ALEXANDRE FIORAVANTI SCHACHT CULTIVO DE UMA … · 2019. 12. 2. · Alexandre Fioravanti Schacht1 Douglas Rossi Jesus2 1Alexandre Fioravanti Schacht - Acadêmico do 4º ano do Curso

0

UNIVERSIDADE PARANAENSE - UNIPAR

CURSO DE FARMÁCIA - TOLEDO

ALEXANDRE FIORAVANTI SCHACHT

CULTIVO DE UMA LINHAGEM DE BASIDIOMICETO SOB DIFERENTES

CONCENTRAÇÕES DE INDUTORES VISANDO A PRODUÇÃO DE LACASE E

BIOMASSA MICELIAL

TOLEDO - PR

2018

1

ALEXANDRE FIORAVANTI SCHACHT



BIOMASSA MICELIAL

Trabalho de Conclusão do Curso apresentado à Banca

Examinadora do Curso de Graduação em Farmácia -

Universidade Paranaense - Unidade Universitária de

Toledo, como requisito parcial para a obtenção do título

de Farmacêutico, sob orientação do Prof. Me. Douglas

Rossi Jesus.

TOLEDO - PR

2018

2

3



BIOMASSA MICELIAL

Alexandre Fioravanti Schacht1

Douglas Rossi Jesus2

1Alexandre Fioravanti Schacht - Acadêmico do 4º ano do Curso de Farmácia da Universidade

Paranaense - Unidade Universitária Toledo. Endereço para correspondência: Rua Bento Munhoz da

Rocha Neto, 2283, Jardim La Salle, Toledo - Paraná. CEP: 85902-000. Fone: (45) 99956-8264.

e-mail: [email protected]

2Douglas Rossi Jesus - Professor adjunto do Curso de Farmácia da Universidade Paranaense -

Unidade Universitária Toledo. Endereço para correspondência: Av. Parigot de Souza, 3636, Jardim

Prada, Toledo - Paraná. CEP: 85903170. Fone: (45) 3277-8500.e-mail: [email protected]

4



BIOMASSA MICELIAL

Influência de indutores na produção de lacase e biomassa

RESUMO: Os fungos basidiomicetos auxiliam na manutenção do equilíbrio do ecossistema, além

de serem biorreguladores. Destacam-se por desempenharem um importante papel na ciclagem de

nutrientes, por meio da degradação da lignina a partir da ação coordenada de uma série de enzimas

intra e extracelulares. Buscou-se realizar o cultivo de uma linhagem de basidiomiceto sob diferentes

concentrações de indutores visando a produção da lacase e biomassa micelial. Para isso, três

linhagens de basidiomicetos (U15-3, U15-7 e U16-5) foram cultivadas em extrato de malte 2%

durante 14 dias a 28 °C. Após esse período, foi avaliada a produção de lacase, biomassa micelial e

pH. Constatando a linhagem de maior produção enzimática, foi analisada a influência de diferentes

concentrações de indutores (50, 100, 150, 200 e 250 µM de sulfato de cobre, associado ou não a 1

mM de guaiacol, xilidina ou vanilina) sobre a atividade de lacase, crescimento micelial e pH final

do meio. Entre as linhagens analisadas, a U15-7 se destacou na produção de lacase e biomassa.

Apenas as associações de sulfato de cobre e xilidina, em todas as concentrações, demonstraram

aumento significativo na produção de lacase e no crescimento micelial em comparação ao controle.

De forma geral, a menor produção de biomassa foi observada com xilidina (81,876 mg mL-1) e a

maior no tratamento vanilina 1 mM + 150 µM sulfato de cobre (163,544 mg mL-1). Nenhum pH foi

superior ao tempo zero (pH 5,67) e ao controle (pH 5,23). Os indutores vanilina (37669 U L-1) e

guaiacol (37484 U L-1) se destacaram na atividade de lacase em relação à xilidina e ao controle.

Novos estudos são necessários a fim de otimizar a influência de indutores no metabolismo fúngico.

PALAVRAS-CHAVE: Fenoloxidases. pH. Crescimento micelial. Sulfato de cobre. Indutores

fenólicos.

CULTIVATION OF A BASIDIOMICET LINEAGE UNDER DIFFERENT

CONCENTRATIONS OF INDUCTORS AIMING THE PRODUCTION OF LACASE AND

MICELIAL BIOMASS

Influence of inductors on the production of laccase and biomass

ABSTRACT: The basidiomycete fungi help in maintaining the balance of the ecosystem, besides

being bioregulators. They play an important role in the cycling of nutrients, through the degradation

of lignin from the coordinated action of a series of intra and extracellular enzymes. The cultivation

of a basidiomycete strain was carried out under different concentrations of inducers aiming at the

production of laccase and mycelial biomass. For this, three basidiomycete strains (U15-3, U15-7

and U16-5) were grown in malt extract (2%) for 14 days at 28 °C. After this period, laccase

production, mycelial biomass and pH were evaluated. The influence of different concentrations of

inducers (0, 50, 100, 150, 200 and 250 μM of copper sulfate and 0 and 1 mM of guaiacol, xylidine

or vanillin) on the activity of laccase, mycelial growth and final pH of the medium. Among the

analyzed strains, U15-7 stood out in the production of laccase and biomass. Only associations of

copper sulfate and xylidine at all concentrations showed a significant increase in laccase production

and mycelial growth compared to control. In general, the lowest biomass production was observed

with xylidine (81.876 mg mL-1) and the highest in the treatment 1 mM vanillin + 150 μM copper

sulfate (163.544 mg mL-1). No pH was higher than time zero (pH 5.67) and control (pH 5.23). The

vanillin (37669 U L-1) and guaiacol (37484 U L-1) inducers were prominent in laccase activity

relative to xylidine and control. New studies are needed in order to optimize the influence of

inducers on fungal metabolism.

KEYWORDS: Phenoloxidases. pH. Mycelial growth. Copper sulphate. Phenolic inducers.

5

INTRODUÇÃO

Considerados na maioria das vezes prejudiciais pela população, os fungos são utilizados por

muitas indústrias na fabricação de seus produtos, como a indústria alimentícia, farmacêutica e

biotecnológica (FERREIRA et al., 2016). Cerca de 100.000 espécies compõe o Reino Fungi,

entretanto, os filos Ascomiceto e Basiodiomiceto possuem maior atividade degradante da matéria

orgânica. Os fungos têm habilidade de se reproduzirem sexuada ou assexuadamente. Os de

reprodução sexuada, denominados fungos perfeitos ou telemorfos, produzem zigosporos ou

basidioporos, enquanto os imperfeitos ou amorfos, se reproduzem assexuadamente por meio de

brotamentos, fragmentos e produção por conídios (KAMIDA et al., 2005; NIEUWENHUIJZEN;

OEI, 2006; CERNIGLIA; SUTHERLAND, 2010).

De acordo com Kirk et al. (2010), o filo Basidiomycota é composto por 29.914 espécies

conhecidas, como os populares cogumelos e orelhas-de-pau, carvões, ferrugens, gasteromicetos e os

gelatinosos. Eles apresentam uma estrutura produtora de esporos exógenos em número de quatro

ou, dificilmente, dois, chamado de basídio, caracterizando a sua diferença. Ainda apresentam

micélio filamentoso e pluricelular (PAULA et al., 2007; SALVI, 2011).

Os basidiomicetos podem ser divididos em fungos causadores de podridão branca, deixando

a madeira com uma coloração esbranquiçada, pois degradam a celulose, hemicelulose e lignina; e os

fungos causadores de podridão parda, que possuem as mesmas capacidades degradativas dos fungos

de podridão branca, com exceção da lignina, alterando sua cor (SALVI, 2011).

Segundo Gou et al. (2009), dentre todos os microrganismos que possuem capacidade de

descolorir efluentes por biosorção e biodegradação, os fungos basidiomicetos são mais

frequentemente usados para esse propósito. Fato justificado pelas habilidades comuns dos fungos da

decomposição branca em oxidar compostos fenólicos, relacionados à lignina, que na maioria dos

casos está associada a enzimas extracelulares ligninolíticas (MELO; AZEVEDO, 2008). As

enzimas modificadoras de lignina, possuindo falta de especificidade ao substrato, têm a capacidade

de degradar uma extensa variedade de xenobióticos, incluindo os corantes sintéticos (MUNARI et

al., 2008).

Essas enzimas estão atraindo a atenção de diversas aplicações industriais, devido à

capacidade de catalisar a oxidação de fenóis e outros compostos aromáticos, como a

deslignificação, produção de etanol, modificação de fibras da madeira, clareamento de corantes e

remediação de solos e águas contaminadas. Com a habilidade de atuar em condições brandas de pH

e temperatura, elas permitem maior controle da geração de produtos de interesse, a um menor custo

energético e com menor impacto ambiental (BINOD et al., 2008).

6

As principais enzimas ligninolíticas presentes nos fungos basidiomicetos são: Lignina

Peroxidase (LiP), possuindo capacidade em oxidar compostos fenólicos e não fenólicos de alto

potencial redox; Manganês Peroxidase (MnP), capaz de oxidar compostos fenólicos na presença de

manganês, e ainda oxidar um segundo mediador para efetivar a quebra de compostos não fenólicos;

e Lacase, que por sua vez possui capacidade em oxidar compostos fenólicos simultaneamente à

redução do oxigênio molecular à água (WONG, 2009). De acordo com suas capacidades oxidativas,

essas enzimas ligninolíticas podem ser ordenadas em LiPs > MnPs > Lacases (AGUIAR; FERRAZ,

2011).

Quatro íons de cobre, subdivididos em três sítios ativos compõe a estrutura molecular da

lacase, que se envolvem para a transferência de elétrons do substrato para a direção do oxigênio

(GIARDINA et al., 2010). Conforme Neto (2006), as lacases possuem massas moleculares que

variam de 45 a 100 kDa.

A localização dos fungos na natureza, a concentração do substrato, a temperatura, o pH e

outras condições do ambiente aos quais eles estão expostos influenciam e regulam a produção

destas enzimas (HERRERA-ESTRELLA; HORWITZ, 2007). Além de outros fatores como tempo

de cultivo, composição química do meio, aeração, estágio de desenvolvimento e presença de

indutores como o nitrogênio e compostos aromáticos (DEKKER et al., 2007), a citar: álcool

veratrílico, ácido vanílico, 2,5 xilidina, ácido ferúlico, siringaldazina e guaiacol.

Os compostos aromáticos possuem estrutura similar à lignina ou derivados de lignina,

entretanto, dependendo da linhagem do fungo, do tipo do composto e da concentração empregada, a

influência de tais compostos ocorre de forma distinta (PISCITELLI et al., 2011). A utilização de

indutores pode ser empregada para diversas aplicações industriais, desde que a adição dessas

substâncias aumente consideravelmente a produção de lacase, subsidiando a produção de enzimas

em larga escala (COUTO; TOCA-HERRERA, 2007).

Devido ao cobre em seu sítio ativo, as lacases fúngicas são capazes de catalisar reações de

desmetilação, importantes em processos de biodegradação de cadeias poliméricas, rompendo anéis

aromáticos presentes na estrutura da lignina (PERALTA et al., 2004). Esses atributos tornam o

cobre um dos indutores mais eficientes (GALHAUP; HALTRICH, 2001; DEKKER et al., 2007). O

cobre também promove a síntese de isoformas de enzimas ligninolíticas (TERRON et al., 2004;

COUTO; TOCA-HERRERA, 2007).

A possibilidade de produção em curto período de tempo, elevada produção em um espaço

reduzido e facilidade de controle dos parâmetros físico-químicos, garantindo menores riscos de

contaminação e a obtenção dos produtos de maneira uniforme, possibilitam que a fermentação

submersa se torne uma alternativa promissora para a produção eficiente de biomassa de fungos e

seus metabólitos de interesse biotecnológico (GREGORI et al., 2007). Assim, este trabalho teve por

7

objetivo realizar o cultivo de uma linhagem de basidiomiceto sob diferentes concentrações de

indutores visando a produção de lacase e biomassa micelial.

MATERIAL E MÉTODO

O estudo foi conduzido nos laboratórios de Biotecnologia, Microbiologia e Farmacotécnica

da Universidade Paranaense - UNIPAR, Unidade Universitária de Toledo, entre os meses de abril e

outubro de 2018.

Microrganismos e produção de inóculo

Três linhagens (U15-3, U15-7 e U16-5) de basidiomicetos pertencentes à coleção de culturas

do Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Aplicada à Agricultura da Universidade

Paranaense (UNIPAR), Unidade Universitária de Umuarama, foram utilizadas neste estudo. Com

exceção da linhagem U16-5, os outros dois isolados se encontram em fase de identificação

molecular (Tabela 1).

Tabela 1: Provável táxon e local de coleta das três linhagens de fungos

basidiomicetos.

Linhagem Provável Táxon Local de Coleta

U15-3 Puffball Umuarama - PR

U15-7 Polyporaceae Iporã - PR

U16-5 Trametes polyzona Umuarama - PR

As linhagens foram mantidas em meio ágar-extrato de malte (AEM) 1% (m/v) a 28 ºC por

repique contínuo e cultivadas em AEM 2% (m/v) a 28 ºC para produção de inóculo.

Cultivo submerso

O meio fermentativo utilizado no cultivo submerso foi o extrato de malte, preparado com 20

g de malte para 1 L de água purificada (2%, m/v). Após o preparo do meio, foram inoculados cinco

discos de AEM (6 mm de diâmetro) contendo o micélio sem setoriamento. Os frascos foram

mantidos por 14 dias a 28 ºC, sem influência de luz e agitação (BOD). Ao final do período de

cultivo, foi realizada a filtração de cada amostra utilizando bomba a vácuo. Com o filtrado foi

determinada a atividade de lacase e o pH final do meio, enquanto que a biomassa micelial foi

avaliada com o resíduo retido no papel filtro.

8

Determinação da atividade de lacase

Por meio da oxidação de uma solução (1 mM) de ABTS (2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-

6-sulfatonato), foi avaliada a atividade de lacase. Para isso, 0,2 mL do meio de cultivo foi

misturado com 0,7 mL de água, 0,45 mL de tampão acetato de sódio (0,1 M, pH 5,0) e 0,15 mL de

ABTS (HAN; CHOI; SONG, 2005). A mistura foi mantida a 30 ºC por 10 minutos, sendo esta

diluída com 3,5 mL de água purificada e, então, realizada a leitura da absorbância a 420 nm (ε

=36000 M-1 cm-1). Como controles analíticos foram utilizadas uma mistura de meio de cultivo (0,2

mL), água (0,85 mL) e tampão acetato de sódio (0,45 mL) e outra mistura de água (0,9 mL),

tampão acetato de sódio (0,45 mL) e ABTS (0,15 mL). Uma unidade (U) de atividade enzimática

foi definida como a quantidade de enzima necessária para oxidar 1 μmol de ABTS por minuto

(BOURBONNAIS; LEECH; PAICE, 1998).

Determinação da biomassa micelial

A biomassa de cada amostra foi introduzida em frascos de coleta universal previamente

secos e tarados em balança analítica com quatro casas decimais. Os frascos com o material fúngico

foram levados à estufa de secagem com ar circulante a 60 ºC até massa constante (MARIM, 2017).

Determinação do pH

A leitura do pH foi feita por meio da imersão do eletrodo do pHmetro (marca Gehaka®),

previamente calibrado com soluções padrão pH 4 e 7, no filtrado de cada linhagem. Além disso, o

pH do meio de cultivo também foi determinado no primeiro dia, antes da inoculação das linhagens.

Influência de indutores sobre a produção de lacase e biomassa micelial

A linhagem que demonstrou maior atividade enzimática foi cultivada nas mesmas condições

do experimento anterior, acrescida de diferentes concentrações de indutores. Inicialmente foi

testada a interferência do sulfato de cobre (CuSO4) a 50, 100, 150, 200 e 250 µM, sendo um grupo

sem o composto empregado como controle.

Feito isso, o CuSO4 nas diferentes concentrações foi associado aos indutores aromáticos

guaiacol, xilidina e por último vanilina, todos a 1 mM. O tratamento contendo apenas o indutor

aromático foi usado como controle em cada um dos experimentos. Lembrando que também foi

avaliada a influência dos diferentes indutores aromáticos em relação ao controle (sem indutor). Os

indutores foram esterilizados por filtração (membrana Millipore 0,22 μm) e adicionados

assepticamente aos meios de cultivo no quarto dia de fermentação.

A atividade de lacase, a produção de biomassa micelial e a leitura do pH do meio foram

determinadas no 14º dia de cultivo, conforme procedimentos descritos anteriormente.

9

Análise estatística

Todos os ensaios seguiram o delineamento inteiramente casualizado (DIC), conduzidos em

triplicata. Os resultados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e as diferenças

significativas entre as médias (p≤0,05) determinadas pelo teste de Scott-Knott com auxílio do

software SISVAR 5.6 - DEX - UFLA.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Depois de permanecerem 14 dias sob temperatura de 28 ºC na BOD, foi analisada a

atividade enzimática, biomassa e pH final do meio contendo as linhagens U15-3, U15-7 e U16-5,

com o objetivo de utilizar a linhagem que registrasse maior produção enzimática para a avaliação

sob a influência de indutores. Neste caso, a linhagem U15-7 teve a maior produção de lacase (32323

U L-1), sendo superior estatisticamente à linhagem U15-3 (25240 U L-1), seguida da U16-5 (11140

U L-1) (Tabela 3).

Um meio de cultura líquido possui muita importância para a produção de fungos, devendo

conter fontes de nitrogênio, carbono e minerais (BARBOSA et al., 2004). Se controladas as

condições de pH e temperatura, a fermentação em estado submerso é a mais propícia ao

crescimento dos microrganismos e consequente recuperação das enzimas extracelulares (FEITOSA,

2009). Além disso, os meios líquidos são facilmente controlados e satisfatórios para a produção de

lacase (MAJEU; TYAGI, 2010). Fenice et al. (2003) verificaram em seu estudo que a produção de

lacase em fermentação em estado submerso foi maior (4600 U L-1) do que em fermentação em

estado sólido (1300 U L-1).

Tabela 3: Atividade de lacase, produção de biomassa e pH final do meio de cultivo de três

linhagens (U15-3, U15-7 e U16-5) mantidas em meio extrato de malte 2% a 28 ºC por 14 dias.

Todos os resultados foram expressos em média ± desvio padrão.

Linhagem Atividade de lacase

(U L-1)

Produção de biomassa

(mg mL-1)

pH final do meio

T0 = 5,63 ± 0,01b

U15-3 25240 ± 1827b 35,392 ± 4,615c 6,06 ± 0,141a

U15-7 32323 ± 1168a 130,946 ± 7,765a 5,06 ± 0,176 c

U16-5 11140 ± 1649c 56,332 ± 12,703b 4,61 ± 0,062d

*Letras minúsculas comparam colunas e letras diferentes indicam diferença estatística pelo teste de Scott-Knott

(p≤0,05).

10

Em relação ao crescimento micelial, foi possível perceber que a maior produtora também foi

a linhagem U15-7 (130,946 mg mL-1), seguida da linhagem U16-5 (56,332 mg mL-1) e por último,

da U15-3 (35,392 mg mL-1) (Tabela 3).

A biomassa é constituída por citosol, parede celular e membrana plasmática. Fazendo parte

do metabolismo dos fungos, ela confere o formato das células e possui uma flexibilidade para que

ocorram mudanças nas suas estruturas durante o seu desenvolvimento, fornecendo aos fungos

proteção contra ações mecânicas, ataque de outros microrganismos, mudanças de calor e frio e

pressão osmótica (PÉREZ; RIBAS, 2004; FUKUDA et al., 2009; GUPTA et al., 2012; FREE,

2013).

Os fungos alteraram o pH durante o cultivo, demonstrando diferença estatística entre as

linhagens mantidas em extrato de malte 2%. O maior valor de pH foi visto para a linhagem U15-3

(pH 6,06), que obteve um aumento estatístico quando comparada ao T0 (pH 5,63). As demais

linhagens U15-7 (pH 5,06) e U16-5 (pH 4,61) também registraram uma diferença estatística em

relação ao T0, entretanto, apresentaram pH inferior ao mesmo e diferentes entre si (Tabela 3).

Com exceção dos fungos filamentosos, que podem suportar variação do pH de 2,0 a 9,0, o

pH ideal para o cultivo fúngico varia de 4,0 a 6,0 (SANTAELLA et al., 2009). Segundo Prasad et al

(2005), o pH é um parâmetro que pode ser utilizado como mecanismo de otimização da produção

enzimática. Fato justificado por Tavares et al. (2006), que por meio de um estudo em diferentes

concentrações iniciais de glucose utilizando o fungo Trametes versicolor, constataram que quanto

menor o pH, menor a produção de lacase.

Devido ao melhor resultado da atividade de lacase entre as três linhagens analisadas (U15-3,

U15-7 e U16-5) ser da linhagem U15-7, ao quarto dia após sua nova inoculação, foram acrescidos

ao meio os indutores sulfato de cobre associado ou não ao guaiacol, xilidina e vanilina, para avaliar

a influência destes na atividade de lacase, produção de biomassa e pH do meio de cultivo.

Embora as diferentes concentrações de cobre tenham promovido um aumento da produção

de lacase, esse aumento não foi significativo em relação ao controle (34907 U L-1), que não possuía

a presença do indutor (Tabela 4). Os resultados elevados na produção de lacase devem ser

atribuídos a uma característica da linhagem, e não como influência do indutor sulfato de cobre,

podendo ser utilizado 50 µM devido a proximidade da atividade de lacase nas diferentes

concentrações ou até mesmo nem adicioná-lo.

Segundo Faraco, Giardina e Sannia (2003), a influência do cobre na regulação da expressão

gênica de lacase ocorre via elementos sensíveis a metal (MRE - metal responsive element) presentes

na região promotora de genes de lacase, sendo indiretamente afetados pela presença de cobre no

meio de cultivo. Mais tarde, os autores identificaram quatro MREs na região promotora de dois

genes de lacase de Pleurotus ostreatus.

11

Tabela 4: Atividade de lacase, produção de biomassa e pH final do meio líquido extrato de malte

2% contendo a linhagem U15-7 sob influência do indutor sulfato de cobre em diferentes

concentrações (50 a 250 µM). Resultados expressos em média ± desvio padrão.

Sulfato de cobre

(µM)

Atividade de lacase

(U L-1)

Produção de

biomassa (mg mL-1)

pH final do meio

T0 = 5,67 ± 0,000a

0 (C) 34907 ± 2266a 119,436 ± 5,939a 5,23 ± 0,000b

50 36967 ± 1816a 114,422 ± 2,488a 4,88 ± 0,070c

100 36234 ± 676a 101,809 ± 14,352a 4.,93 ± 0,020c

150 37068 ± 257a 109,174 ± 4,771a 4,79 ± 0,060c

200 37654 ± 524a 102,113 ± 10,490a 4,79 ± 0,047c

250 36659 ± 215a 99,235 ± 5,632a 4,78 ± 0,145c

(C) = controle; T0 = tempo zero.


(p≤0,05).

Fonseca et al. (2010) constataram uma maior produção de lacase na presença de 500 µM de

cobre por diferentes espécies nativas da Argentina (Ganoderma applanatum, Peniophora sp.,

Pycnoporus sanguineus e Coriolus versicolor f. antarcticus). Apesar dos dados disponíveis sobre a

presença de MREs nos promotores de lacases, são poucas as análises sobre os mecanismos

moleculares envolvidos na regulação da expressão de lacase por diferentes estímulos, como

presença de cobre.

Além de provocar o aumento da atividade de lacase, o cobre ainda induz a transcrição da

enzima. O estresse oxidativo provocado pela adição do metal aos cultivos tem sido relacionada à

indução da transcrição (GALHAUP; HALTRICH, 2001). Fato comprovado por Peralta, Souza e

Bôer (2004), que ao constatarem que a produção de lacase por Pleurotus pulmonarius aumentou

com o cobre, determinaram que a razão fisiológica da produção pela adição de cobre é o estresse

provocado pelos íons cobre. Entretanto, o cobre é extremamente tóxico para as células microbianas

em níveis mais elevados em sua forma livre (HESS et al., 2002).

De acordo com Saparrat et al. (2002), na presença de 150 µM de CuSO4, a produção de

lacase por Coriolopsis rigida foi antecipada e aumentou cerca de 500 vezes (~95000 U L-1). Mais

recentemente, Silva et al. (2012) também observaram aumento significativo da produção de lacase

com a adição de CuSO4 na mesma concentração de 150 M feita após 3 dias de cultivo por

linhagens de Lentinula edodes, Pleurotus ostreatus e Pleurotus florida.

Outra análise que também não apresentou diferença significativa em relação ao controle foi

a produção de biomassa, reforçando assim a ausência de uma interferência do sulfato de cobre sobre

a linhagem (Tabela 4). No trabalho realizado por Nogueira et al. (2009), os meios de cultura (Batata

dextrose; Pontecorvo e Extrato de malte + Peptona) proporcionaram o crescimento micelial de

Lentinus strigellus quando submetidos à luz e a condições estáticas. O meio de cultivo de batata

12

proporcionou a maior produção de biomassa, considerando a massa micelial seca da colônia no

período de 20 dias.

Já o pH do controle (5,23) quando comparado ao T0 (5,67) apresentou resultados estatísticos

inferiores, porém, superior em comparação com as diferentes concentrações de sulfato de cobre

(Tabela 4). Segundo diversos estudos, uma boa produção enzimática pelas enzimas obtidas por

meio dos fungos ocorre entre as faixas de pH 3,0 e 5,2, sendo que estas estão relacionadas com as

funções fisiológicas e nicho ecológico das mais diferentes espécies (BALDRIAN, 2006;

MADHAVI; LELE, 2009; GIARDINA et al., 2010; STRONG; CLAUS, 2011).

Na segunda bateria de tratamento, foi avaliada de maneira isolada a influência do guaiacol,

seguida da associação com o sulfato de cobre em diferentes concentrações. Tanto a atividade

enzimática, quanto o crescimento micelial não apresentaram diferença estatística em relação ao

controle (somente indutor guaiacol) (Tabela 5).

Além do MRE, a região promotora de genes de lacase possui sequências denominadas

elementos sensíveis a xenobióticos (XRE - xenobiotic responsive element) e elementos sensíveis a

antioxidantes (ARE - antioxidant responsive element). Por meio da interação com outros elementos,

essas sequências estimulam a transcrição de genes de lacase na presença de compostos aromáticos

(GIARDINA et al., 2010). A presença desses elementos na região promotora possibilitaria a

indução da lacase por compostos aromáticos e a ausência de indução ocorre pela ausência desses

elementos (GIARDINA et al., 2010; PISCITELLI et al., 2011).


2% contendo a linhagem U15-7 sob influência do indutor guaiacol (1 mM) e em associação com

sulfato de cobre em diferentes concentrações (50 a 250 µM). Resultados expressos em média ±

desvio padrão.

Sulfato de

cobre (µM)

Guaiacol

(mM)

Atividade de lacase

(U L-1)

Produção de

biomassa (mg mL-1)

pH final do meio

T0 = 5,67 ± 0,000a

0 (C) 1 37484 ± 1303a 136,325 ± 3,772a 4,84 ± 0,010b

50 1 39243 ± 773a 123,753 ± 14,844a 4,73 ± 0,010c

100 1 39151 ± 1064a 121,787 ± 0,440a 4,74 ± 0,005c

150 1 40578 ± 1853a 117,231 ± 3,904a 4,65 ± 0,086c

200 1 39583 ± 1376a 130,358 ± 18,787a 4,58 ± 0,105d

250 1 39691 ± 1539a 121,518 ± 4,665a 4,47 ± 0,080e



(p≤0,05).

Terron et al. (2004) observaram com a adição de diversos compostos fenólicos, dentre eles o

guaiacol, um aumento na produção de lacase por Trametes sp. Além de demonstrar que o guaiacol

13

parece ter efeito na atividade de lacase, com os resultados do estudo relatado foi possível notar

efeitos na expressão de genes desta enzima por Trametes sp. Xiao et al. (2006) também perceberam

que a produção de lacase por Trametes sp. foi afetada pelo guaiacol, produzindo 712 U L-1 na

presença de 12 mM de indutor.

O pH do meio de cultivo contendo apenas guaiacol e em associação com sulfato de cobre

não foram superiores ao pH do tempo zero (pH 5,67). Porém, o tratamento com guaiacol se

apresentou estatisticamente superior (pH 4,84) às associações de guaiacol com sulfato de cobre.

Para as concentrações de 50 µM (pH 4,73), 100 µM (pH 4,74) e 150 µM (pH 4,65) não houve

diferença estatística significativa entre si. A concentração de 200 µM foi inferior (pH 4,58) quando

comparada às anteriores, entretanto, superior à concentração de 250 µM (pH 4,47) (Tabela 5).

Em seus estudos, Marim (2017) constatou que o pH inicial do meio de cultivo a base de

extrato de malte influenciou a produção de biomassa (p≤0,05) do fungo Lentinus crinitus. A maior

produção da linhagem U13-5 ocorreu em pH 5 (3,4 mg mL-1). Houve uma redução da produção da

biomassa da linhagem quando elevou-se o pH para 6 (3 mg mL-1) e 7 (2,9 mg mL-1).

Segundo Wesenberg, Kyriakides e Agathos (2003), o pH para cultivo desses fungos deve

estar entre 2,0 e 8,5 para que haja ótima produção da enzima lacase. Mukherjee et al. (2013)

reforçaram essa vantagem dos fungos serem cultivados em uma ampla faixa de pH, possibilitando

uma produção enzimática eficaz.

A terceira bateria de tratamento contou com a presença do indutor xilidina. A atividade de

lacase do tratamento com o indutor aromático (33295 U L-1) teve resultados estatisticamente

inferiores quando comparada às associações xilidina + sulfato de cobre em diferentes concentrações

(Tabela 6). Ou seja, a produção enzimática aumentou em 18% na associação de xilidina 1 mM com

50 µM de sulfato de cobre, 16% (xilidina 1 mM + sulfato de cobre 100 µM), 14% (xilidina 1 mM +

sulfato de cobre 150 µM), 18% (xilidina 1 mM + sulfato de cobre 200 µM) e 19% (xilidina 1 mM +

sulfato de cobre 250 µM).

Rancaño et al. (2003) compararam a interferência de etanol, álcool veratrílico e xilidina na

produção de lacase por Trametes versicolor e constataram que a xilidina se destacou, apresentando

os melhores resultados na indução da atividade enzimática (cerca de 1500 U L-1), aumentando 14

vezes a produção em relação a nenhum indutor adicionado ao meio (controle).

A xilidina foi a que conduziu a maiores atividades enzimáticas para o fungo Trametes

modesta entre muitos indutores testados (NYANHONGO et al., 2002). A adição de 2,5-xilidina

aumentou a atividade de lacase 50 vezes por diferentes linhagens do fungo Pycnoporus sanguineus

(POINTING; JONES; VRIJMOED, 2002). Por outro lado, estudos mostraram que outros fungos

como Chalara paradoxa (ROBLES et al., 2002) e Pleurotus pulmonarius (SOUZA et al., 2004) não

responderam à indução por 2,5-xilidina.

14


2% contendo a linhagem U15-7 sob influência do indutor xilidina (1 mM) e em associação com


desvio padrão.

Sulfato de

cobre (µM)

Xilidina

(mM)

Atividade de lacase

(U L-1)

Produção de

biomassa (mg mL-1)

pH final do meio

T0 = 5,67 ± 0,000a

0 (C) 1 33295 ± 2424b 81,876 ± 6,754c 4,77 ± 0,015b

50 1 39220 ± 257a 121,889 ± 5,321a 4,79 ± 0,050b

100 1 38719 ± 658a 103,718 ± 7,623b 4,83 ± 0,077b

150 1 37939 ± 2016a 123,630 ± 0,906a 4,83 ± 0,025b

200 1 39413 ± 1604a 115,759 ± 6,298a 4,71 ± 0,025b

250 1 39482 ± 698a 109,285 ± 7,119b 4,74 ± 0,112b



(p≤0,05).

A produção de biomassa teve maiores resultados nas concentrações de xilidina + cobre a 50

µM, 150 µM e 200 µM, sendo o aumento de 49%, 51% e 41%, respectivamente. As concentrações

associadas de 100 µM e 250 µM de cobre foram estatisticamente inferiores às outras, entretanto,

superiores quando comparada à produção de biomassa do tratamento somente com xilidina (81,876

mg mL-1). Neste caso, o acréscimo na produtividade foi de 27% (100 µM ) e 33% (250 µM). Todos

os resultados de pH foram inferiores ao tempo zero e não demonstraram diferenças estatísticas

significativas entre si (Tabela 6).

Conforme Campos et al. (2010), a produção micelial depende das características metabólicas

de cada linhagem, podendo algumas apresentar menor tempo de produção. Em seus estudos, o meio

líquido apresentou melhor produção de biomassa quando foram cultivados fungos a 30 ºC por 20

dias. Além disso, pôde-se verificar máxima produção de biomassa pelos fungos Pleurotus em nove

dias de cultivo em meio Pontecorvo sem agitação.

Conforme Purschwitz et al. (2006), evidências mostram que a sinalização de pH envolve um

complexo de membranas. Ainda no estudo ressalta-se que o pH ambiente regula a virulência

fúngica em plantas, insetos e animais, sendo que existem características específicas de pH para cada

espécie.

A última bateria de tratamento foi exposta ao indutor vanilina, de maneira isolada e

associada com o sulfato de cobre em diferentes concentrações. Os resultados da atividade de lacase

não apresentaram diferença estatística significativa. Ao contrário da produção de biomassa, que

apresentou diferenças no tratamento com a vanilina + sulfato de cobre a 50 µM (136,979 mg mL-1),

100 µM (146,902 mg mL-1) e 200 µM (134,944 mg mL-1), sendo inferiores quando comparadas à

biomassa dos tratamentos submetidos à presença exclusiva da vanilina e da associação com as

15

concentrações de cobre 150 µM (163,544 mg mL-1) e 250 µM (153,970 mg mL-1). Nenhum pH foi

superior ao T0 e não apresentaram diferenças estatísticas significativas entre si (Tabela 7).


2% contendo a linhagem U15-7 sob influência do indutor vanilina (1 mM) e em associação com


desvio padrão.

Sulfato de

Cobre (µM)

Vanilina

(mM)

Atividade de

Lacase (U L-1)

Produção de

biomassa (mg mL-1)

pH final do meio

T0 = 5,67 ± 0,000a

0 (C) 1 37669 ± 810a 156,909 ± 3,575a 4,72 ± 0,078b

50 1 40277 ± 1641a 136,979 ± 2,105b 4,74 ± 0,090b

100 1 40478 ± 1588a 146,902 ± 13,707 b 4,67 ± 0,064b

150 1 39405 ± 1106a 163,544 ± 8,574a 4,65 ± 0,047b

200 1 40215 ± 1500a 134,944 ± 0,485b 4,56 ± 0,015b

250 1 40339 ± 846a 153,970 ± 10,230a 4,65 ± 0,105b



(p≤0,05).

Determinados tipos de fungos da classe dos Basidiomicetos quando incubados com

compostos fenólicos, são induzidos à produção de lacase (FARNET et al., 2004; GARCIA;

SANTIAGO; ULHOA, 2006; SHRADDHA et al., 2011). Pode ser observado em alguns estudos a

vanilina sendo utilizada na indução da produção de lacase (SOUZA et al., 2004; CAVALLAZZI;

KASUYA; SOARES, 2005).

Para ocorrer o aumento da conversão de ácido vanílico para vanilina pelo fungo, deve haver

uma diminuição de vanilina no meio, pois acima da concentração de 1 g L-1, a vanilina é tóxica para

os microrganismos de maneira geral (LOPEZMALO; ALZAMORA; ARGAIZ, 1997).

Bugarski et al. (2002) avaliaram meios de cultivo contendo diferentes concentrações de

carboidrato (0,1; 0,2 e 0,3% de Maltex - extrato de malte contendo 55% de maltose e maltotriose e

10% de glicose e frutose) no crescimento micelial de duas linhagens de Pleurotus ostreatus. O meio

de cultivo que continha a maior concentração de açúcar proporcionou as melhores condições de

crescimento micelial para as duas linhagens.

Os microrganismos devem se adaptar ao pH para sobreviver e proliferar. Estas condições de

pH interno são um meio de garantir que a síntese das moléculas ou enzimas segregadas e

metabólitos ocorram apenas a valores de pH em que melhor se adaptam (PEÑALVA et al., 2008).

Com base nos resultados obtidos, foi possível avaliar a influência dos indutores aromáticos

no metabolismo da linhagem fúngica testada (Tabela 8). A atividade de lacase da linhagem U15-7

sob influência do guaiacol (37484 U L-1) e da vanilina (37669U L-1) foram superiores

16

estatisticamente em relação a da xilidina (33295 U L-1) e ao controle (34907 U L-1). Já a produção

de biomassa sob influência da vanilina (156,909 mg mL-1) foi superior ao do guaiacol (136,325 mg

mL-1), que por sua vez, apresentou resultado estatístico superior ao controle (119,436 mg mL-1) e

xilidina (81,876 mg mL-1).

A indução via compostos aromáticos se dá em nível transcricional, ocorrendo de forma

distinta para diferentes fungos, bem como entre diferentes isoenzimas do mesmo organismo

(PISCITELLI et al., 2011). A concentração e a estrutura dos compostos aromáticos desempenham

uma importante função na regulação da síntese enzimática (ELISASHVILI et al., 2010).


2% contendo a linhagem U15-7 sob influência dos indutores aromáticos guaiacol, xilidina e

vanilina (1 mM) em comparação ao controle (ausência de indutor). Resultados expressos em média

± desvio padrão.

Tratamento Atividade de lacase

(U L-1)

Produção de biomassa

(mg mL-1)

pH final do meio

T0 = 5,67 ± 0,000a

Controle 34907 ± 2266b 119,436 ± 5,939c 5,23 ± 0,000b

Guaiacol 37484 ± 1303a 136,325 ± 3,772b 4,84 ± 0,010c

Xilidina 33295 ± 2424b 81,876 ± 6,754d 4,77 ± 0,015d

Vanilina 37669 ± 810a 156,909 ± 3,575a 4,72 ± 0,078d

T0 = tempo zero.


(p≤0,05).

O T0 foi superior a todos os pHs, seguido pelo pH do controle (pH 5,23), que apresentou

resultados estatísticos superiores ao pH da linhagem U15-7 sob influência do guaiacol (pH 4,84).

Tanto os tratamentos que foram submetidos à influência da xilidina (pH 4,77), quanto da vanilina

(pH 4,72) foram inferiores estatisticamente ao guaiacol (pH 4,84) (Tabela 8).

Baseado nos estudos de Joshi et al. (2013), pode-se afirmar que o pH do meio de cultivo tem

influência direta na produção micelial dos fungos basidiomicetos, pois ao buscarem maior

produtividade de biomassa micelial por Schizophyllum commune em diferentes pHs, observaram

que os resultados foram melhores quando o pH foi ajustado para 6, produzindo 8,6 mg mL-1 em 14

dias.

Strong (2011) utilizou água residual de destilaria de conhaque com o pH ajustado entre 3,5 e

6 no cultivo de Trametes pubescens e observou que os pHs diferentes ocasionaram uma grande

variação na produção de lacase, tendo sua produção maior quando o pH inicial foi 5.

17

CONCLUSÃO

A linhagem U15-7 apresentou resultados superiores em relação à produção de lacase e

biomassa micelial.

Somente a xilidina estimulou a atividade enzimática e crescimento fúngico, quando

associada a diferentes concentrações de cobre. Nenhum pH foi superior ao T0 (pH 5,67) e ao

controle (pH 5,23).

Os indutores aromáticos vanilina e guaiacol se destacaram na produção de lacase em relação

à xilidina e ao controle. Vanilina também foi superior estatisticamente para produção de biomassa.

Novos estudos são necessários a fim de otimizar a influência de indutores no metabolismo fúngico.

REFERÊNCIAS

AGUIAR, A.; FERRAZ, A. Mecanismos envolvidos na biodegradação de materiais

lignocelulósicos e aplicações tecnológicas correlatas. Química Nova, v. 34, n. 10, p. 1729-1738,

2011.

BALDRIAN, P. Fungal laccases - occurrence and properties. FEMS microbiology reviews, v. 30,

n. 2, p. 215-242, 2006.

BARBOSA, A. M. et al. Produção e aplicações de exopolissacarídeos fúngicos. Seminário de

Ciências Exatas e Tecnológicas, v. 25, n. 1, p. 29-42, 2004.

BINOD, P. et al. Advances in fermentation technology. New Deli: Asiatech Pulishers, Inc, p.

291-319, 2008.

BOURBONNAIS, R.; LEECH, D.; PAICE, M. G. Electrochemical analysis of the interactions of

laccase mediators with lignin model compounds. Biochimica et Biophysica Acta - General

Subjects, v. 1379, n. 3, p. 381-390, 1998.

BUGARSKI, D. et al. Effect of major environmental conditions on the development of the

mycelium and growth of the oyster mushroom (Pleurotus ostreatus). Acta of Horticulture, v. 579,

2002.

CAMPOS, C. et al. Produção de biomassa, proteases e exopolissacarídeos por Pleurotus ostreatus

em cultivo líquido. Arquivo Ciências Veterinária Zoologia. UNIPAR, v. 13, n. 1, p. 19-24, 2010.

CAVALAZZI, J. R. P.; KASUYA, C. M.; SOARES, M. A. Screening of inducers for laccase

production by Lentinula edodes in liquid medium. Brazilian Journal of Microbiology, n. 36, p.

383-387, 2005.

18

CERNIGLIA, C. E.; SUTHERLAND, J. B. Degradation of polycyclic aromatic hidro carbons by

fungi. In: TIMMIS, K. N. Handbook of hydro carbono and lipid microbiology. Heidelberg:

Springer-Verlag, 2010.

COUTO, S. R.; TOCA-HERRERA, J. L. Laccase production at reactors cale by filamentous

fungi. Biotechnology Adv., v. 25, p. 558-569, 2007.

DEKKER, R. F. H. et al. Influence of nutrients on enhancing laccase production by

“Botryosphaeria rhodina” MAMB-05. Journal of the Spanish Society for Microbiology, v. 10, n.

3, p. 177-186, 2007.

ELISASHVILI, V. et al. Effect of aromatic compounds on the production of laccase and manganese

peroxidase by white-rot basidiomycetes. Journal Ind. Microbiology Biotecnology, v. 37, p. 1091-

1096, 2010.

FARACO, V.; GIARDINA, P.; SANNIA, G. Metal responsive elements in Pleurotus ostreatus

laccase gene promoters. Great Britain Microbiology, v. 149, p. 2155- 2162, 2003.

FARNET, A. et al. Purification of a laccase from Marasmius quercophilus induced with ferulic

acid: reactivity towards natural and xenobiotic aromatic compounds. Enzyme and Microbial

Technology, Amsterdam, v. 34, p. 549-554, 2004.

FEITOSA, I. C. Produção de enzimas lipolíticas utilizando bactéria isolada de solo com

histórico de contato com petróleo em fermentação submersa. Dissertação (Mestrado em

Engenharia de Processos) - Universidade Tiradentes, Aracaju, 2009.

FENICE, M. et al. Submerged and solid-state production of laccase and Mn-peroxidase by Panus

tigrinus on olive mill wastewater-based media. Journal of Biotechnology, v. 100, n. 1, p. 77-85,

2003.

FERREIRA, F. da S. et al. Otimização do crescimento de fungos degradadores de madeira.

Marupiara, v. 1, n. 1, 2016.

FONSECA, M. I. et al. Copper inducing effect on laccase production of white rot fungi native from

Misiones (Argentina). Enzyme and Microbial Technology, v. 46, p. 534- 539, 2010.

FREE, S. J. Fungal cell wall organization and biosynthesis. Advances in Genetics, v. 81, p. 33-82,

2013.

FUKUDA, E. K. et al. Polissacarídeos de parede celular fúngica: purificação e caracterização.

Semina: Ciências Agrárias, v. 30, p. 117-134, 2009.

GALHAUP, C.; HALTRICH, D. Enhanced formation of laccase activity by the white-rot fungus

Trametes pubescenes in the presence of copper. Applied Microbial Biotechnology, v. 56, p. 225-

232, 2001.

19

GARCIA, T. A.; SANTIAGO, M. F.; ULHOA, C. J. Properties of laccases produced by

Pycnoporus sanguineus induced by 2,5-xylidine. Biotechnology Letters, Dordrecht, v. 28, p. 633-

636, 2006.

GIARDINA, P. et al. Laccases: a never-ending story. Cellular and Molecular Life Sciences, v. 67,

p. 369-385, 2010.

GOU, M. et al. Azo dye decolorization by a new fungal isolate, Penicillium sp. QQ and fungal-

bacterial cocultures. Journal of Hazardous Materials, v. 170, p. 314-319, 2009.

GREGORI, A. et al. Cultivation techniques and medicinal properties of Pleurotus spp. Food

Technology and Biotechnology, v. 45, p. 236-247, 2007.

GUPTA, V.K. et al. (Ed.). Current methods in fungal biology. Springer Science & Business Media.

Laboratory protocols in fungal biology, 2012.

HAN, M.-J.; CHOI, H.-T.; SONG, H.-G. Purification and characterization of laccase from the white

rot fungus Trametes versicolor. The Journal of Microbiology, v. 43, n. 6, p. 555-560, 2005.

HERRERA-ESTRELLA, A.; HORWITZ, B. A. Looking through the eyes of fungi: molecular

genetics of photoreception. Molecular Microbiology, v. 64, n. 1, p. 5-15, 2007.

HESS, J. et al. Enhanced formation of extracellular laccase activity by the white rot fungus

Trametes versicolor. Applied Biochemistry and Biotechnology, v. 98, p. 229-241, 2002.

JOSHI, M. et al. Nutrient improvement for simultaneous production of exopolysaccharide and

mycelial biomass by submerged cultivation of Schizophyllum commune AGMJ-1 using statistical

optimization. 3 Biotechnology, v. 3, n. 4, p. 307-318, 2013.

KAMIDA, H. M. et al. Biodegradação de efluente têxtil por Pleurotus sajor-caju. Química Nova,

v. 28, n. 4, p. 629-632, 2005.

KIRK, P. M. et al. Dictionary of the fungi. CAB International, Wallingford, v. 396. 2010.

LOPEZ-MALO, A.; ALZAMORA, S. M.; ARGAIZ, A. Effect o fvanillin concentration, pH and

incubation temperature on Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus and

Aspergillus parasiticus growth. Food Microbiology, Summit Argo, v. 14, p. 117-124, 1997.

MADHAVI, V.; LELE, S. S. Laccase: properties and applications. Bio Resources, v. 4, p. 1694-

1717, 2009.

MAJEAU, J.; BRAAR, S. K.; TYAGI, R. D. Laccases for removal of recalcitrante and emerging

pollutants. Bioresource Technology, v. 101, p. 2331-2350, 2010.

MARIM, A. R. Cultivo de Lentinus crinitus em diferentes condições abióticas visando a

produção de lacase.2017, 50 f. Tese (Mestrado em Biotecnologia) - Universidade Paranaense -

UNIPAR. Umuarama, 2017.

MELO, I. S.; AZEVEDO, J. L. Microbiologia ambiental. v. 2. Jaguariúna: Embrapa Meio

Ambiente, 2008. 647p.

20

MOREIRA NETO, S. L. Enzimas ligninolíticas produzidas por Psilocybe castanella CCB 444

em solo contaminado com hexaclorobenzeno. 2006, 110f. Dissertação (Mestrado em

Biodiversidade Vegetal e Meio Ambiente) - Instituto de Botânica da Secretaria de Estado do Meio

Ambiente, São Paulo, 2006.

MUKHERJEE, S. et al. Potential use of polyphenol oxidases (PPO) in the bioremediation of

phenolic contaminants containing industrial wastewater. Reviews in Environmental Science and

Bio/Technology, v. 12, p. 61-73, 2013.

MUNARI, F. M. et al. Decolorization of textile dyes by enzymatic extract and submerged cultures

of Pleurotus sajor-caju. World Journal of Microbioly Biotechnoly, v. 24 p. 1383-1392, 2008.

NIEUWENHUIJZEN, B. V.; OEI, P. O cultivo de cogumelos em pequena escala: pleuroto,

shiitake e orelha-de-pau. Fundação Agromisa e CTA, p. 90, 2006.

NOGUEIRA, J. C. et al. Efeito da temperatura e do meio de cultura na produção de biomassa

micelial de Lentinus strigellus. XVIII Jornada de Iniciação Científica PIBIC

CNPq/FAPEAM/INPA. Manaus. 2009.

NYANHONGO, G. S. et al. Production of laccase by a newly isolated strain of Trametes modesta.

Bioresource Technology v. 84, p. 259-263, 2002.

PAULA, E. J. et al. Introdução à Biologia das Criptógamas. São Paulo: Instituto de Biociências

da Universidade de São Paulo, Departamento de Botânica, p. 184, 2007.

PEÑALVA, M. A. et al. Ambient pH gene regulation in fungi: making connections. Trends in

microbiology, v. 16, n. 6, p. 291-300, 2008.

PÉREZ, P.; RIBAS, J. C. Cell wall analysis. Methods, v. 33, n. 3, p. 245-251, 2004.

PERALTA, R. M.; SOUZA, C. G. M.; BÔER, C. G. As principais oxidorredutases de uso

industrial. In: Said, S.; Pietro, R. C. L. R. (Ed.). Enzimas como agentes biotecnológicos, 2004.

PISCITELLI, A. et al. Induction and transcriptional regulation of laccases in fungi.Current

Genomics, v. 12, p. 104-112, 2011.

POINTING, S. B.; JONES, E. B. G; VRIJMOED, L. L. P. Optimization of laccase production by

Pycnoporus sanguineus in submerged liquid culture. Mycologia, v. 1, p. 139-144, 2002.

PRASAD, K.K. et al. Laccase production using Pleurotus ostreatus 1804 immobilized on PUF

cubes in batch and packed bed reactors: Influence of culture conditions. The Journal of

Microbiology, v. 43, p. 301-307, 2005.

PURSCHWITZ, J. et al. Seeing the rainbow: light sensing in fungi. Current opinion in

microbiology, v. 9, n. 6, p. 566-571, 2006.

RANCAÑO, G. et al. Production of laccase by Trametes versicolor in na airlift fermentor. Process

Biochemistry v. 39, p. 467-473, 2003.

21

ROBLES, A. et al. Characterization of laccase activity produced by the hyphomycete Chalara (syn.

Thielavopsis) paradoxa CH32. Enzyme and Microbial Technology, v. 31, p. 516-522, 2002.

SALVI, M. B. de. Fungos basidiomicetos em biorremediação. São Paulo: Instituto de Botânica

de São Paulo, 2011.

SANTAELLA, S. T. et al. Tratamento de efluentes de refinaria de petróleo em reatores com

Aspergillus niger. Engenharia Sanitária Ambiental, v. 14, n. 1, p. 139-148, 2009.

SAPARRAT, M. C. N. et al. Induction, isolation, and characterization of two laccases from the

white rot basidiomycete Coriolopsis rigida. Applied and Environmental Microbiology, v. 68, n.

4, p. 1534-1540, 2002.

SHRADDHA, R. S. et al. Laccase: microbial sources, production, purification, and potential

biotechnological applications. Enzyme Research, New York, v. 2011, p. 1-11, 2011.

SILVA, J. J. da et al. Produção de lacase de fungos basidiomicetos por fermentação submersa

com casca de café. Arquivos de Ciências Veterinárias e Zoologia da UNIPAR, v. 15, n. 2, supl 1, p.

191-196, 2012.

SOUZA, C. G. M. Production of laccase isoforms by Pleurotus pulmonarius in response to

presence of phenolic and aromatic compounds. Journal of Basic Microbiology, Berlin, v. 44, p.

129-136, 2004.

STRONG, P. J.; CLAUS, H. Laccase: a review of its past and its future in bioremediation. Critical

Reviews in Environmental Science and Technology, v. 4, p. 373-434, 2011.

STRONG, P. J. Improved laccase production by Trametes pubescens MB89 in distillery

wastewaters. Enzyme Research, 2011.

TAVARES, A. P. M. et al. Produção de lacase para potencial aplicação como oxidante na

indústria papeleira. 2006. 190 f. Tese (Doutorado em Engenharia Química) - Universidade de

Aveiro, 2006.

TERRÓN, M. C. et al. Structural close-related aromatic compound shave diferente effects on

laccase activity and onlcc gene expression in the ligninolytic fungus Trametes sp. Fungal Genetics

and Biology, v. 41, p. 954-962, 2004.

WESENBERG, D.; KYRIAKIDES, I.; AGATHOS, S. N. White-rot fungi and their enzymes for the

treatment of industrial dye effluents. Biotechnology Advances, v. 22, p. 161-187, 2003.

WONG, D. W. S. Structure and action mechanism of ligninolytic enzymes. Applied Biochemistry

and Biotechnology, v. 157, p. 174-209, 2009.

XIAO, Y.Z. et al. Cloning of novel laccase isozyme genes from Trametes sp. AH28-2 and analyses

of their differential expression. Applied Microbiology and Biotechnology, v. 71, p. 493-501,

2006.

22

23

24

Documents

ALEXANDRE FIORAVANTI SCHACHT CULTIVO DE UMA … · 2019. 12. 2. · Alexandre Fioravanti Schacht1 Douglas Rossi Jesus2 1Alexandre Fioravanti Schacht - Acadêmico do 4º ano do Curso