Análises Microbiológicas de Alimentos de Origem Animal e Água IFTM.pdf

2013

Mariana Torres de Castro

Tcnica em Alimentos e laticnios

Anlises Microbiolgicas de Alimentos de Origem Animal e

gua

INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAO, CINCIA E TECNOLOGIA DO TRIANGULO MINEIRO CAMPUS ITUIUTABA

2

Sumrio ANLISES MICROBIOLGICAS PARA CONTROLE DE PRODUTOS DE ORIGEM ANIMAL E GUA ... 4

CONTAGEM PADRO DE MICRORGANISMOS MESFILOS AERBIOS ESTRITOS E

FACULTATIVOS VIVEIS ......................................................................................................... 5

CONTAGEM DE BOLORES E LEVEDURAS ................................................................................ 7

PROCEDIMENTOS .............................................................................................................. 7

CONTAGEM DE MICRORGANISMOS MESFILOS AERBIOS VIVEIS CAPAZES DE CAUSAR

ALTERAO EM PRODUTOS LCTEOS LQUIDOS UHT ............................................................ 9

CONTAGEM DE Clostridium SULFITO REDUTORES E DE Clostridium perfringens................... 13

CONTAGEM DE Staphylococcus aureus ................................................................................ 17

CONTAGEM DE COLIFORMES TOTAIS E COLIFORMES TERMOTOLERANTES EM ALIMENTOS 21

CONTAGEM DE Bacillus cereus ............................................................................................ 23

CONTAGEM TOTAL DE ENTEROBACTRIAS .......................................................................... 27

NMERO MAIS PROVVEL DE COLIFORMES TOTAIS E COLIFORMES TERMOTOLERANTES EM

GUA E GELO ...................................................................................................................... 29

NMERO MAIS PROVVEL DE COLIFORMES TOTAIS E COLIFORMES TERMOTOLERANTES EM

ALIMENTOS ......................................................................................................................... 32

NMERO MAIS PROVVEL DE Staphylococcus aureus ......................................................... 35

NMERO MAIS PROVVEL DE Vibrio parahaemolyticus (Pescado e Derivados) ....................... 39

NMERO MAIS PROVVEL (NMP) DE MICRORGANISMOS MESFILOS AERBIOS VIVEIS

CAPAZES DE CAUSAR ALTERAO EM PRODUTOS LCTEOS UHT E ESTERILIZADOS,

PASTOSOS E VISCOSOS. ....................................................................................................... 46

PESQUISA DE Listeria monocytogenes (alimentos crneos e lcteos). .................................. 51

PESQUISA DE Salmonella (alimentos de origem animal, raes e ingredientes). .................. 58

PESQUISA DE Salmonella POR SEPARAO IMUNOMAGNTICA (IMS)................................. 67

PESQUISA DE Vibrio cholerae .............................................................................................. 70

PESQUISA DE Escherichia coli O157: H7 ............................................................................... 78

PESQUISA DE Paenibacillus larvae subsp. Larvae (produtos da colmeia). ............................. 86

TESTE DE ESTERILIDADE COMERCIAL PARA ALIMENTOS DE BAIXA ACIDEZ pH > 4,6 .......... 91

DILUIES E SOLUES .......................................................................................................... 97

DILUIES ........................................................................................................................... 97


3

SOLUES ......................................................................................................................... 102

PROCEDIMENTOS BSICOS DE CONTAGEM ........................................................................... 108

TCNICAS DE CONTAGEM EM PLACAS ............................................................................... 108

TCNICA DE NMERO MAIS PROVVEL ............................................................................. 109

Tabelas de NMP ................................................................................................................ 116

PROCEDIMENTOS PARA CONTAGEM DE COLNIAS ............................................................... 127

PROCEDIMENTOS PARA O PREPARO, PESAGEM E DESCARTE DE AMOSTRAS ......................... 137

PROCEDIMENTOS DE MICROSCOPIA ..................................................................................... 143

PROCEDIMENTOS DE COLORAO ........................................................................................ 150

Bibliografia ........................................................................................................................... 159


4

ANLISES MICROBIOLGICAS PARA CONTROLE DE PRODUTOS DE ORIGEM ANIMAL E GUA

Essas anlises foram retiradas da Instruo Normativa N 62, de 26 de Agosto de 2003, em que oficializou os mtodos Analticos para Anlises Microbiolgicas para Controle de Produtos de Origem Animal e gua.


5

CONTAGEM PADRO DE MICRORGANISMOS MESFILOS AERBIOS ESTRITOS E FACULTATIVOS VIVEIS

FUNDAMENTO

Baseia-se na semeadura da amostra ou de suas diluies em gar padro para contagem seguida de incubao em temperatura de 36 1C por 48 horas. Aplica-se a amostras de matrias-primas, gua e alimentos.

REAGENTES E MATERIAIS

Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos;

Agar padro para contagem (PCA);

Soluo salina peptonada 0,1%.

EQUIPAMENTOS

Equipamentos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos. PROCEDIMENTOS

1. Pesagem e preparo da amostra: Pesar 25 0,2 g ou pipetar 25 0,2 ml da amostra, de acordo com os procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras. Adicionar 225 ml de soluo salina peptonada 0,1%. Homogeneizar, esta a diluio 10-1.

2. Inoculao em placas: A partir da diluio inicial (10-1), efetuar as demais diluies desejadas em soluo salina peptonada 0,1%, de acordo com os procedimentos para diluies e solues. Semear 1 ml de cada diluio selecionada em placas de Petri estreis. Adicionar de 15 a 20 ml de PCA fundido e mantido em banho-maria a 46-48C. Homogeneizar adequadamente o gar com o inculo. Deixar solidificar em superfcie plana.

3. Incubao: Incubar as placas invertidas a 36 1C por 48 horas. 4. Leitura:

Segundo o tipo de amostra em anlise, realizar a leitura selecionando as placas de acordo com o seguinte critrio, contando todas as colnias presentes:

Produtos em geral: Placas que contenham entre 25 e 250 colnias;

Amostras de gua: Placas que contenham entre 30 e 300 colnias.


6

RESULTADOS

A partir dos dados obtidos, calcular o nmero de microrganismos presentes na amostra em anlise, seguindo os procedimentos para contagem de colnias. Expressar o resultado em UFC/g ou ml.


7

CONTAGEM DE BOLORES E LEVEDURAS

FUNDAMENTO

Baseia-se na verificao da capacidade desses microrganismos se desenvolverem em meios de cultura com pH prximo a 3,5 e temperatura de incubao de 25 1C. A utilizao de meios acidificados a pH 3,5 0,1 promove seletivamente o crescimento de fungos, inibindo a maioria das bactrias presentes no alimento.



gar batata glicose 2%;

L(+) cido tartrico 10%;


EQUIPAMENTOS

Equipamentos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos.

PROCEDIMENTOS

1. Preparo das placas: fundir o gar batata glicose. Resfriar em banho-maria at 46-48C. Acidificar o meio at pH 3,5 por meio da adio de 1,5 ml de soluo de cido tartrico 10% para cada 100 ml de meio. Verter nas placas aproximadamente15 a 20 ml. Deixar solidificar em superfcie plana. Identificar as placas. Antes da utilizao, secar as placas semiabertas com o fundo voltado para cima em estufa a 50C por aproximadamente 15 minutos, ou em fluxo laminar expondo a superfcie pelo tempo necessrio para a completa secagem.

2. Pesagem e preparo da amostra: pesar 25 0,2 g ou pipetar 25 0,2 ml da amostra. Adicionar 225 ml de soluo salina peptonada 0,1%. Para amostras de doce de leite e de leite condensado, utilizar como diluente soluo salina peptonada com 20% de glicose. A partir da diluio inicial 10-1, efetuar as diluies desejadas.

3. Inoculao em placas: Inocular 0,1 ml das diluies selecionadas sobre a superfcie seca de gar batata glicose 2% acidificado a pH 3,5. Com o auxlio de ala de Drigalsky ou basto do tipo hockey, espalhar o inculo cuidadosamente por toda a superfcie do meio, at sua completa absoro. Utilizar no mnimo duas diluies decimais ou duplicata da mesma diluio. Nos casos em que a legislao exigir valores menores que 100 UFC/g ou ml, distribuir em duplicata 1 ml da diluio 10-1 em 3 placas (0,4 ml, 0,3 ml e 0,3 ml). No caso de produtos lquidos poder ser inoculado 0,1 ml diretamente da amostra (10), o que corresponder diluio 10-1.

4. Incubao: Incubar as placas, sem inverter, a 25 1C, por 5 a 7 dias, em incubadora de B.O.D.


8

5. Leitura: Selecionar as placas que contenham entre 15 e 150 colnias.

OBSERVAO: No abrir, em hiptese alguma, as placas que contenham crescimento de fungos, para evitar a contaminao ambiental por meio da disperso dos seus esporos.

RESULTADOS A partir dos dados obtidos, calcular o nmero de microrganismos presentes e expressar o resultado em UFC/g ou ml.


9

CONTAGEM DE MICRORGANISMOS MESFILOS AERBIOS VIVEIS CAPAZES

DE CAUSAR ALTERAO EM PRODUTOS LCTEOS LQUIDOS UHT

FUNDAMENTOS

Pr-incubao

Baseia-se na incubao das amostras em estufa a 36 1C por 7 dias e posterior verificao da ocorrncia de alteraes das caractersticas do produto.

Contagem em placa

Baseia-se na semeadura da amostra e suas diluies em gar crebro-corao e em gar nutriente isento de extrato de levedura, seguida de incubao a 30 1C por 72 horas, e posterior identificao dos microrganismos presentes.

Limitaes do Mtodo

Devido opacidade produzida pela homogeneizao do meio de cultura com alguns tipos de amostras, pode haver dificuldade para a contagem de colnias na diluio 100. Nesses casos, o resultado final deve ser obtido nas diluies subsequentes, o que pode resultar em dados finais estimados.



gar crebro-corao (ABHI);

gar nutriente isento de extrato de levedura;

gar esculina; Caldo crebro-corao nitrato (BHI-NO3);

Caldo vermelho de fenol com glicose; Soluo salina peptonada 0,1%;

gar ureia;

Reativo para oxidase (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina ou oxalato de para-amino-dimetilanilina) ou tiras para teste de oxidase (comercialmente disponveis);

Perxido de hidrognio 3%;

Alfa-naftilamina 0,5%;

cido sulfanlico 0,8%;

Corantes para colorao de Gram;

Zinco em p; Etanol 70% ou Etanol 70 GL;

Reagentes para colorao de Gram.


10

EQUIPAMENTOS


PROCEDIMENTOS

Preparo da amostra

Aps a pr-incubao, as amostras visualmente inalteradas devem ser agitadas por 25 vezes. Antes da abertura, desinfetar externamente as embalagens com soluo desinfetante e aps com etanol 70% ou etanol 70GL. Deixar secar. Com auxlio de tesouras ou bisturis previamente esterilizados, abrir a embalagem. Caso se observe alterao evidente (coagulao, floculao, dessorao, odor no caracterstico ou outros), interromper a anlise e reportar como produto alterado aps incubao a 36 1C por 7 dias. As amostras que apresentarem qualquer alterao no devem ser analisadas. Reportar o resultado como amostra alterada, incluindo informaes sobre o tipo de alterao observada.

Contagem em placas

Diluir a amostra em tubos contendo 9 ml de soluo salina peptonada 0,1% at 10-2. Pipetar 1 ml diretamente da amostra (100) e 1 ml de cada uma das diluies preparadas (10-1 e 10-2), transferindo-as para placas de Petri estreis, em duplicata. Adicionar aproximadamente20 ml de gar crebro-corao (ABHI) a uma das placas de cada diluio. Nas demais, adicionar aproximadamente 20 ml de gar nutriente isento de extrato de levedura. Homogeneizar adequadamente os meios com os inculos. Deixar solidificar. Inverter as placas.

Incubao

Incubar as placas a 30 1C por 72 horas.

Leitura

Verificar a presena de colnias nas placas, contando cada uma e observando suas caractersticas. Selecionar placas que contenham entre 25 e 250 colnias para a realizao da contagem, se os resultados de contagem obtidos em ambos os meios forem coerentes entre si. Se os resultados forem discrepantes entre si, considerar o resultado obtido nas placas de ABHI.

Quando o crescimento bacteriano devido presena de esporos de Bacillus sporothermodurans na amostra em anlise, ser observado nas placas de ABHI um abundante crescimento de colnias lisas, de forma regular, com colorao entre branco e bege, com dimetro mximo de 3 mm, facilmente identificveis. No gar nutriente isento de extrato de levedura, o Bacillus sporothermodurans comumente no forma colnias visveis, porm podero se desenvolver colnias puntiformes, de colorao entre branco e bege.


11

Esta diferenciao necessria porque as colnias de Bacillus sporothermodurans no devem ser contabilizadas no clculo de mesfilos aerbios viveis capazes de causar alterao no produto. Quando for observado crescimento em ambos os meios, realizar a contagem nas placas de ABHI, registrando em separado o nmero de colnias suspeitas de serem Bacillus sporothermodurans, que devero ser confirmadas de acordo com o que segue: Repicar 3 a 5 colnias suspeitas para tubos com ABHI inclinado. Incubar a 36 1C por at 72h. Realizar os testes confirmatrios.

Testes Confirmatrios

1. Colorao de Gram: Preparar esfregao e corar pelo mtodo de Gram. Quando forem observados bastonetes Gram positivos, realizar a prova da catalase. Quando forem observados microrganismos com morfologia e caractersticas diferentes de bastonetes Gram positivos, reportar o nmero encontrado como a contagem total de microrganismos aerbios mesfilos.

2. Catalase: Com auxlio de ala de platina, palito de madeira, basto de vidro ou Pipeta de Pasteur, estreis, transferir a cultura para uma lmina ou placa de vidro contendo uma gota de perxido de hidrognio 3%. Misturar o inculo ao perxido e observar a reao. A no formao de borbulhas indica prova negativa para catalase. A formao de borbulhas indica prova positiva para catalase. A maioria dos membros do gnero Bacillus apresentam reao de catalase positiva. Quando a colorao de Gram demonstrar a presena de bastonetes Gram positivos e a prova da catalase for positiva para a cultura em teste, confirmar a presena de Bacillus sporothermodurans por meio das provas da oxidase, crescimento em anaerobiose, hidrlise da esculina, fermentao da glicose, reduo do nitrato e produo de urease, conforme abaixo descrito.

3. Oxidase: Usando ala de platina, Pipeta de Pasteur, palitos de madeira ou de plstico, descartveis e estreis, realizar a prova de oxidase, espalhando a cultura sobre papel-filtro impregnado com o reativo para oxidase ou sobre tiras para teste de oxidase. Fazer a leitura em 10 a 20 segundos. Aps esse tempo, reaes falso-positivas podem ocorrer. O aparecimento de cor azul (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina) ou vermelho intenso (oxalato de para-amino-dimetilanilina) indicativo de uma reao positiva. No utilizar alas de nquel-cromo ou alas de ao inoxidvel para realizar a prova de oxidase, pois traos de xido de ferro na superfcie flambada pode produzir reao falso-positiva. O Bacillus sporothermodurans apresenta reao de oxidase positiva.

4. Crescimento em anaerobiose: Inocular a cultura em tubos de ABHI inclinados e incubar em jarra de anaerobiose a 36 1C por 72h. O Bacillus sporothermodurans no cresce em anaerobiose.

5. Hidrlise da esculina: Inocular a cultura, com agulha, em tubos contendo gar esculina inclinado. Incubar a 36 1C por 72h. A hidrlise da esculina evidenciada pelo enegrecimento do meio. O Bacillus sporothermodurans hidrolisa a esculina.

6. Fermentao da glicose: Semear tubos com caldo vermelho de fenol-base adicionados de glicose.


12

7. Incubar a 36 1C por at 72 horas. A viragem de cor do indicador vermelho de fenol para amarelo indica a fermentao do acar presente. O Bacillus sporothermodurans no fermenta a glicose.

8. Reduo de nitrato: Inocular a cultura, com ala, em tubos contendo caldo BHINO3. Incubar a 36 1C por 72 horas. Aps incubao, adicionar aos tubos 0,5 a 1 ml de alfa naftilamina 0,5%, e 0,5 a 1 ml de cido sulfanlico 0,8%. O aparecimento de colorao rosa indica positividade para reduo de nitrato. Quando no houver desenvolvimento de colorao, adicionar ao tubo alguns miligramas de p de zinco. Nessa situao, o aparecimento de colorao rosa indica reao negativa, enquanto que o no desenvolvimento de cor indica positividade. O Bacillus sporothermodurans no reduz o nitrato a nitrito.

9. Prova da urease: Inocular a cultura, com ala, em tubos ou placas contendo gar ureia. Incubar a 36 1C por 72h. Observar o crescimento com mudana de colorao para rosa intenso, o que indica positividade para produo de urease. O Bacillus sporothermodurans no produz urease.

RESULTADOS

A partir dos dados obtidos, calcular o nmero de microrganismos mesfilos aerbios viveis presentes na amostra em anlise. O nmero de UFC/ml de Bacillus sporothermodurans no dever ser reportado como resultado da contagem de mesfilos aerbios.

Quando estes microrganismos forem encontrados, constar como observao: Presena de Bacillus sporothermodurans. Somente ser reportado o nmero de unidades formadoras de colnias de outros mesfilos encontrados.

Devero ainda acompanhar o resultado da anlise informaes adicionais sobre o tipo de microrganismo encontrado (como por exemplo: cocos Gram positivos, bastonetes Gram negativos, flora mista, etc.) ou o(s) microrganismo(s) aerbio(s) presente(s), quando identificado(s).

Os resultados de contagem de microrganismos mesfilos aerbios viveis em leite UHT a 30C por at 72 horas devem ser expressos em UFC/ml. Para todos os produtos UHT, o resultado da anlise de pr-incubao por 7 dias a 36 1C deve ser expresso como alterado ou sem alterao.


13

CONTAGEM DE Clostridium SULFITO REDUTORES E DE Clostridium perfringens

FUNDAMENTOS

Contagem

Baseia-se na inoculao da amostra ou de uma diluio da mesma em meios de cultura seletivos. Aps incubao em anaerobiose, os Clostridium formam colnias negras, devido reao de reduo de sulfito a sulfeto, que reage com citrato de amnio e ferro III, formando um precipitado negro.

Fermentao tempestuosa

Baseia-se na verificao da fermentao tempestuosa do leite presente no meio leite com ferro, caracterstica do Clostridium perfringens.p. Essa fermentao caracteriza-se por formao de cogulo bem definido, com grande formao de gs, durante incubao temperatura seletiva de 46 1C.

Testes confirmativos

A confirmao de Clostridium perfringens se faz por meio de provas confirmativas, com as quais se evidenciam suas caractersticas de: imobilidade, reduo de nitratos, produo de cido e gs a partir da lactose, fermentao da rafinose e liquefao da gelatina.



Soluo salina peptonada 0,1%;

gar triptose - sulfito - cicloserina (TSC)- base ou gar Sahid Ferguson Perfringens (SFP) - base;

gar estoque;

gar motilidade - nitrato tamponado;

Meio leite com ferro; Meio lactose-gelatina;

Caldo vermelho de fenol-base;

Soluo de rafinose 10%;

Caldo de carne cozida (opcional caldo Tarozzi);

Meio tioglicolato;

Alfa naftilamina 0,5%;

cido sulfanlico 0,8%;

Soluo de cicloserina 5%;

Polimixina B; Kanamicina;

Vaspar ou leo mineral ou parafina lquida;

Gerador de anaerobiose;


14


EQUIPAMENTOS


PROCEDIMENTOS

Pesagem e preparo da amostra

Pesar 25 0,2 g da amostra, adicionar 225 ml de soluo salina peptonada 0,1% e homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em stomacher. Essa a diluio 10-1.

Inoculao em Placas

A partir da diluio inicial 10-1, efetuar as diluies desejadas, a partir das diluies escolhidas, semear alquotas de 1 ml em placas estreis e adicionar aproximadamente15 ml de gar TSC ou SFP em temperatura de 46 - 48C. Homogeneizar cuidadosamente e deixar solidificar em superfcie plana. Aps, adicionar uma segunda camada de aproximadamente 10 ml do mesmo meio. Deixar solidificar em superfcie plana.

Incubao

Imediatamente aps a solidificao do gar, incubar as placas (sem inverter), em jarra de anaerobiose a 36 1C por 18 a 24 horas.

Seleo e Isolamento

As colnias tpicas de Clostridium sulfito redutores so negras e de tamanho varivel de 1 a 3 mm no gar TSC e no gar SFP. Selecionar placas que contenham entre 20 e 200 colnias tpicas. Contar todas as colnias negras presentes. Anotar o resultado. Esse resultado, multiplicado pela diluio usada, corresponde ao nmero de Clostridium sulfito redutor presentes por grama da amostra em anlise. Escolher 5 colnias negras e repicar para tubos com gar estoque. Incubar em anaerobiose a 36 1C por no mnimo 24 horas. Paralelamente, repicar para meio tioglicolato ou caldo de carne cozida (com selo estril de vaspar ou vaselina ou parafina lquida ou leo mineral).

Testes confirmativos para Clostridium perfringens

1. Colorao de Gram: A partir de cultura pura em gar estoque ou dos meios usados paralelamente, preparar esfregao e corar pelo mtodo de Gram. Quando for verificada a presena de bastonetes retos com extremidades arredondadas, Gram-positivos, realizar a prova de fermentao tempestuosa.


15

2. Fermentao tempestuosa (storm test): Transferir 1 ml da cultura fresca obtida no meio tioglicolato ou no caldo de carne cozida para um tubo contendo meio leite com ferro. Adicionar o selo estril e incubar a 46 1C em banho-maria por 6 horas (reincubar por maior tempo (12 a 18 h) quando o controle positivo no apresentar reao claramente positiva). Alternativamente, pode ser utilizada uma suspenso da cultura em teste, obtida pela lavagem da superfcie do gar estoque com soluo salina peptonada 0,1%, transferindo 1 ml desta para o meio leite com ferro. O Clostridium perfringens geralmente coagula o leite em at 6 horas a 46C, com formao de cogulo firme e grande quantidade de gs (fermentao tempestuosa). A partir das culturas que se apresentaram como C.perfringens na colorao de Gram e ofereceram resultado positivo na prova de fermentao tempestuosa, realizar as seguintes.

3. Prova da motilidade: Inocular a cultura, com agulha, em gar motilidade-nitrato tamponado. Incubar em anaerobiose a 36 1C por 24 horas. O Clostridium perfringens imvel, com crescimento apenas ao longo da linha de inoculao.

4. Prova da reduo do nitrato: Aps a leitura da motilidade, acrescentar ao gar 0,5 a 1 ml de soluo de alfa-naftilamina 0,5% e 0,5 a 1 ml de cido sulfanlico 0,8%. O aparecimento de colorao vermelha indicar a reduo do nitrato a nitrito. Para confirmao do resultado negativo, acrescentar alguns miligramas de p de zinco. O aparecimento de uma cor rosa ser indicativo da no reduo do nitrato, enquanto que a no alterao de cor ser indicativa de reao positiva para reduo do nitrato. O Clostridium perfringens reduz nitrato a nitrito.

5. Fermentao da lactose e liquefao da gelatina: Inocular a cultura, com agulha, em vrios pontos do meio lactose-gelatina. Se o meio for utilizado 8 ou mais horas aps a sua preparao, regener-lo por aquecimento a 50C por 2 horas em banho-maria, antes da inoculao. Incubar em anaerobiose a 36 1C por 44 2h. Aps a incubao, manter os tubos em geladeira por 1 hora. Observar a fermentao da lactose pela produo de bolhas de gs e pela mudana da cor do meio de vermelho para amarelo e tambm a liquefao da gelatina por meio da permanncia do estado lquido aps o resfriamento por aproximadamente1 hora em geladeira. O Clostridium perfringens fermenta a lactose e liquefaz a gelatina em 44 2h a 36 1C.

6. Fermentao da rafinose: Repicar a cultura para tubo contendo caldo para fermentao da rafinose. Aps inoculao, adicionar 1 a 2 ml de selo estril: vaspar ou vaselina ou parafina lquida ou leo mineral. Incubar a 36 1C por 72 2h. Verificar a fermentao da rafinose pela viragem da cor do indicador vermelho de fenol para amarelo. As provas de liquefao da gelatina em 44 2h horas e a fermentao da rafinose em 72 2h tornam possvel a diferenciao entre Clostridium perfringens e outros clostrdios imveis e redutores de nitrato como o Clostridium celatum, Clostridium sardiniense e Clostridium paraperfringens. O Clostridium perfringens fermenta a rafinose dentro de 72 2h.


16

CARACTERSTICAS DIFERENCIAIS DE CLOSTRDIOS

Espcies de Clostridium

Meio motilidade nitrato Meio lactose-gelatina

Motilidade Nitrato cido/ gs Liquefao. gelatina

C. perfringens A - + AG/T + (48h)

C.perfringens B - + AG/T + (48/72h)

C. absonum + + AG/CS -*

C. baratii - + AG/CS -

C. celatum - + AG/CS -

C. paraperfringens - + AG/CS -

C. sardiniense (+) AG/CS -*

A = cido; AG = cido e gs; T = turbidez; CS = claro com sedimento celular; + = positiva; - = negativa; (+) = fraco; = motilidade fraca; * = hidrlise lenta da gelatina.

RESULTADOS

Clculo do nmero de Clostridium sulfito redutor presentes na amostra: Calcular o nmero de Clostridium sulfito redutores multiplicando o nmero de colnias negras contadas no gar TSC ou no gar SFP pelo fator de diluio usado.

Clculo do nmero de Clostridium perfringens: Considerar como Clostridium perfringens as colnias que se apresentarem, na colorao de Gram, como bastonetes Gram positivos, retos, com extremidades arredondadas, positivos para a prova de fermentao tempestuosa, imveis, redutores de nitrato, fermentadores da lactose em 44 2h, da rafinose em at 72 2h e capazes de hidrolisar a gelatina em 44 2h.

A partir dos dados obtidos, calcular o nmero de microrganismos presentes. Expressar o resultado em UFC/g.


17

CONTAGEM DE Staphylococcus aureus

FUNDAMENTOS

Contagem

Baseia-se na inoculao das diluies desejadas das amostras em gar Baird-Parker, cuja composio evidencia a habilidade desse microrganismo de crescer na presena de 0,01 a 0,05% de telurito de potssio em combinao com 0,2 a 0,5 % de cloreto de ltio e 0,12 a 1,26% de glicina. O Staphylococcus aureus reduz anaerbia e aerobiamente o telurito de potssio, produzindo colnias negras. O gar Baird-Parker suplementado com soluo de gema de ovo possibilita a verificao das atividades proteoltica e lipoltica do Staphylococcus aureus, por meio do aparecimento de um halo de transparncia e um de precipitao ao redor da colnia, respectivamente.

Prova da coagulase

Baseia-se na comprovao da capacidade de coagular o plasma de coelho pela ao da enzima coagulase produzida pelo microrganismo.

Provas complementares

1. Colorao de Gram: Baseia-se na verificao das caractersticas morfolgicas e tintoriais do microrganismo.

2. Prova da termonuclease: Baseia-se na degradao do DNA em oligonucleotdeos pela ao da enzima DNAse produzida pelo microrganismo. A reao evidenciada pelo aparecimento de um halo de colorao rsea no gar azul de toluidina e de clarificao, quando utilizado o gar para teste de DNAse com verde de metila.

3. Prova da catalase: Baseia-se na capacidade da enzima catalase de decompor o perxido de hidrognio, liberando oxignio, o que evidenciado por meio da formao de borbulhas.

Limitaes do Mtodo

A metodologia para contagem de S. aureus, no que se refere aos resultados da prova de coagulase, apresenta limitaes quanto especificidade, devido ao fato de que algumas espcies de Staphylococcus relacionadas a animais, como o S. intermedius, S. hyicus, S. delphini e S. schleiferi ssp coagulans, tambm serem coagulase positivas. Cepas de S. schleiferi ssp schleiferi e algumas cepas de S. lugdunensis apresentam fraca reao na prova da coagulase. Alm disso, o S. schleiferi ssp schleiferi apresenta reao de termonuclease positiva.


18



gar Baird-Parker - base;

gar azul de toluidina - DNA ou gar para ensaio de DNAse, com verde de metila;

gar estoque;

Caldo crebro-corao (BHI);


Soluo salina 0,85%;

Emulso de gema de ovo a 50%;

Telurito de potssio 3,5%;

Plasma de coelho oxalatado ou com EDTA;


Etanol 70% ou Etanol 70 GL;


EQUIPAMENTOS


PROCEDIMENTOS

Pesagem e preparo da amostra

Pesar 25 0,2 g da amostra, adicionar 225 ml de soluo salina peptonada 0,1%. Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em stomacher. Essa a diluio 10-1.

Inoculao

A partir da diluio inicial 10-1, efetuar as diluies desejadas. Inocular, sobre a superfcie seca do gar Baird-Parker, 0,1 ml de cada diluio selecionada. Com o auxlio de ala de Drigalsky ou basto do tipo hockey, espalhar o inculo cuidadosamente por toda a superfcie do meio, at sua completa absoro. Utilizar no mnimo duas diluies decimais ou duplicata da mesma diluio. Nos casos em que a legislao exigir valores menores que 100 UFC/g ou ml, distribuir em duplicata 1 ml da diluio 10-1 em 3 placas (0,4 ml, 0,3 ml e 0,3 ml). No caso de produtos lquidos podero ser inoculado 0,1 ml diretamente da amostra (10), o que corresponder diluio 10-1.

Incubao

Incubar as placas invertidas a 36 1C por 30 a 48 horas.

Leitura


19

Selecionar as placas que contenham entre 20 e 200 colnias. Contar as colnias tpicas (T): negras brilhantes com anel opaco, rodeadas por um halo claro, transparente e destacado sobre a opacidade do meio. Contar tambm colnias atpicas (A): acinzentadas ou negras brilhantes, sem halo ou com apenas um dos halos. Registrar separadamente as contagens de colnias tpicas e atpicas. Selecionar 3 a 5 colnias de cada tipo (T) e/ou (A) e semear cada colnia em tubos contendo BHI, para confirmao. Incubar a 36 1C, por 24 horas. Observao: para a obteno do nmero final de UFC/ml ou g, utilizar, de preferncia, apenas uma diluio, pois, uma colnia atpica pode tornar-se tpica na diluio subsequente em funo da maior disponibilidade de nutrientes e pela menor competio bacteriana.

Prova da coagulase

1. Transferir 0,3 ml de cada tubo de cultivo em BHI para tubos estreis contendo 0,3 ml de plasma de coelho.

2. Incubar a 36 1C por 6 horas. 3. Verificar a presena de cogulos, considerando os critrios a seguir:

a. Reao negativa: no formao de cogulo; b. Reao 1+: cogulo pequeno e desorganizado; c. Reao 2+: cogulo pequeno e organizado; d. Reao 3+: cogulo grande e organizado; e. Reao 4+: coagulao de todo o contedo do tubo, que no se desprender

quando o tubo for invertido;

4. Quando a reao de coagulao for do tipo 3+ e 4+, considerar a prova positiva para Staphylococcus aureus;

5. Quando a reao de coagulao for negativa, considerar a prova negativa para Staphylococcus aureus.

6. Quando a reao for duvidosa do tipo 1+ e 2+, repicar do mesmo caldo de cultura para

um tubo contendo gar estoque ou outro contendo caldo BHI. Incubar a 36 1C por 24 horas, para a realizao dos testes complementares.

Testes complementares

A partir da cultura pura em BHI ou gar estoque, realizar as seguintes provas confirmativas:

1. Colorao de Gram: Preparar esfregao e corar pelo mtodo de Gram. A ausncia de cocos Gram positivos indica teste negativo para Staphylococcus aureus. A presena de cocos Gram positivos indica a necessidade da realizao de testes complementares.

2. Pesquisa de termonuclease: Fazer orifcios equidistantes com aproximadamente 2 mm de dimetro no gar para ensaio de termonuclease ou no gar azul de toluidina - DNA, em placas previamente preparadas. Colocar os tubos das culturas, mantidos em caldo BHI, em banho-maria


20

fervente por 15 minutos. Deixar esfriar e preencher completamente um orifcio para cada cultivo a ser analisado.

3. Incubar a 36 1C por 4 horas ou a 50 2C por 2 horas. O aparecimento, ao redor dos orifcios, de um halo rosa no gar azul de toluidina ou de um halo de clarificao no gar para ensaio de DNAse com verde de metila, ser indicativo de reao positiva para termonuclease. Considerar como positivas as culturas que apresentarem halo de dimetro superior a 1 mm O Staphylococcus aureus termonuclease positiva.

4. Prova da catalase: Com auxlio de ala de platina, basto de vidro, palito de madeira ou Pipeta de Pasteur, estreis, retirar uma alquota do cultivo em gar estoque e transferir para uma lmina ou placa de vidro contendo uma gota de perxido de hidrognio a 3%. Misturar o inculo ao perxido e observar a reao. A no formao de borbulhas indica prova negativa para catalase. A formao de borbulhas indica prova positiva para catalase. O Staphylococcus aureus catalase positiva.

RESULTADOS

Quando o nmero de colnias confirmadas for igual ao nmero de colnias

selecionadas e repicadas, o resultado ser igual contagem inicial, levando-se em

considerao a diluio utilizada. Quando o nmero de colnias confirmadas for

diferente do nmero de colnias selecionadas e repicadas, calcular a proporo de

colnias positivas.

O resultado final ser a soma dos resultados de colnias tpicas e atpicas confirmadas.

Expressar o resultado como: Contagem de Staphylococcus aureus: Xx 10y UFC/ g ou ml

ou Contagem de Staphylococcus coagulase positiva: Xx10y UFC/ g ou ml.


21

CONTAGEM DE COLIFORMES TOTAIS E COLIFORMES TERMOTOLERANTES EM ALIMENTOS

FUNDAMENTOS

Prova presuntiva: Baseia-se na inoculao das diluies desejadas das amostras sob teste em gar cristal violeta vermelho neutro bile (VRBA) e posterior contagem das colnias suspeitas. O gar cristal violeta vermelho neutro bile apresenta em sua composio sais biliares e cristal violeta, responsveis pela inibio de microrganismos Gram positivos e vermelho neutro, um indicador de pH que revela a fermentao da lactose pelos microrganismos presentes. A adio de sobrecamada visa a preveno do crescimento e do espraiamento de colnias na superfcie do gar.

Prova confirmativa para coliformes totais; A confirmao da presena de coliformes totais feita por meio da inoculao das colnias suspeitas em caldo verde brilhante bile 2% lactose e posterior incubao a 36 1C. A presena de gs nos tubos de Durham evidencia a fermentao da lactose presente no meio. O caldo verde brilhante bile 2% lactose apresenta em sua composio bile bovina e um corante derivado do trifenilmetano (verde brilhante) responsveis pela inibio de microrganismos Gram positivos.

Prova confirmativa para coliformes termotolerantes: A confirmao da presena de coliformes termotolerantes feita por meio da inoculao das colnias suspeitas em caldo EC e posterior incubao em temperatura seletiva de 45 0,2C, em banho-maria com agitao ou circulao de gua. A presena de gs nos tubos de Durham evidencia a fermentao da lactose presente no meio. O caldo EC apresenta em sua composio uma mistura de fosfatos que lhe confere um poder tamponante impedindo a sua acidificao. A seletividade devido a presena de sais biliares responsveis pela inibio de microrganismos Gram positivos.


Vidrarias e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos;

gar cristal violeta vermelho neutro bile (VRBA);

Caldo verde brilhante bile 2% lactose;

Caldo EC;


EQUIPAMENTOS


Banho-maria com movimentao de gua (agitao ou circulao).


22

PROCEDIMENTOS

1. Pesagem e preparo da amostra: Pesar 25 0,2 g ou pipetar 25 0,2 ml da amostra. Adicionar 225 ml de soluo salina peptonada 0,1%. Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em stomacher. Esta a diluio 10-1.

2. Incubao: Incubar os tubos a 36 1C por 24 a 48 horas. 3. Leitura: A presena de coliformes totais confirmada pela formao de gs (mnimo

1/10 do volume total do tubo de Durham) ou efervescncia quando agitado gentilmente. Anotar o resultado obtido para cada colnia, bem como a diluio utilizada.

4. Observao: A leitura pode ser feita aps 24 horas de incubao, porm, s sero vlidos os resultados positivos. Os tubos que apresentarem resultado negativo devero ser reincubados por mais 24 horas.

Coliformes termotolerantes

1. Inoculao: Inocular as culturas suspeitas de coliformes termotolerantes em tubos contendo caldo

2. Incubao: Incubar os tubos a 45 0,2C, por 24 a 48 horas em banho-maria com agitao.

3. Leitura: A presena de coliformes termotolerantes confirmada pela formao de gs (mnimo 1/10 do volume total do tubo de Durham) ou efervescncia quando agitado gentilmente. Anotar o resultado obtido para cada tubo, bem como a diluio utilizada. Observao: A leitura pode ser feita aps 24 horas de incubao, porm, s sero vlidos os resultados positivos. Os tubos que apresentarem resultado negativo devero ser reincubados por mais 24 horas.

RESULTADOS

Para alimentos comercializados no MERCOSUL, os resultados de contagem de coliformes totais se referem determinao contagem de coliformes a 35C e os resultados da contagem de coliformes termotolerantes correspondem determinao coliformes a 45C. Para o clculo final das contagens de coliformes totais e termotolerantes. Expressar o resultado em UFC/g ou ml.


23

CONTAGEM DE Bacillus cereus

FUNDAMENTOS

Contagem: Baseia-se na inoculao das diluies desejadas das amostras sob teste em gar polimixina gema de ovo vermelho de fenol (MYP) ou em gar cereus (PEMBA). Em ambos adicionada emulso de gema de ovo que objetiva a verificao da produo de lecitinase pelo B.cereus. No gar PEMBA, a presena de 0,1% de peptona associada ao piruvato de sdio evidencia a precipitao da lecitina da gema do ovo adicionada ao meio. A polimixina B um agente seletivo utilizado nos dois meios, que atua sobre a flora acompanhante. No PEMBA, quando um grande nmero de leveduras esperado no alimento, poder ser adicionada tambm cicloheximide (40g/ml) como agente seletivo. Estes dois meios contm manitol, carbohidrato no fermentado pelo B.cereus. No MYP, o indicador de pH o vermelho de fenol e no PEMBA, o azul de bromotimol.

Provas Bioqumicas: A identificao bioqumica de Bacillus cereus baseia-se na verificao de produo de -hemolisina, motilidade em meio semislido, na capacidade de decomposio da tirosina, reduo do nitrato a nitrito, verificao do tipo de crescimento em superfcie de gar nutriente, e da no produo de corpsculos de incluso cristalina.




gar nutriente;

gar manitol gema de ovo polimixina segundo Mossel (MYP) ou gar cereus (PEMBA);

gar estoque;

gar Columbia sangue de carneiro desfibrinado;

gar tirosina; gar motilidade - nitrato;

cido sulfanlico soluo 0,8%;

Alfa naftilamina soluo aquosa 0,5%;

Polimixina B - soluo contendo 5.000 UI/ml;

Emulso de gema de ovo 50%; Sangue de carneiro desfibrinado;

cido actico 5N;

Zinco em P; Reagentes para colorao de corpsculos de incluso cristalina;


EQUIPAMENTOS



24

PROCEDIMENTOS

1. Pesagem e preparo da amostra: Pesar 25 0,2 g ou pipetar 25 0,2 ml da amostra, adicionar 225 ml da soluo salina peptonada 0,1%. Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em stomacher. Esta a diluio 10-1.

2. Inoculao: A partir da diluio inicial 10-1, efetuar as diluies desejadas. Inocular sobre a superfcie seca do gar MYP ou gar PEMBA 0,1 ml de cada diluio selecionada. Com auxilio de ala de Drigalsky ou basto tipo hockey, espalhar o inculo cuidadosamente por toda a superfcie do meio at completa absoro. Utilizar, no mnimo, duas diluies decimais ou duplicata da mesma diluio. Nos casos em que for necessria a obteno de resultado menor que 100 UFC/g ou ml distribuir 1 ml da diluio 10-1 em 3 placas (0,4 ml, 0,3 ml e 0,3 ml). No caso de amostras lquidas, poder ser inoculado 0,1 ml diretamente da amostra.

3. Incubao: Incubar as placas invertidas a 30 1C por 30 a 48 horas. 4. Leitura: Selecionar as placas que contenham entre 15 e 150 colnias. Contar as

colnias rodeadas por um halo de precipitao opaco sobre um fundo rseo, no gar MYP e azul turquesa com aspecto recortado, com aproximadamente 5 mm de dimetro e rodeadas por halo de precipitao de lecitina hidrolisada, no gar PEMBA. Selecionar 3 a 5 colnias tpicas e seme-las em tubos com gar estoque inclinado. Incubar a 36 1C por 24 horas. De cada tubo, fazer esfregao e corar pelo mtodo Gram para verificar a presena de bastonetes curtos Gram positivos, com extremidades quadradas dispostos em cadeias. Os esporos so centrais ou subterminais.

5. Das culturas puras em gar estoque inclinado, realizar as seguintes provas:

Identificao Bioqumica

1. Motilidade e reduo de nitrato: Inocular, com agulha, tubos contendo gar motilidade-nitrato. Incubar a 36 1C por 18 a 24 horas. Aps incubao, verificar o tipo de crescimento presente. Culturas imveis mostram crescimento apenas na linha de inoculao, enquanto que as mveis crescem de forma difusa. O Bacillus cereus em 50 a 90% dos casos mostra-se mvel. Aps a leitura da motilidade, adicionar aos tubos 2 a 3 gotas de alfa naftilamina 0,5% e 2 a 3 gotas de cido sulfanlico 0,8%. O aparecimento de colorao rosa indica positividade para reduo de nitrato. Quando no houver desenvolvimento de colorao, adicionar ao tubo alguns miligramas de p de zinco. Nesta situao, o aparecimento de colorao rosa indica reao negativa, enquanto que o no desenvolvimento de cor indica positividade. O Bacillus cereus reduz o nitrato a nitrito.

2. -hemlise em gar sangue de carneiro: Inocular por estria em placa com gar sangue de carneiro. Incubar a 36 1C por 24 horas. Observar a produo de -hemlise caracterstica do Bacillus cereus. Bacillus cereus produtor de -hemlise.

3. Decomposio da tirosina: Inocular por estrias a superfcie de gar tirosina (inclinado em tubo ou distribudo em placas). Incubar a 36 1C por 48 horas. Aps incubao, observar o aparecimento de uma zona clara prxima ao crescimento produzida pela


25

decomposio da tirosina. Nos casos em que houver dvidas, reincubar por at 7 dias a 36 1C. O Bacillus cereus decompe a tirosina.

4. Crescimento rizide: Inocular com ala sobre a superfcie seca de gar nutriente, depositando o inculo no ponto central da placa. Incubar a 36 1C por 48 a 72 horas. Aps incubao verificar o tipo de crescimento. Crescimento rizide se caracteriza pelo aparecimento de colnias com longas extenses em forma de razes ou longos fios, tpicas de Bacillus mycoides. O Bacillus cereus no apresenta crescimento rizide, porm algumas cepas podem apresentar colnias rugosas em forma de galxia.

5. Teste para verificao da presena de corpsculos de incluso cristalina. A partir das culturas suspeitas repicadas em gar estoque inclinado (item 5.5) e deixadas em temperatura ambiente por 2 a 3 dias, verificar a presena de corpsculos de incluso cristalina. A presena de cristais tetragonais de toxina so abundantes em culturas velhas (3-4 dias) de Bacillus thuringiensis, que so liberados somente aps a lise do esporngio. Verifica-se ento a presena dos cristais e esporos livres. O Bacillus cereus no produz corpsculos de incluso cristalina.

PROVAS DIFERENCIAIS PARA MICRORGANISMOS DO GNERO Bacillus

Bacillus megaterium

Bacillus cereus Bacillus thuringiensis

Bacillus mycoides

Bacillus anthracis

Colorao de Gram

+

+a

+

+

+

Catalase + + + + +

Motilidade b -c -

Reduo de nitrato

-d + + +

Hemlise em sangue de carneiro

-

+

+

+

-d

Decomp. da tirosina

+

+

-d

Corpsc. de incluso cristalina

-

-

+

-

-

Crescimento rizide

- - - + -

a: 90 a 100% so positivos b: 50 a 90% so positivos c: 90 a 100% so negativos d: a maioria negativa


26

RESULTADOS A partir dos dados obtidos, calcular o nmero de microrganismos presentes na amostra em anlise. Calcular o nmero de Bacillus cereus multiplicando o nmero de colnias confirmadas, nas provas confirmativas, pelo fator de diluio usado. Expressar o resultado em UFC/g ou ml.


27

CONTAGEM TOTAL DE ENTEROBACTRIAS

FUNDAMENTOS

Contagem: Baseia-se na inoculao das diluies desejadas das amostras testadas em gar cristal violeta vermelho neutro bile glicose (VRBG), cuja composio evidencia a habilidade dos microrganismos fermentarem a glicose com produo de cido, reao indicada por uma viragem do indicador a vermelho e a precipitao de sais biliares ao redor das colnias. A seletividade exercida pela presena de cristal violeta e bile no meio.



gar cristal violeta vermelho neutro bile glicose (VRBG);

gar estoque;


Reativo para oxidase (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina ou oxalato de para-amino-dimetilanilina), ou tiras de papel para teste de oxidase;

Reativos para colorao de Gram.

EQUIPAMENTOS

Equipamentos bsicos, obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos.

PROCEDIMENTOS

1. Pesagem e preparo da amostra: Pesar 25 0,2 g ou pipetar 25 0,2 ml da amostra, adicionar 225 ml de soluo salina 0,1%. Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em stomacher. Esta a diluio 10-1.

2. Inoculao: A partir da diluio inicial (10-1), efetuar as demais diluies desejadas em soluo salina peptonada 0,1%. Inocular 1 ml de cada diluio em placas de Petri esterilizadas. Adicionar a cada placa aproximadamente15 ml de gar cristal violeta vermelho neutro bile glicose previamente fundido e mantido a 46C-48C em banho-maria. Homogeneizar cuidadosamente o inculo com o meio e deixar em repouso at total solidificao. Aps adicionar uma Segunda camada com o mesmo meio e deixar solidificar.

3. Incubao: Aps completa solidificao do meio, incubar as placas em posio invertida em temperatura de 36 1C por 18 a 24 horas.

4. Leitura: Selecionar placas que contenham entre 15 e 150 colnias. Contar as colnias de colorao vermelha, rodeadas ou no por halo de precipitao da bile presente no meio, com 0,5 a 2 mm de dimetro e anotar os resultados de contagem. Selecionar 3 a 5 colnias tpicas e repicar para tubos com gar estoque inclinado. Incubar a 36 1C por 24 horas. Realizar a prova da oxidase.


28

5. Prova da oxidase: Usando ala de platina, Pipeta de Pasteur, palitos de madeira estreis, ou de plstico descartveis estreis, realizar a prova da oxidase espalhando a cultura sobre papel filtro impregnado com o reativo para oxidase ou sobre tiras de papel com reativo para oxidase, comercialmente disponveis. Fazer a leitura em 10 a 20 segundos. Aps este tempo, reaes falso-positivas podem ocorrer. O aparecimento de cor azul (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno diamina) ou vermelho intenso (oxalato de para-amino-dimetilanilina) indicativo de reao positiva. No utilizar alas de nquel-cromo ou alas de ao inoxidvel para realizar a prova da oxidase, pois traos de xido de ferro na superfcie flambada podem produzir reao falso-positiva. Todas as enterobactrias apresentam reao de oxidase negativa.

6. Colorao de Gram: Das colnias oxidase negativas, preparar esfregao e corar pelo mtodo de Gram. Todas as enterobactrias apresentam-se como bastonetes Gram negativos.

RESULTADOS A partir dos dados obtidos, calcular o nmero de microrganismos presentes. Expressar o resultado em UFC/g ou ml.


29

NMERO MAIS PROVVEL DE COLIFORMES TOTAIS E COLIFORMES TERMOTOLERANTES EM GUA E GELO

FUNDAMENTOS

Prova presuntiva: Baseia-se na inoculao da amostra em caldo lauril sulfato de sdio, em que a presena de coliformes evidenciada pela formao de gs nos tubos de Durham, produzido pela fermentao da lactose contida no meio. O caldo lauril sulfato de sdio apresenta, em sua composio, uma mistura de fosfatos que lhe confere um poder tamponante, impedindo a sua acidificao. A seletividade do meio se deve presena do lauril sulfato de sdio, um agente surfactante aninico que atua na membrana citoplasmtica de microrganismos Gram positivos, inibindo o seu crescimento.

Prova confirmativa para coliformes totais: confirmao da presena de coliformes totais feita por meio da inoculao dos tubos positivos para a fermentao de lactose, na prova presuntiva, em caldo verde brilhante bile 2% lactose, e posterior incubao a 36 1C. A presena de gs nos tubos de Durham do caldo verde brilhante evidencia a fermentao da lactose presente no meio. O caldo verde brilhante bile 2% lactose apresenta em sua composio bile bovina e um corante derivado do trifenilmetano (verde brilhante), responsveis pela inibio dos microrganismos Gram positivos.

Prova confirmativa para coliformes termotolerantes: A confirmao da presena de coliformes termotolerantes feita por meio da inoculao em caldo EC, com incubao em temperatura seletiva de 45 0,2C a partir dos tubos positivos obtidos na prova presuntiva. A presena de gs nos tubos de Durham evidencia a fermentao da lactose presente no meio. O caldo EC apresenta em sua composio uma mistura de fosfatos que lhe confere um poder tamponante, impedindo a sua acidificao. A seletividade do meio se deve presena de sais biliares, responsveis pela inibio dos microrganismos Gram positivos.


Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de

alimentos;

Caldo lauril sulfato de sdio concentrao simples;

Caldo lauril sulfato de sdio concentrao dupla;

Caldo verde brilhante bile 2% lactose;

Caldo EC;


EQUIPAMENTOS


Banho-maria com movimentao de gua (agitao ou circulao).


30

PROCEDIMENTOS

Preparo da amostra: Preparar a amostra de gua. No caso de amostras de gelo, quando encaminhadas em frascos de boca larga, deixar descongelar no prprio frasco, sob refrigerao, pelo perodo necessrio para seu completo descongelamento. Antes do incio da anlise, homogeneizar bem. Quando o gelo for encaminhado em sacos plsticos, colocar a amostra dentro de outro saco plstico resistente (sem perfuraes) e deixar descongelar, sob-refrigerao, pelo perodo necessrio para seu completo descongelamento. Aps descongelamento total, verificar a presena de gua no saco plstico de proteo da amostra, o que indica a presena de perfuraes na embalagem do gelo. Nesse caso, no analisar a amostra. Da mesma forma, as amostras de gelo que chegarem descongeladas ou em descongelamento devero ser descartadas. Quando a embalagem da amostra de gelo mostrar evidncias de que no continha perfuraes, aps o descongelamento total, homogeneizar bem e proceder anlise, seguindo o procedimento estabelecido para amostras de gua.

Prova presuntiva

1. Inoculao: Inocular volumes de 10 ml da amostra a ser analisada em uma srie de 3 tubos contendo caldo lauril sulfato de sdio em concentrao dupla. Inocular volumes de 1 ml da amostra na segunda srie de 3 tubos contendo caldo lauril sulfato de sdio em concentrao simples e volumes de 1 ml da diluio 10-1 na terceira srie de 3 tubos contendo o mesmo meio.

2. Observao: caso seja necessrio um maior nmero de diluies. Neste caso, inocular volumes de 1 ml de cada uma das diluies efetuadas em sries de 3 tubos contendo caldo lauril sulfato de sdio em concentrao simples. Quando o limite de aceitao for


31

3. Leitura: A presena de coliformes totais confirmada pela formao de gs (mnimo 1/10 do volume total do tubo de Durham) ou efervescncia quando agitado gentilmente. Anotar o nmero de tubos positivos em cada srie de diluio.

Observao: A leitura pode ser feita aps 24 horas de incubao, porm, s sero vlidos os resultados positivos. Os tubos que apresentarem resultado negativo devero ser reincubados por mais 24 horas.

Coliformes termotolerantes

1. Inoculao: Repicar cada tubo positivo de caldo lauril sulfato de sdio obtido na prova presuntiva, para tubo contendo caldo EC.

2. Incubao: Incubar os tubos a 45 0,2C, por 24 a 48 horas em banho-maria com agitao ou circulao de gua.

3. Leitura: A presena de coliformes termotolerantes confirmada pela formao de gs (mnimo 1/10 do volume total do tubo de Durham) ou efervescncia quando agitado gentilmente. Anotar o resultado obtido para cada tubo, bem como a diluio utilizada.


RESULTADOS

A partir da combinao de nmeros correspondentes aos tubos que apresentaram resultado positivo em cada um dos testes confirmativos (coliformes totais e coliformes termotolerantes), verificar o Nmero Mais Provvel. Certificar-se que a tabela de NMP usada a indicada para o caso especfico. Expressar o valor obtido em NMP/100 ml.


32

NMERO MAIS PROVVEL DE COLIFORMES TOTAIS E COLIFORMES

TERMOTOLERANTES EM ALIMENTOS

FUNDAMENTOS

Prova presuntiva: Baseia-se na inoculao da amostra em caldo lauril sulfato de sdio, em que a presena de coliformes evidenciada pela formao de gs nos tubos de Durham, produzido pela fermentao da lactose contida no meio. O caldo lauril sulfato de sdio apresenta, em sua composio, uma mistura de fosfatos que lhe confere um poder tamponante, impedindo a sua acidificao. A seletividade do meio se deve presena do lauril sulfato de sdio, um agente surfactante aninico que atua na membrana citoplasmtica de microrganismos Gram positivos, inibindo o seu crescimento.

Prova confirmativa para coliformes totais: A confirmao da presena de coliformes totais feita por meio da inoculao dos tubos positivos para a fermentao de lactose em caldo verde

brilhante bile lactose 2% e posterior incubao a 36 1C. A presena de gs nos tubos de Durham do caldo verde brilhante evidencia a fermentao da lactose presente no meio. O caldo verde brilhante bile lactose 2% apresenta, em sua composio, bile bovina e um corante derivado do trifenilmetano (verde brilhante), responsveis pela inibio dos microrganismos Gram positivos.

Prova confirmativa para coliformes termotolerantes: A confirmao da presena de coliformes termotolerantes feita por meio da inoculao em caldo EC, com incubao em temperatura

seletiva de 45 0,2C a partir dos tubos positivos obtidos na prova presuntiva. A presena de gs nos tubos de Durham evidencia a fermentao da lactose presente no meio. O caldo EC apresenta em sua composio uma mistura de fosfatos que lhe confere um poder tamponante, impedindo a sua acidificao. A seletividade do meio se deve presena de sais biliares, responsveis pela inibio dos microrganismos Gram positivos.



Caldo lauril sulfato de sdio concentrao simples;

Caldo lauril sulfato de sdio concentrao dupla;

Caldo verde brilhante bile lactose 2%;

Caldo EC;


EQUIPAMENTOS

Equipamentos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos; Banho-maria com movimentao de gua (agitao ou circulao).


33

PROCEDIMENTOS

Pesagem e preparo da amostra: Pesar 25 0,2 g ou pipetar 25 0,2 ml da amostra, adicionar 225 ml de soluo salina peptonada 0,1%. Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em stomacher. Esta a diluio 10-1.

Prova presuntiva

1. Inoculao

Produtos slidos, pastosos e creme de leite pasteurizado.

A partir da diluio inicial (10-1), inocular volumes de 10 ml em srie de 3 tubos contendo caldo lauril sulfato de sdio em concentrao dupla (corresponde diluio 100).

A seguir, inocular volumes de 1 ml da diluio inicial (10-1) em uma srie de 3 tubos contendo caldo lauril sulfato de sdio em concentrao simples.

A partir da diluio 10-1, preparar a diluio 10-2 em soluo salina peptonada 0,1% de acordo com as instrues contidas no Anexo II, Diluies e solues, roteiro anterior.

Inocular 1 ml da diluio 10-2 na terceira srie de 3 tubos.

Havendo necessidade, outras diluies decimais podem ser inoculadas em sries de 3 tubos.

Produtos lquidos

Diretamente da amostra (100), inocular volumes de 1 ml em uma srie de 3 tubos contendo caldo lauril sulfato de sdio em concentrao simples;

Transferir tambm 1 ml da amostra para tubo contendo soluo salina peptonada 0,1% de forma a obter a diluio 10-1.

A partir da diluio 10-1, efetuar as demais diluies desejadas em soluo salina peptonada 0,1% de acordo com as instrues contidas no Anexo II, Diluies e solues, roteiro anterior.

A seguir, inocular volumes de 1 ml da diluio 10-1 na segunda srie de 3 tubos contendo caldo lauril sulfato de sdio em concentrao simples.

Inocular 1 ml da diluio 10-2 na terceira srie de 3 tubos.

Havendo necessidade, outras diluies decimais podero ser inoculadas em sries de 3 tubos.

2. Incubao: Incubar os tubos a 36 1C por 24 a 48 horas. 3. Leitura: A suspeita de coliformes totais indicada pela formao de gs nos tubos de

Durham (mnimo 1/10 do volume total) ou efervescncia quando agitado gentilmente; Anotar o nmero de tubos positivos em cada srie de diluio.


34


Prova confirmativa

Coliformes Totais

1. Inoculao: Repicar cada tubo positivo de caldo lauril sulfato de sdio obtido na prova presuntiva, para tubo contendo caldo verde brilhante bile 2% lactose.

2. Incubao: Incubar os tubos a 36 1C por 24 a 48 horas. 3. Leitura: A presena de coliformes totais confirmada pela formao de gs (mnimo

1/10 do volume total do tubo de Durham) ou efervescncia quando agitado gentilmente. Anotar o nmero de tubos positivos em cada srie de diluio.


Coliformes Termotolerantes

1. Inoculao: Repicar cada tubo positivo de caldo lauril sulfato de sdio, obtido na prova presuntiva, para tubo contendo caldo EC.

2. Incubao: Incubar os tubos a 45 0,2C, por 24 a 48 horas em banho-maria com agitao ou circulao de gua.

3. Leitura: A presena de coliformes termotolerantes confirmada pela formao de gs (mnimo 1/10 do volume total do tubo de Durham) ou efervescncia quando agitado gentilmente. Anotar o resultado obtido para cada tubo, bem como a diluio utilizada.


RESULTADOS

A partir da combinao de nmeros correspondentes aos tubos que apresentaram resultado positivo em cada um dos testes confirmativos (coliformes totais e coliformes termotolerantes), verificar o Nmero Mais Provvel. Certificar-se que a tabela de NMP usada a indicada para o caso especfico. Expressar o valor obtido em NMP/g ou ml.


35

NMERO MAIS PROVVEL DE Staphylococcus aureus

FUNDAMENTOS

Determinao do NMP

1. Baseia-se na inoculao das diluies desejadas das amostras sob teste em caldo telurito manitol glicina, segundo Giolitti e Cantoni ou Caldo soja triptona com sal 10% - piruvato de sdio 1% (TSB-NP), com posterior confirmao em gar Baird-Parker.

2. No caldo TSB-NP, a alta concentrao de NaCl (10%) atua seletivamente, inibindo o crescimento de microbiota acompanhante que no apresente capacidade de se desenvolver nesta condio.

3. O Staphylococcus aureus reduz, anaerbia e aerobiamente, o telurito de potssio, produzindo escurecimento do caldo Giolitti e Cantoni, bem como colnias negras no gar Baird-Parker.

4. O gar Baird-Parker, enriquecido com soluo de gema de ovo, possibilita a evidenciao das atividades proteoltica e lipoltica do Staphylococcus aureus, respectivamente, por meio do aparecimento de um halo de precipitao e um de transparncia ao redor da colnia.

Prova da coagulase

Baseia-se na comprovao da capacidade do microrganismo de coagular o plasma de coelho pela ao da enzima coagulase.

Provas complementares

1. Colorao de Gram: Baseia-se na verificao das caractersticas morfolgicas e tintoriais do microrganismo.

2. Prova da termonuclease: Baseia-se na degradao do DNA em oligonucleotdeos pela ao da enzima DNAse produzida pelo microrganismo. A reao evidenciada pelo aparecimento de um halo de colorao rsea no gar azul de toluidina e de clarificao, quando utilizado o gar para teste de DNAse com verde de metila.

3. Prova da catalase: Baseia-se na capacidade da enzima catalase de decompor o perxido de hidrognio, liberando oxignio, o que evidenciado por meio da formao de borbulhas.

Limitaes do Mtodo

A metodologia para contagem de S. aureus, no que se refere aos resultados da prova de coagulase, apresenta limitaes quanto especificidade, devido ao fato de algumas espcies de Staphylococcus relacionadas a animais, como o S. intermedius, S. hyicus, S. delphini e S. schleiferi ssp coagulans, tambm serem coagulase positivas;


36

Cepas de S. schleiferi ssp schleiferi e algumas cepas de S. lugdunensis apresentam fraca reao na prova da coagulase. Alm disto, o S. schleiferi ssp schleiferi apresenta reao de termonuclease positiva.



gar Baird-Parker-base;

gar azul de toluidina - DNA ou gar para ensaio de DNAse com verde de metila;

gar estoque;

Caldo soja triptona sal 10%-piruvato de sdio 1% (TSB-NP) ou Caldo telurito manitol glicina segundo; Giolitti e Cantoni (GC);

Caldo crebro-corao (BHI);


Soluo salina 0,85%;

Soluo de azul de toluidina 1%;

Emulso de gema de ovo a 50%;

Telurito de potssio 3,5%;

Plasma de coelho oxalatado ou com EDTA;


Etanol 70% ou Etanol 70 GL;


EQUIPAMENTOS


PROCEDIMENTOS

1. Pesagem e preparo da amostra

Alimentos slidos

Pesar 25 0,2 g da amostra. Adicionar 225 ml de soluo salina peptonada 0,1%. Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos no stomacher. Esta a diluio 10-1. A partir da diluio inicial 10-1. Inocular 1 ml de cada diluio selecionada em trs sries de trs tubos contendo caldo telurito manitol glicina (GC) ou caldo TSB-NP. Adicionar a cada tubo de caldo GC uma camada de 1 a 2 ml de selo estril (vaspar, vaselina, leo mineral ou parafina lquida, estreis e previamente fundidos).

Alimentos lquidos


37

Pipetar 1 ml diretamente da amostra e transferir para cada um dos trs tubos contendo caldo GC ou caldo TSB-NP. Transferir tambm 1 ml da amostra para um tubo contendo 9 ml de soluo salina peptonada 0,1% (diluio 10-1). A partir da diluio inicial 10-1. Inocular 1 ml das duas diluies subsequentes em sries de trs tubos com caldo GC ou caldo TSB-NP. Adicionar uma camada de 1 a 2 ml de selo estril (vaspar, vaselina, leo mineral ou parafina lquida, estreis e previamente fundidos) a cada tubo de caldo GC.

2. Incubao: Incubar a 36 1C por 48 horas. 3. Leitura: Fazer a leitura anotando os tubos que apresentarem escurecimento do meio

ou precipitado negro em caldo GC e turvao em caldo TSB-NP.

Provas confirmatrias

1. Com pipetas de Pasteur estreis, retirar do fundo de cada tubo de caldo GC positivo uma gota da cultura e coloc-la sobre a superfcie seca de gar Baird-Parker, junto borda da placa, estriando posteriormente com ala, de forma a obter colnias isoladas.

2. A partir dos tubos de caldo TSB-NP que apresentarem turvao, com auxlio de ala de platina ou nquel-cromo, repicar sobre a superfcie seca de gar Baird-Parker.

3. Incubar a 36 1C por 30 a 48 horas. 4. Selecionar de 2 a 3 colnias negras, brilhantes, com anel opaco de precipitao e/ou

rodeadas por halo transparente, correspondentes a cada um dos tubos positivos e repicar cada colnia para um tubo contendo caldo BHI.

5. Incubar a 36 1C por 18 a 24 horas. 6. A partir das culturas em BHI, efetuar a prova da coagulase.

Prova da coagulase

1. Transferir 0,3 ml de cada tubo de cultivo em BHI para tubos estreis contendo 0,3 ml de plasma de coelho.

2. Incubar a 36 1C, por 6 horas. 3. Verificar a presena de cogulos, considerando os critrios a seguir:

Reao negativa: no formao de cogulo;

Reao 1+ : cogulo pequeno e desorganizado;

Reao 2+ : cogulo pequeno e organizado;

Reao 3+ : cogulo grande e organizado;

Reao 4+: coagulao de todo o contedo do tubo que no se desprender quando o tubo for invertido;

Quando a reao de coagulao for do tipo 3+ e 4+, considerar a prova positiva para Staphylococcus aureus; Quando a reao de coagulao for negativa, considerar a prova negativa para Staphylococcus aureus;


38

Quando a reao for duvidosa do tipo 1+ e 2+, repicar do mesmo caldo de cultura para um

tubo contendo gar estoque ou caldo BHI. Incubar a 36 1C por 24 horas para a realizao dos testes complementares.

Testes complementares

A partir da cultura pura em caldo BHI ou gar estoque, realizar as seguintes provas confirmativas:

1. Colorao de Gram: Preparar esfregao e corar pelo mtodo de Gram. A ausncia de cocos Gram positivos indica teste negativo para Staphylococcus aureus. A presena de cocos Gram positivos indica a necessidade da realizao de testes complementares.

2. Pesquisa da termonuclease:

Fazer orifcios equidistantes, com cerca de 2 mm de dimetro, no gar para ensaio da termonuclease ou no gar azul de toluidina - DNA, em placas previamente preparadas.

Colocar os tubos das culturas mantidas em caldo BHI em banho-maria fervente por 15 minutos. Deixar esfriar e preencher completamente um orifcio para cada cultivo a ser analisado.

Incubar a 36 1C por 4 horas ou a 50 2C por 2 horas.

O aparecimento de um halo rosa no gar azul de toluidina ou de um halo de clarificao no gar para ensaio de DNAse com verde de metila, ser indicativo de reao positiva para termonuclease.

Considerar como positivas as culturas que apresentarem halo de dimetro superior a 1 mm. O Staphylococcus aureus termonuclease positiva.

3. Prova da catalase

Com auxlio de ala de platina, basto de vidro, palito de madeira ou pipeta de Pasteur, estreis, retirar uma alquota do cultivo em gar estoque e transferir para uma lmina ou placa de vidro contendo uma gota de perxido de hidrognio a 3%.

Misturar o inculo ao perxido e observar a reao.

A no formao de borbulhas indica prova negativa para catalase.

A formao de borbulhas indica prova positiva para catalase.

O Staphylococcus aureus catalase positiva.

RESULTADOS

A partir da combinao de nmeros correspondentes aos tubos que apresentaram resultado positivo em cada um dos testes confirmativos, verificar o Nmero Mais Provvel. Certificar-se de que a tabela de NMP em uso a indicada para cada caso especfico. Expressar o valor obtido em NMP/g ou ml.


39

NMERO MAIS PROVVEL DE Vibrio parahaemolyticus (Pescado e

Derivados)

FUNDAMENTOS

Provas presuntivas

Enriquecimento em caldo seletivo

Inoculao em meio de cultura de enriquecimento seletivo: caldo glicose sal Teepol (GSTB) ou caldo Horie arabinose violeta de etila (HAEB), em que a presena de Vibrio parahaemolyticus evidenciada pela turvao do meio aps a incubao. Em sua composio, o meio GSTB apresenta teepol, soluo aquosa de sulfatos de sdio alcalinos primrios que atuam na membrana citoplasmtica de microrganismos Gram positivos, inibindo o seu crescimento e formalina que funciona como um agente antimicrobiano. Como o Vibrio parahaemolyticus halfilo obrigatrio, os dois meios contm 3% de cloreto de sdio.

Isolamento em gar tiossulfato citrato sacarose sais biliares (TCBS)

Isolamento se realiza em gar TCBS, meio seletivo altamente alcalino que contm elevada concentrao de tiossulfato e citrato de sdio, responsveis pela inibio do crescimento das enterobactrias presentes. A bile e o colato de sdio inibem os enterococos. Como indicador de pH, o meio possui o azul de timol e o azul de bromotimol que alteram a cor do meio para amarelo quando da formao de cido pelos microrganismos que fermentam a sacarose contida no meio.

Provas de identificao

A identificao de Vibrio parahaemolyticus feita por meio de provas bioqumicas, sorolgicas, morfolgicas e tintoriais.



gar Meller-Hinton sal 3%;

gar nutriente sal 3%;

gar gelatina sal 3%;

gar soja triptona sal 3%;

gar tiossulfato citrato sacarose sais biliares (TCBS);

gar ferro trs acares (TSI) sal 3% ou gar Kligler sal 3%;

gar motilidade sal 3%;

Caldo glicose sal teepol (GSTB) ou Caldo Horie arabinose violeta de etila (HAEB);

Caldo peptonado sem sal;


40

Caldo peptonado sal 3%;




Caldo ONPG sal 3%%;

Caldo vermelho de fenol manitol sal 3%;

Caldo vermelho de fenol sacarose sal 3%;

Caldo vermelho de fenol arabinose sal 3%;

Caldo vermelho de fenol arginina sal 3%;

Caldo vermelho de fenol lisina sal 3%;

Meio O/F (Hugh-Leifson) sal 3%;

Soluo salina peptonada 0,1% sal 3%;

Soluo fisiolgica (NaCl 0,85%);

Agente vibriosttico O 129 10g;

Agente vibriosttico O 129 150 g;

Arabinose;

L-arginina;

L-lisina;

Manitol;

Sacarose;

leo mineral ou parafina lquida estreis;

Reativo para Oxidase (oxalato de para-amino-dimetilanilina ou NNNN-tetrametil-parafenileno-diamina);

Teepol; O-nitrofenil--D-galactopiranosdeo ou p-nitrofenil--D-galactosdeo;

Etanol 96%;


EQUIPAMENTOS


PROCEDIMENTOS

Preparo e Pesagem

Pesar 50g da amostra. Adicionar 450 ml de Caldo peptonado sal 3%. Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em stomacher. Esta a diluio 10-1.

Provas presuntivas

Inoculao em caldo de enriquecimento seletivo:


41

1. A partir da diluio inicial (10-1), efetuar as demais diluies desejadas em Caldo peptonado sal 3% (no mnimo mais duas diluies). Inocular volumes de 1 ml de cada uma das diluies desejadas em sries de 3 tubos contendo GSTB ou caldo HAEB.

2. Incubao: Incubar os tubos a 36 1C por 18 horas a 24 horas. 3. Leitura A presena de turvao do meio indica a suspeita da presena de Vibrio

parahaemolyticus. Anotar o nmero de tubos de cada srie que apresentaram turvao.

Isolamento em gar tiossulfato citrato sais biliares (TCBS)

1. Inoculao: A partir de cada tubo de GSTB ou HAEB que apresentar turvao, sem agit-lo e com auxlio de uma ala de nquel-cromo, de platina ou descartvel estril, retirar uma alada do crescimento da superfcie e estri-la sobre a superfcie seca de gar tiossulfato citrato sacarose sais biliares (TCBS).

2. Incubao: Incubar as placas em posio invertida a 36 1C por 24 horas. 3. Leitura: Verificar o aparecimento de colnias arredondadas, opacas, de cor azul

esverdeada, com 2 a 3 mm de dimetro, tpicas de Vibrio parahaemolyticus. Quando no houver colnias suspeitas, o resultado ser negativo para o tubo de origem.

Provas preliminares para identificao de Vibrio parahaemolyticus

1. De cada placa, selecionar de 2 a 3 colnias tpicas e transferi-las simultaneamente para tubos contendo caldo peptonado sal 3% e gar nutriente sal 3% inclinado.

2. Incubar a 36 1C por 18 a 24 horas.

Colorao de Gram

A partir do cultivo mantido em gar nutriente sal 3%, proceder colorao de Gram. O Vibrio parahaemolyticus se apresenta como bastonetes retos ou curvos Gram negativos. Em culturas antigas, pode se apresentar em forma de cocobacilos.

Crescimento com 8% de sal e sem sal

A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, transferir, com auxlio de ala de nquel-cromo, platina ou descartvel estril, uma alada para um tubo contendo caldo

peptonado sem sal e caldo peptonado sal 8%. Incubar os tubos a 36 1C por 18 a 24 horas. Aps o perodo de incubao, verificar a presena de turvao indicativa da ocorrncia de crescimento. O Vibrio parahaemolyticus no cresce no meio sem sal e cresce no meio com 8% de sal.

Prova da oxidase

A partir do cultivo mantido em gar nutriente sal 3%, usando palitos de madeira, de plstico descartveis, pipetas Pasteur, ou ala de platina, realizar a prova de oxidase espalhando a


42

cultura sobre papel filtro impregnado com o reativo para oxidase ou sobre tiras de papel para teste de oxidase, comercialmente disponveis. Fazer a leitura em 10 a 20 segundos. Aps este tempo, podem ocorrer reaes falso-positivas. O aparecimento de cor azul (quando usado o reativo NNNN-tetrametil-parafenileno-diamina) ou de cor vermelha intensa (quando o reativo usado o oxalato de para-amino-dimetilanilina) indicativo de reao positiva. O Vibrio parahaemolyticus oxidase positiva OBS.: No utilizar alas de nquel-cromo ou alas de ao para realizar a prova de oxidase, pois traos de xido de ferro na superfcie flambada podem produzir reao falso-positiva.

Caldo vermelho de fenol sacarose sal 3%

A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, inocular, com auxlio de ala de nquel-cromo, um tubo contendo caldo vermelho de fenol sacarose sal 3%. Cobrir o meio com 2 a 3

ml de leo mineral ou parafina lquida, estreis. Incubar a 36 1C por 18 a 24 horas. Aps o perodo de incubao, observar a mudana de colorao do meio, de vermelho para amarelo, devido fermentao da sacarose e produo de cido. O Vibrio parahaemolyticus no altera a colorao do meio, pois no capaz de fermentar a sacarose.

gar ferro trs acares sal 3% (TSI) ou gar Kligler ferro sal 3%

A partir do cultivo mantido no gar nutriente sal 3% inclinado, com auxlio de agulha de platina ou nquel-cromo, inocular, mediante picada central em toda a profundidade do gar e estriando a superfcie inclinada, tubos com gar TSI sal 3% ou gar Kligler ferro sal 3%. Incubar

a 36 1C por 24 horas. O Vibrio parahaemolyticus apresenta base cida (amarela), sem gs, sem produo de H2S e bisel alcalino (vermelho).

Teste ONPG

A partir da cultura em TSI, inocular uma alada espessa em tubo contendo 0,5 ml de caldo ONPG sal 3%. Incubar em banho-maria a 36 1C, durante 2 horas. Examinar os tubos , verificando o aparecimento ou no de cor amarela, indicativa de reao positiva. Se o caldo permanecer incolor, a reao negativa. O Vibrio parahaemolyticus ONPG negativo.

Provas adicionais para identificao de Vibrio parahaemolyticus

As colnias que apresentarem comportamento compatvel com V.parahaemolyticus nas provas preliminares devero ser submetidas s provas adicionais.

Teste do crescimento a 42C

A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, com auxlio de ala de nquel-cromo, platina ou descartvel estril, inocular um tubo contendo caldo peptonado sal 3%. Incubar a

42 1C por 24 horas. Aps o perodo de incubao, observar a presena de turvao dos meios. O vbrio parahaemolyticus cresce temperatura de 42C.


43

gar gelatina sal 3%

A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, com auxlio de ala de nquel-cromo, platina ou descartvel estril, inocular uma placa de Petri contendo gar gelatina sal 3% (cada placa pode ser dividida em at 6 setores e cada cultivo pode ser inoculado no centro de cada

setor). Incubar as placas a 36 1C por 18 a 24 horas. Colocar as placas em refrigerao por alguns minutos antes de realizar a leitura, o que facilita a visualizao do halo. O aparecimento de um halo opaco ao redor do crescimento indica a presena da gelatinase. O Vibrio parahaemolyticus gelatinase positiva.

Teste da motilidade

A partir da cultura mantida no gar nutriente sal 3% inclinado, com auxlio de agulha de nquel-cromo, platina ou descartvel estril, atravs de picada central, inocular um tubo contendo

gar motilidade sal 3%. Incubar a 36 1C por 24 horas. Um crescimento bacteriano difuso ao redor da picada caracteriza motilidade positiva. O Vibrio parahaemolyticus apresenta motilidade positiva.

Prova de Hugh-Leifson glicose (OF)

A partir do cultivo mantido em gar nutriente sal 3% , inocular, com auxlio de agulha de nquel-cromo, platina ou descartvel estril, dois tubos contendo meio OF glicose (Hugh-Leifson) sal 3%. Cobrir um dos tubos com 2 a 3 ml de leo mineral ou parafina lquida, estril.

Incubar a 36 1C por 18 a 24 horas. Aps o perodo de incubao, verificar a viragem de cor dos meios de verde para amarelo e a presena de bolhas de gs nos meios. A cor amarela nos dois tubos significa fermentao da glicose. A presena de cor amarela somente no tubo sem leo mineral significa utilizao oxidativa da glicose. O Vibrio parahaemolyticus fermenta a glicose sem produo de gs, ou seja, os dois tubos devem apresentar colorao amarela.

Descarboxilao da lisina

A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, com auxlio de ala de nquel-cromo, platina ou descartvel estril, inocular um tubo contendo Caldo vermelho de fenol lisina sal 3%. Inocular tambm um tubo contendo meio base (sem adio do aminocido) que servir de controle. Cobrir os tubos com 2 a 3 ml de leo mineral ou parafina lquida, estril. Incubar a 36

1C por, no mximo, 4 dias, juntamente com um tubo de Caldo vermelho de fenol lisina sal 3% no inoculado, que servir de controle negativo. Examinar os tubos todos os dias.

Durante o perodo de incubao, a cor do meio passa para amarela devido fermentao da glicose, e, ocorrendo a descarboxilao da lisina, o meio retorna cor prpura devido produo de aminas primrias e dixido de carbono. O tubo controle, sem aminocido, deve virar para amarelo e assim permanecer. O Vibrio parahaemolyticus descarboxila a lisina.

Hidrlise da arginina


44

A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, com auxlio de ala de nquel-cromo, platina ou descartvel estril, inocular um tubo contendo caldo arginina sal 3%. Inocular tambm um tubo contendo o meio base (sem adio do aminocido) que servir de controle.

Cobrir os tubos com 2 a 3 ml de leo mineral ou parafina lquida, estril. Incubar a 36 1C por, no mximo, 4 dias, juntamente com um tubo de caldo arginina sal 3% no inoculado, que servir de controle negativo. Examinar os tubos todos os dias. Durante o perodo de incubao, a cor do meio passa para amarela devido fermentao da glicose, e, ocorrendo a hidrlise da arginina, o meio retorna a cor prpura devido produo de aminas primrias e dixido de carbono. O tubo controle, sem aminocido, deve virar para amarelo e assim permanecer. O Vibrio parahaemolyticus no hidrolisa a arginina.

Prova da fermentao do manitol e arabinose

A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, com auxlio de ala de nquel-cromo, platina ou descartvel estril, inocular um tubo contendo caldo vermelho de fenol manitol sal 3% e outro tubo contendo caldo vermelho de fenol arabinose sal 3%. Cobrir o meio com 2 a 3

ml de leo mineral ou parafina lquida, estril. Incubar a 36 1C por 24 horas. Aps o perodo de incubao, observar a mudana de colorao dos meios de vermelho para amarelo, devido fermentao dos acares e consequente produo de cido. 99% das cepas de Vibrio parahaemolyticus fermenta o manitol. 50% das cepas de Vibrio parahaemolyticus fermenta a arabinose.

Teste do halofilismo

A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, com auxlio de ala de nquel-cromo, platina ou descartvel estril, inocular tubos contendo caldo peptonado sal 6% e 10%. Incubar

a 36 1C por 24 horas. Aps o perodo de incubao, observar a presena de turvao nos meios. O Vibrio parahaemolyticus cresce a 6% de sal e no cresce, ou apresenta crescimento discreto, a 10% de sal.

Sensibilidade do agente vibriosttico O/129

Esta prova utilizada como diferencial entre Vibrio parahaemolyticus e V. vulnificus. Embeber um swab previamente esterilizado com a cultura suspeita mantida em caldo peptonado sal 3% e inocular uma placa contendo gar Meller-Hinton sal 3% ou gar soja triptona sal 3%, espalhando bem o inculo, de forma a obter um crescimento o mais homogneo possvel. Deixar as placas absorverem o inculo. Colocar um disco do agente vibriosttico O/129 com

concentrao de 10g e um disco de concentrao de 150g. Incubar as placas a 36 1C por

24 horas. O Vibrio parahaemolyticus resistente concentrao de 10g de agente vibriosttico O/129 enquanto o V. vulnificus sensvel. Todos os vbrios so sensveis

concentrao de 150g do agente O/129.


45

RESULTADOS

Sero consideradas como positivas para Vibrio parahaemolyticus as culturas que apresentarem os seguintes resultados nas provas adicionais de identificao:

1. Motilidade - positiva 2. Hugh Leifson (OF) - glicose fermentativo 3. Descarboxilao da lisina - positivo 4. Hidrlise da arginina - negativa 5. Crescimento a 42C - positivo 6. Fermentao do manitol - positivo 7. Fermentao da arabinose - positivo

8. Sensibilidade ao Agente Vibriosttico O/129 10g - resistente

9. Sensibilidade ao Agente Vibriosttico O/129 150g - sensvel 10. gar gelatina sal 3% - crescimento com formao de halo 11. Halofilismo (6% sal) - positivo 12. Halofilismo (8% sal) - positivo 13. Halofilismo (10% sal) - negativo ou crescimento discreto

A partir da combinao de tubos com resultado positivo em cada srie, calcular o Nmero Mais Provvel. Expressar o valor obtido em NMP/g.


46

NMERO MAIS PROVVEL (NMP) DE MICRORGANISMOS MESFILOS

AERBIOS VIVEIS CAPAZES DE CAUSAR ALTERAO EM PRODUTOS LCTEOS

UHT E ESTERILIZADOS, PASTOSOS E VISCOSOS.

FUNDAMENTOS

1. Pr-incubao: Baseia-se na incubao das amostras em estufa a 36 1C por 7 dias e posterior verificao da oco

Documents

Análises Microbiológicas de Alimentos de Origem Animal e Água IFTM.pdf