MINISTRIO DA EDUCAO UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS INSTITUTO DE
BIOLOGIA CURSO DE CINCIAS BIOLGICAS
ANLISE MICROBIOLGICA DE BARRAS DE CEREAIS E CEREAIS MATINAIS,
COMERCIALIZADOS NA CIDADE DE PELOTAS - RS
FERNANDA CORRA DA SILVA VASCONCELLOS
MONOGRAFIA DE CONCLUSO DE CURSO
Universidade Federal de Pelotas Campus Universitrio s/n Caixa
Postal 354, CEP 96010-900 Pelotas RS Brasil
2006
FERNANDA CORRA DA SILVA VASCONCELLOS
ANLISE MICROBIOLGICA DE BARRAS DE CEREAIS E CEREAIS MATINAIS,
COMERCIALIZADOS NA CIDADE DE PELOTAS - RS
Monografia
apresentada
Universidade
Federal de Pelotas, sob a orientao da Prof. Dra. Gladis Aver
Ribeiro, como parte das exigncias para obteno do ttulo de Bacharel
Biolgicas. e Licenciada em Cincias
PELOTAS Rio Grande do Sul Brasil Outubro de 2006
Banca ExaminadoraProf. Dra. Gladis Aver Ribeiro Prof. Msc.
Adriane Maria Delgado Menezes Msc. Helen Silveira Coimbra Prof.
Dra. Patrcia da Silva Nascente
Dedico
Aos meus pais e ao meu irmo.
AGRADECIMENTOSA Deus e a Nossa Senhora, pela minha vida e
proteo; Aos meus pais, Neister e Elizabeth, pelo apoio e incentivo,
nos momentos complicados e de incerteza na minha vida; Ao meu irmo
Gabriel, pela amizade, companheirismo, e alegrias que me
proporcionou incansavelmente; A minha Dinda Martha por ser minha
segunda me; A minha orientadora Prof. Dra. Gladis Aver Ribeiro,
pela pacincia, amizade e incentivo pesquisa; Aos meus amigos e
colegas de aula Alessandra, Dvia, Joo, Michele e Taciane pela
amizade, incentivo e descontrao em todos os momentos durante o
caminho percorrido na graduao; Aos colegas de laboratrio Natlia,
Rafael e Patrcia, que me auxiliaram a dar os meus primeiros passos
dentro do laboratrio de Microbiologia; As colegas de laboratrio
Simone, companheirismo; A todos que me incentivaram direta ou
indiretamente, para realizao da graduao e finalmente deste
trabalho. Rosana e Vanessa pela amizade e
S em Deus encontrarei glria e salvao. Ele meu rochedo protetor,
meu refgio est Nele. Sl 61- 8
RESUMOOs alimentos saudveis e prontos esto com uma forte
tendncia de consumo, devido necessidade de uma alimentao balanceada
e de um bem-estar fsico e emocional. Com isso, as barras de cereais
e os cereais matinais surgiram com a finalidade de auxiliar na
alimentao equilibrada fornecendo fibras, carboidratos e protenas
com baixo teor de calorias e gorduras. Portanto, para verificao
microbiolgica das barras de cereais e dos cereais matinais, foram
analisadas 20 amostras de barras de cereais e dez de cereais
matinais, no perodo de maro a setembro de 2005, obtidos nos
supermercados da cidade de Pelotas, a fim de analisar a presena dos
microrganismos Bacillus cereus, Coliformes Termotolerantes e
Salmonella spp. Para anlise de Bacillus cereus foi utilizado o meio
de cultura gar Manitol Gema de Ovo Polimixina (MYP), sendo as
colnias caractersticas estocadas em gar Nutriente para posteriores
provas bioqumicas, para Coliformes Totais e Termotolerantes, os
meios de cultura utilizados foram o Caldo Lactosado para o teste
presuntivo, o Caldo Lactose Bile Verde Brilhante (CLBVB) para o
teste confirmativo de Coliformes Totais e o Caldo EC para o teste
confirmativo de Coliformes Termotolerantes e para anlise de
Salmonella spp. foram utilizados os caldos Rappaport, Tetrationato
e Selenito e os gar HE e XLD para o isolamento de colnias, dos
quais as tpicas foram submetidas as provas bioqumicas. Todas as 20
amostras de barras de cereais estavam dentro dos padres previstos
pela Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (ANVISA), ou seja, para
Bacillus cereus o limite de 5 x 102 UFC.g -1, para Coliformes
Termotolerantes de 5 x 10 NMP.g -1 e para Salmonella spp. a
ausncia. J para os cereais matinais, apenas uma amostra (10%)
estava contaminada com Bacillus cereus (1,0 x 104 UFC.g -1), no
qual o limite de 5 x 103 UFC.g -1. Com os resultados encontrados a
partir das amostras analisadas do comrcio de Pelotas, pode-se
observar que estes alimentos no oferecem risco a sade do
consumidor. Palavras-Chaves: barra de cereais; cereais matinais;
Bacillus cereus; Coliformes Termotolerantes; Salmonella spp.
ABSTRACTThe healtly and prepared foods theyre with strong trend
of consumption, just of necessity a balanced alimentations,
physical and emotion welfaire. With this, the cereals bars and
breakfast cereals had appeared with the purpose of assisting in
equilibrate alimentation supplying fibres, carbohydrates and
proteins with low calories and fats. Therefore, for verification of
the cereals bars and breakfast cerals had been analysed 20 samples
of cereals bars and ten of breakfast cereals, between March a
September 2005, obtained of supermarket of the Pelotas city, with
objective to analyze the presence Bacillus cereus, Thermotolerant
Coliform and Salmonella spp. microrganisms. For analyse of Bacillus
cereus was used Agar Manitol Gema de Ovo Polimixina (MYP), where
characteristics colonys thrust in Agar Nutriente for backsides
biochemistry tests, for Thermotolerant and Total Coliforms was used
Lactosado Broth for the presuntive test, Brilliant Green Lactose
Bile Broth for confirmative test of Total Coliform and EC Broth for
confirmative test of Thermotolerant Coliform and to analyse
Salmonella spp. was used Rappaport, Tetrationato and Selenito
Broths and HE and XLD Agar for colonys isolation, at the typical
colonys went submited the biochemistry tests. All the 20 samples of
cereals bars was within expected standart of Agncia Nacional de
Vigilncia Sanitria (ANVISA), or be, for Bacillus cereus this limit
is this 5x102 UFC. g-1, for Thermotolerant Coliform is this 5x10
NMP.g -1 and for Salmonella spp. is this absence. Now for breakfast
cereals, just one sample (10%) was contamined with Bacillus cereus
(1,0x104 UFC. g-1), in which the limit is this 5x 103 UFC. g-1.
Finally, these results demonstrated these foods dont offer to risk
consumers health. Key Words: Cereals bars; Breakfast cereals;
Bacillus cereus; Thermotolerant Coliform; Salmonella spp.
LISTA DE FIGURASFigura 1: Anlise de Coliformes Totais e
Termotolerantes ..............................21
Figura 2: Anlise de Bacillus
cereus....................................................................25
Figura 3: Deteco de Salmonella
spp................................................................28
Figura 4 a: Provas bioqumicas realizadas para identificao de
Bacillus cereus encontrado nas amostras positivas.
..................................................... 30
Figura 4 b: Provas bioqumicas realizadas para identificao de
Bacillus cereus encontrado nas amostras positivas.
..................................................... 31
Figura 5: Fluxograma do processo de fabricao de barras de
cereais ........36
Figura 6: Fluxograma do processo de fabricao de cereais matinais
..........37
LISTA DE TABELASTabela 1: Reaes bioqumicas caractersticas de
Escherichia coli nos testes de IMViC
...................................................................................................................20
Tabela 2: Reaes bioqumicas caractersticas de Bacillus cereus
..............24
Tabela 3: Contagem de Bacillus cereus nas amostras positivas
....................29
SUMRIO
RESUMO
....................................................................................................................vi
ABSTRACT
...............................................................................................................vii
LISTA DE FIGURAS
...............................................................................................viii
LISTA DE
TABELAS.................................................................................................ix
1. INTRODUO
....................................................................................................11
2. OBJETIVO
...........................................................................................................13
3. REVISO DE LITERATURA
.............................................................................14
3.1 Qualidade e Segurana Alimentar
..........................................................14 3.2
Salmonella
spp...........................................................................................15
3.3 Colifo rmes Totais e
Termotolerantes......................................................16
3.4 Escherichia coli
..........................................................................................16
3.5 Bacillus cereus
...........................................................................................17
4. MATERIAL E MTODOS
..................................................................................18
4.1 Coleta e procedimento das
anlises.......................................................18
4.2 Anlise de Coliformes Totais e
Termotolerantes..................................18 4.3 Anlise da
presena de Escherichia
coli................................................19 4.4 Contagem
de Bacillus cereus
..................................................................22
4.5 Deteco de Salmonella
spp...................................................................26
5. RESULTADOS
....................................................................................................29
6.
DISCUSSO........................................................................................................32
7.
CONCLUSO......................................................................................................35
8.
REFERNCIAS...................................................................................................38
9. ANEXOS
..............................................................................................................41
1. INTRODUOA preocupao do consumidor, com a qualidade dos
alimentos e a conseqente reduo dos riscos sade vem aumentando ao
longo dos anos. A segurana alimentar, que tem crescido em
importncia juntamente com os novos processos de industrializao e
com as novas tendncias do comportamento do consumidor, entendida
como a garantia do consumidor em adquirir um alimento que possua
como caracterstica intrnseca a sanidade, bem como atributos
nutricionais e sensoriais desejveis (BENEVIDES et al., 2004). Entre
as qualidades desejveis que se devem relacionar com os alimentos
est a iseno de microrganismos infecciosos. Pode no ser possvel
conseguir uma tolerncia certa para todos os microrganismos com
alguns procedimentos corretos de fabricao, a produo de alimentos
com um nmero mais baixo possvel de carga microbiana o objetivo
desejvel (JAY, 1992).
Em um mundo faminto, a ingesto diria dos cereais pode ser a
forma mais eficaz de obter nutrientes que cobrem as necessidades de
energia e de crescimento, partindo de recursos alimentcios escassos
e todos os povos da Terra tm uso destes produtos com mais propagao
que de qualquer outro alimento (ICMSF, 1980).
A superfcie externa dos gros de cereais que se colhe, conserva
alguns microrganismos adquiridos durante seu desenvolvimento, mas
os microrganismos contaminantes procedem do solo, dos insetos e de
outras fontes. Os gros de cereais recm colhidos contm desde alguns
mil a vrios milhes de bactrias por grama e desde nenhum a vrias
centenas de mil de esporos de fungos (FRAZIER, et al., 1993). Todos
os cereais do campo esto expostos a uma grande variedade de
microrganismos procedentes do p, gua, plantas enfermas, insetos,
solo, fertilizantes e defecao de animais (ICMSF, 1980).
de se esperar que a composio do trigo, do centeio, do milho e
dos gros de cereais estejam contaminados pelos microrganismos do
solo, pelo ambiente dos locais onde se armazenam estes gros e por
outros microrganismos recolhidos
durante o tratamento destes produtos (JAY, 1992). Por isso, a
melhor maneira de evitar o crescimento microbiano nos gros mant-los
secos (ICMSF, 1980).
Praticamente todo carboidrato ou substncia derivada de
carboidratos est sujeito utilizao como substrato para o crescimento
microbiano, basicamente como fonte de energia. Por outro lado, a
utilizao, pelos microrganismos, dos produtos resultantes da
hidrlise das protenas, bem como de outras substncias nitrogenadas
no proteicas so os principais responsveis pelas marcantes alteraes
dos alimentos em processos de deteriorao. Ao lado dos
microrganismos envolvidos em processos de deteriorao, tambm existem
inmeras espcies patognicas que podem contaminar os alimentos e, em
alg umas situaes, encontrar neles um substrato adequado para a sua
proliferao (ROITMAN et al., 1988).
Dentre os microrganismos envolvidos no processo de contaminao
dos gros de cereais, destacam-se o Bacillus cereus, Coliformes
Totais e Termotolerantes e a Salmonella spp., previstos pela Agncia
Nacional de Vigilncia Sanitria (ANVISA), dos quais as formas
virulentas podem causam ao homem diarria, nuseas, dores abdominais
e febre podendo levar a morte em indivduos imunodeprimidos.
Assim, duas fontes destes microrganismos so as barras de cereais
e os cereais matinais que so produtos feitos com os mais diversos
gros, como o arroz, o milho, o trigo, a aveia podendo ser
adicionado o mel, as frutas desidratadas, a castanha, o amendoim e
o chocolate dentre tantos componentes.
Portanto, as barras de cereais e os cereais matinais so produtos
que satisfazem o paladar dos consumidores que buscam uma alimentao
equilibrada, gostosa e saudvel, aliando ainda uma alimentao rica em
fibras e carboidratos com baixa quantidade de calorias e
gorduras.
2. OBJETIVOO objetivo deste trabalho foi de avaliar as condies
microbiolgicas de barras de cereais e de cereais matinais,
comercializados nos supermercados da cidade de Pelotas, RS Brasil,
atravs da investigao dos microrganismos Bacillus cereus, Coliformes
Fecais (Termotolerantes) e Salmonella spp.
3. REVISO DE LITERATURA
3.1 Qualidade e Segurana AlimentarA educao, a informao e a
motivao de todos que manipulam os alimentos, na indstria, no
comrcio e nos restaurantes, constituem os pontos essenciais de uma
boa poltica de preveno. De uma maneira mais geral, todo o
incremento de conscincia coletiva em matria de higiene no pode ser
mais do que benfico para a sade (BOURGEOIS et al., 1988).
A alimentao dentro dos padres higinicos satisfatrios uma das
condies essenciais para a promoo e manuteno da sade, sendo que a
deficincia nesse controle um dos fatores responsveis pela ocorrncia
de surtos de doenas transmitidas por alimentos (OLIVEIRA et al.,
2003).
Os microrganismos esto intimamente associados com a
disponibilidade, a abundncia e a qualidade do alimento para o
consumo humano. Alimentos so facilmente contaminados com
microrganismos na natureza, durante manipulao e processamento. Aps
ter sido contaminado, o alimento serve como meio para o crescimento
de microrganismos, os quais se tiverem condies de crescer, podem
mudar as caractersticas fsicas e qumicas desse alimento, causando
sua deteriorao (PELCZAR et al., 1996).
O controle sanitrio dos alimentos se constitui em um conjunto de
normas e tcnicas utilizadas para verificar se os produtos
alimentcios esto sendo produzidos, manipulados e distribudos de
acordo com as boas prticas de manipulao e fabricao de alimentos.
Quando isto no obedecido, muitos microrganismos patognicos como
Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella, Bacillus
cereus, por exemplo, podem contaminar o alimento, tornando este um
fator de risco a sade do consumidor. A presena de coliformes
geralmente considerada indicadora de ms condies higinico-sanitrias
(BENEVIDES et al., 2004).
A anlise microbiolgica dos alimentos para se verificar a presena
de microrganismos fundamental para se conhecer as condies de
higiene nas quais estes alimentos foram preparados (BRUM &
RIBEIRO, 2001).
3.2 Salmonella spp.Os insetos, os roedores, os pssaros, as
pessoas podem contaminar os gros com Salmonella, Escherichia,
Shigella ou Klebsiella. Destes gneros, as salmonelas so as que
trazem mais problemas (BROOKS, 1969 apud ICMSF, 1980). O gnero
Salmonella spp. compreende espcies de bactrias na forma de bacilos
Gramnegativos, anaerbicos facultativos e no formadores de esporos.
Seu habitat normal o trato intestinal dos seres humanos e muitos
animais. (TORTORA et al., 2003).
As infeces humanas produzidas por salmonelas em geral ocorrem
por ingesto de alimentos, gua ou leite contaminados por fezes
humanas ou de animais. As salmonelas so primariamente patgenos de
animais (aves domsticas, sunos, pssaros, ovinos), os quais so as
principais fontes de salmonelose no-tifide em humanos (KONEMAN et
al., 2001).
A Salmonella um dos microrganismos mais envolvidos em casos e
surtos de doenas de origem alimentar em diversos pases, inclusive o
Brasil. A sua patogenicidade varia de acordo com o tipo sorolgico,
idade e condies de sade do hospedeiro. As doenas causadas costumam
ser divididas em febre tifide, febre entrica e enterocolite ou
salmonelose. (FRANCO et al., 2001 apud BALIONI, 2003).
3.3 Coliformes Totais e Termotolerantes (Fecais)
O grupo dos Coliformes so definidos como bastonetes
Gram-negativos aerbios ou anaerbios facultativos, no formadores de
endsporos. Como algumas bactrias do grupo no so enterobactrias, e
sim bactrias comumente encontradas em amostras de plantas e solo,
muitos padres para alimentos e gua especificam a identificao de
coliformes termotolerantes. O coliforme termotolerante predominante
a Escherichia coli, que constitui uma grande proporo da populao
bacteriana
entre coliformes termotolerantes e no termotolerantes. Em
condies normais os coliformes no so por si s patognicos, embora
algumas linhagens possam causar diarrias e infeces urinrias
oportunistas (TORTORA, et al., 2003).
Em alimentos o ndice de coliformes totais utilizado para avaliar
as condies higinicas, de forma que altas contagens significam
contaminao ps-
processamento, limpezas e sanificaes deficientes (ZARDEH 2001
apud MATA, 2003).
3.4 Escherichia coliEscherichia coli a espcie predominante entre
os diversos microrganismos anaerbios facultativos que fazem parte
da microbiota intestinal de animais de sangue quente. O significado
da presena de E. coli em um alimento deve ser avaliado sob dois
ngulos. Inicialmente, E. coli, por ser uma enterobactria, uma vez
detectada no alimento, indica que esse alimento tem uma contaminao
microbiana de origem fecal e, portanto est em condies higinicas
insatisfatrias e outro aspecto a ser considerado que diversas
linhagens de E. coli so comprovadamente patognicas para o homem e
para os animais (FRANCO et al., 1996).
Geralmente o agente E. coli aceito como indicador de contaminao
e pode sugerir a possvel ocorrncia e o crescimento de muitos outros
patgenos mesfilos e entricos (GILL et al, 1998 apud MATA,
2003).
3.5 Bacillus cereus
O Bacillus cereus uma bactria grande, Gram-positiva, formadora
de endsporos que muito comum no solo e na vegetao, e geralmente
considerada inofensiva. Contudo, ela foi identificada como causa de
surtos de doena veiculada por alimentos (TORTORA, et al.,
2003).
As
substncias
alimentares
desidratadas
no
so
estreis,
alguns
microrganismos e particularmente, alguns esporos bacterianos
sobrevivero ao
processo de desidratao. Os esporos bacterianos so freqentemente
encontrados em cereais e outros alimentos (HOBBS, & ROBERTS.,
1993).
O B. cereus, possui ampla distribuio geogrfica, e pode ser
encontrado em solos, gua e p ambiental, foi isolado de uma
variedade de alimentos, incluindo verduras, carnes, cereais, leite
fresco pasteurizado e leite em p. A freqncia de intoxicao alimentar
causada por B. cereus, doena mediada por uma toxina, aumentou nos
ltimos anos (KONEMAN et al., 2001).
Existem dois tipos reconhecidos de intoxicaes alimentares
causadas por B. cereus: o diarrico e o emtico. Ambos so
autolimitantes e a recuperao ocorre dentro de 24h. O B. cereus
produz toxinas diarricas durante o crescimento no intestino delgado
humano, enquanto as toxinas emticas so pr formadas no alimento. O
tipo diarrico causado por uma enteroxina diarrica, essa toxina
inativada a 56C por 30min, enquanto que o tipo emtico causado por
um peptdeo bastante resistente ao calor (126C por 90min). Os
sintomas da intoxicao alimentar diarrica so: diarria aquosa, dores
abdominais, nuseas e raramente vmitos e os sintomas da intoxicao
alimentar emtica so: nuseas, vmitos e dores abdominais com
possibilidade de diarria (FORSYTHE, 2002).
4. MATERIAL E MTODOS4.1 Coleta e procedimento das anlises
As barras de cereais e os cereais matinais foram obtidos em
supermercados da cidade de Pelotas e transportados na prpria
embalagem at o laboratrio de Microbiologia do Departamento de
Microbiologia e Parasitologia (DEMP), UFPel para serem analisados.
Cada barra de cereal contm 25g, logo uma barra foi destinada para a
anlise de Coliformes, outra foi para o teste de Salmonella spp. e
outras duas barras (50g) foram para o teste de Bacillus cereus.
Para os cereais matinais foram pesados 25g para a anlise de
Coliformes, 25g para Salmonella spp. e 50g para a anlise de
Bacillus cereus. Foram analisados no total 30 amostras, sendo que
20 foram de barras de cereais e dez de cereais matinais, no perodo
de maro a setembro de 2005. Antes da realizao das anlises o local e
as embalagens foram desinfetados com lcool 70.
4.2 Anlise de Coliformes Totais e TermotolerantesA metodologia
utilizada foi baseada em SILVA et al. (1997). As anlises de
Coliformes Totais e Termotolerantes foram feitas atravs da tcnica
do Nmero Mais Provvel (NMP). Uma barra de cereal e 25g de cereal
matinal foram
homogeneizados, separadamente, com 225mL de gua peptonada 0,1% e
submetidos a diluies de 10-1 a 10-4 em tubos com 9mL de gua
peptonada. Depois de realizada as diluies, foi inoculado um mL de
cada diluio em trs tubos de Caldo Lactosado (CL) c om tubos de
Durhan, que foram mantidos a 35C por no mximo 48h, sendo esta etapa
presuntiva. Os tubos que apresentaram turbidez e formao de gs
dentro dos tubos de Durhan foram considerados positivos, e destes
foram retiradas de uma a duas gotas com uma ala de platina e
inoculadas em tubos com Caldo Lactose Bile Verde Brilhante (CLBVB)
com tubos de Durhan e incubados a 35C por 48h. Para confirmao de
coliformes totais, aps este perodo foram considerados positivos
aqueles tubos que apresentaram a presena de gs e turbidez do meio
de cultura, sendo expressos em NMP.g -1. A partir dos tubos
positivos de
coliformes totais foram retiradas de uma a duas gotas do caldo e
inoculadas em tubos com Caldo EC contendo tubos de Durhan que foram
incubados em banho Maria a 45,5C por 48h. Aps este perodo foi
observado a turbidez e produo de gs, sendo estes tubos positivos
para coliformes termotolerantes, sendo o resultado expresso em
NMP.g-1 (Figura 1).
4.3 Anlise de presena de Escherichia coliDe cada tubo de Caldo
EC positivo, foi retirada uma alada do meio e estriada em placas
contendo gar Eosina Azul de Metileno (EMB) que foram incubadas a
35C por 24h para a anlise de colnias tpicas de E. coli (nucleadas
com centro preto, com ou sem brilho metlico).
Havendo colnias tpicas, foram transferidas duas colnias isoladas
de cada placa para tubos contendo gar Nutriente, que foram
incubadas a 35C por 48h para posteriores provas bioqumicas de
indol, motilidade, produo de H2S, MR-VP e citrato (IMViC) (Figura
1). Todos estes testes podem ser inoculados a partir de uma nica
alada de cultura, porm, o teste de citrato deve ser o primeiro,
para evitar a introduo de compostos dos outros meios.
Com uma agulha de platina foi inoculada uma alada com inculo bem
leve da cultura no tubo com gar Citrato de Simmons, incubando a 35C
por 72/96h e se observou o crescimento bacteriano (teste positivo)
ou no (teste negativo). O outro teste realizado foi com o gar
semi-slido SIM, para verificao da produo de indol, motilidade e
produo de H2S, que utilizando a mesma agulha de platina, foi
semeado no gar que ser incubado a 35C por 24h. Depois deste perodo
foi verificado a motilidade e produo de H2S e para verificao da
produo de indol foi adicionado ao meio de cultura cinco gotas do
reagente de Kovacs para observar se houve a degradao do aminocido
Triptofano e produo de Indol, o que se observa pelo desenvolvimento
de um anel vermelho na superfcie do meio (teste positivo) ou se o
anel permanecer amarelo da mesma cor do reagente (teste negativo).
Para a realizao dos testes de Vermelho de Metila (VM) e
Voges-Proskauer (VP), utilizou-se dois tubos com o Caldo MR-VP que
foram incubados a 35C por 48h para o teste de VP e 96h para o teste
de VM. Para o teste de VP, foi adicionado nos
tubos 0,6 mL de soluo de a naftol 5% e agitou-se, adicionando em
seguida 0,2mL de KOH 40%, onde deve ser observado por at uma hora o
desenvolvimento de uma cor rosa no meio de cultura (teste
positivo), a permanncia do meio na cor do reagente marrom ser teste
negati vo. Para o teste de VM foram adicionadas cinco gotas de
soluo de vermelho de metila, sendo observado imediatamente uma
colorao vermelha do meio sendo o teste positivo. As reaes
bioqumicas no teste de IMViC caractersticas para E. coli esto
apresentadas na Tabela 1.
Tabela 1: Reaes bioqumicas caractersticas de Escherichia coli
nos testes de IMViC. IMViC CITRATO INDOL SIM MOTILIDADE H2S VP
MR-VP VM
-
+/-
+/-
-
+
FONTE: MATA, 2003
10-1 25 g da amostra + 225mL de gua peptonada Homogeneizao 1
mL
10-2 1 mL
10-3 1 mL
10-4
9 mL H2O peptonada 1 mL Teste Presuntivo: Caldo Lactosado 1 mL 1
mL 1 mL
Incubao a 35C/48 h
Teste 1 alada confirmativo Coliformes Teste Totais: Caldo
confirmativo 1 alada Lactose Bile Coliformes Termotolerantes: Verde
Brilhante Caldo EC Tabela Tabela NMP NMP Teste confirmativo E. coli
gar EMB Incubao a 45,5C/48h Incubao a 35C/48h
gar Nutriente Provas Bioqumicas
Citrato MR
VP
SIM
Figura 1 Anlise de Coliformes Totais e Termotolerantes (adaptado
de SILVA et al., 1997).
4.4 CONTAGEM DE Bacillus cereus
A metodologia utilizada foi baseada em SILVA et al, (1997). A
contagem de Bacillus cereus foi feita atravs da tcnica de Unidade
Formadora de Colnia (UFC). Duas barras de cereais e 50g de cereal
matinal foram homogeneizadas, separadamente, com 450 mL de gua
peptonada 0,1% e as diluies foram feitas da 10-1 a 10-3 em tubos
com 9mL de gua peptonada. Foi inoculado um mL da primeira diluio
distribudas em quatro placas de gar manitol gema de ovo polimixina
(MYP) espalhando o inculo com ala de Drigalski at que o meio
absorvesse o inculo. As demais diluies foram semeadas em duplicata
com 0,1mL em cada placa e o inculo espalhado com a ala de
Drigalski. recomendado que se utilize uma ala estril para cada
diluio, porque a flambagem com lcool no eliminar os esporos. As
placas foram incubadas a 35C por 48h (Figura 2).
Logo aps foram selecionadas placas com 10 a 100 colnias,
contendo no mais do que 30 colnias tpicas, ou seja, esfricas com a
colorao rsea leitosa, com bordas perfeitas, planas, secas, rodeadas
por um grande halo de precipitao devido reao da lecitinase sobre a
gema de ovo. As colnias suspeitas de serem B. cereus foram
repicadas em gar Nutriente e incubadas a 35C por 48h para
posteriores provas bioqumicas (Figura 2).
Teste de decomposio de tirosina: Foram feitas estrias com o
inculo da ala de platina em placas de gar Tirosina incubando a 35C
por at 10 dias para observao do desenvolvimento de uma zona clara e
transparente de decomposio e dissoluo de cristais de tirosina
(teste positivo) podendo o meio ficar com uma colorao castanha.
Teste de Voges-Proskauer (VP): Foi inoculado por disperso no
caldo VP e incubado a 35C por 48h, adicionando 0,6mL de a naftol 5%
e 0,2mL de KOH 40%, agitando o tubo e deixando descansar por uma
hora aparecendo a cor vermelha (teste positivo) e a permanncia do
meio na cor amarela (teste negativo).
Teste de reduo do nitrato : Foi inoculado no tubo com o caldo
nitrato e incubado a 35C por 24h e aps este perodo adicionou-se de
3 a 4 gotas do reativo de Zambelli e tambm de 3 a 4 gotas de
Hidrxido de Amnia, verificando o desenvolvimento da cor laranja
(teste positivo).
Teste de hidrlise de gelatina : Foi transferida uma alada da
cultura para as placas de gar Gelatina, fazendo uma estria na
superfcie do meio incubando a 30C por 24h, logo aps cobriu-se toda
a superfcie do gar com o reagente de Frazier observando o
desenvolvimento de um halo transparente ao redor da estria da
cultura (teste positivo) ou ausncia deste halo (teste
negativo).
Teste de motilidade em meio SIM : Foi inoculado com uma picada
no meio e incubado a 35C por 48h, verificando o deslocamento do
crescimento em regies fora da picada, o B. cereus geralmente
mvel.
Teste de verificao de crescimento rizide: Foram utilizadas
placas com gar Nutriente onde foi depositada uma alada da cultura
bem no centro do meio, sem espalhar, incubando a 35C por 48h tendo
que observar se a colnia apresentou crescimento rizide,
caracterstico das cepas da variedade mycoides.
Teste do manitol: Foi inoculada uma alada no tubo com o caldo
manitol e incubou-se a 35C por 48h e aps este perodo observou-se a
cor do manitol (roxa) que permaneceu inalterada (teste positivo) o
u caso tenha ficado amarelo (teste negativo). As cepas do Bacillus
cereus no fermentam o manitol.
Teste de Lecitinase: Foram utilizadas placas de gar MYP onde foi
depositada uma alada da cultura no centro do meio, incubando a 35C
por 48h. As colnias de Bacillus cereus so caracterizadas por um
grande halo de precipitao, indicando a degradao da lecitina.
Teste da atividade hemoltica: Foi repicada a cultura por
esgotamento em gar Sangue de carneiro incubando a 35C por 48h onde
se observou a formao
do halo devido atividade hemoltica, sendo as cepas de B. cereus
fortemente hemolticas.
Tabela 2: Reaes bioqumicas caractersticas do Bacillus cereus.
Caractersticas Degradao de Tirosina Bacillus cereus +
Reao de VP
+
Reduo do Nitrato
+
Hidrlise de Gelatina
+
Motilidade
+
Crescimento Rizide
+
Reduo do Manitol
-
Reao de Lecitinase
+
Atividade Hemoltica+ positivo - negativo
+
25 g da amostra+ 225mL de gua peptonada Homogeneizao
10 -1 1mL
10-2 1mL
10-3
gar Manitol Gema de Ovo Polimixina
9mL H2O 0,3mL0,3mL0,2mL0,2mL peptonada Incubao a 35C/48h 0,1mL
0,1mL 0,1mL 0,1mL
Colnias Suspeitas
Colorao de Gram: Bacilo Gram +
gar Nutriente Incubar a 35C/48h
Provas Bioqumicas
Degradao de Tirosina
Teste do VP
Teste de Motilidade Crescimento Rizide
Teste de reduo do Nitrato Teste de Lecitinase
Atividade Hemoltica
Hidrlise de gelatina
Teste do Manitol
Figura 2 Anlise de Bacillus cereus (adaptado de SILVA et al.,
1997)
4.5 DETECO DE Salmonella spp.
A metodologia recomendada para a deteco de Salmonella spp.,
segue basicamente cinco etapas que podem ser aplicadas a qualquer
tipo de alimento segundo SILVA et al, (1997). A primeira etapa foi
o pr enriquecimento em caldo no seletivo onde foram homogeneizadas
uma barra de cereal (25g) e 25g de cereal matinal, separadamente,
em 225mL de Caldo Lactosado incubados a 35C por 24h. Na prxima
etapa foi feito o enriquecimento em caldos seletivos sendo
inoculado um mL do pr enriquecimento para tubos com 10mL dos Caldos
Tetrationato e Selenito e 0,1mL para o Caldo Rappaport sendo todos
mantidos a 35C por 24h. Logo aps este perodo foi feito o
plaqueamento seletivo diferencial em placas contendo Agar
Hektoen-Enteric (HE) e Agar Xilose Lisina Desoxicolato (XLD) com o
objetivo de isolar colnias tpicas de Salmonella spp. O material
para o cultivo em HE e XLD foi obtido a partir dos caldos
seletivos, sendo retirado de cada caldo uma a duas aladas de inculo
com a ala de platina (Figura 3). No gar HE as colnias de Salmonella
spp. so colnias verde-azuladas, com ou sem centro preto, onde cepas
fortemente produtoras de H2S podem produzir colnias inteiramente
pretas, colnias fermentadoras de lactose ou sacarose so de cor
roscea. No gar XLD so colnias de cor rosa escuro, com ou sem centro
preto, cepas fortemente produtoras de H2S podem produzir colnias
com centro preto grande e brilhante ou inteiramente preto, cepas
fermentadoras de lactose ou sacarose produzem colnias amarelas com
ou sem centro negro. Havendo resultados positivos para Salmonella
spp., estas foram submetidas a identificao sorolgica usando os
soros anti-Salmonella somtico polivalente (Figura 3).
Depois deste perodo foram feitas as provas bioqumicas com as
colnias tpicas de Salmonella spp.:
Agar Trplice de Ferro (TSI): Colnia tpica foi semeada na
superfcie do meio com uma agulha de platina e logo aps introduzida
at o fundo do meio, incubando a 35C por 24h, foi observado no Agar
TSI a mudana de colorao (teste positivo) ou continuou igual (teste
negativo).
Agar Lisina Ferro (LIA): Colnias tpicas foram introduzidas at o
fundo do meio duas vezes com o auxlio da agulha de platina e
incubadas a 35C por 24h, logo aps foi observado se o meio que roxo
permaneceu inalterado (teste positivo) ou mudou para amarelo (teste
negativo).
Caldo Uria: As colnias foram semeadas com o auxlio da ala de
platina e incubadas a 35C por 24h, depois foi observado se o meio
no mudou de cor (teste positivo) ou mudou de cor (teste
negativo).
25 g da amostra + 225mL de Caldo Lactosado
Homogeneizao
Incubar a 35C/24 h
0,1mL
1mL
1mL
Caldo Rapapport
Caldo Tetrationato Incubar a 35C/24 h
Caldo Selenito
XLD
HE
XLD
HE
XLD HE
Incubar a 35C/48 h
Provas Bioqumicas
LIA
TSI
URIA
Incubar a 35C/48 h
Sorologia: pesquisa do Ag somtico
Figura 3 Deteco de Salmonella spp. (adaptado de SILVA et al.,
1997).
5. RESULTADOS
Dentre as 30 amostras analisadas, 20 de barra de cereais e dez
de cereais matinais, duas (10%) amostras de barra de cereais e uma
(10%) amostra de cereais matinais apresentaram colnias
caractersticas de Bacillus cereus, conforme mostra a tabela abaixo,
no apresentando isolamento de Coliformes Termotolerantes e
Salmonella spp. Dos resultados encontrados verificou-se a
contaminao com B. cereus com contagem de 1,9 x 102 UFC.g -1 e 1,7 x
102 UFC.g -1 nas barras de cereais e 1,0 x 104 UFC.g -1 nos cereais
matinais, este acima do previsto pela ANVISA (Tabela 3).
Tabela 3 - Contagem de Bacillus cereus nas amostras positivas de
barras de cereais e cereais matinais comercializados em Pelotas, RS
em 2006. Amostras Resultados (UFC.g -1)* ANVISA** (UFC.g -1)*
Barra de cereal n2 Barra de cereal n10 Cereal matinal n09* UFC
(Unidade Formadora de Colnia)
1,9 x 102 1,7 x 102 1,0 x 104
5,0 x 102 5,0 x 102 5,0 x 103
** ANVISA (Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria)
Aps a contagem das colnias caractersticas de B. cereus foram
realizados os testes bioqumicos, para confirmao do microrganismo B.
cereus nas trs amostras positivas, conforme mostram as Figuras 4 a
e Figura 4 b.
A Teste positivo de decomposio de tirosina em Agar Tirosina.
B Teste positivo de Voges Proskauer em Caldo MR VP.
C Teste positivo de reduo do nitrato Caldo Nitrato.
D Teste de hidrlise de gelatina em Agar Gelatina.
E Teste positivo de motilidade em meio de SIM.
F Teste do crescimento rizide em Agar Nutriente.
Figura 4 a: Provas bioqumicas realizadas para identificao de
Bacillus cereus encontrado nas amostras positivas.
G Teste do manitol em Caldo Manitol.
H Teste de lecitinase em Agar MYP.
I Teste de atividade hemoltica em Agar Sangue de Carneiro.
Figura 4 b: Provas bioqumicas realizadas para identificao de
Bacillus cereus encontrado nas amostras positivas.
6. DISCUSSO
As barras de cereais e os cereais matinais so compostos por
vrios gros de cereais como, trigo, aveia, milho, cevada, arroz e
tambm de frutas desidratadas como; banana, uva passa, morango, ma,
coco, mamo dentre outras alm de chocolate e mel. Todos esses
componentes contm protenas, fibras, carboidratos, vitaminas
essenciais para manuteno da sade podendo ser consumidos de maneira
fcil e rpida.
De acordo com McKEVITH (2004), os cereais so produtos bsicos
para alimentao fornecendo uma grande variedade de macro e micro
nutrientes para populao mundial e um grande consumo de cereais est
associado com um decrscimo do risco de desenvolver srias doenas
crnicas.
Para OLIVEIRA (2006), a aveia que um alimento funcional (previne
e ajuda a tratar doenas) um produto dos cereais matinais e das
barras de cereais que auxilia a controlar o diabete, a hipertenso e
o colesterol ruim, tudo isso graas ao betaglucano que um tipo de
fibra solvel presente nesse cereal. Ela impede o aumento da
glicemia, melhora a circulao sangnea e atua no intestino, inibindo
a absoro de gorduras.
Porm, desde a colheita dos gros que j podem estar expostos a uma
grande variedade de microrganismos atravs da gua, p, plantas
enfermas (ICMSF, 1980) at passar por todas as etapas de
processamento para compactao das barras e a produo dos cereais
matinais (FIGURAS 5 e 6), podem tambm ocorrer vrias contaminaes
durante esse percurso com diversos microrganismos podendo
comprometer a sade do consumidor, uma vez que, os esporos do B.
cereus so ativados pela ao trmica, ou seja, so termorresistentes
podendo germinar e os bacilos se multiplicarem rapidamente (MURRAY
et al., 2004).
Dentre as trs amostras que apresentaram B. cereus das 30
analisadas neste trabalho, apenas a contaminao de cereais matinais
estava acima dos padres previstos pela ANVISA, que estabelece o
mximo de 5,0 x 103 UFC.g-1, j que as demais amostras de barras de
cereais apresentaram contagem inferior ao limite permitido de 5,0 x
102 UFC.g -1.
LACA et al. (2006), constatou que a composio microbiana dos
cereais est relacionada ao armazenamento dos gros, onde a alta
umidade permite o crescimento dos microrganismos alterando assim,
as propriedades do produto, sendo, 13% de umidade considerado o
valor mximo para armazenar trigo, milho, cevada e arroz durante um
curto perodo, j que os gros midos parecem sofrer a ao fermentativa
devido a ao ltica e de coliformes.
De acordo com JAY (1992), estes produtos tm um elevado contedo
de protenas e de carboidratos, sua aw (atividade da gua) to baixa
que, se armazenar convenientemente, limitam o crescimento de todos
os microrganismos. Portanto, provavelmente este fator foi limitante
para o no desenvolvimento de Salmonella spp. e E. coli.. FORSYTHE
(2002), define como atividade da gua a medida da gua disponvel em
uma amostra. A aw a razo entre a presso do vapor da gua da amostra
e a da gua pura, mesma temperatura. Para o B. cereus a aw mnima de
0,930, para E. coli de 0,935 e para Salmonella spp. de 0,940. E nos
gros a aw fica em torno de 0,87 0,80 o que, possivelmente,
dificultou o crescimento bacteriano nas amostras analisadas neste
trabalho.
DUC et al. (2005) analisaram amostras de um produto infantil a
base de cereais, envolvidos em doenas de origem alimentar e foi
verificada a contaminao de dois tipos de bactrias esporognicas
Bacillus subtilis e B. cereus. Como ocorreu neste trabalho, presena
de B. cereus em uma amostra de cereais matinais.
BRUM et al. (2001), estudaram 30 amostras de diversos alimentos
amilceos obtidos no comrcio de Pelotas-RS e obtiveram apenas uma
amostra de aveia cereal que tambm faz parte da composio das barras
de cereais e cereais matinais com ndice acima do permitido, pela
Legislao Vigente, para B. cereus que foi de
8,0 x 102 UFC.g -1. Semelhante ao encontrado em nosso estudo,
onde apenas uma amostra foi encontrada este microrganismo.
Analisando barra de cereal caseira elaborada com biscoito de
amido de milho, acar, leite em p desnatado, flocos de arroz, aveia
em flocos, xarope de glicose de milho, uva passa e damasco seco,
BRITO et al. (2004) no encontraram Salmonella spp. e Coliformes
Termotolerantes. Resultados compatveis aos encontrados neste
trabalho.
ICMSF (1980), verificou que os indicadores fecais (coliformes)
esto em pequena concentrao nos gros no campo, a menos que haja uma
considervel atividade animal no local. O B. subtilis e B. cereus
esto presentes em pequeno nmero e Staphylococcus aureus e as
espcies de Salmonella no so detectadas nas distintas investigaes
efetuadas nos gros no campo nos pases ocidentais. De acordo com
FORSYTHE (2002), a sobrevivncia dos coliformes no solo de 30 dias o
que dificultaria sua permanncia nos gros.
7. CONCLUSO
Pode-se concluir que as barras de cereais esto dentro dos padres
previstos pela ANVISA. J os cereais matinais embora tenha-se
analisado um nmero pequeno , verificou-se que uma amostra estava
acima do permitido, ento cabe ao consumidor verificar as condies de
embalagem e armazenamento do produto no local de comercializao.
COLHEITA ? SECAGEM ? ARMAZENAGEM ? DISSOLUO ? PREPARAO ?
FORMATAO ? EMBALAGEM ? EXPEDIOFigura 5 Fluxograma do processo de
fabricao de barra de cereais.Fonte: adaptado do site -
http://www.ufrgs.br/alimentus/feira/prcerea/barracereal/flux.htm
Acessado em 27/04/06.
COLHEITA ? SECAGEM ? ARMAZENAMENTO ? DEGERMINAO ? SECAGEM ?
MOAGEM ? MISTURA ? COZIMENTO ? PR-SECAGEM ? LAMINAO ? PR-SECAGEM ?
TORREFAO ? RESFRIAMENTO ? COBERTURA ? ENVASE DE ACAR ? NATURAL
Figura 6 Fluxograma do processo de fabricao de cereais
matinais.Fonte: adaptado do site -
http://www.ufrgs.br/Alimentus/feira/prcerea/matinal/flux.htm
Acessado em 27/04/06.
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ANEXOS
GUA PEPTONADA (0,1%) Peptona gua destilada pH 7,0 1,0g
1000mL
CALDO LACTOSE BILE VERDE BRILHANTE (2%) Bile de boi (oxgall)
Peptona Lactose Verde Brilhante(13,3mL de soluo aquosa 0,1%) Diluir
em 1000mL de gua destilada pH 7,2 20,0g 10,0g 10,0g 0,0133g
CALDO LACTOSADO Extrato de carne Peptona Bacteriolgica Lactose
Diluir em 100mL de gua destilada pH 6,9 3g 5g 5g
CALDO EC Triptose Lactose Sais Biliares n3 Fosfato monocido de
potssio Fosfato bicido de potssio Cloreto de Sdio Diluir em 1000mL
de gua destilada pH 6,9 20g 5g 1,5g 4g 1,5g 5g
CALDO SELENITO CISTINA Triptona Lactose Fosfato dissdico
Selenito cido de sdio L cistina Diluir em 1000mL de gua destilada
pH 7,0 5,0g 4,0g 10,0g 4,0g 0,01g
CALDO TETRATIONATO Proteose peptona Sais biliares Tiossulfato de
sdio Carbonato de clcio Diluir em 1000mL de gua destilada pH 8,4
suplemento Soluo de iodo Soluo 0,1% verde brilhante (opcional) 5,0g
1,0g 30,0g 10,0g
0,2mL/10mL base 0,1mL/10mL base
CALDO RAPPAPORT Peptona de farinha de soja Cloreto de magnsio
hexahidrato Cloreto de sdio Fosfato dopotssico Dihidrogeno fosfato
potssico Verde malaquita Diluir em 1000mL de gua destilada pH 5,2
CALDO URIA Peptona Dextrose Cloreto de sdio Fosfato monopotssico
Uria Vermelho de fenol (6mL de soluo 0,2%) Diluir em 1000mL de gua
destilada pH 6,8 1,0g 1,0g 5,0g 2,0g 20,0g 0,012g 4,5g 29,0g 8,0g
0,4g 0,6g 0,036g
GAR EOSINA AZUL DE METILENO (EMB)
Peptona Lactose Fosfato dipotssico Eosina amarela (20mL da soluo
aquosa 2%) Azul de metileno (26mL da soluo aquosa 0,25%) gar Diluir
em 1000mL de gua destilada pH 7,1
10,0g 10,0g 2,0g 0,4g 0,065g 15g
GAR XLD Extrato de levedura L lisina Xilose Lactose Sacarose
Desoxicolato de sdio Citrato frrico amoniacal Tiossulfato de sdio
Vermelho de fenol (40mL soluo 0,2%) gar Diluir em 1000mL de gua
destilada pH 7,4 3,0g 5,0g 3,75g 7,5g 7,5g 2,5g 0,8g 5,0g 0,08g
15g
GAR TRPLICE ACAR DE FERRO (TSI) Extrato de carne Extrato de
levedura Peptona Proteose peptona Dextrose Lactose Sacarose Sulfato
ferroso Cloreto de sdio Tiossulfato de sdio Vermelho de fenol (12mL
da soluo 0,2%) gar Diluir em 1000mL de gua destilada pH 7,4 3,0g
3,0g 15,0g 5,0g 1,0g 10,0g 10,0g 0,2g 5,0g 0,3g 0,024g 12,0g
GAR ENTRICO DE HECTOEN (HE) Proteose peptona Extrato de levedura
Sais biliares n3 Lactose Sacarose Salicina Cloreto de sdio
Tiossulfato de sdio Citrato frrico amoniacal Azul de bromotimol
(32,5mL da soluo 0,2%) Fucsina cida gar Diluir em 1000mL de gua
destilada pH 7,5 12,0g 3,0g 9,0g 12,0g 12,0g 2,0g 5,0g 5,0g 1,5g
0,65g 0,1g 14,0g
GAR LISINA DE FERRO (LIA) Peptona Extrato de levedura Dextrose
Cloridrato de L lisina Citrato frrico amoniacal Tiossulfato de
sdico Prpura de bromocresol (2mL soluo 1%) gar Diluir em 1000mL de
gua destilada pH 6,7 5,0g 3,0g 1,0g 10,0g 0,5g 0,04g 0,02g
15,0g
GAR MANITOL GEMA DE OVO POLIMIXINA (MYP) Extrato de carne
Peptona D manitol Cloreto de sdio Vermelho de fenol (12,5mL da
soluo 0,2%) gar Diluir em 1000mL de gua destilada pH 7,1 GAR
NUTRIENTE Extrato de carne Peptona Diluir em 1000mL de gua
destilada pH 6,8 3,0g 5,0g 1,0g 10,0g 10,0g 10,0g 0,025g 15,0g
