Análise da Capacidade de Multiplicação de Análise da Capacidade de Multiplicação de

Genotipos do Genotipos do M. tuberculosisM. tuberculosis em Macrófagos em Macrófagos

HumanosHumanos

Moisés Palaci

Opsonização

Th1Th1

Th1CD8Th1CD8

IFN-TNF-

Vitamina D3

MtbMtb

ETZ

Lisossomos

pH

NONO2

-

NO3-

H2O2-

OH1O2

-

NH4

GLSTLAM

Arginina

Citrulina

NO

OO22--

SODSOD

OO22--

NADPHNADPH

HemolisinaIons regulating factors

CR1/CR3/CR4RPS-AScavenger receptorCD 14MMRTLR2/TLR4

NOS2NOS2

katGrpoV

ST

noxR1ahpCnoxR3

LAM

Citoplasma

Genes IFN-VirulênciaVirulência

Célula de Langhans

Coroa de linfócitos / histiócitos

Céls. epitelióides

Necrose caseosa

Lesões nodularescaseificadas

Lesões cavitárias

TuberculoseAspectos Patológicos

D =D =n n x x V V x x H H

I in x I adI in x I ad Formula de Rich

Cepas de M. tuberculosis com Elevada Capacidade de Disseminação (Anos 90)

Estados Unidos da América

C - Strain Friedman et al, 1997

W - Strain (MDR)Frieden et al, 1996

NYNY

CDC1551Valway et al, 1998

KY/TNKY/TN

210 - StrainBarnes et al, 1997

LALA

Diversidade Genética de Mycobacterium tuberculosis por RFLP

Beijing, Beijing, EAI EAI

LAM; LAM; HaarlemHaarlem

LAM; LAM; BeijingBeijing

BeijingBeijingHaarlemHaarlem

LAMLAM

A Resistência à Drogas Interfere na Virulência do Mtb?

Estudos Epidemiológicos

. Narain et al, 1967 (India)

. Devadatta et al, 1970 (India)

. Siminel et al, 1979 (Romênia)

Estudos Experimentais

. Mitchison et al, 1953

. Magarão, 1956

. Daddi, 1994

SIM

Estudos Epidemiológicos

. Snider et al, 1985

. Teixeira et al, 2001 (Brasil)

Estudos Experimentais

Ordway et al, 1995

Não

Avaliação da Virulência

Capacidade de: infectar / causar doençaCapacidade de: infectar / causar doença / disseminar

Modelos AnimaisModelos Animais

Modelos EpidemiológicosModelos Epidemiológicos

Friedman et al, J Infect Dis, 1997

Valway et al. N Engl J Med, 1998

López et al, Clin Exp Immunol, 2003

Avaliação da Virulência

Modelos Cultura de CélulasModelos Cultura de Células

Macrófago Murino –

Macrófagos Humanos - - Zhang Zhang et alet al., 1998., 1998

4 8 16 20 244 8 16 20 24 Tempo (Dias)Tempo (Dias)

CF

U (

log)

`2

3

4

5

6

7

`2

3

4

5

6

7

H37RvH37Rv

H37RaH37Ra

Pulmão / Baço

Modelo Animal

CF

U (

log)

M Infectados

Lise. Acréscimo de RPMI-10% SHA

. Incubação 14 dias

Sonicação

. Diluição Seriada

. Inoculação (Middlebrook 7H10)

. Incubação 37 C / 21 dias

. Quantificação CFU

IMI =CFU Dia 14

CFU Dia 0

Placa - Dia 0 Placa - Dia 14

PBMC

M

7 dias

Lavagens M (24 hs) Lavagens M (24 hs)

MMETODOLOGIAETODOLOGIA

Zhang Zhang et alet al., 1998., 1998

ESTRATÉGIA EXPERIMENTAL

Estudo sobre infecção e adoecimento entre contactantes domiciliares Estudo sobre infecção e adoecimento entre contactantes domiciliares de casos de tuberculose pulmonar (Teixeirade casos de tuberculose pulmonar (Teixeira et al, et al, 1998)1998)

43 cepas Mtb43 cepas Mtb

RFLPRFLP

Informações:ClínicasEpidemiológicasLaboratoriais

Resistentes a drogas, isoladas de casos índices que causaram

doença em seus contatos(n = 5)

Resistentes a drogas, isoladas de casos índices que NÃO causaram

doença em seus contatos(n = 5)

Sensíveis a drogas, isoladas de casos índices que causaram

doença em seus contatos(n = 6)

Sensíveis a drogas, isoladas de casos índices que NÃO causaram

doença em seus contatos(n = 6)

XX XXXX

Prodecimentos:IdentificaçãoDet. CIMAliquotas -70 C

Grupos de cepas selecionadas

1 2 3 4 5

CI Contato

H37Ra2181022165182391914H37Rv24201172415171313

Subtipo Genético No Ensaios

666106410106612146610106101210410614

Sub Grupos ( IMI )

1 2 3 4

388186240267282322410489524

5816156448209209551070112312601361

2416383039965174

H37Ra2181022165182391914H37Rv24201172415171313

Subtipo Genético No Ensaios

666106410106612146610106101210410614

Sub Grupos ( IMI )

1 2 3 4

388186240267282322410489524

5816156448209209551070112312601361

2416383039965174

Cepas de M. tuberculosis detectadas no estudo

com perfis genéticos semelhantes

Os números indicam os subtipos 3, 4, 5 e 13 e SP indica o subtipo genético predominante no estado de São Paulo

CR 3 4 5 SP 13CR 3 4 5 SP 13

HAARLEMHAARLEM

RFLPRFLP

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

ContatoContatoCICI

Comparação entreentre os índices de multiplicação

intracelular dos 4 gruposgrupos de cepas de M.

tuberculosis

Grupos

DCBA

Índ

ice

de

Mu

ltip

lica

ção

In

tra

celu

lar

(Ma

cró

fag

os) 6000

5000

4000

3000

2000

1000

0

-1000

-2000

Analise de variância - ANOVA

Resistentes a drogas, isoladas de casos índices que causaram

doença em seus contatos(n = 5)

Resistentes a drogas, isoladas de casos índices que NÃO causaram

doença em seus contatos(n = 5)

Sensíveis a drogas, isoladas de casos índices que causaram

doença em seus contatos(n = 6)

Sensíveis a drogas, isoladas de casos índices que NÃO causaram

doença em seus contatos(n = 6)

XXHarlem = 3LAM = 1

LAM = 2

Harlem =1LAM = 3

LAM = 2

Spoligotyping das Cepas de acordo com os

grupos

Grupos

C e DA e B

Índ

ice

de

Mu

ltip

lica

ção

In

tra

celu

lar

(Ma

cró

fag

os) 80

70

60

50

40

30

20

10

Comparação entreentre os subtipos genéticos do M. tuberculosis

sensíveis e resistentes as drogas quanto a capacidade de

multiplicação intracelular

Analise de variância - ANOVA

Correlação Entre o Índice de Multiplicação Intracelular e a Correlação Entre o Índice de Multiplicação Intracelular e a

Resistência a Drogas Anti-Tuberculose dos Subtipos Genéticos Resistência a Drogas Anti-Tuberculose dos Subtipos Genéticos

do do M. tuberculosisM. tuberculosis

Subtipo Genético

543127910118

Coeficientep- valor

322920399538308201123524239107086

IMI

44

0,2588

1684

1664

-0,1750,630

32322

1288

12812812864

128

-0,3110,381

128128

8<2<2<2<2<2<2<2

0,1050,773

CIM

INH RMP SM

codon 315codon 315codon 315codon 315codon 315codon 315codon 315codon 315Codon 315WT

KatG

NDI-UFESNDI-UFESSolange A. VinhasSolange A. VinhasTatiana R. Có Tatiana R. Có Fabíola K.C. RibeiroFabíola K.C. RibeiroRenata L. PeresRenata L. PeresLuciléia Teixeira Luciléia Teixeira Reynaldo DietzeReynaldo Dietze

Lucilaine Ferrazoli -Lucilaine Ferrazoli - IALIALTânia M.A.D. Zucchi - ICB/USPTânia M.A.D. Zucchi - ICB/USPElis R. Dalla Costa - FEPPSElis R. Dalla Costa - FEPPS