Análise funcional do gene CsDTIP e seu emprego em

i

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO VEGETAL

CRISTINA DE PAULA SANTOS MARTINS

ANÁLISE FUNCIONAL DO GENE CsDTIP E SEU EMPREGO EM

TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA DE CITROS

ILHÉUS - BAHIA 2012

ii




Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Produção Vegetal, da Universidade Estadual de Santa Cruz – UESC, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Produção Vegetal. Área de Concentração: Melhoramento de Plantas e Biotecnologia. Orientador: Prof. Dr. Márcio Gilberto Cardoso Costa.

ILHÉUS - BAHIA 2012

ii




Ilhéus, BA, 05 de março de 2012.

Dr. Eduardo Augusto Girardi – Embrapa

Mandioca e Fruticultura

Prof. Dr. Carlos Priminho Pirovani -

UESC

Profa. Dra. Fátima Cerqueira Alvim –

UESC

Prof. Dr. Marcio Gilberto Cardoso

Costa - UESC/ Orientador

iii

DEDICO

Aos meus queridos pais, Maria Lúcia e Valmir.

“Esperar não significa inércia, muito menos desinteresse;

Renunciar não quer dizer que não ame; Abrir mão não

quer dizer que não queira; O tempo ensina, mas não cura.”

Martha Medeiros

iv

AGRADECIMENTOS

A Deus, por me proteger e iluminar o meu caminho em todos os dias da minha

vida.

Aos funcionários e professores do PPGPV, pelo apoio.

A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível superior (Capes),

pela concessão da bolsa de estudo.

A toda a minha família, em particular aos meus irmãos (Thiago e Walmir) e aos

meus pais (Maria Lúcia e Valmir), por colocarem sempre os meus interesses

em primeiro lugar e por todos os sacrifícios que fizeram e fazem por mim, o

meu profundo agradecimento. Amo vocês!!!

Agradeço ao meu orientador, Professor Doutor Marcio Gilberto Cardoso Costa

pelo apoio, dedicação, disponibilidade e amizade, tornando possível a

realização deste trabalho. Peço desculpa pelas diversas faltas e por ter

causado algum cabelo branco a mais.

A Luciana Cardoso Cidade, por ter sido durante este trabalho o meu braço

direito e muitas vezes o esquerdo. Por ter sido minha orientadora e me ajudado

em tudo durante a realização do mestrado.

Pela amizade, sinceridade e contribuições da família CBG (Diana, Jamilly,

Amanda, Fabiana, Tahise, Lívia, Verônica, Ângela, Laís, Luana, Sara,

Genilson, Gabriela, Andressa e Eulaísa)

Por todo o apoio dos colegas do PPGPV em especial Nadjama, Adriano,

Tessio, Carolina, Lucas e Georgia.

Aos meus preciosos e verdadeiros amigos de Rio Acima e da UFMG, pelo

companheirismo e paciência durante todos esses anos de convívio.

A todos aqueles que por diferentes razões possibilitaram a realização deste

trabalho, muito obrigada!!!

v

SUMÁRIO

SUMÁRIO .......................................................................................................... v

RESUMO.......................................................................................................... vii

ABSTRACT ....................................................................................................... ix

LISTA DE FIGURAS ......................................................................................... xi

1 INTRODUÇÃO ......................................................................................... 1

2 OBJETIVOS ............................................................................................. 4

2.1 Geral ..................................................................................................... 4

2.2 Específicos ............................................................................................ 4

3 REVISÃO DE LITERATURA.................................................................... 5

3.1 Aspectos gerais da citricultura .............................................................. 5

3.2 Propagação: enxertia ............................................................................ 6

3.3 Transformação genética de citros ......................................................... 9

3.4 Resposta molecular e fisiológica ao déficit hídrico .............................. 10

3.5 Major Intrinsic Proteins (MIPs) ............................................................ 12

4 MATERIAL E MÉTODOS....................................................................... 16

4.1 Material biológico ................................................................................ 16

4.1.1 Material vegetal ................................................................................ 16

4.1.2 Cultura e manutenção dos isolados de Agrobacterium tumefaciens 16

4.2 Identificação do gene DELTA-TIP ....................................................... 17

4.3 Alinhamento de múltiplas sequências e análise filogenética ............... 17

4.4 Análise de expressão do gene CsDTIP em variedades porta-enxerto de

citros submetidas à déficit hídrico pela técnica de qPCR ............................. 18

4.5 Clonagem molecular do gene CsDTIP e introdução em vetor de

transformação de plantas ............................................................................. 20

4.6 Transformação genética de citros e tabaco ........................................ 21

4.7 Caracterização das plantas transgênicas ............................................ 22

4.7.1 Teste histoquímico da expressão do gene uidA (GUS) ................... 22

4.7.2 Extração de DNA genômico e análise da inserção do gene CsDTIP

pela técnica de PCR .................................................................................... 22

4.7.3 Extração de RNA, síntese de cDNA e análise de expressão do gene

CsDTIP nas plantas transgênicas de tabaco pela técnica da RT-PCR ........ 23

vi

4.7.4 Análise da perda do conteúdo de água ........................................... 23

4.7.5 Acúmulo de H2O2 ............................................................................. 24

5 RESULTADOS ....................................................................................... 25

5.1 Identificação do gene CsDTIP em bancos de informações genômicas

de citros ........................................................................................................ 25

5.2 Alinhamento de múltiplas sequências e análise filogenética ............... 26

5.3 Análise da expressão de CsDTIP em variedades porta-enxerto de

citros submetidas a deficiência hídrica ......................................................... 29

5.4 Clonagem de CsDTIP e introdução em plantas de tabaco .................. 31

5.5 Caracterização molecular das plantas transgênicas de Nicotiana

tabacum ........................................................................................................ 33

5.5.1 Análise da expressão de CsDTIP nas linhagens transgênicas de

Nicotiana tabacum ....................................................................................... 34

5.6 Transformação genética de variedades porta-enxerto de citros com o

gene CsDTIP ................................................................................................ 35

5.7 Análise da tolerância a estresse por desidratação das linhagens

transgênicas de tabaco ................................................................................. 37

5.8 Acúmulo de H2O2 ................................................................................ 38

6 DISCUSSÃO .......................................................................................... 40

7 CONCLUSÕES ...................................................................................... 46

8 REFERÊNCIAS ...................................................................................... 47

vii

RESUMO

MARTINS, Cristina de Paula Santos, M.S., Universidade Estadual de Santa

Cruz, Ilhéus, março de 2012. Análise funcional do gene CsDTIP e seu emprego

em transformação genética de citros. Orientador: Dr. Márcio Gilberto Cardoso

Costa. Co-orientador: Dr. Alex-Alan Furtado de Almeida.

Na agricultura mundial, as frutas cítricas ocupam o primeiro lugar em volume

de produção em fruticultura, sendo o Brasil o maior produtor mundial de laranja

e exportador de suco de laranja concentrado e congelado. A citricultura

brasileira encontra-se sustentada principalmente no porta-enxerto limoeiro

‗Cravo‘ (Citrus limonia Osbeck), o que vem causando expressiva diminuição na

produção de frutos devido a sua suscetibilidade à doenças, tornando

necessário uma diversificação dos porta-enxertos. Os principais porta-enxertos

alternativos ao limoeiro ‗Cravo‘ apresentam algumas limitações importantes,

como intolerância à seca. As plantas possuem mecanismos que respondem a

deficiência hídrica, sendo que as respostas envolvem as funções de múltiplos

genes que conferem a planta a capacidade de tolerar aquela condição

desfavorável. Um dos mecanismos envolvidos na resposta à deficiência hídrica

é mediado pela expressão de aquaporinas, pertencentes a família MIP (major

intrinsic proteins). Membros dessa família estão envolvidos na resposta e

tolerância a estresses hídrico e salino, atuando como transportadores de água,

ureia e de outros solutos. No presente estudo, foram realizadas análises

molecular e funcional de um gene da família MIP de citros codificando para

DELTA-TIP (CsDTIP), identificado nas bases de informação genômica de

citros, com o objetivo de validar a sua função em mecanismos de resposta e

tolerância à seca, bem como introduzi-lo em variedades porta-enxerto de citros

por meio de transformação genética mediada por Agrobacterium tumefaciens.

Análises de bioinformática demonstraram que CsDTIP codifica uma proteína

com 247 aminoácidos que possui homologia com membros da subfamília TIP2

(DELTA-TIP) de Arabidopsis thaliana, sendo um ortólogo do gene AtTIP2;1 de

Arabidopsis, cujo produto gênico localiza-se no tonoplasto e está envolvido em

viii

resposta ao estresse hídrico e transporte de água e ureia. Estudos de

expressão gênica por PCR em tempo-real demonstraram que CsDTIP foi

altamente induzido em folhas e raízes de plantas de limoeiro ‗Cravo‘ e

tangerineira ‗Sunki Maravilha‘ submetidas a deficiência hídrica. Experimentos

de transformação genética mediada por Agrobacterium permitiram a obtenção

de 17 linhagens transgênicas de tabaco (Nicotiana tabacum) contendo CsDTIP,

bem como 11 brotos de tangerineira ‗Cleópatra‘ (C. reshni hort. ex Tanaka) e

citrumeleiro ‗Swingle‘ [C. paradisi Macf. cv Duncan x P. trifoliata (L.) Raf.]

positivos no teste de GUS. Caracterizações molecular e bioquímica de nove

linhagens transgênicas de tabaco confirmaram a inserção e expressão de

CsDTIP em todas as linhagens analisadas. A fim de investigar se a

superexpressão de CsDTIP em plantas transgênicas de tabaco correlaciona-se

com tolerância a estresse, discos foliares de quatro linhagens transgênicas

foram submetidos à desidratação e avaliados quanto à perda do conteúdo de

água e acúmulo de espécies reativas de oxigênio (ROS). Os resultados

demonstraram que as plantas transgênicas perderam significativamente menos

água e acumularam menos ROS do que a planta controle não-transformada,

indicando a maior resistência das plantas transgênicas à desidratação. Em

conclusão, os resultados obtidos no presente estudo confirmam o potencial do

gene CsDTIP em conferir resistência à desidratação, podendo ser utilizado em

estratégias que visem a obtenção de variedades porta-enxerto de citros

tolerantes à seca.

Palavras chave: Citricultura, estresse hídrico, melhoramento, transgenia,

expressão gênica.

ix

ABSTRACT

MARTINS, Cristina de Paula Santos, M.S., Universidade Estadual de Santa

Cruz, Ilhéus, March 2012. Functional analysis of the gene CsDTIP and its use

in genetic transformation of citrus. Advisor: Dr. Márcio Gilberto Cardoso Costa.

Committee Member: Dr. Alex-Alan Furtado de Almeida.

In global agriculture, citrus fruits take the first place in volume of production,

with Brazil as the largest world producer of oranges and exporter of frozen

concentrated orange juice. The Brazilian citriculture is currently sustained

primarily in the rootstock 'Cravo' rangpur lime (Citrus limonia Osbeck), which

has caused an expressive decrease in fruit production because of its

susceptibility to diseases. A diversification of the citrus rootstock cultivars is

thereby required. The major rootstocks alternatives to 'Cravo' show some

important limitations, such as susceptibility to drought. Plants have developed

mechanisms that respond to drought stress, but these responses involve the

functions of multiple genes that give to plant the ability to tolerate against this

unfavorable condition. One of the drought tolerance mechanisms involves the

expression of aquaporins, which belong to the MIP (major intrinsic proteins)

family. Members of this family are involved in response and tolerance to water

and salt stress, working as transporters of water, urea and other solutes. In this

study, a gene coding for a member of MIP family in citrus, DELTA-TIP

(CsDTIP), was identified in the citrus genome databases and characterized in

order to validate its function in mechanisms of drought tolerance. Bioinformatic

analysis showed that CsDTIP codes for a protein of 247 amino acids that has

homology with the members of the TIP2 (DELTA-TIPs) subfamily from

Arabidopsis thaliana, which is localized in the tonoplast and is involved in

mechanisms of drought stress tolerance and transport of water and urea.

Analysis of gene expression by real-time PCR showed that CsDTIP was highly

induced in leaves and roots of 'Cravo' and ‗Sunki Maravilha‘ subjected to

drought stress. Experiments on Agrobacterium-mediated genetic transformation

enabled to obtain 17 transgenic lines of tobacco (Nicotiana tabacum) containing

x

CsDTIP, as well as 11 GUS positive shoots of ‗Cleopatra‘ mandarin (C. reshni

hort. ex Tanaka) and 'Swingle' citrumelo [C. paradisi Macf. cv Duncan x P.

trifoliata (L.) Raf.]. Molecular and biochemical characterization of the transgenic

tobaccos confirmed the insertion and expression of CsDTIP in all transgenic

lines analyzed. To investigate whether the overexpression of CsDTIP in

transgenic tobacco plants correlated with stress tolerance, leaf discs of four

transgenic lines were subjected to dehydration and evaluated for the loss of the

water content and accumulation of reactive oxygen species (ROS). The results

showed that all the transgenic plants evaluated lost significantly less water and

accumulated significantly less ROS than the untransformed control plants,

indicating a higher resistance of the transgenic plants to dehydration. In

conclusion, the results obtained in this study confirm the potential of the gene

CsDTIP in inducing resistance to dehydration, so that it can be used in

strategies to obtain citrus rootstock varieties tolerant to drought.

Key words: Citriculture, water stress, breeding, transgenesis, gene expression.

xi

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Algumas das múltiplas funções das aquaporinas em células vegetais.

As diferentes subfamílias são identificadas na ilustração por cores distintas.

Fonte: MAUREL et al. (2008). .......................................................................... 15

Figura 2. Sequência aminoacídica da proteína deduzida a partir da sequência

gênica CsDTIP. As regiões em destaque referem-se ao sítio relacionado a

seletividade do substrato (NPA), sítio de N-glicosilação (NISG), sítio de

fosforilação da proteína quinase CAMP (KKGS), sítio de fosforilação da

proteína quinase C (SFK), sítio de fosforilação da proteína Caseína Quinase II

(TAAD), sítios de N-miristoilação (GSFKAY, GVGSAI, GANISG, GLALGG,

GSIVAS,, GAIEGV, GLVYTV, GSLGTI, GGGLAG), sítio conservado

característico da família MIP (HVNPAVTFG) e um sítio de função desconhecida

(AEF). ............................................................................................................... 26

Figura 3. Análise filogenética das proteínas da família MIP de Arabidopsis (At)

e CsDTIP de citros. As sequências de aminoácidos foram alinhadas utilizando

ClustalW e o método Neighbor-Joining. A árvore foi construída com um suporte

de bootstrap de 1000 replicações. Abreviaturas para o nome das subfamílias

são as seguintes: PIP (proteínas intrínseca da membrana plasmática); TIP

(proteínas intríseca do tonoplasto); NIP (proteínas intrínseca Nodulin26); SIP

(proteínas intrínsecas pequenas). .................................................................... 27

Figura 4. Comparação entre as sequências CsDTIP e aquelas da subfamília

TIP descrita para Arabidopsis. Resíduos em vermelho são idênticos nas

sequências analisadas. O alinhamento foi realizado pelo programa ClustalW. 29

Figura 5. Análise da expressão relativa do gene CsDTIP em plantas de

limoeiro ‗Cravo‘ e tangerineira ‗Sunki Maravilha‘ sob condições controle

(potencial hídrico foliar de -0,25 MPa) ou de deficiência hídrica (potencial

hídrico foliar de -1,5 MPa). A: Expressão relativa em raiz. B: Expressão relativa

em folha. A expressão do gene da β-actina foi usado como normalizador. Os

dados representam a média) de três réplicas experimentais. **Diferenças

significativas pelo teste t em nível de 1% de probabilidade e * em nível de 5%.

......................................................................................................................... 30

Figura 6. Etapas na obtenção de plantas transgênicas de Nicotiana tabacum

contendo o gene CsDTIP. A: explantes foliares transformados com A.

xii

tumefaciens: CsDTIP em meio de co-cultivo; B: indução de brotos em meio

seletivo de regeneração; C: ensaio histoquímico para expressão do gene uidA

em segmentos de brotos de N. tabacum; D: linhagem transgênica

individualizada. ................................................................................................. 32

Figura 7. Desenvolvimento, florescimento e obtenção de sementes das plantas

transgênicas de tabaco contendo o gene CsDTIP em casa de vegetação. A:

plantas em desenvolvimento. B e D: plantas em florescimento e C: cápsulas de

sementes. ......................................................................................................... 33

Figura 8. Amplificação do fragmento do gene nptII em plantas transgênicas de

Nicotiana tabacum por PCR. M: marcador de 1 kb ; C-: controle negativo -

planta não transformada; C+: controle positivo - DNA plasmidial diluído (1:100)

de pCAMBIA 2301;. L1 à L21: plantas transformadas. .................................... 34

Figura 9. Análise da expressão relativa do gene CsDTIP em diferentes

linhagens transgênicas de Nicotiana tabacum por qPCR. A expressão do gene

da β-actina foi usada como normalizador. Os dados representam a média ± SE

(erro padrão) de três réplicas experimentais. L1, L3, L4, L8, L9, L10, L12, L13,

L21: Linhagens transgênicas. As médias seguidas por letras diferentes

apresentam diferenças significativas pelo Teste de Scott Knott (P ≤ 0,05). ..... 35

Figura 10. Esquema de obtenção de plantas transgênicas de citros contendo o

gene CsDTIP. A: epicótilo em meio seletivo; B: brotos em meio seletivo; C:

ensaio histoquímico para expressão do gene uidA em segmentos basais; D:

plantas transformadas de citros (citrumeleiro ‗Swingle‘) confirmada com o gene

CsDTIP. ............................................................................................................ 36

Figura 11. Taxa de desidratação de discos foliares da planta controle não-

transformada e linhagens transgênicas (4, 8, 9 e 12) sob estresse durante 180

min em temperatura ambiente. Medição por redução de peso fresco a cada 30

min.* (P <0,05) e ** (P <0,01) indicam que a taxa de perda de água nas

linhagens transgênicas é significativamente menor do que o controle no mesmo

ponto de tempo pelo Teste de Dunnett. ........................................................... 38

Figura 12. Produção de peróxido de hidrogênio em tecido foliar de N. tabacum

inoculado com HCL-DAB (1 mg mL-1). Discos foliares foram submetidos ao

estresse por desidratação durante 180 min e a produção de H2O2 foi

visualizada através da coloração com DAB. A: planta não-transformada

submetida à desidratação;B: planta não-transformada túrgida; C: planta não-

xiii

transformada submetida a desidratação e infiltrada a vácuo com 10 mM de

peróxido de hidrogênio por 30 min; D: planta não transformada fresca infiltrada

com água; E-H: linhagens transgênicas 4, 8, 9 e 12, respectivamente, submetidas

à desidratação. ................................................................................................. 39

1

1 INTRODUÇÃO

Os citros pertencem à família Rutaceae, sendo os principais gêneros

Fortunella, Poncirus e Citrus (SIMÃO, 1998). A citricultura representa 23% de

toda a produção mundial de frutas e a décadas o Brasil ocupa posição de

destaque (FAO, 2010). O Brasil é o maior produtor mundial de citros, com

produção de cerca de 19,4 milhões de toneladas de frutos (MAPA, 2011), e

maior exportador de suco de laranja concentrado congelado (NEVES, 2010). O

agronegócio da citricultura está concentrado no Estado de São Paulo, que

participa com 78,4% da produção nacional de frutos (IBGE, 2010), seguido

pelos Estados da Bahia (5,1%) e de Sergipe (4,5%) (ABECITRUS, 2009).

Os citros podem ser propagados por diferentes métodos, sendo a

enxertia a forma mais utilizada por apresentar diversas vantagens (POMPEU

JUNIOR, 2005). O limoeiro ‗Cravo‘ (Citrus limonia Osbeck) é a espécie mais

utilizada como porta-enxerto devido a diversos atributos, dentre as quais se

destacam: tolerância à seca e à tristeza dos citros, facilidade de obtenção de

sementes, compatibilidade adequada com a maioria das variedades copas,

produção precoce e alta modulação induzida às copas nele enxertadas

(POMPEU JUNIOR, 2005). Contudo a suscetibilidade do limoeiro ‗Cravo‘ à

Morte Súbita dos Citros (MSC) se tornou um sério problema na atualidade,

tendo como consequência a expressiva diminuição na produção de frutos

(CANTAGALLO et al., 2005). A diversificação de porta-enxertos na citricultura

brasileira é fundamental, com ênfase na busca de variedades mais bem

adaptadas às condições de eficiência hídrica, já que a citricultura brasileira é

conduzida praticamente sem irrigação (SANTOS et al., 1999). A falta de

resistência a doenças e as condições ambientais desfavoráveis, como a seca,

tem incentivado inúmeros trabalhos de pesquisa voltados ao melhoramento

genético. Ferramentas biotecnológicas, por meio das técnicas de cultura de

tecidos e transformação genética, têm oferecido novas alternativas para o

melhoramento dos citros, permitindo a rápida introdução de genes de interesse

sem alterar o padrão varietal. Em citros, a transformação genética já é um

processo bem estabelecido (COSTA et al., 2007).

2

Dados do genoma funcional de citros, obtidos por meio do

sequenciamento de aproximadamente 500.000 ESTs (sequências expressas)

de Citrus e Poncirus, foram disponibilizados para acesso pela comunidade

científica (http://harvest.ucr.edu) como parte de um programa (U.S. Citrus

Genomics Initiative) que visa o rápido avanço do conhecimento científico

relacionado aos problemas que limitam a produção citrícola. Por meio de uma

busca preliminar neste banco de dados, identificou-se a existência de diversos

genes ortólogos de resposta e tolerância à seca. Dentre esses, destacam-se os

genes da família MIP (―major intrinsic proteins‖).

As MIPs constituem uma super família de proteínas de membrana, as

quais têm sido implicadas em atuarem como os componentes centrais das

relações hídricas em plantas (JOHANSON et al., 2001). Recentemente, MIPs

provaram ser mais do que canais de água, estando relacionadas a meio de

transporte para outros substratos de importância fisiológica. Embora o termo

aquaporina tenha sido inicialmente proposto a MIPs que transportam água,

atualmente este termo tem sido usado num sentido mais amplo, referindo-se a

todos os membros da família (TYERMAN et al., 2002). A descoberta das

aquaporinas trouxe uma nova visão do mecanismo de transporte de água

transmembrana, fornecendo a base molecular para uma rápida e sólida

regulação reversível de transporte de água transmembrana e sugerindo que a

alta permeabilidade à água pode ser necessária para determinados processos

fisiológicos (MAUREL, 1997; MAUREL; CHRISPEELS, 2001). A abundância e

a atividade dessas proteínas na membrana plasmática e tonoplasto podem ser

reguladas, permitindo que a planta controle rigorosamente os fluxos de água

dentro e fora das células (MAUREL, 2007; KALDENHOFF; FISCHER, 2006;

JOHANSSON et al., 2000; JAVOT; MAUREL, 2002).

No presente estudo, um membro da família MIP, denominado DELTA-

TIP, foi identificado nos bancos de dados de informação genômica de citros

(HarvEST:Citrus) e caracterizado por meio de análises molecular e funcional

em plantas de tabaco. Além disso, o gene foi introduzido em variedades porta-

enxerto de citros, sob expressão constitutiva, por meio de transformação

genética mediada por Agrobacterium tumefaciens. Esse estudo contribuiu,

assim, para a ampliação da base de conhecimento potencialmente aplicável ao

3

melhoramento, bem como para o desenvolvimento de novos genótipos

potencialmente úteis para a citricultura brasileira.

4

2 OBJETIVOS

2.1 Geral

Validar a função do gene candidato de tolerância à seca DELTA-TIP

(CsDTIP), identificado nas bases de informação genômica de citros, por meio

de análises molecular e funcional em plantas de tabaco, bem como introduzi-lo

em variedades porta-enxerto de citros por meio de transformação genética

mediada por Agrobacterium tumefaciens.

2.2 Específicos

Caracterizar a sequência do gene DELTA-TIP presente no genoma

de citros em nível de cDNA e aminoácidos;

Clonar o gene DELTA-TIP em vetores de transformação de plantas;

Transformar plantas de tabaco (var. Petit Havana) e variedades

porta-enxerto de citros (tangerineira ‗Cleópatra‘ e citrumeleiro

‗Swingle‘) com o gene DELTA-TIP;

Analisar a expressão gênica das plantas de tabaco transformadas

pela técnica de PCR em tempo real;

Caracterizar as plantas transformadas quanto à integração e

expressão do transgene e resposta frente a condições simuladas de

deficiência hídrica.

5

3 REVISÃO DE LITERATURA

3.1 Aspectos gerais da citricultura

O gênero Citrus pertence à família Rutaceae, subfamília Aurantioideae e

tribo Citreae, sendo esta composta por três subtribos. A subtribo Citrinae

apresenta 13 gêneros e 65 espécies, contendo as principais espécies de

interesse comercial, como as do gênero Poncirus, Fortunella e Citrus

(SWINGLE, REECE, 1967), que são coletivamente chamadas de citros. Os

citros são originários de regiões com clima tropical e subtropical do sul e

sudeste Asiático (MOORE, 2001; NICOLOSI, 2007, PENÂ et al., 2008).

Hoticulturamente os citros podem ser agrupados em laranjeiras doce

(Citrus sinensis (L.) Osbeck), tangerineiras (Citrus reticulata Blanco), limoeiros

(Citrus limon (L.) Buen. F.), limeiras ácidas [Citrus aurantiifolia (Christm.)

Swingle e Citrus latifolia (Yu. Tanaka)], pomeleiros (Citrus paradisi Macf.), entre

outras (PIO et al., 2005). Algumas espécies e seus híbridos são utilizadas

principalmente como porta-enxertos, como o limoeiro ‗Cravo‘ (C. limonia

Osbeck), limoeiro ‗Volkameriano‘ (C. volkameriana V. Ten. & Pasq.),

tangerineira ‗Sunki‘ (C. sunki hort. ex Tanaka), tangerineira ‗Cleopatra‘ ( C.

reshni hort. ex Tanaka), laranjeira azeda (C. aurantium L.) e citrumeleiro

‗Swingle‘ [C. paradisi Macf. cv Duncan x P. trifoliata (L.) Raf.] (POMPEU

JUNIOR, 2005).

Cultivado em mais de 130 países, os citros constituem uma das mais

importantes fruteiras cultivadas no mundo, sendo que Brasil, China e Estados

Unidos detêm aproximadamente 44% da produção mundial (FAO, 2011). A

citricultura é economicamente importante nas regiões tropicais e subtropicais,

onde as condições edafoclimáticas são favoráveis para o seu desenvolvimento.

As plantas cítricas são cultivadas em regiões entre os paralelos 40º N e 40º S e

as principais regiões produtoras estão em latitudes superiores a 22º N e 22º S

(DAVIES; ALBRIGO, 1994).

O Brasil ocupa uma posição de destaque no cenário internacional, sendo

o maior produtor de laranja (aproximadamente 19,4 milhões de toneladas de

frutos em uma área aproximada de 856 mil hectares) (Ministério da Agricultura,

6

Pecuária e Abastecimento, 2011) e o maior exportador de suco de laranja

concentrado e congelado (NEVES, 2010). O sistema agroindustrial citrícola

movimenta cerca de R$ 9 bilhões por ano e gera mais de 260 mil empregos

diretos e indiretos (NEVES, 2010). Em 2009, a exportação de suco foi de 1,3

milhões de toneladas, sendo os Estados Unidos e a União Européia os

principais importadores do produto (FNP CONSULTORIA & COMÉRCIO,

2010).

A agroindústria citrícola brasileira está concentrada no Estado de São

Paulo, responsável por 78,42% da produção nacional e pelo processamento de

praticamente toda a safra nacional de laranja, além do abastecimento de parte

significativa do mercado mundial do suco concentrado e congelado e de

subprodutos da laranja (IBGE, 2010). Porém, o seu perfil mudou na última

década, pois além da migração do cultivo para o sudoeste de São Paulo, as

regiões Sul e Nordeste têm cada vez mais participação na produção brasileira

de citros. O Nordeste brasileiro detém, após o Estado de São Paulo, a

citricultura de maior expressão, graças à liderança nesse setor dos Estados da

Bahia e Sergipe, que praticamente se igualam na produção de citros

(Associação Brasileira dos Exportadores de Cítricos, 2009).

As mudanças com relação à migração do local de produção de laranja

estão relacionadas principalmente com surgimento de diversas doenças, como

a gomose de Phytophthora (Phytophthora spp.), pinta preta (Guignardia

citricarpa Kiely), tristeza dos citros (Citrus tristeza virus), cancro cítrico

(Xanthomonas citri pv. citri), huanglongbing (Candidatus Liberibacter spp.) e a

morte súbita dos citros (MSC) (Fundo de Defesa da Citricultura, 2010).

3.2 Propagação e variedades porta-enxertos

As plantas cítricas podem ser multiplicadas por sementes (via sexual),

por alporquia, estaquia e enxertia (via assexual), sendo este último método

mais utilizada comercialmente por apresentar algumas vantagens, entre as

quais se destacam a uniformidade das mudas, alta quantidade de sementes,

precocidade no início de produção e aumento na produtividade, além de se

obter mudas idênticas à planta-mãe e maior resistência ou tolerância a

7

condições desfavoráveis de clima, solo, pragas e doenças de acordo com o

porta-enxerto ou combinação utilizado (POMPEU JUNIOR, 2005).

Devido à facilidade no método de multiplicação por sementes, esta

predominou até a metade do século XIX, quando problemas relacionados ao

ataque de Phytophthora spp., na Ilha dos Açores (Portugal) determinaram o

uso de porta-enxertos tolerantes a estes fungos. Na Espanha, os agricultores

perceberam que as plantas provenientes de sementes tardavam muito a entrar

em produção e tinham muitos espinhos, que podiam lesionar as frutas,

passando então a adotar a enxertia a partir da segunda metade do século XIX

(CARLOS et al., 1997).

Na introdução da citricultura no Brasil no século XVI, a multiplicação

também foi por sementes. Apenas quando a citricultura alcançou expressão

comercial, iniciou-se o uso de plantas enxertadas, sendo as laranjeiras doces,

entre elas a laranjeira ‗Caipira‘ (C. sinensis L.Osbeck), os porta-enxertos mais

utilizados. Porém, a baixa resistência da laranjeira ‗Caipira‘ à seca e à gomose

fez com que ela fosse substituída pela laranjeira ‗Azeda‘, que passou a ser a

principal cultivar até o final da década de 1940, quando, em função do

surgimento da Tristeza do citros, teve que ser substituída, devido à sua

susceptibilidade a essa doença. Experimentos conduzidos no início do século

XX mostraram que plantas enxertadas em limoeiro ‗Cravo‘, tangerineira

‗Cleópatra‘, tangerineira ‗Sunki‘ (C. sunki (Hayata) hort. ex Tanaka), laranjeira

‗Caipira‘ e limoeiro ‗Rugoso‘ (C. jambhiri Lush.) não manifestavam os sintomas

da doença. Assim, esses porta-enxertos, considerados tolerantes à Tristeza

dos citros, foram utilizados na renovação da citricultura (POMPEU JUNIOR,

2005).

As características apresentadas pelo limoeiro ‗Cravo‘ o tornaram o

preferido pelos citricultores, de modo que a partir da década de 60 passou a

ser praticamente o único porta-enxerto da citricultura paulista (POMPEU

JÚNIOR, 2001). O limoeiro ‗Cravo‘ é considerado um híbrido natural entre

limoeiro e tangerineira, originado na região de Canton, no sul da China.

Apresenta média resistência às gomoses de P. parasitica e P. citrophthora, é

suscetível a nematóides (Tylenchulu semipenetrans e Pratylenchus jaehni),

tolerante ao vírus da tristeza dos citros, suscetível ao declínio do citros e

tolerante à seca. Apresenta melhor desempenho quando plantado em solos

8

arenosos e profundos e pode apresentar produtividade inferior à das

tangerineiras ‗Cleópatra‘ e ‗Sunki‘ quando plantado em solos argilosos.

Com o surgimento de uma doença, em 1999, conhecida como Morte

Súbita dos Citrus (MSC), que afeta laranjeiras e tangerineiras enxertadas em

limoeiro ‗Cravo‘ e ‗Volkameriano‘, ocorreu uma aceleração na diversificação de

porta-enxertos. Assim, surgiu a busca por novos porta-enxertos viáveis ao uso

comercial, visando principalmente combater a vulnerabilidade fitossanitária.

Pompeu Junior (2001) revisou as possibilidades das novas variedades

indicadas como promissoras, dentre eles a tangerineira ‗Cleópatra‘ e o

citrumeleiro ‗Swingle‘.

A variedade Cleópatra é uma das tangerineiras mais estudadas em todo

o mundo e, no Brasil, vem sendo utilizada há mais de 30 anos como porta-

enxerto. Apresenta tolerância aos vírus da tristeza e viróides como o exocorte,

a xiloporose, ao declínio e a MSC, bem como apresenta média resistência à

gomose de Phytophthora ssp. No entanto, não é resistente ao nematóide dos

citros e apresenta limitações, tais como: início de produção mais tardia do que

as plantas enxertadas em limoeiro ‗Cravo‘ e citrumeleiro ‗Swingle‘, produção de

plantas com porte mais alto e maior intolerância à seca. Com relação à

produtividade, quando plantada em solos argilosos, induz produções de frutos

próximas ou superiores às obtidas em limoeiro ‗Cravo‘ (POMPEU JUNIOR,

2005).

O citrumeleiro ‗Swingle‘ é um híbrido entre pomeleiro ‗Duncan‘ e

trifoliateiro, o qual foi produzido na Flórida em 1907 por Walter S. Swingle e

introduzido no Brasil em 1948 pelo IAC (Instituto Agronômico de Campinas).

Contudo, o interesse por esse porta-enxerto começou em 1988 (POMPEU

JUNIOR, 2005). Apresenta resistência à gomose (MEDINA FILHO et al., 2004),

declínio e nematóide dos citros (Tylenchulus semipenetrans) (POMPEU

JUNIOR, 1992), tolera a morte súbita dos citros, tristeza (MACHADO et al.,

2004), a xiloporose e o exocorte, porém é sensível à seca (POMPEU JUNIOR,

2005). Laranjeiras enxertadas em citrumeleiro ‗Swingle‘ produzem frutos de alta

qualidade, com alto teor de sólidos solúveis, de tamanho médio, porém

apresentam maturação de frutos mais tardiamente do que em outros porta-

enxertos (POMPEU JUNIOR, 2005; STUCHI et al., 1996).

9

As variedades apresentadas não possuem a robustez e as

características de tolerância à seca como o limoeiro ‗Cravo‘, necessitando

assim de estudos voltados ao melhoramento desses genótipos.

3.3 Transformação genética de citros

Em 1893, no Estado da Flórida, Swingle e Webber iniciaram o primeiro

programa de melhoramento genético de citros, sendo que posteriormente

vários trabalhos nesta área foram desenvolvidos em todo o mundo (DAVIES;

ALBRIGO, 1994). É notório que pesquisas relacionadas com o melhoramento

genético têm levado a aumentos na produtividade de diversas espécies

cultivadas. Porém, o melhoramento genético convencional de citros apresenta

algumas limitações, como a descontinuidade nos programa estabelecidos e

fatores biológicos característicos de cada espécie, como ciclos de reprodução

longo, juvenilidade, poliembrionia nucelar, heterozigose alta, incompatibilidade

sexual, esterilidade gametofítica e poliploidia (GROSSER; GMITTER JUNIOR,

1990). Dessa forma, a maioria das cultivares existentes nas principais regiões

citrícolas do mundo é proveniente de seleções ou de mutações somáticas

espontâneas (CERVERA et al., 2008; DUTT; GROSSER, 2009).

A utilização de ferramentas biotecnológicas como a transformação

genética de plantas em programas de melhoramento de citros possibilitam a

utilização da variabilidade genética disponível, produzindo novas combinações

genéticas que podem resultar em novas cultivares (SINGH; RAJAM, 2009).

Embora a transformação genética seja uma importante ferramenta auxiliar no

melhoramento de citros, sua eficiência pode variar em função de diversos

fatores, incluindo o genótipo e a própria construção gênica utilizada.

A tecnologia do DNA recombinante possibilitou o isolamento de genes e

a inserção estável em um genoma hospedeiro (QUECINI; VIEIRA, 2001). Esta

técnica pode ser definida como a introdução controlada de ácidos nucleicos em

um genoma receptor, excluindo a fecundação, ou seja, é a transferência não

sexuada de genes para plantas. Consiste de um processo controlado, onde

apenas um fragmento de ácido nucleico (DNA) é introduzido no genoma

receptor, devendo ser a ele integrado (BRASILEIRO; DUSI, 1999).

10

A transformação genética de plantas pode ser agrupada em duas

categorias: transferência direta e indireta de genes. A transferência direta

ocorre através de processos físico-bioquímicos, já na indireta o DNA exógeno é

inserido no genoma pela ação de vetores biológicos. O sistema mais utilizado

em transformações indiretas de plantas é mediado por bactérias do gênero

Agrobacterium. As espécies A. tumefaciens e A. rhizogenes são bactérias

fitopatogênicas de solo, pertencentes à família Rhizobiaceae, que causam

doenças em dicotiledôneas, conhecidas como galhas da coroa e raiz em

cabeleira, respectivamente (BRASILEIRO; DUSI, 1999). A interação

Agrobacterium - célula vegetal é descrita como exemplo de engenharia

genética da natureza, pelo fato de ocorrer transferência de genes entre reinos

diferentes (TEMPÉ; SCHELL, 1977).

Por ser considerada uma técnica confiável, eficiente e rápida, a

transformação genética mediada por Agrobacterium tumefaciens tem sido

utilizada por diversos autores para espécies cítricas (MOORE et aI., 1992;

PEÑA et aI., 1995, 1997; KANEYOSHI et aI., 1994; MENDES et aI., 2002;

CERVERA et aI., 1998a,b, 2008, GUTIÉRREZ-E et aI., 1997; COSTA et aI.,

2002; ALMEIDA et aI., 2003; MOLINARI et aI. 2004; FOGOAGA et aI., 2007;

ZANEK, 2008; ZOU et aI., 2008; CARDOSO et al., 2009; DUTT;GROSSER,

2009; RAJAM, 2009; OLIVEIRA et aI., 2009; CIDADE, 2010). Assim, a

transferência de genes de forma indireta via Agrobacterium tumefaciens já é

uma metodologia bem estabelecida para citros.

3.4 Respostas molecular e fisiológica à deficiência hídrica

Como todos os seres vivos, as plantas necessitam de água para o

funcionamento do metabolismo e para o seu desenvolvimento. Além disso, o

entado hídrico de uma célula influencia a estrutura de muitas proteínas, ácidos

nucleicos, polissacarídeos e ainda outros constituintes de uma célula. A água é

o meio aonde muitos processos bioquímicos ocorrem, assim como participa

diretamente em muitos deles (TAIZ; ZEIGER, 2003).

A água corresponde à maior parte da massa celular nas células

vegetais, sendo a massa total de água em tecidos em crescimento situada

11

entre 80% e 95%. As sementes, apesar de possuírem uma percentagem de

água muito baixa (5 a 15%), necessitam absorver muita água para iniciar o seu

processo de germinação. A presença da parede celular permite que as células

resistam a altas pressões hídricas (pressões de turgor) que resultam do

processo hídrico das plantas. Este tipo de pressão é necessário para diferentes

processos fisiológicos, para o transporte de solutos no floema, assim como

para a rigidez e estabilidade mecânica dos tecidos vegetais não lenhosos

(TAIZ; ZEIGER, 2003).

As plantas que são tolerantes à seca apresentam uma série de

mecanismos para que, durante o estresse, as respostas sejam rapidamente

ativadas. Cada planta possui uma percepção do sinal, assim como a regulação

molecular e fisiológica, que se reflete nas diferenças de tolerância à seca inter

e intraespecífica (BARTELS; SUNKAR, 2005). Diferenças entre indivíduos da

mesma espécie foram relatadas para Citrus (GARCÍA-SÁNCHEZ et al., 2007)

em relação às variáveis fisiológicas, como eficiência do uso da água (KNIGHT

et al, 2006; KLAMKOWSKI;TREDER, 2008) e ao estágio de desenvolvimento e

à atividade de diversas enzimas (HONG et al., 2005).

As plantas necessitam de gás carbônico (CO2) para realizar

fotossíntese, porém muitas vezes elas têm que se adaptar entre a perda de

água (H2O) e a absorção de CO2, que é modulado pela regulação estomática.

Este mecanismo depende do vapor de água, do CO2 e das variações da

pressão de turgescência das células-guarda. Em situação de seca, a regulação

da abertura estomática é controlada pelo ácido abcísico (ABA), o principal

hormônio envolvido no fechamento estomático, assim como pelas citocininas,

para a abertura dos estômatos (TAIZ; ZEIGER, 2003).

É comum o fechamento dos estômatos em resposta à seca. Assim, com

os estômatos fechados, o CO2 deixa de entrar na folha, o que leva a limitar o

substrato disponível para a enzima RUBISCO, reduzindo a taxa fotossintética e

a assimilação de CO2 (CHAVES et al., 2009). A entrada de CO2 nas plantas é

regulada em função da disponibilidade deste gás, assim como pela abertura

dos estômatos, como demonstram as diferenças na resposta da fotossíntese à

concentração interna (Ci) de CO2 (TALLMAN, 2004). Em plantas de citros, a

baixa disponibilidade hídrica e temperatura prejudicam o processo de

fotossíntese (RIBEIRO, 2006).

12

Em nível molecular, muitos genes que estão envolvidos em resposta à

seca também estão envolvidos em resposta a salinidade e frio (SEKI et al.,

2002). Alguns desses genes foram identificados por análises de microarranjos

em Arabidopsis e arroz. Bray et al. (2004) identificaram que as chaperonas,

proteínas LEA (Late Abundant Proteins), osmotinas, proteínas anti-

congelamento e de ligação ao mRNA, enzimas da biossíntese de osmólitos,

aquaporinas, transportadores iônicos, de açúcares e de aminoácidos, enzimas

detoxificadoras e proteases atuam de forma direta na proteção das células

contra o estresse por desidratação. Outros genes atuam indiretamente, com os

produtos gênicos envolvidos na regulação ou transdução de sinais durante a

resposta ao estresse, sendo denominadas de proteínas regulatórias. Estas

incluem os fatores de transcrição, proteínas quinases e fosfatases, enzimas do

metabolismo de fosfolipídeos e da síntese de ABA e outras moléculas

sinalizadoras, como proteínas de ligação à calmodulina (SHINOZAKI;

YAMAGUCHI-SHINOZAKI, 2007).

3.5 Major Intrinsic Proteins (MIPs)

As MIPs constituem uma superfamília de proteínas transmembranas,

com peso molecular entre 23-31 kDa, que se encontram presentes em todos os

organismos. As MIPs, também conhecidas como aquaporinas, possuem uma

estrutura tetramérica, composta por quatro monômeros, cada um com um poro

ativo (MAUREL et al., 2008).

Esta família com membros em animais, plantas e micróbios, é composta

por proteínas integrais de membrana que facilitam a transferência bidirecional

de água e pequenos solutos em membranas biológicas (JOHANSON et al.,

2001). A função das aquaporinas, como reguladores do transporte de água, foi

descoberta através da expressão de uma aquaporina humana em oócitos de

Xenopus, em que se obteve um aumento da permeabilidade à água

(TYERMAN et al., 2002). A primeira aquaporina descoberta em plantas foi da

subfamilia TIP (tonoplast intrinsic protein), presente no tonoplasto, o que

potencializou a pesquisa de mais genes desta família (TYERMAN et al., 2002).

13

Inicialmente, as aquaporinas foram identificadas como canais de

transporte seletivo de água (MAUREL et al., 1993). Porém, novos estudos

evidenciaram que esses canais também podem transportar glicerol (GERBEAU

et al, 1999.; LI et al, 2008), uréia (KLEBL et al., 2003; GERBEAU et al, 1999;. LI

et al, 2008; DYNOWSKI et al, 2008b), peróxido de hidrogênio (H2O2) (BIENERT

et al., 2007; DYNOWSKI et al., 2008a) e compostos gasosos como a amônia

(NH3) (JAHN et al, 2004; LOQUE et al., 2005; DYNOWSKI et al, 2008b) e

dióxido de carbono (CO2) (WU; BEITZ, 2007).

As aquaporinas possuem papel importante em situações de estresses

abióticos, como seca e salinidade. Vários estudos demonstraram que, em

casos de estresse hídrico, a transcrição das aquaporinas é alterada, sendo que

o padrão de expressão destes genes é coincidente com um aumento da

tolerância das plantas (MARTRE et al., 2002; MAUREL et al., 2008; ZHANG et

al., 2007). Em mudas de arroz submetidas ao estresse hídrico, ocorreu o

aumento no funcionamento fisiológico dos canais de água pelo aumento da

atividade de água do canal da raiz ou pelo aumento do número aquaporinas

em comparação com mudas do controle não submetidas ao estresse (LU;

NEUMANN, 1999). A diminuição da expressão do gene aquaporinI, que está

presente na membrana plasmática, em plantas de Arabidopsis reduziu a

condutividade hidráulica dessa plantas, levando ao decréscimo na tolerância à

seca (SIEFRITZ et al., 2002).

A regulação transcricional das MIPs é realizada de diferentes formas.

Podem ser induzidas por diferentes hormônios, como o ABA e as giberelinas,

por diferentes fatores de estresse abiótico (MAUREL et al., 2002) e por

modificações pós-traducionais, através de fosforilação. A fosforilação da

aquaporina leva à abertura do poro, em oposição ao mecanismo de

fechamento, que passa pela percepção de protóns (MAUREL et al., 2008).

Em seres humanos (Homo sapiens), foram descritos 13 MIPs (MAGNI et

al., 2006), enquanto que no genoma de arroz, Arabidopsis, milho e tomate

foram descritos 33, 35, 36 e 37 genes, respectivamente (CHAUMONT et al.,

2001; JOHANSON et al., 2001,SAKURAI et al., 2005; SADE et al., 2008). Por

homologia, os genes de Arabidopsis foram agrupados em quatro classes ou

subfamílias diferentes. O maior subgrupo é formado pelas proteínas intrínsecas

da membrana plasmática (PIPs), contendo treze genes, seguido pelas

14

proteínas intrísecas do tonoplasto (TIPs), que possuem dez genes homólogos.

Proteínas intrínsecas do tipo Nodulin26 (NIPs) foram inicialmente

caracterizadas como exclusivamente expressas em membranas

peribacteróides fixadoras de nitrogênio em raiz simbiótica, em nódulos de

leguminosas, e em Arabidopsis, em que nove membros estão presentes. A

quarta categoria inclui as proteínas intrínsecas pequenas (SIPs), da qual três

membros estão presentes em citros (LUU; MAUREL, 2005). Pesquisas atuais

mostram a existência de outros membros das aquaporinas (GUSTAVSSON et

al., 2005; DANIELSON; JOHANSON, 2008), porém os quatro grupos descritos

acima ainda são considerados os principais.

As aquaporinas possuem diversas funções de transporte em vários

compartimentos subcelulares (Figura 1). Isoformas da proteína intrínseca da

membrana (PIP1 e PIP2) estão relacionadas com a via secretora, que promove

o transporte de partículas a partir do retículo endoplasmático (ER). PIPs

também passam por ciclos repetidos de endocitose e reciclagem através de

compartimentos endossomais antes de eventualmente voltarem para o vacúolo

lítico através dos corpos multivesiculares (ROBINSON et al., 1996). As

proteínas intrínsecas do tonoplasto TIP1s (GAMA-TIPs) são encontradas na

membrana vacúolo do lítico, já TIP2s (DELTA-TIPs) e TIP3s (BETA-TIPs) estão

preferencialmente associadas a vacúolos que acumulam proteínas de reserva

em células vegetativas e em sementes, respectivamente. As proteínas

intrínsecas do tipo Nodulin-26 (PIN) mostram um amplo espectro no padrão de

localização subcelular. AtNIP2;1 está localizada no retículo endoplasmático e

na membrana plasmática (CHOI; ROBERTS, 2007; MIZUTANI, et al., 2006).

Em Oryza sativa, OsNIP2;1 (transportador de silício) e em Arabidopsis thaliana,

AtNIP5;1 (transportador de ácido bórico), estão localizadas na membrana

plasmática, enquanto que em soja (Glycine max), GmNOD26 é exclusivamente

expressa na membrana peribacteroide (MAUREL et al., 2008) (Figura 1).

15

Figura 1. Algumas das múltiplas funções das aquaporinas em células vegetais. As diferentes subfamílias são identificadas na ilustração por cores distintas. Fonte: MAUREL et al. (2008).

16

4 MATERIAL E MÉTODOS

Os experimentos foram desenvolvidos no Laboratório de Cultura de

Tecidos Vegetais e Laboratório de Biologia Molecular, localizado no Centro de

Biotecnologia e Genética (CBG) da Universidade Estadual de Santa Cruz

(UESC), em Ilhéus-BA.

4.1 Material biológico

4.1.1 Material vegetal

Para a realização da transformação genética dos explantes de

citrumeleiro ‗Swingle‘ e tangerineira ‗Cleopatra‘ foram utilizadas sementes

obtidas do Banco Ativo de Germoplasma (BAG) de citros da EMBRAPA

Mandioca e Fruticultura (Cruz das Almas, BA). A espécie Nicotiana tabacum foi

empregada no presente trabalho como sistema-modelo, já que apresenta

características adequadas para o desenvolvimento de estudos de função

gênica (BRASILEIRO; CARNEIRO, 1998). Foram utilizadas culturas pré-

estabelecidas de tabaco cv. Havana mantidas no Laboratório de Cultura de

Tecidos Vegetais do CBG da UESC.

4.1.2 Cultura e manutenção dos isolados de Agrobacterium tumefaciens

A estirpe de Agrobacterium tumefaciens EHA 105 foi utilizada nos

experimentos. As culturas foram conservadas em solução de glicerol (50%) e

meio de cultura YEP líquido (extrato de levedura, NaCl e peptona), mantido em

-80ºC. A partir dessa solução, a bactéria foi plaqueada em meio de cultura YEP

sólido (suplementado com 100 mg L-1 de canamicina e 50 mg L-1 de

rifampicina) e incubada a 28ºC, por 48h. Após esse período, colônias isoladas

foram selecionadas e transferidas para meio de cultura YEP líquido, contendo

100 mg L-1 de canamicina e 50 mg L-1 de rifampicina, e incubado overnight a

28ºC / 200rpm. Logo após, a solução foi centrifugada por 15 min a 5000 rpm e

17

o precipitado formado foi ressuspendido em meio de cultura MS para uso em

transformação genética de plantas.

4.2 Identificação do gene DELTA-TIP

Sequências de aminoácidos codificada por genes da família MIP,

previamente identificados em Arabidopsis, foram utilizadas para identificar os

respectivos ortólogos em bibliotecas de ESTs de citros disponíveis na base de

informação genômica do HarvEST:Citrus (http://harvest.ucr.edu), por meio da

ferramenta BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Dentre os genes identificados,

selecionou-se para caracterização nesse estudo aquele codificando para uma

DELTA-TIP (Unigene 39450, assembly C52), por ter sido expresso em

bibliotecas de raízes e folhas de citros submetidos a seca e a salinidade

(Tabela 1). O referido gene corresponde aos locos orange1.1g025817m.g em

Citrus sinensis (Phytozome database) e AT3G16240 em Arabidopsis (TAIR

database) e foi nomeado no presente estudo de Citrus sp. DELTA-TIP

(CsDTIP)

4.3 Alinhamento de múltiplas sequências e análise filogenética

A sequência de aminoácidos codificada pelo gene CsDTIP (Tabela 1),

juntamente com as sequências homólogas de MIPs de Arabidopsis descritas

no trabalho de Johanson et al. (2001) foram alinhadas para comparação e

análise filogenética. O alinhamento das sequências preditas de aminoácidos foi

efetuado utilizando o programa ClustalW (http://clustalw.genome.jp/)

(THOMPSON et al., 1994) e a árvore filogenética foi gerada utilizando o

método Neighbor-Joining (SAITOU; NEI, 1987) e a opção de bootstrap (1000

replicações). O dendrograma foi construído pelo programa MEGA4 (TAMURA

et al., 2007). Para predição de sequências conservadas, foi utilizado o

programa PredictProtein (http://cubic.bioc.columbia.edu/predictprotein/).

18

Tabela 1. Sequência de nucleotídeos do gene CsDTIP.

Gene Sequência de nucleotídeo

CsDTIP GGGGGTGCTCGATCGAGATAAAACCTTATCTTCTTCTTCTTCTTA

AGAAAGACTCGAGAGAGTTTTTTTTTCCCTATTCTCTAGCTCTTT

CTTGATCAACAATGGCTATTGCCTTCGGCCGCTTCGATGATTCTT

TCAGCTTAGGCTCCTTCAAGGCCTATCTTGCTGAGTTTATCTCAA

CTTTGCTCTTTGTTTTCGCCGGCGTTGGCTCGGCCATTGCTTTCA

ACAAGATGACAGCAGATGCAGCACTTGATCCATCAGGGCTAGTAG

CCATCGCTATTTGCCATGGATTTGCTCTATTTGTCGCAGTTGCAA

TTGGTGCTAACATCTCAGGTGGCCACGTCAACCCAGCCGTCACCT

TTGGATTGGCTCTTGGTGGCCAAATCACCATCCTCACTGGCATCT

TCTACTGGATTGCCCAACTTCTTGGCTCTATTGTTGCCAGCTTCC

TCCTCAAAGTTGTCACTGGAGGCTTGGCAGTTCCTACCCACAATG

TTGCTGCTGGAGTTGGAGCCATTGAAGGAGTTGTGATGGAGATCA

TCATCACATTTGGTTTGGTCTACACGGTCTATGCCACGGCAGCTG

ACCCCAAGAAGGGATCATTGGGCACCATTGCACCCATTGCCATCG

GTTTCATTGTCGGTGCCAACATCCTGGCCGCCGGCCCATTCTCCG

GTGGTTCCATGAACCCGGCCCGTTCCTTCGGGCCTGCCGTTGCCA

GCGGCAACTTTCAGGACAACTGGATCTACTGGGTTGGCCCTCTCA

TTGGCGGTGGCCTTGCCGGGCTCATCTATGGCAATGTGTTCATGC

ACTCTGAACATGCACCCCTATCTAATGACTATTAATTAATTAGTT

AAACTTTGTTTAAAAGTTTAGTTAAATCATTTGATCACCTGCTTT

TGGCTCTTTCTTTTTTGTAATAAAAGAAGGAAAAGCAGCTTTGGC

TCTTTCTTCTTTTCTTCTTTAGTTTCTTGGTATCCTTCTTTTTAA

ATCATTTCTTTTGGAGGTTGTAAAAAGTCTTTGTTGTGGTGGTCC

ATTGCGGCTTTTCTGACGATAATGGATGGATTGGGAGACATGCTT

GAATGACACTCTTTAGTCTTTAAAAAAAAAAAAAAAAA

ATG: Códon de iniciação. TAA: Códon de terminação.

4.4 Análise de expressão do gene CsDTIP em variedades porta-enxerto

de citros submetidas à deficiência hídrica pela técnica de qPCR

Amostras de RNAs utilizadas para análise de expressão do gene

CsDTIP em variedades porta-enxerto de citros (limoeiro ‗Cravo‘ e tangerineira

‗Sunki Maravilha‘) foram gentilmente cedidas por Diana Matos Neves, sendo

obtidas como parte de sua dissertação (NEVES, 2011). Brevemente, os

experimentos foram conduzidos em casa de vegetação com umidade e

temperaturas do ar controladas (70 a 80% e 25 a 30Cº). Cada vaso, contendo

apenas uma planta, foi irrigado para que o solo fosse mantido próximo à

capacidade de campo até o momento de ser aplicado o tratamento de

deficiência hídrica. Após 45 dias da transplantação, as mudas foram divididas

19

em dois grupos (i) tratamento controle (plantas irrigadas; potencial hídrico foliar

de -0,25 MPa) e (ii) tratamento de deficiência hídrica (plantas foram submetidas

à suspensão completa da irrigação, por 40 dias; potencial hídrico foliar de -1,5

MPa na ante-manhã). O monitoramento da umidade de água (m3/m-3) no solo

foi por meio da sonda TDR (reflectrometria no domínio do tempo). Para

medição do potencial hídrico foliar ante-manhã, amostras de folhas de cada

tratamento foram destacadas e imediatamente analisadas em bomba de

pressão do tipo Scholander (m670, Pms Instrument Co., Albany, USA), às 4:00

a.m..

Para a extração de RNA, amostras de folhas e raízes foram destacadas

com uma lâmina de bisturi, envolvidas com papel alumínio e imediatamente

congeladas com nitrogênio líquido até serem armazenadas no freezer -80ºC.

Amostras de RNA total foram isoladas utilizando-se o Kit RNAqueous (Ambion,

Inc.), seguindo as instruções do fabricante. A qualidade e a integridade do RNA

extraído foram avaliadas por análise em gel de agarose a 1,5%. As amostras

foram tratadas com DNAse após o processo de extração, usando o Kit Turbo

DNA-free (Ambion, Inc.), seguindo as instruções do fabricante (1 μL de

DNAse). A ausência de contaminação com DNA genômico foi confirmada por

PCR negativo, empregando-se oligonucleotídeos específicos para amplificação

do gene da β-actina. A reação de transcrição reversa foi realizada usando o kit

RETROscript (Ambion Inc.), seguindo as instruções do fabricante.

Todos os procedimentos de qPCR, incluindo testes, validações e

experimentos, foram conduzidos no aparelho ABI 7500 (Applied Biosystems,

EUA), seguindo as instruções do fabricante. O gene da β-actina (ACT) foi

amplificado juntamente com o gene-alvo, como controle endógeno, para

normalizar a expressão entre as diferentes amostras.

Os oligonucleotídeos específicos utilizados para esse experimento

foram: CsDTIP-F (5‘-CGCAGTTGCAATTGGTGCTA–3)‘, CsDTIP-R (5‘-GATG

CCAGTGAGGATGGTGAT-3‘); ACT-F (5‘- TTAACCCCAAGGCCAACAGA-3‘);

ACT-R (5‘-TCCCTCATAGATTGGTACAGTATGGAC-3‘). As reações de qPCR

foram conduzidas em triplicata, em volume de reação de 20 μL, contendo 75-

100 ng de cDNA, 1 μL de primers (F+R) na concentração de 500 nM, 10 μL de

Maxima® SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2X) (Fermentas, EUA) e

aproximadamente 8 μL de água Milli-Q esterilizada por autoclavagem. As

20

condições de amplificação foram realizadas utilizando-se as seguintes etapas:

(1) ativação da Taq DNA polimerase a 50ºC por 2 min, (2) desnaturação inicial

a 95ºC por 10 min, (3) desnaturação a 94ºC por 15s, (4) anelamento a 60ºC por

30s e (5) extensão a 60ºC por 1 min. As etapas 3 a 5 foram repetidas por 45

ciclos.

Para quantificação da expressão gênica, foi utilizado o método

comparativo de Ct:ΔΔCt (LIVAK; SCHMITTGEN, 2001), com dados

provenientes de duas repetições biológicas. Reações controle desprovidas de

cDNA (NTC) também foram utilizadas em todos os experimentos. O programa

Dissociation Curve 1.0 (Applied Biosystems, EUA) foi usado para verificar que

somente um único produto de PCR foi gerado pela amplificação dos transcritos.

Foi realizada análise de variância dos dados de expressão, sendo as médias

comparadas pelo teste t em nível de 5% de probabilidade.

4.5 Clonagem molecular do gene CsDTIP e introdução em vetor de

transformação de plantas

O RNA total foi extraído de plantas de limoeiro ‗Cravo‘ submetidas à

situação de deficiência hídrica (NEVES, 2011) e utilizado em reações de PCR,

empregando-se os oligonucleotídeos CsDTIP -F (5‘-TCCCTATTCTCTAGCTCT

TTCTTGA–3)‘ e CsDTIP-R (5‘-CAAAGACTTTTTACAACCTCCAAAA-3‘),

especificamente desenhados para amplificar a sequência codante completa do

gene CsDTIP. O fragmento de cDNA amplificado foi clonado no vetor pGEM-T

(Promega, EUA), por meio do sistema de clonagem TA, e utilizado em

transformação de E. coli, estirpe TOP 10. A identidade do produto amplificado

foi confirmada pela técnica de PCR e por digestões com enzimas de restrição.

A sequência completa de cDNA do gene CsDTIP foi retirada do

plasmídeo pGEM-T, por meio de digestão com a enzima NotI, e sub-clonado no

mesmo sítio de restrição do plasmídeo pUC118/CaMV35S. Esse plasmídeo

contém as sequências promotora e terminadora do gene 35S do vírus do

mosaico da couve-flor (CaMV 35S). Clones contendo a sequência de cDNA em

orientação senso foram identificados por meio de digestão com as enzimas de

restrição NcoI e BamHI. O cassete foi posteriormente retirado do plasmídeo

21

pUC118/CaMV35S e inserido no vetor de transformação de plantas pCAMBIA

2301 (www.cambia.org.au), empregando-se a enzima PstI. O vetor pCAMBIA

2301 contém o gene repórter uidA (GUS) e o gene seletivo nptII (neomycin

phosphotransferase II), ambos sob o controle do promotor constitutivo

CaMV35S. Esses vetores foram introduzidos na cepa de Agrobacterium

tumefaciens EHA-105 e utilizados em experimentos de transformação genética

de tabaco e citros.

4.6 Transformação genética de citros e tabaco

Os experimentos de transformação genética de citros foram efetuados

conforme metodologia descrita por Cidade (2010). As sementes foram

desinfestadas e colocadas para germinação in vitro, no escuro. Após 30 dias,

os epicótilos foram cortados transversalmente em segmentos de 0,5-1,0 cm e

imersos em solução de Agrobacterium por 20 minutos (OD600= 1,0), e depois

transferidos para meio de co-cultivo. Após três dias de co-cultivo, os explantes

foram transferidos para meio seletivo de regeneração de brotos, contendo sais

e vitaminas de meio MS, 0,5 mg L-1 da citocinina 6-benzilaminopurina (BAP)

(1mg/mL), 100 mg L-1 de canamicina e 250 mg L-1 de cefotaxima. Explantes

com gemas adventícias foram transferidos para meio de alongamento de

brotos, contendo as mesmas concentrações dos antibióticos acima descritas.

Os experimentos de transformação genética de tabaco foram efetuados

conforme metodologia descrita por Brasileiro et al. (1998). Plântulas de N.

tabacum cv. Havana, de aproximadamente 3 meses de idade, multiplicadas à

partir da germinação in vitro de sementes, foram utilizadas como material para

excisão dos explantes. As folhas foram cortadas em quadrados de

aproximadamente 3-cm2 e colocadas em contato com suspensão bacteriana

(OD600= 0,5), por 15 minutos a temperatura ambiente sob leve agitação. Os

explantes foram posteriormente lavados com água destilada estéril, secos com

papel de filtro e mantidos durante 48 h (período de co-cultivo) em meio MS

(MURASHIGE; SKOOG, 1962) sólido, sem adição de antibióticos, no escuro.

Logo após, os explantes foram transferidos para placas contendo meio seletivo

de regeneração de brotos, com sais e vitaminas de MS, 100 mg L-1 de

22

canamicina e 250 mg L-1 de cefotaxima. Brotos de aproximadamente 1,0 cm de

tamanho foram excisados e transferidos para frascos tipo Magenta contendo

meio MS sólido visando o enraizamento. As plantas enraizadas e positivas para

os ensaios de GUS foram mantidas in vitro e aclimatadas em condições

controladas, visando à obtenção de sementes e posterior caracterização.

4.7 Caracterização das plantas transgênicas

4.7.1 Teste histoquímico da expressão do gene uidA (GUS)

Segmentos transversais da base dos brotos das plantas potencialmente

transformadas foram analisados histoquimicamente quanto à expressão do

gene uidA. Os segmentos (~ 1 mm de espessura) foram cortados e incubados

em solução com tampão de ensaio [NaH2PO4.H2O 100 mMol L-1

(pH 7,0),

K4Fe(CN)6.3H2O 0,5 mMol L-1, Na2EDTA.2H2O mMol L

-1, Triton X-100 0,1%

(v/v)] e X-GLUC (5-bromo-4-cloro-indolil-β-D-glucuronideo) à 37°C, no escuro

por 16 h (CARNEIRO et al., 1998). Visando facilitar a visualização da coloração

azul do tecido vegetal (indicando atividade da enzima β-glucoronidase), o

material foi lavado com etanol (70%) para a retirada da clorofila.

4.7.2 Extração de DNA genômico e análise da inserção do gene CsDTIP pela técnica de PCR

Foram coletadas folhas jovens dos explantes de plantas confirmadas

como GUS positivas e o DNA total foi extraído pelo método CTAB (DOYLE;

DOYLE, 1990) e analisado pela reação em cadeia da polimerase (PCR)

utilizando-se oligonucleotídeos específicos para a detecção das plantas

transformadas. As sequências dos oligonucleotídeos utilizados foram: uidA-F

(5‘– CACGAACTGAACTGGCAG–3‘) e uidA-R (5‘–CATCACCACGCTTGGGTG

–3‘); nptII-F (5′-ATGGGGATTGAACAAGATGGATTG-3′) nptII-R e (5′-

TCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC-3′); CsDTIP-F (5‘-TCCCTATTCTCTAGCT

CTTTCTTGA–3)‘ CsDTIP-R (5‘-CAAAGACTTTTTACAACCTCCAAAA-3‘). A

amplificação foi realizada empregando-se 0,5 μL de DNA (50-100 ng), 0,2 μL

23

de dNTPs (10 mMol L-1), 1,0 μL de MgCl2 (25 mMol L

-1), 2,0 μL de tampão

(10x), 1,0 μL (2,5 μM) dos oligonucleotídeos específicos e 0,2 μL Taq

Polimerase (5U μL-1), em volume de reação de 25 μL. As reações foram

amplificadas em termociclador TC-412 (Techne, Inglaterra), com uma

desnaturação inicial de 94ºC por 2 min, 35 ciclos de 94ºC por 1 min, 48ºC (nptII

e uidA) ou 58ºC (CsDTIP) por 1 min, 72ºC por 2 min e uma extensão final de

72ºC por 10 min. O PCR foi avaliado por eletroforese em gel de agarose (1,0%)

corado com brometo de etídeo (0,5 μg mL-1) e fotografado em luz UV.

4.7.3 Extração de RNA, síntese de cDNA e análise de expressão do gene CsDTIP nas plantas transgênicas de tabaco pela técnica de PCR em tempo real

Amostras de RNA total de folhas de tabaco foram isoladas utilizando o Kit

RNAqueous (Ambion, Inc.), seguindo as instruções do fabricante. Os demais

procedimentos de síntese de cDNA e de qPCR, incluindo a confecção das

reações, condições de amplificação e métodos de quantificação e comparação

dos sinais de expressão, foram efetuados conforme metodologia descrita no

item 4.4. Os dados foram submetidos à análise de variância, sendo as médias

comparadas pelo teste de Scott Knott a 5% de probabilidade.

4.7.4 Análise da perda do conteúdo de água

A perda do conteúdo de água foi analisada em plantas de tabaco não-

transformada (controle) e transgênicas (geração T0) pela diferença entre o peso

fresco inicial e final dos tecidos foliares em cada período avaliado. Para esta

finalidade, amostras uniformes de discos foliares foram extraídas da folha mais

jovem, totalmente expandida, de plantas adultas, com auxílio de um perfurador

de 1,0 cm de diâmetro, evitando-se a nervura central. Em seguida, os discos

foliares foram submetidos à desidratação em temperatura ambiente por 180

min, sendo as medições de peso fresco realizadas a cada 30 min. Cada

tratamento foi constituído por três repetições com cinco discos foliares por

repetição. Os dados foram submetidos à análise de regressão e análise de

24

variância, sendo as médias comparadas pelo Teste de Dunnett (na análise de

regressão a 1% e 5%) e Teste de Scott Knott (na análise dos dados no final do

experimento, em nível 5% de probabilidade).

4.7.5 Presença de H2O2

Para avaliar o estresse oxidativo em tecidos foliares submetidos a

desidratação, todos os discos foliares de tabaco analisados no tópico 4.7.4

foram submetidos ao ensaio de coloração histoquímica com DAB-HCl (3,3‘ –

diaminobenzidene), conforme metodologia proposta por THORDAL-

CHRISTENSEN et al. (1997). As amostras foram submetidas a infiltração a

vácuo com 1 mg mL-1 de DAB-HCl, por 4 h. Após esse período, os discos

foliares foram fervidos em etanol 96% por 4 h e posteriormente fotografados

em lupa para detecção da coloração marrom.

25

5 RESULTADOS

5.1 Identificação do gene CsDTIP em bancos de informações genômicas

de citros

Utilizando as sequências de aminoácidos codificadas por genes da

família MIP previamente identificados em Arabidopsis, buscas foram efetuadas

nas bases de informação genômica do HarvEST:Citrus, por meio de BLAST,

visando identificar as respectivas sequências ortólogas de citros. Dentre os

genes identificados, aquele correspondente ao unigene no. 39450 (Assembly

C52 do HarvEST:Citrus) foi observado estar presente em bibliotecas de ESTs

de raiz de Citrus limonia submetido à seca (GenBank: EY873983 e EY873211),

de folha de Citrus reticulata submetido à seca + reidratação (GenBank:

CX295844) e de raiz de Citrus reshni, submetido a estresse salino (GenBank:

DY306355 e DY306589). Por, provavelmente, possuir um papel na resposta e

tolerância a estresses hídrico e salino, o referido gene, identificado como

CsDTIP, foi selecionado para caracterização no presente estudo.

As análises da sequência de aminoácidos, deduzida a partir da

sequência de nucleotídeos de CsDTIP, permitiram obtenção de informações

importantes acerca da possível função da proteína. De acordo com as análises

de bioinformática, o gene CsDTIP codifica uma proteína de 247 aminoácidos

que possui homologia com membros da subfamília TIP (TIP2;1 ou DELTA-TIP

de Arabidopsis). CsDTIP possui seis hélices transmembranas, domínios N- e

C-terminal citoplasmáticos e diversas regiões conservadas características da

família MIP (Figura 2). De acordo com a análise da sequência de aminoácidos

em programa específico, há alguns sítios conservados que estão relacionados

a sua família, como, o sítio ativo característico da família MIP entre os

aminoácidos 80 e 88. Foram também identificados entre os aminoácidos 82 a

84 e 196 a 198 sítios de domínio transmembrana que formam pequenas

hélices hidrofóbicas e participam da seletividade de substrato (Figura 2). Outros

14 domínios foram identificados na proteína CsDTIP, todos relacionados a

algum sítio ativo, exceto o da sequência AEF (22 a 24), que foi caracterizada

como aminoácidos conservados, porém com função desconhecida (Figura 2).

26

Nove desses domínios são característicos da subfamília TIP, como sítios de N-

miristoilação (aminoácidos 15 a 20, 34 a 39, 73 a 78, 88 a 93, 110 a 115, 137 a

142, 151 a 156, 166 a 171, 223 a 228), um domínio de sítio de N-glicosilação

(75 a 78), um sítio de fosforilação da proteína quinase CAMP (164 a 167), um

sítio de fosforilação da proteína quinase C (16 a 18) e um sítio de fosforilação

da proteína Caseína Quinase II (159 a 162) (Figura 2).

Figura 2. Sequência aminoacídica da proteína deduzida a partir da sequência gênica CsDTIP. As regiões em destaque referem-se ao sítio relacionado à seletividade do substrato (NPA), sítio de N-glicosilação (NISG), sítio de fosforilação da proteína quinase CAMP (KKGS), sítio de fosforilação da proteína quinase C (SFK), sítio de fosforilação da proteína Caseína Quinase II (TAAD), sítios de N-miristoilação (GSFKAY, GVGSAI, GANISG, GLALGG, GSIVAS,, GAIEGV, GLVYTV, GSLGTI, GGGLAG), sítio conservado característico da família MIP (HVNPAVTFG) e um sítio de função desconhecida (AEF).

5.2 Alinhamento de múltiplas sequências e análise filogenética

A sequência da proteína CsDTIP de citros identificada no presente

estudo, juntamente com sequências homólogas de Arabidopsis descritas no

trabalho de Johanson et al. (2001), foram alinhadas para comparação e análise

filogenética (Figura 3). A análise filogenética indicou que a proteína CsDTIP de

citros identificada, de fato, pertence à subfamília TIP, com uma estabilidade

interna suportada por análise de ―bootstrap‖, sendo um ortólogo do gene

AtTIP2;1 de Arabidopsis. O resultado do alinhamento de todas as sequências

permitiu a identificação das regiões conservadas através do programa

PredictProtein (Figura 4).

27

Figura 3. Análise filogenética das proteínas da família MIP de Arabidopsis (At) e CsDTIP de citros. As sequências de aminoácidos foram alinhadas utilizando ClustalW e o método Neighbor-Joining. A árvore foi construída com um suporte de bootstrap de 1000 replicações. Abreviaturas para o nome das subfamílias são as seguintes: PIP (proteínas intrínsecas da membrana plasmática); TIP (proteínas intríseca do tonoplasto); NIP (proteínas intrínsecas Nodulin26); SIP (proteínas intrínsecas pequenas).

28

29

Figura 4. Alinhamento entre as sequências CsDTIP e aquelas da subfamília TIP descritas para Arabidopsis. Resíduos em vermelho são idênticos nas sequências analisadas. O alinhamento foi realizado pelo programa ClustalW.

5.3 Análise da expressão de CsDTIP em variedades porta-enxerto de

citros submetidas à deficiência hídrica

Variedades porta-enxerto de citros contrastantes para tolerância à seca

foram submetidas à deficiência hídrica visando investigar a expressão do gene

CsDTIP. É conhecido que o limoeiro ‗Cravo‘ é uma variedade que apresenta

tolerância à seca, enquanto a tangerineira ‗Sunki Maravilha‘ apresenta elevada

intolerância à seca. De acordo com os resultados obtidos, a expressão do gene

CsDTIP foi induzida sob condições de deficiência hídrica tanto em raiz como

em folha de ambas as variedades analisadas (Figura 5). Observa-se que as

plantas de tangerineira ‗Sunki Maravilha‘ apresentaram, sob deficiência hídrica,

maior expressão do gene CsDTIP na raiz quando comparados ao limoeiro

‗Cravo‘, com valores de expressão relativa de 8,15 e 3,17, respectivamente

(Figura 5). Já em folhas, a expressão do gene CsDTIP sob deficiência hídrica

foi maior em limoeiro ‗Cravo‘ (28,68 x) do que em tangerineira ‗Sunki Maravilha‘

(2,37 x) (Figura 5). Estatisticamente, o perfil das plantas do limoeiro ‗Cravo‘ e

tangerineira ‗Sunki Maravilha‘ sob deficiência hídrica apresentaram diferenças

30

significativas quando comparadas as plantas controle, tanto em raiz como em

folha (Figura 5)

Figura 5. Análise da expressão relativa do gene CsDTIP em plantas de limoeiro ‗Cravo‘ e tangerineira ‗Sunki Maravilha‘ sob condições controle (potencial hídrico foliar na ante-manhã de -0,25 MPa) ou de deficiência hídrica (potencial hídrico foliar na ante-manhã de -1,5 MPa). A: Expressão relativa em raiz. B: Expressão relativa em folha. A expressão do gene da β-actina foi usada como normalizador. Os dados representam a média de três réplicas experimentais. **Diferenças significativas pelo teste t em nível de 1% de probabilidade e * em nível de 5% de probabilidade.

31

5.4 Clonagem de CsDTIP e introdução em plantas de tabaco

A sequência completa de cDNA de CsDTIP foi clonada pela técnica de

RT-PCR, a partir de amostras de cDNA de raiz de limoeiro ‗Cravo‘ submetidas

à seca, subclonada no vetor de transformação de plantas pCAMBIA 2301, sob

o controle do promotor constitutivo CaMV35S, e inserida na cepa de A.

tumefaciens EHA-105, conforme metodologia descrita em Material e Métodos.

A construção gênica foi utilizada em experimentos de transformação genética

de tabaco, utilizando-se o método do co-cultivo de segmentos foliares. A

regeneração dos brotos potencialmente transformados ocorreu a partir de 20

dias após a incubação em sala de crescimento. Os brotos (~1 cm) regenerados

em meio seletivo foram selecionados aleatoriamente para os ensaios

histoquímicos de GUS, permitindo a obtenção de 17 linhagens GUS+,

representando eventos de transformação independentes (Figura 6).

Posteriormente a confirmação de GUS+, nove linhagens foram individualizadas

e transferidas para meio de enraizamento. O crescimento da parte aérea e

início da rizogênese se deu 20 dias após a transferência dos brotos para meio

de alongamento. Dessa forma, com a metodologia utilizada, foi possível a

obtenção de plantas completas em média de 60 dias após a incubação dos

explantes em solução de Agrobacterium. Todas as linhagens GUS+

apresentaram fenótipo normal e foram férteis.

32

Figura 6. Etapas na obtenção de plantas transgênicas de Nicotiana tabacum contendo o gene CsDTIP. A: explantes foliares transformados com A. tumefaciens: CsDTIP em meio de co-cultivo; B: indução de brotos em meio seletivo de regeneração; C: ensaio histoquímico para expressão do gene uidA em segmentos de brotos de N. tabacum; D: linhagem transgênica individualizada.

Após a aclimatação, as plantas (transformadas e controle) foram levadas

para a casa de vegetação, onde o florescimento ocorreu aproximadamente dois

meses após a transferência. As etapas referentes ao desenvolvimento,

florescimento e obtenção de sementes das plantas transgênicas estão

ilustradas na Figura 7.

33

Figura 7. Desenvolvimento, florescimento e obtenção de sementes das plantas transgênicas de tabaco contendo o gene CsDTIP em casa de vegetação. A: plantas em desenvolvimento. B e D: plantas em florescimento e C: cápsulas de sementes.

5.5 Caracterização molecular das plantas transgênicas de Nicotiana

tabacum

A natureza transgênica das plantas foi inicialmente determinada por

meio de reações de PCR, utilizando-se oligonucleotídeos específicos para

amplificação do gene nptII. No gel de agarose, uma banda de

aproximadamente 800 kb, correspondente ao tamanho esperado para o gene,

pode ser observada em todas as linhagens transgênicas de N. tabacum

analisadas (Figura 8).

34

Figura 8. Amplificação do fragmento do gene nptII em plantas transgênicas de Nicotiana tabacum por PCR. M: marcador de 1 kb ; C-: controle negativo - planta não transformada; C+: controle positivo - DNA plasmidial diluído (1:100) de pCAMBIA 2301; L1 à L21: linhagens transgênicas.

5.5.1 Análise da expressão de CsDTIP nas linhagens transgênicas de Nicotiana tabacum

A expressão do gene CsDTIP foi analisada nas linhagens transgênicas e

planta controle não-transformada de Nicotiana tabacum. De acordo com os

resultados obtidos, a expressão do gene CsDTIP pode ser observada em todas

as linhagens de N. tabacum. Contudo, na planta controle a expressão do

mesmo não foi observada. A maior expressão relativa foi observada na

linhagem L9, com uma expressão 758 vezes maior quando comparada à

linhagem L13, a linhagem de menor expressão do transgene (1 x). As

linhagens L10, L8 e L1 apresentaram uma expressão 576, 540 e 495 vezes

maior do que L13, respectivamente. As linhagens L4, L3, L12 e L21

apresentaram níveis de expressão de 4, 17, 158 e 171 vezes maior do que L13

(Figura 9). Estatisticamente, a maior expressão foi obtida para L9, seguido

pelas linhagens L1, L8 e L10 que não diferiram entre si, já as linhagens L3, L12

e L21 obtiveram níveis de expressão similares e mais baixos do que as

linhagens anteriores, não ocorrendo diferença entre si. A linhagem L4 foi igual

à linhagem calibradora L13.

35

Figura 9. Análise da expressão relativa do gene CsDTIP em diferentes linhagens transgênicas de Nicotiana tabacum por qPCR. A expressão do gene da β-actina foi usada como normalizador. Os dados representam a média ± SE (erro padrão) de três réplicas experimentais. L1, L3, L4, L8, L9, L10, L12, L13, L21: Linhagens transgênicas. As médias seguidas por letras diferentes apresentam diferenças significativas pelo Teste de Scott Knott (P ≤ 0,05).

5.6 Transformação genética de variedades porta-enxerto de citros com o

gene CsDTIP

Experimentos de transformação genética via Agrobacterium tumefaciens

com os porta-enxertos tangerineira ‗Cleópatra‘ e citrumeleiro ‗Swingle‘ foram

realizados visando a introdução do gene CsDTIP sob expressão constitutiva.

Foram realizados seis e quatro experimentos distintos de transformação para

tangerineira ‗Cleópatra‘ e citrumeleiro ‗Swingle‘, respectivamente (Tabela 2).

Um total de mais de 500 segmentos de epicótilos foram inoculados em solução

de Agrobacterium, proporcionando um total de 237 brotos regenerados. Desse

total, 11 brotos foram confirmados como GUS positivos, gerando uma eficiência

média de transformação de 4,89% (Tabela 2). Avaliando a porcentagem de

brotos transformados por variedade, as melhores eficiências de transformação

foram obtidas para citrumeleiro ‗Swingle‘ (6,79%). Já tangerineira ‘Cleópatra‘

rendeu uma eficiência média de transformação de 2,98%.

36

Os brotos positivos para o teste GUS foram enraizados com sucesso e

mantidos in vitro para análises posteriores. Todas as plantas apresentaram

fenótipo normal (Figura 10).

Tabela 2. Experimentos de transformação genética mediada por Agrobacterium tumefaciens em segmentos de epicótilos de tangerineira ‗Cleópatra‘ e citrumelo ‗Swingle‘ com o gene CsDTIP.

a: A eficiência de transformação foi calculada como: nº de brotos GUS positivos/ nº de explantes inoculados x 100.

Figura 10. Esquema de obtenção de plantas transgênicas de citros contendo o gene CsDTIP. A:epicótilo em meio seletivo; B: brotos em meio seletivo; C: ensaio histoquímico para expressão do gene uidA em segmentos basais; D: plantas transformadas de citros (citrumeleiro ‗Swingle‘) confirmadas com o gene CsDTIP.

Variedade

No de

segmentos

cultivados

Nº de

brotos

regenerados

No de

brotos

GUS+

Eficiência de

transformação

(%)a

Tangerina

‗Cleópatra‘

314 134 4 2,98

Citrumelo

‗Swingle‘

217 103 7 6,79

TOTAL 531 237 11 4,89

37

5.7 Análise da tolerância a estresse por desidratação em linhagens

transgênicas de tabaco

Para investigar se a superexpressão de CsDTIP correlaciona-se com a

tolerância ao estresse por desidratação, plantas controle e linhagens

transgênicas de tabaco foram submetidas ao estresse de desidratação por

curto prazo. Discos foliares das plantas de tabaco com três meses de idades

foram desidratados em temperatura ambiente por 180 min. De um modo geral,

observou-se que as linhagens transgênicas perderam significativamente menos

água em comparação à planta controle (Figura 11). Com excessão de L8, que

apresentou taxa de desidratação significativamente menor do que a planta

controle já a partir de 30 min, pôde-se observar uma redução significativa da

perda de água nas plantas transgênicas em relação à planta controle a partir

de 120 min. L8 foi a linhagem que apresentou a menor taxa de desidratação

(24,03%±0,19), seguida por L12, que apresentou uma taxa de desidratação de

26,72%±0,41, e L4 (28,81%±0,070) e L9 (28,01%±0,33), que não diferiram

estatisticamente entre si (Tabela 3).

Ao final dos 180 min, todas as linhagens transgênicas apresentaram taxas

de desidratação significativamente inferiores comparadas com a planta controle

(Tabela 3 e Figura 11). Entretanto, comparando-se os resultados obtidos com

os níveis de expressão de CsDTIP nas plantas transgênicas de tabaco (Figura

9), verifica-se que as linhagens com extremos superior (L9) ou inferior (L4) de

expressão foram menos tolerantes à desidratação do que as linhagens com

expressão intermediária (L8 e L12).

Tabela 3. Diferença média na taxa de desidratação das linhagens transgênicas e da planta controle, entre os tempos de 0 a 180min.

Linhagens Taxa de desidratação (%)

L4 28,81±0,070c

L8 24,03±0,187a

L9 28,01±0,332c

L12 26,72±0,408b

controle 39,95±0,550d

As médias ± erro padrão seguidas por letras diferentes apresentam diferenças significativas pelo Teste de Scott Knott (P ≤ 0,05).

38

Figura 11. Taxa de desidratação de discos foliares da planta controle não-transformada e linhagens transgênicas (L4, L8, L9 e L12) sob estresse durante 180 min em temperatura ambiente. Medição por redução de peso fresco a cada 30 min. * (P <0,05) e ** (P <0,01) indicam que a taxa de perda de água nas linhagens transgênicas é significativamente menor do que o controle no mesmo ponto de tempo pelo Teste de Dunnett.

5.8 Acúmulo de H2O2

A fim de investigar se a maior tolerância à desidratação das plantas

transgênicas está correlacionada com menores níveis de estresse oxidativo, a

produção de H2O2 foi analisada em discos foliares de tabaco após 180 min de

desidratação, por meio da técnica de DAB-HCl (Figura 12). Na planta controle

não-transformada, a desidratação causou um visível escurecimento

ocasionado pelo acúmulo de H2O2 (Figura 12A), que foi de menor intensidade

em plantas controle não-desidratadas (Figura 12B) e de maior intensidade nas

plantas controle tratadas com H2O2 (Figura 12C). Por outro lado, não se

observou escurecimento dos tecidos em plantas controle tratadas com água

em vez de DAB (Figura 12D). A intensidade de coloração dos discos foliares

das plantas transgênicas foi menor e claramente distinta daquelas das plantas

controle desidratadas (Figuras 12E-H), indicando que as plantas transgênicas

acumularam menos ROS sob condições de estresse por desidratação.

39

Figura 12. Produção de peróxido de hidrogênio em tecido foliar de N. tabacum inoculado com HCL-DAB (1 mg mL-1). Discos foliares foram submetidos ao estresse por desidratação durante 180 min e a produção de H2O2 foi visualizada através da coloração com DAB. A: planta não-transformada submetida à desidratação; B: planta não-transformada túrgida; C: planta não-transformada submetida a desidratação e infiltrada a vácuo com 10 mM de peróxido de hidrogênio por 30 min; D: planta não transformada fresca infiltrada com água; E-H: linhagens transgênicas 4, 8, 9 e 12, respectivamente, submetidas à desidratação.

40

6 DISCUSSÃO

No presente estudo, um membro da família MIP de citros, CsDTIP, foi

identificado em bibliotecas de raízes e folhas de plantas submetidas a estresse

hídrico ou salino e selecionado para caracterização. A comparação entre as

sequências de aminoácidos de CsDTIP e membros da subfamília TIP de

Arabidopsis demonstrou a presença de regiões conservadas, como NPA, que

está relacionada com a seletividade de substrato através dos poros (PARK;

SAIER, 1996; MATHAI; AGRE, 1999). A seletividade de substrato é feita

através de mecanismos de exclusão por polaridade de carga e pelo tamanho

da molécula (FUJIYOSHI et al., 2002; HUB et al., 2008). Através da formação

de pontes de hidrogênio entre as moléculas de água e os resíduos de

asparagina do NPA, as aquaporinas bloqueiam o transporte de prótons,

impossibilitando a formação de pontes de hidrogênio entre as moléculas de

água dentro do canal (MURATA et al., 2000; TAJKHORSHID et al., 2002).

Ainda há MIPs, em células humanas e em vegetais, que também contêm uma

região altamente conservada, Ala-Glu-Phe (AEF) (PRESTON; AGRE, 1991) de

função incerta (ZARDOYA; VILLALBA, 2001). Alguns autores propuseram que

aquaporinas podem funcionar como osmosensores, mas os mecanismos

moleculares envolvidos permanecem ainda desconhecidos (HILL et al., 2004;

MACROBBIE, 2006). Assim, MIPs vegetais são importantes não só para

relações planta-água, mas também para os aspectos fisiológicos, como

resposta a estresses abióticos, bióticos e de sinalização, germinação de

sementes, transporte de nutrientes nas folhas e ajuste na toxicidade de

metalóide (MAUREL et al., 2008).

A análise filogenética demonstrou que CsDTIP pertence à subfamília

TIP, de acordo com a classificação proposta por Johanson et al. (2001), sendo

um ortólogo do gene AtTIP2;1 de Arabidopsis thaliana. Utilizando a técnica de

fusão com GFP e expressão em protoplastos de Arabidopsis, o produto do

gene AtTIP2;1 foi localizado principalmente em tonoplastos de vacúolos líticos

e de armazenamento de proteínas (DANIELS et al., 1996; LIU et al., 2003;

SAITO et al., 2002). Trabalhos iniciais também sugerem que o gene AtTIP2,1

está envolvido com transporte de água (DANIELS et al., 1996) e de ureia (LIU

41

et al., 2003). A ureia é a principal forma de nitrogênio fornecido em fertilizantes

na agricultura, e é retomado por transportadores de ureia localizados na

membrana plasmática de raízes (LIU et al., 2003). O gene AtTIP2;1 pode

transportar ureia por um mecanismo de transporte semelhante ao da água (LIU

et al., 2003). Genes da subfamília TIP, tais como AtTIP2;1 e AtTIP2,3, foram

identificados como funcionais na acumulação de NH3 em situação de déficit de

nitrogênio (LOQUÉ, 2005; GERBEAU et al., 1999, GASPAR et al., 2003; LIU et

al., 2003). Quando aplicado às raízes, a ureia acumula preferencialmente na

parte aérea (GERENDÁS et al., 1998), e quando aplicada em folhas, o

transporte ocorre de acordo com as taxas de transpiração (PALTA et al., 1991).

Assim, provavelmente o transporte de ureia segue o fluxo de massa de água

durante a transpiração, através de uma via comum de transporte para os dois

substratos. Neste caso, MIPs localizadas na membrana plasmática poderiam

facilmente explicar a ligação entre água e a fisiologia de absorção de ureia

pelas raízes, enquanto que MIPs localizadas no tonoplasto podem controlar a

carga e descarga de ureia no vacúolo, possivelmente visando o

armazenamento ou desintoxicação de ureia excessiva (LIU et al., 2003;

MARTINOIA et al., 2007).

A assimilação do nitrogênio é um processo vital que controla o

crescimento e o desenvolvimento das plantas e tem efeitos marcantes sobre a

fitomassa e a produtividade final das culturas. Como parte do metabolismo

global das plantas, o metabolismo do nitrogênio é afetado pela deficiência

hídrica (SHANER; BOYER, 1976). O gene BnTIP2, homólogo dos genes da

subfamília TIP, isolados de sementes de canola (Brassica napus L.), foi

relacionado a etapas distintas do processo germinativo, sendo que sua

expressão foi correlacionada ao alongamento celular associado à protrusão da

radícula (GAO et al., 1999). A expressão de genes de aquaporina associada à

função de transporte de nutrientes também foi demonstrada durante o

desenvolvimento de sementes de uma gimnosperma (Picea abies (L.) H.

Karst.) (HAKMAN; OLIVIUSSON, 2002). Tomado em conjunto, estes estudos

suportam a conclusão de que AtTIP2;1 é capaz de transportar NH3 em adição à

água (LOQUÉ, 2005; LIU et al., 2003).

Sade et al. (2009) demonstraram que a expressão constitutiva de outra

DELTA-TIP, TIP2;2, foi capaz de promover a modulação da transpiração em

42

plantas de tomate mantendo as funções fisiológicas, crescimento e

produtividade em níveis normais mesmo em condição de estresse hídrico e

salino. AtTIPs são reguladas em nível de transcrição por diferentes estímulos

ambientais e, em particular, por alterações no potencial osmótico

(KJELLBOMET et al., 1999; TYERMAN et al., 2002). Genes de aquaporinas,

homólogos de TIP2s de Arabidopsis, expressos em folhas de girassol

(Helianthus annuus), foram identificados em células-guarda dos estômatos,

denominados SunTIP7 e SunTIP20. Foi demonstrado que a variação no nível

de transcritos de SunTIP7 acompanhou as alterações de condutância

estomática (gs) ao longo do dia e aumentou em plantas submetidas à

deficiência hídrica, sugerindo o papel desta aquaporina na modulação da

abertura e fechamento estomático, contribuindo assim para efluxo de água a

partir da célula guarda (SARDA et al., 1997).

A técnica de PCR em tempo-real foi utilizada para investigar o perfil de

expressão do gene CsDTIP em tecido foliar e de raiz de plantas de limoeiro

‗Cravo‘ e tangerineira ‗Sunki Maravilha‘, em situação controle e de deficiência

hídrica. Os resultados revelaram uma indução do gene nos dois órgãos, assim

como relatado para AtTIP2;1 em Arabidopsis (HUNTER et al., 2007;

GATTOLIN et al., 2009). Robinson et al. (1996), avaliando os níveis de

expressão de genes homólogos de MIPs em plantas de Arabidopsis,

constataram que os primeiros sinais de expressão ocorrem nas folhas das

plantas submetidas a algum tipo de estresse. No presente estudo, observou-se

que plantas de tangerineira ‗Sunki Maravilha‘ apresentaram maior expressão

do gene na raiz, quando comparado ao limoeiro ‗Cravo‘. Em folhas, a

expressão do gene sob deficiência hídrica foi maior em limoeiro ‗Cravo‘. Neves

(2011) constatou, através da análise de área foliar de plantas de limoeiro

‗Cravo‘ e tangerineira ‗Sunki Maravilha‘ submetidas a condições de deficiência

hídrica (potencial hídrico foliar de -1,5 MPa) e controle (potencial hídrico foliar

de -0,25 MPa), que as plantas de limoeiro ‗Cravo‘ apresentaram crescimento

em ambos os tratamentos, enquanto as plantas de tangerineira ‗Sunki

Maravilha‘ não apresentaram crescimento sob deficiência hídrica. A correlação

entre os níveis de expressão de CsDTIP e crescimento da parte aérea em

limoeiro ‗Cravo‘ sob condições de deficiência hídrica sugere que o gene possui

43

um papel importante na adaptação das plantas à seca, provavelmente por estar

envolvido no processo de transporte de água e/ou nitrogênio.

A inserção e a expressão do gene CsDTIP foi confirmada nas plantas

transgênicas de N. tabacum via teste histoquímico de GUS, análise de PCR e

pela técnica de RT-PCR. Diferenças nos níveis de expressão de CsDTIP foram

observadas entre as diferentes linhagens transgênicas avaliadas.

Possivelmente esse resultado ocorreu devido aos efeitos de posição ou

integração de diferentes números de cópias do T-DNA nas linhagens

transgênicas. A inserção do gene CsDTIP foi confirmada nas plantas

transgênicas de tangerineira ‗Cleópatra‘ e citrumeleiro ‗Swingle‘ via teste

histoquímico de GUS. O número de escapes foi elevado para transformação de

citros, sendo tangerineira ‗Cleópatra‘ mais sensível ao antibiótico canamicina e

apresentando menor número de brotos transformados quando comparado ao

citrumeleiro ‗Swingle‘. O elevado número de escapes tem sido relatado como

um problema em transformação genética de citros (MOORE et al., 1992; PEÑA

et al., 1995; GUTIÉRREZ et al., 1997; ALMEIDA et al., 2003; SCHINOR et al.,

2006; SILVA et al., 2009; MENDES et al., 2009). A frequência de escapes

elevada pode ser atribuída à proteção que as células transformadas fazem às

células não-transformadas que as circundam contra a ação de agentes

seletivos (DOMINGUES et al., 2004). A persistência da Agrobacterium nos

explantes por um longo período após o co-cultivo pode favorecer a formação

de brotos falsos positivos ou quiméricos (COSTA et al., 2002). Além desses

fatores, o número de escapes e a eficiência da transformação genética estão

associados com a ação dos agentes seletivos (MENG et al., 2007).

Resposta a estresses abióticos exigem a ação coordenada de diversos

genes, incluindo os da família MIP. O ensaio de tolerância a desidratação

demonstrou que as quatro linhagens transgênicas avaliadas conservaram mais

água nas células em comparação à planta controle. Entretanto, as linhagens de

expressão gênica intermediária (L8 e L12) foram mais resistentes à

desidratação do que as linhagens com extremos de expressão gênica (L9 e

L4), sugerindo que expressões muito acentuadas de CsDTIP podem

desencadear algum tipo de regulação pós-transcricional que culmina em

fenótipos similares aqueles conferidos pela baixa expressão do transgene.

Diversos trabalhos correlacionam a influência da expressão de aquaporinas ao

44

estresse hídrico (BAIGES et al., 2002; MARTRE et al., 2002; MAUREL et al.,

2008; ZHANG et al., 2007), seja na indução ou na repressão. Na indução, os

genes dessa família estão relacionados com o aumento da permeabilidade da

membrana ao transporte da água em condições de deficiência hídrica

(YAMADA et al., 1997). Na repressão, estes genes podem conservar a água da

célula durante períodos de estresse hídrico (LI et al., 2000; SMART et al.,

2001). Assim, observa-se que no presente trabalho a expressão do gene

CsDTIP auxiliou na conservação da água nas células da planta, em todas as

linhagens transgênicas avaliadas. Trabalhando com genes da mesma

subfamília de CsDTIP, Willigen et al. (2004) observaram que durante o

processo de desidratação as plantas de Eragrostis nindensis Ficalho & Hiem

sofreram diversas modificações anatômicas, bioquímicas e funcionais,

associados ao aumento da expressão de TIP3;1 nos vacúolos dos tecidos

desidratados. Ainda analisando pesquisas que correlacionam membros da

subfamília TIP com a tolerância à seca, Peng et al. (2007) superexpressaram

uma aquaporina (TIP1) em Arabidopsis e observaram um aumento significativo

no crescimento da planta quando submetida ao estresse hídrico. Assim, esses

trabalhos revelam que genes ortólogos de CsDTIP possuem um papel no

crescimento e na tolerância à deficiência hídrica.

As linhagens transgênicas também foram avaliadas quanto ao acúmulo de

H2O2 sob condições de desidratação. As plantas devem manter ROS em

baixos níveis a fim de minimizar os danos e a consequente morte celular

causada pelo estresse oxidativo (HARB et al., 2010; FOYER; SHIGEOKA,

2011). O acúmulo de ROS depende principalmente de um balanço entre a sua

produção e simultânea extinção por antioxidantes não-enzimáticos (ex., ácido

ascórbico, GSH e prolina) e enzimas extintoras de espécies reativas de

oxigênio (SOD, POD, PPO e CAT) (BUCHANAN; BALMER, 2005). O DAB tem

sido comumente utilizado para detectar a presença de peróxido de hidrogênio,

que é considerado a primeira resposta de plantas a estresses abióticos, sendo

possível visualizar coloração diferenciada na presença deste composto (KIM et

al., 2008; SCANDALIOS, 2005). No presente estudo, plantas de N. tabacum

transformadas com o gene CsDTIP acumularam menos H2O2 do que as plantas

controle sob condições de desidratação, sugerindo que CsDTIP contribui para

45

a detoxificação de H2O2 provavelmente por facilitar a sua difusão para o

vacúolo, que possui um eficiente sistema antioxidante (BIENERT et al., 2006).

46

7 CONCLUSÕES

CsDTIP é um ortólogo de AtTIP2;1 de Arabidopsis;

A indução da expressão de CsDTIP em folhas e raízes de plantas

cítricas submetidas à deficiência hídrica, bem como a maior tolerância à

desidratação das plantas transgênicas de tabaco, confirmam a função

do gene em mecanismos de tolerância à seca;

As plantas transgênicas foram mais tolerantes ao estresse por

desidratação devido ao baixo acúmulo de ROS, o que sugere uma

atuação da CsDTIP na translocação de H2O2 para o vacúolo

contribuindo para a sua detoxicação;

O gene CsDTIP pode ser empregado em trabalhos de transformação

genética de variedades porta-enxerto de citros, visando a obtenção de

plantas mais tolerantes à seca.

47

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Análise funcional do gene CsDTIP e seu emprego em