1

ALINE DOS SANTOS GARCIA GOMES AVALIAÇÃO DO POTENCIAL DOS ÁCIDOS OLEANÓLICO E URSÓLICO, ISOLADOS

DE Lippia lacunosa, EM INIBIR A FUNÇÃO DE TRANSPORTE DA Pdr5p DE Saccharomyces cerevisiae E DE QUIMIOSENSIBILIZAR UMA CEPA DE Candida

albicans RESISTENTE A FLUCONAZOL

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós Graduação em Ciências (Microbiologia), Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas (Microbiologia)

Orientador: Prof. Dr. Antonio Ferreira Pereira

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO INSTITUTO DE MICROBIOLOGIA PROF PAULO DE GÓES

FEVEREIRO DE 2010

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2

FICHA CATALOGRÁFICA

GARCIA-GOMES, Aline dos Santos Avaliação do potencial dos ácidos oleanólico e ursólico, isolados de Lippia lacunosa, em inibir a função de transporte da Pdr5p de Saccharomyces cerevisiae e de quimiosensibilizar uma cepa de Candida albicans resistente a fluconazol / Aline dos Santos Garcia Gomes – Rio de Janeiro. 156, número de folhas. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas). Universidade Federal do Rio de Janeiro/ Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes, 2010. Orientador: Antonio Ferreira Pereira Referencias Bibliográficas f: 121 1. MDR 2. S. cerevisiae 3. Pdr5p 4. Transportadores ABC 5. Lippia lacunosa 6. Ácido oleanólico 7. Ácido ursólico 8. C. albicans 9. Curcumina I. Ferreira-Pereira, Antonio II. UFRJ. Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes, Mestrado em Ciências Biológicas III. Avaliação do potencial dos ácidos oleanólico e ursólico, isolados de Lippia lacunosa, em inibir a função de transporte da Pdr5p de Saccharomyces cerevisiae e de quimiosensibilizar uma cepa de Candida albicans resistente a fluconazol.

3

ALINE DOS SANTOS GARCIA GOMES

AVALIAÇÃO DO POTENCIAL DOS ÁCIDOS OLEANÓLICO E URSÓLICO, ISOLADOS DE Lippia lacunosa, EM INIBIR A FUNÇÃO DE TRANSPORTE DA Pdr5p DE Saccharomyces cerevisiae E DE QUIMIOSENSIBILIZAR UMA CEPA DE Candida

albicans RESISTENTE A FLUCONAZOL Rio de Janeiro, 26 de fevereiro de 2010. ______________________________________________________________________

Dr. Antonio Ferreira Pereira, Prof. Associado, UFRJ

______________________________________________________________________

Dra. Ana Paula Vieira Colombo, Prof. Adjunto, UFRJ)

______________________________________________________________________

Dra.Tânia Beatriz Creczynski-Pasa, Prof. Associado, UFSC)

______________________________________________________________________

Dra. Eveline Gomes Vasconcelos, Prof. Associado, UFJF)

______________________________________________________________________

Dra. Rosangela Maria de Araujo Soares, Prof. Associado, UFRJ)

4

O presente trabalho foi realizado no Laboratório de

Bioquímica Microbiana, Departamento de

Microbiologia Geral, Instituto de Microbiologia Prof.

Paulo de Góes, Centro de Ciências da Saúde

(CCS), Universidade Federal do Rio de Janeiro,

sob a orientação do Prof. Dr. Antonio Ferreira

Pereira.

5

AGRADECIMENTOS

Inicialmente gostaria de agradecer a minha família, pelo apoio sempre constante e pela

torcida de que a formação que venho escolhendo para minha vida seja sempre a melhor. Não

teria como deixar de agradecer a meu noivo, José Miguel Machado, pelo carinho, amor, por me

entender, por estar sempre disponível para fazer qualquer figura não só para esta dissertação mas

também pôsteres de congressos e apresentações em geral, sem dúvida é ele que traz um toque de

beleza às minhas apresentações.

Aos meus amigos de laboratório, Antonio, Luciana, Geralda, Fernanda, Júlia e, mais

recentemente, Ana, gostaria de dizer que cada um de vocês contribuiu de uma maneira especial

para este trabalho, seja fazendo meus dias mais felizes e engraçados, seja me dando puxões de

orelha e me ensinando, muitas vezes, coisas que com certeza vou levar para o resto da vida, seja

me auxiliando indiretamente ou diretamente em meus experimentos, deixo a vocês aqui o meu

muito obrigada, vocês sem dúvida foram parte essencial destes anos que passei no Laboratório

de Bioquímica Microbiana e estão marcados em mim.

Obrigada a todos!

6

Como sempre, não teria como não

dedicar este trabalho aos meus pais.

As minhas vitórias são, e sempre serão, de vocês também.

7

RESUMO

Aline dos Santos Garcia Gomes

AVALIAÇÃO DO POTENCIAL DOS ÁCIDOS OLEANÓLICO URSÓLICO, ISOLADOS DE Lippia lacunosa, EM INIBIR A FUNÇÃO DE TRANSPORTE DA Pdr5p DE

Saccharomyces cerevisiae E DE QUIMIOSENSIBILIZAR UMA CEPA DE Candida albicans RESISTENTE A FLUCONAZOL

Orientador: Antonio Ferreira Pereira Resumo da Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências

(Microbiologia), Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes da Universidade Federal do Rio

de Janeiro, como parte dos requisitos necessários para a obtenção do título de Mestre em

Ciências Biológicas.

Dentre os diversos mecanismos que contribuem para o fenótipo de resistência a múltiplas drogas (MDR) em células fúngicas, a superexpressão de bombas de efluxo pertencentes às superfamílias de transportadores ABC e MFS, é a causa mais frequente de resistência a antifúngicos em isolados clínicos. Pdr5p, um transportador ABC presente em Saccharomyces cerevisiae, transporta uma grande variedade de substratos distintos, apresentando sobreposição de substratos com outros transportadores de fungos patogênicos, como os de Candida albicans, fazendo deste um interessante modelo de estudo para a identificação de novos compostos que poderiam funcionar como inibidores do MDR. O isolamento do ácido oleanólico e de uma mistura de ácido oleanólico e ácido ursólico de Lippia lacunosa, possibilitou um estudo para analisar a capacidade desses isômeros, diferenciados apenas pela posição de um grupamento metila, em inibir o efluxo de rodamina 6G promovido pela Pdr5p. O ácido oleanólico não foi capaz de restaurar o acúmulo deste composto, enquanto a mistura, quando usada na mesma concentração, mostrou uma capacidade moderada de inibir este efluxo. A utilização do ácido ursólico purificado mostrou que este composto era o responsável pela inibição visualizada para a mistura, apresentando uma forte inibição (~ 72%) da função de transporte da Pdr5p, necessitando de apenas 50 µM para promover a inibição do transporte. A caracterização da resistência de uma cepa de C. albicans hiperesistente a fluconazol isolada de um paciente HIV+ possibilitou uma avaliação do uso do ácido ursólico como um quimiosensibilizador quando utilizado em combinação com fluconazol, permitindo a inibição do crescimento desta cepa. Uma interação sinérgica entre estes dois compostos foi encontrada, permitindo reduzir o MIC80 desta cepa de 256 µg/ml para 4 µg/ml. Com este estudo nosso grupo mostrou uma nova função para o ácido ursólico como um inibidor do fenótipo de MDR apresentado por células fúngicas e um possível uso na clínica para sensibilizar cepas de C. albicans hiperesistentes ao tratamento com fluconazol.

8

ABSTRACT

Aline dos Santos Garcia Gomes

EVALUATION OF THE POTENTIAL OF OLEANOLIC AND URSOLIC ACID,

ISOLATED FROM Lippia lacunosa, TO INHIBIT THE TRANSPORT FUNCTION OF Pdr5p FROM Saccharomyces cerevisiae AND TO CHEMOSENSITIZE A Candida

albicans STRAIN HIPERESISTANT TO FLUCONAZOLE

Orientador: Antonio Ferreira Pereira Resumo da Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências

(Microbiologia), Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes da Universidade Federal do Rio

de Janeiro, como parte dos requisitos necessários para a obtenção do título de Mestre em

Ciências Biológicas.

Among several mechanisms contributing to the multiple drug resistance (MDR) phenotype in fungal cells, overexpression of efflux pumps, belonging to the ABC superfamily and to the MFS superfamily, is the most frequent cause of resistance to antifungal in clinical isolates. Pdr5p, an ABC pump present in Saccharomyces cerevisiae, transports a broad array of distinct substrates, with some overlaps with other pumps like those from Candida albicans, making it an interesting model of study useful for screening of new compounds that may function as MDR inhibitors. The isolation of oleanolic acid and a mixture of oleanolic and ursolic acid from Lippia lacunosa, enable a study to analyze the ability of these two isomers, differentiable only in the position of a methyl group, in inhibit rhodamine 6G efflux promoted by Pdr5p. Oleanolic acid was not able to restore rhodamine 6G accumulation, while the mixture, when used in the same concentration, showed a moderate capability to inhibit the efflux. The use of purified ursolic acid showed that this compound was the responsible of the inhibition visualized for the mixture, presenting a strong inhibition (~ 72%) of the transport function mediated by Pdr5p, needing 50 µM to inhibit this transport. A characterization of C. albicans strain hyperesistant to fluconazole isolated from a HIV+- patient enabled an evaluation of the use of ursolic acid as a chemosinsetizer when used in combination with fluconazole, permitting the growth inhibition of this strain. A synergistic interaction was found, permitting reduce the MIC80 from 256 µg/ml to 4 µg/ml. With this study our group showed a new function for ursolic acid as a MDR inhibitor for fungal cells expressing a MDR phenotype and a possible use in clinical practice to sensitize hyperesistant strains of C. albicans to fluconazole treatment.

9

Índice

1. Introdução 1

1.1 O uso de plantas medicinais pela humanidade 1

1.2 Resistência a múltiplas drogas 3

1.3 Os principais transportadores relacionados ao MDR em fungos 6

1.3.1 Transportadores ABC 6

1.3.1.1 Histórico 6

1.3.1.2 Definição e estrutura 6

1.3.1.3 Ciclo catalítico 10

1.3.1.4 Mecanismo de transporte 11

1.3.1.5 Sítio de ligação a drogas 14

1.3.2 Transportadores MFS 15

1.3.2.1 Histórico 15

1.3.2.2 Definição e estrutura 16

1.3.2.3 Mecanismo de transporte 18

1.4 Resistência a múltiplas drogas em fungos 19

1.4.1 Saccharomyces cerevisiae: um modelo de estudo 19

1.4.1.2 As cepas AD1234567 e AD124567 21

1.4.2 Candida albicans: um fungo de interesse clínico 22

1.5 Funções fisiológicas dos transportadores relacionados ao MDR em

fungos

25

1.6 Os terpenóides: ácido oleanólico e ácido ursólico 27

1.7 Revertendo o processo de MDR em fungos 32

2. Justificativa 35

3. Objetivos 36

4. Material e métodos 37

4.1 Produtos químicos e drogas 37

4.2 Isolamento de compostos 37

4.3 Crescimento dos microrganismos 37

4.4 Avaliação da toxicidade dos compostos frente as cepas de S. 38

10

cerevisiae e C. albicans

4.5 Efluxo de rodamina 6G 38

4.5.1 Análise qualitativa – Microscopia ótica de fluorescência 38

4.5.2 Análise quantitativa – Citometria de fluxo 39

4.6 Determinação da concentração mínima inibitória de antifúngicos de

uso clínico para cepas de C. albicans

40

4.7 Avaliação de atividade sinérgica entre ácido ursólico e fluconazol

frente ao isolado clínico de C. albicans

40

4.8 Avaliação da capacidade do isolado clínico de C. albicans em

extruir compostos fluorescentes

41

4.9 Análises estatísticas 41

5. Resultados 42

5.1 Avaliação da toxicidade do AO e da mistura AO/AU frente a cepas

AD1234567 e AD124567 de S. cerevisiae

42

5.2 Avaliação da capacidade do AO e da mistura AO/AU em inibir o

efluxo de rodamina 6G realizado pela Pdr5p

45

5.3 Avaliação da toxicidade do AU frente às cepas AD1234567 e

AD124567 de S. cerevisiae

50

5.4 Avaliação da capacidade do AU em inibir o efluxo de rodamina 6G

realizado pela Pdr5p

52

5.5 Caracterização da resistência apresentada pelo isolado clínico de C.

albicans

54

5.5.1 Avaliação de resitência a antifúngicos de uso clínico 54

5.5.2 Avaliação da capacidade do isolado clínico de C. albicans em

reter fluoróforos substratos de bombas ABC e MFS

56

5.6 Avaliação da toxicidade do AU frente ao isolado clínico de C.

albicans

58

5.7 Avaliação de interação entre AU e fluconazol quando usados em

combinação contra o isolado clínico de C. albicans

60

8. Discussão 63

9. Conclusões 70

11

Anexo I 72

1. Curcumina 73

2. Material e Métodos 76

3. Resultados 76

3.1 Avaliação da toxicidade da curcumina frente às cepas Candida

abicans

76

3.2 Avaliação da interação entre curcumina e fluconazol quando

usados em combinação contra o isolado clínico de C. albicans

81

3.3 Avaliação da capacidade da curcumina em inibir o efluxo de

vermelho do nilo do isolado clínico Pri de C. albicans

84

4. Discussão 86

5. Conclusões 87

10. Referências

88

12

LISTA DE ABREVIATURAS

µg microgramas

µM micromolar

Å Angstron

a.C. antes de Cristo

AAS ácido acetil salicílico

ABC do inglês “ATP binding cassette” (Casete ligador de ATP)

AD1234567 cepa mutante de S. cerevisiae deletada de transportadores de multidrogas

AD124567 cepa mutante de S. cerevisiae que super expressa a Pdr5p

AIDS do inglês “Acquired Immunodeficiency Syndrome” (Síndrome da

Imunodeficiência Adquirida)

AO ácido oleanólico

AU ácido ursólico

AO/AU mistura ácido oleaólico + ácido ursólico

ATP adenosina trifosfato

ATP-Na adenosina trifosfato ligada a sódio

BHI do inglês “Brain Heart Infusion” (infusão coração/cérebro)

CCD cromatografia em camada delgada

CaCDR1p transportador do tipo ABC, produto do gene CDR1 de C. albicans

CaCDR2p transportador do tipo ABC, produto do gene CDR2 de C. albicans

CDR3p produto de gene CDR3 de C. albicans

CaMDR1p transportador do tipo MFS, produto do gene MDR1 de C. albicans

CFDA do inglês “Carboxyfluorescein diacetate” (fluoróforo substrato da MDR1p)

CgCDR1p transportador do tipo ABC produto do gene CDR1 de C. glabrata

CLSI do inglês “Clinical and Laboratory Standards Institute”

COX-2 cicloxigenase-2

d.C depois de Cristo

DMSO dimetilsufóxido

FK506 lactona cíclica, inibidor do transporte promovido pela Pdr5p (Tacrolimus)

g grama

13

HIV do inglês “Human Imuno Deficiency Virus” (Vírus da Imunodeficiência

Humana)

kDa quilodaltons

LacY Lactato permease

M molar

MATE do inglês “multidrug and toxic-compound extrusion family”

MDR do inglês “Multidrug resistance” (Resistência a múltiplas drogas)

MFS do inglês “Major facilitator superfamily (Superfamília dos principais

facilitadores)

MIC concentração mínima inibitória

min minutos

mM milimolar

MRP1 transportador do tipo ABC de mamíferos

MRSA estafilococos resistente a meticilina

NBD do inglês “Nucleotide Binding Domain” (Domínio de ligação ao

nucleotídeo)

NPPN Núcleo de pesquisa de produtos naturais

NF-κB fator nuclear kappa B

nm nanômetro

Nm nanomolar oC graus célsius

OppD transportador de oligopeptídeos de S. typhimurium

PBS tampão salina fosfato

PDR do inglês “Pleiotropic Drug Resistance” (Resistência pleiotrópica a drogas)

PDR5 gene codificador da Pdr5p

Pdr1p fator de transcrição, produto do gene PDR1 de S. cerevisiae

Pdr3p fator de transcrição, produto do gene PDR3 de S. cerevisiae

Pdr5p produto do gene PDR5 de Saccharomyces cerevisiae

P-gp do inglês “P Glycoprotein” (Glicoproteína-P)

pH potencial hidrogeniônico

Pri isoado clínico de C. albicans resistênte a fluconazol

14

RND do inglês “resistance nodulation division”

rpm rotações por minuto

SD meio de cultura Saboroud dextrose

SDS dodecil sulfato de sódio

SMR do inglês “small multidrug resistance family”

SNQ2 gene codificador da Sqn2p

Snq2p produto do gene SNQ2 de S. cerevisiae

TMD do inglês “Transmembrane Domains” (domínios transmembranares)

TMS do inglês “Transmembrane Segment (”segmento transmembranar”)

TNF fator de necrose tumoral

v/v volume/volume

VRE enterococos resistente a vancomicina

YPD meio de crescimento contendo extrato de levedura, peptona e dextrose

YOR1 gene codificador da Yor1p

Yor1p produto do gene YOR1 de S. cerevisiae

15

LISTA DE FIGURAS

Fig 1. Esquema das famílias de transportadores de múltiplas drogas.

Fig 2. Organização estrutural dos Transportadores ABC. Fig 3. Modelos propostos para o arranjo dos domínios dos Transportadores ABC.

Fig. 4. Modelos propostos para o mecanismo de transporte de drogas pela P-gp.

Fig. 5. Organização estrutural dos transportadores da família MFS.

Fig. 6. Exemplar do vegetal Lippia lacunosa utilizado para o isolamento do ácido oleanólico e da

mistura ácido oleanólico/ácido ursólico testados neste trabalho.

Fig. 7: Propostas de drogas alternativas que possam atuar em células que apresentem o fenótipo

de MDR.

Fig. 8: Avaliação da toxicidade do AO e da mistura AO/AU sobre o crescimento da cepa

AD124567.

Fig. 9: Avaliação da toxicidade do AO e da mistura AO/AU sobre o crescimento da cepa

AD1234567.

Fig. 10. Avaliação qualitativa da inibição do efluxo de rodamina 6G após tratamento da cepa

AD124567 com AO ou AO/AU.

Fig. 11. Avaliação quantitativa da inibição do efluxo de rodamina 6G promovida pelo tratamento

da cepa AD124567 com AO.

Fig. 12: Avaliação quantitativa da inibição do efluxo de rodamina 6G promovida pelo tratamento

da cepa AD124567 com AO/AU.

Fig. 13: Avaliação da toxicidade do AU frente às cepas AD124567 e AD1234567 de S.

cerevisiae.

Fig. 14: Avaliação quantitativa da inibição do efluxo de rodamina 6G promovida pelo tratamento

da cepa AD124567 com AU.

Fig. 15: Avaliação da capacidade da cepa 24433 e do isolado Pri de C. albicans em extruir

compostos fluorescentes.

Fig. 16: Avaliação da toxicidade do AU frente à cepa 24433 e ao isolado clínico Pri de C.

albicans.

Fig. 17: Avaliação da capacidade de quimiosensibilização do AU em associação ao fluconazol.

ANEXO

16

Fig. 1: Curcuma longa e complexo curcuminóide.

Fig. 2: Avaliação da toxicidade da curcumina frente à cepa ATCC24433 de C. albicans.

Fig. 3: Avaliação da toxicidade da curcumina frente ao isolado clínico Pri de C. albicans.

Fig. 4: Avaliação da toxicidade da curcumina frente ao isolado clínico 88 de C. albicans.

Fig. 5: Avaliação da capacidade de quimiosensibilização da curcumina em associação ao

fluconazol.

Fig. 6: Avaliação da capacidade da curcumina em inibir o efluxo do fluoróforo vermelho do nilo

do isolado Pri de C. albicans.

17

LISTA DE TABELAS

Tabela I. Substratos e inibidores de transportadores de C. albicans com relevância clínica

(modificado de CANNON et al. 2009).

Tabela II. Avaliação da concentração mínima inibitória (MIC) de antifúngicos de uso clínico

para o isolado Pri e cepa ACTCC24433. Tabela III. Avalição da interação entre fluconazol e AU apresentada durante o tratameto do

isolado Pri de C. albicans.

ANEXO

Tabela I. Avaliação da interação entre fluconazol e curcumina apresentada durante o tratamento

do isolado Pri de C. albicans.

18

1. INTRODUÇÃO

1.1 O uso de plantas medicinais pela humanidade

A tentativa de descobrir compostos com capacidade de curar doenças e aliviar dores

remonta ao aparecimento do homem na Terra. O emprego das plantas no controle de diversas

doenças e pragas é provavelmente tão antigo quanto o próprio aparecimento da humanidade

(FRANÇA, 2003). Os conhecimentos e experiências acumulados pelas civilizações foram

transmitidos, ao longo dos anos, de geração a geração, levando ao descobrimento de alguns dos

medicamentos mais importantes utilizados na medicina moderna (SIMÕES et. al., 1986).

Hipócrates, no final do século cinco a.C., teria mencionado de 300 a 400 plantas

medicinais em sua obra Corpus Hippocraticu (SCHULTES, 1978), enquanto Dioscórides

escreveu De Materia Medica no primeiro século d.C., um catálogo de plantas medicinais que se

tornou um protótipo para as atuais farmacopéias. A própria Bíblia oferece descrições de diversos

tipos de plantas com poderes de “cura” (COWAN, 1999).

De um modo geral a natureza é responsável pela produção da maioria das substâncias

orgânicas conhecidas, sendo o reino vegetal o detentor da maior parcela de diversidade química

conhecida e registrada na literatura (VIEGAS JR, BOLZANI & BARREIRO, 2006). As plantas

possuem várias vias metabólicas secundárias que dão origem a diversos compostos como

alcalóides, flavonóides, taninos, cumarinas, terpenos, dentre outros, cujas funções, até pouco

tempo eram desconhecidas. Hoje já se sabe que tais compostos são utilizados como mecanismo

de defesa contra predação por microrganismos, insetos e animais herbívoros, como é o caso dos

19

terpenóides, que conferem odor característico, dificultando a predação de plantas (COWAN,

1999 LIMA, 2001; NIERO et al., 2003).

Estima-se que existam de 250.000 a 500.000 espécies de plantas na Terra e apesar de

tanta diversidade vegetal, somente cerca de 5% das plantas têm sido estudadas fitoquimicamente

e uma porcentagem ainda menor avaliadas sob os aspectos biológicos medicinais (CECHINEL

FILHO & YUNES, 1998).

No início dos estudos químicos de extratos vegetais buscando o isolamento e

identificação de substâncias ativas, as plantas estudadas eram as de uso popular, que geralmente

já estavam incorporadas às farmacopéias da época (VIEGAS JR, BOLZANI & BARREIRO,

2006). As plantas eram, portanto, modelos moleculares fornecidos pela natureza que

fundamentaram estudos de relação entre estrutura e atividade e inspiraram o desenvolvimento da

síntese orgânica clássica. Dentre as substâncias derivadas de plantas que são utilizadas até hoje

ou que sofreram algum tipo de modificação química podemos citar o ópio, preparado a partir de

bulbos de Papaver somniferum, conhecido e usado há séculos devido às suas propriedades

soporíferas e analgésicas, havendo relatos de seu uso desde 4000 a.C. (VIEGAS JR, BOLZANI

& BARREIRO, 2006); os salicilatos, provenientes do extrato da espécie Salix alba, descobertos

em 1757, e descritos por Edward Stone com propriedades analgésicas e antipiréticas e que mais

de cem anos a frente dariam origem ao ácido acetil salicílico (AAS); forscolina, obtida de Coleus

barbatus, que apresenta promissores efeitos contra hipertensão, glaucoma, asma e contra certos

tumores; a artemisinina, presente em Artemisia annua, que exerce potente atividade antimalárica;

o diterpenóide anticancerígeno taxol, isolado de plantas do gênero Taxus, que após sua síntese

em escala industrial, já se encontra disponível no mercado farmacêutico; e por fim, como um

20

último exemplo, mas não menos importante, a quinina, a qual durante quase 300 anos foi o único

princípio ativo eficaz contra a malária (HEDNER & EVERTS, 1998).

No século XX, o surgimento dos antibióticos produzidos por fermentação microbiana,

aliado ao desenvolvimento de fármacos sintéticos produzidos pela indústria farmacêutica, logo

depois da I Grande Guerra, foram causas marcantes no declínio do uso de plantas medicinais e

conseqüentemente, no investimento em fármacos de origem vegetal (MONTANARI &

BALZANI, 2001). Após a síntese do AAS, ocorreu o fim do período no qual a busca por

substâncias naturais terapeuticamente ativas era feito ao acaso, iniciando-se a era da síntese

química de novos compostos com atividade biológica. Porém, essa metodologia mostrou-se

muito mais complexa e dispendiosa, tendo em vista o pequeno número de novos compostos que

venciam as etapas pré-clínicas e clínicas (VIEGAS Jr, BOLZANI & BARREIRO, 2006).

Neste período, porém, a descoberta de novos compostos naturais com indiscutível

importancia médica, como a vinblastina e vincristina, ambas extraídas da espécie Catharantus

roseus (JOHNSON et al., 1963), bem como de análogos do etoposídeo e do taxol, fizeram

resurgir o interesse da indústria farmacêutica pelos produtos de origem natural.

Devido a todo esse contexto apresentado, os produtos naturais vêm recuperando seu

espaço na pesquisa científica e na indústria farmacêutica seja por si mesmo, ou como fonte de

inspiração para novos modelos moleculares bioativos, o que pode ser claramente observado pelo

aumento de trabalhos publicados nesta área, tanto em congressos como em periódicos nacionais

e internacionais, além do surgimento de periódicos específicos sobre produtos naturais ativos

(CECHINEL FILHO & YUNES, 1998).

No Brasil, diversos grupos étnicos usam emplastros, decocções, infusões e extratos brutos

de plantas sem nenhum conhecimento científico, mas que são passados de geração em geração

21

como tendo propriedades curativas. Sendo assim, essas plantas usadas na medicina popular

durante milhares de anos constituem uma escolha óbvia de estudo, principlamente em nosso país,

favorecido pela grande diversidade da flora com potencial terapêutico, o que estimula os

pesquisadores a estudar suas possíveis ações farmacológicas, bem como ações tóxicas. A fim de

produzir medicamentos eficazes e seguros, com menos efeitos colaterais, muitos compostos

biologicamente ativos já vem sendo isolados de diversas espécies distintas de plantas (GUERRA

& NODARI, 2003).

1.2 Resistência a múltiplas drogas

O processo de resistência a múltiplas drogas, ou MDR (do inglês “Multidrug

Resistance”) foi observado inicialmente por oncologistas clínicos, quando estes perceberam que

cânceres tratados com diferentes tipos de fármacos desenvolviam uma resistência cruzada a

diversos agentes citotóxicos aos quais estes tumores não haviam sido expostos previamente

(revisto em AMBUDKAR et al., 1999). Este processo já havia sido demonstrado na década de

1960, quando surgiram relatos das primeiras bactérias multiresistentes a antibióticos (SHEPS &

LING, 2007).

Este tipo de resistência na quimioterapia antimicrobiana e anticâncer é a maior causa de

falhas destes tratamentos, sendo uma das mais importantes e preocupantes (LAGE, 2003).

O mecanismo de MDR melhor caracterizado, denominado “MDR clássico”, se baseia na

super expressão de uma bomba de efluxo de drogas dependente de energia denominada

Glicoproteína P (do inglês “P-glycoprotein” ou “P-gp”), detectada inicialmente como uma

glicoproteína de superfície superexpressa em cultura de células cancerosas selecionadas por

22

MDR (revisto em AMBUDKAR et al., 1999). Este fenótipo consiste na expulsão, do interior

celular ou ainda da membrana plasmática, de diversos tipos de fármacos, estruturalmente e

funcionalmente distintas, as quais guardam entre si apenas o caráter levemente hidrofóbico em

comum, promovendo uma redução de sua concentração no meio intracelular (GOTTESMAN &

PASTAN, 1993).

Após a descoberta deste processo, um grande número de proteínas transportadoras de

múltiplas drogas homólogas foi identificado em células cancerosas e em microrganismos

patogênicos (LAGE, 2003).

Logo no início da observação deste fenômeno e posterior detecção de uma proteína

visível em gel corado como uma banda de aproximadamente 170 kDa, inexistente em células

sensíveis e proeminentes em células super resistentes, era difícil crer que uma única proteína

fosse responsável por todo o fenótipo de resistência, interagindo com cada um dos muitos

substratos (RIORDAN & LING, 1979). A aceitação de que esta teria efetivamente uma função

como bomba de efluxo de uma incrível gama de substratos veio com o reconhecimento de que a

P-gp era um homólogo de uma família multifuncional de proteínas transportadoras em bactérias,

a qual passou a ser denominada a família dos Transportadores ABC (do inglês “ATP Binding

Cassette”) (revisto em SHEPS & LING, 2007).

Existem cinco famílias de proteínas de efluxo que estão associadas com o fenótipo de

MDR (Figura 1) estando presentes em todos os organismos: a superfamília de transportadores

ABC, a MFS (do inglês “Major Facilitator Superfamily”), a MATE (do inglês “Multidrug and

Toxic-compound Extrusion Family”), a SMR (do inglês “Small Multidrug Resistance Family”) e

a RND (do inglês “Resistance Nodulation Division”) (LAGE, 2003).

23

Estes transportadores podem ser divididos em duas classes baseado em sua fonte de

energia. A primeira classe é composta por proteínas capazes de realizar transporte ativo primário,

utilizando como energia a hidrólise de ATP, enquanto a segunda classe é composta por proteínas

capazes de realizar transporte ativo secundário, usando um gradiente iônico, através de simporte

ou antiporte (PUTMAN, VAN VEEN & KONINGS, 2000; CHANG, 2003).

Os transportadores primários exercem seu papel principalmente em células eucarióticas

enquanto em células procarióticas os transportadores secundários são predominantes (LAGE,

2003).

24

Fig. 1. Esquema das famílias de transportadores de múltiplas drogas. Transportadores

ABC (do inglês “ATP binding cassette”), a MFS (do inglês “major facilitator superfamily”), a

MATE (do inglês “multidrug and toxic-compound extrusion family”), a SMR (do inglês “small

multidrug resistance family”) e a RND (do inglês “resistance nodulation division”) (adaptado de

LAGE, 2003).

Transportadores de Múltiplas Drogas

Transportadores ativos secundários Transportadores ativos primários

MATE

SMR

Transportadores ABC RND MFS

25

1.3 Os principais transportadores relacionados ao MDR em eucariotos

1.3.1 Transportadores ABC

1.3.1.1 Histórico

Os transportadores ABC foram primeiramente identificados e caracterizados em

bactérias. A fisiologia dos sistemas de transportes mediando à captação de nutrientes por

bactérias (especialmente Escherichia coli e Salmonella typhimurium) foi estudada em detalhes

na década de 1970 e em 1974 foi caracterizada uma classe de transportadores sensível ao choque

osmótico e energizado pela hidrólise de ATP, sendo esta devido à perda de sua proteína de

ligação ao substrato, uma proteína periplasmática (revisto em HIGGINS, 2001).

Após o sequenciamento completo do transportador de oligopeptídeos (OppD) de S.

typhimurium, notou-se que essas proteínas possuíam uma região de nucleotídeos bastante

conservada, similar aos previamente identificados em ATP sintetase, miosina e adenilato quinase

(WALKER et al., 1982), sugerindo portanto que a hidrólise de ATP estaria acoplada ao processo

de transporte. Esta hipótese foi posteriormente confirmada (BISHOP et al., 1989, MIMMACK et

al., 1989) ao se observar um domínio de ligação ao ATP nestes transportadores. Em 1985 ficou

reconhecido que as subunidades ligadoras de ATP em transportadores de bactérias definiriam

uma superfamília de proteínas as quais teriam uma organização estrutural formada por uma

unidade básica composta por quatro domínios (HIGGINS et al., 1985).

No ano seguinte, o primeiro transportador pertencente a essa família em eucariotos,

responsável pela resistência a múltiplas drogas em humanos, foi identificado e denominado

26

como Glicoproteína P (CHEN et al., 1986, GERLACH et al., 1986; GROS, CROOP &

HOUSMAN, 1986), e em 1990 o termo Transportador ABC começou a ser usado (HYDE et al.,

1990).

1.3.1. 2 Definição e estrutura

Os transportadores ABC podem ser encontrados na maioria das espécies e exercendo

diversos papéis fisiológicos. Em bactérias possuem papel central na eliminação de compostos e

captação de nutrientes, podendo também atuar como bomba de efluxo de drogas, enquanto que

em fungos, o seu papel principal é o de resistência a antifúngicos (MADIGAN, MARTINKO &

PARKER, 2004). No geral, os transportadores do tipo ABC estão relacionados ao transporte de

substâncias através de membranas, estando localizados com frequência na membrana plasmática,

mas também podendo estar presentes nas membranas de algumas organelas (RUTHERFORD &

WILLINGHAM, 1993; MOLINARI et al., 1994; MARALDI et al., 1999).

Dentre diversos mecanismos que parecem contribuir para o fenômeno de MDR, a

superexpressão de bombas de efluxo pertencentes à superfamília dos transportadores ABC é a

causa mais frequente de desenvolvimento de resistência a antifúngicos, herbicidas e drogas

citotóxicas (PRASAD & PANWAR, 2004).

A estrutura desses transportadores é caracterizada pela presença de uma unidade básica

constituída por quatro domínios, sendo dois domínios transmembranares (TMD) e dois domínios

de ligação ao nucleotídeo (NBD), os quais podem ser produtos de um mesmo gene ou de genes

distintos. Em procariotos cada um dos quatro domínios pode ser codificado como um

polipeptídio separado, porém em alguns transportadores esses domínios podem ser fundidos uns

aos outros de diversas formas (Figura 2). Na maioria das proteínas ABC de eucariotos, é possível

27

encontrar esses domínios sendo codificados como um polipeptídio único, o qual contém todos os

quatro domínios (ALTENBERG, 2003).

Os TMDs são tipicamente formados por seis alfas hélices, também denominados

seguimentos transmembranares (TMS), que atravessam a membrana plasmática formando um

total de 12 por transportador (Figura 3). Estes formam o caminho pelo qual o composto atravessa

a membrana e determina a especificidade do transportador, uma vez que possui sítios de ligação

ao substrato (HIGGINS, 1992). Os NBDs são domínios hidrofílicos e estão perifericamente

associados com a face citoplasmática da membrana (Figura 3). Eles representam uma região

altamente conservada de aproximadamente 215 aminoácidos, podendo ser também denominados

de domínio ABC, pelo qual estes transportadores são definidos, sendo a conservação deste

domínio essencial para definição e delimitação da família ABC (revisto por HIGGINS, 2001).

Como para todas as outras ATPases, o domínio de ligação ao ATP dos transportadores ABC

contém a região conservada walker A (seqüência rica em glicina) e walker B (seqüência

hidrofóbica) (WALKER et al.,1982), além de uma terceira seqüência conservada (“LSGGQ”),

denominada motivo C, exclusiva dos domínios ABC e mais conhecida como “assinatura ABC”

(HYDE et al., 1990).

28

Fig. 2. Organização estrutural dos Transportadores ABC. Domínios de ligação ao ATP

(NBD) (ovais laranja) e Domínios transmembranares (TMD) (quadrados verde). Os domínios

podem se apresentar fundidos em diversas, 2001). combinações: (A) codificados como 4

polipeptídios separados, (B) NBDs fundidos, (C) TMDs fundidos, (D) cada NBD fundido a um

TMD, (E) um único TMD fundindo a um NBD e o outro TMD e NBD codificados em

polipeptídios separados e (F) todos os quatro domínios fundidos em um único polipeptídio

(desenho realizado por JM Machado – designer gráfico, adaptado de ALTENBERG, 2003)

29

Fig. 3. Modelos propostos para o arranjo dos domínios dos Transportadores ABC. A

região amarela representa o domínio de ligação ao nucleotídeo (NBD), contendo os motivos

Walker A, Walker B e assinatura ABC; Domínios transmembranares (TMD) estão representados

como áreas verdes, sendo formados por seis segmentos transmembranares (TMS). (A)

configuração [NBD-TMD], como no ADP1p de Saccharomyces cerevisiae; (B) configuração

[TMD-NBD]; como no LmrA de Lactococcus lactis; (C) configuração [NBD-TMD]2 como na

P-gp de mamíferos (D) configuração [TMD-NBD]2, como no Pdr5p de Saccharomyces

cerevisiae; (E) representação da estrutura de poro adquirida por transportadores ABC. Droga,

substrato do transportador, representada como círculo vermelho (desenho realizado por JM

Machado – designer gráfico, adaptado de LAGE, 2003 e CANNON et al., 2009).

30

Em eucariotos, em geral, os transportadores apresentam uma topologia [TMD-NBD]2 ou

[NBD-TMD]2, sendo a segunda topologia também chamada de configuração invertida (Figura

3).

Com relação a sua estrutura tridimensional, os TMDs se arrumam de modo a formar um

poro central, o qual, provavelmente, atua como o caminho de translocação do substrato (Figura

3). Apesar de estudos de cristalografia terem demonstrado diversas arquiteturas para o poro

central de proteínas ABC distintas, a maioria pode ser classificada em duas estruturas diferentes,

uma estrutura que apresenta uma abertura voltada para o citoplasma (FERREIRA-PEREIRA, et

al., 2003; PIKETT et al., 2007; GERBER et al., 2008; ALLER et al., 2009; KHARE et al.,

2009) e uma outra com a abertura para o meio extracelular (LOCHER, LEE & REES, 2002;

DOWSON & LOCHER, 2006; OLDHAM et al., 2007).

1.3.1.3 Ciclo catalítico

A grande maioria dos estudos visando analisar o processo de catálise realizado por

transportadores dessa família foram realizados com a P-gp, porém devido à homologia que esta

proteína possui com outros transportadores da mesma família acredita-se que esse mesmo ciclo

poderia ser utilizado como um modelo para diversos transportadores da família ABC.

Al-Shawi & Sênior (1993) sugeriram que a ligação do ATP ao NBD não é necessária

para que ocorra a ligação do fármaco à P-gp, sendo assim os eventos de ligação do fármaco e

ligação do ATP são independentes um do outro. Porém, sabemos que para que ocorra o

transporte de uma molécula é essencial que ocorra a ligação e hidrólise do nucleotídeo

31

trifosfatado (TEODORI et al., 2002) e que os dois NBDs podem ligar e hidrolisar ATP

(GOTTESMAN, PASTAN & AMBUDKAR, 1996).

Para que ocorra o transporte de uma única molécula do fármaco são necessários dois

eventos não simultâneos de hidrólise de ATP (SAFA, 1992). No modelo inicialmente descrito

por Senior e colaboradores, em 1995, e complementado por Sauna e Ambudkar (2000), foi

descrito que a ligação do substrato aos TMDs estimula a atividade ATPásica da P-gp, porém

apenas um NBD de cada vez atua como um sítio catalítico, e a conformação deste impede o

segundo NBD de hidrolisar outro ATP. Após a hidrólise do nucleotídeo trifosfatado ocorre uma

mudança conformacional no sítio de ligação à droga que libera o substrato para o exterior

celular. A hidrólise no segundo sítio de ligação ao ATP parece ser necessária para restaurar a

conformação inicial do transportador, para que este possa ligar um novo substrato, completando

um ciclo catalítico (revisto por LINTON, 2007). Modificações conformacionais entre os dois

estados citados previamente, parecem ser essenciais para o transporte (HOLLENSTEIN, FREI &

LOCHER, 2007; MOUSSATOVA et al., 2008; OLDHAM, DAVIDSON & CHEN, 2008). Para

procariotos, geralmente os NBDs adotam um arranjo no qual um fica de frente para o outro

ficando inseridas no meio as duas moléculas de ATP (SMITH et al., 2002; CHEN et al., 2003;

VERDON et al., 2003; ZAITSEVA et al., 2005, WENG, FAN & WANG, 2009). Durante a

hidrólise do ATP a interface do dímero deve ser desfeita e os NBDs voltam a se isolar (LU et al.

2005; ZAITSEVA et al., 2006).

32

1.3.1.4 Mecanismos de transporte

Acredita-se que os transportadores ABC envolvidos na resistência a múltiplas drogas

tenham um mecanismo molecular de transporte em comum. Diversos modelos foram sugeridos

para explicar sua ampla gama de especificidade por compostos quimicamente tão distintos

(VARMA et al., 2003), porém até o momento não se reconheceu nenhum mecanismo de

transporte proposto como sendo o mecanismo de transporte geral dos transportadores ABC.

Atualmente apenas três modelos são aceitos como possíveis mecanismos de transporte

(Figura 4), dentre eles: o modelo de poro (ALTENBERG et al., 1994), flipase (HIGGINS &

GOTTESMAN, 1992) e “aspirador hidrofóbico” (RAVIV et al., 1990). No modelo de poro, o

fármaco seria captada diretamente do citoplasma e translocada para o meio extracelular; no

modelo de flipase o fármaco se acumularia no folheto interno da membrana plasmática enquanto

a proteína transportadora por um movimento de “flip-flop” transportaria o fármaco para o folheto

externo, onde este poderia se difundir no espaço extracelular; e por fim, no modelo de aspirador

hidrofóbico propõe-se que a molécula seria detectada e expulsa diretamente da bicamada

lipídica, da mesma forma como para o modelo de flipase. Neste caso, porém, o fármaco se ligaria

a proteína e seria transportado por um canal central para o meio extracelular (FERREIRA-

PEREIRA et al., 2003; AL-SHAWI & OMOTE, 2005; SIARHEYEVA, LOPEZ, &

GLAUBITZ, 2006). Hoje é observado como duas estruturas conformacionais distintas que se

alternam para promover o transporte de um substrato parece ser uma combinação desses

mecanismos inicialmente propostos.

33

Fig. 4. Modelos propostos para o mecanismo de transporte de drogas pela P-gp. (a) Modelo

de poro, (b) modelo flipase e (c) modelo de aspirador hidrofóbico (desenho refeito por JM

Machado – designer gráfico, extraído de VARMA et al., 2003).

34

1.3.1.5 Sítio de ligação a drogas

Esforços têm sido feitos na tentativa de identificar resíduos na Pdr5p, que estariam

relacionados com sua funcionalidade. Egner e colaboradores (1998) iniciaram esses estudos

utilizando ferramentas que promoviam mutações randomizadas, e posteriormente, em 2000,

estudos de mutação sítio-dirigida (EGNER et al., 2000).

Acredita-se que para o funcionamento da Pdr5p, e outros transportadores ABC,

aminoácidos específicos nos domínios transmembranares funcionariam no reconhecimento e

ligação do substrato (EGNER et al., 1998; MOODY et al., 2002; NEYFAKH, 2002).

Egner e colaboradores (1998) e Wolfger e colaboradores (2001) indicaram que na Pdr5p,

assim como para P-gp, uma região de ligação a drogas estaria localizada nos TMS, uma vez que

mutações pontuais nestes geravam mutantes com especificidade alterada pelo substrato. Em seus

estudos foi mostrado que mutações no TMS 10 promoviam alterações na especificidade do

transportador.

Posteriormente, o grupo de Golin (2003) propôs a existência de pelo menos três sítios de

ligação à droga na Pdr5p, e uma possível interação de diferentes substratos em um mesmo sítio,

significando, portanto, que neste transportador poderia ocorrer a sobreposição de sítios. Neste

mesmo trabalho também foi observada uma dependência do tamanho do fármaco (que deve ser

em torno de 200-225 Å) para que o transportador pudesse transportá-la.

Além disso, Tutulan-Cunita e colaboradores (2005) analisando diversos mutantes,

observaram que mutações nos TMS 4 e 9 e nas alças hidrofílicas que conectam os TMS na

porção extracelular (por ex. EL6) conferiam diferentes graus de alterações na especificidade ao

35

substrato, comprovando assim a idéia que estes transportadores albergariam múltiplos sítios de

interação com drogas.

Características específicas dos substratos, além do tamanho da molécula, também são

levadas em consideração, tanto que moléculas anfipáticas e hidrofóbicas que possam caber no

sítio podem se transformar em substratos. Dentro de seu sítio de ligação, o substrato estabelece

diversas ligações de Van der Waals com resíduos hidrofóbicos encontrados nos TMS e/ou

alterações eletrostáticas com resíduos carregados (TUTULAN-CUNITA et al., 2005).

1.3.2 Transportadores MFS

1.3.2.1 Histórico

A família MFS (Superfamília dos Principais Facilitadores) compreende uma superfamília

de proteínas encontradas em todos os reinos, representando o maior grupo de transportadores que

promovem o transporte acoplado a íons (SAIER et al., 1999). Tais transportadores são capazes

de translocar seus substratos através de membranas, acoplando a este o transporte de um íon (H+

ou Na+) ou a outro soluto, contra seu gradiente (KABACK et al., 2001).

Inicialmente se acreditava que os transportadores MFS estariam envolvidos

exclusivamente na captação de açúcares (MAIDEN et al., 1987; HENDERSON & MAIDEN,

1990), porém estudos posteriores revelaram que sistemas de efluxo de drogas também

pertenciam a essa família (GRIFFITH et al., 1992; PAULSEN & SKURRAY, 1994). Esta

família de transportadores foi primariamente identificada na década de 1990, quando

36

pesquisadores observaram que um grande grupo de transportadores de solutos se relacionava

evolucionariamente (HENDERSON, 1990; GRIFFITH et al., 1992; MARGER & SAIER, 1993).

Em 1993 Marger e Saier, com o auxílio de análises estatísticas, observaram que tais

transportadores compartilhavam uma estrutura em comum, dividindo-os em famílias e dentre

essas, cinco compreenderiam o que hoje conhecemos como a superfamília MFS, nomeclatura

também definida pelo mesmo grupo.

Após a divisão proposta por Marger e Saier (1993), Paulsen e colaboradores (1996)

utilizando estudos filogenéticos, dividiram a família em duas subfamílias de acordo com sua

topologia, inserindo assim mais uma família às cinco propostas inicialmente, uma vez que se

conseguiu identificar membros que apresentavam divergências em suas topologias (PAULSEN

et al., 1996). Pouco tempo depois, em 1998, uma nova divisão foi proposta, sendo baseada

exclusivamente em similaridades de sequências, criando assim uma divisão das proteínas MFS

em 17 famílias, e conseguindo mostrar que as famílias filogenéticas estavam correlacionadas

com a função da proteína, de forma que, cada uma das famílias reconheceria e transportaria uma

classe específica de substratos estruturalmente relacionados (PAO, PAULSEN & SAIER, 1998).

1.3.2.2 Definição e estrutura

Como já descrito anteriormente, nesta família encontramos proteínas que realizam

transporte ativo secundário, não utilizando, portanto, a energia metabólita da célula (ATP). O

gradiente de concentração de uma substância representa um armazenamento de energia química

potencial que pode ser utilizado para realizar trabalho (ROBERT & MATTHEW, 1996) e é este

37

trabalho que impulsionará o transporte de uma segunda substância contra seu gradiente de

concentração.

Até o momento, mais de 300 proteínas, que pertencem a essa superfamília, já foram

identificadas, incluindo a TPO1 de S. cerevisiae (DERISSI et al., 2000; ROGERS et al., 2001),

CaMd1p de Candida albicans (BEN-YAACOV et al., 1994) e LacY de Eschericcia coli,

também denominada lactose permease, o transportador MFS mais bem caracterizado até o

momento (ABRAMSON et al., 2003).

Para praticamente todos os transportadores MFS existe uma topologia básica, composta

por um único domínio transmembranar formado por 12 alfas hélices, conectadas por alças intra e

extracelulares, tendo tanto o seu domínio N-terminal quanto o C-terminal localizados na porção

citoplasmática (PAO, PAULSEN & SAIER, 1998; SAIER, 2003; SAIER et al., 1999). Porém,

algumas exceções podem estar presentes nessa família, onde encontramos membros com 14, 24

ou apenas 6 alfa hélices (Figura 5). As duas hélices adicionais nos membros de 14 alfas hélices

surgiram, provavelmente, a partir da inserção da alça citoplasmática central na membrana,

enquanto que os membros de 24, podem ser oriundos de um evento de fusão de genes (SAIER,

2003) e os de 6, provavelmente funcionam como homodímeros (LAW, MALONEY & DA-

NENGWANG, 2008).

38

(A)

(B)

(C)

Fig. 5. Organização estrutural dos transportadores da família MFS. Os

transportadores MFS podem ser formados por TMDs que possuam: (A) 6 segmentos

transmembranares, (B) 12 segmentos transmembranares ou (C) 14 segmentos transmembranares.

As porções N- e C- terminais estão livres no citoplasma (desenho realizado por JM Machado –

designer gráfico, baseado no modelo proposto por GAUR et al., 2008).

39

No geral, pouca homologia é encontrada quando comparamos as duas metades da

proteína, o que sugere que o surgimento desta molécula ocorreu após um evento de duplicação

e/ou fusão de genes (MAIDEN et al., 1987). Quando comparamos proteínas dentro de uma

mesma família é possível observar altas taxas de similaridade (PAO, PAULSEN & SAIER,

1998), porém, quando a comparação é realizada em nível de superfamília, proteínas individuais

compartilham baixa identidade ou similaridade de sequência, sendo unidos apenas por um par de

sequências conservadas localizadas nas porções N- e C- terminais e em algumas alças (MAIDEN

et al., 1987)

Estudos de cristalografia 3D de alta resolução com as proteínas LacY, GlpT, EmrD, e de

baixa resolução de OxlT, mostram que apesar das diferenças nas sequências dessas proteínas

MFS, todas compartilhavam praticamente a mesma estrutura tridimensional. Essa descoberta

permite propor um modelo estrutural básico compartilhado pelas proteínas dessa família,

funcionando como um esqueleto para todas as proteínas MFS, independente de sua função

(revisto por LAW, MALONEY & WANG, 2008). Até o momento encontramos disponível

detalhes da estrutura 3D para 3 transportadores, sendo todos eles de procariotos (HIRAI et al.,

2002; HUANG et al., 2003; YIN et al., 2006). As estruturas disponíveis indicam não só uma

conservação no dobramento mas também na arquitetura da proteína, consistente com a formação

de dois domínios com um poro central.

Algumas características podem ser consideradas típicas de transportadores MFS, como: a

presença de 12 alfas hélices transmembranares (topologia mais comum) com as porções N- e C-

terminais localizadas no citoplasma; uma sequência composta por 400-600 aminoácidos e uma

assinatura conservada (RXXXR) entre as alças 2-3 (MAIDEN et al., 1987; PAO, PAULSEN &

SAIER, 1998; HIRAI, HEYMANN & SUBRAMANIAM, 2003).

40

1.3.2.3 Mecanismos de transporte

Com relação à cinética de transporte realizada por estes transportadores, dois mecanismos

são observados: simporte, no qual ocorre o transporte de duas ou mais moléculas

simultaneamente na mesma direção energizado pelo gradiente eletroquímico de uma dessas

moléculas, e o antiporte, que transporta duas ou mais moléculas em direções opostas.

Nos transportadores antiportes, relacionados com efluxo de drogas, acredita-se que exista

um único sítio de ligação que funcionaria em um mecanismo de acesso alternado, podendo o

transportador adquirir duas principais conformações que se alternam, com aberturas voltadas

para o citoplasma ou para o espaço extracelular (VIDAVAR, 1966; JENCKS, 1980; TANFORD,

1982; TANFORD, 1983; WEST, 1997), nesse caso o transporte de uma molécula seria realizado

pela interpolação dessas duas conformações.

Alguns modelos para explicar o mecanismo de transporte são propostos: no mecanismo

de “cadeira de balanço” ou “gangorra” (HUANG et al., 2003) sugere-se que um substrato é

fixado no sítio de ligação, em seguida o acesso alternado é realizado a partir de mudanças

conformacionais que poderão gerar acessos para as diferentes superfícies (MALONEY, 1994);

um segundo mecanismo seria o de poro (PATLAK, 1957) e neste, o substrato se moveria pelo

centro do transportador assim como ocorre em um canal de íons, porém com aberturas que

seriam alternadas entre o meio intra e extracelular, sendo que esta visão é mais comumente aceita

para outros transportadores que não são MFS (revisto por LAW, MALONEY & WANG, 2008).

41

1.4 Resistência a múltiplas drogas em fungos

1.4.1 Saccharomyces cerevisiae: um modelo de estudo

O reino dos Fungos compreende uma variabilidade de aproximadamente 1,5 milhões de

espécies, sendo que 200 dessas teriam alguma associação com o homem. Alguns fungos podem

coexistir com humanos de forma comensal, não causando nenhum dano a eles, enquanto outros

podem ser considerados patógenos (Revisto por CANNON et al., 2009). Os fungos e as

leveduras estão presentes em praticamente todos os habitats da Terra, participando em diversos

processos biológicos.

Leveduras, como a S. cerevisiae, participam da alimentação do homem desde épocas em

que o homem vivia apenas da colheita. Com o estabelecimento da prática agrícola, as colheitas

passaram a ser processadas em bebidas e alimentos elaborados, com a colaboração das leveduras.

Em relíquias do antigo Egito é possível encontrar papiros e esculturas que indicam a existência,

já naquela época, de panificadoras e casas de fermentação. Atualmente, as leveduras possuem

aplicações biotecnológicas podendo ser utilizadas na tecnologia ambiental e em pesquisas de

base, onde são avaliados metabolismo de drogas, biologia celular e molecular e na indústria

farmacêutica e de alimentos e bebidas (WALKER, 1998). A espécie S. cerevisiae possui

aproximadamente seis mil genes e o seu genoma foi o primeiro a ser completamente sequenciado

(GOFFEAU et al., 1996).

As leveduras (patogênicas ou não), assim como outras células, são capazes de

desenvolver mecanismos de resistência quando são desafiadas com antifúngicos ou outras drogas

com poder citotóxico (revisto por PRASAD & PANWAR, 2004). Um desses mecanismos

42

envolve a superexpressão de bombas de efluxo relacionadas ao processo de MDR, como

membros das famílias ABC e MFS (LAGE, 2003). O fenótipo apresentado pela S. cerevisiae se

assemelha ao processo de MDR de células de mamíferos, sendo denominado Resistência

Pleiotrópica a Drogas (PDR) (BALZI & GOFFEAU, 1994; 1995).

O primeiro transportador ABC homólogo a P-gp encontrado em sistema diferente de

células de mamífero foi descrito em S. cerevisiae. Esse transportador é formado por 1290

resíduos de aminoácidos e foi denominado Ste6p. Este exibe a configuração [TMD-NBD]2 e está

envolvido não com a resistência a fármacos, mas com o transporte do feromônio fator-a (LAGE,

2003). Após essa constatação, duas diferentes análises do genoma da levedura revelaram

aproximadamente 30 genes (TAGLICHT & MICHAELIS, 1998; DECOTTIGNIES &

GOFFEAU, 1997) que codificam possíveis proteínas ABC, sendo essas subdivididas em cinco

subfamílias: PDR, MDR, MRP/CFTR, RL1, YEF3 e ALDP (MICHAELIS & BERKOWER,

1995; DECOTTIGNIES & GOFFEAU, 1997; ROGERS et al., 2001). A subfamília PDR é a

maior, compreendendo grande parte das proteínas ABC desta levedura, sendo seus membros

também encontrados em outros fungos, como Candida albicans, Candida glabrata e Aspergillus

nidulans (DEL SORBO, SCHOONBEEK & DE WAARD, 2000). Desta análise gênica, foi

possível concluir que cinco dos aproximadamente 30 genes identificados, codificavam

transportadores ABC mediando o fenótipo de MDR quando presentes em múltiplas cópias:

PDR5, PDR11, SNQ2, YCF1 e YOR1 (DECOTTIGNIES et al., 1995). Destes, os produtos

Pdr5p, Pdr11p e Snq2p apresentam a chamada topologia invertida [NBD-TMD]2 (BALZI et al.,

1994; BISSINGER & KUCHLER, 1994), nomeclatura denominada em relação à estrutura

apresentada por outros transportadores ABC como a P-gp de mamíferos.

43

O produto do gene PDR5 é o transportador mais bem caracterizado em leveduras

(GOLIN et al., 2007). A superexpressão desse gene gera uma resistência a centenas de compotos

sem relação química entre si, dentre as quais estão incluídas: cicloheximida, rodamina 6G,

rodamina 123, drogas anticâncer, trifluoperazina, nigericina, hormônios esteróides, como

progesterona, muitas classes de antimicóticos, como os azóis, e fungicidas agrícolas (ex.

anilinopirimidinas, benzimidazois, ditiocarbamatos e análogos de estrobilurina)

(KOLACZKOWSKI et al., 1996).

PDR5, SNQ2 e YOR1 compartilham ativadores transcricionais em comum e esses

ativadores são produtos dos genes regulatórios PDR1 e PDR3 e co-regulam constitutivamente a

rede PDR (BALZI & GOFFEAU, 1995). Mutações de ganho de função, nesses fatores de

transcrição, induzem a superexpressão dessas proteínas em membranas plasmáticas. De uma

forma geral, a expressão dos transportadores ABC em S. cerevisiae está sob o controle de uma

complexa rede de regulação que envolve, além dos fatores de transcrição Pdr1p e Pdr3p, outros

fatores reguladores de resposta ao estresse (KOLACZKOWSKA & GOFFEAU, 1999).

Já foi demonstrado que a Pdr5p compartilha além da hidrólise de nucleotídeos

trifosfatados, substratos e moduladores com outros transportadores de fungos e mamíferos

(revisto por CANNON et al., 2009), o que torna esta proteína um ótimo modelo para estudos na

busca de inibidores para transportadores homólogos em microrganismos patogênicos, como o

transportador CgCdr1p (SANGLARD, 1999) e CaCdr1p de cepas resistentes a azóis de C.

glabrata e C. albicans, respectivamente, que também codificam transportadores de múltiplas

drogas, e são os produtos dos genes mais comumente associados ao efluxo de drogas dependente

de energia em isolados clínicos resistentes a fluconazol (SANGLARD & BILLIE, 2002). Além

44

dos substratos já descritos podemos destacar a cicloheximida, benomil, flusilazol, nuarimal,

fenapromil e sorafen como substratos exclusivos da Pdr5p (ROGERS et al., 2001).

1.4.1.1 As cepas AD1234567 e AD124567 de S. cerevisiae

Os transportadores ABC de leveduras são normalmente expressos em quantidades muito

baixas em cepas selvagens, além de apresentarem sobreposição no seu espectro de ação, o que

gera dificuldades nos estudos bioquímicos e fisiológicos dessas proteínas em cepas selvagens

(ROGERS et al., 2001).

Cepas mutantes foram desenvolvidas por Decottignies e colaboradores (1998) com o

objetivo de se conseguir estudar o transportador de interesse descartando a influência dos outros

transportadores da levedura. Nessas cepas foram deletados diversos tipos de transportadores

como YOR1, SNQ2, PDR5, YCF1, PDR10, PDR11 e PDR3 em diferentes combinações, além

de mutações de ganho de função nos genes dos ativadores transcricionais PDR1 e PDR3,

levando a um aumento da expressão de seus genes alvos.

Com essas mutações foram obtidas diversas cepas, dentre elas a AD1234567 e

AD124567, sendo a primeira uma cepa na qual todos os genes mencionados acima (indicados

por números na nomeclatura da cepa) foram deletados, gerando uma cepa hipersensível a

diversos compostos, os quais serviriam como substratos para os transportadores ABC (ROGERS

et al., 2001), podendo ser utilizada, portanto, como um controle para ensaios com células

intactas; e a segunda uma cepa que expressa ativamente grandes quantidades do transportador

Pdr5p funcional, o que torna esse cepa altamente resistente.

45

1.4.2 Candida albicans: um fungo de interesse clínico

A espécie C. albicans faz parte da flora anfibionte dos homens (PERFECT &

CASADEVALL, 2006), colonizando pele e mucosas de pessoas saudáveis e atuando

comensalmente no trato gastrointestinal, cavidade oral e vagina, podendo, frequentemente,

causar infecções superficiais sem gravidade alguma, mas também sendo capaz de se disseminar e

causar infecções invasivas. Podem ser considerados patógenos oportunistas, uma vez que

ocasionam infecções quando seu hospedeiro está com o sistema imunológico debilitado

(MAVOR, THEWES & HUBE, 2005), como no caso da Síndrome da Imunodeficiência

Adquirida (BACCAGLINI et al., 2007), causando sérias infecções da mucosa oral e podendo,

até mesmo, se disseminar por todo organismo humano.

Infecções fúngicas sistêmicas, como as que podem ser ocasionadas por diversas espécies

de Candida, são de difícil diagnóstico e além disso, o limitado número de antifúngicos

disponíveis no mercado, quando comparado com a amplitude de antibióticos colabora para suas

altas taxas de mortalidade (revisto por CANNON et al., 2009).

Existem apenas cinco classes de antifúngicos disponíveis para o uso clínico: análogos de

5-flucitosina, que interferem na síntese de ácidos nucléicos; os poliênicos, que atuam pela

formação de poros na porção ergosterol da membrana plasmática; as equinocandinas, a mais

nova classe de antifúngicos, que inibem a síntese da β1-3 glucana sintase; as alilaminas, que

atuam na síntese de ergosterol, e os azóis, que também atuam na síntese de ergosterol, sendo o

fluconazol, o representante desta classe de antifúngicos mais amplamente utilizado devido a sua

relativa baixa toxicidade e sua melhor solubilidade, quando comparado aos antifúngicos de

outras classes (revisto por CANNON et al., 2009).

46

Na espécie C. albicans podemos observar diversas estratégias para o desenvolvimento de

resistência, como alterações e super expressão dos sítios alvos dos antifúngicos e super expressão

na membrana plasmática, de bombas de efluxo capazes de extruir essas moléculas, impedindo

que sua concentração intracelular ideal seja alcançada (WHITE, MARR & BOWDEN, 1998;

revisto por AKINS 2005; COWEN & STEINBACH, 2008), porém, devemos lembrar que o

processo de resistência é sempre multifatorial, envolvendo, portanto, várias estratégias de

resistência (ROGERS & BARKER, 2003).

A resistência de isolados clínicos de C. albicans a análogos de flucitosina está

relacionada com mutações na enzima alvo; para polienos, a redução de ergosterol de membrana

está relacionada com a resistência; enquanto que para azóis, diversos mecanismos já foram

observados, como aumento da expressão e/ou mutações pontuais na enzima alvo (Erg11p) e

superexpressão de bombas de efluxo pertencentes as famílias MFS e ABC (revisto em

CANNON et al., 2007).

Dentre as bombas de efluxo relacionadas com o processo de MDR, a espécie C. albicans

é capaz de expressar diversos transportadores in vitro (WHITE, 1997; ROGERS & BARKER,

2003), porém não se sabe ao certo qual o nível de expressão desses transportadores é requerido,

in vivo, para se tornarem significativos clinicamente (CANNON et al., 2009). Análises do

genoma identificaram pelo menos 27 proteínas do tipo ABC; dessas proteínas, sete foram

confirmadas como sendo transportadores ABC, mas apenas duas, CaCDR1 (PRASAD et al.,

1995) e CaCDR2 (SANGLARD et al., 1997), estariam envolvidas com o fenótipo de MDR

transportando diversos compostos (Tabela I) (GAUR, CHOUDHURY & PRASAD, 2005) e

apresentando sua expressão aumentada em isolados resistentes a fluconazol e itraconazol

(ROGERS & BARKER, 2003; KARABABA et al., 2004; XU et al., 2006).

47

Transportador Substratos Inibidores

CaCDR1p (ABC)

Azóis, rodamina 6G, cicloheximida,

rodamina123, cerulenina, rifluoperazina,

nigericina, verapamil e vermelho do

nilo.

Milbemicina, eniatina,

FK506, FK520, unarmicina e

curcumina

CaCDR2p (ABC) Azóis, rodamina 6G, cicloheximida,

cerulenina, diamida e vermelho do nilo.

Milbemicina e curcumina

CaMDR1p (MFS)

Benomyl, metotrexato, fluconazol,

voriconazol, cicloheximida, cerulenina,

diamida e vermelho do nilo.

Sem descrições

Tabela I. Substratos e inibidores de transportadores de C. albicans com relevância clínica

(adaptado de CANNON et al., 2009).

48

Mutantes nulos em CaCDR1 se mostram extremamente sensíveis ao fluconazol

(SANGLARD et al., 1996), enquanto mutantes nulos apenas em CaCDR2, apresentam

sensibilidade reduzida, não alcançando níveis parecidos com o mutante para CaCDR1.

Entretanto, mutantes duplamente nulos, se tornam mais sensíveis quando comparados a mutantes

nulos apenas para CaCDR1 (SANGLARD et al., 1997). Estes dados confirmam que o

transportador CaCDR1 seria o principal transportador na expressão do fenótipo de MDR

(HOLMES et al., 2008; TSAO, RAHKHOODAEE & RAYMOND, 2009).

Além dos transportadores ABC, também se encontra transportadores MFS atuando em

espécies de Candida. Até o momento, seis genes foram anotados como possíveis transportadores

MFS, porém apenas um, o CaMDR1, está relacionado com o processo de MDR (FLING et al.,

1991; BEN-YAACOV et al., 1994) (Tabela I). Sua superexpressão está associada a isolados

clínicos que apresentam resistência a fluconazol, e seus mutantes nulos, apresentam resistência

diminuída a este antifúngico (WHITE, 1997; WIRSCHING, MICHEL & MORSCHHAUSER,

2000; PEREA et al., 2001). É interessante notar que, apesar dos transportadores CDR conferirem

resistência a diversos azóis (NAKAMURA et al., 2001), o produto do gene MDR1 confere

resistência apenas ao azol fluconazol (WIRSCHING &MORSCHHAUSER, 2000; KOHLI et al.,

2001), porém ambas as classes de transportadores estão fortemente relacionadas com a

resistência a azóis em isolados clínicos resistentes a fluconazol (SANGLARD & BILLIE, 2002)

49

1.5 Funções fiosiológica dos transportadores relacionados ao MDR em fungos

É possível que uma família tão grande, quanto à família ABC, existisse apenas com o

com o intuito de promover resistência a fármacos? Provavelmente não, e muitas evidências já

surgiram com relação à função fisiológica dos transportadores ABC em células de mamíferos

(revisto por AMBUDKAR et al., 1999), o que levanta suspeita de que nos fungos, assim como

em outros tipos celulares, tais transportadores também possuiriam outras funções fisiológicas

além de extruir fármacos do meio intracelular.

Reforçando esta hipótese está o fato de alguns estudos demonstrarem que proteínas

homólogas a estes transportadores não realizam efluxo de fármacoss, estando diretamente

relacionados com funções fisiológicas nas células. Um exemplo seriam os transportadores

CDR3p e Ste6p, de C. albicans e S. cerevisiae, respectivamente, que guardam grande homologia

com CDR1p, CDR2p e Pdr5p, mas não estão envolvidos com o efluxo de drogas (MCGRATH &

VERSHAVSKY, 1989; BALAN, ALARCO & RAYMOND, 1997; FRANZ, MICHEL &

MORSCHHAUSER, 1998; PRASAD, PANWAR & SMRITI, 2002).

Estudos realizados por Decottignies e colaboradores (1995) mostraram que a

superexpressão de SNQ2 e PDR5 acarreta em redução da fase exponencial de crescimento,

sugerindo, portanto, que ambas as proteínas seriam necessárias para o desenvolvimento celular.

Até o momento, estudos apontam no geral apenas duas funções fisiológicas destes

transportadores em fungos: manutenção da distribuição assimétrica de fosfolipídios na

membrana plasmática e extrusão de catabólitos.

A superexpressão, não apenas de PDR5, mas também de CDR1 está diretamente

relacionada com a fase do crescimento celular, sendo sua expressão maior na fase exponencial e

50

até mesmo na fase estacionária do crescimento (SERVOS, HAASE & BRENDEL, 1993;

SZCZYPCA et al., 1994; DECOTTIGNIES et al., 1995; KATZMANN et al., 1995; PRASAD et

al., 1995; SANGLARD et al., 1997; WEMMIE & MOYE-ROWLEY, 1997; KOLACZKOWSKI

et al., 1998; KRISHNAMUYTHY et al., 1998; LYONS & WHITE, 2000), o que poderia ter

uma ligação com o fato de que nesta fase existe uma grande concentração de catabólitos no

interior celular, sendo assim, esta expressão aumentada permitiria à célula se livrar do acúmulo

de metabólitos tóxicos durante seu desenvolvimento e metabolismo.

A distribuição assimétrica dos fosfolipídios na membrana plasmática dos fungos parece

ser mantida por alguns transportadores do tipo ABC. Na maioria dos tipos celulares

fosfatidiletanolamina e fosfatidilserina estão localizadas no folheto interno da membrana

plasmática, enquanto fosfatidilcolina, esfingomielina e glicolipídios estão localizados no folheto

externo (DIAZ & SCHROIT, 1996; WILLIAMSON & SCHLEGEL, 1997).

Recentemente, observou-se que alguns transportadores de C. albicans e S. cerevisiae

estão relacionados com essa distribuição assimétrica. Cdr1p e Cdr2p parecem atuar em

movimentos de fli-flop, no qual a fosfatidiletanolamina do folheto interno é translocada para o

folheto externo (DOGRA et al., 1999; SMRITI et al., 2002). Enquanto isso, Cdr3p, um

transportador ABC de C. albicans que não tem envolvimento com o processo de resistência a

múltiplas drogas, atua na translocação de fosfolipídios do folheto externo para o folheto interno

(SMRITI et al., 2002). Essa diferença na direção do transporte pode ter relação com a capacidade

de transporte de fármacos, não conferida a Cdr3p (SMRITI et al., 2002).

Assim como para C. albicans, alguns transportadores de S. cerevisiae também estão

envolvidos na translocação de fosfolipídios. Decottignies e colaboradores (1998) mostraram que

tanto Pdr5p quanto Yor1p também estão envolvidos na translocação de fosfatidiletanolamina.

51

Até o momento, atividades secretoras não foram observadas para transportadores de

fungos, a não ser para Ste6p, de S. cerevisiae, que está envolvido na secreção do peptídeo

ferohormônio fator-a, essencial para o processo de brotamento (MCGRATH & VERSHAVSKY,

1989).

1.6. Os terpenóides: ácido ursólico e oleanólico

Os terpenos constituem uma família bem diversificada de substâncias naturais,

produzidos por uma grande variedade de plantas, principalmente as coníferas, estando presentes

nas sementes, folhas, flores, raízes e madeira de plantas superiores, bem como em musgos, algas

e líquens.

Inicialmente considerou-se que os terpenos seriam derivados do 2-metil-butadieno, mais

conhecido como isopreno, no entanto, com o tempo percebeu-se que os terpenos não derivavam

do isopreno, uma vez que este nunca foi encontrado como produto natural, sendo seu verdadeiro

precursor o ácido mevalônico. Apesar disso, a regra do isopreno ainda é usada para classificá-

los. Sendo assim, são classificados de acordo com a quantidade de unidades de isopreno em:

hemiterpenóides (C5), monoterpenóides (C10), sesquiterpenóides (C15), diterpenóides (C20),

triterpenóides (C30) e carotenóides (C40) (SPITZER, 2003).

Essas substâncias estão presentes nos óleos essenciais de muitas plantas e flores, sendo

esses óleos muito utilizados nas indústrias alimentícias, cosmética e farmacêutica (SPITZER,

2003).

52

Dentre diversas ações biológicas, os terpenóides que ocorrem naturalmente, apresentam

propriedades antiinflamatórias, antimicrobianas, antiparasitárias, tripanocida, larvicida e

hipoglicemiante, além de inibir a agregação plaquetária e interferir em passos da transdução de

sinais (CALIXTO et al., 1998; 2000) bem como atuação em bombas de efluxo relacionadas com

o processo de MDR (COREA et al., 2003; BRAGA et al., 2007).

O ácido oleanólico (AO) e o seu isômero, ácido ursólico (AU) (Figura 6), são triterpenos

que se encontram abundantes na natureza, sendo o AO encontrado em mais de 120 espécies

distintas de plantas (WANG & JIANG, 1992), como por exemplo a Lippia lacunosa, encontrada

no Brasil (Figura 6). Ambos podem existir naturalmente como ácidos livres ou aglicanas,

também denominadas saponinas (PRICE, JOHNSON & FENWICK, 1987; MAHATO et al.,

1988; WANG & JIANG, 1992) quando possuem uma aglicana ligada a uma ou mais cadeias de

açúcar. Estruturalmente esses compostos se diferem apenas pela posição de um grupamento

metila (revisto por LIU, 1995).

Durante as últimas três décadas, estudos farmacológicos envolvendo AU e AO indicaram

que estes triterpenóides possuem muitos efeitos benéficos à saúde humana (revisto por LIU,

1995) apresentando baixa toxicidade para células de mamíferos (SCHIMMER et al., 2003).

Em 1969, Gupta e colaboradores, foram os primeiros a identificar uma ação

antinflamatória proporcionada pelo AO. O efeito antinflamatório é uma propriedade comum aos

triterpenóides (PRICE et al., 1987; MAHATO et al., 1988), estando o AO e o AU em posição de

destaque por apresentarem um alto grau de inibição deste processo.

A capacidade hepatoprotetora destes compostos recebe um grande destaque, sendo muito

explorada e estudada sua capacidade em proteger o fígado contra injúrias causadas tanto por

compostos tóxicos quanto contra fibrose e cirrose (LIU,1995). Após resultados terapêuticos

53

satisfatórios em testes clínicos (Hunan Med. Inst., 1975), o AO tem sido usado com sucesso por

médicos chineses com o intuito de tratar doenças do fígado, como hepatite aguda e crônica,

dentre outras doenças (QU, 1981; WU & LI, 1986; CHEN & WANG, 1989). No Brasil, também

encontramos medicamentos indicados para regeneração da pele, antinflamatório, prevenção de

manchas, tratamento de acne e hepatoprotetor, que também possuem AO ou AU em sua

composição, como Colastil®, Tri-Def® e Ursacol®. O efeito benéfico ao fígado pode estar

relacionado não só com sua atividade antinflamatória, mas também antioxidante, bem como

devido a seus efeitos em enzimas que metabolizam drogas (LIU, 1995).

Outras atividades biológicas também são relacionadas a estes compostos, como

propriedades antihipertensiva, antimicrobiana, anti ateriosclerótica e antitumoral (revisto por

LIU, 2005; HORIUCHI et al., 2007), nesta última podendo atuar como inibidores do processo de

angiogênese, invasão tumoral e metástase (OVESNA et al., 2004).

54

(A) (B)

(C)

Fig. 6. Exemplar do vegetal Lippia lacunosa utilizado para o isolamento do ácido

oleanólico e da mistura ácido oleanólico/ácido ursólico testados neste trabalho. (a) Arbusto

em seu local de cultivo e coleta - Horto da Faculdade de Farmácia – Bioquímica da Universidade

Federal de Juíz de Fora (UFJF), (b) detalhe da inflorescência (fotos gentilmente cedidas pela

Profa. Suzana Leitão e a pós-graduanda Aline Castellar – Faculdade de Farmácia/UFRJ), (c)

estrutura química dos compostos isolados, ácido oleanólico (posição I = H e posição II = CH3) e

ácido ursólico (posição I = CH3 e posição II = H).

55

Com relação a sua atividade antitumoral, diversos grupos apontam que ambos compostos

podem atuar em etapas distintas do desenvolvimento tumoral, como a iniciação e promoção, bem

como na inibição de proliferação de células tumorais e na indução de apoptose dessas células

(HUANG et al., 1994; HSU et al., 2004; LIU, 2005; PATHAK et al., 2007; MANU &

KUTTAN, 2008; YAN et al., 2009; SHAN et al., 2009). Dentre muitos relatos de atuação desses

compostos em células cancerosas, podemos destacar: a indução de apoptose em células de

leucemia mielóide aguda e em linhagens de câncer de fígado, proporcionadas, respectivamente,

pela utilização de AO e derivados modificados quimicamente, e pelo AO e AU (KONOPLEVA

et al., 2004; YAN et al., 2009); a capacidade do AU em induzir apoptose e inibir a proliferação

de células de câncer de ovário humano (WANG et al., 2009) bem como induzir apoptose em

células de câncer de próstata, mesmo quando a proteína relacionada à resistência a apoptose

(Bcl2) está sendo constitutivamente expressa (ZHANG et al., 2010); o potencial, apresentado

pelo AU em inibir a ativação do NF-κB, um fator de transcrição que atua de forma crítica na

sobrevivência e proliferação de células tumorais (SHISHODIA et al., 2003) e a capacidade do

AO e seu derivado contendo uma molécula de dextrose ligada (DEX-AO), in vitro e in vivo, de

inibir a atividade de células de osteosarcoma (HUA et al., 2009).

No Japão o uso destes compostos é recomendado para o tratamento de câncer de pele

(MUTO et al., 1990), já tendo sido patenteado por japoneses, formulações cosméticas contendo

AO/AU para uso tópico com o intuito de proteger contra este tipo de câncer (ISHIDA et al.,

1990).

Em estudos de avaliação da capacidade antimicrobiana destes compostos, Horiuchi

(2007) observou esta atividade apenas contra bactérias gram positivas, como Staphylococcus

aureus resistente a meticilina (MRSA), Staphylococcus pneumonie e enterococos resistentes a

56

vancomicina (VRE). Neste trabalho também se concluiu que para esta atividade, o AU

apresentava um potencial superior ao AO. Análises mostram que nenhum dos compostos

apresenta atividade antifúngica contra C. albicans, necessitando de concentrações acima de 128

µg/ml para se impedir a proliferação deste fungo (HORIUCHI et al., 2007). Outros estudos

confirmam esse dado, enfatizando a atuação do AO na membrana desses microrganismos

(SZAKIEL et al., 2008).

Existem na literatura dados contraditórios com relação à atividade microbicida frente a

bactérias gram negativas e estudos mais recentes priorizam que esta atividade não é observada

para nenhum dos dois compostos (WOLDEMICHAEL et al. 2003; HORIUCHI et al., 2007).

Para AO já foram observadas atividades sinérgicas com Rifampicina, Isoniazida e Etambutol, já

foram observadas no tratamento in vitro contra Mycobacterium tuberculosis (GAUR et al.,

2010).

Alguns estudos demonstram a capacidade do AO em inibir transportadores relacionados

ao fenótipo de MDR. Braga e colaboradores (2007) mostraram a capacidade deste composto em

bloquear o efluxo do substrato fluorescente da bomba de efluxo MRP1, o composto CFDA,

porém o mesmo não era capaz de impedir o efluxo de Rodamina 123 da bomba P-gp. Neste

trabalho também foi demonstrada a baixa toxicidade do AO frente a células de mamíferos,

evidenciando sua capacidade citotóxica apenas contra células cancerosas. Para o AU, um estudo

recente evidenciou sua capacidade em inibir o efluxo dos substratos fluorescentes da P-gp a

daunorubucina e rodamina 123, porém o mesmo composto não foi capaz de inibir o efluxo de

calceína, um substrato fluorescente da bomba MRP1 (NABEKURA et al., 2009), o que pode

indicar que tais compostos atuariam em sítios distintos nessas bombas.

57

1.7. Revertendo o fenótipo MDR em fungos

Devido ao crescente número de pacientes imunodebilitados, seja pelo aparecimento da

síndrome da imunodeficiência adquirida (do inglês, AIDS), da terapia anticâncer ou pelo grande

número de transplantes realizados, vê-se um aumento significativo na incidência de infecções

fúngicas resistentes.

As infecções fúngicas sistêmicas geralmente são fatais, sendo poucos os compostos

disponíveis para serem usados na terapia antifúngica, além disso, muitas desses fármacos não são

utilizadas por apresentarem alta toxicidade, “resistência” ou alto custo, restando assim, um

pequeno leque de escolhas para compor uma terapia eficaz (revisto por CANNON et al., 2009).

O desenvolvimento de novos compostos antifúngicos continua, porém a maioria dos

compostos desenvolvidos atua em alvos intracelulares, o que torna essas moléculas suscetíveis

aos mecanismos de detoxificação celular ou efluxo, caracterizando sua resistência. Cannon e

colaboradores (2009) propuseram alguns interessantes mecanismos de ação para possíveis novos

fármacos que possam atuar em seu sitio alvo sem sofrer efluxo proporcionado pelos

transportadores MDR, como pode ser observado na Figura 7, onde quatro modelos estão

demonstrados. Destes quatro modelos o que chama mais a atenção seria o de compostos

denominadas quimiosensibilizadoras (Figura 7b), que poderiam atuar inibindo as bombas de

efluxo e permitindo que antifúngicos já disponíveis no mercado possam ser usados sem serem

extruídos das células, permitindo assim, a reversão do fenótipo de MDR.

Dentre os compostos quimiosensibilizadoras já conhecidas estão o FK506 (MAESAKI et

al., 1998) e a ciclosporina A (MARCHETTI et al., 2000), ambos inibidores do processo de MDR

em células de mamíferos, sendo o FK506 também inibidor de transportadores ABC de fungos,

58

porém ambos são imunossupressores, o que impossibilita seu uso para tratamentos de longa

duração na clínica.

Para a quimioterapia antifúngica não encontramos compostos quimiosensibilizadores

sendo utilizados na clínica, porém, alguns compostos já foram mostrados como promissores em

reverter tal fenótipo, como eniatina, fenotiazinas, isonitrila e derivados do ácido gálico

(KOLACZKWSKI, MICHALAK & MOTOHASHI, 2003; HIRAGA et al., 2005;

YAMAMOTO et al., 2005; RANGEL et al., 2010), no entanto, os testes realizados se resumem a

Pdr5p e a transportadores de C. albicans expressos em S. cerevisiae.

Diversos grupos passaram a buscar em fontes naturais como plantas, possíveis inibidores

de transportadores ABC, tendo em vista que muitos dos compostos que podem ser isolados,

como alcalóides, flavonóides e terpenóides já foram testados em células cancerosas que

apresentam o fenótipo de MDR com algum êxito (KUNTZ et al., 1999; IKEGAWA et al., 2000;

COREA et al., 2003; BRAGA et al, 2007; RANGEL et al., 2008).

59

(A) (B) (C) (D)

Fig. 7: Propostas de fármacos alternativos que possam atuar em células que apresentem o

fenótipo de MDR. (A) Célula suscetível a um composto que não é substrato para as bombas de

efluxo, ou que é rapidamente fungicida. (B) o composto é administrada em combinação com

inibidor para a bomba. (C) O composto é um inibidor multifuncional que afeta ao mesmo tempo

seu alvo, a atividade da bomba de efluxo e a transcrição do transportador. (D) a captação do

fármaco é aumentada e supera o efluxo. Fator de transcrição(FT) (Adaptado de CANNON et al.,

2009)..

60

2. JUSTIFICATIVA

A resistência a múltiplas drogas é um processo preocupante. Tendo em vista a variedade

da flora brasileira e as diversas referências, vindas do uso popular e corroboradas por pesquisas

científicas de seu uso no tratamento de enfermidades, torna-se evidente o interesse de nosso

grupo por compostos isolados de plantas que possam ter algum efeito inibitório de

transportadores que conferem o fenótipo MDR.

Em nosso estudo preliminar, em colaboração com o grupo da Prof. Dra. Suzana

Guimarães Leitão, do Departamento de Alimentos e Produtos Naturais da Faculdade de

Farmácia – UFRJ e sua aluna de mestrado Aline Castellar, iniciado em minha monografia,

frações da espécie Lippia lacunosa se mostraram eficazes em promover a inibição do

transportador Pdr5p, sendo isolado inicialmente um triterpeno da fração mais ativa. No início

deste trabalho realizamos a identificação deste triterpeno, denominado ácido oleanólico e um

novo isolamento proporcionou a identificação de uma mistura dos terpenos ácido oleanólico e

ácido ursólico, o que nos estimulou a avaliar a capacidade desses compostos em atuar sobre o

fenótipo de resistência a múltiplas drogas em uma cepa de S.cerevisiae e um isolado clínico de

C. albicans.

61

3. OBJETIVOS

• Avaliar a toxicidade do ácido oleanólico, da mistura ácido oleanólico/ursólico, isolados

da espécie Lippia lacunosa e do ácido ursólico purificado (comercial), frente a cepas

Saccharomyces cerevisiae.

• Avaliar a capacidade do ácido oleanólico, da mistura ácido oleanólico/ursólico e do ácido

ursólico purificado em inibir o transporte do substrato fluorescente, rodamina 6G,

promovido pelo transportador Pdr5p de Saccharomyces cerevisiae.

• Avaliar a toxicidade do ácido ursólico purificado frente às cepas de Candida albicans,

utilizando a cepa padrão ATCC24433 e o isolado clínico hiperesistente a fluconazol,

obtido de mucosa oral de paciente HIV+, procedendo a uma caracterização da resistência

deste isolado.

• Avaliar o potencial do ácido ursólico em reduzir a concentração mínima inibitória (MIC)

do fluconazol sobre o isolado clínico hiper resistente de Candida albicans, avaliando o

tipo de interação que esses dois compostos possuem.

62

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Produtos químicos e fármacos

AO e a mistura AO/AU foram isolados da espécie vegetal Lippia lacunosa e

solubilizados em DMSO 100%. O AU foi obtido comercialmente (Sigma Aldrich) e também

solubilizado em DMSO 100%. Fluconazol (Aquafarma®) e rodamina 6G (Sigma®) foram

dissolvidos em água destilada, sendo o fluconazol solubilizado em água destilada estéril.

Itraconazol (Sigma®), FK506 (Tecoland Corporation® USA) e vermelho do Nilo (Sigma®)

foram solubilizados em DMSO 100%. Concentrações de DMSO de no máximo 2% foram

utilizadas nos ensaios, dados anteriores de nosso grupo indicam que nestas concentrações não

ocorre interferencia no crescimento celular.

4.2 Isolamento de compostos

O extrato em diclorometano originado das folhas de Lippia lacunosa foi fracionado em

coluna com suporte de sílica de malha de 70 – 230 . As frações foram recolhidas até o volume de

300 ml. Como sistema de solventes foi utilizado diclorometano / acetato de etila seguido de

acetato de etila / metanol, ambos em proporções decrescentes.

As frações foram analisadas em cromatografia em camada delgada (CCD) em placas de

sílica e reveladas com solução de ácido sulfúrico com posterior aquecimento por dois minutos a

100 oC. As manchas observadas na placa, referentes à triterpenos, foram raspadas e purificadas e

63

os compostos identificados por Ressonância Mangnética Nuclear de H1 e C13 no Núcleo de

Pesquisa de Produtos Naturais (NPPN) da Universidade Federal do Rio de Janeiro.

4.3 Crescimento dos microrganismos

De acordo com o procedimento a ser realizado o cultivo das cepas utilizadas neste

trabalho foi realizado como descrito a seguir: as cepas mutantes de S. cerevisiae AD124567 ou

AD1234567 foram crescidas em meio de cultura YPD (dextrose 2 %, extrato de levedura 1 % e

peptona 2 %) a partir de um inóculo inicial de 2 x 105 células/ml, até se obter aproximadamente

3,0 de densidade ótica, a 600 nm (primeira metade da fase exponencial de crescimento celular).

Para as cepas de C. albicans, o crescimento foi realizado em meio BHI ou Sabouraud Dextrose

(SD) dependendo do experimento a ser realizado. Para solidificar os meios de cultura, quando

necessário, 2% de ágar foi utilizado. O isolado clínico de C. albicans (Pri) foi mantido em

estoque de glicerol (20% v/v de glicerol) e estocado a - 20 oC e sempre que necessário, reativado

em meio líquido antes da inoculação em meio sólido. A cepa ATCC 24433 e as cepas de S.

cerevisisiae foram mantidas em meio sólido a 4 oC.

4.4 Avaliação da toxicidade dos compostos frente às cepas de S. cerevisiae e C.

albicans

O efeito tóxico do AO, da mistura AO/AU e do AU foi avaliado em meio líquido como

descrito no protocolo M27-A2 do CLSI com pequenas modificações. Para cepas de S. cerevisiae,

concentrações crescentes de AO, AO/AU e AU foram utilizadas. A partir de um crescimento em

64

meio líquido, 4,0 x 103 foram incubadas em meio YPD em placas de 9 poços. As células foram

inoculadas em cada poço juntamente com concentrações crescentes dos compostos, sendo o

volume final em cada poço igual a 200 µl. Para S. cerevisiae, a placa foi incubada a 28 oC por

48h. O crescimento celular foi avaliado de acordo com a turbidez do meio de cultura, medida a

600 nm em leitor de microplacas (FLUOstar OPTIMA BMG Labtech). Para as cepas de C.

albicans o mesmo protocolo foi realizado, utilizando-se o meio líquido SD e concentrações

crescentes dobradas apenas do AU, sendo a placa incubada a 37 oC por 48 h. Como controle foi

utilizado o poço contendo apenas meio de cultura e células, sendo este ponto considerado 100%

de crescimento celular.

4.5 Efluxo de Rodamina 6G

4.5.1 Análise Qualitativa - Microscopia óptica de fluorescência

• Avaliação da capacidade do AO e da mistura AO/AU em inibir o efluxo de

rodamina 6G proporcionado pela Pdr5p de S. cerevisiae

Com objetivo de avaliar o potencial dos compostos isolados em promover o acúmulo de

rodamina 6G (um substrato fluorescente da Pdr5p) foi utilizado o protocolo descrito por

Yamamoto e colaboradores (2005), com algumas modificações. As cepas AD124567 e

AD1234567 foram crescidas em meio YPD até se obter aproximadamente 3,0 de densidade ótica

a 600 nm. As células foram lavadas e ressuspendidas em tampão PBS glicosado (2% p/v) pH 7,0

e 2,0 x 106 células/ml foram incubadas por 2 horas com AO ou a mistura AO/AU na

65

concentração final de 100 µM, com posterior adição de rodamina 6G (concentração final de 4

µM) e incubação por 30 minutos. Depois de lavadas 3 vezes com tampão PBS pH 7,0, as células

foram visualizadas em microscópio de fluorescência (Nikon Eclipse E400) .

Como controle positivo de acúmulo de rodamina 6G utilizamos a cepa sensível

AD1234567, bem como uma cepa selvagem de S. cerevisiae (gentilmente cedida pelo Prof. Dr

Allen Hagler – Titular do Departamento de Microbiologia Geral /IMPPG/UFRJ), isolada de

bromélia e que não foi manipulada geneticamente em laboratório. O composto FK506 foi

utilizado como controle positivo de inibição do transporte de rodamina 6G, na concentração final

de 20 µM.

4.5.2 Análise Quantitativa - Citometria de fluxo

• Avaliação da capacidade do AO, da mistura AO/AU e do AU em inibir o efluxo

de rodamina 6G proporcionado pela Pdr5p de S. cerevisiae

Este teste foi realizado como descrito por Cernicka e colaboradores (2007) com algumas

modificações. As cepas AD1234567 e AD124567 foram crescidas até se obter aproximadamente

3,0 de densidade ótica a 600 nm, quando então foram lavadas com tampão PBS pH 7,0. Após as

lavagens, 2,0 x 106 células foram ressuspendidas em PBS glicosado (2% p/v) pH 7,0 para um

volume final de 500 µl. A essa suspensão de células foi adicionado o composto de interesse em

concentrações crescentes. Para testes com AO e a mistura AO/AU foram usadas as

concentrações de 10, 25, 50, 100 e 200 µM e para os testes com AU foram usadas as

concentrações de 10, 25, 50, 100, 125, 150 e 200 µM. Estas células foram posteriormente

66

incubadas por 30 min a 30 ºC com as concentrações de interesse de cada um dos compostos

juntamente com rodamina 6G (concentração final de 4 µM). Após o tempo de incubação, 500 µl

de PBS pH 7,0 gelado foi adicionado, com o objetivo de diminuir o metabolismo celular, sendo

as células então centrifugadas a 5000 rpm em centrífuga refrigerada e posteriormente

ressuspendidas em 500 µl de PBS glicosado pH 7,0 (2% p/v) contendo as mesmas

concentrações anteriores dos compostos, seguindo uma nova incubação por mais 30 min a 30ºC.

Após o tempo de incubação as células foram lavadas e armazenadas em gelo até serem avaliadas

em citômetro de fluxo (BD FACSCalibur). Como controle de acúmulo de rodamina 6G

utilizamos a cepa AD1234567. Como controle de inibição do efluxo de rodamina 6G foi

utilizado o inibidor clássico FK506 a 20 µM. As avaliações em citômetro de fluxo foram

realizadas no Instituto Nacional do Câncer, com a colaboração do Prof. Dr. Marcelo Alex

Carvalho e do doutorando Renato Sampaio Carvalho.

4.6 Determinação da concentração mínima inibitória de antifúngicos de uso clínico

para cepas de C. albicans

Para determinar a concentração mínima inibitória de antifúngicos de uso clinico, foi

utilizado o protocolo M27-A2 do CLSI com pequenas modificações. Para as cepas de C.

albicans utilizamos os antifúngicos fluconazol (2 a 128 µg/ml) e itraconazol (0,1 a 2 µg/ml). A

partir de um crescimento em meio líquido, 4 x 103 células/poço foram incubadas em meio SD em

placas de 96 poços. As células foram inoculadas em cada poço juntamente com concentrações

crescentes dos fármacos, sendo o volume final em cada poço igual a 200 µl. A placa foi incubada

a 37 oC por 48 h. O crescimento celular foi avaliado em cada poço como turbidez, medida em

67

leitor de microplacas (FLUOstar OPTIMA BMG Labtech) a 600 nm. Como controle foi

utilizado o poço contendo apenas meio de cultura e células, sendo este ponto considerado 100%.

4.7 Avaliação de atividade sinérgica entre ácido ursólico e fluconazol frente ao

isolado clínico de C. albicans

Com objetivo de avaliar a existência de um efeito combinatório entre AU e fluconazol,

experimentos de “checkerboard” foram realizados, para o isolado Pri (cepa obtida de coleta de

infecção orofaríngea de paciente HIV+) (PORTELA, 2006), de acordo com o protocolo descrito

pelo Mukherjee e colaboradores (2005). Interações entre as moléculass foram classificadas de

acordo com o índice de inibição fracionária (FICI), um modelo não paramétrico definido pela

equação: FICI = FIC do composto A + FIC do compostoa B (MUKHERJEE et al., 2005). FIC do

composto A é definido como o MIC80 do AU combinado com fluconazol dividido pelo MIC80 do

AU sozinho, e o FIC do composto B é definido como MIC80 do fluconazol combinado com o AU

dividido pelo MIC80 do fluconazol sozinho. Quando o MIC80 para alguma dos compostos não é

alcançado, se admite que o MIC80 passe a equivaler a próxima concentração dobrada. Os valores

obtidos por esta equação definem o tipo de interação entre as moléculass. Valores abaixo ou

igual a 0,5 indicam interação sinérgica, entre 0,5 – 1,0 indicam atividade aditiva, entre 1 – 2,

indicam atividade indiferente e maior de 2,0, efeitos antagônicos.

Para este experimento utilizamos o protocolo de checkerboard como descrito por

Marchetti e colaboradores (2000), seguindo as recomendações do CLSI no qual concentrações

crescentes, dobradas, de AU e de fluconazol foram utilizadas sozinhas ou em combinação.

68

4.8 Avaliação da capacidade do isolado clínico de C. albicans em extruir compostos

fluorescentes

Com objetivo de se caracterizar a capacidade do isolado clínico de C. albicans em extruir

fluoróforos padrões, as cepas ATCC 24433 e Pri, foram crescidas em meio BHI até se obter

aproximadamente 6,0 de densidade ótica (primeira metade da fase fase exponencial de

crescimento celular). As células foram lavadas e ressuspendidas em tampão PBS glicosado (2%

p/v) pH 7,0 e 2 x 106 células/ml foram incubadas por 30 minutos à 30oC com rodamina 6G

(substrato das bombas CaCDR1p e CaCDR2p) na concentração final de 4 µM ou Vermelho do

Nilo (substrato das bombas CaCDR1p, CaCDR2p e CaMDR1p) na concentração final de 7 µM.

Depois de lavadas três vezes com tampão PBS pH 7,0, as células foram visualizadas em

microscópio de fluorescência. Neste caso a cepa ATCC 24433 foi utilizada como controle

positivo para acúmulo de rodamina 6G.

4.9 Análises estatísticas

Quando necessário utilizamos os testes de Anova e Dunnets, utilizando para realização

dos mesmos o programa Excell (Microsoft®), dotado das equações dos referidos testes, para os

cálculos matemáticos.

69

5. RESULTADOS

5.1 Avaliação da toxicidade do AO e da mistura AO/AU frente a cepas AD1234567 e

AD124567 de S. cerevisiae

Nossos experimentos se iniciaram com teste visando avaliar a toxicidade do AO e da

mistura AO/AU frente às cepas AD1234567 e AD124567, a partir de agora denominadas

hipersensível e hiperesistente, respectivamente. Utilizando-se concentrações crescentes de AO e

da mistura AO/AU, que variavam de 10 a 200 µM no meio de cultura, estas células foram

incubadas por 48 horas na presença e ausência dos compostos, possibilitando avaliar diferenças

no crescimento celular em cada uma dessas concentrações. Como demonstrado no resultado

apresentado na figura 8, para a cepa hiperesistente podemos notar que nenhum dos compostos foi

capaz de influenciar negativamente o crescimento celular desta cepa, mesmo na maior

concentração testada (200 µM), apresentando inibição máxima de 3,17 ± 2,1 % e 4,87 ± 3,5 %

do crescimento celular, quando tratada, respectivamente, como AO e AO/AU.

Prosseguindo nossos testes, o mesmo experimento citado previamente foi realizado, desta

vez com a cepa hipersensível (Figura 9). Foi possível observar uma inibição de 36,5 ± 2,5 %do

crescimento celular quando esta cepa foi submetida ao tratamento com AO, e 9,98 ± 5,48 % de

inibição quando tratada com AO/AU, sendo que estes valores são observados apenas quando

ambos foram testados na concentração de 200 µM.

70

Composto (µM)

0 50 100 150 200

Cre

scim

ento

cel

ular

(% re

lativ

a ao

con

trole

)

0

20

40

60

80

100

120

140

Fig. 8: Avaliação da toxicidade do AO e da mistura AO/AU sobre o crescimento da cepa

AD124567. A cepa AD124567 foi crescida em meio YPD por 48 horas na presença de

concentrações crescentes de AO (●) ou AO/AU (○) como descrito em Material e Métodos.

Como controle utilizamos o crescimento das cepas na ausência do composto. Os resultados

refletem a média de três experimentos ± erro padrão.

71

Composto (µM)

0 50 100 150 200

Cre

scim

ent

o ce

lula

r (%

rela

tiva

ao c

ontro

le)

0

20

40

60

80

100

120

Fig. 9: Avaliação da toxicidade do AO e da mistura AO/AU sobre o crescimento da cepa

AD1234567. A cepa AD1234567 foi crescida em meio YPD por 48 horas na presença de

concentrações crescentes de AO (●) ou AO/AU (○) como descrito em Material e Métodos.

Como controle utilizamos o crescimento das cepas na ausência do composto. Os resultados

refletem a média de três experimentos ± erro padrão.

72

5.2 Avaliação da capacidade do AO e da mistura AO/AU em inibir o efluxo de

rodamina 6G realizado pela Pdr5p

Em uma segunda etapa, foi realizada uma avaliação da capacidade destes compostos em

inibir o transporte de rodamina 6G, um substrato fluorescente da bomba de efluxo Pdr5p,

utilizando para isto uma concentração única desses compostos (100 µM final) no tratamento da

cepa hiperesistente.

Uma análise qualitativa, utilizando uma abordagem de microscopia óptica, nos permitiu

observar que na concentração testada o AO parece ser capaz de inibir o transporte do substrato

fluorescente, sendo possível observar a retenção de uma pequena quantidade de fluorescência no

interior da célula (Figura 10). Para a mistura AO/AU, conseguimos observar um acúmulo de

rodamina 6G na célula hiperesistente, visualmente maior que o acúmulo observado para o

tratamento com o AO puro (Figura 10), sugerindo uma maior eficiência da mistura de ambos os

compostos.

Para quantificarmos e analisarmos a diferença nos níveis de fluorescência procedemos a

uma avaliação quantitativa da inibição observada nos experimentos de microscopia, utilizando,

dessa vez, concentrações crescentes do AO, variando de 10 a 200 µM, para avaliar a capacidade

deste composto em inibir o efluxo de rodamina 6G, permitindo assim sua retenção no interior da

célula hiperesistente. Os resultados obtidos se referem a porcentagem de inibição relativa ao

controle, célula hipersensível, que equivale ao nosso máximo de retenção do fluoróforo. Para

este experimento, trabalhamos com a abordagem de citometria de fluxo, em colaboração com o

Prof. Dr. Marcelo Alex Carvalho, do Instituto Federal do Rio de Janeiro (IFRJ) e doutorando

Renato Sampaio Carvalho, utilizando o citômetro do Instituto Nacional do Câncer (INCA). Neste

experimento podemos observar que apenas na maior concentração testada de AO (200 µM), foi

73

possível observar um efeito inibitório significativo, porém, muito inferior ao efeito observado

pelo tratamento com o inibidor clássico FK506, alcançando apenas 16,86 ± 3,01 % de inibição

do efluxo (Figura 11). Um controle realizado neste ensaio permitiu a exclusão da hipótese de

autofluorescencia do AO. Para isto as células foram submetidas a tratamento apenas com este

composto, em sua maior concentração (200 µM) e foram analisadas por citometria (dado não

mostrado).

74

Fig. 10. Avaliação qualitativa da inibição do efluxo de rodamina 6G após tratamento

da cepa AD124567 com AO ou AO/AU. Para avaliar a capacidade dos compostos em inibir o

efluxo de rodamina 6G foi realizado como descrito em Material e Métodos. Para este

experimento utilizamos como controles positivos de acúmulo de rodamina 6G as cepas

AD1234567 (PDR -) e selvagem (WT); para controle positivo de inibição utilizamos o fármaco

FK506 a 20 µM e para controle positivo de extrusão, a cepa AD124567 (PDR +). AO e AO/AU

foram utilizados a 100 µM.

75

Ácido oleanólico (µM)

Pdr - Pdr + 10 50 100 200 FK506

Ácum

ulo

de R

odam

ina

6G (%

rela

tiva

ao c

ontro

le)

0

20

40

60

80

100

120

Fig. 11. Avaliação quantitativa da inibição do efluxo de rodamina 6G promovida

pelo tratamento da cepa AD124567 com AO. A avaliação quantitativa foi realizada como

descrito em Material e Métodos, sendo utilizadas concentrações crescentes de AO. Para este

experimento utilizamos como controles positivos de acúmulo de rodamina 6G as cepas

AD1234567 (representada como Pdr -); para controle positivo de inibição utilizamos o fármaco

FK506 a 20 µM e para controle positivo de extrusão, a cepa AD124567 (representada como Pdr

+). Os resultados refletem a média ± erro padrão de três experimentos. * p < 0,001

*

*

*

76

Realizamos também uma avaliação quantitativa da inibição inicialmente observada por

microscopia quando se tratava a célula hiperesistente com a mistura AO/AU (Figura 12). Para

isto foram utilizadas concentrações crescentes do AO/AU, variando de 10 a 200 µM, utilizando o

mesmo protocolo citado para AO (Figura 11).

Neste experimento podemos constatar um padrão de inibição do efluxo de rodamina 6G

do tipo dose dependente, no qual a maior inibição observada, de 56,76 ± 15,08 % , foi alcançada

com a concentração máxima testada. (Figura 12). Utilizamos o mesmo controle previamente

citado, excluindo assim a hipótese de autofluorescencia da mistura AO/AU (dado não mostrado).

77

Ácido oleanólico/Ácido ursólico (µM)

Pdr - Pdr + 10 50 100 200 FK506

Acú

mul

o de

Rod

amin

a 6G

(% re

lativ

a ao

con

trole

)

0

20

40

60

80

100

120

Fig. 12: Avaliação quantitativa da inibição do efluxo de rodamina 6G promovida

pelo tratamento da cepa AD124567 com AO/AU. A avaliação quantitativa foi realizada como

descrito em Material e Métodos, sendo utilizadas concentrações crescentes de AO/AU. Para este

experimento utilizamos como controles positivos de acúmulo de rodamina 6G as cepas

AD1234567 (representada como Pdr -); para controle positivo de inibição utilizamos o fármaco

FK506 a 20 µM e para controle positivo de extrusão, a cepa AD124567 (representada como Pdr

+). Os resultados refletem a média ± erro padrão de três experimentos. * p < 0,001

*

* *

78

5.3 Avaliação da toxicidade do AU frente às cepas AD1234567 e AD124567 de S. cerevisiae

Com o objetivo de avaliarmos o potencial citotóxico do AU frente às cepas hiperesistente

e hipersensível de S. cerevisae utilizamos concentrações crescentes deste composto, variando de

10 a 200 µM, com tempo de incubação de 48 horas, utilizando o mesmo protocolo descrito para

AO e AO/AU.

De acordo com o resultado apresentado no gráfico da figura 13 podemos observar uma

inibição de 31,2 ± 9,88 % e 32,9 ± 1,9 % do crescimento celular para as cepas hiperesistente e

cepa hipersensível, respectivamente, quando submetidas ao tratamento com a maior

concentração de AU (200 µM).

79

Ácido ursólico (µM)

0 50 100 150 200

Cre

scim

ento

cel

ular

(% re

lativ

a ao

con

trole

)

0

20

40

60

80

100

120

Fig. 13: Avaliação da toxicidade do AU frente às cepas AD124567 e AD1234567 de S.

cerevisiae. Para avaliar toxicidade do AU frente as cepas AD124567 (●) e AD1234567 (○) de S.

cerevisiae foram incubadas com concentrações crescentes de AU como descrito em Material e

Métodos. Como controle utilizamos o crescimento das cepas na ausência do composto. Os

resultados refletem a média de três experimentos ± erro padrão.

80

5.4 Avaliação da capacidade do AU em inibir o efluxo de rodamina 6G realizado

pela Pdr5p

Avaliações da capacidade deste composto em inibir o efluxo de rodamina 6G das células

hiperesistentes de S. cerevisiae foram realizadas por citometria de fluxo.

Para este teste, assim como feito para AO e AO/AU, utilizamos concentrações crescentes

de AU variando de 10 a 200 µM (Figura 14). Neste experimento podemos constatar inibições

significativas a partir de 50 µM de AU (71,37 ± 10,48 %), quando comparamos com o acúmulo

observado para a cepa hipersensível, resultado comparável ao obtido para o tratamento com FK

506 a 20 µM, o qual foi capaz de inibir 77,94 ± 8,44 %. É possível observar um efeito inibitório

do tipo dose dependente, que parece atingir seu potencial máximo de inibição do efluxo de

rodamina 6G com 125 µM de AU, onde alcançamos uma inibição de 91,2± 3,68 %. Neste caso

também foi realizado controle de autofluorescencia do AU, assim como já descrito para AO e

AO/AU (dado não mostrado).

81

Ácido ursólico (µM)

Pdr - Pdr + 10 25 50 100 125 15 200 FK506

Acú

mul

o de

Rod

amin

a 6G

(% re

lativ

a)

0

20

40

60

80

100

0

Fig. 14: Avaliação quantitativa da inibição do efluxo de rodamina 6G promovida

pelo tratamento da cepa AD124567 com AU. A avaliação quantitativa foi realizada como

descrito em Material e Métodos. Concentrações crescentes de AU foram utilizadas. Para este

experimento foi utilizado como controle positivo de acúmulo de rodamina 6G a cepa

AD1234567 (representada como Pdr -); para controle positivo de inibição utilizamos o fármaco

* *

* * *

* *

82

FK506 a 20 µM e para controle positivo de extrusão, a cepa AD124567 (representada como Pdr

+). Resultados refletem a média ± erro padrão de três experimentos. * p < 0,001

5.5 Caracterização da resistência apresentada pelo isolado clínico de C. albicans

5.5.1 Avaliação de resistência a antifúngicos de uso clínico

Estudos visando caracterizar a resistência ao fluconazol apresentado pelo isolado clínico

Pri de C. albicans foram realizados. Inicialmente foi avaliada a menor concentração inibitória

(MIC80) para dois azóis de uso clínico, itraconazol e fluconazol, para o isolado Pri e para a cepa

padrão ATCC24433 (Tabela 2).

Para avaliação do MIC80 utilizamos o protocolo M27-A2, padronizado pelo CLSI. Para

realização deste protocolo utilizamos o itraconazol em concentrações que variavam de 0,1 a 1

µg/ml e o fluconazol em concentrações de 2 a 512 µg/ml. O crescimento celular foi avaliado por

medida de turbidez a 600 nm, sendo considerado como MIC80 a concentração do fármaco na qual

observamos uma redução de no mínimo 80% do crescimento celular.

Para o isolado Pri foi obtido um MIC80 de 256 µg/ml para fluconazol e 0,1 µg/ml para

itraconazol. Para a cepa padrão ATCC24433 observamos um MIC80 de < 2 µg/ml para

fluconazol e 1,6 µg/ml para itraconazol.

83

Concentração Mínima Inibitória (MIC)* Cepa

Fluconazol (µg/ml) Itraconazol (µg/ml)

C. albicans Pri 256 0,1

C. albicans ATCC 24433 < 2 1,6

Tabela II. Avaliação da concentração mínima inibitória (MIC) de antifúngicos de

uso clínico para o isolado Pri e cepa ACTCC24433. Resultados obtidos de acordo com a

metodologia descrita previamente em Material e Métodos, seguindo as normas descritas pelo

CLSI. * Os valores apresentados equivalem ao MIC80 após 48 horas de incubação a 37oC.

84

5.5.2 Avaliação da capacidade do isolado clínico de C. albicans em reter

fluoróforos substratos de bombas ABC e MFS

Dando continuidade a caracterização da resistência do isolado Pri, com relação aos

transportadores relacionados ao processo de MDR, foi avaliada a capacidade desta cepa em

extruir os compostos fluorescentes, rodamina 6G e vermelho do nilo. Para esta avaliação foi

utilizada a abordagem de miscroscopia óptica de fluorescência.

A cepa Pri e ATCC24433 foram submetidas à incubação com rodamina 6G ou vermelho

do nilo, sendo posteriormente observados em microscopia óptica de fluorescência. Nos

resultados mostrados na figura 15 é possível observar a capacidade de ambas as cepas em

acumular rodamina 6G, porém o acúmulo de vermelho do nilo é visualizado apenas para a cepa

padrão ATCC24433. A fluorescência observada no interior das células do isolado clínico Pri,

tratadas com vermelho do nilo, se mostrou tênue, quando comparada à fluorescência acumulada

pela cepa ATCC24433.

85

Fig. 15: Avaliação da capacidade da cepa 24433 e do isolado Pri de C. albicans em

extruir compostos fluorescentes. A metodologia utilizada tanto na incubação como para a

observação em microscopia óptica de fluorescência estão descritos em Material e Métodos.

86

5.6 Avaliação da toxicidade do AU frente ao isolado clínico de C. albicans

Com o objetivo de avaliar a toxicidade do AU para as cepas de C. albicans foi utilizada a

cepa ATCC24433 e o isolado Pri, aplicando a metodologia descrita pelo protocolo M27-A2 do

CLSI, no qual foram usadas concentrações de AU que variavam de 8 a 256 µM.

No gráfico observado na figura 16 é possível notar que o AU se mostra não tóxico para o

isolado Pri, inibindo apenas 1,12% ± 4,0 do crescimento celular na maior concentração utilizada.

Com relação a cepa ATCC, foi possível observar uma inibição de 43,0% ± 5,7 do crescimento

celular quando utilizada a mesma concentração do AU. Com esses dados podemos observar,

portanto, um MIC80 para o AU de 512 µM para ambas as cepas.

87

Ácido Ursólico (µM)

0 50 100 150 200 250

Cre

scim

ento

cel

ular

(%

rela

tiva

ao c

ontro

le)

0

20

40

60

80

100

120

Fig. 16: Avaliação da toxicidade do AU frente à cepa 24433 e ao isolado clínico Pri de

C. albicans. Para avaliar a toxicidade do AU para a cepa ATCC24433 (○) e isolado Pri (l)

foram incubadas com concentrações crescentes de AU como descrito em Material e Métodos.

Como controle foi utilizado o crescimento das cepas na ausência do composto. Os dados

apresentados refletem a média de três experimentos ± erro padrão.

88

5.7 Avaliação de interação entre AU e fluconazol quando usados em combinação

contra o isolado clínico de C. albicans

Para avaliar a interação do AU com o antifúngico fluconazol utilizamos a metodologia de

“checkerboard” descrita em Materiais e Métodos. Neste ensaio, diferentes combinações de

concentrações de cada um dos compostos foi utilizada, visando obter uma concentração de AU

que seja capaz de sensibilizar a cepa Pri ao tratamento com fluconazol, revertendo assim, o seu

fenótipo de resistência ao fluconazol.

Para este ensaio o AU foi utilizado em concentrações que variavam de 2 a 32 µM e o

fluconazol em concentrações de 2 a 128 µg/ml. Os resultados obtidos indicam que se utilizando

o AU na concentração de 4 µM é possível reduzir o MIC80 do fluconazol de 256 µg/ml para 4

µg/ml (Figura 17).

Com estes resultados foi possível calcular o tipo de interação que estas duas moléculas

possuem, sendo para isto calculado o FICI (Índice de Inibição Fracionária). Na Tabela III são

apresentados os valores de FIC para cada umas das moléculas. Para o fluconazol obtivemos um

FIC de 0,0937 ± 0,078 e para o AU um FIC de 0,0104 ± 0,0026, obtendo-se, com isso, um valor

de FICI de 0,1041 ± 0,0807, indicativo de atividade sinérgica entre os dois compostos.

89

Fig. 17: Avaliação da capacidade de quimiosensibilização do AU em associação ao

fluconazol. O isolado Pri foi incubado na ausência e na presença de 4 µM de AU combinado

com concentrações crescentes de fluconazol como mostrado na figura. Como controle de

crescimento (barra CTR) foi utilizado a mesma cepa na ausência de ambos os compostos. Os

resultados refletem a média de três experimentos ± erro padrão.

90

Cepa FIC AU FIC fluconazol FICI

Isolado Pri 0,0104 ± 0,0026 0,0937 ± 0,078 0,1041 ± 0,0807

Tabela III. Avaliação da interação entre fluconazol e AU apresentada durante o

tratamento do isolado Pri de C. albicans. Os dados mostrados na tabela foram obtidos a partir

do “checkerboard”, utilizando a equação: FICI = FIC do AU + FIC do fluconazol, onde FIC do

AU equivale ao MIC80 do AU combinado com fluconazol dividido pelo MIC80 do AU sozinho,

enquanto o FIC de fluconazol equivale ao MIC80 do fluconazol combinado com AU dividido

pelo MIC80 do fluconazol sozinho. Valores de FICI ≤ 0,5 indicam atividade sinérgica; > 0,5 ≤ 1,

indicam atividade aditiva; > 1 e ≤ 2 indicam atividade indiferente e > 2 indicam atividade

antagônica.

91

8. DISCUSSÃO

Em estudos anteriores, utilizando a partição em diclorometano, obtida a partir do extrato

etanólico bruto de folhas de Lippia lacunosa, foi demonstrado que esta partição era capaz de

inibir a atividade catalítica da enzima Pdr5p de S. cerevisiae e, seus compostos inicialmente

isolados, um flavonóide e um triterpeno, eram capazes de inibir o efluxo de rodamina 6G

(GARCIA-GOMES, 2007). Análises cromatográficas dessa partição em diclorometano

permitiram o isolamento de dois compostos majoritários. Com o auxílio da Ressonância

Mangnética Nuclear de H1 e C13, os terpenos isolados foram identificados como ácido oleanólico

(AO) e ácido ursólico (AU). Destes, o AO foi obtido como composto isolado, em purificações

iniciais, enquanto outra amostra, obtida mais tardiamente, continha AO/AU na proporção de 6:4,

sendo de difícil separação.

Uma vez que não existem dados na literatura que mostrem a atividade de terpenos em

fungos apresentando o processo de MDR, nossa discussão será mais fortemente desenvolvida

com base nos resultados encontrados por nosso grupo.

Em estudos iniciais, avaliamos a toxicidade desses isolados frente às cepas hipersensível e

hiperesistente de S. cerevisiae, confirmando dados da literatura que apontam a baixa toxicidade

destes terpenos para leveduras (HORIUCHI et al., 2007). Nesses experimentos podemos

observar uma maior inibição do crescimento da cepa hipersensível quando tratada com AO, em

comparação com a inibição de crescimento da cepa hiperesistente. Neste caso obtivemos 36,5%

de inibição do crescimento da cepa hipersensível e 9,98% para cepa hiperesistente, mostrando

que o AO é tóxico apenas para a cepa hipersensível, quando utilizado na maior concentração

testada. Estes dados analisados em conjunto sugerem que o AO poderia ser um substrato para o

92

transportador, sendo transportado para o meio extracelular, permitindo assim, que uma cepa que

possua superexpressão de Pdr5p, seja capaz de suportar maiores concentrações de AO em seu

meio de cultura.

Para a mistura AO/AU podemos observar que a mesma não foi capaz de inibir

significativamente o crescimento das cepas hiperesistente e hipersensível, obtendo inibições de

4,87% e 9,98%, respectivamente.

Com o objetivo de analisar a capacidade do AO e do AO/AU em inibir o efluxo do

substrato fluorescente rodamina 6G, proporcionado pela Pdr5p, inicialmente realizamos uma

microscopia óptica de fluorescência, na qual as células hiperesistentes foram tratadas com 100

µM de cada um desses compostos, utilizando como controles as cepas hipersensível e selvagem,

bem como o inibidor clássico FK506 a 20 µM. Este inibidor, pertencente a classe das lactonas, já

foi mostrado como um eficiente inibidor do efluxo de rodamina 6G proporcionado pela Pdr5p,

atuando de modo competitivo para alcançar esta inibição (HENDRYCH et al., 2009). As

imagens obtidas nos permitiram constatar que os compostos apresentavam efeitos distintos com

relação a inibição do transporte mediado pela Pdr5p, sendo, visualmente, observada uma maior

capacidade de inibição mediada pela mistura AO/AU, comparável, visualmente, a inibição

proporcionada pelo FK506. Já com relação ao AO, foi observada uma fraca inibição onde poucas

células apresentavam uma leve fluorescência interna.

Com o objetivo de quantificar a inibição observada por microscopia, seguimos para uma

abordagem em citometria de fluxo. Para ambos os compostos utilizamos concentrações de 10,

25, 50, 100 e 200 µM. Os resultados obtidos para o tratamento com AO nos permitiram

comprovar que este composto era realmente incapaz de promover tal inibição, necessitando de

altas concentrações para se obter apenas 16,86% de inibição do efluxo do fluoróforo. Este

93

resultado parace ser comum para transportadores ABC, tendo em vista que estudos de Braga e

colaboradores (2007) mostraram que esse mesmo composto também não era capaz de inibir o

efluxo de rodamina 123 de uma linhagem de célula de mamífero que superexpressava o

transportador P-gp, um transportador ABC que guarda homologia não só estrutural, mas também

de substratos, com a Pdr5p (KOLACZKOWSKI et al., 1996). Esse resultado pode ser

complementar ao descrito previamente com relação ao crescimento celular (Figura 8 e 9), já que

levantamos a hipótese de que o AO pode ser transportado pela Pdr5p. Neste caso o AO seria

transportado para o meio extracelular sem interferir no transporte de rodamina, provavelmente

por não interagir com o mesmo sítio de ligação de rodamina, o que poderia indicar sítios

distintos para estes compostos. Estes resultados não colaboraria com a idéia de uma inibição do

tipo competitiva, na qual o composto testado competiria pelo sítio de ligação ao fármaco, não

permitindo que esse, mesmo sendo um substrato, fosse capaz de impedir o efluxo de outra

molécula, como foi demonstrado para os derivados de ácido gálico na Pdr5p (RANGEL et al.,

2010).

Os mesmos estudos realizados com a mistura AO/AU mostraram que esta apresentava

uma capacidade bem maior de inibir o efluxo do fluoróforo rodamina 6G, conseguindo inibir

56,76 % quando utilizamos a maior concentração da mistura, mesmo tendo em sua composição

aproximadamente 60% de AO. Com este resultado, duas hipóteses foram levantadas: na primeira

hipótese o AO e o AU poderiam atuar de forma sinérgica. Este tipo de associação é muito

comum em extratos de plantas, em que temos a presença de vários compostos juntos

desenvolvendo uma ação biológica, mas pouco analisada devido a dificuldades de se combinar

concentrações e compostos em variedades tamanha que se torne possível fazer um estudo de

sinergismo. Em nossa segunda hipótese, o composto realmente eficaz em promover a inibição do

94

transporte promovido pela Pdr5p seria o AU mesmo se apresentando em menor quantidade na

mistura (40%).

Uma maneira simples de responder a questão levantada seria repetir os testes, dessa vez

utilizando-se apenas o AU. Como a purificação do AU não foi possível a partir da nossa mistura

AO/AU, tivemos como alternativa a opção de utilizar um AU comercial (Sigma©) com grau de

pureza superior a 98%. Com as análises de efluxo de substrato fluorescente, foi possível observar

que o AU comercial se mostrou mais eficaz em inibir o transporte promovido pela Pdr5p quando

comparado não só com o AO, mas também quando comparado com a mistura, alcançando uma

forte inibição a 50 µM (71,38%) comparável a obtida com 20 µM de FK506 (77,94%),

alcançando um máximo de inibição na concentração de 125 µM (91,2%). Estes dados nos

permitiram concluir que nossa segunda hipótese era a que se encaixava melhor para explicar a

inibição obtida com a mistura AO/AU. Neste caso podemos confirmar a capacidade do AU em

inibir o transporte de rodamina 6G pela Pdr5p, já tendo sido mostrada a capacidade deste

composto em inibir o efluxo de substratos fluorescentes de células que superexpressam P-gp

(NABEKURA et al., 2009).

Analisando os resultados obtidos até o momento, e resultados já presentes na literatura

com relação a atividade diferenciada entre AO e AU (HORIUCHI et al., 2007; BRAGA et al.,

2007; NABEKURA et al., 2009), podemos inferir que o posicionamento de um grupamento

metila é capaz de promover interações distintas das moléculas testadas com transportadores do

tipo ABC. O grupamento metila na posição I, como ocorre para o AU (Figura 6) permite uma

interação com a Pdr5p que impede o transporte de rodamina 6G, o que não ocorre quando o

mesmo grupamento se encontra na posição II, caso do AO (Figura 6).

95

Analisando conjuntamente os resultados de toxicidade e inibição de efluxo, podemos

sugerir que, tendo em vista que o AU não interfere negativamente no crescimento das cepas de S.

cereviseae e ao mesmo tempo é capaz de inibir o efluxo do substrato fluoróforo, este composto

parece inibir diretamente o transportador. Esta inibiçãom pode ocorrer, provavelmente, devido a

uma interação com o mesmo sítio de ligação de rodamina 6G ou em algum sítio próximo, que

poderia inclusive ser o NBD, inibindo ou não a atividade ATPásica deste transportador. Em

ambos os casos, poderia ocorrer um impedimento alostérico, não possibilitando o efluxo do

fluoróforo.

De acordo com os resultados de viabilidade, podemos inferir que o AU não é um substrato

para a bomba, até mesmo devido as altas concentrações necessárias para se observar inibições

significativas do crescimento celular, sendo assim, provavelmente ele não atuaria como um

inibidor do tipo competitivo. Esses resultados corroboram a idéia de que neste caso, o AU deve

se ligar a algum sítio próximo ao da rodamina, seja nos TMS ou nos NBDs, e de certa forma

dificultar o acesso da rodamina 6G ao seu sítio de ligação, inibindo, assim, o seu efluxo.

Após a obtenção desses resultados, aumentou nosso interesse em avaliar a atuação deste

composto em um isolado clínico de C. albicans, que apresentava o fenótipo de resistência a

fluconazol, obtida de um paciente HIV+ a partir de um infecção de orofaringe, denominado Pri

(BRAGA-SILVA et al., 2007). Com este isolado também foi possível analisar o processo de

resistência com o objetivo de descobrir se nesta cepa poderia estar ocorrendo uma

superexpressão de uma bomba de efluxo que conferiria o fenótipo MDR.

Na tentativa de analisar esse fenótipo foram utilizadas duas abordagens: uso demoléculas

que fossem substratos e a utilização de fluoróforos que também seriam substratos.

Transportadores do tipo ABC de C. albicans, quando superexpressos, são capazes de conferir

96

resistência à classe dos azóis como um todo (LAMPING et al., 2008), já no caso de

transportadores do tipo MFS, os mesmos conferem resistência a azóis específicos, não sendo

capazes de conferir resistência por exemplo a itraconazol (revisto por CANNON et al., 2009).

Partindo desses dados já descritos na literatura, realizamos avaliações de MIC80 para fluconazol e

itraconazol, utilizando como controle uma cepa padrão sensível, denominada ATCC24433.

Neste caso podemos observar que a cepa Pri apresentava alta resistência para fluconazol,

apresentando um MIC80 de 256 µg/ml, valor bem acima dos pontos de referência propostos pelo

CLSI, no qual para uma cepa ser resistente a fluconazol seu MIC80 deve ser maior ou igual a 64

µg/ml, enquanto para uma cepa ser considerada sensível o MIC80 deve ser menor ou igual a 8

µg/ml; enquanto isso para itraconazol encontramos um MIC80 de 0,1 µg/ml, indicativo de

sensibilidade para este azol, já que de acordo com o mesmo órgão citado acima, para uma cepa

ser considerada resistente a este azol, seu MIC80 deve ser maior que 1 µg/ml, sendo considerado

sensível quando obtemos MIC80 menor ou igual a 0,125 µg/ml. Estes resultados já apresentavam

um indício de que neste isolado clínico provavelmente não deveria ocorrer a superexpressão de

transportadores do tipo ABC, podendo ocorrer uma expressão aumentada, provavelmente, de

uma bomba do tipo MFS, uma vez que observamos um padrão de resistência apenas a fluconazol

e de sensibilidade a itraconazol.

Em nossa segunda metodologia de caracterização avaliamos o potencial dessa cepa em

extruir compostos fluorescentes, como rodamina 6G e vermelho do nilo. Sabemos que a

rodamina 6G é um substrato clássico para bombas do tipo ABC, porém recentemente em um

estudo de Ivnitski-Steele e colaboradores (2009) foi demonstrado que o vermelho do nilo,

corante de regiões ricas em lipídios, é um substrato não só para os transportadores ABC,

CaCDR1p e CaCDR2p, mas também para o transportador MFS CaMDR1p, fazendo com que

97

ambos os compostos possam ser utilizados para se obter informações sobre o tipo de

transportador presente em uma cepa. Utilizando os dois fluoróforos podemos avaliar a presença

de um transportador ABC, sem definir qual deles estaria presente, tendo em vista que a C.

albicans pode expressar tanto CaCDR1p quanto CaCDR2p (GAUR, CHOUDHURY &

PRASAD, 2005). A observação da presença de um transportador MFS, também pode ser

realizada, neste caso, uma vez que o vermelho do nilo pode ser extruído por qualquer um desses

transportadores e a rodamina, apenas pelos transportadores do tipo ABC, sendo o transportador

MFS CaMDR1p mais relacionado com o fenótipo MDR em C. albicans (FLING et al., 1991;

BEN-YAACOV et al., 1994).

Para este experimento utilizamos os dois fluoróforos já citados e as cepas Pri e

ATCC24433 em uma abordagem de microscopia óptica de fluorescência. Neste caso observamos

que ambas as cepas eram capazes de reter a rodamina 6G em seu interior, não ocorrendo,

portanto, extrusão visualmente significativa deste fluoróforo do interior celular. Entretanto,

quando as cepas foram incubadas com vermelho do nilo, foi possível observar que a cepa Pri

acumulava este fluoróforo em quantidade muito inferior a cepa ATCC24433.

Analisando conjuntamente os dados obtidos com as avaliações do MIC80 e a extrusão de

fluoróforos, foi possível coletar mais indícios de que o isolado clínico Pri apresenta um fenótipo

de MDR, devido provavelmente a superexpressão de uma bomba de efluxo do tipo MFS.

Neste momento, tendo em mãos um composto com atividade contra o transporte mediado

pela Pdr5p de S. cerevisiae, uma bomba do tipo ABC, e uma cepa de C. albicans, superesistente

a fluconazol devido a um fenótipo MDR, provavelmente mediado pela superexpressão de um

transportador do tipo MFS e sabendo que existem similaridades entre estas duas famílias, como

por exemplo: estrutura em alfa hélice dos TMS, sobreposição de substratos e o fato de que

98

alguns transportadores ABC mesmo após deleção de seus NBDs permaneceram capazes de

transportar fármacos, inclusive permitindo que sua unidirecionalidade fosse alterada, fazendo

com que compostos possam também ser captados para o interior celular (revisto por VENTER et

al., 2005); aumentou o nosso interesse em avaliar a capacidade do AU, já identificado neste

trabalho como inibidor do transporte de rodamina 6G promovido pela Pdr5p, em atuar

resensibilizando esta cepa ao tratamento com fluconazol.

Para utilizar o AU como possível substância quimiosensibilizadora se torna necessário

analisar primariamente sua toxicidade frente à cepa de referência ATCC24433 e para o isolado

Pri. Para isso, utilizamos a abordagem padronizada pelo CLSI para obtenção do MIC80 deste

composto. Os resultados apresentados na figura 16 mostram que o AU não é tóxico para o

isolado Pri até a concentração máxima testada (256 µM), alcançando apenas 1,12% de inibição

do crescimento celular, fazendo com que seu MIC80 corresponda a 512 µM. Diferentemente, para

a cepa padrão ATCC24433 observamos que o AU se mostrava tóxico dose dependente,

alcançando inibição máxima (43,0%), a 256 µM, e de acordo com as regras propostas pelo CLSI,

seu MIC80 corresponderia também a 512 µM. Apesar dessa diferença de inibição do

crescimento, estes dados estão em concordância com dados da literatura que mostram que para

uma ação antifúngica são necessárias concentrações superiores a 128 µg/ml tanto para AU

quanto para AO (HORIUCHI et al., 2007) Estes resultados se assemelham aos obtidos para o

AO com a Pdr5p, indicando que provavelmente, para o transportador expresso neste isolado

clínico, o AU seja um substrato, diferente do que ocorre quando este composto é utilizado com o

intuito de inibir o efluxo de rodamina 6G proporcionado pela Pdr5p.

Avaliações da ação conjunta do AU com fluconazol permitiram observar que na presença

de 4 µM deste composto, o MIC80 do fluconazol para o isolado Pri, que antes se apresentava

99

como 256 µg/ml, passa a ser 4 µg/ml (Figura 17), permitindo concluir, portanto, que o AU

resensibiliza esta cepa ao tratamento com fluconazol, revertendo seu fenótipo resistente.

Com estes dados foi possível calcular o índice de inibição fracionária (FICI) que nos

permitiu avaliar o tipo de interação que o AU possui quando usado em conjunto com o

fluconazol, sendo encontrado um valor de 0,1041, condizente com sinergismo, o que indica que

ambas as moléculas atuariam em conjunto para inibir o crescimento celular.

Até o momento, os testes com a finalidade de se obter moléculas quimiosensibilizadoras

têm sido realizados em cepas mutadas e até mesmo com expressão heteróloga de transportadores,

o que por fim acaba sendo um modelo de estudo que não reflete a realidade, até mesmo devido

ao fato de que, no caso de Candida spp., por exemplo, não é possível determinar ao certo o nível

de expressão, para os transportadores relacionados a MDR, que conferem relevância clínica a um

isolado (CANNON et al., 2009). A expressão heteróloga de proteínas de membrana pode levar a

modificações celulares como, por exemplo, alterações na estrutura da membrana plasmática, o

que pode resultar em análises equivocadas de substratos e inibidores (WIRSCHING, 2001).

Além disso, a geração de um “background” que favoreça o estudo de um único transportador,

sem outras interferências, acaba sendo artificial, uma vez que sabemos que o processo de

resistência, em fungos, muitas vezes é multifatorial, dependendo de vários mecanismos. Neste

caso torna-se interessante analisar um isolado clínico, no qual se observa o fenótipo de MDR.

Por existir um limitado número de classes de antifúngicos disponíveis, a escolha

terapêutica para o tratamento de infecções fúngicas sistêmicas, acaba sendo extremamente

limitado (revisto por CANNON et al., 2009), o que pode favorecer o desenvolvimento de

resistência, principalmente nos casos em que se observam altas taxas de reincindiva da infecção,

como para pacientes HIV+, o que poderia contribuir para um maior impacto do fenótipo MDR

100

em fungos. Neste contexto, a utilização de substâncias resensibilizadoras, ou

quimiosensibilizadoras, permitiria que este processo fosse sobreposto. Neste trabalho

descrevemos pela primeira vez um estudo de avaliação da atividade inibitória do AO e do AU

frente ao transportador ABC Pdr5p, de S. cerevisiae. Este modelo de estudo se mostrou bastante

útil para identificar o AU como um novo inibidor do processo de MDR apresentado por uma

cepa de C. albicans que apresentava um fenótipo de hiperesistencia a fluconazol, e ao que tudo

indica, devido a expressão aumentada de um transportador MFS, provavelmente o CaMDR1,

conferindo a este trabalho grande relevância clínica.

9. CONCLUSÕES

• O AO e a mistura AO/AU, isolados de Lippia lacunosa não apresentam

toxicidade significativa para a cepa AD124567. Enquanto a mistura AO/AU se

mostrou tóxica quando utilizada na maior concentração testada. no crescimento da

cepa AD1234567. O AO apresenta uma toxicidade dose-dependente para a cepa

AD1234567, mais evidenciada quando utilizado na maior concentração testada. O

AU de origem comercial apresentou toxicidade dose-dependente para ambas as

cepas, alcançando grau significativo de inibição do crescimento celular quando

utilizado na maior concentração testada.

• Com relação à capacidade dos compostos testados em inibir o efluxo de rodamina

6G, promovido pela Pdr5p super expressa na cepa AD124567, o AO não foi

101

capaz de promover tal inibição. Entretanto, a mistura AO/AU mostrou uma

inibição do tipo dose-dependente do efluxo, apesar de necessitar de altas

concentrações para conseguir um nível de inibição comparável ao inibidor

clássico FK506. O AU se mostrou eficaz em promover esta inibição, necessitando

de apenas 50 µM para alcançar uma inibição comparável a promovida pelo

inibidor clássico. Os resultados obtidos indicam que não ocorre um sinergismo

entre AO, sendo a presença do AU na mistura AO/AU, responsável em promover

o acúmulo de rodamina 6G.

• A abordagem utilizada permitiu caracterizar o isolado clínico Pri de C. albicans

como: hiperesistente a fluconazol, sensível a itraconazol, capaz de reter rodamina

6G em seu interior e de extruir vermelho do nilo. Estas características são

indicativas da possível atuação de um transportador MFS, provavelmente

CaMDR1p

• O AU se mostrou atóxico para o isolado Pri de C. albicans, porém tóxico de

forma dose-dependente para a cepa padrão ATCC2443.

• Quando utilizado em combinação com fluconazol, o AU é capaz de reverter o

fenótipo resistente do isolado Pri, sendo necessário baixas concentrações de AU

para reduzir o MIC80 para 4 µg/ml, caracterizando esta atividade como sinérgica.

102

• A utilização de nosso modelo de S. cerevisiae, com superexpressão do

transportador ABC Pdr5p se mostrou eficaz para seleção de inibidores, não

somente para transportadores ABC mas também para transportadores MFS,

devido a similaridades entre estas duas famílias de bomba de efluxo.

103

ANEXO I

Dados recentes demonstram a utilização da curcumina, um composto de origem natural,

como inibidor de transportadores relacionados ao processo de MDR, mostrando inclusive sua

capacidade de inibir transportadores ABC de fungos (SHARMA et al., 2009)

Paralelamente a esta dissertação, após conseguir a caracterização de um isolado clínico

de Candida albicans resistente a fluconazol, e pelos dados sugerirem a presença de uma bomba

de efluxo do tipo MFS, cresceu nosso interesse em analisar se a inibição inicialmente

visualizada, com a utilização da curcumina, para transportadores ABC de C. albicans expressos

em mutantes de Sacharomyces cerevisiae, poderia ocorrer também no isolado clínico

caracterizado nesta dissertação, possibilitando a sensibilização desta cepa ao tratamento com

fluconazol.

Esta parte do trabalho foi desenvolvida em colaboração com a Prof. Dra Rosangela

Soares e o mestrando Alexandre Curvelo, sendo nossos resultados apresentados neste anexo.

104

1. INTRODUÇÃO

1.1 Curcumina

A Curcumina é um polifenol lipofílico natural, de coloração amarela alaranjado,

produzido pelos rizomas da planta Curcuma longa (Figura 1), espécie amplamente cultivada na

Índia e outras partes do sudoeste asiático, fazendo parte do tempero turmérico e compondo

temperos como curry e mostardas, amplamente utilizados na cozinha indiana (revisto por

JURENKA et al. 2009; BENGMARK, MESA & GIL, 2009; PIANTINO et al., 2009).

O turmérico é composto por um grupo de curcuminóides denominados curcumina,

demetoxi-curcumina e bis-dimetoxi-curcumina, além de alguns óleos voláteis, açúcares,

proteínas e resinas. Este complexo curcuminóide (Figura 1) é conhecido como açafrão da índia e

seu componente principal, o qual confere sua cor alaranjada, é a curcumina, inicialmente

identificada por Lampe e Milobedzka (1913).

Na Índia e em muitos países asiáticos, a curcumina é utilizada por séculos pela medicina

Ayurvédica devido a suas propriedades antinflamatórias (AMMON & WAHL, 1991), sendo

utilizada para o tratamento de artrite, colite e hepatite (BENGMARK, MESA & GIL, 2009). A

segurança da curcumina já foi avaliada em diversos estudos com modelos animais (QURESHI et

al., 1992; SHANKAR et al., 1980), ficando claro que este composto não é tóxico mesmo quando

altas doses são utilizadas em animais de laboratório (BRAVANI et al., 1980; CHAINAINI,

2003).

Diversas atividades biológicas já foram atribuídas à curcumina, dentre elas:

antinflamatória, antioxidante, antimicrobiana e anticâncer, atuando em diversos tipos de

105

linhagens cancerosas (revisto por JURENKA, 2009; PIANTINO et al., 2009), e anti-HIV-1, pela

inibição de suas sequências longas de repetição (LTR) (LI et al., 1993).

Com relação a sua atividade antinflamatória, pesquisas apontam que a curcumina é

altamente pleiotrópica, sendo capaz de interagir com diversas moléculas envolvidas no processo

inflamatório. A modulação deste processo está relacionada com a regulação negativa da

ciclooxigenase-2 (COX-2), lipoxigenase e óxido nítrico sintase induzida (iNOS), pela inibição da

produção de citocinas inflamatória, TNF-α, e diversas interleucinas, bem como inibição da

ativação de NF-κB. Sua atuação em gastrintestinal já foi amplamente relatada, atuando em

dispepsia, infecções por Helicobacter pylori, úlcera péptica, doença de Crohn e colite ulcerativa

(revisto por JURENKA, 2009).

106

(A) (B)

(C)

Fig. 1: Curcuma longa e complexo curcuminóide. (A) Foto da espécie Curcuma longa.

(B) Rizoma da espécie C. longa. (C) Estrutura dos componentes do complexo curcuminóide:

curcumina, demetoxi-curcumina e Bis-demetoxi-curcumina.

107

Muitos efeitos antitumorais já foram descritos para este composto em diversos modelos

pré-clínicos de tumores sólidos de pâncreas, cólon e reto, próstata e de mama (revisto por

PIANTINO et al., 2009). Seu efeito anticâncer pode estar diretamente relacionado ao seu efeito

antinflamatório, uma vez que já é sabido que estados proinflamatórios estão relacionados à

promoção de tumores (BENNETT, 1986; QIAO et al., 1995).

Dentre os efeitos antinflamatórios relacionados com seu potencial anticarcinogênico

podemos citar: inibição de NF- κB e COX-2, uma vez que níveis aumentados de COX-2 estão

associados a diversos tipos de câncer (HUANG, LYSZ & FERRARO, 1991; SURH et al., 2001);

inibição do metabolismo de ácido aracdônico; diminuição de expressão de interleucinas pró-

inflamatórias, que resultam na diminuição do crescimento de linhagens de células cancerosas e

regulação negativa de proteínas como Cinase C, que medeiam o processo inflamatório e

proliferação de célula tumoral (LIU, LIN & LIN, 1993).

Além dessas atividades, já foi descrita também sua atividade antimicrobiana, contra

fungos, tendo melhores atividades contra C. albicans (MARTINS et al., 2009; SHARMA et al.,

2009) e Paracoccidioides brasilensis (MARTINS et al., 2009). No estudo de Martins e

colaboradores (2009) também foi avaliada a capacidade da curcumina em inibir não só a

proliferação da espécie C. albicans, mas também sua capacidade em inibir a adesão de Candida

spp. à células de epitélio bucal, demonstrando um maior potencial antifúngico da curcumina

quando comparado ao antifúngico fluconazol. Sharma e colaboradores (2009), também

demonstraram a capacidade deste composto em impedir o desenvolvimento de hifas na mesma

espécie, diminuindo, portanto, sua capacidade invasora.

Estudos recentes demonstram a atuação modulatória da curcumina em células cancerosas

que apresentam o fenótipo de MDR. Neste caso já foi mostrado que este composto natural é

108

capaz de modular a atividade dos transportadores do tipo ABC de humanos como MRP1 e P-gp

(ANUCHAPREEDA et al., 2002; CHEARWAE et al., 2004; CHEARWAE et al., 2006).

É interessante citar que a curcumina já se mostrou capaz de inibir transportadores de

fungos como a Pdr5p e também CaCDR1p e CaCDR2p, de C. albicans super expressos em

mutantes de S. cerevisiae, neste caso, sendo capaz de atuar em sinergia com antifúngicos de uso

clínico para impedir a proliferação celular dessa espécie (SHARMA et al., 2009). Neste

contexto, tendo em mãos o isolado Pri de C. albicans, decidimos analisar a capacidade da

curcumina em promover a reversão do fenótipo de resistência apresentado por esta cepa.

2. MATERIAL E MÉTODOS

Neste anexo utilizamos as mesmas metodologias descritas no tópico Material e Métodos

desta dissertação.

3. RESULTADOS

3.1 Avaliação da toxicidade da curcumina frente às cepas de C. albicans

Experimentos iniciais visando avaliar o potencial tóxico da curcumina frente a C.

albicans foram realizados utilizando a cepa ATCC24433, o isolado clínico Pri (PORTELA,

2006), resistente a fluconazol e um novo isolado clínico, denominado 88 (gentilmente cedida

pela Prof. Dra Rosangela Soares), altamente sensível a fluconazol, sendo utilizadas

concentrações crescentes de curcumina até um máximo de 50 µM

109

Para todas as cepas testadas podemos observar uma inibição do crescimento do tipo dose-

dependente (Figuras 2, 3, 4). No caso da cepa ATCC24433, podemos observar uma inibição que

parece ser estabilizada quando utilizamos 20 µM de curcumina, não ocorrendo grande diferença

de inibição mesmo quando utilizamos 50 µM, obtendo assim uma inibição máxima de 40,78% e

um IC50 de 14,31 µM (Figura 2); para o isolado clínico Pri observamos uma inibição máxima de

63,26% e um IC50 de 17,65 µM (Figura 3); e por fim, para o isolado clínico 88, observamos uma

inibição máxima de 90,0% e um IC50 de 17,01 µM (Figura 4).

110

Curcumina (µM)

0 10 20 30 40 50

Cre

scim

ento

cel

ular

(% d

o co

ntro

le)

0

20

40

60

80

100

120

Fig. 2: Avaliação da toxicidade da curcumina frente à cepa ATCC24433 de C.

albicans. A cepa foi crescida em meio SD por 48 horas na presença de concentrações crescentes

de curcumina como descrito em Material e Métodos. Como controle utilizamos o crescimento da

cepa na ausência do composto. Para cálculos de IC50 utilizamos a equação Ki = f(x)=

Vo/(1+(x/Ki)) +R

IC50 = 14,31 µM ± 5.39

111

Curcumina (µM)

0 10 20 30 40 50

Cre

scim

ento

cel

ular

(% d

o co

ntro

le)

0

20

40

60

80

100

120

Fig. 3: Avaliação da toxicidade da curcumina frente ao isolado clínico Pri de C.

albicans. A cepa foi crescida em meio SD por 48 horas na presença de concentrações crescentes

de curcumina como descrito em Material e Métodos. Como controle utilizamos o crescimento da

cepa na ausência do composto. Para cálculos de IC50 utilizamos a equação Ki = f(x)=

Vo/(1+(x/Ki)) +R

IC50 = 17,65 µM ± 2,28

112

Curcumina (µM)

0 10 20 30 40 50

Cre

scim

ento

cel

ular

(% d

o co

ntro

le)

0

20

40

60

80

100

120

Fig. 4: Avaliação da toxicidade da curcumina frente ao isolado clínico 88 de C.

albicans. A cepa foi crescida em meio SD por 48 horas na presença de concentrações crescentes

de curcumina como descrito em Material e Métodos. Como controle utilizamos o crescimento da

cepa na ausência do composto. Para cálculos de IC50 utilizamos a equação Ki = f(x)=

Vo/(1+(x/Ki))

IC50 = 17,01 µM ± 8,16

113

3.2 Avaliação de interação entre curcumina e fluconazol quando usados em

combinação contra o isolado clínico de C. albicans

Para avaliar a interação da curcumina com o antifúngico fluconazol utilizamos a

metodologia de “checkerboard” (MUKHERJEE et al., 2005). Neste ensaio diferentes

combinações de concentrações de cada um dos compostos foram utilizadas, visando encontrar

uma concentração de curcumina que fosse capaz de sensibilizar a cepa Pri ao tratamento com

fluconazol, revertendo assim o seu fenótipo de resistência a este antifúngico.

Para este ensaio a curcumina foi utilizada em concentrações que variavam de 4 a 32

µg/ml e o fluconazol em concentrações de 2 a 128 µg/ml. Os resultados obtidos indicam que se

utilizando a curcumina na concentração de 4 µg/ml, o que equivale a 11 µM, é possível reduzir o

MIC80 do fluconazol de 256 µg/ml para 2 µg/ml (Figura 4).

Com estes resultados foi possível calcular o tipo de interação que estas duas moléculas

possuem, usando os valores calculados do FICI cuja metodologia e fórmula foram descritos

previamente. Na tabela I são apresentados os valores de FIC para cada umas das moléculas. Para

o fluconazol obtivemos um FIC de 0,0182 e para o curcumina um FIC de 0,0208, obtendo-se,

com isso, um valor de FICI de 0,0391, o qual é indicativo de atividade sinérgica entre os dois

compostos.

114

Fig. 5: Avaliação da capacidade de quimiosensibilização da curcumina em

associação ao fluconazol. O isolado Pri foi incubado na ausência (barra em preto) e na presença

de apenas 11 µM de curcumina (barras em cinza) combinado com concentrações crescentes de

fluconazol como descrito em Material e Métodos. Como controle de crescimento (barra CTR) foi

utilizado a mesma cepa na ausência de ambos os compostos. Os resultados refletem a média de

três experimentos ± erro padrão.

115

Cepa FIC Curcumina FIC fluconazol FICI

Isolado Pri 0,0208 ± 0,0052 0,0182 ± 0,0069 0,0391 ± 0,008

Tabela I. Avaliação da interação entre fluconazol e curcumina apresentada durante o

tratamento do isolado Pri de C. albicans. Os dados mostrados na tabela foram obtidos a partir

do “checkerboard”, utilizando a equação: FICI = FIC do AU + FIC do fluconazol, onde FIC da

curcumina equivale ao MIC80 da curcumina combinada com fluconazol dividido pelo MIC80 do

AU sozinho, enquanto o FIC de fluconazol equivale ao MIC80 do fluconazol combinado com AU

dividido pelo MIC80 do fluconazol sozinho. Valores de FICI ≤ 0,5 indicam atividade sinérgica;

valores > 0,5 ≤ 1, indicam atividade aditiva; valore > 1 e ≤ 2 indicam atividade indiferente e

valores > 2 indicam atividade antagônica.

116

3.3 Avaliação da capacidade da curcumina em inibir o efluxo de vermelho do nilo do

isolado clínico Pri de C. albicans

Para avaliar a capacidade da curcumina em impedir o efluxo de vermelho do nilo do

isolado Pri, utilizamos a metodologia descrita em materiais e métodos para AU, neste caso,

utilizando a curcumina em uma concentração final de 11 µM (Figura 5). Análises em

microscópio óptico de fluorescência nos permitiram observar que com este tratamento, a cepa Pri

perdia sua capacidade de extruir o fluoróforo vermelho do nilo, sendo possível a observação de

fluorescência no interior celular superior à fluorescência visualizada quando as células não eram

tratadas com curcumina, e similar a fluorescência observada para a cepa controle ATCC24433.

Para este teste também utilizamos como controle o fluoróforo rodamina 6G, substrato apenas

para transportadores ABC.

117

Fig. 6: Avaliação da capacidade da curcumina em inibir o efluxo do fluoróforo

vermelho do nilo do isolado Pri de C. albicans. Para avaliar a capacidade da curcumina em

inibir o efluxo de vermelho do nilo foi realizada a metodologia descrita em Material e Métodos,

sendo utilizado 11 µM de curcumina. Para este experimento utilizamos como controles positivos

de acúmulo de rodamina 6G e vermelho do nilo a cepa ATCC24433, sendo ambos os controles

feitos na ausência d curcumina.

118

4. DISCUSSÃO

Nos resultados apresentados nas figuras 2, 3 e 4, podemos observar que a curcumina

apresenta um alto poder inibitório do crescimento celular das cepas de leveduras utilizadas neste

trabalho. Esta atividade parece variar de cepa para cepa dentro de uma mesma espécie, de C.

albicans, obtendo-se neste estudo uma maior inibição para o crescimento do isolado 88 (Figura

4), onde uma inibição de aproximadamente 100% do crescimento celular foi alcançada pelo

tratamento com 50 µM de curcumina.

É interessante notar que a cepa de referência ATCC24433 conseguiu se manter viável

crescendo em concentrações superiores (Figura 2), quando comparada com o isolado Pri (Figura

3). Nesta dissertação constatamos que esta cepa de referência apresenta resistência a itraconazol,

mas não a fluconazol, sendo capaz de reter rodamina 6G e vermelho do nilo em seu interior, o

que exclui a possibilidade de super expressão de um transportador ABC ou MFS. Entretanto,

algum mecanismo de resistência (provavelmente envolvendo um mecanismo de detoxificação

celular) parece estar presente, permitindo que esta cepa sobreviva em altas concentrações deste

antifúngico e neste caso, também, de curcumina.

Os dados de inibição de crescimento celular estão em concordância com dados da

literatura que indicam a atividade antifúngica da curcumina contra Candida spp. (MARTINS et

al., 2009). Alíquotas retiradas do experimento de “checkerboard”, posteriormente semeadas em

ágar BHI e incubadas por 48 horas a 37 oC, nos permitiram constatar que a curcumina não possui

atividade fungicida e sim fungistática (dado não mostrado).

119

Além disso, neste estudo foi observada uma interação sinérgica entre fluconazol e

curcumina, na qual com a utilização de 11 µM deste composto foi possível reverter o fenótipo de

resistência a fluconazol apresentado pelo isolado clínico Pri (Figura 5 e Tabela I). Entretanto a

curcumina não induz ao desenvolvimento de uma atividade fungicida deste fármaco,

prevalecendo a sua característica de composto fungistático. Com a mesma concentração foi

possível observar que a curcumina é capaz de inibir o efluxo de vermelho do nilo do isolado Pri,

permitindo que este fluoróforo seja retido no interior celular de modo comparável a cepa sensível

ATCC24433 (Figura 6).

Os resultados aqui apresentados em combinação com dados da literatura que mostram

que a curcumina é capaz de inibir transportadores ABC de C. albicans (SHARMA et al., 2009),

reiteram o que já foi constatado nesta dissertação, onde podemos perceber que estudos que

apresentam inibidores de bombas do tipo ABC, podem também revelar potenciais inibidores de

bombas do tipo MFS devido a similaridades compartilhadas entre estas bombas (revisto por

VENTER et al., 2005).

120

5. CONCLUSÕES

• A curcumina apresenta atividade antifúngica contra Candida albicans, porém não

apresentando capacidade fungicida e sim fungistática.

• Usada em combinação com fluconazol, a curcumina em baixas concentrações, é

capaz de reduzir o MIC80 do fluconazol do isolado Pri para 4 µg/ml, apresentando

um FICI de 0,0391, indicativo de atividade sinérgica entre estes dois compostos.

• A curcumina é capaz de promover a inibição do efluxo do fluoróforo vermelho do

nilo do isolado Pri, sendo necessário baixas concentrações desse composto para se

obter, de forma qualitativa, uma restauração da fluorescência intracelular.

121

10. REFERÊNCIAS

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