ANÁLISE TÓXICO-GENÉTICA COMPARATIVA DOS ANTI-ANÁLISE TÓXICO-GENÉTICA COMPARATIVA DOS ANTI-

RETROVIRAIS ZIDOVUDINA E DIDANOSINA EM CÉLULASRETROVIRAIS ZIDOVUDINA E DIDANOSINA EM CÉLULAS

SOMÁTICAS DE SOMÁTICAS DE Drosophila melanogasterDrosophila melanogaster

Nilza Nascimento GuimarãesNilza Nascimento Guimarães

ANÁLISE TÓXICO-GENÉTICA COMPARATIVA DOS

ANTI-RETROVIRAIS ZIDOVUDINA E DIDANOSINA EM

CÉLULAS SOMÁTICAS DE Drosophila melanogaster

NILZA NASCIMENTO GUIMARÃES

Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Biologia da Universidade Federal de Goiás, para a obtenção

do Grau de Mestre em Biologia.

Orientadora: Profa. Dra. Kênya Silva Cunha

Goiânia

2006

2

Ao meu pai,

“Aquilo que não me mata,

me faz ainda mais forte.”

Obrigada por me mostrar que os laços de amor e de ternura podem

ser mais fortes que os laços de sangue. Obrigada por me amar. Obrigada

pela educação que me deste e por me ensinar a ter coragem de enfrentar

os meus medos. Obrigada por jamais me deixar sozinha. Mesmo agora

que já partiu, ainda sinto a sua voz falando ao meu ouvido: vai minha

filha, se tudo der errado dê a volta por cima e comece outra vez. Obrigada

por ter sido o meu verdadeiro pai.

À minha mãe,

Se Deus me desse a chance voltar no tempo e escolher em qual

ventre eu seria gerada, eu escolheria o seu. É muito bom ser sua filha.

Perdoe-me por cada dia que passei longe da senhora. É o preço que se

paga pelo crescimento profissional.

Dedico a vocês este trabalho.

3

Ao meu amado Giovanni,

“Não importa que amanheça devagar, as flores não tem pressa.

Nem os frutos. Sabem que a vagareza dos minutos adoça mais o outono

por chegar. Portanto, não faz mal que, devagar, o dia vença a noite em

seus redutos de leste. O que nos cabe é termos enxutos os olhos e a

intenção de madrugar.”

Autor desconhecido

Sua maturidade e paciência foram fundamentais nestes longos

meses de luta. Seu amor me deu forças para superar cada dia difícil. E me

faz ter vontade de voltar para casa todos os dias da minha vida.

4

À Kênya,

“Pois tu formaste o meu interior, tu me teceste no seio de minha

mãe, graças te dou, visto que por modo assombrosamente maravilhoso

me formaste; os teus olhos me viram a substância ainda informe, e no

teu livro foram escritos todos os meus dias, cada um deles escrito e

determinado, quando nenhum deles havia ainda”.

Salmo 139:13-16

Destino, acaso, sorte... Chamem do que quiserem. Para mim, obra

de algo ou alguém maior. Às vezes acho que estamos soltos,

abandonados neste mundo. Outras vezes me sinto uma marionete

conduzida por algo inexplicável que rege a minha vida. E no fim fica uma

pergunta: como vai ser amanhã? Uma resposta eu tenho: para sempre

com você na lembrança.

5

AGRADECIMENTOS

À Dra. Kênya Silva Cunha,

Pela confiança quando nem eu mesma sabia se era capaz. O carinho

e a ética que nos transmite, tornam o ambiente de trabalho muito

prazeroso e confiável. Levarei para sempre a lembrança da sua alegria de

viver. E, também, tudo o que aprendi ao seu lado. Os amigos são a

família que nos permitiram escolher. Obrigada por tudo.

Aos meus colegas de laboratório,

Igor Gomes de Oliveira, Karla de Castro Pereira, Leonardo Pereira

Franchi, Letícia Cunha Fernandes, pela amizade, respeito,

responsabilidade e humildade de todos vocês, que muito contribuíram

para a execução deste trabalho. Sem dúvidas seremos irmãos para toda a

vida.

Ao Dr. Luis Arthur Mendes Bataus

Por estar presente sempre que precisamos de um braço forte, de

um ombro amigo, de um conselheiro ou apenas de um companheiro para

o café da tarde.

À Dra. Alice Helena Andrade Ferreira Rios (IQUEGO),

Pela presteza e prontidão que nos acolheu. Sua contribuição foi

fundamental para a realização desta pesquisa.

Aos meus irmãos,

Por compreender minha distância, torcer por meu sucesso e

pela paciência nos dias de estresse.

6

Este estudo foi realizado nas instalações do Laboratório de Genética

Toxicológica do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular do

Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Goiás, como

parte do projeto “Estudo comparativo da toxicidade genética induzida por

compostos antimetabólicos de uso clínico”, processo nº 472036/2003-3,

estabelecido pelo Edital Universal CNPq 01/2002.

7

SUMÁRIO

1.INTRODUÇÃO.......................................................................... 16

1.1.AIDS.................................................................................... 16

1.2.Tratamento anti-retroviral....................................................... 22

1.3.AZT e ddI: indutores de lesão no DNA...................................... 26

1.4.Recombinação somática e análise tóxico-genética...................... 32

1.5.Drosophila melanogaster na genética toxicológica...................... 33

2.OBJETIVO ............................................................................. 36

3.MATERIAL E MÉTODO ............................................................... 37

3.1.Agente anti-retroviral............................................................. 37

3.2.Meios de cultura e condições de cultivo..................................... 37

3.3.Teste para Detecção de Mutação e Recombinação

Somática (SMART)............................................................. 38

3.4.Linhagens teste de Drosophila melanogaster............................. 38

3.5.Cruzamento e tipos de larvas.................................................. 38

3.6.Tratamentos......................................................................... 39

3.7.Montagem das lâminas........................................................... 39

3.8.Análise microscópica.............................................................. 40

3.9.Bases genéticas..................................................................... 41

3.9.1.Adultos trans-heterozigotos.................................................. 41

3.9.2.Adultos heterozigotos para o cromossomo balanceador TM3..... 41

3.10.Análise estatística................................................................ 42

4.RESULTADO............................................................................. 44

4.1.Efeito citotóxico e toxicidade genética....................................... 44

4.2.Indivíduos trans-heterozigotos................................................ 46

4.3.Indivíduos heterozigotos para o cromossomo balanceador TM3.... 46

4.4.Toxicidade genética padronizada por unidade de exposição......... 47

8

5.DISCUSSÃO............................................................................ 51

6. PERSPECTIVAS PARA FUTURAS INVESTIGAÇÕES......................... 57

7.BIBLIOGRAFIA......................................................................... 60

9

LISTA DE ABREVIATURAS

µg: Micrograma

µM: Milimolar

AIDS: Síndrome da Imunodeficiência Humana Adquirida

AN: Análogos nucleosídeos

APRT: Adenina fosforribosiltransferase

ATP: Adenosina trifosfato

AZT: Zidovudina, 3’-azido-3’-desoxitimidina, retrovir

AZTTP: Zidovudina trifosfato

ddA: Didesoxiadenosina

ddAMP: Didesoxiadenosina monofosfato

ddATP: 2,3-didesoxiadenosina-5-trifosfato

ddC: Zalcitabina

ddI: Didanosina, 2’-3’-didesoxiinosina, Videx

ddIMP: Didesoxiinosina monofosfato

ddNTP: 2’- desoxinucleosídeo-5’-trifosfato endógena

dNTP: Desoxinucleosídeo trifosfato endógena

DNA: Ácido desoxirribonucléico

dNK: Desoxiribonucleosídeo quinase

dTMP: Desoxitimidina monofosfato

dTMPK: Desoxitimidina monofosfato quinase

dTTP: 2’,3’-desoxitimidina trifosfato endógena

FDA: Food and Drug Administration

GAZT: 3'-azido-3'-desoxi-5'-O-β-D-glicopiranosiltimidina

HIV: Vírus da Imunodeficiência Humana

HPRT: Hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase

HPV: Papillomavírus

LAV: Vírus associado à linfadenopatia

mg: Miligrama

mtDNA: Ácido desoxi-ribonucléico mitocondrial

NDPK: Nucleosídeo fosfato quinases

10

NMPK: Nucleosídeo monofosfato quinase

NNRTIs: Inibidores não-nucleosídeos da transcriptase reversa

NRTIs: Inibidores Nucleosídeos da Transcriptase Reversa

NtRTIs: Inibidores nucleotídeos da transcriptase reversa

PCR: Reação em cadeia da polimerase

PM: peso molecular

Pol γ: DNA polimerase mitocondrial humana

RNA: ácido ribonucléico

RT: Transcriptase Reversa

SMART: Teste para Detecção de Mutação e Recombinação em Células

Somáticas de Drosophila melanogaster

TK: Timidina quinase autossômico

TTP: Timidina trifosfato

11

RESUMO

O vírus da imunodeficiência humana (HIV), causador da Síndrome da

Imunodeficiência Adquirida (AIDS), possui genoma de RNA e não é capaz

de codificar enzimas para metabolização de nucleotídeos ou nucleosídeos

(nucleosídeo quinases, nucleotídeo redutase, timidilato sintetase) e,

então, depende completamente do maquinário metabólico das células

hospedeiras para sua síntese de DNA e RNA. Entretanto, além de uma

série de proteínas estruturais e regulatórias, o HIV ainda codifica muitas

enzimas que são essenciais para a clivagem de proteínas (proteases),

para a síntese de DNA (Transcriptase Reversa) e para a incorporação do

produto do DNA viral no genoma humano (integrase). A ausência de uma

enzima análoga a RT em células humanas e o conhecimento prévio de

inibidores desta enzima, utilizados no tratamento de retroviroses animais,

tornaram a inibição da RT o alvo terapêutico óbvio para o tratamento da

infecção por HIV. Entre os medicamentos mais utilizados no combate ao

HIV estão a zidovudina (AZT) e a didanosina (ddI), que pertencem à

classe dos Inibidores Nucleosídeos da Transcriptase Reversa (NRTIs).

Estas drogas substituem ou imitam os substratos naturais durante a

síntese do DNA viral, interrompendo a atividade de transcrição reversa,

agindo, assim, como terminadores de cadeia. O presente estudo teve

como principal enfoque o diagnóstico genotóxico do AZT e da ddI,

buscando caracterizar, quantificar e padronizar por unidade de exposição,

os efeitos destes fármacos em nível de mutações pontuais, mutações

cromossômicas e/ou recombinação mitótica, através do Teste para

Detecção de Mutação e Recombinação em Células Somáticas de

Drosophila melanogaster (SMART de asa). A comparação das freqüências

padronizadas de indução de clones mutantes, obtidas para estas duas

drogas demonstra que ambas apresentam um elevado potencial

genotóxico. De fato, a ddI mostrou-se 4,25 vezes mais genotóxica que o

AZT (0,34 clones na ddI para 0,08 clones induzidos no AZT) nos

indivíduos trans-heterozigotos. Por outro lado, a análise da freqüência

12

padronizada de clones mutantes induzida pelas drogas, nos indivíduos

heterozigotos para o cromossomo TM3, demonstra que a ddI tem uma

atividade indutora de mutações praticamente nula, ao passo que o AZT

apresenta indução de uma pequena freqüência de clones mutantes. Como

comprovado em outros estudos, a perda de heterozigose tem

demonstrado ser uma chave importante no desenvolvimento de eventos

causadores de diversos tipos de cânceres (esporádicos e/ou hereditários)

em humanos e está intimamente associada com eventos

recombinacionais. A análise dos resultados obtidos no presente estudo

sugere que estas drogas, devido ao seu alto potencial indutor de

recombinação homóloga, são agentes com grande capacidade de induzir

neoplasias como conseqüência do tratamento anti-retroviral.

13

ABSTRACT

The Human Immunodeficiency Virus (HIV) causes the Acquired Immune

Deficiency Syndrome (AIDS), has RNA genome and is unable to codify

enzymes for metabolization of nucleosides or nucleotides (nucleoside

kinases, nucleotide redutase, thymidilate syntetase) and then, depend

completly of the metabolic machinary of host cells for the DNA and RNA

synthesis. However, besides a series of structurals and regulatory protein,

the HIV codify severals essential enzymes for the protein cleavage

(proteases), DNA synthesis (reverse transcriptase - RT) and incorporation

of DNA viral into human genome (integrase). The absence of a RT analog

in human cell and the previous knowledge about this enzyme inhibitors,

used in treatment of retrovirus diseases in animals, make RT inhibition the

main target for the HIV infection treatment. Zidovudine (AZT) and

didanosine (ddI) are the most commonly drugs used for HIV treatment,

belonging to the nucleoside reverse transcriptase inhibitor (NRTIs) class.

These drugs shift or imitate the natural substrate during viral DNA

synthesis, interrupting the reverse transcription, acting as chain

terminator. This study had have as first focus the genotoxic diagnostic of

AZT and ddI, through the characterization, quantification and unit

exposition standardization of the drugs effects in the level of point

mutation, cromossomal mutation and/or mitotic recombination, using the

Somatic Mutation and Recombination Test in Drosophila melanogaster

(wing SMART). Comparison of standardized frequency of mutant clone

induced by these drugs shows that both exhibit a high genotoxic potential.

Indeed, ddI was 4,25-fold most genotoxic than AZT (0,38 clones in ddI for

0,08 clones in AZT) in trans-heterozygote individuals. On the other hand,

the analysis of standardized frequency of mutant clone in heterozygote

TM3 individuals, shows that ddI has a inductive activity of mutations

practically null, whereas AZT it presented induction of a small frequency of

14

mutant clones. As established in other studies, loss of heterozigosity

(LOH) have been demonstrated to be an important key in the

development of events which cause several kinds of human cancers

(sporadic and/or hereditary) and is close associated with recombinational

events. The analysis of results obtained in the present study suggests that

these drugs, which have high homologous recombination potential, are

able to induce neoplasy as a consequence of antiretroviral treatment.

15

1. INTRODUÇÃO

1.1. AIDS

A Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS) é uma doença

degenerativa do sistema imune causada pelo vírus da imunodeficiência

humana (HIV), um lentivírus com genoma de RNA pertencente à família

Retroviridae (Peter & Gambertoglio, 1998). Esta síndrome é caracterizada

por diversos aspectos clínicos que incluem desde perda de peso e

degeneração do Sistema Nervoso Central até uma imunodepressão

profunda, com infecções oportunistas e alterações neoplásicas. O HIV já

contaminou mais de 47 milhões de pessoas em todo o planeta e causou a

morte de quase 14 milhões de adultos e crianças (Abbas, et al., 2003). No

Brasil, entre 1980 e 2004 foram registrados 362.364 novos casos da

doença (http://www.aidsinfo.nih_gov).

O HIV-1 foi simultaneamente isolado em 1983, pelos pesquisadores

Luc Montaigner, na França, como Vírus Associado a Linfadenopatia (LAV) e

Robert Gallo, nos EUA, como Vírus T-Linfotrópico Humano tipo III. Em

1986 foi identificado outro agente etiológico com características

semelhantes, também um retrovírus, que recebeu a denominação de HIV-

2, demonstrando menor virulência que o HIV-1. Recentemente, foram

descritos subtipos destes dois agentes (HIV-1 e HIV-2), em pacientes

infectados oriundos de diversas regiões geográficas do mundo. Os isolados

de HIV-1 são classificados em dois subgrupos: M (major) onde são

identificados nove subtipos (A, B, C, D, E, F, G, H e I) e o grupo O

(outlier) com apenas um subtipo (http://www.aidsinfo.nih_gov/drugs).

A sobrevida de partículas do vírus HIV no meio intracelular é de no

máximo um dia, ao passo que as partículas virais presentes nos fluidos

corpóreos em meio externo podem resistir de forma latente até 15 dias à

temperatura ambiente ou 11 dias a 37°C - se não forem destruídos por

agentes físicos e químicos tais como calor, hipoclorito de sódio e

glutaraldeído (http://www.aidsinfo.nih_gov/drugs).

16

O HIV apresenta maior afinidade pelas células do sistema imune

humano. A infecção por este vírus causa uma severa depleção das células

que expressam as proteínas CD4 e CD8 que incluem os linfócitos T,

macrófagos e monócitos levando a uma profunda imunossupressão (Peter

& Gambertoglio, 1998; Abbas et al., 2003). Através do método de reação

em cadeia da polimerase (PCR) foi revelado que o RNA do HIV pode ser

detectado no plasma em qualquer estágio da doença. Além disso, em

indivíduos assintomáticos, o tecido linfóide demonstrou ser o maior sítio

de replicação viral quando comparado com as concentrações virais

presentes no sangue periférico (Peter & Gambertoglio, 1998).

A estrutura genômica típica do vírus HIV-1 consiste de duas mono-

fitas idênticas de RNA, com aproximadamente 9,2 kb de comprimento,

que, supostamente, existe na forma de uma ribonucleoproteína contendo

as enzimas transcriptase reversa (RT), integrase, protease e a proteína p7

de ligação ao RNA (Peçanha et al., 2002) (Figura 1). Envolvendo o

genoma e suas enzimas associadas há um cerne ou capsídeo formado pela

proteína p24, que está contido em uma matriz protéica (proteína p17)

circundante. Finalmente, a parte mais externa do vírus é formada por um

envelope de membrana fosfolipídica (derivada das células do hospedeiro),

contendo proteínas de membrana (gp41 e gp120) - codificadas pelo

genoma viral - que se ligam às moléculas de CD4 da membrana do

hospedeiro (Peçanha et al., 2002; Abbas et al., 2003).

A infecção se inicia com a ligação das subunidades da proteína

gp120 às moléculas de CD4 e seus co-receptores de quimiocinas. Em

seguida há uma alteração conformacional da proteína gp41 que se insere

na membrana celular (fusão peptídica) e induz a fusão da membrana viral

com a membrana celular da célula hospedeira. Ocorre, então, a liberação

do genoma viral no citoplasma da célula. A partir deste momento são

ativadas as enzimas virais do complexo nucleoprotéico, iniciando-se assim

o ciclo replicativo do HIV. O genoma RNA do vírus é transcrito, pela RT

viral, formando o DNA viral de fita dupla que, juntamente com a integrase

17

Figura 1 - Estruturas do HIV.

18

Glicoproteína transmembrana (gp120)

Glicoproteina transmembrana (gp41)

Membrana viral

TransciptaseReversa

viral, penetra no núcleo da célula e, com o auxílio desta enzima, integra-

se ao genoma do hospedeiro (Abbas et al., 2003) (Figura 2).

O DNA do HIV integrado ao genoma do hospedeiro passa a ser

chamado de provírus. Este poderá permanecer inativo para transcrição

por meses ou anos, produzindo poucas ou nenhuma proteína viral ou

vírions, ficando na forma latente sem infectar outras células do indivíduo.

Estímulos fisiológicos - como as citocinas do sistema imune - podem

acelerar o processo de transcrição do gene viral, reativando o provírus,

que passa a produzir o mRNA viral que é exportado para o citoplasma.

A expressão dos genes virais pode ser dividida em dois estágios: um

inicial, no qual são produzidas proteínas reguladoras, que passam a

comandar a síntese de novos genomas virais e um estágio tardio, no qual

são expressas proteínas estruturais, que participam da construção da

estrutura externa de novos vírus que serão liberados pela célula

hospedeira. Sucede, neste processo, a construção do capsídeo viral, que

envolve o novo genoma transcrito do vírus e migra até a membrana

celular do hospedeiro, onde as proteínas virais gp120 e gp41 já estarão

inseridas - originando assim a partícula viral madura. O vírus pode, então,

infectar novas células ou permanecer no fluido extracelular (Abbas et al.,

2003). É importante salientar que o vírus HIV não codifica enzimas para

metabolização de nucleotídeos ou nucleosídeos (nucleosídeo quinases,

nucleotídeo redutase, timidilato sintetase) e, então, depende

completamente do maquinário metabólico das células hospedeiras para

sua síntese de DNA e RNA. Entretanto, além de uma série de proteínas

estruturais e regulatórias, o HIV ainda codifica muitas enzimas que são

essenciais para a clivagem de proteínas (proteases), para a síntese de

DNA (RT) e para a incorporação do produto do DNA viral no genoma

humano (integrase) (Balzarini, 2000).

Neste contexto, ocorre uma incoerência no organismo infectado pelo

HIV, na tentativa de reagir contra o agente agressor. O vírus ataca

seletivamente as células CD4 ativadas, utilizando o seu maquinário para

19

Figura 2 - Ciclo de vida do HIV na célula hospedeira

20

efetuar a sua replicação. Sob qualquer estímulo que desencadeie o

recrutamento de células de defesa para uma resposta imune aguda,

haverá uma proliferação destes linfócitos CD4, que estarão carreando o

pró-vírus em seu DNA. Conseqüentemente, o pró-vírus também estará se

multiplicando através das células de defesa do organismo infectado. Isto

acontece porque os aspectos pró-inflamatórios da infecção pelo HIV

podem resultar na ativação e proliferação das células T CD4, específicas

para outros antígenos, diferentes daqueles produzidos contra este vírus e

que podem estar infectadas com o HIV, embora em uma menor

freqüência. Assim, uma resposta imune contra o vírus da AIDS pode ter o

efeito paradoxal de intensificar a replicação viral e acelerar a progressão

da doença, ao passo que a perspectiva mais proeminente de seus

hospedeiros (os linfócitos T CD4) em uma ativação crônica intensa do

sistema imune é a depleção progressiva destas células, diretamente

envolvidas (Deeks & Walker, 2004).

A infecção pelo vírus HIV está intimamente associada com uma

elevação do risco de desenvolvimento de linfomas sistêmicos da doença

de Hodgkin e também de linfomas primários no sistema nervoso central

(Parekh et al., 2003). Além disto, alguns estudos demonstraram que, em

situações nas quais os indivíduos têm seu sistema imunológico muito

debilitado, aumentam até cem vezes os riscos de desenvolverem cânceres

associados a vírus. Em uma pesquisa realizada com dois grupos de

pacientes imunossuprimidos para avaliar a incidência do Sarcoma de

Kaposi – um grupo de pessoas infectadas pelo HIV e outro de pessoas que

receberam transplantes de órgãos e utilizavam drogas imunossupressivas

para evitar a rejeição – ficou demonstrado que o Sarcoma de Kaposi foi

quase quatro vezes mais freqüente em indivíduos infectados pelo HIV do

que em transplantados, tornando evidente que o HIV é um agente

potencialmente indutor deste tipo de neoplasia (Serraino et al., 2005). Um

outro agente causador de lesões escamosas intra-epiteliais, de alto e

baixo grau, precursoras de câncer cervical em mulheres, é o

papilomavírus (HPV). Mulheres infectadas pelo vírus HIV têm um grande

21

risco de desenvolver câncer cervical em conseqüência de infecções

secundárias pelo HPV. O mecanismo pelo qual a infecção pelo HIV eleva

os riscos de neoplasia cervical não é completamente conhecido. Uma

explicação plausível é que a imunossupressão induzida pelo HIV leva a

uma inabilidade em controlar a expressão do HPV e a produção de

oncoproteínas pelo HPV (Hawes et al., 2006).

1.2. Tratamento anti-retroviral

A ausência de uma enzima análoga a RT em células humanas e o

conhecimento prévio de inibidores desta enzima, utilizados no tratamento

de retroviroses animais, tornaram a inibição da RT o alvo terapêutico

óbvio para o tratamento da infecção por HIV (Peçanha et al., 2002). A

munição comumente usada na quimioterapia contra infecções pelo HIV

consiste de 5 classes de compostos já licenciados: (i) inibidores

nucleosídeos da transcriptase reversa (NRTIs), (ii) inibidores nucleotídeos

da transcriptase reversa (NtRTIs), (iii) inibidores não-nucleosídeos da

transcriptase reversa (NNRTIs), (iv) inibidores de protease e (v) inibidor

da entrada viral na célula (Peter e Gambertoglio, 1998; De Clercq, 2004).

O uso destes medicamentos em uma terapia anti-viral altamente ativa,

combinados em potentes coquetéis, desde o início dos anos 1990,

diminuiu sensivelmente a morbidade e mortalidade dos pacientes

infectados pelo HIV (Duan et al., 2001; Turner et al., 2004).

O AZT, um NRTI, sintetizado inicialmente como um agente anti-

tumor, e apresentando atividade anti-viral contra o vírus de leucemia em

murinos, demonstrou atividade inibitória contra o vírus HIV in vitro e foi o

primeiro fármaco a ser aprovado pela FDA (Food and Drug Administration)

no tratamento da AIDS e condições relacionadas a ela (Peter &

gambertoglio, 1998; Peçanha et al., 2002). Também denominado 3-azido-

3-desoxitimidina; 3-azidotimidina; azidodesoxitimidina; azidotimidina;

Retrovir; ZDV ou ZVD, possui fórmula química estrutural C10H13N5O4 e

22

peso molecular 267,2438, sendo a sua solubilidade em água de 1-5 g/mL

a 17°C (http://chemfinder.cambridgesoft.com) (Figura 3).

Esta droga é de rápida e quase completa absorção no trato

gastrointestinal, entretanto, a biodisponibilidade sistêmica do AZT, em

formulações do tipo cápsula ou solução, é de aproximadamente 65%

(variando entre 52 a 75%). A biodisponibilidade em neonatos de até

quatorze dias de vida é de aproximadamente 89%, e em neonatos com

mais de quatorze dias de idade, ela decresce para aproximadamente 61%.

A administração em um meio altamente gorduroso pode diminuir as taxas

de absorção. Sua distribuição ultrapassa a barreira hematoencefálica

atingindo, no fluido cerebrospinal, médias aproximadas de 24% da

concentração plasmática em crianças. Também apresenta concentrações

no sêmen de pacientes infectados pelo HIV. Há casos reportados da

presença de AZT no tecido do Sistema Nervoso Central de fetos humanos

demonstrando que a droga também ultrapassa a barreira placentária

(Farmacopéia USP-DI/98).

Após sofrer metabolização no fígado, o AZT é primariamente

eliminado na forma do metabólito inativo 3'-azido-3'-desoxi-5'-O-β-D-

glicopiranosiltimidina (GAZT), com 60 a 80% da dose administrada sendo

detectada na urina como este composto. A excreção desta droga ocorre

por via renal e a meia-vida é de aproximadamente uma hora no plasma

sangüíneo, em humanos e em várias espécies animais, ao passo que a

meia vida intracelular na forma fosforilada é de aproximadamente 3,3

horas (Cretton et al., 1991).

Outro NRTI, a ddI, também denominada didanosina,

2’,3’-didesoxiinosina; didesoxiinosina; CCRIS 805; ddIno ou Videx,

aprovada pela FDA em 1991, possui fórmula química estrutural C10H12N4O3

e peso molecular 236,2298, sendo a sua solubilidade em água de 1-5

g/100mL a 21°C (http://chemfinder.cambridgesoft.com, Styrt et al.,

1996) (Figura 4).

23

A ddI é muito lábil em meio ácido. Portanto, todas as suas

formulações contêm agentes tamponantes para aumentar o pH do trato

gástrico, o que permite que sejam administradas com estômago vazio.

24

A B

Figura 3 - Estruturas químicas da timidina (A) e da zidovudina (B).

A B

Figura 4 – Estruturas químicas da inosina (A) e da didanosina (B).

25

Quando ingerida até cinco minutos após as refeições, os níveis de

concentração plasmática caem até 50%. Caso a ddI não seja tamponada

no estômago, ela se transforma em 2,3-didesoxirribose e hipoxantina, um

precursor do ácido úrico. A biodisponibilidade da ddI é extremamente

variável em adultos e crianças. Em adultos, após a ingestão de uma

formulação liofilizada do produto em uma dose simples, seus valores

chegam a 33%. Já em crianças (de 7 meses a 19 anos de idade) que

recebem a administração de uma formulação similar, em uma solução oral

para uso pediátrico, a biodisponibilidade sistêmica aumenta para 19 a

42% (Farmacopéia USP-DI/98).

A ddI ultrapassa a barreira hemato-encefálica e se distribui no fluido

cerebrospinal. É metabolizada intracelularmente e tem meia-vida de

aproximadamente uma hora e meia, no plasma sangüíneo e, na forma

aminada e fosforilada de ddATP, varia de oito a vinte e quatro horas

dentro das células. Sua eliminação ocorre pelo sistema renal, via filtração

glomerular e secreção tubular ativa (Farmacopéia USP-DI/98).

O AZT foi muito utilizado como monoterapia contra a infecção pelo

HIV. Entretanto, foi demonstrada que a combinação do AZT com outros

compostos levou a uma maior sustentação da supressão viral. O uso

associado do AZT com outros dois NRTIs, como, por exemplo, o coquetel

triplo que associa o AZT com a ddI e zalcitabina (ddC), apresentou uma

redução permanente da viremia no plasma, com aumento da contagem de

CD4, indicando ser clinicamente benéfico (Peter & Gambertoglio, 1998).

O AZT e a ddI são análogos de base que pertencem à categoria dos

medicamentos anti-virais sistêmicos (Farmacopéia USP-DI/98) e atuam

como antimetabólitos causando a inibição de rotas bioquímicas

relacionadas com a síntese da cadeia de DNA viral. O mecanismo de ação

do AZT e da ddI é semelhante ao dos demais análogos de base. Estas

drogas substituem ou imitam bases nitrogenadas que compõem o genoma

viral. Durante a atividade da RT, elas atuam como inibidores enzimáticos

competitivos, ligando-se ao domínio palma, localizado no sítio ativo da RT,

fazendo uma inibição alostérica da enzima, impedindo sua ação no

26

elongamento da cadeia de DNA do HIV, funcionando como terminadores

da cadeia (Peçanha et al., 2002; De Clercq, 2004).

A atividade dos análogos de nucleosídeos somente se inicia após a

sua fosforilação - com conseqüente conversão em nucleotídeos - uma vez

que os metabólitos essencialmente ativos da maioria dos análogos

nucleosídeos são seus trifosfatos (Wutzler & Thust, 2001). Para que isto

aconteça faz-se necessária uma ativação citoplasmática da fosforilação do

nucleosídeo por uma enzima quinase. O AZT, um análogo estrutural da

timidina, atravessa a membrana celular através de transportadores de

nucleosídeos, sendo fosforilado pela timidina quinase intracelular em AZT-

monofosfato, que é convertido em AZT-difosfato pela timidilato quinase e

posteriormente convertido em AZT-trifosfato por outras enzimas celulares

(Farmacopéia USP-DI/98; Peter & Gambertoglio, 1998). O nucleotídeo

formado, AZT-trifosfato, irá competir, então, com o nucleotídeo

trifosfatado endógeno, timidina trifosfato, na atividade de transcrição

reversa do RNA viral (Hoggard & Back, 2002) (Figura 5).

A ddI, um análogo estrutural da inosina, é também fosforilada por

enzimas no citoplasma transformando-se em 2’,3’-didesoxiadenosina-

5’-trifosfato (ddATP). É sabido que a etapa inicial de fosforilação da ddI

em ddIMP é catalizada pela 5’-nucleotidase citosólica, seguida pela

aminação - via enzimas adenilsuccinato sintetase e adenilsuccinato liase -

em ddAMP. A ddAMP é fosforilada pela adenilato quinase, que utiliza ATP

como doador de grupos fosfatos, transformando-se em ddATP. Após a

remoção do grupo difosfato ocorre a incorporação da ddA 5’-monofosfato

à extremidade 3’ da cadeia de DNA viral, mediada pela RT (Farmacopéia

USP-DI/98; Peter & Gambertoglio,1998; De Clercq, 2004) (Figura 6).

1.3. AZT e ddI: indutores de lesão no DNA

O uso dos anti-retrovirais tem sido acompanhado pelo

desenvolvimento de resistência viral específica a estas drogas, o que leva

a uma nova fase de virulência e conseqüente falência clínica (Turner et

27

Figura 5 – Fosforilação intracelular do AZT.

28

al., 2004). O tratamento com estes coquetéis levou os pacientes a

coexistirem com baixos índices do vírus por anos, mas a sua utilização

vem sendo cerceada, por um lado, pelo desenvolvimento de resistência do

HIV a estas drogas e, por outro, pela alta toxicidade destes análogos

(Johnson et al., 2001). Existem também evidências de que estes análogos

atuem como substratos para a DNA polimerase mitocondrial humana (Pol

γ), resultando na inibição da replicação mitocondrial, o que pode gerar os

mesmos sintomas de doenças mitocondriais nos pacientes tratados com

os coquetéis de NRTIs – como, por exemplo, miopatias, neuropatias

periféricas, miocardiopatia hipertrófica, Diabetes mellitus, pancreatite,

acidose láctica e falência das células hepáticas, entre outras (Styrt et al.,

1996; Johnson et al., 2001; Dagan et al., 2002; Bienstock et al., 2004;

Gerschenson et al., 2005). Estudos histológicos e de microscopia

eletrônica em células musculares expostas ao AZT demonstraram

acúmulos anormais de mitocôndrias com inclusões paracristalinas no

espaço abaixo do sarcolema mostrando fibras vermelhas rotas que,

presentes no músculo esquelético, são diagnóstico de desordens genéticas

mitocondriais causadas por mutações pontuais, deleções e/ou

aneuploidias (Dagan et al., 2002). Complementado estes estudos, foram

observados sinais de disfunção mitocondrial em algumas crianças que

foram expostas aos agentes anti-retrovirais ainda no útero materno, as

quais desenvolveram encefalomiopatias neonatal, anemias,

hiperlactatemia, atrasos psicomotores e distúrbios visuais, em períodos

variando de uma semana a trinta meses de idade. Estes achados reforçam

os dados sobre as conseqüências das lesões no DNA mitocondrial nas

funções celulares (Poirier et al., 2003; Tovo et al., 2005).

Além disto, a análise de linfócitos CD4 e CD8, isolados do sangue

periférico de seis pessoas sadias e estimuladas com anticorpos anti-CD3 e

anti-CD28, na presença e na ausência de ddI, revelou que, na ausência da

droga, estas células realizaram mitose normalmente, sendo condizente

com uma auto-regulação dos mtDNA e com a produção de lactato

29

necessárias para que este processo aconteça. Por outro lado, a presença

da ddI causou uma depleção dos mtDNA nos linfócitos gerando

conseqüentes danos funcionais, inclusive nos eventos mitóticos destas

células (Setzer et al., 2005).

O AZT também demonstrou ser um potente indutor de

anormalidades estruturais dos cromossomos, em concentrações iguais ou

maiores que 3 µg.mL-1, em estudos citogenéticos utilizando cultura de

linfócitos humanos. Nestas mesmas culturas, a ddI, em altas

concentrações (≥ 5000 µg.mL-1), elevou a freqüência de células com

mutações cromossômicas (Farmacopéia USP-DI/98). Todavia, os ensaios

com Salmonella typhimurium – Teste de Ames - utilizando AZT e ddI,

demonstraram efeitos negativos para a indução de mutações pontuais.

Tais resultados podem estar vinculados à incapacidade destes organismos

em fosforilar e ativar suficientemente estas drogas – pela ausência de

enzimas específicas equivalentes às encontradas nas células de mamíferos

(Wutzler & Thust, 2001). A análise dos efeitos mutagênicos destas duas

drogas, em cultura de linfoblastos humanos, revelou um aumento

complementar da incorporação do AZT no DNA humano e também um

aumento da freqüência de indução de mutações gênicas e cromossômicas

quando as drogas foram utilizadas associadas em coquetéis, maiores que

nas exposições às drogas em monoterapias. Foram observados, como

sítios-alvo de mutagênese induzida, o gene hipoxantina-guanina

fosforibosiltransferase (HPRT) ligado ao cromossomo X e dois genes

autossômicos, timidina quinase (TK) e adenina fosforribosiltransferase

(APRT). Os níveis de incorporação do AZT e ddI, mensuradas por

radioimunoensaio, demonstraram aumentos nas taxas de incorporação de

AZT no DNA (Meng et al., 2000a; Meng et al., 2000b; Olivero et al.,

1999). Também nos ensaios para HPRT e TK foram observados efeitos

mutagênicos em culturas de células expostas ao AZT, ou doses

equimolares de AZT combinado com ddI, em exposições a concentrações

variando de 3 a 30 vezes os níveis máximos encontrados no plasma

humano (Meng et al., 2000b). Sussman et al., (1999) investigaram, em

30

linhagens de células linfoblásticas humanas TK6, a relação entre os níveis

de incorporação do AZT no DNA genômico e os efeitos citotóxicos

causados pela presença do AZT no DNA, através do delineamento da

freqüência de mutações no gene HPRT e o espectro de mutações do tipo

deleção, por meio de amplificação gênica. Os resultados obtidos

demonstraram que os níveis de incorporação do AZT no DNA genômico

têm relação direta com o tempo de exposição das células à droga e que o

aumento significante da freqüência de mutações no gene HPRT foi

proporcional aos níveis de incorporação deste análogo ao DNA. As análises

moleculares das colônias mutantes, obtidas nos teste HPRT, TK e APRT,

demonstraram que a maioria das mutações induzidas pelo AZT foi

acompanhada por grandes deleções ou perda de heterozigose,

relacionadas com o mecanismo de terminação de cadeia que os análogos

de base exercem. Concomitantemente, a ddI foi moderadamente positiva,

tanto na presença quanto na ausência de ativação metabólica em

concentrações ≥ 2000 µg.mL-1 (Farmacopéia USP-DI/98).

Desde 1987, o AZT vem sendo utilizado em tratamentos contra a

AIDS em adultos e crianças. Em estudos comparativos, uma triagem

controlada com placebos demonstrou que o tratamento com o AZT reduziu

dramaticamente as taxas de transmissão do HIV de mãe para filho -

transmissão vertical ou transplacentária - tornando esta droga a principal

arma na prevenção da transmissão vertical do HIV (Ayers et al., 1997).

Entretanto, em bioensaios realizados para avaliar o potencial

carcinogênico do AZT, em ratos e camundongos expostos por via

transplacentária, alguns autores detectaram, além da presença de

carcinomas de células escamosas, limitados à vagina, uma leve anemia

macrocítica em fêmeas que receberam de 20 a 40 mg/kg/dia de AZT por

24 meses, porém sem apresentar efeitos carcinogênicos transplacentários.

Por outro lado, outros autores demonstraram que o AZT foi incorporado

ao DNA em diversos tecidos e descobriram grande incidência de tumores

no fígado e pulmões dos filhotes de camundongos, que receberam a droga

por via transplacentária e tumores em pulmões e órgãos reprodutores das

31

fêmeas nascidas, após 1 ano de idade (Olivero et al., 1994; Ayers et al.,

1997). Também, em ratos, o potencial carcinogênico do AZT por via

transplacentária foi significante. Em filhotes de ratazanas F344 que

receberam doses de 480, 240 e 80 mg de AZT / kg / dia, nos últimos sete

dias de gestação, houve um aumento na incidência de gliomas (2 a 4%)

comparado ao controle negativo (0%) (Walker et al., 2004). Em análise

por Southem blot, em diversos órgãos fetais de macacos Erythrocebus

patas, foram detectados encurtamentos de telômeros, após a

administração de coquetéis de NRTIs em fêmeas grávidas (Olivero et al.,

1997; 2002). Uma vez que a mutagênese está comumente associada

com a indução de tumores por via transplacentária em modelos

experimentais, crianças também expostas por esta via a combinações de

NRTIs podem ter riscos de desenvolver câncer no decorrer de suas vidas

(Meng et al., 2000b; Mittelstaedt et al., 2004).

Estudos de carcinogenicidade demonstraram a ocorrência de

neoplasias em células escamosas vaginais de 60 fêmeas de camundongos

que receberam AZT em doses de 120 mg/kg/dia, reduzidas até 40

mg/kg/dia. Adicionalmente, ratos que receberam doses de 600 mg/kg/dia,

reduzidas até 450-300 mg/kg/dia, apresentaram carcinoma de células

escamosas. Os tumores ocorreram ao final do curto período de vida

destes animais. O potencial carcinogênico do AZT foi demonstrado em

ensaios de transformação in vitro de células de mamíferos, utilizando-se

concentrações ≥ 0,5 µg.mL-1 (Farmacopéia USP-DI/98, Ayers et al.,

1997).

Embora os estudos sobre a carcinogenicidade destes fármacos em

humanos ainda não tenham apresentado evidências conclusivas, muitos

autores os consideram carcinógenos, baseados no seu modo de ação –

através da interferência no metabolismo de ácidos nucléicos e nas

evidências em organismos experimentais. Como a incorporação e o

subseqüente processamento dos análogos de base no DNA das células

alvo é, presumivelmente, uma pré-condição da atividade genotóxica

destes agentes, a extensão das lesões depende dos modelos

32

experimentais (por exemplo, o tipo de células utilizadas), da sua atividade

proliferativa, da duração da exposição e dos períodos pós-exposição

(Wutzler & Thust, 2001).

1.4. Recombinação somática e análise tóxico-genética

A princípio, a análise dos danos genéticos - decorrentes da

exposição dos organismos vivos aos agentes genotóxicos - concentrou-se

na indução de mutações gênicas e mutações cromossômicas – visto que

tais alterações genéticas eram consideradas como causas primárias de

doenças hereditárias. Portanto, a grande maioria dos ensaios

desenvolvidos para avaliar a toxicidade genética se restringia à avaliação

de parâmetros mutacionais em células germinais. Posteriormente,

verificou-se que, eventos mutacionais em tecidos somáticos poderiam

levar ao desenvolvimento de doenças somáticas que incluem câncer ou

anomalias neurológicas.

Mais recentemente, a recombinação tem sido considerada um

importante parâmetro de avaliação tóxico-genético uma vez que se

estabeleceu uma alta correlação entre estas lesões e o desenvolvimento

do processo carcinogênico. Além disso, eventos recombinacionais

poderiam explicar a existência de carcinógenos destituídos de atividade

mutagênica, seja ela gênica ou cromossômica (Richard, 1994; Stark &

Jasin, 2003). Na procura de respostas para tal comportamento, foram

desenvolvidos sistemas-teste voltados para a detecção de um novo

parâmetro genético - a recombinação mitótica - que poderia estar

envolvida na promoção do câncer mediada por tais agentes (Andrade &

Lehmann, 2003).

Estudos sobre os eventos genéticos envolvidos na formação de

tumores sugerem que um importante fator responsável pelo

desenvolvimento destas malignidades é a perda da heterozigose (Langlois

et al., 1989). Uma vez que conversão gênica e, em particular,

recombinação mitótica são potentes mecanismos que geram a perda da

33

heterozigose, infere-se que estes fenômenos são importantes tanto para

promoção de tumores, em células portadoras de heterozigose herdada,

como para células que adquiriram a heterozigose através de alterações

gênicas causadas por agentes químicos ou vírus tumorais (Guzmán-Rincón

& Graf, 1995). Existem também várias patologias que estão associadas ao

desenvolvimento de desordens genéticas associadas a neoplasias. A

Síndrome de Bloom, é uma rara desordem do crescimento, com

característica genética autossômica recessiva, que aumenta grandemente

as chances dos indivíduos acometidos de desenvolver câncer. Uma

característica constante da Síndrome de Bloom é um arranjo diferente das

anormalidades citológicas em uma variedade de tipos celulares, que

incluem alta freqüência espontânea de quebras e rearranjos

cromossômicos, trocas entre cromátides irmãs, células micronucleadas, e

células com mutações em locus específicos. Um complexo de

anormalidades citogenéticas, demonstradas facilmente em células in vitro

na Síndrome de Bloom, levanta a possibilidade de que mutações pontuais,

rearranjos cromossômicos e recombinações somáticas são também

substancialmente aumentadas in vivo na Síndrome de Bloom e isto

poderia explicar o extremo risco de desenvolvimento de câncer (Langlois

et al., 1989). Sendo assim, torna-se importante o desenvolvimento de

testes que façam a detecção simultânea dos eventos mutacionais clássicos

e rearranjos relacionados com recombinação mitótica.

1.5. Drosophila melanogaster na genética toxicológica

Durante este último século, a mosca-da-fruta foi o instrumento de

trabalho para estudos genéticos em eucariontes. Estes estudos fornecem

a base para a maior parte da nossa compreensão conceitual dos aspectos

fundamentais da genética dos eucariontes, incluindo a base cromossômica

da hereditariedade (Rubin & Lewis, 2000). Atualmente a Drosophila possui

uma variedade de linhagens, que apresentam diversos marcadores

moleculares e outras propriedades que facilitam as manipulações

34

genéticas. A clonagem molecular e a análise funcional dos genes da

Drosophila tornaram possível reunir um perfil molecular de muitos

processos celulares e de desenvolvimento. Genes clonados em Drosophila

levaram à identificação de cognatos em mamíferos que apresentam

funções intimamente relacionadas. Isto inclui fatores de transcrição e seus

reguladores, proteínas estruturais, proteínas cromossomais, canais iônicos

e proteínas sinalizadoras. Os genes homeobox são alguns dos exemplos

da conservação genética entre moscas e outros animais. Mais

recentemente, tem sido demonstrada uma alta correlação entre os

caminhos que controlam o desenvolvimento dos membros, sistema

nervoso, olhos, sistema circulatório, bem como um complexo de

interações sistêmicas - como o ritmo circadiano e imunidade inata. A

conservação dos processos biológicos entre moscas e mamíferos aumenta

a importância das pesquisas utilizando a Drosophila como organismo

experimental para elucidação de problemas relacionados com a saúde

humana, destacando-se os caminhos envolvidos no ciclo celular e na

biologia do câncer (Kornberg & Krasmow, 2000).

O aparato bem desenvolvido de sistemas utilizados para análise

genotóxica em Drosophila melanogaster tem sido amplamente utilizado

para testar também a antigenotoxicidade de vários compostos e misturas

complexas (Graf et al., 1984; 1998). Nos últimos anos, o teste para

detecção de mutação e recombinação em células somáticas de Drosophila

melanogaster (SMART) tem sido o mais empregado neste sentido. Este

teste é baseado no princípio de que a perda da heterozigose de

marcadores recessivos apropriados pode levar à formação de clones de

células mutantes, que são, então, expressas como manchas de células

mutantes nas asas das moscas adultas (Graf et al., 1984). O teste SMART

fornece um grande espectro de informações sobre a detecção de

mutações gênicas, mutações cromossômicas e/ou recombinações

genéticas, ocasionadas por genotoxinas de ação direta ou que necessitem

ser metabolizadas. Neste contexto, a vantagem de se trabalhar com a

Drosophila melanogaster torna-se ainda maior devido à semelhança da

35

atividade das suas enzimas de metabolização com as enzimas de fígado

de mamíferos (citocromo P-450) (Ramel & Magnusson, 1992). Outras

vantagens estão na presença de uma série de genes marcadores, nestes

insetos, que permitem a criação de testes específicos para a detecção e

triagem de atividade genotóxica em células germinais e somáticas e, por

fim, na possibilidade de se detectar, simultaneamente, em ensaios

genotóxicos como o teste SMART, alterações de mutações clássicas assim

como eventos relacionados com recombinação mitótica. Uma conveniência

apreciável da aplicação do teste SMART é a possibilidade de se qualificar

as atividades genotóxicas de muitas substâncias, confirmando efeitos de

natureza exclusivamente recombinogênica, enquanto outros testes

apresentam negatividade quando investigados efeitos mutagênicos e/ou

clastogênicos (Campesato et al., 1997).

36

2. OBJETIVOS

Visando contribuir para uma maior elucidação sobre a indução de

eventos mutagênicos e recombinogênicos induzidos pelos análogos de

base AZT e ddI, são propostos os seguintes objetivos:

1. Caracterização qualitativa da ação mutagênica e/ou recombinogênica

das drogas em estudo empregando o cruzamento padrão do teste SMART

de asa - que permite basicamente o diagnóstico de agentes genotóxicos

de ação direta;

2. Avaliação quantitativa dos diferentes tipos de eventos genotóxicos

induzidos pelos agentes antiretrovirais - estimando a sua contribuição

para a genotoxicidade total - através da comparação dos resultados

obtidos em dois diferentes genótipos, que permitem acompanhar

alterações genéticas específicas:

- genótipo trans-heterozigoto - que evidencia a ocorrência de

eventos mutagênicos e/ou recombinogênicos;

- genótipo heterozigoto para o cromossomo balanceador TM3 -

que expressa, exclusivamente, lesões do tipo mutação gênica e

mutação cromossômica.

37

3. MATERIAL E MÉTODO

3.1. Agente anti-retroviral

Foram utilizados neste trabalho a zidovudina (AZT, PM 267,2438) e

a didanosina (ddI, PM 236,2) adquiridas da Indústria Química de Goiás

(IQUEGO).

As soluções foram preparadas à hora dos tratamentos. O AZT foi

diluído em água destilada, em aproximadamente 40°C, nas concentrações

previamente calculadas de 6,25, 12,5, 25 e 50 mg.mL-1. A ddI foi diluída

em 5% tween 80 + 5% etanol absoluto, para a obtenção das

concentrações de 0,9375, 1,875, 3,75 e 7,5 mg.mL-1. Os respectivos

solventes foram utilizados como controles negativos.

3.2. Meios de cultura e condições de cultivo

Os estoques de Drosophila melanogaster foram mantidos em frascos

de vidro de 300mL contendo o meio de cultura padrão feito com 1000mL

de água destilada, 70g de açúcar cristal, 50g de fermento biológico

(Fleischmann e Royal Ltda), 7g de ágar, 0,005g de nipagin e 100g de

farinha de milho (Graf comunicação pessoal, modificado). Este meio de

cultura também foi utilizado para os cruzamentos.

Utilizamos também um meio de ovoposição, para obtenção de larvas

de terceiro estágio, contendo uma base sólida de ágar-ágar a 2,5% com

aproximadamente 1cm de espessura, coberta por uma camada de

aproximadamente 3cm de fermento pastoso (Fleischmann e Royal Ltda) -

previamente aquecido em banho-maria e fermentado com sacarose na

seguinte proporção: 500g de fermento, 2 colheres de açúcar e 20mL de

água destilada.

Os tratamentos das larvas foram feitos em tubos plásticos

descartáveis contendo 0,9g de meio de cultura instantâneo e hidratado

com 3mL de solução-teste.

38

Todas as culturas de Drosophila melanogaster foram mantidas a

25°C ± 1°C e a umidade de 60-70%.

3.3. Teste SMART

O teste SMART DE ASA avalia os pêlos das asas dos indivíduos

adultos, fundamentando-se no fato de que estas estruturas são originadas

durante o desenvolvimento embrionário, em um grupo de células (discos

imaginais das asas) que se proliferam por mitose até se diferenciarem

formando as asas durante a metamorfose. Se ocorrer alguma alteração

genética durante as divisões celulares, isto resultará em clones de células

mutantes que se expressarão como manchas de pêlos mutantes na

superfície das asas dos adultos (Graf et al., 1984; Andrade et al., 2003).

3.4. Linhagens de Drosophila melanogaster

Foram utilizadas, neste trabalho, duas linhagens de Drosophila

melanogaster. Cada linhagem possui genes marcadores específicos

localizados no braço esquerdo do cromossomo 3, que se expressam

fenotipicamente na forma dos pêlos das asas. Suas constituições

genotípicas encontram-se representadas abaixo:

• flr3 - flr3 / In(3LR)TM3,rippsepI(3)89Aabx34eeBds

• mwh - mwh/mwh

O cromossomo balanceador TM3, presente na linhagem flr3 é

indispensável para a manutenção do gene marcador flr3 em heterozigose,

pois este gene é letal zigótico (Garcia-Bellido & Dapena, 1974).

3.5. Cruzamento e tipos de larvas

Foi utilizado o cruzamento padrão no qual fêmeas virgens flr3

cruzaram com machos mwh. Este cruzamento origina larvas com duas

constituições genotípicas:

39

- larvas mwh + / + flr3 - trans-heterozigotas para os marcadores

recessivos mwh e flr3, ligados ao braço esquerdo do cromossomo 3;

- larvas mwh + / TM3, BdS - heterozigotas para o cromossomo

balanceador TM3. As asas destes indivíduos adultos tem um padrão

recortado, devido à presença do marcador BdS, o que permite diferenciá-

los dos imagos trans-heterozigotos que apresentam asas com formato

normal.

3.6. Tratamentos

Foram cruzados 80 fêmeas e 40 machos em vidros contendo meio

de cultura de farinha por um período de 3 dias. Ao término deste tempo

os casais foram transferidos para vidros contendo meio de ovoposição por

um período de 8 horas. Após este período, os casais foram descartados,

ficando apenas as larvas nos vidros, por 72 ± 4 horas a partir do início da

ovoposição. Estas larvas foram coletadas por flotação em água corrente,

quando atingiram o terceiro estágio e colocadas em tubinhos plásticos

descartáveis contendo meio de cultura sintético (0,9g) hidratado com as

soluções de tratamento (3mL). As larvas ficaram expostas aos

tratamentos, com diferentes concentrações da drogas, por

aproximadamente 48 horas (tratamento crônico), sendo que, neste

período, as células dos discos imaginais passaram por sucessivos ciclos de

divisão mitótica (5 a 6 divisões), sob a ação dos fármacos, até atingirem o

estágio de pupa.

Os indivíduos adultos nascidos de 10 a 12 dias após a postura dos

ovos foram conservados em etanol 70%.

3.7. Montagem das lâminas

As moscas estocadas em etanol 70% foram lavadas em água

corrente. Em seguida as asas dos imagos foram separadas do corpo com

auxílio de duas pinças de relojoeiro (n.5) e mergulhadas em solução de

40

FAURE (preparada com 30g de goma arábica, 20mL de glicerol, 50g de

hidrato cloral e 50mL de água). Após este procedimento as asas foram

retiradas da solução e distendidas sobre a superfície de lâminas de vidro

onde foram mantidas por um período de 24 horas (acondicionadas em

placas de Petri) para secagem. Posteriormente, foram cobertas com

lamínulas (24 x 32 mm), contendo uma gota da solução de FAURE,

permanecendo por mais 24 horas pressionadas com cubos de metal – com

peso total de aproximadamente 400g – visando uma perfeita aderência

das asas às lâminas. Foram montadas lâminas com imagos trans-

heterozigotos ou com imagos heterozigotos para o cromossomo TM3

separadamente, sendo que ambas continham cinco pares de asas de

fêmeas e cinco pares de asas de machos.

3.8. Análise microscópica

Foram analisados os adultos trans-heterozigotos e heterozigotos

para o cromossomo TM3, considerando-se o fenótipo dos tricomas

presentes nas superfícies dorsal e ventral das asas.

A presença de manchas simples, com um único tipo de fenótipo

mutante flr3 (pêlos de base alargada) ou mwh (pêlos múltiplos), pôde

determinar a ocorrência de diferentes eventos genéticos tais como

mutação pontual, alterações cromossômicas ou recombinação mitótica.

Por outro lado, manchas gêmeas contendo ambos fenótipos

mutantes, mwh e flr3 simultaneamente, formadas por células adjacentes,

expressaram exclusivamente eventos relacionados com recombinação.

Foram analisados os tricomas dos adultos trans-heterozigotos e dos

heterozigotos para o cromossomo TM3 presentes nas regiões ventral e

dorsal e nos compartimentos distais das asas - 5 indivíduos de cada sexo

por lâmina, em microscópio óptico com aumento de 400 vezes – para

serem determinadas as seções e o número de células mutadas (Garcia -

Bellido et al., 1976).

41

3.9. Bases genéticas

3.9.1. Adultos trans-heterozigotos

Observando-se a manifestação fenotípica da forma dos pêlos

presentes nas asas dos adultos trans-heterozigotos, podem-se

caracterizar os eventos ocorridos conforme o tipo de mancha mutante

encontrada. Sendo assim, manchas simples com fenótipo pêlos

múltiplos (mwh) ou pêlos com a base alargada (flr3) podem originar-se

por mutação gênica, mutação cromossômica e/ou recombinação mitótica.

As manchas simples com o fenótipo mwh podem ocorrer em

conseqüência de recombinação simples entre os loci mwh e flr3, ao passo

que a ocorrência de duas recombinações simples (entre flr3 e o

centrômero seguida de flr3 e mwh) origina pêlos de base alargada.

Desta forma, as manchas simples podem ser produto tanto de

eventos mutacionais - incluindo as mutações pontuais e mutações

cromossômicas - como também por recombinação mitótica. Já as

manchas gêmeas, cuja manifestação fenotípica expressa

simultaneamente os marcadores flr3 e mwh, são produzidas

exclusivamente por eventos de recombinação simples entre flr3 e o

centrômero, com posterior segregação de um cromossomo recombinado e

um parental.

3.9.2. Adultos heterozigotos para o cromossomo balanceador TM3

A análise das asas de indivíduos adultos heterozigotos para o

cromossomo TM3 revela exclusivamente manchas simples que expressam

o fenótipo pêlos múltiplos. Além disso, o cromossomo TM3 possui uma

série de inversões em aproximadamente 90% de toda a sua extensão,

causando inviabilidade das células que sofrem recombinação mitótica.

Conseqüentemente, células mutantes observadas nestes indivíduos são

42

resultantes de eventos relacionados com mutação gênica e/ou mutações

cromossômicas.

Portanto, a comparação dos resultados obtidos nos dois genótipos,

permite quantificar, separadamente, a porcentagem de eventos

mutagênicos e recombinogênicos no total de eventos genotóxicos

ocorridos.

3.10. Análise estatística

Em experimentos realizados para avaliação genotóxica de um

determinado fármaco, as séries tratadas são comparadas com uma série

controle, que geralmente é o solvente. A partir desta análise pode-se

calcular o potencial genotóxico do fármaco (Andrade et al., 2003). Frei &

Würgler (1988) propuseram duas hipóteses estatísticas que, quando

combinadas, permitem distinguir entre as possibilidades de um resultado

positivo, fraco positivo, inconclusivo ou negativo. Na hipótese nula (H0),

assume-se que não existe diferença na freqüência de mutações entre as

séries tratadas e o controle negativo (freqüência espontânea).

Considerando uma análise unicaudal, a rejeição da hipótese nula indica

que o tratamento resultou em uma freqüência de mutações

estatisticamente maior que o controle negativo. A hipótese alternativa

(HA) postula a priori que o tratamento resultou em uma freqüência de

mutações m vezes maior quando comparado com a freqüência

espontânea. O fator multiplicador (m) foi estabelecido empiricamente

como m=2 para o total de manchas e para as manchas simples pequenas,

devido a sua maior freqüência espontânea, e m=5 para as manchas

simples grandes e também para as manchas gêmeas (Frei & Würgler,

1988; 1995). A rejeição de HA indica que o tratamento não produz um

aumento suficiente de manchas para o composto ser considerado

genotóxico.

43

Para cada hipótese testada existem duas respostas possíveis: (i)

aceita-se H ou (ii) rejeita-se H. A combinação entre as respostas obtidas

para as duas hipóteses testadas pode ser visualizada no Quadro 1.

Quadro 1- Resultados possíveis obtidos a partir da combinação das

hipóteses Ho e HA.

HIPÓTESES Aceita-se H0 Rejeita-se H0

Aceita-se HA inconclusivo PositivoRejeita-se HA Negativo fraco positivo

Para testar as duas hipóteses foi utilizado o teste de χ2 para

proporções com um nível de significância igual a 5% (Andrade et al.,

2003).

44

4. RESULTADO

4.1. Efeito citotóxico e toxicidade genética

As concentrações das soluções de AZT, empregadas nos experimentos,

foram obtidas a partir de um experimento piloto onde foi determinada a

solubilidade máxima de AZT em água a aproximadamente 40°C. A partir

desta concentração máxima (50 mg.mL-1) foram estabelecidas as demais

concentrações seguindo o fator divisor 2 até a menor dose (6,25 mg.

mL-1). O mesmo critério foi adotado para a obtenção das concentrações da

ddI utilizadas nos experimentos. Entretanto, estas concentrações (0,9375

a 7,5 mg.mL-1) só foram obtidas utilizando-se como solvente 5% etanol +

5% tween 80.

Após estabelecidas as diluições dos fármacos, foi realizado um teste

de sobrevivência onde larvas de terceiro estágio foram expostas às

diferentes doses de AZT e ddI. Em todas as concentrações dos fármacos,

o número de indivíduos sobreviventes foi acima de 95% para o AZT e

acima de 70% para a ddI (resultados não apresentados).

Os resultados obtidos nos experimentos e sua avaliação estatística

estão apresentados na Tabela 1. Nos testes com o AZT foram analisados

um total de 350 imagos trans-heterozigotos e 350 indivíduos

heterozigotos para o marcador TM3, derivados de três experimentos

independentes. Paralelamente, nos três experimentos realizados com a

ddI, foram analisadas 297 indivíduos trans-heterozigotos e 248 imagos

heterozigotos para o cromossomo TM3. Em ambos foram incluídos os

respectivos controles negativos.

Os dados obtidos foram avaliados considerando-se os valores

individuais de cada um dos três diferentes tipos de manchas (manchas

simples pequena, manchas simples grande e manchas gêmeas), assim

como o número total de manchas observadas em cada uma das 4 doses

de AZT e ddI. Como podem ser observadas na Tabela 1, as freqüências de

45

aDiagnóstico estatístico de acordo com Frei e Würgler (1988): +, positivo; -, negativo; i, inconclusivo. m, fator de multiplicação para a avaliação de resultados significativamente negativos. Níveis de significância 0,05. bIncluindo manchas simples flr3 raras. cConsiderando os clones mwh para as manchas simples mwh e para as manchas gêmeas. dNúmeros entre chaves são as freqüências de indução corrigidas em relação a incidência espontânea estimada do controle negativo.eC = 48.000, isto é, número aproximado de células examinadas por indivíduo. fCalculado de acordo com Frei et al. (1992). gApenas manchas simples mwh podem ser observadas nos indivíduos heterozigotos mwh/TM3, já que o cromossomo balanceador TM3 não contém o gene mutante flr3.

TABELA 1Avaliação dos efeitos mutagênico e/ou recombinogênico do AZT e ddI em células somáticas de larvas de terceiro estágio provenientes de cruzamento padrão.Genótipos

e Conc.

(mg.mL-1)

N. deIndiv.

(N)

Manchas por indivíduo (nº de manchas) diag. estatísticoa

MSP MSG MG TM (1-2 céls.)b (>2 céls.)b

m = 2 m = 5 m = 5 m = 2

Totalmanchas

mwhc

(n)

Média dasclasses de tam.Clones mwhc,d

(î)

Freqüência de indução de manchas (por 105 células por

divisão celular)f

(n/NC)AZTmwh/flr3

Neg. contr. 70 0,30 (21) 0,11 (08) 0,04 (03) 0,46 (32) 31 2,29 0,916,25 70 0,97 (68) + 0,43 (30) + 0,20 (14) + 1,60 (112) + 111 2,44 {2,50} 3,25 {2,34}12,5 70 0,54 (38) + 0,30 (21) + 0,24 (17) + 1,09 (76) + 76 2,72 {3,02} 2,22 {1,32}25 70 0,64 (45) + 0,43 (30) + 0,17 (12) + 1,24 (87) + 87 2,57 {2,73} 2,55 {1,64}50 70 0,81 (57) + 0,49 (34) + 0,09 (06) i 1,39 (97) + 95 2,37 {2,41} 2,78 {1,87}

mwh/TM3Neg. contr. 70 0,20 (14) 0,04 (03)

6,25 70 0,20 (14) i 0,01 (01) i12,5 70 0,37 (26) + 0,06 (04) i25 70 0,24 (17) i 0,06 (04) i50 70 0,40 (28) + 0,14 (10) +

g0,24 (17) 17 1,59 0,50

0,21 (15) - 15 1,47 {2,50} 0,44 -{0,06}0,43 (30) + 30 1,70 {1,85} 0,88 {0,38}0,30 (21) i 21 1,95 {3,50} 0,61 {0,12}0,54 (38) + 38 1,84 {2,05} 1,11 {0,61}

ddImwh/flr3

Cont. neg. 60 0,43 (26) 0,08 (05) 0,02 (01) 0,53 (32) 32 1,88 1,090,9375 60 0,60(36) i 0,18 (11) i 0,00 (00) i 0,78 (47) i 47 2,02 {2,33} 1,61 {0,51}1,875 60 0,83 (50) + 0,18 (11) i 0,10 (06) i 1,12 (67) + 66 2,03 {2,18} 2,25 {1,16}3,75 60 0,63 (38) i 0,38 (23) + 0,12 (07) + 1,13 (68) + 68 2,47 {3,00} 2,32 {1,23}7,5 57 1,05 (60) + 0,23 (13) + 0,14 (08) + 1,42 (81) + 81 2,05 {2,15} 2,91 {1,82}

mwh/TM3Cont. neg. 50 0,34 (17) 0,02 (01)

0,9375 50 0,14(07) - 0,06 (03) i1,875 50 0,16 (08) - 0,02 (01) i3,75 50 0,18 (09) - 0,08 (04) i7,5 48 0,31 (15) - 0,02 (01) i

g 0,36 (18) 18 1,61 0,740,20 (10) - 10 1,90 {1,25} 0,41 -{0,33}0,18 (09) - 09 1,67 {1,56} 0,37 -{0,37}0,26 (13) - 13 2,08 {0,40} 0,53 -{0,20}0,33 (16) - 16 1,63 {1,44} 0,68 -{0,05}

manchas espontâneas alcançaram valores que são compatíveis com os

resultados apresentados na literatura (Graf et al., 1984).

4.2. Indivíduos trans-heterozigotos

A análise estatística dos resultados obtidos para os imagos trans-

heterozigotos nos experimentos com o AZT (Tabela 1) demonstrou que,

em todas as doses aplicadas, esta droga induziu aumentos significantes

nas freqüências de manchas simples pequenas, quando comparado às

freqüências espontâneas apresentadas no controle negativo, o mesmo

acontecendo com relação à indução de manchas simples grandes.

Entretanto, um único resultado inconclusivo foi observado na freqüência

de manchas gêmeas na maior dose aplicada.

Os resultados da análise estatística dos experimentos com a ddI

(Tabela 1) demonstraram aumento das freqüências de manchas simples e

gêmeas, quando comparadas com as freqüências obtidas no controle

negativo. Entretanto, os resultados obtidos no total de manchas

mostraram diagnóstico positivo dose-resposta para todas as

concentrações.

Considerando os resultados positivos no total de manchas

analisadas nos tratamentos com AZT e ddI podemos inferir que ambos

fármacos são capazes de induzir toxicidade genética relacionadas com

mutações e/ou eventos recombinacionais.

4.3. Indivíduos heterozigotos para o cromossomo TM3

A análise dos indivíduos heterozigotos para o cromossomo TM3

demonstrou que a freqüência total de manchas induzidas pelo AZT não

mantém uma relação dose-dependente. Porém, as três maiores

concentrações apresentam valores acima das freqüências do controle

negativo. Estes resultados foram aproximadamente 2,5 a 7,6 vezes

menores quando comparados com o total de manchas induzidas nos

indivíduos trans-heterozigotos. Infere-se, portanto, que o AZT pode

induzir eventos mutacionais, uma vez que a presença de manchas com

pêlos mutantes, em imagos heterozigotos para o cromossomo TM3, está

relacionada apenas com este tipo de evento.

Por outro lado, a análise dos efeitos mutacionais induzidos pela ddI

nas asas dos imagos heterozigotos para o cromossomo TM3 demonstrou

freqüências de indução de manchas menores ou próximas aos valores

encontrados no controle negativo. Estes resultados caracterizam a

ausência de um possível efeito indutor de mutações causado pela ddI.

4.4. Toxicidade genética padronizada por unidade de exposição

A Tabela 2 apresenta uma visão comparativa da atividade

genotóxica induzida pelos anti-retrovirais AZT e ddI. A análise dos

resultados obtidos com os indivíduos trans-heterozigotos permite observar

a indução de todos os tipos de eventos (mutacionais e recombinogênicos)

causados por estas drogas. A freqüência padronizada dos clones mwh, em

áreas de 105 células, demonstra a ação genotóxica total induzida por

mg.mL-1 dos fármacos, nos indivíduos trans-heterozigotos. Comparando-

se as freqüências padronizadas do AZT e ddI apresentadas na Tabela 2,

pode-se visualizar que a ddI tem um potencial genotóxico 4,25 vezes

maior que o AZT (0,34 clones na ddI para 0,08 clones induzidos no AZT).

Por outro lado, a análise das freqüências padronizadas de clones

mutantes induzida pelas drogas, nos indivíduos heterozigotos para o

cromossomo TM3, demonstra que a ddI tem uma atividade indutora de

mutações praticamente nula, ao passo que o AZT apresenta indução de

uma pequena freqüência de clones mutantes.

Quando se compara as freqüências padronizadas obtidas nos

indivíduos trans-heterozigotos e heterozigotos para o cromossomo TM3

pode-se obter a contribuição de eventos recombinogênicos, considerando

a genotoxicidade total induzida pelos anti-retrovirais. Os valores de

porcentagem de recombinação apresentados na Tabela 2 permitem a

aTodos os valores são corrigidos pelo controle. As freqüências nas moscas heterozigotas para os marcadores mwh/flr3 são calculadas com e sem correção para o tamanho dos clones; por conseguinte, estimativas um pouco diferentes são obtidas para as contribuições relativas de recombinação para os totais de clones induzidos. bAs freqüências de clones por indivíduo, divididas pelo número de células examinadas por indivíduo (48 800) dão uma estimativa das freqüências por célula e por divisão celular em experimentos de exposição crônica (Frei e Würgler, 1988). c,dA média geométrica e as correções foram calculadas de acordo com Frei et al. (1992).

TABELA 2Freqüência padronizada de indução de clones mwh por mg.mL-1 de concentração de exposição e a prevalência de eventos recombinacionais a

Compostos Trans-heterozigotos mwh/flr3 Heterozigotos para os marcadores mwh/TM3 Recombinação (%)Freqüência

padronizadab

(clones mwhpor 105 céls.por mg.mL-1)

Média geométricade tamanhodos clonesc

(células)

Freqüência padronizada por

105 céls.corrigida p/

tam. dos clonesd

Freqüênciapadronizadab

(clones mwhpor 105 céls.

por mg.mL-1)

Média geométricade tamanhodos clonesc

(células)

Freqüência padronizada por

105 céls.corrigida p/

tam. dos clonesd

Sem correçãopor tamanho

de clone

(ft) (2ît-1) (f’t=2ît-2 x ft) (fh) (2îh-1) (f’h=2îh-2 x fh) (1-fh/ft)x100

ddI 0,34 2,40 0,45 0,07 1,20 0,04 79,51

AZT 0,08 2,67 0,13 0,01 2,23 0,01 89,72

diagnose do AZT como um agente efetivamente indutor de eventos do

tipo recombinação mitótica (89,72%), porém capaz de induzir mutações

em menor proporção (10,28%) em células somáticas de D.

melanogaster. Do mesmo modo, os valores obtidos na análise da ddI

demonstram que este fármaco induz preferencialmente eventos

recombinacionais (79,51%), porém com uma porcentagem de indução

de mutações maior do que a do AZT (20,49%).

Os gráficos 1a e 1b mostram a distribuição das manchas de pêlos

mutantes em indivíduos trans-heterozigotos tratados com AZT e ddI.

Nos resultados apresentados pode-se observar que a maior incidência

de alterações está representada por clones com duas a quatro células

mutantes, sendo baixa a incidência de manchas grandes. Considerando-

se que, após o tratamento as células-alvo sofrem 5-6 ciclos de divisões

(Frei & Würgler, 1988), pode-se inferir que os medicamentos foram

capazes de induzir alterações, predominantemente, no final das divisões

celulares.

1 2 3 a 4 5 a 8 9 a 1617 a 32

33 a 6465 a128 129 a

256 >256

Cont. neg.

6,25

12,525

500

2

4

6

8

10

12

14

16

12

3 a 45 a 8

9 a 1617 a 32

33 a 6465 a128 129 a

256 >256

Cont. neg.

0,9375

1,875

3,75

7,50

5

10

15

20

25

30

35

Gráfico 1-Distribuição de manchas por classes em indivíduos trans-heterozigotos tratados com (a) AZT e (b) ddI.

(a)

(a)

(b)

5. DISCUSSÃO

O AZT e a ddI pertencem a uma classe de medicamentos

agrupados sob o nome genérico de antimetabólitos ou análogos de

bases que constituem um dos maiores grupos de quimioterápicos. Como

o próprio nome diz, estes compostos são capazes de serem

reconhecidos e incorporados erroneamente como intermediários

metabólicos normais, causando a inibição de rotas bioquímicas críticas,

destacando-se, neste caso, o metabolismo de ácidos nucléicos. A

estratégia de combate ao HIV através da quimioterapia com AZT e ddI

relaciona-se à capacidade destas drogas de bloquearem a enzima RT e,

uma vez incorporadas ao material genético, induzirem lesões que

podem levar à morte das células infectadas pelo vírus (Farmacopéia

USP-DI/98; Wutzler & Thust, 2001; Hoggard & Back, 2002; Peçanha et

al., 2002; De Clercq, 2004).

Os resultados obtidos neste trabalho revelaram que uma pequena parte

das lesões causadas pela incorporação do AZT (10,28%) originou

eventos caracterizados como mutação gênica e/ou cromossômica. Por

outro lado, a ddI demonstrou uma porcentagem de indução de

mutações maior do que a do AZT (20,49%). Entretanto, ficou

demonstrado que eventos recombinacionais são preferencialmente

induzidos pelo AZT (89,72%) e pela ddI (79,51%).

Estudos sobre o metabolismo da ddI revelaram que este

composto exerce sua atividade anti-viral em virtude da sua capacidade

de gerar didesoxiadenosina trifosfato (ddATP). Sabe-se que a etapa

inicial da fosforilação da ddI em ddIMP é catalizada pela 5’-nucleotidase

citossólica seguida pela aminação, via enzimas adenilosuccinato

sintetase e adenilosuccinato liase, em ddAMP. As posteriores

fosforilações são intermediadas pelas adenilato quinases. Entretanto,

analisando-se o pool de metabólitos da ddI em três linhagens celulares

diferentes, foi demonstrado que apenas 3% da ddI é convertida em

ddATP (Peter & Gambertoglio, 1998).

A fosforilação dos diferentes análogos nucleosídeos é altamente

dependente do estágio de ativação das células envolvidas. Um exemplo

disto é que a atividade da timidina quinase é de alguma forma

dependente do ciclo celular, não sendo surpreendente que o AZT seja

preferencialmente fosforilado em células ativadas. Por outro lado, o

sistema enzimático responsável pela ativação da ddI não é afetado pelo

ciclo celular e os níveis de fosforilação da ddI são iguais tanto em

células ativadas como em repouso (Peter & Gambertoglio, 1998). Um

fato importante ressaltado por Peter & Gambertoglio (1998) é que a

enzima difosfato quinase, que catalisa a última etapa de fosforilação,

pode utilizar tanto purinas quanto pirimidinas como substrato. Durante a

atividade celular, a construção da cadeia de DNA (na replicação ou nas

atividades metabólicas celulares) ocorre paralelamente à produção dos

nucleosídeos e nucleotídeos, que serão utilizados como substrato nesta

construção. Com o pool de análogos de nucleosídeos (AN) intracelular

maior ou igual ao de nucleosídeos endógenos, torna-se maior a

probabilidade das enzimas DNA polimerases utilizarem os análogos de

bases como substrato no lugar dos nucleosídeos endógenos.

Existem duas vias de síntese dos desoxirribonucleotídeos, sendo

uma via por síntese “de novo” e a outra por reciclagem de nucleotídeos

não utilizados pela célula. Os desoxirribonucleotídeos sintetizados por

reciclagem são importantes para os mecanismos de reparo no DNA

(Rompay et al., 2003). As enzimas que participam deste processo são

as desoxirribonucleosídeo quinases (dNK), as nucleosídeo mono-fosfato

quinases (NMPK) e as nucleosídeo difosfato quinases (NDPK).

Entretanto, a fosforilação dos nucleosídeos, assim como dos análogos de

nucleosídeos, é irreversível para os di- e trifosfatos, sendo exceção os

monofosfatos, que podem voltar a nucleosídeos pela 5’-nucleotidase

(Rompay et al., 2003). Com o aumento no pool de AZT intracelular, o

AZT monofosfato (AZTMP) torna-se um substrato alternativo inibidor da

construção da desoxitimidina monofosfato (dTMP) pela desoxitimidina

monofosfato quinase (dTMPK). Isto pode resultar na redução da

desoxitimidina trifosfato endógena (dTTP) na mitocôndria e diminuir,

então, a síntese de DNA mitocondrial (Rompay et al., 2003). O AZTMP

tem sido apresentado como o metabólito mais tóxico do AZT, e estudos

recentes apresentaram evidências de que o AZTMP é comumente

formado no citossol e é o responsável principal pela toxicidade celular. A

incorporação dos AN no DNA nuclear causa quebra na cadeia de DNA

(fase S) e parece ser crucial na iniciação da apoptose. A presença dos

AN no DNA causa a interrupção no elongamento da cadeia e,

posteriormente, também causam resistência à revisão pelas

exonucleases (Rompay et al., 2003), tornando maior a possibilidade de

permanecerem pequenos erros na construção do DNA, que podem

transformar-se em lesões do tipo mutação e/ou recombinação o que

aumenta as chances de iniciação de tumores.

O fator mais importante na inibição do HIV é a interação dos

2’-3’-didesoxinucleosídeos trifosfatos com os 2’-desoxinucleosídeos-

5’-trifosfatos endógenos e a razão resultante (ddNTP/dNTP) desta

interação, uma vez que eles competem diretamente entre si pela RT

viral. Estudos in vitro utilizando diferentes tipos celulares demonstraram

que o AZT reduz substancialmente o pool de timidina trifosfato em

células P19 em até 4 vezes. Entretanto, esta redução depende

parcialmente do tipo celular. No total, a razão AZTTP/TTP é maior em

células ativadas, o que pode explicar a melhor atividade anti-viral do

AZT nestas células (Peter & Gambertoglio, 1998) .

O teste que utiliza Salmonella typhimurium (teste de Ames) foi o

único método no qual o AZT não demonstrou efeito mutagênico. Neste

teste, o AZT parece não exercer nenhuma atividade sobre o genoma

bacteriano, devido à ausência de enzimas de fosforilação compatíveis

com as enzimas presentes nos demais organismos experimentais e que

são específicas e necessárias para ativar esta droga. Uma vez que estas

enzimas de fosforilação são essenciais também no que tange a ativação

da ddI, este método também não foi capaz de detectar mutações

relativas à ação deste medicamento (Wutzler et al., 2001).

Por outro lado, outros trabalhos consideram o AZT como um

potencial agente indutor de mutações em vários modelos experimentais.

Foi demonstrada uma correlação direta entre a incorporação do AZT ao

DNA genômico e o tempo de exposição em células linfoblastóides

humanas TK6, causando um aumento, preferencialmente, na indução de

grandes deleções (64% das mutações induzidas), visualizadas através

do incremento nas freqüências de mutantes HPRT e analisadas por

amplificação gênica. Estas freqüências de mutações aumentaram para

84% quando o parâmetro avaliado foi o gene TK (Meng et al., 2000c).

Estes resultados foram confirmados em experimentos que analisaram

alterações no locus APRT, nas mesmas condições experimentais, com

freqüências de indução semelhantes àquelas obtidas nas análises para o

locus TK. Entretanto tais resultados foram três vezes maiores que

aqueles obtidos para o gene HPRT. Análises moleculares de mutantes

HPRT, TK e APRT indicaram um papel dominante da perda de

heterozigose nos eventos mutagênicos induzidos pelo AZT (Meng et al.,

2000c; Mittelstaedt et al., 2004). Os três trabalhos apresentam uma

alta correlação entre a incorporação de AZT ao DNA celular e o aumento

nas freqüências de mutações nos genes HPRT, TK e APRT, indicando que

os efeitos adversos do AZT podem estar, em parte, relacionados à

incorporação do AZT no DNA celular e subseqüente terminação de

cadeia conforme propostos anteriormente por Sussman et al., 1999.

O AZT apresentou um efeito mutagênico sinergístico com a ddI

quando foi testada a combinação AZT+ddI em bioensaios utilizando

células humanas mutantes para os genes HPRT e TK. Acredita-se que,

em parte, este efeito sinergístico foi causado pelo aumento da

incorporação do AZT, tanto no DNA viral quanto no DNA celular, devido

à co-exposição aos dois agentes anti-retrovirais (Meng et al., 2000b).

Por outro lado, o AZT demonstrou atividade clastogênica através

da indução de micronúcleos em células de medula óssea de

camundongo em doses razoavelmente altas (≥ 200 a 500 mg/Kg/dia),

enquanto a ddI somente foi capaz de induzir micronúcleos em

concentrações muito altas, incompatíveis com as doses usualmente

empregadas em tratamentos clínicos. Sendo assim, a ddI foi

considerada incapaz de induzir a formação de micronúcleos (Phillips et

al., 1991).

Os resultados obtidos com os dois NRTIs no teste SMART de asa,

após exposição crônica das larvas oriundas do cruzamento padrão,

revelaram que a toxicidade genética do AZT e da ddI mescla uma leve

incidência de mutações com índices relativamente altos de

recombinação.

Uma alteração genética comum nas células tumorais é a perda de

heterozigose que pode envolver a perda de grandes segmentos de

cromossomos e posteriormente causar perdas substanciais de

informação genética do alelo específico. Esta é uma das alterações

genéticas mais comumente observadas em tumores esporádicos e

presume-se que esta seja uma etapa obrigatória na tumorigênese em

muitas síndromes de cânceres familiares envolvendo genes supressores

tumorais (Langlois et al., 1989). O mecanismo potencial de perda da

heterozigose pode ser deduzido de uma análise do cariótipo do tumor e

dos marcadores que são polimórficos entre cromossomos parentais. A

perda da heterozigose pode surgir por muitos caminhos, incluindo

deleções, não-disjunção mitótica bem como a recombinação entre

cromossomos homólogos. Cada um destes caminhos tem implicado

também na geração da perda de heterozigose em modelos

experimentais, como camundongos, com recombinação mitótica

predominando na maioria dos casos (Stark & Jasin, 2003).

Os processos mediados por recombinação podem ocorrer em

vários estágios do ciclo celular, podendo ser distinguidas na mitose a

recombinação homóloga e a não-homóloga (Wijnhoven et al., 2001). A

recombinação homóloga pode desempenhar um papel fundamental na

carcinogênese, uma vez que, conversões gênicas, deleções, trans-

locações, amplificações gênicas e crossing-over desiguais podem ser

mediadas por este mecanismo e contribuem para o desenvolvimento de

alguns tipos de tumores (Bishop & Schiestl, 2001). Bishop & Schiestl

(2003) afirma, ainda, que, a recombinação homóloga pode atuar em

diferentes estágios da carcinogênese, contribuindo para a iniciação

tumoral, mas atuando principalmente em etapas subseqüente da

progressão tumoral.

No presente trabalho foram diagnosticadas altas freqüências de

recombinação homóloga induzidas pelos agentes anti-retrovirais AZT e

da ddI. Estes resultados indicam uma maior necessidade de

investigações sobre os efeitos potenciais em humanos, especialmente

aqueles que recebem AZT por razões profiláticas. Os resultados obtidos

em células linfoblastóides indicam que a quimioprofilaxia perinatal com

AZT pode expor as crianças de mães HIV positivas a um risco potencial

de alterações genéticas (Sussman et al., 1999). O aumento da utilização

de AZT como agente profilático para indivíduos HIV-negativos, de alto

risco, e mulheres grávidas HIV-positivo, merece um detalhamento nas

relações entre terapias com o AZT (monoterapias ou coquetéis),

incorporação do AZT ao DNA das células e mutagenicidade e potencial

risco à saúde humana em longo prazo.

6. PERSPECTIVAS PARA FUTURAS INVESTIGAÇÕES

A relação que existe entre os mecanismos que levam ao

surgimento de neoplasias e o tipo de lesão no DNA torna muito

importante o conhecimento acerca dos mecanismos de ação dos

fármacos para que se possa prevenir ou pelo menos avaliar os possíveis

danos que uma terapia com os análogos de base pode causar em um

organismo. As combinações entre as drogas são muito utilizadas nos

coquetéis anti-AIDS, seja para aumentar a eficácia dos tratamentos a

longo prazo, para aumentar a eficácia na prevenção da transmissão

vertical do vírus HIV ou para diminuir os índices de mutações do HIV

que podem levar ao desenvolvimento de resistência do vírus às terapias

de longa duração. O objetivo destas combinações é potencializar a ação

de um ou mais fármacos utilizados no coquetel, para que prevaleça a

função esperada e mais pertinente para cada caso, ficando os demais

componentes como coadjuvantes na terapia. Muitos estudos em torno

dos efeitos de cada combinação tem sido realizados de forma

comparativa, entre os efeitos das monoterapias e os efeitos das

combinações – também chamadas terapias cruzadas. O AZT e a ddI tem

diferentes perfis de cada um dos seus efeitos, e foram consideradas

componentes para a combinação mais favorável de drogas para inibir a

replicação viral e para prevenir a transmissão perinatal do HIV. Nos

testes de mutagenicidade o AZT produziu efeitos primariamente

clastogênicos em culturas de células humanas e em camundongos

expostos a altas concentrações e também a concentrações clinicamente

relevantes, ao passo que a ddI produziu respostas clastogênicas e

mutagênicas apenas em doses muito elevadas. Em um estudo realizado

para comparar a genotoxicidade e mutagenicidade destas drogas em

monoterapias e em terapias combinadas (AZT + ddI), foram

demonstrados aumentos nos níveis de incorporação do AZT no DNA em

células expostas às drogas combinadas (33µM AZT + 33µM ddI) muito

acima dos níveis de incorporação destas drogas em células expostas a

monoterapias. Previamente, a análise de citotoxicidade demonstrou que

a ddI foi mais citotóxica que o AZT em células TK6 de linfócitos

humanos, mesmo em menores concentrações (900µM AZT para

~500µM ddI). As respostas mutagênicas nos genes HPRT e TK foram

analisadas em amostras de células tratadas com AZT, ddI e AZT + ddI.

Exposições às drogas individuais causaram aumentos significativos na

freqüência de mutações no gene HPRT a concentrações ≥ 300µM de

ambas as drogas. Entretanto, a exposição a combinações equimolares

das drogas produziu uma freqüência de mutações significativamente

elevada em todas as concentrações utilizadas, podendo chegar a valores

três vezes maiores que os valores de indução em terapias com apenas

uma das drogas (Meng et al., 2000b). O aumento sinergístico das

respostas mutagênicas em terapias combinadas das drogas está

correlacionado com a potencialização da incorporação do AZT no DNA

causada por este tipo de tratamento. Esta disparidade indica que as

coexposições AZT-ddI, comparadas com a ddI sozinha, levam a

potencialização da contribuição da ddI nos mecanismos de

mutagenicidade, diretamente também pelo aumento na incorporação de

ddI no DNA ou indiretamente através do aumento da inibição das DNA

polimerases, de alterações no pool de nucleosídeos, inibição de enzimas

que participam da biossíntese do DNA e/ou pela interferência nos

processos de reparo no DNA (Meng et al., 2000b).

Desta forma, este registro sobre os efeitos da interação entre o

AZT e a ddI estabelece um valor ainda maior para o conhecimento dos

mecanismos de ação e efeitos individuais de cada uma destas drogas

para que se possa desvendar o porque do aumento na indução de

respostas mutagênicas em exposições aos coquetéis. Torna-se

necessária, ainda, a continuidade da investigação acerca dos potenciais

de indução de mutação e recombinação com estas drogas associadas.

Uma vez que o benefício clínico das terapias cruzadas já foi estabelecido

e as causas do aumento nos níveis de mutações ainda são obscuras, um

critério de avaliação acerca do custo benefício deve ser o maior

responsável pela escolha da melhor forma de terapia a ser utilizada.

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