujo mecanismo de ação ainda não foi esclarecido. Demonstrou-se que a FrPbAII exerce efeito anticonvulsivante contra crises induzidas por vários convulsivantes químicos com bons índices terapêuticos. Além disso, quando injetado na substância negra, a FrPbAII inibiu crises evocadas pela estimulação Area tempestas do córtex piriforme. Este composto apresenta ainda atividade ansiolítica quando injetado no hipocampo dorsal. Continuando o estudo da atividade neurofarmacológica da FrPbAII, no presente trabalho avaliou-se a atividade neuroprotetora e anticonvulsivante em um modelo crônico, comparando sua eficiência a de drogas neuroativas com mecanismos de ação variados. Para tanto, ratos Wistar foram submetidos a um Status epilepticus (SE) de 3 h induzido pela injeção intrahipocampal de pilocarpina. A seguir os animais foram divididos em grupos (n=6-15) tratados com salina, FrPbAII (0.15, 0.075, 0.037 µg/µL), ácido nipecótico (12 µg/µL, i.c.v.), drogas anti-epilépticas convencionais fenitoína (60mg/kg, i.p.) e carbamazepina (120mg/kg, i.p.), um anestésico já testado como neuroprotetor cetamina (50 mg/kg, i.p.) e um ansiolítico diazepam (2mg/kg, i.p.). Como parâmetros de neuroproteção foram monitorados déficits funcionais do hipocampo no labirinto aquático de Morris, alterações morfológicas em neurônios e astrócitos e incidência de crises recorrentes de 5-20 dias após o SE. Mostrou-se que os tratamentos com alvo no sistema GABAégico; diazepam, a FrPbAII (0.15µg/µL) e o ácido nipecótico foram mais eficientes como neuroprotetores, do que as demais drogas. Uma semana após o SE, os ratos tratados com estes compostos apresentaram desempenho no labirinto semelhante àqueles não submetidos ao SE. Com relação à estimativa de células piramidais do hipocampo, foi constatado que os ratos tratados com todas as drogas e eutanasiados 20 dias após o SE, exibiram diminuição da perda destas células, quando comparados aos animais epilépticos sem pós-tratamento. No entanto, o número de células nestes animais não foi semelhante às de animais dos grupos controles não epilépticos. Ainda, foi observado um aumento da expressão de GFAP, devido ao aumento volume das células astrocíticas (corpo celular e prolongamentos), mas não de número de astrócitos. Além disso, foi observada uma menor incidência de crises recorrentes entre os ratos tratados com as drogas potencializadoras do GABA. Considerando que a FrPbAII foi cerca de 100 vezes mais potente que o ácido nipecótico e que este composto inibe as captações de GABA e glicina, pode-se supor que o bloqueio inespecífico de transportadores de GABA, representa uma alternativa poderosa para prospecção de drogas com potencial antiepileptogênico.

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Abstract

Cunha, A.O.S. Neuroprotective and anticonvulsant activity of FrPbAII isolated from the venom of the spider Parawixa bistrita in Wistar rats submitted to the pilocarpine-induced Status Epilepticus. 2008. 120f. Thesis (Doctoral) Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Ribeirão Preto, 2007.

Temporal lobe epilepsy (TLE) is accounts for 70% of patients with epilepsy and it is thus, the most common epileptic syndrome and the one with the highest number of refractory. Despite the therapeutic potential of these compounds, many patients either do not respond to treatment, or do not tolerate the severe side-effects triggered by chronic treatment. Therefore, there is still a need to search for novel alternatives for the treatment of TLE as well as other neurological diseases. In this context, arthropod venoms appear as sources of compounds that act on neuronal structures with selectivity and specificity. In the light of these facts, the laboratory of Neurobiology and Venoms isolated a linear molecule named FrPbAII (174 Da) from the venom of the spider Parawixia bistriata, which inhibits GABA and glycine uptake, through mechanisms still not fully characterized. Previous data have shown that FrPbAII is anticonvulsant against seizures evoked by a wide range of chemoconvulsants with good therapeutic indexes. Moreover, the injection of this compound into the Substantia nigra pars reticulate blocks seizures elicited from the stimulation of the Area tempestas in the piriform cortex. Still, intrahippocampal administration of FrPbAII was anxiolytic. Continuing the studies with this molecule, the present study evaluated its antiepileptogenic and neuroprotective properties, comparing its effects with the effects of neuroactive drugs with different modes of action. Therefore, the animals were submitted to the three-hour SE induced by the intrahippocampal pilocarpina. They were divided in groups (n=6-15) treated with saline, 3 doses of FrPbAII (0.15, 0.075, 0.037 µg/µL), nipecotic acid, two convencional antiepileptics carbamazepine and phenytoin, the neuroprotective agent ketamine and the benzodiazepine diazepam. As parameters of neuroprotection the cognitive deficits of the hippocampus were monitored in the Morris water maze. Moreover, morphological alterations in neurons and astrocytes were analyzed and incidence of recurrent seizures was estimated from 5 to 20 days after the initial SE. The present work shows that drugs targeting GABAergic system; diazepam, FrPbAII (0.15µg/µL) and nipecotic acid were more efficient neuroprotective drugs than the rest of the compounds used. One week after SE, animals treated only with these drugs learned the task in the Morris water maze as quickly as control healthy animals. Regarding to pyramidal cell estimate densities, animals treated with all drugs and sacrificed 20 days post-SE showed attenuated cell loss as compared to epileptic non-treated animals. However, cell density was still lower than control non-epileptic animals. Furthermore, an increase in GFAP expression was observed, mainly due to the increase in astrocytes volume (cell body and processes) rather than astrocytes number. Finally, groups of animals treated with GABA enhancing drugs had lower number of animals with recurrent seizures, although this result was not statistically significant. As FrPbAII inhibits both GABA and glicine uptakes and it was over 100 more potent than nipecótico acid in this work, one can suppose that the unspecific blockade of GABA transporters may represent a powerful alternative to be used in the design of drugs with antiepileptogenic potential.

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Prefácio

A epilepsia, a doença que faz cair, é uma das mais antigas desordens neurológicas, com registros de até 4500 AC. Conceitos básicos em epilepsia foram desenvolvidos e aperfeiçoados na Índia durante o período Védico entre 45001500 AC. Na literatura Charaka Samhita, a epilepsia é descrita com o nome de apasmara, que significa perda de consciência. O Charaka Samhita contém referências sobre muitos aspectos da epilepsia, incluindo sintomatologia, etiologia, diagnóstico e tratamento. No Ocidente, no entanto, esta doença sempre foi associada à presença de espíritos e demônios, os quais dominavam as pessoas e provocavam salivação excessiva, queda e contorções do corpo. Durante estes ataques de demônios e espíritos, cada tipo de ataque era provocado por um demônio específico, o espírito da pessoa seria aprisionado, deixando-a fora da realidade. Os gregos antigos acreditavam que a pessoa contraía epilepsia se ofendesse aos deuses, sobretudo a deusa Selena, daí a epilepsia ser conhecida como a doença sagrada. Mais tarde, Hipócrates utilizou a sua teoria sobre desequilíbrio de humores para explicar o desencadeamento da epilepsia. Nas palavras de Hipócrates O cérebro é a causa desta calamidade. Quando o muco do cérebro desce para as veias, o paciente perde a fala e espuma pela boca, suas mãos se contraem, seus olhos se contorcem, ele deixa de sentir e em alguns casos as vísceras se esvaziam. Todos estes sintomas são causados quando o muco frio do cérebro entra em contato com o sangue quente. No Evangelho de São Marcos (9, 17-18) escrito aproximadamente 70 DC está descrito que Jesus Cristo exorcizou um rapaz do qual o demônio roubava a fala quando o atacava. Segundo o apóstolo quando o demônio atacava, este fazia o rapaz cair, espumar pela boca, ranger os dentes e torna-se rígido. A idéia de que a epilepsia era contagiosa surgiu durante o império romano. Nesta época, assim como durante o final do século 17, os epiléticos eram separados do convívio comum e mesmo em manicômios, eles eram mantidos afastados dos loucos para não contaminá-los. Durante a Idade Média, os ataques epilépticos eram considerados características para identificação de bruxos e bruxas. Relatos desta época mostram que depois da peste, a epilepsia é a segunda maior doença, cuja cura fora atribuída aos milagres dos santos. A cura da epilepsia na maioria das vezes era obtida através do exorcismo do paciente. Contudo, outras curas como dormir em templos, utilizar amuletos ou relicários, alguns fitoterápicos e até absinto também foram utilizados ao longo do tempo. Devido ao horror que os ataques epilépticos causavam às pessoas que os assistiam, bem como a explicação baseada em preconceitos e superstições, os portadores de epilepsia sempre foram tratados como aberrações. Foi somente nos séculos 19 e 20, com o aumento dos conhecimentos sobre neuroanatomia e fisiologia, que a epilepsia começou a ser estudada com uso de métodos científicos. Nesta época o notável fisiologista inglês John Hughlings Jackson (1859-1906), definiu as crises convulsivas como sendo descargas ocasionais, excessivas e desordenadas dos nervos sobre os músculos. No entanto, mesmo em países desenvolvidos como nos Estados Unidos na década de 1920, havia leis permitindo a esterilização compulsória de pessoas epilépticas. De fato, com base no conhecimento de que a epilepsia é uma doença hereditária, o 3º. Reich, com suas medidas de higiene racial descritas na Lei de Prevenção a Prole com Doenças Hereditárias editada em 14 de Julho de 1933, previa que portadores de epilepsia deveriam ser esterilizados. Além disso, pessoas com epilepsia intratável deveriam ser encaminhadas aos campos de exterminação. Hoje, o Museu Alemão de Epilepsia localizado em Kork, em uma antiga casa de tratamento para pessoas epilépticas abriga um acervo artístico de obras cujo tema está relacionado com a epilepsia. Algumas obras deste museu estão apresentadas neste trabalho.

Ribeirão Preto, Dezembro de 2007

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Sumário

1. Introdução 1

1.1. Epilepsia panorama, definições, tratamento e modelos

experimentais 1

1.2 Mecanismos básicos da transmissão de informação no cérebro 6

1.2.1. Neurotransmissões inibitórias: GABA e Glicina 6

1.2.2.Neurotransmissão excitatória: L-Glutamato 10

1.3.O Hipocampo e o modelo de Epilepsia pós Status Epilepticus 12

1.5.As neurotoxinas de artrópodos e o desenvolvimento de novas DAs. 17

1.6 A aranha Parawixia bistriata. 19

2. Objetivos 23

3. Material e Métodos 24

3.1 Coleta das aranhas, purificação de veneno e isolamento da FrPbAII 24

3.1.1. Coleta da aranha Parawixia bistriata 24

3.1.2. Purificação do composto FrPbAII 24

3.1.3. Etapas de isolamento em Cromatografia Liquida de Alta

Eficiência (CLAE) 25

3.1.4. Espectrometria de massa 26

3.2. Bioensaios 27

3.2.1. Animais 27

3.2.2. Cirurgia 27

3.2.3. Drogas 27

3.2.4. Indução do SE. 28

3.2.5. Ensaios comportamentais no labirinto Aquático de Morris 29

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3.3. Procedimentos histológicos 31

3.4. Imunofluorescência 32

3.4.1. Secções em parafina 32

3.4.2. Secções congeladas 32

3.5. Análise Dano Neuronal 33

3.5.1. Análise Qualitativa, Quantitativa da histologia e

imunofluorecência. 33

3.6. Análise estatística 34

4. Resultados

4.1. Purificação do composto FrPbAII 36

4.2. Espectrometria de massa 38

4.3. O SE induzido por pilocarpina e o tratamento 39

4.4. Labirinto Aquático de Morris 41

4.5. Análise histolopatológica 48

4.5.1. Análise histopatológica qualitativa 48

4.5.2. Análise quantitativa do dano neuronial 54

4.6. Imunofluorescência para GFAP 58

4.7. Incidência de crises recorrentes 60

5. Discussão 61

6. Conclusões 73

7. Referências Bibliográficas 74

8. Anexos 90

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Lista de Figuras

Figura 1 Esquematização das sinapses inibitórias GABAérgicas 7

Figura 2 Esquematização do fluxo informacional no hipocampo, suas

aferências, eferências e suas regiões. 13

Figura 3 Binding do H3-Glutamato em membranas hipocampais e

corticais de ratos Wistar 15 dias após o SE. 15

Figura 4 Esquematização da epileptogênese secundária. 16

Figura 5 A. Exemplar da aranha P. bistriata. B. Colônia coletada na

região de Mococa 20

Figura 6 Fluxograma ilustrando as etapas experimentais para obtenção

do composto FrPbAII. 26

Figura 7 Labirinto aquático de Morris. 30

Figura 8 Fluxograma mostrando as etapas da parte experimental do

trabalho. 35

Figura 9 Perfil cromatográfico do veneno de P. bistriata 37

Figura 10 Perfil espectrométrico do composto FrPbAII 38

Figura 11 Efeitos comportamentais da injeção por via intrahipocampal do

agonista colinérgico pilocarpina. 40

Figura 12 Trajetórias desenvolvidas pelos animais no labirinto aquático de

Morris 41

Figura 13 Médias (±SEM) das latências de escape para encontrar a

plataforma durante o primeiro e segundo dia de treinamento no

labirinto aquático de Morris

43

Figura 14 Médias (±SEM) das latências de escape para encontrar a 44

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plataforma durante o terceiro e quarto dia de treinamento no

labirinto aquático de Morris

Figura 15 Médias (±SEM) das latências de escape para encontrar a

plataforma durante o probe trial no labirinto aquático de Morris. 45

Figura 16 Médias (±SEM) das latências de escape para encontrar a

plataforma durante os quatro dias de treino no labirinto aquático

de Morris dos animais controles.

46

Figura 17 Médias (±SEM) dos tempos de permanência dos animais no

quadrante-alvo (plataforma). 47

Figura 18 Cortes histológicos (parafina) do hipocampo na região da CA1. 49

Figura 19 Cortes histológicos (criostato) do hipocampo na região da CA1. 50

Figura 20 Cortes histológicos (parafina) do hipocampo na região da CA3. 51

Figura 21 Cortes histológicos (criostato) do hipocampo na região da CA3. 52

Figura 22 Cortes histológicos (parafina) do hipocampo na região do GD. 53

Figura 23 Cortes histológicos (criostato) do hipocampo na região do GD 54

Figura 24 Porcentagem de perda de neurônios em três regiões do

hipocampo 57

Figura 25 Secções (parafina) de marcadas com anticorpo para GFAP no

GD do hipocampo 58

Figura 26 Imunomarcação para GFAP no hilus do GD 59

Figura 27 Secções (criostato) de marcadas com anticorpo para GFAP no

GD 59

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Lista de Tabelas

Tabela I Classificação das crises convulsivas 2

Tabela II Resumo dos modelos experimentais de epilepsia 3

Tabela III Compostos anticonvulsivantes isolados de venenos de

artrópodos 18

Tabela IV Critérios comportamentais para classificação das crises límbicas 28

Tabela V Protocolo experimental no labirinto aquático de Morris. 30

Tabela VI Incidência de crises recorrentes após SE induzido pela injeção

de pilocarpina 60

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Lista de Abreviações

ILAE - Liga Mundial de Luta contra Epilepsia (do inglês International League

Against Epilepsy)

WHO Organização Mundial de Saúde (do inglês World Health Organization)

EEG Eletroencefalograma

ELT Epilepsia do Lobo Temporal

SE Status Epilepticus

MEST Teste de Máximo Eletrochoque (do inglês Maximal Eletroshock Test)

PTZ Pentilenotetrazol

NMDA N-metil-D-Aspartato

KA Ácido caínico (do inglês Kainic Acid)

AMPA Ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropionico

DAs Drogas Anticonvulsivantes

GABA Ácido γ-aminobutírico

SNC Sistema Nervoso Central

PIPS Potencial Inibitório Pós Sináptico

GAT Transportador de GABA (do inglês GABA Transporter), subtipos 1-4

L-Glu L-Glutamato

m-GluR Receptores metabotrópicos de glutamato

EAATs Transportadores de aminoácidos excitatórios (do inglês Excitatory

aminoacid Transporters), subtipos 1-5

LTP Potencialização à longo prazo (do inglês Long Term Potentiation)

LTD Depressão à longo prazo (do inglês Long Term Depression)

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CA1 Corno de Amon 1

CA3 Corno de Amon 3

GD Giro Denteado

PP Via perfurante (do inglês Perfurant Path) porção lateral LPP e porção

medial MPP

MF Fibras musgosas (do inglês Mossy Fibers)

SrTx1.3 Neurotoxina isolada do veneno da aranha Scaptocosa raptoria

AG2 Neurotoxina isolado do veneno da aranha Argiope trifasciata

BmK AE Neurotoxina isolada do veneno do escorpião Buthus martensi Karsch

i.c.v. Intracerebroventricular

HE Hematoxilina e eosina

GFAP Proteína glial acídica fibrilar (do inglês Glial fibrillary acidic protein)

COBEA Colégio Brasileiro de Experimentação Animal

CEUA Comitê de Ética para o Uso de Animais

CLAE Cromatografia Liquida de Alta Eficiência

FITC Fluoresceína isotiocianato (do inglês Fluorescein isothiocyanate)

IgG Imunoglobulina do tipo G

EPM Erro padrão da média

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Introdução

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1

1. Introdução

1.1. Epilepsia panorama, definições, tratamento e modelos experimentais

Estima-se que cerca de 1% da população mundial seja afetada por

algum tipo de epilepsia, sendo que 80% dos casos estão em países em

desenvolvimento (Meinardi et al., 2001). Em um recente estudo realizado

durante a campanha mundial contra epilepsia (Global Campaign Against

Epilepsy) promovida pela Liga Mundial Contra Epilepsia (ILAE) e Organização

Mundial da Saúde (WHO), Dua e colaboradores (2006) relataram os resultados

de um levantamento sobre os recursos disponíveis para tratamento da

epilepsia. Os dados deste levantamento revelaram discrepâncias entre países

ricos e pobres, tais como: preço de medicamento (três vezes mais caros em

países pobres), equipamentos disponíveis para diagnóstico (apenas 45% dos

serviços Africanos e 55% dos serviços do leste Asiático fazem monitoramento

do tratamento) e intervenção cirúrgica (apenas 13% dos centros localizados

em países pobres, em contraste com 65% dos centros localizados em países

ricos) (Dua et al., 2006).

As epilepsias constituem um grupo heterogêneo de doenças crônicas

do cérebro, caracterizado pela ocorrência de sincronização de descargas

elétricas neuronais que culminam com a ocorrência de crises espontâneas e

imprevisíveis. A incidência das síndromes epilépticas muda drasticamente com

a idade, ocorrendo no primeiro ano de vida numa freqüência de 150/100.000

de indivíduos caindo para 45-50/100.000 após 9 anos de idade. Até os 15 anos

de 1.0 a 1.7% das crianças têm pelo menos 1 crise e de 0.7 a 0.8% das crianças

têm crises recorrentes (Guerrini, 2006). Curiosamente, a incidência destas

síndromes se eleva novamente entre indivíduos da terceira idade. Grupos de

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sintomas e sinais definem síndromes epilépticas específicas. A classificação

destas síndromes se baseia em critérios clínicos, neuroimagem e neurofisiologia

(Comissão para Classificação e Terminologia da Liga Internacional Contra

Epilepsia - Commission on Classification and Terminology of the International

League Against Epilepsy, 1989). De uma maneira geral, as epilepsias são

divididas em dois grandes grupos: 1. Generalizadas (40% dos casos) quando o

registro eletroencefalográfico (EEG) detecta disparos sincronizados

generalizados em diversas regiões do cérebro; 2. Parciais (60%), quando o EEG

detecta disparos sincronizados em áreas localizadas (Tabela I) (Löscher, 1998;

Engel, 2001).

Tabela I. Classificação das crises convulsivas

Tipos

Crises generalizadas Crises Parciais

Ausência (Petit mal) Parciais simples

Mioclônicas Parciais complexas

Clônicas Parciais secundariamente generalizadas

Tônicas

Tônico-clônicas (Grand mal)

Atônicas

Classificação proposta pela Comissão para Classificação e Terminologia da Liga Internacional Contra Epilepsia (Commission on Classification and Terminology of the International League Against Epilepsy, 1989).

Em alguns casos, as síndromes epilépticas podem apresentar causas

bem definidas, ou seja, decorrentes de traumas, distúrbios bioquímicos, lesões

cerebrais, infecções virais, aberrações genéticas (Síndrome de Lennox-

Gastaut); ou criptogênicas sem causa dectável, sendo, neste caso,

denominadas idiopáticas (Engel, 2001). Dentre as diversas síndromes epiléticas

destaca-se a Epilepsia do Lobo Temporal (ELT), reconhecidamente o tipo mais

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comum de epilepsia em adultos (40% dos casos), sendo de difícil tratamento,

uma vez que 70% dos pacientes tornam-se refratários (De Deyn et al., 1992).

A atividade epileptiforme inicia-se no sistema límbico no lobo temporal;

hipocampo, amigdala e córtex entorrinal, levando a uma crise parcial

complexa (Engel, 1996). Pacientes com ELT freqüentemente relatam

antecedentes clínicos: Status epilepticus (SE), convulsões febris ou trauma,

seguido por um período de alguns anos antes do desencadeamento de crises

parciais complexas recorrentes (François et al., 2006). Uma das hipóteses

vigentes sugere que após a lesão, contatos sinápticos estabelecidos pelo

brotamento de axônios das fibras musgosas remanescentes, induzem uma

excitabilidade anormal do sistema límbico, sobretudo no hipocampo

(Buckmaster et al., 2002). Esta hipótese é corroborada por dados obtidos de

biópsias do tecido nervoso de alguns pacientes com ELT, os quais revelam a

ocorrência de extensa morte celular e brotamento de fibras nervosas no

hipocampo caracterizando um quadro de esclerose hipocampal (Buckmaster

et al., 2002; Ebert et al., 2002; Furtado et al., 2002). Uma vez que a esclerose

hipocampal não é encontrada em todos os pacientes com ELT, o papel destas

lesões no desencadeamento e manutenção desta patologia ainda não foi

estabelecido. Além disto, diversos trabalhos revelam que portadores de ELT,

apresentam déficits funcionais (Hannesson & Corcoran, 2000) dentre os quais:

diminuição da velocidade de processamento de informações, codificação

gráfico-motora, memória de curto e longo prazo e distorções perceptuais

(Rabinovitz et al., 2004).

Na tentativa de entender os mecanismos envolvidos no

desencadeamento e propagação das crises convulsivas, bem como testar

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compostos com atividade anticonvulsivante, foram desenvolvidos dezenas de

modelos experimentais de epilepsia. Estes podem ser agrupados em modelos

de indução aguda de crises e modelos crônicos (Tabela II).

Tabela II Resumo dos modelos experimentais de epilepsia

Indução aguda Crônicos

Máximo eletrochoque MEST Pós-Status Epilepticus induzido por

agentes químicos

Injeção de antagonistas de aminoácidos

inibitórios PTZ, bicuculina, picrotoxina e

estriquinina

Pós-Status Epilepticus induzido por

estímulo elétrico

Injeção de agonistas de aminoácidos

excitatórios NMDA, KA e AMPA

Abrasamento elétrico

Injeção de metais Hidróxido de

Alumínio, Cobalto, Sulfato de Zinco

Abrasamento químico

Injeção de toxinas tetânica Animais geneticamente modificados

Dados extraídos de DeDeyn (1992) e Löscher (2002).

O uso de modelos animais revelou dados importantes sobre as

epilepsias; substratos neuronais envolvidos, recrutamento de áreas,

neurodegeneração e alvos bioquímicos para o tratamento. Desta forma,

foram descobertas várias drogas anticonvulsivantes (DAs) novas, desenhadas

a partir da modificação estrutural de DAs pré-estabelecidas ou a partir do

conhecimento das estruturas neuronais envolvidas no desencadeamento e

manutenção da atividade epileptiforme.

Os modelos de indução aguda de crise são rápidos e popularmente

utilizados em screenings farmacológicos, revelando informações importantes

como: toxicidade motora e doses efetivas. Estes modelos, no entanto, podem

selecionar DAs sem nenhuma atividade antiepileptogênica, ou seja, DAs que

não alteram a progressão da doença, sendo considerados como modelos de

crises agudas ao invés de modelos de epilepsia (Löscher, 2002). Os modelos

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crônicos, por sua vez, simulam disfunções crônicas do cérebro e fornecem

pistas sobre a progressão das epilepsias, bem como novos alvos de

intervenção farmacológica. A maior dificuldade no desenvolvimento de

drogas anticonvulsivantes é a falta de modelos animais que reproduzam por

completo as síndromes epilépticas humanas. Isto se dá principalmente devido

às diferenças específicas, etiológicas e ontogenéticas entre homens e demais

animais (De Deyn et al., 1992).

Até o momento, o tratamento das epilepsias consiste na administração

diária de DAs, as quais mantêm as crises sob controle em cerca de 75% dos

pacientes (Kohl & Dannhardt, 2001; Czapinski et al., 2005). Nestes casos, as

drogas anticonvulsivantes convencionais mais utilizadas são: fenobarbital,

carbamazepina, fenitoína e ácido valpróico (em 95, 93, 86 e 87% dos países)

(Dua et al., 2006). Nos demais 25% dos pacientes nos quais ocorre falência

terapêutica e subseqüente ocorrência de crises convulsivas, são freqüentes os

casos onde nem os tratamentos mais invasivos, neurocirurgia e estimulação

vagal são eficazes (Ängehagen et al., 2003). Além disso, o tratamento com as

DAs induz nos pacientes uma ampla variedade de efeitos colaterais, impondo

restrições consideráveis ao tratamento crônico e comprometendo a

qualidade de vida destas pessoas. A administração do ácido valpróico nos

primeiros meses de gravidez induz em cerca de 2% dos fetos,

mielomeningocele (spina bifida aperta) deformação decorrente do

fechamento anormal do tubo neural (Nau et al., 1991 in Kohl & Dannhardt,

2001). A vigabatrina, o primeiro medicamento desenvolvido com uma

estratégia racional de pesquisa por DAs (Rho & Sankar, 1999), induz lesões na

matéria branca cerebelar em espécies não-primatas (Kohl & Dannhardt, 2001).

Outros efeitos colaterais incluem sedação, comprometimento cognitivo,

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letargia, ataxia, desconforto gástrico, diplopia, distúrbios de comportamento,

agranulocitose e interações medicamentosas diversas (Villetti et al., 2001;

Mortari et al., 2007a).

Apesar da quantidade e severidade das reações adversas ao

tratamento, estudos epidemiológicos mostram que em populações sem

tratamento, há uma piora do quadro e um encurtamento dos intervalos entre

as crises (Reynolds, 1987). Além disso, um recente estudo realizado com 2455

pacientes sem tratamento e com diagnóstico recente de epilepsia em áreas

rurais da China mostrou índices de mortalidade 3.9 vezes maior que na

população em geral para pacientes epilépticos tratados. Vale ressaltar que só

foram consideradas mortes associadas diretamente com a doença (Ding et

al., 2006). Apesar de possuir aspectos éticos questionáveis, o estudo recebeu

um comentário na revista The Lancet, segundo o qual estudos como este são

necessários para ressaltar a necessidade de acesso aos tratamentos de baixo

custo existentes em países pobres e em desenvolvimento (Tomson, 2006).

As primeiras DAs surgiram por acaso, ainda no começo do século XX,

quando foram introduzidos os brometos, seguidos dos barbitúricos. O fato de

que ambas as classes de drogas induzem efeitos sedativos muito intensos,

levou a introdução da Fenitoína em 1938 (Tunnicliff, 1996). Estes agentes são

em sua maioria inespecíficos e possuem múltiplos sítios de ação. A maioria das

DAs em uso clínico faz parte desta primeira geração de medicamentos. A

partir da década de 1970, começaram a surgir as drogas de segunda

geração, desenhadas a partir de drogas já existentes, cuja modificação em

suas estruturas visava mais eficiência e menos efeitos colaterais. Durante este

período apareceram as drogas gabamiméticas, as quais foram desenvolvidas

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através de uma abordagem racional à luz da hipótese de que disfunções no

sistema inibitório estariam crucialmente envolvidas nas disfunções do cérebro

epiléptico (Löscher, 1998).

1.2. Mecanismos básicos da transmissão de informação no cérebro

1.2.1. Neurotransmissões inibitórias: GABA e Glicina

O Sistema Nervoso Central (SNC) funciona através da comunicação

entre neurônios, a qual se torna possível devido ao equilíbrio entre excitação e

inibição das sinapses. Neste sentido, o principal componente do sistema de

neurotransmissão inibitória do SNC é o ácido γ-aminobutírico (GABA), o qual

medeia cerca de 70% das sinapses rápidas no SNC (Andersen et al., 2001;

Beleboni et al., 2004a).

A função inibitória do GABA é exercida por três tipos de receptores: dois

ionotrópicos, GABAA e GABAC, e um metabotrópico, GABAB. O receptor

GABAA encontra-se acoplado a canais de íons de Cl no SNC de vertebrados

(Olsen & Avoli, 1997) e junções neuro-musculares de insetos (Wolff & Wingate,

1998). A ligação do GABA aos receptores pós-sinápticos do tipo GABAB ativa

indiretamente a canais de íons de K+ e Ca2+ por meio de transdutores de

membrana, sendo esta ativação responsável pelo componente tardio do

potencial inibitório pós sináptico (PIPS) (Kerr & Ong, 1996; Higashima et al.,

2000). O receptor GABAC é acoplado a canais de íons de Cl-,

predominantemente em retinas de vertebrados (Bormann & Feigenspan, 1995;

Wegelius et al., 1998; Enz & Cutting, 1998). Sabe-se que a ativação dos

receptores de GABAA induz hiperpolarização da célula pós-sináptica,

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enquanto a ativação de receptores de GABAB altera a liberação de outros

transmissores. Já o receptor GABAC tem sido pouco estudado e sua função

permanece questionada devido à localização restrita à retina (Czapinski et al.,

2005).

O GABA é removido da sinapse por difusão ou por transportadores gliais

e neuronais de alta afinidade dependentes de sódio. Dois transportadores,

GAT 1 e 2 são até o momento, os principais candidatos a alvos de

intervenções farmacológicas, devido a sua extensa localização no cérebro

(Dalby, 2003). Na figura 1 encontra-se esquematizado o sistema GABAérgico

com suas estruturas.

Figura 1. Esquematização das sinapses inibitórias GABAérgicas. Estão descritos o

metabolismo do GABA (), receptores e transportadores neuronais e gliais. AC=

Adenilato ciclase, Gi/0= Proteínas G i e 0. Modificado de Böhme & Lüddens (2001).

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Nos últimos 40 anos, a maioria das pesquisas sobre a neurotransmissão

gabaérgica enfatizou o receptor GABAA devido ao fato de que a maioria das

drogas de importância clínica atua sobre este receptor (Martin & Dunn, 2002).

Estes estudos resultaram em grandes avanços no entendimento de aspectos

da farmacologia do GABA. Desta forma, a caracterização dos receptores,

transportadores e enzimas ligadas à sua síntese e degradação (GABA

descarboxilase e GABA transaminase, respectivamente) levou ao

desenvolvimento de novos compostos com comprovado potencial

farmacológico (Beleboni et al., 2004a; Iversen, 2004). No entanto, o benefício

destes compostos muitas vezes é também seguido por efeitos colaterais

indesejados (Villetti et al., 2001). Uma alternativa é o desenvolvimento de

drogas que afetam o transporte de GABA, uma vez que elas atuam sobre uma

quantidade de neurotransmissor liberada em condições fisiológicas, apenas

mantendo-o por mais tempo na fenda sináptica (Andersen et al., 2001).

Desde a década de 80 é sabido que inibidores do transporte de GABA

são anticonvulsivantes, tendo sido empregados esforços para desenvolver

análogos dos inibidores mais antigos, como exemplo o ácido nipecótico, o

qual é um dos mais potentes inibidores da captação do GABA in vitro

(Krogsgaard-Larsen & Johnston 1975; Gadea & Lopez-Colome, 2001a;

Schousboe et al., 2004). No entanto, este composto é altamente polar, sendo

incapaz de ultrapassar a barreira hemato-encefálica, tornando-se ineficiente

quando aplicado sistemicamente (Bonina et al., 1999). Na tentativa de alterar

as propriedades de solubilidade deste composto, muitos análogos foram

sintetizados e testados, dentre estes, o ácido (R)-N-(4,4-di-(3-methylthien-2-yl)

but-3-enyl) nipecótico hidrocloreto, tiagabina. Esta é um potente e seletivo

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inibidor do transportador GAT1 (Suzdak & Jansen, 1995) comercializada em

vários países como droga antiepilética, sendo utilizada no tratamento de

convulsões complexas refratárias e mioclônicas (Dalby & Nielsen, 1997; Dalby,

2000; Kwan et al., 2001) e recentemente indicada também no tratamento

para o transtorno de ansiedade generalizada (Rosenthal, 2003). No Brasil, a

utilização da tiagabina se encontra em fase de aprovação pelo Ministério da

Saúde.

Apesar dos inúmeros benefícios, o uso crônico da tiagabina também

induz efeitos colaterais indesejados, sendo os mais freqüentes; tonturas, dores

de cabeça, tremores, nervosismo, astenia e pensamento anormal (The

National Society for Epilepsy - Reino Unido - www.epilepsynse.org.uk). Deste

modo, faz-se necessário buscar novos compostos com atividade sobre o

sistema de transportadores GABAérgicos, os quais poderão ser utilizados como

ferramentas farmacológicas e terapêuticas a serem utilizadas para ambos;

pesquisa básica e terapia clínica.

O segundo aminoácido inibitório mais abundante no SNC é a glicina,

que predomina em número de receptores nas regiões do tronco cerebral,

medula espinhal e retina, não obstante estar presente em outras estruturas do

encéfalo. Semelhante ao GABA, a glicina exerce sua atividade inibitória

através da ativação de receptores de alta afinidade com canais intrínsecos

permeáveis a íons de Cl-. A ação da glicina está associada a uma série de

processos fisiológicos, dentre os quais se encontram; respostas reflexas,

processamento de sinais sensoriais e sensação de dor (Bregestovski, 2002).

Devido à semelhança estrutural, muitos ligantes reconhecem ambos

receptores de GABA e glicina, ativando-os de modo semelhante. Este é o caso

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da picrotoxina, que antagoniza receptores de GABA dos tipos A e C, bem

como, receptores de glicina. Contudo, até o momento, poucos ligantes

específicos de glicina foram identificados. O mais conhecido destes ligantes é

o alcalóide estriquinina, antagonista de alta afinidade dos receptores de

glicina que induz crises convulsivas em animais. Acredita-se que injeção de

agonistas glicinérgicos exerça efeitos anticonvulsivantes. No entanto,

nenhuma droga sintetizada até o momento, exerce efeitos exclusivos sobre

estes receptores (Böhme & Luddens, 2001).

1.2.2. Neurotransmissão excitatória: L-Glutamato

Se por um lado a Hipótese GABAérgica da epilepsia levou ao

surgimento de DAs desenvolvidas com o propósito de exacerbar a atividade

do GABA, atualmente existe um consenso de que alterações em ambas as

neurotransmissões, excitatória e inibitória, estariam envolvidas no

desencadeamento de processos patológicos do cérebro. Esta premissa levou

ao do desenvolvimento das drogas de última geração com múltiplos sítios de

ação, incluindo estruturas excitatórias glutamatérgicas.

De fato, a ampla maioria das sinapses excitatórias no SNC é mediada

pelo aminoácido L-Glutamato (L-Glu). O efeito excitatório do L-Glu foi

primeiramente relatado em 1952 pela fisiologista japonesa T. Hayashi que

observou que injeção cortical deste aminoácido em cachorros e macacos

provoca crises clônicas.

Atualmente, sabe-se que o L-Glu exerce seu efeito excitatório através

da ativação de três tipos de receptores ionotrópicos acoplados a canais de

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Na+ e Ca2+; N-metil-D-aspartato (NMDA), ácido a-amino-3-hidroxi-5-metil-4-

isoxazolpropionico (AMPA) e ácido caínico, além oito subtipos de receptores

metabotrópicos; m-GluR 1-8 (Fonnum, 1984; Watkins, 2000). Assim como ocorre

para o GABA, a sinalização glutamatérgica é finalizada pela ação de

transportadores de alta afinidade localizados tanto em membranas de

neurônios quanto de astrócitos. Os transportadores de aminoácidos

excitatórios (EAATs) são divididos em cinco classes EAAT 1-5, os quais captam o

L-Glu em processos dependentes de gradiente iônico estabelecido pelos íons

Na+ e K+ (Danbolt, 2001; Proper et al., 2002)

A ativação de receptores de L-Glu está envolvida em processos

essenciais para a sobrevivência, dentre os quais se destaca a potencialização

a longo prazo (LTP), crucialmente envolvida com a formação da memória. No

entanto, a super ativação destes receptores pode induzir a hiperpolarização

maciça das células pós-sinápticas e entrada excessiva de íons de Ca2+,

levando a um processo denominado excitotoxicidade (Olney et al., 1991;

Sattler & Tymianski, 2000). Desta forma, a ação dos EAATs é crucial para a

manutenção da concentração de L-Glu extracelular por volta de 1 M

(Dingledine et al., 1990). De fato, vários trabalhos demonstram que a

excitotoxicidade mediada pelo L-Glu está envolvida no desencadeamento de

doenças importantes neurodegenerativas, tais como: mal de Alzheimer,

doença de Parkinson, Esclerose Lateral Amiotrófica e a ELT (Meldrum &

Garthwaite, 1990; Meldrum, 1994; Meldrum et al., 1999; Proper et al., 2002).

Na epilepsia, acredita-se que a hiper ativação dos receptores de L-Glu

seja responsável pela iniciação e manutenção da atividade epiléptica. De

fato, Rice & DeLorenzo (1998) demonstraram que a ativação dos receptores

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de L-Glu é essencial para o desencadeamento das crises recorrentes no

modelo do SE induzido por pilocarpina.

Apesar de aparentemente promissor, o bloqueio da transmissão

glutamatérgica através de antagonistas NMDA ou AMPA/cainato tem falhado

como alternativa terapêutica devido a um conjunto de sérios efeitos adversos

(Moldrich et al., 2003). Desta forma, uma alternativa viável consiste em

desenvolver antagonistas de receptores metabotrópicos, sobretudo mGluR1 e

5 (Moldrich et al., 2003) ou moduladores alostéricos, incluindo aqueles que

atuam sobre o sítio da fenciclidina (PCP) (Bergink et al., 2004).

Outra alternativa, seria o uso de agentes que estimulem a recaptação

do L-Glu liberado (Gadea & Lopez-Colome, 2001b; Bridges & Esslinger, 2005).

Neste sentido, alguns compostos têm sido testados, tais como o (R)-(-)-5-methil-

1-nicotinoil-2-pirazolina (MS-153), o qual estimula o transportador glial EAAT1 e

apresentou atividade neuroprotetora em modelo de isquemia global

(Shimada et al., 1999). Como outro exemplo pode-se citar o riluzole, utilizado

na prática clínica em casos de esclerose amiotrófica lateral, que

primeiramente teve o seu efeito neuroprotetor atribuído à inibição da

liberação de L-Glu. No entanto, Azbill e colaboradores (2000) demonstraram

que este agente atua estimulando a recaptação do L-Glu em neurônios da

medula espinhal. Mais recentemente, Frizzo e colaboradores (2004) relataram

este efeito estimulante também sobre transportadores de astrócitos em

cultura. Estes autores salientaram, no entanto, que em condições de liberação

excessiva do L-Glu, o riluzole pode ser tóxico, aumentando a intensidade e

duração de descargas epileptiformes (Pena & Tapia, 2000; Frizzo et al., 2004).

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Concluindo, faz-se necessário buscar fontes alternativas de ligantes

glutamatérgicos, que minimizem os efeitos da hiperexcitabilidade do tecido

neural sem induzir reações adversas que, na maioria dos casos, impossibilitam

o paciente de ter uma vida normal.

1.3. O Hipocampo e o modelo de Epilepsia pós Status Epilepticus

O hipocampo é uma estrutura do lobo temporal pertencente ao

sistema límbico e bastante conservada durante o processo evolutivo. Esta

estrutura é divida em duas regiões principais: Corno de Amon, subdividida em

CA1-3 em roedores e CA1-4 em humanos, e giro denteado (GD). Grande

parte da informação do hipocampo flui através de um circuito tri-sináptico.

Neste circuito, a principal via de entrada para o hipocampo é a via perfurante

formada pelos axônios dos neurônios, cujos corpos celulares encontram-se nas

camadas II e III do córtex entorrinal. Os axônios da via perfurante fazem

sinapse com os neurônios das células granulosas do GD, as quais mandam

prolongamentos até as células piramidais da região da CA3 constituindo as

fibras musgosas. Parte dos axônios dos neurônios piramidais da região de CA3

forma as colaterais de Schaffer, as quais fazem sinapse com as células

piramidais da CA1, cujos axônios mandam a informação para o subículo e

para camada V do córtex entorrinal . Outra parte das células piramidais da

CA3 manda informação para o hipocampo contralateral, assim como outras

estruturas do cérebro (Figura 2).

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Figura 2. Esquematização do fluxo informacional no hipocampo, suas aferências,

eferências e suas regiões. Abreviações: Via perfurante (PP) porção lateral (LPP) e

porção medial (MPP); camadas III/IV do córtex entorrinal; colaterais de Schaffer (SC);

via comissural associativa (AC); cortex entorrinal medial (MEC) e cortex entorrinal

lateral (LEC).

Cerca de 90% das células hipocampais são excitatórias, fazendo parte

desta população as células piramidais da CA1-3, células granulosas do GD e

as fibras musgosas. Apenas 10% das células hipocampais são inibitórias, as

quais são interneurônios localizados, sobretudo, na região do hilus. Devido à

natureza bioquímica de suas células e o arranjo de sua circuitaria, o

hipocampo é uma das estruturas mais vulneráveis aos insultos neurológicos, tais

como: trauma, isquemia e SE (Nadler, 2003; Zhou et al., 2007). Desta forma,

vários estudos descrevem a extensa perda dos neurônios piramidais da CA1,

CA3 e hilus. Interessantemente, os axônios remanescentes destas regiões

crescem e re-estabelecem contatos sinápticos em um processo denominado

brotamento, inicialmente observado no final dos anos 60 pelos pesquisadores

Carl Cotman e Gary Lynch (para revisão veja Cotman & Lynch, 1989). Esta

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sinaptogênese reativa nunca tinha sido descrita no cérebro adulto de

mamíferos e continua sendo alvo de diversos estudos (Nadler, 2003).

O modelo da Epilepsia pós SE induzido por pilocarpina foi proposto por

Turski em 1983 e continua sendo amplamente utilizado, uma vez que este

modelo reproduz grande parte das alterações morfológicas, fisiológicas e

bioquímicas encontradas em cérebros de pacientes portadores da ELT (Turski

et al., 1983; Mello et al., 1993; Löscher, 2002). Neste modelo a injeção do

agonista colinérgico pilocarpina induz uma crise de longa duração, o SE, que

pode ser interrompido pela administração de barbitúricos ou

benzodiazepínicos. Após o término do SE, os animais entram em uma fase

onde não é observada a ocorrência de crises convulsivas; período latente ou

silencioso. Nesta fase, ocorre morte celular (neurônios e astrócitos), ativação

da micróglia e re-organização sináptica, assim como alterações na

composição das subunidades de receptores e transportadores, sobretudo no

hipocampo (Turski et al., 1983; Mello et al., 1983; Löscher, 2002; DAmbrosio,

2004; Tang et al., 2005; Kang et al., 2006). O final da fase silenciosa é marcado

pela ocorrência de crises espontâneas e recorrentes, cuja farmacologia difere

do SE inicial (Rice & DeLorenzo, 1998).

Algumas destas alterações não estão restritas ao hipocampo. De fato,

Fujikawa (1996) descreve a morte neuronal em áreas dos córtices piriforme,

entorrinal e fronto-parietal, amígdala, núcleo do septo lateral e substância

negra mesencefálica em um período que varia de 20 minutos a 72 horas após

o SE. Além disso, em um recente estudo foi observado um aumento na

quantidade de receptores no córtex de ratos 15 dias pós-SE, mas não no

hipocampo, enquanto foi observada alteração da afinidade dos receptores

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de L-Glu no hipocampo, mas não no córtex destes animais (Figura 3) (Cunha

et al., 2007)

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0 1 2 3 4 50

200

400

600Controle

Pilocarpina

Hipocampo

Glutamato (µM)

Liga

ção

espe

cífic

a (p

mol

/mg)

0 1 2 3 4 50

200

400

600

Córtex

Glutamato (µM)

Liga

ção

Espe

cífic

a (p

mol

/mg)

Figura 3. Binding do H3-L-Glutamato em membranas hipocampais e corticais de ratos Wistar 15 dias após o SE. Dados estão representados como média de triplicatas ±EPM. Cunha et al. (2007).

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Existem três hipóteses para explicar como ocorre a epileptogênese

secundária a um insulto inicial como trauma ou SE na ELT. A primeira hipótese

propõe que após o dano, as fibras musgosas se re-organizam em circuitos

excitatórios anormais, gerando uma hiper excitabilidade do tecido

hipocampal (Nadler et al., 1980). Várias evidências têm sido acumuladas em

favor desta hipótese, mostrando que as fibras musgosas de fato invadem a

camada molecular do GD, uma região que em condições normais, é evitada

por estas fibras (Buckmaster et al., 2002). A segunda hipótese propõe que as

fibras musgosas estabelecem contatos com neurônios inibitórios e neste caso o

brotamento levaria ao re-estabelecimento da atividade elétrica normal

(Sloviter, 1992). A figura 4 esquematiza um provável processo de

epileptogênese secundária levando em consideração que ambas as

hipóteses estejam corretas.

Figura 4. Esquematização da epileptogênese secundária.

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No entanto, nem todos os pacientes que sofrem insulto inicial

apresentam crises recorrentes e devido a este fato, acredita-se que fatores

internos influenciem a progressão da epileptogênese secundária. Dentre estes

fatores estariam: predisposição genética, anormalidades durante a ontogenia

e ocorrência de um segundo insulto.

O hipocampo é uma estrutura fundamental em diversos processos

fisiológicos adaptativos; movimento, sono, aprendizagem e memória. De fato,

neurônios hipocampais possuem um padrão de disparos próprios; as ondas

teta, as quais são descritas durante episódios de sono REM (do inglês Rapid Eye

Moviment). Fenômenos de plasticidade neuronal, isto é, de re-organização

sináptica, são descritos em várias regiões cérebro, mas, sobretudo no

hipocampo. É através destes fenômenos que ocorrem aumento e diminuição

da eficiência sináptica, através das LTPs e LTDs, respectivamente. Embora os

mecanismos envolvidos nos processo de plasticidade neural não estejam

completamente esclarecidos, sabe-se que eles participam da formação da

memória e na consolidação de processos de aprendizagem. Desta forma, são

necessários estudos que monitorem a função do hipocampo após dano

neuronal, estabelecendo-se os limites entre a plasticidade neuronal

adaptativa e a patológica.

1.5 As neurotoxinas de artrópodos e o desenvolvimento de novas DAs.

A natureza tem funcionado como um laboratório gigantesco ao longo

de milhões de anos de evolução, onde novas moléculas surgem e

desaparecem de acordo com o grau de adaptação que estas conferem as

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espécies. Neste sentido, animais peçonhentos, incluindo os artrópodos, têm

sido particularmente favorecidos por um arsenal de compostos bioquímicos, os

quais conferem a estes animais uma habilidade única de paralisar e/ou matar

suas presas. Estes compostos, por sua vez, ativam seletivamente estruturas de

diversos sistemas orgânicos das presas, incluindo o sistema nervoso. Quando

inoculadas, as neurotoxinas ativam ou bloqueiam um vasto espectro de

receptores para neurotransmissores inibitórios e/ou excitatórios,

transportadores, enzimas e canais iônicos (Mortari et al., 2007a). Desde a

década de 70, as neurotoxinas de artrópodos têm sido estudadas gerando um

arsenal de compostos bastante heterogêneos do ponto de vista químico e da

atividade biológica (Beleboni et al., 2004b). Entre estes compostos merecem

destaque as neurotoxinas de escorpiões, vespas e aranhas.

As peçonhas de artrópodos atuam sobre diversos sítios nos sistemas

nervosos de insetos e mamíferos, podendo causar uma grande variedade de

efeitos neurológicos (Mortari et al., 2007b). Até o momento foram descritas

algumas dezenas de compostos que atuam sobre canais iônicos como Na+, K+

e Ca2+; receptores colinérgicos, glutamatérgicos e nicotínicos, e

transportadores de L-Glu e GABA (Tabela III) (Beleboni et al., 2004b;

Stromgaard & Mellor 2004; Mortari et al., 2007a). Estes compostos são

altamente seletivos e potentes, garantindo a sobrevivência destes animais por

milhões de anos, sendo no momento, alvo de intensas pesquisas na busca por

novas substâncias neuroativas.

Até o momento, poucos compostos isolados de venenos têm sido

colocados na prática clínica. Contudo, com o uso de novas técnicas de

isolamento e síntese de análogos de compostos naturais, é provável que muito

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em breve uma nova geração de compostos neuroativos esteja à disposição

para ambos; pesquisa básica e desenvolvimento de novas estratégias

terapêuticas.

Tabela III. Compostos anticonvulsivantes isolados de venenos de artrópodos

Compostos ↓ Canais de Na+

↓ Canais de Ca2+

↑ Nt inibitória

↓ Nt excitatória

Não-conhecid

o

Aranhas

FrPbAII - - SIM -

Jorotoxin-3 - - - SIM

SrTx1.3 - - - SIM

Argiotoxin-636 - - - SIM

AG2 - - - SIM

ω-Agatoxin-IVA - SIM - -

Vespas - - -

Philanthotoxin-343

- - - SIM

Philanthotoxin-433

- - - SIM

*P. occidentalis X

*P. ignobilis - - SIM SIM

Escorpiões

BmK AE SIM - - -

Cll9 SIM - - -

Dados modificados de Mortari e colaboradores (2007). *Referência aos venenos brutos

desnaturados

1.6 A aranha Parawixia bistriata.

A aranha P. bistriata é semi-colonial, distribuindo-se pelos cerrados da

América do Sul (Figura 5). A caracterização dos componentes do veneno

desta aranha começou em nosso laboratório, quando foi observado que a

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injeção do veneno bruto em térmitas provoca paralisia destes isópteros

(Fontana et al., 2000). A ação paralisante do veneno é essencial para

sobrevivência das aranhas que paralisam suas presas, mantendo-as vivas até

serem embalsamadas e posteriormente utilizadas na sua alimentação

(Usherwood et al., 1994).

Sabe-se que a junção neuromuscular de insetos é predominantemente

composta de sinapses gabaérgicas e glutamatérgicas (Churchill et al., 2003).

Portanto, foi possível prever que os componentes do veneno de P. bistriata

apresentassem efeitos no SNC de ratos e outros mamíferos.

A B

Figura 5. A. Exemplar da aranha P. bistriata. B. Colônia coletada na região de Mococa, interior do estado de São Paulo (70 Km de Ribeirão Preto). Escala 1:0,5cm (A) e 1:3,5 cm. Fotografias dos arquivos do Laboratório de Neurobiologia e Peçonhas FFCLRP/USP.

Rodrigues e colaboradores (2001) mostraram que o veneno da P.

bistriata é heterogêneo e possui componentes com atividade farmacológica

diversificada. Esses autores demonstraram que a injeção por via i.c.v. do

veneno bruto de P. bistrita causa crises límbicas, cujas alterações

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comportamentais são bastante distintas daquelas induzidas pela injeção do

agonista glutamatérgico ácido caínico, indicando que os componentes do

veneno atuam em sítios diferentes do ácido caínico, ou há multiplicidade de

sítios de ação dos componentes convulsivantes. Quando desnaturado, o

veneno de P. bistriata diminui a recaptação do GABA em sinaptossomas de

cérebro corticais de ratos, além de bloquear crises generalizadas tônico-

clônicas induzidas pelos antagonistas gabaérgicos bicuculina, picrotoxina e

pentilenotetrazol (PTZ), quando injetados por via intracerebroventricular (i.c.v.)

em ratos Wistar (Cairrão et al., 2002).

Diversas toxinas foram identificadas do veneno de P. bistriata, como a

inosina que apresenta efeito paralisante sobre insetos e pró-convulsivante em

ratos (Rodrigues et al., 2004) e o composto Parawixina I, o qual estimula a

recaptação de L-Glu em sinaptossomas cérebro corticais de ratos, além de

atuar como neuroprotetor em modelo de lesão da retina de ratos (Fontana et

al., 2003). Um mecanismo de ação inédito para compostos isolados de veneno

foi descrito para a Parawixina I, a qual aumenta seletivamente o influxo de L-

Glu por transportadores de EET2 em liposomas reconstituídos e células COS

(Fontana et al., 2007). Segundo Torres-Salazar & Fahlke (2007) a seletividade e

especificidade da Parawixina I faz com que esta molécula possa ser

considerada como um ponto de partida para síntese de novas drogas a serem

utilizadas como terapia em patologias que envolvem alterações no sistema

glutamatérgico.

Outro composto isolado a FrPbAII, apresenta seletivamente um potente

efeito inibitório sobre a recaptação do GABA e da glicina, além de ser

anticonvulsivante contra crises agudas induzidas pela bicuculina (Cairrão et

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al., 2002), picrotoxina, pilocarpina, ácido caínico e PTZ, sem induzir toxicidade

motora na dose efetiva (Gelfuso et al., 2007). Além disso, Liberato e

colaboradores (2006) demonstraram que a FrPbAII injetada da substância

negra do mesencéfalo bloqueia crises induzidas pela estimulação da Area

tempestas do córtex piriforme e apresenta efeito ansiolítico quando injetada

no hipocampo dorsal de ratos.

Mais tarde, a estrutura química deste composto foi elucidada

juntamente com parte do seu mecanismo de ação. Foi demonstrado que a

FrPbAII inibe a captação de alta afinidade de GABA e glicina sem alterar a

atividade dos canais de íons de Na+, K+ e Ca2+, dos receptores de GABA, da

GABA transaminase ou sobre o transporte reverso deste neurotransmissor. Além

disso, quando injetada por via endovenosa, em ratos Wistar, a FrPbAII

apresentou efeito neuroprotetor nas camadas nuclear interna e nuclear

externa da retina após lesão causada por isquemia e isquemia/reperfusão

(Beleboni et al., 2006). Recentemente, foi constatado que a injeção intra-vítreo

deste composto protege de maneira dose dependente todas as camadas

retinianas de ratos, após isquemia e isquemia seguida de reperfusão. Neste

mesmo paradigma quando comparada ao ácido nipecótico, observou-se

que a FrPbAII é cerca de 100 vezes mais potente que este inibidor específico

do transportador de GABA GAT1 (Dados não publicados).

Apesar de encorajadores, os resultados obtidos com o estudo dos

compostos de baixo peso molecular do veneno da aranha P. bistriata, são

preliminares. Por outro lado, apenas uma pequena parte destes compostos foi

avaliada até agora.

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Em conclusão, se faz necessário investigar o potencial terapêutico dos

compostos presentes já isolados bem como aqueles ainda não identificados

na peçonha de P. bistriata. Estes estudos podem fornecer novas alternativas

para prospecção de drogas neuroativas, bem como novas ferramentas para

investigação de processos patológicos.

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Objetivos

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2. Objetivos Gerais

Tendo em vista as potencialidades farmacológicas do composto FrPbAII

como inibidor do transporte de GABA e glicina, bem como da grande

necessidade de buscar novas alternativas de substâncias neuroativas, os

objetivos do presente trabalho foram:

• Analisar a atividade neuroprotetora do composto FrPbAII, após a

indução de SE pela injeção intra-hipocampal de pilocarpina,

comparando-se às drogas: diazepam, fenitoína, carbamazepina,

cetamina e ácido nipecótico.

Para tanto,

1. Foi avaliada a atividade neuroprotetora do composto durante a

fase inicial da epileptogênese, no período de 15 dias após a

indução do SE, neste caso, foram utilizados histologia com coloração

por HE e/ou violeta de cresila para contagem de células, bem como

o marcador astrocítico GFAP.

2. Foi avaliado o aspecto funcional do hipocampo submetido ao SE,

duas semanas após as crises, no teste de memória espacial

utilizando-se o labirinto aquático de Morris.

3. Foi avaliada a ocorrência de crises espontâneas durante o período

experimental através de janelas de observação.

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Material e Métodos

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3. Material e Métodos

Todos os protocolos experimentais envolvendo animais foram

estabelecidos conforme as diretrizes para o uso de animais em pesquisa

segundo o Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA). Este

trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética para o Uso de Animais (CEUA) do

Campus de Ribeirão Preto (Protocolo nº 06.1.605.53.8).

3.1 Coleta das aranhas, purificação de veneno e isolamento da FrPbAII

3.1.1. Coleta da aranha Parawixia bistriata

As coletas dos espécimes foram realizadas no perímetro rural de

municípios vizinhos a Ribeirão Preto (SP). A ulterior extração de glândulas foi

realizada com auxilio de pinça e tesoura oftálmicas, sendo o material

armazenado a 70o C até posterior utilização.

3.1.2. Purificação do composto FrPbAII

Quatro mil e quinhentas glândulas de peçonha foram maceradas e

homogeneizadas, formando um extrato, ao qual foram adicionados 100 µL de

água Milli Q. A suspensão foi centrifugada por 20 min a 10.000 xg, a 4o C

(Centrífuga Sorvall RC2-B, rotor SS-34). O sobrenadante foi filtrado em filtro de

13 mm de diâmetro, com membrana PVDF de 0,45 µm de poro (Millipore) e em

seguida filtrado novamente em filtro Microcon (cutoff= 3000 Da, Millipore).

Finalmente o extrato contendo apenas compostos de baixa massa molecular

foi liofilizado, pesado e ressuspendido em água Milli Q.

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3.1.3. Etapas de isolamento em Cromatografia Liquida de Alta Eficiência

(CLAE)

As preparações das amostras a serem injetadas no cromatógrafo

líquido foram realizadas a partir de extratos contendo 1000 glândulas de

peçonha. Na primeira fase de purificação, o extrato liofilizado foi

ressuspendido em 1 mL de água. A fração ativa foi obtida por CLAE de acordo

com Beleboni et al. (2006) com modificações.

Para o processo de separação foram escolhidas como fases móveis,

água Milli Q, pH = 5.5 (Fase A) e acetonitrila (ACN) (MERCK grau CLAE) (Fase B)

utilizando-se uma coluna de fase reversa (C18 ODS, 15 µm, 20 x 250 mm

Phenomenex, Torrence). Após equilíbrio, 2.0 mL da peçonha (40 mg/mL) foram

aplicados para cada cromatografia. A eluição foi feita com ACN e TFA por um

gradiente isocrático de 1% ACN/água + TFA 0,1% por 10 minutos, seguido de

gradiente linear de 2-60% de ACN/água + TFA 0,1% por 50 min. O fluxo

empregado foi de 8 mL/min e o eluato monitorado a 215 nm. As frações foram

coletadas, liofilizadas, pesadas e monitoradas em espectrômetro de massa. A

fração ativa foi então submetida à segunda etapa de purificação, como

segue.

Setenta microlitros da fração FrPbAI (1,37 mg/mL) foram filtrados em

membrana PVDF (0,45 µm) e aplicados em cada uma das cromatografias

realizadas. Para o processo utilizou-se de uma coluna analítica do tipo Shim-

pack CLC-C8 (M) (4,6 x 250 mm, 5 µm), com pré-coluna LC, Shim-pack, CLC G-

C8 (4 x 10 mm) em modo isocrático com H2O/Metanol/TFA (99:1:0,1) (MERCK,

grau CLAE) por 8 min. O fluxo empregado foi de 1 mL/min e a detecção dos

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picos em 215 nm. Ao final foram obtidas cinco frações, as quais foram

liofilizadas e armazenadas a 200C para os experimentos posteriores.

3.1.4. Espectrometria de massa

A determinação do grau de pureza da fração que continha a FrPbAII

foi realizada em um espectômetro de massa de alta resolução (UltrOTOF -

Bruker Daltonics, Billerica, USA). As frações da segunda cromatografia foram

injetadas utilizando-se uma micro-seringa acoplada a uma bomba de infusão

por um fluxo de 10 kL/min. O intervalo da varredura foi de m/z 50-2000 Quattro-

LC da Micromass (Manchester, UK). Uma vez constatada a pureza do

composto, este foi ressuspendido em salina 0.9% para a realização dos ensaios

biológicos (Figura 6).

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Figura 6. Fluxograma ilustrando as etapas experimentais para obtenção do composto

FrPbAII. Fotografias dos arquivos do Laboratório de Neurobiologia e Peçonhas

FFCLRP/USP.

A primeira etapa de isolamento e espectrometria de massa foi realizada no laboratório do Prof. Dr. Norberto Peporine Lopes (FCFRP-USP). A segunda etapa de isolamento foi realizada no laboratório do Prof. Dr. René de Oliveira Beleboni (Biotecnologia UNAERP).

3.2. Bioensaios

3.2.1. Animais

Foram utilizados ratos Wistar machos (200 a 250 g), adquiridos no Biotério

Central da Universidade de São Paulo, Campus de Ribeirão Preto, os quais

foram acondicionados dois a dois em gaiolas e mantidos em biotério de

manutenção do Departamento de Biologia com ciclo claro/escuro de 12/12hs

(luzes às 7:00), temperatura (25 °C) e umidade (55%) controladas. Foram

oferecidas água e alimentação ad libitum.

3.2.2. Cirurgia

Os ratos (n=6-15, por grupo) foram anestesiados com tiopental sódico

(40 mg/kg, intraperitoneal) para a implantação de uma cânula guia no

hipocampo dorsal (CA1) e outra no ventrículo lateral direito. Foi utilizado um

estereotáxico (Stoelting-Standard), sendo que a introdução das cânulas seguiu

as coordenadas do hipocampo dorsal (AP: -3.8 mm; ML: -1.6 mm e DV: -2.8

mm) e ventrículo lateral (AP: -0.9 mm; ML: - 2.0 mm e DV: -3.4 mm) de acordo

com Paxinos & Watson (1986). As duas cânulas e dois parafusos foram fixados

aos crânios dos animais com acrilato dental. Após a polimerização do

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cimento, as cânulas foram seladas com fio de aço inoxidável evitando

obstrução das mesmas.

3.2.3. Drogas

Para indução de crises foi utilizado hidrocloreto de pilocarpina (Sigma)

injetado por via intrahipocampal. Para o tratamento subcrônico, foram

utilizados: diazepam (Sanofi-sinthelabo), fenitoína (Hidantal - Hoechst Marion

Roussel), carbamazepina (Tegretol - Novartis Biociências), cetamina (Ketalar

Parke Davis Warner Lambert) sendo estes últimos injetados por via

intraperitoneal (i.p.).e ácido nipecótico (Sigma-Aldrich-EUA) injetado por via

i.c.v.

3.2.4. Indução do SE.

Após 5-7 dias da cirurgia, os animais foram injetados por via

intrahipocampal com pilocarpina (2.4 mg/µL) sendo, então, observada a

latência para o início do SE. Três horas após o início das crises, o SE foi

interrompido pela injeção i.p. de tiopental sódico (30mg/kg). Os animais que

não apresentaram SE foram descartados do estudo.

O critério de definição do SE se baseia na tabela de classificação de

crises límbicas de Racine (1972) (Tabela IV).

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Tabela IV. Critérios comportamentais para classificação das crises límbicas.

Classe Comportamentos

1 Movimentos orofaciais, piscar de olhos

2 Mioclonia de cabeça e/ou movimentos clônicos faciais severos

3 Mioclonia dos membros anteriores

4 Convulsões clônicas dos membros anteriores com elevação

5 Convulsões tônico-clônicas generalizadas associadas à perda do

controle postural

Modificado de Racine e colaboradores (1972).

Uma hora após a interrupção do SE, os animais foram tratados com

salina, cetamina (CET, 50 mg/kg, i.p.), diazepam (DZP, 2 mg/kg, i.p.),

carbamazepina (CBZ, 120 mg/kg, i.p.) e fenitoína (FEN, 60 mg/kg, i.p.), ácido

nipecótico (Ác NIPE, 4 µg/µL, 3 µL) ou diferentes doses da FrPbAII (0.037; 0.074;

0.15 µg/µL, 1 µL) sendo, estes tratamentos, mantidos por quatro dias no mesmo

horário. O tratamento foi interrompido dois dias antes do início do teste no

labirinto aquático de Morris.

Durante o mesmo período de tempo, ratos não submetidos ao SE (n=5-6

por grupo) receberam os mesmos tratamentos, sendo subseqüentemente

testados no labirinto aquático, descartando-se a hipótese de efeitos colaterais

das próprias drogas.

Os ratos submetidos ao SE foram filmados em 8 períodos de uma hora

por dia escolhidos aleatoriamente, por todo período experimental para

verificação da incidência de crises recorrentes. Os animais que apresentaram

crises durante o teste cognitivo foram descartados deste teste, evitando-se

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efeito das crises sobre o experimento. No entanto, os animais submetidos ao

labirinto aquático foram observados após o teste para incidência de crises.

3.2.5. Ensaios comportamentais no labirinto Aquático de Morris

Duas semanas após indução do SE, os animais foram submetidos ao

teste do labirinto aquático de Morris (Morris et al., 1982). Este se constitui de

uma piscina circular em polietileno azul (1.40 cm de diâmetro e 50 cm de

profundidade) onde foi acrescentada água (23 °C) até uma altura de 25 cm e

2000 mL de leite impedindo a visão da plataforma. Uma plataforma branca de

9 cm de diâmetro foi localizada no quadrante na região sudeste. Referências

visuais foram colocadas nas paredes da sala onde se encontra o labirinto

aquático (Figura 7).

Figura 7. Labirinto aquático de Morris. Piscina com plataforma no quadrante de

número 1, com pistas visuais nas paredes da sala. Adaptado do site

http://www.btc.bol.ucla.edu.

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Foram feitos 6 treinamentos por dia por quatro dias consecutivos, sendo

registradas as latências de escape até a plataforma. Os ratos foram

colocados em posições diferentes nas laterais da piscina para cada sessão de

treinamento, de costas para a plataforma e deixados por 90 segundos ou até

o encontro da mesma. Caso o animal não conseguisse achar a plataforma

este foi colocado e mantido na mesma por 30 segundos, após os quais foi

novamente colocado na água na posição subseqüente (Tabela V).

Tabela V. Protocolo experimental no labirinto aquático de Morris.

Ordem das tentativas

Dias 1a 2a 3a 4a 5a 6a

1 2 4 3 4 2 3

2 4 2 3 4 2 6

3 4 3 2 4 3 2

4 3 2 4 2 3 4

Número do quadrante do labirinto para o posicionamento dos animais de acordo com cada tentativa.

No quarto dia, ao final do treinamento, a plataforma foi retirada da

água para realização do probe trial. O teste consiste de determinar a

ocupação do labirinto pelo animal, verificando quanto tempo este passa em

cada quadrante, na ausência da plataforma. O percurso dos animais foi

traçado manualmente.

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3.3. Procedimentos histológicos

Após o término dos experimentos, os animais receberam uma overdose

de tiopental sódico, sendo perfundidos intracardiamente através do ventrículo

esquerdo. O sangue foi lavado com solução salina a 0,9% (40 mL a 4ûC), e em

seguida foram perfundidos 200 mL de formaldeído a 4% (tampão fosfato 0,5 M;

pH 7.4, gelado) por 15 min a uma pressão de 50 mmHg. Os cérebros foram

extraídos sendo desconectados do cerebelo e bulbos olfatórios e fixados em

solução de formaldeído a 4% por 12 horas. Os cérebros dos animais dos grupos

controles (drogas antiepilépticas, pilocarpina e salina) foram então submetidos

a uma bateria de desidratação para inclusão em parafina. Os blocos foram

então seccionados em cortes de 10 µm em um micrótomo Spencer 820

(American Optical Corporation, EUA) para procedimento de coloração por

HE.

Os cérebros dos animais tratados com o ácido nipecótico, a FrPbAII,

salina e pilocarpina sem pós-tratamento foram colocados em solução de

sacarose a 30% (tampão fosfato 0.1M) por 48 horas após fixação em

formaldeído. O excesso de tecido adjacente ao hipocampo foi retirado e os

tecidos a serem examinados foram imersos em 2-metilbutano (Sigma-Aldrich,

EUA), congelados em gelo seco por 30 min, cobertos por Tissue Tek e então

cortados em secções seriadas de 50 µm de espessura utilizando-se um

criostato (Leica, Alemanha). Cortes foram montados em lâminas gelatinizadas

sendo então submetidos à coloração por cresil violeta.

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3.4. Imunofluorescência

3.4.1. Secções em parafina

Os cortes em parafina foram submetidos à desparafinização e re-

hidratação (xilol I e II; seguidos de álcool+xilol; álcool absoluto I e II; álcool a 95,

90, 80 e 70%; água ultrapura e tampão PBS 0.05M, pH 7.6 com BSA a 1%). Os

cortes foram colocados em solução de PBS com BSA a 2% e Triton-X a 0.5%,

para o 1º bloqueio de ligações inespecíficas por 30 min em temperatura

ambiente. A seguir, os cortes foram mergulhados em solução de PBS com BSA

a 1% e Triton-X a 0.1% e deixados em geladeira (aproximadamente 4oC) até o

dia seguinte (2º bloqueio).

No dia seguinte, os cortes foram trazidos a temperatura ambiente e

incubados com o anticorpo primário anti-GFAP (Dako, EUA) diluído (1:500) na

mesma solução do 1º bloqueio por duas horas à 37oC. Em seguida, os cortes

foram lavados com PBS por 6 vezes de 5 min cada, quando foram então

incubados com o anticorpo secundário. Para tanto, o anticorpo secundário

anti-IgG de camundongo com FITC (Dako, USA) foi diluído (1:200) em solução

utilizada no 2º bloqueio, sendo aplicado aos cortes recém-lavados em PBS. O

tempo de incubação com o anticorpo secundário foi 1 hora em temperatura

de 37oC. Ao término do tempo de incubação, os cortes foram lavados em

tampão por 3 vezes de 10 min, sendo as lâminas montadas em solução

etanólica de glicerol a 50%.

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3.4.2. Secções congeladas

Um dia após o corte, as lâminas mantidas em geladeira foram trazidas à

temperatura ambiente para imunomarcação. A técnica de

imunofluroescência utilizada, se inicia com uma lavagem dos cortes em

solução PBS (0.05 M, pH 7.6) por duas horas, sendo a solução trocada e os

cortes mantidos em PBS até o dia seguinte em geladeira.

No dia seguinte, os cortes foram lavados em solução PBS e depois em

PBS com glicina (0.1 M) por 3 min.O próximo passo consiste em bloquear as

ligações inespecíficas utilizando-se solução de BSA a 1% por 30 min à 37oC. Os

cortes são então incubados com anticorpo primário anti-GFAP, diluído (6:1000)

em solução PBS com BSA a 1% por 2 hs a 37oC. Ao término deste período, os

cortes foram incubados com o anticorpo secundário previamente diluído em

PBS (20:1000) centrifugado a 10000g, a 4oC, por 10 min. Nesta etapa, o tempo

de incubação foi de 30 min a 37oC, ao término do qual, os cortes foram

lavados em solução PBS por 6 vezes de 5 min. As lâminas foram montadas com

solução etanólica de glicerol 50%. Para ambos os protocolos, todo o manuseio

do anticorpo secundário fluorescente foi feito em escuro, evitando-se

exposição à luz.

3.5. Análise do Dano Neuronal

3.5.1. Análise Qualitativa, Quantitativa e imunofluorecência.

Para cada animal de cada grupo foram selecionados três cortes da

formação hipocampal. Foram capturadas, em cada um dos cortes

selecionados, imagens de toda a extensão da camada de células piramidais

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das regiões CA1 e CA3 e da camada de células granulares do GD. Deve-se

salientar que os cortes selecionados encontravam-se nas mesmas

coordenadas estereotáxicas (que variaram de -3,14 mm a -4,52 mm, a partir

do bregma), segundo Paxinos e Watson (1986).

O procedimento de captura de imagem foi realizado utilizando-se um

sistema constituído por uma câmera digital colorida da Leica (DFC300 FX)

conectada a um microscópio (DM 5000 B, Leica Microsytems Alemanha) e a

um computador. As imagens obtidas foram capturadas utilizando uma

objetiva com aumento de 40x e foram obtidas em média seis imagens de

cada região selecionada.

Para análise histopatológica qualitativa, observou-se a presença de

traços histológicos correspondentes a lesão neuronal: edema extracelular,

vacuolização, núcleos picnóticos e grau de desorganização das camadas

piramidais da CA1 e CA 3 e camada granular do GD.

Os neurônios viáveis foram contados manualmente por meio de seleção

feita com ou auxilio do software Q-Win (Leica Microsytems Alemanha). Este

programa também foi utilizado para medir as áreas analisadas. O número

estimado de células viáveis (n) foi determinado pela média dos valores de três

secções adjacentes. O número real de células foi calculado utilizando-se o

método de correção de Abercrombie (1949):

N (por mm2) = n [T/(T+D)] /A

onde N é o número real de células, T é a espessura da secção (10 ou 50 µm), D

é o diâmetro médio de cada núcleo na população da amostra, o qual foi

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medido em uma ampliação de 1000X; e A é área medida (em mm2) de cada

região hipocampal. Os valores obtidos foram expressos como a média das

densidades (neurônios/mm2 ± E.P.M) (Kwak et al., 2005).

A imunofluorescência foi analisada de foram subjetiva, considerando-se

o aspecto das células marcadas e grau de marcação dos prolongamentos e

corpo celular.

Na figura 8 temos um resumo das etapas do bioensaio conduzido no

presente trabalho, bem como o tempo duração de cada etapa.

3.6. Análise estatística

As contagens de células para cada área foram submetidas ao teste de

análise de variância de uma via (ANOVA), seguido pelo pós-teste de Tukey. Os

dados do labirinto aquático de Morris foram analisados através do teste de

ANOVA de medidas repetitivas, seguido do pós-teste de Tukey. As freqüências

de animais que apresentaram crises recorrentes em cada grupo foram

comparadas utilizando-se o teste de qui-quadrado. Todos estes dados foram

demonstrados como média ± EPM e as análises foram feitas utilizando-se o

programa SPSS, versão 13.0 (EUA, 2004).

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Figura 8. Fluxograma mostrando as etapas da parte experimental do trabalho. Cirurgia

extereotáxica para o implante de cânula no Hipocampo; indução do SE; teste

cognitivo e secção histológica do hipocampo. Fotografias dos arquivos do Laboratório

de Neurobiologia e Peçonhas FFCLRP/USP.

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Resultados

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4. Resultados

4.1. Purificação do composto FrPbAII

Após equilíbrio do sistema de CLAE, 1 mL da solução de peçonha bruta

(40 mg/mL) foi filtrado (cutoff <3000Da) e aplicado em coluna de fase reversa

preparativa (C18). O perfil cromatográfico obtido revelou a presença de 12

frações, os quais foram monitorados em espectrômetro de massa. A fração

assinalada (FrPbAI), contendo o composto FrPbAII foi então recromatografada

(Figura 9A).

A segunda etapa de isolamento revelou 4 picos (Figura 9B), os quais

foram injetados novamente em espectrômetro de massa para detecção da

localização e pureza do composto FrPbAII.

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Figura 9. A. Perfil cromatográfico do veneno de P. bistriata com componentes com

massas moleculares menores que 3000 Da. Cromatografia em coluna C-18 preparativa

com gradiente linear de 0-1% de B por 10min e 1-60% de B por 50 min. Os picos estão

numerados sendo o pico correspondente a fração ativa o de número 1 (FrPbAI). B.

Perfil cromatográfico da recromatografia da fração FrPbAI. Coluna de fase reversa

CLC-C8 (M) (4,6 x 250 mm, 5 µm) e pré-coluna C8 (4 x 10 mm), em modo isocrático

H2O/MeOH/TFA (99/01/0,1% v/v). Fluxo de eluição: 8,0 e 1,0 mL/min, para 1ª e 2ª etapas

monitoramento à 215 nm. * Representa FrPbAII.

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4.2. Espectrometria de massa de alta resolução

O espectro de ESI-MS do composto FrPbAII mostrou alto grau de pureza,

contendo um pico com m/z 175,1258 Da (M+H+) (Figura 10). A estrutura

primária do composto foi, então, proposta com base em ressonância

magnética.

Figura 10. Perfil de espectrometria de massa de alta resolução do composto FrPbAII

com sua estrutura, inferida por ressonância, mostrada no alto da figura.

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4.3. O SE induzido por pilocarpina e o tratamento

Aproximadamente 30 minutos após a injeção de pilocarpina por via

intra-hipocampal, cerca de 70% dos animais apresentaram convulsões

epilépticas. Os primeiros sinais consistiram de automatismos orofaciais,

acinesia, mioclonias localizadas e tremores no corpo. Este quadro evoluiu para

hipersalivação, mioclonias generalizadas, elevação e queda límbica (Classe 5

de Racine). Além disso, alguns animais apresentaram corridas e pulos (Figura

11 A-D).

Na maioria dos animais as crises foram revertidas 3 horas após o início

do SE com a aplicação de tiopental e em um pequeno número de animais as

crises foram revertidas espontaneamente. No caso de reversão espontânea

do SE, optou-se pela exclusão dos animais, evitando-se resultados falsos

positivos.

Com relação ao tratamento, não foram observadas reações adversas

severas após a administração das drogas, com exceção da cetamina que

induziu nos animais uma marcante depressão respiratória freqüentemente

acompanhada de ataxia.

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Figura 11. Efeitos comportamentais da injeção por via intrahipocampal do agonista

colinérgico pilocarpina. (A) Observa-se um animal com acinesia inicial, cerca de 15

minutos após a injeção de pilocarpina. Este quadro é seguido de mioclonias

localizadas, principalmente dos membros anteriores (B). A seguir, pode-se observar

elevação e queda límbica (C) acompanhada freqüentemente por hipersalivação (D).

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4.4. Labirinto Aquático de Morris

Após os 4 dias de treinamento, os animais epilépticos submetidos ao

teste do labirinto aquático de Morris apresentaram dificuldade em encontrar a

plataforma de escape. Na figura 12 podem ser observadas as trajetórias que

animais sadios e epilépticos percorrem após algumas sessões de treinamento.

No caso de animais sadios foram necessárias em média 4 sessões de treino

enquanto para os animais epilépticos 24 sessões não foram suficientes para

diminuir a latência de escape para plataforma. É interessante ressaltar que, a

maioria dos animais epilépticos nada junto à parede da piscina durante todas

as sessões de teste.

A B

Figura 12: Trajetórias desenvolvidas pelos animais no labirinto aquático de Morris. A.

Animais sadios. B. Animais epilépticos 7 dias após o SE após algumas sessões de treino;

4 sessões para os animais sadios e 4 dias de treino para os epilépticos. Trajetos

traçados manualmente e digitalizados.

Neste sentido, o teste de ANOVA de medidas repetitivas revelou

diferenças estatisticamente significantes com relação ao parâmetro sessões

de treino [F(3,49) = 46.529 p<0.001] e tratamento [F(10,53) = 10.620 p<0.001],

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bem como a relação à interação treino versus tratamento [F(27,143) = 1.681

p=0.028].

As análises de ANOVA de uma via realizadas para cada dia de treino

revelaram que no primeiro dia, os animais epilépticos tratados com salina,

fenitoína e FrPbAII (0.037 µg/µL), tiveram suas latências de escape

estatisticamente maiores que as latências dos animais não operados e

injetados com salina [F(10,53)=5.853; p=0.002). Os mesmos resultados foram

encontrados para o segundo dia de treino. Além disso, foi observada uma

diminuição nas latências de escape dos animais epilépticos pós-tratados com

diazepam e ácido nipecótico em comparação com os animais epilépticos

pós-tratados com salina [F(10,53)=6.788; p<0.001).

No terceiro dia, observou-se uma diminuição na latência de escape dos

animais epilépticos tratados com diazepam, carbamazepina, ácido

nipecótico e FrPbAII (0,15µg/µL). Estes animais encontraram a plataforma tão

rapidamente quanto os animais não epilépticos ou não operados, em

contraste com os ratos epilépticos não tratados assim como os animais

tratados com a menor dose da FrPbAII [F(10,53)= 5.853; p=0<0.0001]. No quarto

dia de treino, verificou-se que as médias das latências de escape para os

animais epilépticos tratados com a FrPbAII nas doses 0.15 e 0.075 µg/µL, assim

como os animais pós-SE tratados com diazepam, ácido nipecótico e

carbamazepina foram estatisticamente menores que as médias dos animais

epilépticos sem tratamento e tratados com a menor dose da FrPbAII [F(10,53)=

8.607; p<0,0001]. As latências de escape observadas durante os dias de

treinamento de todos os tratamentos estão sumarizadas nas figuras 13 e 14.

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Figura 13: Médias (±EPM) das latências de escape para encontrar a plataforma durante o 1º e 2º. dias de treinamento no labirinto aquático de Morris. No gráfico estão representados como controles sadios: os animais do grupo não operado (sham) (a), animais não submetidos ao SE injetados com salina (canulados) (b). Ainda, animais submetidos ao SE e pós-tratados com salina (SE+Salina)(c), diazepam (SE+DZP), carbamazepina (SE+CBZ), fenitoína (SE+FEN), cetamina (SE+CET), ácido nipecótico (SE+Ác NIPE) e FrPbAII 0.15; 0.075 e 0.037 µg/µL. Dados foram analisados pelo teste de MANOVA, seguido de ANOVAs de uma via para cada dia de teste. Foi utilizado o teste de Tukey como pós-tese. *p<0.05.

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Figura 14: Médias (±EPM) das latências de escape para encontrar a plataforma durante o 3º. e 4º. dias de treinamento no labirinto aquático de Morris. No gráfico estão representados como controles sadios: os animais do grupo não operado (sham) (a), animais não submetidos ao SE injetados com salina (canulados) (b). Ainda, animais submetidos ao SE e pós-tratados com salina (SE+Salina)(c), diazepam (SE+DZP), carbamazepina (SE+CBZ), fenitoína (SE+FEN), cetamina (SE+CET), ácido nipecótico (SE+Ác NIPE) e FrPbAII 0.15; 0.075 e 0.037 µg/µL. Dados foram analisados pelo teste de MANOVA, seguido de ANOVAs de uma via para cada dia de teste. Foi utilizado o teste de Tukey como pós-tese. *p<0.05 e **p<0.01..

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Durante o probe trial com a plataforma retirada, latências de escape

dos ratos epilépticos tratados com salina diferiram estatisticamente das

latências daqueles dos grupos sham e injetados com salina, bem como as dos

animais epilépticos tratados com o diazepam, ácido nipecótico,

carbamazepina e a dose mais alta da FrPbAII (0.15 µg/µL) [F(10,53)=3,936, p=

0.0008] (Figura 15).

Figura 15: Médias (±EPM) das latências de escape para encontrar a plataforma

durante o probe trial no labirinto aquático de Morris. No gráfico estão representados

como controles sadios: os animais do grupo não operado (sham) (a), animais não

submetidos ao SE injetados com salina (canulados) (b). Ainda, animais submetidos ao

SE e pós-tratados com salina (SE+Salina)(c), diazepam (SE+DZP), carbamazepina

(SE+CBZ), fenitoína (SE+FEN), cetamina (SE+CET), ácido nipecótico (SE+Ác NIPE) e

FrPbAII 0.15; 0.075 e 0.037 µg/µL. Dados foram analisados pelo teste de ANOVAs de

uma via, sendo utilizado o teste de Tukey como pós-tese. *p<0.05,**p<0.01 e

***p<0.001.

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Para descartar possíveis efeitos das próprias drogas sobre o

desempenho dos animais, grupos de animais sadios foram tratados com cada

uma das drogas de acordo com o mesmo protocolo experimental. Neste

sentido, o teste de MANOVA revelou um forte efeito das sessões de treino

[F(3,21)=60,314 p<0.0001], mas não apontou diferenças entre tratamentos

[F(5,29)= 1,613 p=0,205], nem em relação a interação treino vs tratamento

[F(12,69)=0,844 p=0.606] (figura 16)

Figura 16: Médias (±EPM) das latências de escape para encontrar a plataforma

durante os quatro dias de treino no labirinto aquático de Morris dos animais controles

injetados com diazepam (DZP), cetamina (CET), carbamazepina (CBZ), fenitoína (FEN),

ácido nipecótico (Ác NIPE) e FrPbAII 0.15 µg/µL (Fr0,15). Dados foram analisados pelo

teste de ANOVA de medidas repetitivas.

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Considerando-se a retenção espacial, animais epiléticos tratados pós-SE

com salina permaneceram o mesmo tempo nos quatro quadrantes da piscina,

enquanto os animais dos grupos sham e injetado com salina, apresentaram

preferência pelo quadrante onde se encontrava a plataforma. Desta forma, o

teste de ANOVA de medidas repetitivas revelou efeito significativo da escolha

do quadrante [F(3,49)= 38.401 p<0.001], dos tratamentos [F(10,53)= 5.092,

p<0.05] e da interação quadrante versus tratamento [F(27,143)= 2.208,

p=0.003]. Os pós-testes indicaram que os animais não operados, injetados com

salina assim como os animais tratados pós-SE com o diazepam e com a dose

mais alta da FrPbAII passaram mais tempo no quadrante alvo do que os

demais grupos de animais [F(10,53)= 4.336, p<0.05].

Figura 17: Médias (±EPM) dos tempos de permanência dos animais no quadrante-alvo

(plataforma). No gráfico estão representados como controles sadios: os animais do

grupo não operado (sham) (a), animais não submetidos ao SE injetados com salina

(canulados) (b). Ainda, animais submetidos ao SE e pós-tratados com salina

(SE+Salina)(c), diazepam (SE+DZP), carbamazepina (SE+CBZ), fenitoína (SE+FEN),

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cetamina (SE+CET), ácido nipecótico (SE+Ác NIPE) e FrPbAII 0.15; 0.075 e 0.037

µg/µL.Dados foram analisados utilizando-se ANOVA de medidas repetitivas. ANOVAs

de uma via foram utilizados para a análise da permanência em cada um dos

quadrantes, tendo aplicando-se em seguida o teste de Tukey, como pós-teste. Foi

considerado p<0.05(*).

4.5. Análise histopatológica

4.5.1. Análise histopatológica qualitativa

Representações das secções histológicas das regiões hipocampais

analisadas nos grupos controles e tratados estão mostrados nas figuras 18 a 22.

Neste sentido, os cortes histológicos de animais epilépticos não-tratados

e sacrificados 18-20 dias após indução do SE, apresentaram perda neuronal,

núcleos picnóticos, vacuolização e edema extracelular nas áreas da CA1

(Figuras 18B e 19B), CA3 (Figuras 20B e 21B) e hilus. Além disso, observou-se

desorganização da camada piramidal destas regiões. Em contraste, na

camada granulosa do GD podem-se observar células resistentes, não obstante

a presença de núcleos picnóticos e perda moderada de células (Figuras 22B e

23B).

Com relação aos tratamentos, os hipocampos dos animais submetidos

ao SE e tratados com a carbamazepina, fenitoína e cetamina apresentam

proliferação da micróglia e raros núcleos picnóticos nas regiões da CA1

(Figuras 18C-F e 19C-F) e CA3 (Figuras 20C-F e 21C-F). Dados semelhantes

foram encontrados com relação aos hipocampos dos animais tratados com as

duas doses mais baixas da FrPbAII (0.075 e 0.037µg/µL). Em contraste, os

hipocampos dos animais tratados com diazepam, ácido nipecótico e FrPbAII

(0.15 µg/µL) apresentaram as camadas piramidais organizadas, pequena

quantidade de núcleos picnóticos e células da micróglia.

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Figura 18: Cortes histológicos representativos do hipocampo na região da CA1. A.

Animais do grupo controle não-epilépticos. Animais experimentais 20 dias após

indução do SE. B. Pós-tratados com salina, cetamina (C), diazepam (D),

carbamazepina (E) e fenitoína (F). Setas pretas indicam células gliais, enquanto setas

amarelas indicam núcleos picnóticos. Secções em parafina de 10 µm cortadas em

micrótomo, visualizadas em um aumento de 400x. Coloração por HE.

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Figura 19: Cortes histológicos representativos do hipocampo na região da CA1. A.

Animais do grupo controle não-epilépticos. A seguir, animais experimentais 20 dias

após indução do SE. B. Pós-tratados com salina, ácido nipecótico (C), FrPbAII 0,15 (D),

FrPbAII 0,075 (E) e FrPbAII 0,037 µg/µL (F). Setas pretas indicam células gliais, enquanto

setas amarelas indicam núcleos picnóticos. Secções de 50 µm cortadas em criostato,

visualizadas em um aumento de 400x. Coloração por cresil violeta.

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Figura 20: Cortes histológicos representativos do hipocampo na região da CA3. A.

Animais do grupo controle não-epilépticos. Animais experimentais 20 dias após

indução do SE. B. Pós-tratados com salina, cetamina (C), diazepam (D),

carbamazepina (E) e fenitoína (F). Setas pretas indicam células gliais, enquanto setas

amarelas indicam núcleos picnóticos. Em E círculo delimita área de proliferação da

micróglia. Secções em parafina de 10 µm cortadas em micrótomo, visualizadas em um

aumento de 400x. Coloração por HE.

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Figura 21: Cortes histológicos representativos do hipocampo na região da CA3. A.

Animais do grupo controle não-epilépticos. A seguir, animais experimentais 20 dias

após indução do SE. B. Pós-tratados com salina, ácido nipecótico (C), FrPbAII 0,15 (D),

FrPbAII 0,075 (E) e FrPbAII 0,037 µg/µL (F). Setas pretas indicam células gliais, enquanto

setas amarelas indicam núcleos picnóticos. Secções de 50 µm cortadas em criostato,

visualizadas em um aumento de 400x.. Coloração por cresil violeta.

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Figura 22: Cortes histológicos representativas do hipocampo na região da GD. A.

Animais do grupo controle não-epilépticos. Animais experimentais 20 dias após

indução do SE. B. Pós-tratados com salina, cetamina (C), diazepam (D),

carbamazepina (E) e fenitoína (F). Setas pretas indicam células gliais, enquanto setas

amarelas indicam núcleos picnóticos. Em E, um círculo delimita área de proliferação

da micróglia. Secções em parafina de 10 µm cortadas em micrótomo, visualizadas em

um aumento de 400x. Coloração por HE.

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Figura 23: Cortes histológicos representativos do hipocampo na região do GD. A.

Animais do grupo controle não-epilépticos. A seguir, animais experimentais 20 dias

após indução do SE. B. Pós-tratados com salina, ácido nipecótico (C), FrPbAII 0,15 (D),

FrPbAII 0,075 (E) e FrPbAII 0,037 µg/µL (F). Setas pretas indicam células gliais, enquanto

setas amarelas indicam núcleos picnóticos. Secções de 50 µm cortadas em criostato,

visualizadas em um aumento de 400x.. Coloração por cresil violeta. *indica o hilus do

GD.

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4.5.2. Análise quantitativa do dano neuronal

Os dados das estimativas das densidades neuronais estão

demonstrados na figura 24 como porcentagem de perda de células. Esta

porcentagem foi calculada com relação à média da densidade de

neurônios/mm2 dos animais sadios de cada procedimento histológico;

incluídos em parafina ou cortados em criostato. Para a análise estatística, no

entanto, os dados brutos (nr de neurônios/mm2) foram tratados

separadamente, como descritos a seguir.

Observou-se que os cérebros de animais epilépticos não tratados

exibem perda de células em todas as áreas examinadas do hipocampo; CA1,

CA3 e GD, mas principalmente as duas primeiras áreas. Além disso, a análise

de ANOVA utilizando-se as densidades absolutas apontou diferenças

estatisticamente significantes entre os tratamentos na região da CA1 [F(5,37)=

21.33, p<0.0001], CA3 [F(5,37)= 18.32, p<0.0001] e do DG [F(5,37)= 13.28,

p<0.0001], para os grupos incluídos em parafina.

Neste caso, os pós-testes mostraram diferenças estatísticas entre as

secções das regiões hipocampais dos animais epilépticos aquelas dos animais

sadios e animais submetidos ao SE pós-tratados com diazepam,

carbamazepina, fenitoína e cetamina nas regiões da CA1 e CA3 (p<0.05). No

entanto, as densidades de neurônios hipocampais de animais tratados após o

SE com estas drogas foram inferiores as densidades de animais sadios não

epilépticos nas três regiões: CA1 (p<0.05), CA3 (p<0.05) e DG (p<0.05). Os

animais epilépticos tratados com diazepam e carbamazepina apresentaram

densidades neuronais estatisticamente diferentes dos animais epilépticos sem

tratamento nas três regiões, sendo que para o diazepam, as porcentagens de

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perda neuronal nas três regiões foram menores. Os animais tratados com esta

droga apresentaram densidades neuronais mais próximas daquelas dos

animais sadios. Cortes histológicos de animais pós-SE tratados com fenitoína e

cetamina tiveram densidades neuronais maiores que as dos animais sem

tratamento, embora menores que os valores encontrados para os ratos sadios.

No GD, estes dados não foram estatisticamente significantes (p~0.06, para

ambos).

A análise das densidades de neurônios dos cérebros cortados em

criostato indicam um efeito neuroprotetor sobre as células piramidais da região

da CA1 [F(5,37)= 39,37, p<0.0001], CA3 [F(5,37)= 6,348 p=0.0004] e das células

granulosas do DG [F(5,37)= 5,93, p=0.0006]. Os pós-testes com os valores das

densidades neuronais dos hipocampos cortados em criostato mostraram que

na região da CA1 dos hipocampos dos animais epilépticos tratados com a

FrPbAII na dose de 0.15 µg/µL e com o ácido nipecótico apresentaram

densidades maiores do que os animais não tratados e animais epilépticos

tratados com a menor dose da FrPbAII (0.037 µg/µL) (p<0.01). Além disso, foi

observado que a dose intermediária do composto (0.075 µg/µL) protegeu os

neurônios piramidais da CA1 (p<0.05). No entanto, neste caso, as densidades

neuronais também diferiram estatisticamente dos animais do grupo sadio

(p<0.05). Nas regiões da CA3 e do GD, apenas a administração da dose mais

alta da FrPbAII (0.15 µg/µL) e do ácido nipecótico diminuíram a perda de

neurônios induzida pelo SE (p<0.01 para ambos os tratamentos).

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Figura 24. Porcentagem de perda de neurônios em três regiões do hipocampo CA1, CA3 e DG. As perdas neuronais dos animais submetidos ao SE sem tratamento [SE+Salina(p) - a] e tratados com as drogas DZP, CET, CBZ, FEN foram estimadas com relação a densidade neuronal média dos cérebros dos animais do grupo sadio incluídos em parafina. As perdas neuronais dos animais submetidos ao SE sem tratamento [SE+Salina(c) - b], ácido nipecótico e FrPbAII (0.037, 0.075 e 0.15 µg/µl) foram estimadas com relação aos cérebros de animais sadios cortados em criostato. *p<0.05, **p<0.01.

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4.6. Imunofluorescência para GFAP

Os hipocampos dos animais epilépticos não tratados pós-SE, bem como

aqueles dos animais submetidos ao SE e pós-tratados com fenitoína e

cetamina apresentaram uma intensa marcação para GFAP nas regiões CA1,

CA3 e GD do hipocampo (Figura 25). No entanto, a marcação mais intensa foi

detectada na região do hilus do GD (Figure 26). Além disso, astrócitos dos

astrócitos destes grupos apresentaram hiperplasia do corpo celular e poucos

corpos celulares marcados, isto é, a marcação foi detectada

predominantemente nos prolongamentos destas células.

Figura 25: Secções marcadas com anticorpo para GFAP no GD do hipocampo de animais submetidos ao SE pela injeção de pilocarpina pós-tratados com salina (SE+Salina), Diazepam (SE+DZP), fenitoína (SE+FEN), carbamazepina (SE+CBZ) e cetamina (SE+CET) sacrificados 20 dias após SE. Estas secções podem ser comparadas as secções histológicas de animais sadios não submetidos ao SE. Secções de 10 µm, visualizadas em um aumento de 400x.

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Figura 26: Imunomarcação para GFAP no hilus do GD dos hipocampos dos animais

submetidos ao SE por pilocarpina e eutanasiados 20 dias após o SE. Animais epilépticos

tratados pós-SE com salina e fenitoína. Secções de 10 µm, visualizadas em um aumento de

400x.

Com relação às secções dos hipocampos cortadas em criostato,

observou-se que os animais tratados com FrPbAII (0,15ug/uL) e ácido

nipecótico apresentaram fraca marcação para GFAP, semelhante aos

hipocampos dos animais sadios não-epilépticos (Figura 27).

Figura 27: Secções (criostato) de marcadas com anticorpo para GFAP no GD do hipocampo de animais submetidos ao SE pela injeção de pilocarpina pós-tratados com salina (SE+Salina), Ácido nipecótico (SE+Ác nipecótico) e FrPbAII (SE+FrPbAII 0,15; 0.075 e 0.037 µg/µL) sacrificados 20 dias após SE. Estas secções podem ser comparadas as secções histológicas de animais sadios não submetidos ao SE. Secções de 50µm, visualizadas em um aumento de 400x.

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4.7. Incidência de crises recorrentes

Os dados resultantes dos períodos de observação indicaram que os

animais submetidos ao SE pela injeção de pilocarpina apresentaram crises

recorrentes em um período de que variou de 5 a 20 dias. Para não subestimar

ou superestimar as eficiências dos compostos testados, a freqüência das crises

de cada animal não foi estimada. Desta forma, registraram-se: o período de

ocorrência das crises e o número de animais que apresentaram crises durante

o período de observação em cada grupo (Tabela VI).

Com relação a incidência de crises dentro dos grupos não foram

registradas diferenças estatísticas entre os tratamentos durante o período

observado (χ2=14.44; p= 0.1076).

Tabela VI Incidência de crises recorrentes após SE induzido pela injeção de pilocarpina

em ratos Wistar.

Tratamento Início das crises

(dias pós-SE)*

Nr de animais com

crises

(escore>3)

Salina - -

SE+Salina 4 10/15 (80%)

SE+DZP 8 2/6 (33%)

SE+CET 11 3/6(50%)

SE+CBZ 6 4/6 (66%)

SE+FEN 11 3/6(50%)

SE+Ác nipecótico 7 1/6 (6%)

SE+FrPbAII 0.15µg/µL 7 1/6 (6%)

SE+FrPbAII 0.075µg/µL 7 3/6 (50%)

SE+FrPbAII 0.037µg/µL 6 4/6 (66%)

*Número de dias pós-SE da primeira crise recorrente no grupo. Número de animais

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com crises de classe >3 segundo índice de Racine (1972), analisados pelo teste de qui-quadrado. χ2=14.44; p= 0.1076.

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Discussão

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5. Discussão

A natureza tem funcionado como um laboratório gigantesco ao longo de milhões de anos de evolução,

onde novas moléculas surgem e desaparecem de acordo com o grau de adaptação que estas conferem as

espécies. Neste sentido, animais peçonhentos têm sido particularmente favorecidos por um arsenal de

compostos bioquímicos, os quais conferem a estes animais uma habilidade única de paralisar e/ou matar suas

presas. Estes compostos, quando inoculados, ativam e/ou inibem seletivamente estruturas de diversos sistemas

orgânicos das presas, incluindo o tecido nervoso (Mortari et al., 2007a).

Até o momento, foram identificadas centenas de neurotoxinas com ação em transportadores, enzimas

e canais iônicos permeáveis aos íons de Na+, K+, Ca++ e Cl-, ativados por voltagem ou por ligantes tais como L-Glu,

acetilcolina, GABA e Glicina (Uchitel, 1997; Denac et al. 2000; Norton & Olivera, 2006; Kyle & Ilyin, 2007). Nestes

estudos, as neurotoxinas isoladas de venenos têm sido úteis na elucidação de vários aspectos do funcionamento

de estruturas neuroniais e têm auxiliado na compreensão do papel destas estruturas na fisiopatologia de diversas

desordens neurológicas (Catterall, 2007). No entanto, estes estudos abordaram apenas uma pequena parte da

enorme biodiversidade existente e utilizam, em sua maioria, ensaios in vitro (Mortari et al., 2007a).

Há uma década, pesquisadores do laboratório de Neurobiologia e Peçonhas da FFCLRP-USP têm

investigado a ação de venenos de vespas e aranhas sobre o SNC de roedores. Nossos estudos levaram ao

isolamento de vários compostos dos venenos das vespas Agelaia vicina, Polybia ignobilis, Polybia occidentalis, da

aranha solitária Scaptocosa raptoria e da aranha colonial Parawixia bistriata com ações anticonvulsivante,

ansiolítica, neuroprotetora e antinociceptiva.

Em um destes estudos, foi isolado do veneno de P. bistriata o composto FrPbAII, o qual apresenta um

potente efeito inibitório sobre a recaptação do GABA e da glicina. A FrPbAII é um composto pequeno que não

altera a atividade dos canais de íons de Na+, K+ e Ca++, dos receptores de GABA, da enzima GABA transaminase

ou do transporte reverso deste neurotransmissor. A atividade neurobiológica deste composto foi testada em

vários modelos. Desta forma, foi observado que quando injetada por via endovenosa, em ratos Wistar, a FrPbAII

exerce efeito neuroprotetor nas camadas nuclear interna e nuclear externa da retina, inibindo a extensão da

lesão causada por isquemia e isquemia/reperfusão (Beleboni et al., 2006). Recentemente, foi constatado que a

injeção intra-vítreo deste composto protege de maneira dose dependente todas as camadas retinianas de ratos,

após isquemia e isquemia seguida de reperfusão, sendo cerca de 100 vezes mais potente do que o inibidor

específico do transportador GAT1 do GABA, ácido nipecótico (Dados não publicados). Além do efeito

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neuroprotetor, a injeção da FrPbAII no hipocampo dorsal de ratos exerce um efeito ansiolítico, aumentando o

tempo de permanência nos braços abertos do labirinto em cruz elevado e no compartimento claro do teste

claro/escuro (Liberato et al., 2006)

A atividade anticonvulsivante da FrPbAII foi inicialmente constatada por Cairrão e colaboradores (2002)

que relataram que a injeção por via i.c.v. desse composto inibe crises induzidas pela administração do antagonista

GABAérgico bicuculina em ratos Wistar. A seguir Liberato e colegas (2006) relataram que quando injetada na

substância negra do mesencéfalo, a FrPbAII bloqueia crises límbicas induzidas pela estimulação da Area

tempestas do córtex piriforme. Interessantemente, o ácido nipecótico não exerce efeito em ratos submetidos a

este paradigma. Além disso, foi demonstrado que o composto apresenta bons índices terapêuticos em ratos

com crises induzidas pela picrotoxina, pilocarpina, ácido caínico e PTZ, e não induz comprometimento cognitivo

quando administrada em ratos previamente à exposição ao labirinto aquático de Morris (Gelfuso et al., 2007).

Todos os resultados descritos anteriormente foram constatados utilizando modelos de indução aguda

(reativa) de crises pela injeção de quimioconvulsivantes em ratos saudáveis. Estes modelos têm levado a

identificação de compostos anticonvulsivantes, mas não conseguem discriminar compostos que exercem efeito

inibitório sobre a progressão das epilepsias (Löscher, 2002). Apesar da grande quantidade de compostos que

atuam inibindo as crises convulsivas, nenhum tratamento disponível atualmente consegue curar a doença, com

exceção da remoção cirúrgica de um foco epiléptico (Walker et al., 2002).

Desta forma, modelos crônicos fornecem pistas sobre a etiologia das epilepsias e auxiliam na descoberta

de novos compostos com propriedades de modificar a progressão da doença. Neste sentido, três modelos

crônicos são particularmente utilizados:

• Injeção sistêmica ou central de ácido caínico (agonista de L-Glu), proposto por Ben-Ari (1981).

• Injeção sistêmica ou central de pilocarpina (agonista de receptores colinérgicos do tipo muscarínicos),

proposto por Turski et al. (1983).

• Estimulação elétrica de áreas cerebrais específicas (sistema límbico), proposto por Lothman et al.

(1990).

O Status Epilepticus (SE) induzido por pilocarpina é um modelo consolidado e bastante utilizado, que

reproduz em roedores muitas das alterações encontradas em pacientes portadores da epilepsia do lobo

temporal (ELT), um dos mais prevalentes tipos de epilepsia (De Deyn et al., 1992; Ebert et al., 2002; Löscher,

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2002). Neste modelo, a injeção da pilocarpina induz crises límbicas que persistem por várias horas ou terminam

espontaneamente. Dependendo da duração das crises, o animal injetado com pilocarpina pode morrer caso o SE

não seja interrompido, o que ocorre regularmente pela injeção de diazepam ou pentobarbital (Löscher, 2002).

Do ponto de vista comportamental, os primeiros sinais detectados após a injeção incluem movimentos orofaciais

que correspondem à atividade epileptiforme no hipocampo, a qual se espalha para a amígdala, quando podem

ser observadas, clonia dos membros anteriores, elevação e queda límbica (Furtado et al., 2002).

Os mecanismos envolvidos no dano neurológico induzido pela injeção sistêmica ou hipocampal de

pilocarpina não são ainda muito claros. No entanto, sabe-se que a farmacologia do SE inicial difere da

farmacologia envolvida no desencadeamento das crises recorrentes (Rice & DeLorenzo, 1998). Após SE inicial, os

animais passam por um período livre das crises, freqüentemente denominado fase latente, o qual segundo Mello

e colaboradores (1993) pode durar de 5 a 34 dias. Durante a fase latente, ocorrem modificações que levam ao

desencadeamento de crises espontâneas e recorrentes, que persistem por toda a vida do animal. Dentre as

mudanças descritas durante a fase latente, podem ser citadas: alterações nas propriedades intrínsecas dos

neurônios (Sanabria et al., 2001), ocorrência de neurogênese (Parent et al., 1997), alterações funcionais nos

receptores (Brooks-Kayal et al., 1998), diminuição da atividade de interneurônios inibitórios (Cossart et al., 2001)

e re-organização sináptica (Okazaki et al., 1995).

Vários trabalhos têm destacado a importância do hipocampo e do giro parahipocampal na inicialização e

manutenção das crises convulsivas durante a progressão da ELT. Nestes estudos, são descritas alterações no

hipocampo de animais submetidos ao SE, bem como autópsias de hipocampo post mortem de pacientes com

ELT, dentre as quais se destacam: extensa morte celular, brotamento das fibras musgosas e gliose (Turski et al.,

1983; Covolan et al., 2000; Ebert et al., 2002; Thom et al., 2005). Em um recente estudo, Scimemi e

colaboradores (2006) descrevem aumento da excitabilidade mediada por L-Glu após SE induzido por

pilocarpina sistêmica, na via perforante que liga o córtex entorrinal às regiões de CA 1-3 que representa a

principal via de entrada excitatória no hipocampo. Segundo os autores deste trabalho, três semanas após o SE

por pilocarpina ocorre um aumento na excitabilidade das células granulosas, o qual deve estar associado com o

aumento da probabilidade de liberação do L-Glu, descartando a possibilidade de alteração nos transportadores

de L-Glu, bem como alterações na cinética (composição de subunidades) dos receptores de L-Glu, em particular

os NMDA. Além disso, foi demonstrada a ocorrência de crosstalk (comunicação extra-sináptica) entre as

porções medial e lateral da via perforante (Scimemi et al, 2006).

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É interessante ressaltar que o SE induz mudanças que não se restringem ao hipocampo e sistema límbico.

Em ratos Wistar jovens, episódios múltiplos de SE reduzem a expressão de GAD-65 e alteram a expressão de

receptores AMPA e NMDA (da Silva et al., 2005). Além disso, Freitas e colaboradores (2004) demonstraram

que ocorre up-regulation dos receptores de L-glu no hipocampo, estriado e córtex frontal de animais adultos,

nas primeiras horas após o SE induzido por pilocarpina sistêmica.

Dados semelhantes foram obtidos pelo nosso laboratório com ratos Wistar sacrificados na fase latente,

quando foi observado um aumento na quantidade de receptores funcionais de L-glu no córtex cerebral. Além

disso, foi verificada também para o córtex, uma diminuição da afinidade destes receptores (Cunha et al., 2007).

Tendo em vista todos estes fatos, o objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade

antiepileptogênica e neuroprotetora do composto FrPbAII isolado do veneno da aranha brasileira P. bistriata,

comparando sua eficiência a de drogas neuroativas com mecanismos de ação variados. Para tanto, os animais

foram divididos em grupos onde foram utilizadas 3 doses da FrPbAII, o ácido nipecótico, drogas anti-epilépticas

convencionais fenitoína e carbamazepina, um anestésico já testado como neuroprotetor cetamina e um

ansiolítico diazepam - comumente utilizado para reversão de SE em humanos. Para tanto se padronizou o

tratamento sub-crônico de quatro dias. A escolha deste período de duração baseou-se em achados de Fujikawa

(1996), que descreve perdas contínuas de neurônios do hipocampo, amígdala e áreas subcorticais, como a

substância negra, até 72 horas após um SE de 3 horas de duração. Além disso, um trabalho mais recente

demonstra que o SE induzido por pilocarpina provoca descargas elétricas anormais continuamente observadas

até 72 horas após os SE (Gao et al., 2007).

Neste estudo, além de monitorar alterações morfológicas induzidas pelo SE no hipocampo, foi analisado

o desempenho dos animais no labirinto aquático de Morris, o qual é baseado no papel do hipocampo na

navegação espacial de mamíferos (Morris et al., 1982). Estudos prévios relatam que lesões no hipocampo de

animais experimentais comprometem o desempenho dos animais neste teste (Halonen et al., 1996; Cha et al.,

2002). Em humanos, danos aos neurônios do hipocampo são também associados a comprometimentos cognitivos

em pacientes com TLE, os quais relatam freqüentemente dificuldades em aprender novas informações (Lencz et

al., 1992; Mikati et al., 2001).

No modelo da pilocarpina, comprometimentos cognitivos podem ser observados durante a fase de

aquisição (treino), assim como durante a fase de teste de retenção da memória. Animais epilépticos aprendem a

localização da plataforma de descanso, mas levam muito mais tempo para aprender esta informação do que

animais sadios. Além disso, animais epilépticos apresentam déficit de retenção de memória, uma vez que eles

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exploram os quatro quadrantes da piscina, sem preferência pelo quadrante onde estava a plataforma (alvo)

(Cavazos et al., 1994; Hort et al., 1999; Mojajeri et al., 2003).

Os resultados do presente trabalho demonstram que o tratamento com a FrPbAII (0.15 µg/µL)

proporcionou melhora da performance dos animais no labirinto aquático de Morris, durante o período de

aprendizagem (treinos) e no teste de retenção. Comparando-se com os tratamentos controles, as performances

dos animais tratados com a FrPbAII foram semelhantes as dos animais tratados com diazepam e com o ácido

nipecótico no terceiro e quarto dia de treino, bem como no teste de retenção (probe trial). No entanto, os

animais administrados com diazepam e o ácido nipecótico foram mais rápidos que a FrPbAII no começo do teste

(2º e 3º dias).

As estimativas de densidade neuronal indicam que todos os tratamentos, com exceção da dose mais

baixa da FrPbAII (0,037µg/µL), exerceram algum efeito neuroprotetor sobre as células piramidais da CA1 e CA3,

bem como nas células granulosas do GD. No entanto, as densidades de células dos animais tratados ainda não são

iguais as dos animais sadios.

Neste ponto, é interessante ressaltar que apesar do desempenho dos animais tratados com diazepam,

FrPbAII (0,15 µg/µL) e ácido nipecótico serem semelhantes as dos animais sadios no labirinto aquático de Morris,

a densidade de células hipocampais foi inferior nestes animais comparando-se aos mesmos animais sadios. De fato,

o desempenho dos animais no labirinto aquático de Morris está correlacionado com a severidade das lesões,

sendo que pelo menos 40% das células do hipocampo devem ser lesadas para que seja observado déficit

cognitivo neste teste (Majajeri et al., 2003). Isto explica porque os animais com perda moderada de células (10-

20%) apresentaram déficits cognitivos. Por outro lado, os animais com perda de neurônios levemente inferiores

aos animais epilépticos sem pós-tratamento, apresentaram desempenho comprometido no labirinto aquático de

Morris.

Muita atenção tem sido dada a perda de neurônios durante a epilepsia. No entanto, sabe-se que muitas

drogas que inibem a perda neuronal não exercem efeitos antiepileptogênicos (Löscher, 2002; DAmbrosio,

2004). Neste sentido, alguns trabalhos vêm tentando estabelecer correlações entre a epileptogênese e a

proliferação de células da glia que ocorre após diferentes tipos de insulto ao tecido nervoso, em um processo

denominado gliose reativa. Durante algum tempo acreditou-se que os astrócitos e a micróglia exercessem papéis

semelhantes, ou seja, isolamento da área lesada evitando que as cascatas de excitoxicidade atingissem células

sadias. Contudo, em um recente trabalho Kang e colaboradores (2006) mostraram que a proliferação da micróglia

aumenta a quantidade de fatores de inflamação no tecido, levando a morte de mais células.

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No presente trabalho, foi detectada astrocitose reativa em animais epilépticos não tratados, assim como

em animais epilépticos tratados com carbamazepina, fenitoína, cetamina e nas doses mais baixas da FrPbAII

(0.075 e 0.037 µg/µL). Neste sentido, os resultados revelaram aumento da imuno-marcação para GFAP em todas

as regiões do hipocampo mas sobretudo, na região do hilus do GD. Além disso, a maior parte da marcação foi

evidenciada nos prolongamentos dos astrócitos, o que aponta mais para processos de crescimento destas células

do que geração de novas células. Dados semelhantes foram encontrados por Kang e colaboradores (2006), em

ratos submetidos ao SE pela injeção sistêmica de pilocarpina, eutanasiados 20 dias após o SE. De fato, estes

autores mostraram dupla marcação de astrócitos com TUNEL (marcador de apoptose) e GFAP a partir de 14

dias após o SE. As células sobreviventes, por sua vez, apresentaram expressão anormal de canais iônicos e

enzimas envolvidas na degradação de neurotransmissores. Segundo DAmbrosio (2004), as alterações nos

astrócitos podem favorecer a quebra da homeostase do tecido neuronal e alterar a liberação de

neurotransmissores.

Com relação à ocorrência de crises recorrentes, não foram observadas diferenças estatísticas entre o

número de animais epilépticos sem ou com tratamento pós SE. Isto pode ser explicado, pelo número de animais

utilizados, uma vez que se observa uma menor freqüência de animais com crises nos grupos tratados com

diazepam, FrPbAII (0,15 µg/µL) e ácido nipecótico (aproximadamente 15% para os três tratamentos contra 80%

dos animais sem tratamento). De fato, o SE causa morte de vários animais durante o experimento, sobretudo nas

primeiras horas pós-SE, quando apesar do tratamento, cerca de 40% dos animais morrem. Desta forma, apesar

dos esforços, não foi possível obter um número muito maior de animais.

Vários estudos têm tentado estabelecer uma ligação entre a ação anticonvulsivante e ação

neuroprotetora de algumas drogas. Alguns autores questionam o benefício real do uso de anticonvulsivantes

como neuroprotetores, uma vez que as crises recorrentes ocorrem pós SE mesmo após algum tratamento

(Pitkänen, 2002). Neste trabalho, foi observado que a carbamazepina protege parcialmente os neurônios do

hipocampo contra os danos induzidos pelo SE, mas não melhora o desempenho dos animais tratados no labirinto.

Em um estudo prévio, Lahtinen e colaboradores (1996) demonstraram que a administração de carbamazepina

(20mg/kg, via i.p.) uma hora antes da estimulação da via perfurante não inibe perda de neurônios, nem

comprometimentos cognitivos no labirinto aquático de Morris. A ação neuroprotetora da carbamazepina

observada neste trabalho pode ser decorrente da dose, bem como no modelo utilizado. Discrepâncias entre

modelos crônicos de estimulação elétrica e química já foram relatados para outras drogas, como por exemplo, o

ácido valpróico, que inibe crises recorrentes após SE, mas não após estimulação elétrica (Löscher, 2002). Os

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efeitos da carbamazepina utilizada após SE induzido pro pilocarpina nunca haviam sido relatados (Calabresi et al.,

2003).

No presente estudo, foi observado uma maior eficiência dos tratamentos com alvo no sistema

GABAégico, tanto em receptores (diazepam), quanto transportadores (FrPbAII e ácido nipecótico). A ação

neuroprotetora do diazepam foi previamente demonstrada por Pitkänen e colaboradores (2005), que relataram

que a administração do diazepam durante o SE induzido por estimulação elétrica da amígdala, reduz o

desenvolvimento e a severidade das crises recorrentes. Além disso, a inibição do transporte de GABA também

já havia sido relatada como neuroprotetora em ratos submetidos ao modelo de estimulação da via perfurante

(Halonen et al., 1996). Foi relatado que a administração da tiagabina, um inibidor seletivo do transportador GAT1,

durante a estimulação elétrica inibiu o comprometimento cognitivo no labirinto aquático de Morris e

concomitantemente reduziu perda de células piramidais de CA1 e CA3. No entanto, esta é a primeira vez que

um inibidor seletivo de GAT1 e um inibidor não específico de GABA e glicina são testados em ratos submetidos

ao modelo da pilocarpina.

Neste sentido, observou-se que a dose utilizada da FrPbAII (0,86 µM) foi quase 100 vezes menor que a

do ácido nipecótico (93 µM). Essa maior eficiência da FrPbAII sobre o ácido nipecótico pode estar ligada a

atuação do composto sobre outros subtipos de transportadores de GABA, que não o GAT1 ou os

transportadores de Glicina. Segundo White e colaboradores (2002), drogas que inibem transportadores de

GABA astrocíticos são mais potentes que inibidores de transportadores neuronais de GABA. Ainda o GAT1 é

predominantemente expresso em neurônios enquanto os transportadores do tipo GAT2 e 3 estão mais

presentes em membranas de astrócitos (Gadea & Lopez-Colomé, 2001a). Uma vez que o ácido nipecótico atua

especificamente sobre o subtipo GAT1 é plausível inferir que esta droga seja menos potente do que um inibidor

não seletivo neste modelo (Schousboe et al., 2004). Além disso, estudos prévios mostram que inibidores

seletivos de GAT1 bloqueiam crises secundariamente generalizadas, enquanto inibidores não seletivos não têm

efeito sobre estas crises, mas bloqueiam crises induzidas pela estimulação elétrica (Dalby et al.,1997; Dalby,

2003). Isto poderia indicar que a FrPbAII tem uma preferência por GAT1, não obstante a ação deste composto

em outros substratos.

A ação inibitória da FrPbAII sobre os transportadores de glicina, pode ser em parte responsável pelos

efeitos anticonvulsivantes e neuroprotetores observados neste e em outros trabalhos. A glicina atua sobre canais

iônicos ativados pela ligação deste neurotransmissor, em sítios receptores de alta afinidade pelo ligante. Além

disso, a glicina pode atuar como co-agonista nos receptores de L-Glu do tipo NMDA (Böhme & Lüddens, 2001).

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No SNC, receptores de glicina podem ser encontrados na medula espinhal, tronco encefálico, mesencéfalo,

retina ou áreas do cérebro dentre as quais se encontra o hipocampo. Disfunções em receptores de glicina

podem resultar em convulsões mioclônicas e desordens motoras hipertônicas (Bregestovski, 2002). De modo

contrário, agonistas glicinérgicos são potenciais anticonvulsivantes. No entanto, devido ao tamanho do sítio de

ligação da glicina, poucos agonistas seletivos deste neurotransmissor são conhecidos e até o momento e nenhum

anticonvulsivante com ação comprovadamente exclusiva nos receptores de glicina foi sintetizado (Böhme and

Lüddens, 2001).

A retirada da glicina dos terminais sinápticos é feita por transportadores de alta afinidade que muitas

vezes reconhecem ambos, GABA e glicina (Beleboni et al., 2004b). No entanto, ao contrário do que ocorre com

o GABA, a retirada da glicina da fenda sináptica não afeta o potencial inibitório pós-sináptico (PiPs), apenas re-

abastece o pool de liberação deste neurotransmissor (Titmus et al., 1999; Gadea & Lopez-Colome, 2001c). Uma

vez que a inibição do transporte de glicina aparentemente não afeta o PiPs e conseqüentemente não aumenta os

efeitos inibitórios da glicina, não há registro da ação anticonvulsivante de inibidores exclusivos destes

transportadores.

A ação neuroprotetora da FrPbAII encontra-se atualmente em investigação também no modelo de

isquemia retiniana em ratos Wistar, utilizando-se antagonistas de receptores de glicina e GABA. Muito em breve

teremos melhores esclarecimentos acerca do substrato neuronal envolvido com os efeitos neuroprotetores

deste composto.

Até o momento, vários esforços têm sido feitos no intuito de estabelecer um protocolo de aplicação

terapêutica com drogas neuroprotetoras. Atualmente, preconiza-se a utilização de anticonvulsivantes

profiláticos como a fenitoína após incidentes como trauma e SE. No entanto, alguns trabalhos mostram que esta

profilaxia não tem exercido efeito antiepileptogênico em pacientes, induzindo ainda déficits cognitivos (Brandt

et al., 2003). Além disso, Hernandez (1997) demonstrou efeito negativo após administração do diazepam ou do

fenobarbital na recuperação do desempenho sensorial motor após traumatismo craniano. Em contraste, estes

efeitos não foram observados durante o tratamento com carbamazepina e vigabatrina.

Apesar de controversos, os resultados de estudos com drogas neuroprotetoras e antiepileptogênicas

sugerem que, mesmo em casos de neuroproteção parcial, onde o processo de desencadeamento da

epileptogênese secundária ocorre apesar do tratamento, efeitos funcionais podem ser detectados. Dentre estes

efeitos pode se citar a diminuição da severidade e da freqüência das crises recorrentes (Brandt et al., 2003).

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Uma vez que a epilepsia é uma condição clinica limitante, outros trabalhos são necessários para que sejam

investigados os benefícios dos efeitos neuroprotetores de drogas anti-epilépticas menos tóxicas. A profilaxia da

epilepsia deve levar em conta janelas terapêuticas e toxicidade das drogas utilizadas. Desta forma, estudos

crônicos devem evidenciar os muitos aspectos da epileptogênese, o que inclui função cognitiva, crises

espontâneas e efeitos colaterais das drogas sobre animais doentes.

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Conclusões

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6. Conclusões

Neste trabalho, avaliou-se o potencial antiepileptogênico do composto FrPbAII isolado do veneno da

aranha Parawixia bistriata e de algumas drogas administradas durante os primeiros quatro dias que sucederam o

Status Epilepticus induzido por pilocarpina. Avaliou-se o número de neurônios sobreviventes na CA1, CA3 e GD

do hipocampo dorsal de ratos Wistar; o desempenho destes animais no labirinto aquático de Morris; a incidência

de crises recorrentes para cada tratamento e a expressão da proteína astrocítica GFAP. Neste sentido os dados

do presente trabalho revelaram um efeito neuroprotetor da FrPbAII, do ácido nipecótico e do diazepam,

considerando todos os parâmetros acima. As drogas carbamazepina, fenitoína e cetamina atenuaram perda

celular, mas não melhoraram o desempenho dos animais no labirinto aquático de Morris. Pode-se inferir que a

potencialização do sistema GABAérgico após um insulto inicial como o trauma ou Status Epilepticus, representa

uma alternativa viável para proteger os neurônios, evitando com isso o desenvolvimento e a progressão das

epilepsias. Neste contexto, trabalhos adicionais são necessários para melhor caracterizar as populações neuronais

sobreviventes; padrão de atividade elétrica, expressão de enzimas e avaliação do padrão de brotamento.

Concluindo, o composto FrPbAII, inibidor dos transportadores de GABA e glicina, exerce um promissor efeito

neuroprotetor, provavelmente através da inibição não seletiva dos transportadores de GABA. Este trabalho em

conjunto com outros demonstram o grande e inexplorado potencial terapêutico de compostos presentes em

venenos de artrópodos.

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Referências Bibliográficas

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Anexos

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ANEXO A

Alexandra Olimpio Siqueira Cunha

1. Formação Acadêmica

Graduação em Ciências Biológicas Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo concluída em 2001.

Mestrado em Psicobiologia Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo concluído em 2004.

Doutorado em Psicobiologia Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo a concluir em Fevereiro de 2008.

2. Artigos Publicados

Cunha AOS, Mortari MR, Carolino ROG, Coutinho-Netto J, dos Santos WF. Glutamate binding is altered in hippocampus and cortex of Wistar rats after pilocarpine-induced Status Epilepticus. Neurosci Lett 2007;424(1):51-54.

Mortari MR, Cunha AOS, Ferreira LB, Santos WF. Neurotoxins from invertebrates as anticonvulsants: from basic research to therapeutic application. Pharmacol & Ther 2007;114:171-83.

Mortari MR, Cunha AOS, Carolino RO, Coutinho-Netto J, Tomaz JC, Lopes NP, Coimbra NC, dos Santos WF. Inhibition of acute nociceptive responses in rats after i.c.v. injection of Thr6-bradykinin, isolated from the venom of the social wasp, Polybia occidentalis. Br J Pharmacol 2007;151:860-9.

Gelfuso EA, Cunha AOS, Mortari MR, Liberato JL, Paraventi KH, Beleboni RO, Coutinho-Netto J, Lopes NP, dos Santos WF. Neuropharmacological profile of FrPbAII, purified from the venom of the social spider Parawixia bistriata (Araneae, Araneidae), in Wistar rats. Life Sci 2007;80(6):566-72.

Liberato JL, Cunha AOS, Mortari MR, Gelfuso EA, de Oliveira L, Beleboni R, Coutinho-Netto J, Dos Santos WF. Anticonvulsant and anxiolytic activity of FrPbAII, a novel GABA uptake inhibitor isolated from the venom of the social spider Parawixia bistriata (Araneidae: Araneae). Brain Res 2006;1124(1):19-27.

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Cunha AOS, Mortari MR, Oliveira L, Carolino RO, Coutinho-Netto J, dos Santos WF. Anticonvulsant effects of the wasp Polybia ignobilis venom on chemically induced seizures and action on GABA and glutamate receptors. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol 2005;141:50-57.

Mortari MR, Cunha AOS, de Oliveira L, Vieira EB, Gelfuso EA, Coutinho-Netto J, Santos WF. Anticonvulsant and behavioural effects of the denatured venom of the social wasp Polybia occidentalis (Polistinae, Vespidae). Basic Clin Pharmacol Toxicol 2005;97(5), 289-95.

Mortari MR, Cunha AOS, Oliveira L, Gelfuso EA, Vieira EB, Santos WF. Comparative effects of the venoms from three wasp species of the Genus Polybia (Hymenoptera, Vespidae). J Biol Sci 2005;5:449-545.

Oliverira L, Cunha AOS, Mortari MR, Coimbra NC, Santos WF. Cataleptic acitivty of the denatured venom of the social wasp Agelaia vicina (Hymenoptera: Vespidae) in Rattus norvegicus (Rodentia, Muridae). Prog Neuropsychophamacol Biol Psychiatry 2005;30(2):198-203.

Oliveira L, Cunha AOS, Mortari MR, Pizzo AB, Miranda A, Coimbra NC, Santos WF. Effects of microinjections of neurotoxin AvTx8, isolated from the social wasp Agelaia vicina (Hymenoptera; Vespidae) venom, on GABAergic nigrotectal pathways. Brain Res 2005;1031(1):74-81.

3. Artigos Submetidos

Cunha AOS, Mortari MR, dos Santos WF. Neuroprotective effects of four conventional antiepileptic drugs in the pilocarpine-induced Status Epilepticus: a functional and morphological study. Submetido a revista Brain Research em Novembro de 2007.

4. Projetos em andamento

Avaliação da atividade neuroprotetora e anticonvulsivante do composto poliamínico FrPbAII isolado da peçonha da aranha Parawixia bistriata, em ratos Wistar submetidos ao Status Epilepticus induzido por pilocarpina intra-hipocampal. Projeto em andamento, FAPESP Nr 05/60254-0. Coordenador: Prof Dr Wagner Ferreira dos Santos

Investigação de componentes antinociceptivos presentes nas peçonhas da aranha Parawixia bistriata e da vespa Polybia occidentalis em modelos de

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Fontes: GABA, Carbamazepina e ácido nipecótico - http://www.neurosci.pharm.utoledo.edu/MBC3320/GABA.htm Diazepam - http://library.thinkquest.org/C0115926/drugs/sedative2.htm Fenitoína - http://www.webalice.it/alberto.frangini/phenytoin.jpg Cetamina - http://www.metrohealthanesthesia.com/edu/ivanes/ketamine2.htm

indução de dor por estimulação térmica e identificação de sítios de ação. Projeto enviado ao CNPq em 21/09/2007. Edital Universal. Coordenador: Prof Dr Wagner Ferreira dos Santos

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ANEXO B

Estruturas químicas dos compostos utilizados neste trabalho comparadas à do GABA

Ácido γ-aminobutírico GABA

FrPbAI Ácido Nipecótico

Diazepam Fenitoína

Carbamazepina Cetamina

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Cauterisação feita durante o século 15. Do livro escrito em otomano, Cerrahiyyet'ul Haniyye. Museu de Kork.

Jesus cura um epiléptico –Extraído do livro das horas “Les tres riches Heures duDuc de Berry” escrito em 1500. Musée Condé, Paris.

Epilepticus sic curabitur –a forma de curar a epilepsia. Gravura de um dos manuscritos de Hans Sloane . De autoriaanônima datado do final do século 12. Museu Britânicode Londres.

São Severino de Noricum 1300. Museu FondazzioneHorne, Florença.

Todas as obras foram copiadas do site do Museu Alemão de Epilepsia de Korkhttp://www.epilepsiemuseum.de

O que é isto? – Gravura de Wilkie Collins 1872 baseada no livro PobreMiss Finch, do mesmoautor. Coleção privada.

A cortina vermelha ou homenagem a Vincent –pintado por um paciente em terapia de grupo com Van Gogh em 1965. Museu de Kork.

A deusa asteca Tlazolteotl. Do manuscrito “Bibliorum SacrorumGraecorum Codex Vaticanus B”. Originais na Biblioteca do Vaticano, Roma.

O simbolismo da Epilepsiadesenho de - KarlheinzGeier 1983. Museu de Kork.

A cura de uma mulher com a doença que faz cair de Henry Perche. Século 15. Seqüência de cura. Museu de Kork.

ANEXO C

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