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ANDRÉ LUÍS SOARES DOS SANTOS - teses.usp.br€¦ · T.3102 Santos, Andre Luís Soares dos FMVZ Efeito da circulação extracorpórea na expressão da conexina 43 no miocário

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ANDRÉ LUÍS SOARES DOS SANTOS

Efeito da circulação extracorpórea na expressão

da conexina 43 no miocárdio

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Clínica Cirúrgica Veterinária da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para a obtenção do Título de Doutor em Ciências Departamento: Cirurgia Área de Concentração: Clínica Cirúrgica Veterinária Orientador: Prof. Dr. Angelo João Stopiglia

São Paulo

2015

Autorizo a reprodução parcial ou total desta obra, para fins acadêmicos, desde que citada a fonte.

DADOS INTERNACIONAIS DE CATALOGAÇÃO-NA-PUBLICAÇÃO

(Biblioteca Virginie Buff D’Ápice da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo)

T.3102 Santos, Andre Luís Soares dos FMVZ Efeito da circulação extracorpórea na expressão da conexina 43 no miocário / André Luís

Soarea dos Santos. -- 2015. 96 f. :il.

Tese (Doutorado) - Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia. Departamento de Cirurgia, São Paulo, 2015.

Programa de Pós-Graduação: Clínica Cirúrgica Veterinária. Área de concentração: Clínica Cirúrgica Veterinária. Orientador: Prof. Dr. Angelo João Stopiglia.

1. Coração. 2. Circulação extracorpórea. 3. Conexinas. 4. Canulação aórtica. I. Título.

ERRATA

SANTOS, A. L. S. dos. Efeito da circulação extracorpórea na expressão da conexina 43 no miocárdio. 2015. 96 f. Tese (Doutorado em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2015.

Página Parágrafo Onde se lê Leia-se

Ficha

catalográfica

2º parágrafo miocário miocárdio

ERRATA

SANTOS, A. L. S. dos. Efeito da circulação extracorpórea na expressão da conexina 43 no miocárdio. 2015. 96 f. Tese (Doutorado em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2015.

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Ficha

catalográfica

2º parágrafo miocário miocárdio

ERRATA

SANTOS, A. L. S. dos. Efeito da circulação extracorpórea na expressão da conexina 43 no miocárdio. 2015. 96 f. Tese (Doutorado em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2015.

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Ficha

catalográfica

2º parágrafo miocário miocárdio

ERRATA

SANTOS, A. L. S. dos. Efeito da circulação extracorpórea na expressão da conexina 43 no miocárdio. 2015. 96 f. Tese (Doutorado em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2015.

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Ficha

catalográfica

2º parágrafo miocário miocárdio

ERRATA

SANTOS, A. L. S. dos. Efeito da circulação extracorpórea na expressão da conexina 43 no miocárdio. 2015. 96 f. Tese (Doutorado em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2015.

Página Parágrafo Onde se lê Leia-se

Ficha

catalográfica

2º parágrafo miocário miocárdio

FOLHA DE AVALIAÇÃO

Autor: SANTOS, André Luís Soares dos

Título: Efeito da circulação extracorpórea na expressão da conexina 43 no

miocárdio

Tese apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Clínica Cirúrgica Veterinária

da Faculdade de Medicina Veterinária e

Zootecnia da Universidade de São Paulo

para a obtenção do título de Doutor em

Ciências

Data: ______ / ______ / ______

Banca Examinadora

Prof. Dr.: ___________________________________________________________

Instituição: ________________________ Julgamento: ______________________

Prof. Dr.: ___________________________________________________________

Instituição: ________________________ Julgamento: ______________________

Prof. Dr.: ___________________________________________________________

Instituição: ________________________ Julgamento: ______________________

Prof. Dr.: ___________________________________________________________

Instituição: ________________________ Julgamento: ______________________

Prof. Dr.: ___________________________________________________________

Instituição: ________________________ Julgamento: ______________________

“Seja você quem for, seja qual for a posição social que você

tenha na vida, a mais alta ou a mais baixa, tenha sempre como meta

muita força, muita determinação e sempre faça tudo com muito amor e

com muita fé em Deus, que um dia você chega lá. De alguma maneira

você chega lá."

Ayrton Senna

À meus pais, Inez e José. Estiveram e estão

sempre presentes. Esforçaram-se para me

possibilitar um ambiente familiar com muita

riqueza: amor, carinho, educação, princípios

e valores importantes para minha formação.

Ensinaram-me a nunca desistir do objetivo

desejado. Não teria conseguido nada sem o

seu apoio incondicional.

Obrigado, simplesmente por tudo!

Amo vocês.

“Quando encontrar alguém e esse alguém fizer seu coração

parar de funcionar por alguns segundos, preste atenção: pode ser a

pessoa mais importante da sua vida. Se os olhares se cruzarem e, neste

momento, houver o mesmo brilho intenso entre eles, fique alerta: pode

ser a pessoa que você está esperando desde o dia em que nasceu. Se

o toque dos lábios for intenso, se o beijo for apaixonante, e os olhos se

encherem d’água neste momento, perceba: existe algo mágico entre

vocês. Se o primeiro e o último pensamento do seu dia for essa pessoa,

se a vontade de ficar juntos chegar a apertar o coração, agradeça: Deus

te mandou um presente: O Amor. Por isso, preste atenção nos sinais -

não deixe que as loucuras do dia-a-dia o deixem cego para a melhor

coisa da vida: O AMOR.”

Carlos Drummond de Andrade

À minha esposa Alessandra. Meu porto

seguro para todos os momentos, inclusive os

mais difíceis. Pela compreensão, paciência e

incentivo, ajuda, carinho.

Amo você!

AGRADECIMENTOS

Ao Prof. Dr. Angelo João Stopiglia, pela orientação, amizade e

convivência ao longo destes anos. Pela atenção e disponibilidade em ajudar quando

solicitado, sempre atento em explicar tudo nos mínimos detalhes. Por me ensinar a

ter uma visão crítica sobre a academia e sobre a nossa profissão.

A Profª Drª Maria Lúcia Zaidan Dagli, por permitir meu ingresso no

Laboratório de Oncologia Experimental do Departamento de Patologia da

FMVZ/USP para realização das técnicas de biologia molecular. Obrigado pela

atenção e por todo auxílio nos momentos de dificuldade.

Ao Dr. Fábio Antonio Gaiotto, médico e exímio cirurgião cardiovascular.

Pela dedicação, paciência e orientação durante as intervenções cirúrgicas e

principalmente por compartilhar seus conhecimentos. Esta tese não seria possível

sem a sua colaboração. Muito obrigado!

A Mestre Karina Lacava Kwasnicka, médica veterinária e perfusionista.

Seus conhecimentos, sua ajuda e principalmente a sua competência foram decisivos

para a realização deste estudo. Muito obrigado pela sua ajuda!

A Profª Drª Denise Tabbachi Fantoni e a equipe de anestesistas Drª

Márcia Aparecida Portela Kahvegian, Drª Larissa Borges Cardozo, Tatiana Ribeiro

de Castro Carvalho, Maria Fernanda Cerniawsky Innocencio Rizzo, Amadeu Batista

da Silva Neto pela realização dos procedimentos anestésicos durante as

intervenções cirúrgicas.

Ao Dr. Daniel Soares Sanches, médico veterinário com experiência em

patologia animal. Pelo auxílio no delineamento deste estudo, na explicação das

técnicas de biologia molecular e também pela realização da análise histopatológica e

documentação fotográfica da mesma.

Aos médicos veterinários Eduardo Lipparelli Fernandez e ao Dr Kaleizu

Teodoro Rosa pela realização dos exames ecocardiográficos.

Ao médico veterinário e pós-graduando Caio Sabino de Oliveira pela

amizade e por todo auxílio no decorrer deste estudo.

Ao Dr. Lucas Martins Chaible e a Drª Ivone Izabel Mackowiak da Fonseca

pelo auxílio na realização das técnicas de biologia molecular e também pela ajuda

na interpretação dos resultados. Certamente aprendi muito com vocês! Obrigado.

Ao Prof. Dr. Bruno Cogliati pela amizade e a equipe de seu laboratório,

que também sempre estiveram dispostos para ajudar no que foi preciso.

Ao Prof. Dr. José Henrique de Hildebrand e Grisi Filho pela atenção e

orientação referente à estatística do estudo. Agradeço também a Mestre Renata

Santos Silva pelo auxílio na realização da densitometria do western blot e ao médico

veterinário mestrando Marcelo Vannucci Tedardi pela ajuda na realização e

interpretação da análise estatística da referida técnica.

Ao médico veterinário residente Danilo Marin Rodrigues pelo auxílio na

orientação da realização das fotomicrografias referente à imunofluorescência.

Ao secretário do Departamento de Cirurgia da FMVZ-USP Belarmino Ney

Pereira e à secretária do Programa de Pós-graduação em Clínica Cirúrgica do

mesmo departamento Livia dos Santos Gimenes, pela amizade sincera, pelos

momentos agradáveis e por sempre estarem disponíveis para ajudar.

A todos os colaboradores do Departamento de Cirurgia da FMVZ-USP,

pela amizade e por sempre estarem dispostos para ajudar.

A todos os colaboradores do Departamento de Patologia da FMVZ-USP,

colegas e amigos que proporcionaram bons dias. Agradeço à técnica Marguiti Izaura

Soares Silva, pelo auxílio e orientação na realização da imunofluorescência.

Agradeço também a graduanda Ana Paula Dias pela colaboração.

Aos colaboradores da biblioteca da FMVZ-USP, pela amizade, atenção e

ajuda. Agradeço a Elza Maria Rosa B. Faquim, pelo auxílio na normalização da tese

para que estivesse em conformidade com as normas exigidas pelo programa de

pós-graduação em Clínica Cirúrgica Veterinária.

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP),

pelo auxílio financeiro para viabilizar a realização desta pesquisa.

Agradeço a FMVZ/USP pela minha formação acadêmica (graduação e

pós-graduação). Tenho muito orgulho de fazer parte da história desta casa.

“Só sei que nada sei; o fato de saber isso me coloca

em vantagem sobre aqueles que acham saberem

alguma coisa.”

Sócrates

RESUMO

SANTOS, A. L. S. dos. Efeito da circulação extracorpórea na expressão da conexina 43 no miocárdio. [Effect of cardiopulmonary bypass on myocardial connexin 43]. 2015. 96 f. Tese (Doutorado em Ciências) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2015.

As conexinas são proteínas essenciais e estão diretamente relacionadas à

propagação do impulso elétrico no coração, à velocidade de condução bem como à

gênese de muitas afecções cardíacas. Em face da circulação extracorpórea (CEC)

ainda ser utilizada de forma inconsistente na medicina veterinária e devido aos

poucos estudos observados na literatura sobre os efeitos provocados pelo emprego

da CEC na expressão da conexina 43 (Cx43) no miocárdio, objetivou-se avaliá-la em

15 animais da espécie canina, distribuidos em três grupos (C, CEC-1 e CEC -2)

sendo, respectivamente, antes de realizada a CEC, com 60 minutos após esta e 60

minutos de CEC seguida de 30 minutos de restauração da perfusão espontânea.

Avaliou-se a Cx43 pelas técnicas de imunofluorescência, western blot e RT-PCR em

tempo real no tecido muscular cardíaco de regiões correspondentes aos átrios

direito (AD) e esquerdo (AE), ventrículos direito (VD) e esquerdo (VE) e septo

transverso. Os resultados indicaram a presença da Cx43 em todas as regiões do

miocárdio nos grupos C, CEC-1 e CEC-2. A expressão da Cx43 variou

significativamente em CEC-2 no AE e VD em relação ao grupo C (p<0,05). A

expressão gênica de Gja1 (gene da Cx43) não apresentou diferença significativa

entre os grupos estudados. Em CEC-2 identificou-se a presença de vacuolização na

túnica média de artérias de pequeno calibre do miocárdio. Concluiu-se também que

a canulação da aorta bem como a instalação do circuito de CEC no modo aorto-

bicaval constitui técnica exequível.

Palavras-chave: Coração. Circulação extracorpórea. Conexinas. Canulação aórtica.

ABSTRACT

SANTOS, A. L. S. dos. Effect of cardiopulmonary bypass on myocardial connexin 43. [Efeito da circulação extracorpórea na expressão da conexina 43 no miocárdio]. 2015. 96 f. Tese (Doutorado em Ciências) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2015.

Connexins are essential proteins that are directly associated with electrical impulse

propagation and speed of propagation in the heart. They also play a major role in

numerous heart conditions. The use of cardiopulmonary bypass (CPB) in veterinary

medicine is inconsistent and few studies describe the effect of cardiopulmonary

bypass on the expression of connexin 43 (Cx43) in the myocardium. The objective of

this study was to evaluate myocardial expression of Cx43. Connexin 43 of 15 dogs

was assessed at 3 moments: prior to CPB (Group C); 60 minutes after CPB (Group

CPB1); and 60 minutes after CPB followed by 30 minutes of spontaneous perfusion

(Group CPB2). Assessment of Cx43 included immunofluorescence, western blot and

RT-PCR real time of heart tissue samples from the right atrium (RA), left atrium (LA),

right ventricle (LV), right ventricle (RV) and transverse septum. Our results showed

the presence of Cx43 in all 5 areas of the myocardium in groups C, CPB1 and CPB2.

A significant variation on the expression of Cx43 was observed when CPB2 LA and

CPB2 RV were compared to group C (p<0,05). Expression of Gja1 (gene for Cx43)

did not vary significantly among the study groups. Group CBP2 presented

vacuolation of the tunica media of small myocardial arteries. We conclude that

cannulation of the aorta and aorto-bicaval setup of the CPB circuit is feasible

technique.

Key words: Heart. Cardiopulmonary bypass. Connexins. Aortic cannulation.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1- Modelo de organização da placa juncional desenvolvido a partir de estudos de microscopia eletrônica e de difração de raios-X de junções comunicantes do tipo gap de fígado de camundongos ............. 30

Figura 2 - Família multigênica das conexinas derivadas de um provável ancestral comum .................................................................................... 31

Figura 3 - Esquerma relativo à topologia membranal de uma conexina ................. 32

Figura 4 - Esquerma do coração humano ilustrando a propagação do impulso e os padrões de expressão das conexinas de acordo com a região. ........ 34

Figura 5 - Imagem fotográfica do acesso cirúrgico ao nível do 4º espaço intercostal direito .................................................................................... 40

Figura 6 - Imagem fotográfica referente à sutura em bolsa de tabaco dom fio polipropilene 4.0 ou 5.0 realizada na artéria aorta e na veia cava cranial ..................................................................................................... 41

Figura 7 - Imagens fotográficas referente à cânula arterial sendo referenciada com fio algodão ...................................................................................... 42

Figura 8 - Imagens fotográficas referente à cânula venosa sendo referenciada com fio algodão ...................................................................................... 42

Figura 9 - Imagem fotográfica referente à canulação arterial imediatamente antes da incisão da artéria aorta com bisturi para posterior introdução da cânula arterial .................................................................. 43

Figura 10 - Imagem fotográfica referente à canulação arterial seguida de fixação .. 43

Figura 11 - Imagem fotográfica referente à canulação da veia cava cranial imediatamente após a introdução da cânula venosa e antes da fixação da cânula com fio de polipropilene 4.0 ou 5.0. Em ca de cânula arterial proveniente da artéria aorta ............................................ 44

Figura 12 - Imagem fotográfica referente à canulação da artéria aorta e das veias cavas cranial e caudal e fixação com fio de polipropilene 4.0 ou 5.0 .......................................................................................................... 45

Figura 13 - Imagem fotográfica referente à máquina de CEC Modelo ECO 01 - Braile Biomédica .................................................................................... 45

Figura 14 - Imagem fotográfica referente à eletroforese em gel das proteínas ........ 52

Figura 15 - Esquema indicando a colocação das amostras nos poços do gel Bolt® ...................................................................................................... 53

Figura 16 - Fotomicrografia de corte histológico de tecido muscular cardíaco (átrio direito) de animal submetido a CEC por 60 minutos seguida de restauração da perfusão espontânea por 30 minutos ............................ 60

Figura 17 - Fotomicrografia de corte histológico de tecido muscular cardíaco (ventrículo direito) de animal submetido a CEC por 60 minutos seguida de restauração da perfusão espontânea por 30 minutos .......... 60

Figura 18 - Fotomicrografia de corte histológico de tecido muscular cardíaco (átrio esquerdo) de animal submetido a CEC por 60 minutos seguida de restauração da perfusão espontânea por 30 minutos ....................... 61

Figura 19 - Fotomicrografia de corte histológico de tecido muscular cardíaco (ventrículo esquerdo) de animal submetido a CEC por 60 minutos seguida de restauração da perfusão espontânea por 30 minutos .......... 61

Figura 20 - Fotomicrografia de corte histológico de tecido muscular cardíaco (septo) de animal submetido a CEC por 60 minutos seguida de restauração da perfusão espontânea por 30 minutos ............................ 62

Figura 21 - Fotomicrografia de corte histológico de tecido muscular cardíaco de animal do grupo Controle ....................................................................... 62

Figura 22 - Fotomicrografia de corte histológico de tecido muscular cardíaco de animal do grupo controle ........................................................................ 63

Figura 23 - Fotomicrografia de corte histológico de tecido muscular cardíaco de animal submetido a CEC por 60 minutos seguida de restauração da perfusão espontânea por 30 minutos apresentando lesão (degeneração vacuolar) discreta ............................................................ 63

Figura 24 - Fotomicrografia de corte histológico de tecido muscular cardíaco de animal submetido a CEC por 60 minutos seguida de restauração da perfusão espontânea por 30 minutos apresentando lesão (degeneração vacuolar) discreta ............................................................ 64

Figura 25 - Fotomicrografia de corte histológico de tecido muscular cardíaco de animal submetido a CEC por 60 minutos seguida de restauração da perfusão espontânea por 30 minutos apresentando lesão (degeneração vacuolar) moderada ........................................................ 64

Figura 26 - Fotomicrografia de corte histológico de tecido muscular cardíaco de animal submetido a CEC por 60 minutos seguida de restauração da perfusão espontânea por 30 minutos apresentando lesão (degeneração vacuolar) moderada ........................................................ 65

Figura 27 - Fotomicrografia de corte histológico de tecido muscular cardíaco de animal submetido a CEC por 60 minutos seguida de restauração da perfusão espontânea por 30 minutos apresentando lesão (degeneração vacuolar) intensa ............................................................. 65

Figura 28 - Fotomicrografia de corte histológico de tecido muscular cardíaco de animal submetido a CEC por 60 minutos seguida de restauração da perfusão espontânea por 30 minutos apresentando lesão (degeneração vacuolar) intensa ............................................................. 66

Figura 29 - Fotomicrografia referente à imunofluorescência de região de miocárdio (átrio direito) de animal do grupo Controle ............................. 68

Figura 30 - Fotomicrografia referente à imunofluorescência de região de miocárdio (ventrículo direito) de animal do grupo Controle .................... 68

Figura 31 - Fotomicrografia referente à imunofluorescência de região de miocárdio (átrio esquerdo) de animal do grupo Controle ....................... 69

Figura 32 - Fotomicrografia referente à imunofluorescência de região de miocárdio (ventrículo esquerdo) de animal do grupo Controle ............... 69

Figura 33 - Fotomicrografia referente à imunofluorescência de região de miocárdio (septo transverso) de animal do grupo Controle .................... 70

Figura 34 - Fotomicrografia referente à imunofluorescência de região de miocárdio (átrio direito) de animal do grupo CEC-1 ............................... 70

Figura 35 - Fotomicrografia referente à imunofluorescência de região de miocárdio (ventrículo direito) de animal do grupo CEC-1 ....................... 71

Figura 36 - Fotomicrografia referente à imunofluorescência de região de miocárdio (ventrículo direito) de animal do grupo CEC-2 ....................... 71

Figura 37 - Fotomicrografia referente à imunofluorescência de região de miocárdio (ventrículo esquerdo) de animal do grupo CEC-2 .................. 72

Figura 38 - Fotomicrografia referente à imunofluorescência de região de miocárdio (septo transverso) de animal do grupo CEC-2 ....................... 72

Figura 39 - Fotomicrografia referente à imunofluorescência (controle negativo da reação) de região de miocárdio (ventrículo direito) de animal do grupo Controle ........................................................................................ 73

Figura 40 - Esquema referente à membrana (região septo transverso) após revelação ................................................................................................ 74

Figura 41 - Boxplots referente à análise densitométrica da expressão da Cx43 ...... 75

Figura 42 - Boxplot referente à análise da expressão do gene Gja1 (Cx43) no átrio direito.............................................................................................. 76

Figura 43 - Boxplot referente à análise da expressão do gene Gja1 (Cx43) no ventrículo direito ..................................................................................... 77

Figura 44 - Boxplot referente à análise da expressão do gene Gja1 (Cx43) no átrio esquerdo ........................................................................................ 77

Figura 45 - Boxplot referente à análise da expressão do gene Gja1 (Cx43) no ventrículo esquerdo ................................................................................ 78

Figura 46 - Boxplot referente à análise da expressão do gene Gja1 (Cx43) no septo interventricular .............................................................................. 78

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

cDNA fita de ácido desoxirribonucleico complementar a ácido ribonucleico que contém a mensagem que codifica para determinada proteína.

CEC Circulação extracorpórea cAMP Monofosfato de adenosina cíclico cGMP Monofosfato de guanosina cíclico Cx Conexina Cxs Conexinas Cx26 Conexina 26 Cx30.2 Conexina 30.2 Cx31.9 Conexina 31.9 Cx37 Conexina 37 Cx40 Conexina 40 Cx43 Conexina 43 Cx45 Conexina 45 Cx46 Conexina 46 Cx50 Conexina 50 DNA Ácido desoxirribonucleico. Gap Fenda GAPDH proteína gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase Gja1 Gene da conexina 43 H&E Hematoxilina e Eosina IM Intramuscular IP3 Trifosfato de inositol IV Intravenoso

MPM Marcador de peso molecular mRNA Ácido ribonucleico cuja informação que codifica para uma determinada

proteína estão contidos pH Concentração do íon hidrogênio RNA Ácido ribonucleico Rpm Rotações por minuto RT-PCR Reação de polimerização em cadeia a partir de ácido ribonucleico,

utilizando a enzima transcriptase reversa.

LISTA DE SÍMBOLOS

Ca+ Símbolo referente ao elemento químico cálcio G Gaus K+ Símbolo referente ao elemento químico potássio kDa Kilodalton mg/kg Miligramas por quilograma de peso mL/kg/h Mililitros por quilograma de peso por hora mL/kg/min Mililitros por quilograma de peso por minuto mmHg Milímetros de mercúrio Na+ Símbolo referente ao elemento químico sódio nm Nanômetros UI/kg Unidade internacional por quilograma de peso V Volts µg/kg Micrograma por quilo de peso µm Micrômetro µL Microlitro ºC Graus Celsius

LISTA DE TERMOS EM INGLÊS

Bradford Reagente utilizado para se determinar a concentração de

proteínas numa solução

GJIC Comunicação intercelular através de junções tipo gap.

Knockout Animal geneticamente manipulado em que determinado(s)

gene(s) é (são) suprimidos

RT-PCR Reação de polimerização em cadeia a partir de ácido

ribonucleico, utilizando a enzima transcriptase reversa

Primer É uma sequência de geralmente 20bp que é o ponto inicial de

reconhecimento pela polimerase na duplicação do DNA sense

Probe Nome dado a sequência de oligonucleotídeos (20bp) que

contém os fluoróforos utilizados no RT-PCR em tempo real. O

produto de amplificação do RT-PCR em tempo real é

proporcional à intensidade luminosa do fluoróforo

Taqman Nome dado ao conjunto de primers e probe fluorescente

utilizados no RT-PCR em tempo real

Western Blot Método utilizado para identificação de proteínas, baseado em

extração, eletroforese, transferência e identificação através de

anticorpos e sistema de revelação.

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ............................................................................................... 21

2 REVISÃO DE LITERATURA .......................................................................... 23

3 OBJETIVO GERAL ........................................................................................ 37

3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................... 37

4 MATERIAL E MÉTODO ................................................................................. 38

4.1 PRODECIMENTO ANESTÉSICO .................................................................. 38

4.2 PROCEDIMENTO CIRÚRGICO .................................................................... 40

4.3 MOMENTOS DA AVALIAÇÃO DOS PARÂMETROS ..................................... 47

4.4 AVALIAÇÃO DOS PARÂMETROS ................................................................. 47

4.4.1 Histopatogia do tecido muscular cardíaco ...................................................... 48

4.4.2 Imunofluorescência para a conexina 43 ......................................................... 49

4.4.3 Western blot para a conexina 43 .................................................................... 50

4.4.4 Determinação da expressão do mRNA correspondente ao Gja1 (gene da

conexina 43) utilizando a técnica de RT-PCR em tempo real ......................... 55

4.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................................................. 58

5 RESULTADOS ............................................................................................... 59

5.1 AVALIAÇÃO DA CANULAÇÃO DA AORTA E INSTALAÇÃO DO CIRCUITO

DE CEC NO MODO AORTO-BICAVAL .......................................................... 59

5.2 AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA DO TECIDO MUSCULAR CARDÍACO ... 59

5.3 IMUNO-LOCALIZAÇÃO DA CONEXINA 43 (IMUNOFLUORESCÊNCIA) ..... 66

5.4 AVALIAÇÃO QUANTITATIVA DA CONEXINA 43 (WESTERN BLOT) .......... 73

5.5 AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DO mRNA DA CONEXINA 43 (RT-PCR EM

TEMPO REAL) ............................................................................................... 76

6 DISCUSSÃO .................................................................................................. 79

7 CONCLUSÃO ................................................................................................. 88

REFERÊNCIAS...............................................................................................90

21

1 INTRODUÇÃO

Considerada como um dos mais importantes avanços na medicina do

século XX, a cirurgia cardíaca a céu aberto teve o seu início em 1952 no Hospital da

Universidade de Minnesota (Estados Unidos) quando F. John Lewis corrigiu uma

comunicação interatrial de dois cm de diâmetro, sob visão direta, com interrupção do

fluxo nas cavas e hipotermia corporal moderada (26º C), em uma menina de cinco

anos de idade. Reconhecida como o berço da cirurgia cardíaca mundial, a referida

universidade foi responsável pela formação de muitos pioneiros na cirurgia torácica

e cardiovascular de outros países. Estas complexas cirurgias tornaram-se possíveis

devido ao advento da circulação extracorpórea (CEC), pois ao mesmo tempo que

assegurou a oxigenação dos tecidos e a eliminação dos seus produtos finais,

permitiu ao cirurgião acessar o interior do coração por período de tempo superior

àquele estabelecido pela parada circulatória total (BRAILE; GODOY, 2012; HESSEL,

2014).

Na medicina veterinária, a CEC tem sido utilizada de forma inconsistente

desde o final da década de 1960 para o tratamento de doenças cardíacas

congênitas e adquiridas, tais como defeitos do septo ventricular, dupla via de saída

do ventrículo, tetralogia de Fallot e doença valvar mitral (BORENSTEIN et al., 2004;

PELOSI et al., 2013). Em animais, tanto a máquina quanto os materiais descartáveis

empregados na implantação da CEC são idênticos aos da espécie humana, sem

qualquer modificação (HOLMBERG, 1998).

Porém, a grande variedade no tamanho dos animais domésticos dificulta

a padronização de técnicas de canulação, dos oxigenadores, volumes do perfusato

e das soluções utilizadas. Além disso, os altos custos envolvidos na aplicação da

técnica e a exigência de uma equipe especialmente treinada para se garantir

resultados satisfatórios ainda são responsáveis pela limitação no seu uso

(KWASNICKA, 2003; HUNT, 2005; PELOSI et al., 2013).

Fatores como o tempo de CEC e o clampeamento aórtico estão

diretamente relacionados com a incidência de complicações, entre as quais

destacam-se arritmias, fibrilação ventricular, hipotensão, alterações hematológicas e

bioquímicas, hemorragia proveniente da canulação da aorta, hipóxia e inflamação

sistêmica (PELOSI et al., 2013).

22

Para uma melhor compreensão da fisiopatologia destes processos

existem muitos temas que necessitam ser pesquisados, com o objetivo de

solucionar, amenizar e até mesmo prevenir as alterações decorrentes da CEC.

Neste contexto, destaca-se o estudo das junções intercelulares do tipo gap, as quais

são compostas de uma família de proteínas chamadas conexinas. Tais junções

permitem a comunicação entre as células cardíacas.

As conexinas são essenciais para a propagação do impulso elétrico pelo

coração e determinantes para a velocidade de condução. Sua disfunção constitui um

importante fator na gênese do ritmo cardíaco anormal, além de ser extremamente

relevante na patogênese de uma grande variedade de doenças cardíacas. A

conexina 43 (Cx43) é a principal isoforma presente no miocárdio, e está diretamente

envolvida no controle da homeostasia tecidual, crescimento e proliferação celular

(JANSEN et al., 2010; LAMBIASE1; TINKER, 2014).

Deste modo, aventou-se a hipótese do estudo da referida proteína

presente no miocárdio, avaliando-se os possíveis efeitos da CEC sobre a localização

e expressão da Cx43 e sobre a expressão gênica de Gja1 (gene da Cx43).

1 LAMBIASE, P. D.; TINKER, A. Connexins in the heart. Cell and Tissue Research, 31 out. 2014. No prelo.

23

2 REVISÃO DE LITERATURA

A doença cardíaca pode ser considerada como a principal afecção no

mundo. Nos dias atuais, a cirurgia torácica e cardiovascular é comumente utilizada

para revascularização na doença arterial coronariana, reparo e/ou substituição de

valva cardíaca e transplantes cardíaco e cardiopulmonar. Tais cirurgias destinam-se

ao tratamento de doenças cardíacas congênitas ou adquiridas (PUNJABI; TAYLOR,

2013). Tais evoluções na cirurgia cardiotorácica somente foram viabilizadas a partir

do desenvolvimento da circulação extracorpórea (CEC), técnica considerada como

um dos avanços clínicos mais importantes na medicina durante a segunda metade

do século XX (HESSEL, 2014).

Pode-se, admitir que a história da CEC tenha tido o seu início nos idos de

1628, confundindo-se com a descrição da circulação do sangue publicada por

William Harvey, em seu livro intitulado “De Motu Cordis” (“Sobre o Movimento do

Coração e do Sangue”). Decorridos 175 anos após a descrição da circulação,

Lavoisier desenvolveu seus estudos colaborando para à compreensão da fisiologia

respiratória (SOUZA; ELIAS, 2006). O conceito de que o coração poderia ser

substituído por uma CEC foi sugerido pela primeira vez por Le Gallois em 1813. Dois

anos mais tarde, Frey e Gruber construíram um sistema de oxigenação sanguínea

extracorpórea (HESSEL, 2014). Posteriormente, Ludwig Rehn, em 1896, obteve

êxito ao suturar um ferimento de ventrículo direito (BRAILE; GODOY, 2012).

As primeiras ideias sobre a circulação cruzada em animais originaram-se

das pesquisas de Fredericq (1890) e de Hedon (1910), enquanto que as primeiras

aplicações em seres humanos datam de 1940 e 1948, e foram realizadas por

Duncan e Vecchietti, e tinham como objetivo depurar o sangue de pacientes

portadores de insuficiência hepática e renal (SOUZA; ELIAS, 2006).

Southworth e Pierce (1952) avaliaram o emprego da circulação cruzada

em cirurgia cardíaca. Em seu estudo, detalharam o método e estabeleceram os

princípios para a canulação do sistema. Em humanos, o sistema foi abandonado

devido às sérias reações imunológicas. No entanto, existe estudo em cães indicando

a viabilidade da circulação cruzada como método de CEC, desde que o cão doador

seja de porte grande e o cão receptor de porte médio (HUNT et al., 1993).

24

Muitas descobertas científicas e novas técnicas tiveram de ser

desenvolvidas antes de se proceder à instituição da CEC. A descoberta da heparina

e da protamina tornaram a CEC cirurgicamente possível (HESSEL, 2014).

A primeira cirurgia cardíaca a céu aberto, com sistema coração-pulmão

artificial, foi realizada com sucesso em seis de maio de 1953 pelo médico John

Gibbon e sua equipe em uma paciente de 18 anos que apresentava comunicação

interatrial. Gibbon desenvolveu com sua esposa o sistema, para conseguir acesso

ao interior do coração. A duração total da CEC foi de 45 minutos (BORDLEY;

HARVEY, 1976; SOUZA, ELIAS, 2006; HESSEL, 2014).

Após este marco histórico, inúmeros estudos na medicina têm sido

conduzidos até os dias atuais com o intuito de se aprimorar cada vez mais as

técnicas da circulação extracorpórea.

Na medicina veterinária, tanto a cirurgia torácica em geral quanto a

cardiovascular, mais especificamente, vem se tornando cada vez mais uma

realidade em hospitais veterinários de universidades desde as décadas finais do

século XX, principalmente devido aos avanços tecnológicos. No Brasil, os estudos

iniciais sobre cirurgias cardíacas datam do final da década de 1990 e direcionaram-

se ao estudo das técnicas de toracotomias e parada circulatória temporária (PINTO

et al., 2000; KWASNICKA et al., 2000; STOPIGLIA et al., 2001, GARCIA et al., 2005;

ANDRADE et al., 2006; MINGRONE et al., 2006, GARCIA et al., 2009).

Intervenções cirúrgicas visando à correção de bradiarritmias (FREITAS et

al., 2002), correção cirúrgica paliativa da tetralogia de Fallot (FREITAS et al., 2003),

correção da persistência do ducto arterioso (STOPIGLIA et al., 2004) e correção da

comunicação inter-atrial (FREITAS et al., 2005) foram realizadas em cães doentes

com resultados promissores.

Ao mesmo tempo que pesquisadores confirmaram a viabilidade da

pneumonectomia (IRINO et al., 2004; SIMÕES et al., 2005; BINOKI et al., 2007;

SIMÕES et al., 2007), outros estudos se direcionaram a uma melhor compreensão

sobre o funcionamento da máquina de circulação extracorpórea e as variações das

técnicas de perfusão (KWASNICKA, 2003) além da avaliação das alterações

clínicas, laboratoriais e anátomo-histopatológicas ocasionadas pela CEC, em cães

(FREITAS, 2004).

A CEC vem sendo utilizada na medicina veterinária de forma pouco

sistematizada desde o final da década de 1960 para o tratamento de doenças

25

cardíacas congênitas e adquiridas, tais como defeitos do septo ventricular, dupla via

de saída do ventrículo, tetralogia de Fallot e doença valvar mitral. Em cães e gatos,

a variação anatômica da cavidade torácica, os diferentes tipos de canulação, a

variabilidade considerável no tamanho e conformação do corpo, o limitado volume

sanguíneo em pacientes menores, as diferenças relacionadas à coagulação e

hemostasia quando comparado aos pacientes humanos, da disponibilidade limitada

de hemocomponentes e os custos associados à sua utilização são importantes

fatores relacionados a CEC que devem ser considerados (PELOSI et al., 2013).

As doenças cardíacas congênitas cujo tratamento cirúrgico é considerado

rotina incluem a persistência do ducto arterioso e a persistência do quarto arco

aórtico direito (HUNT, 2005). No entanto, para a correção cirúrgica de outras

doenças como defeitos do septo atrial e ventricular, estenoses pulmonar e aórtica,

defeito no canal atrioventricular, tetralogia de Fallot e doenças valvulares também se

faz necessário a utilização da técnica de circulação extracorpórea (KLEMENT et al.,

1987).

Segundo o hospital veterinário da Universidade da Califórnia (Davis -

Estados Unidos), cerca de 17% dos cães e 5% dos gatos avaliados pelo serviço de

cardiologia da referida instituição ao longo de um período de 10 anos foram

diagnosticados com doença cardíaca congênita. As cardiopatias congênitas mais

comuns em cães foram a estenose sub-aórtica e a persistência do ducto arterioso.

Os gatos foram mais acometidos por displasia da valva tricúspide e defeito no septo

ventricular (MACDONALD, 2006).

Em animais, tanto a máquina quanto os materiais descartáveis

empregados na implantação da CEC são idênticos aos da espécie humana, sem

qualquer modificação (HOLMBERG, 1998).

A CEC constitui-se em sistema artificial por meio do qual o sangue é total

ou parcialmente transportado para fora do organismo temporariamente onde é

oxigenado em máquina apropriada, filtrado, retornando à circulação (SANT’ANA;

LUCCHESE, 1994). Pode também ser denominado de sistema coração-pulmão

artificial (KURUSZ, 2003).

O aparelho de CEC possui duas partes principais: a parte motora (que

possui a função do coração propriamente dita) e a parte oxigenadora. Considera-se

ideal que a parte motora produza mínimo trauma nos elementos sanguíneos,

permitindo o controle de fluxo de acordo com a necessidade do paciente, sendo

26

capaz de impulsionar o sangue (GOMES, 1985). A parte oxigenadora constitui-se de

dispositivo mecânico que torna possível as trocas de oxigênio, dióxido de carbono,

vapor de água e gases anestésicos entre o sangue do paciente e a atmosfera

adjacente (SANT’ANA; LUCCHESE, 1994).

Estudos têm sido conduzidos na tentativa de viabilizar a técnica de CEC

em medicina veterinária (KWASNICKA, 2003; FREITAS, 2004). Entretanto, a grande

variedade no tamanho dos animais domésticos dificulta a padronização de técnicas

de canulação, dos oxigenadores, volumes do perfusato e das soluções utilizadas.

Além disso, os altos custos envolvidos na aplicação da técnica e a exigência de uma

equipe especialmente treinada para se garantir resultados satisfatórios ainda são

responsáveis pela limitação no seu uso (KWASNICKA, 2003; HUNT, 2005; PELOSI

et al., 2013). No mínimo, a equipe para realização de cirurgias cardíacas consiste do

cirurgião principal, cirurgião assistente, instrumentador, enfermeiro, anestesista,

perfusionista além dos membros da unidade de terapia intensiva (GRIFFITHS,

2010).

A incidência de complicações está diretamente relacionada com fatores

como o tempo de CEC e o clampeamento aórtico. Entre as principais complicações

destacam-se arritmias, fibrilação ventricular, hipotensão, alterações hematológicas e

bioquímicas, hemorragia proveniente da canulação da aorta, hipóxia e inflamação

sistêmica (PELOSI et al., 2013).

Diversos trabalhos discorrem as alterações ocasionadas pela CEC, entre

as quais citam-se as alterações hematológicas como hemólise e oclusão

microvascular (SANT’ANA; LUCCHESE, 1994; MARQUES et al., 1995), agregação

plaquetária e trombocitopenia, além de alterações hidroeletrolíticas como a

hipocalemia (HOLMBERG, 1998). Em estudos de microscopia eletrônica no coração

Kawai et al. (1992) observaram aumento das mitocôndrias, laceração das miofibrilas,

edema intracelular. Já, Freitas (2004), observou edema perinuclear, hemorragia,

miocardite aguda, necrose, pericardite neutrofílica no miocárdio e enfisema, áreas

focais com hemorragia, derrame de fibrina, infiltrado inflamatório misto e atelectasia

pulmonar em cães.

Entre as principais causas de arritmias nos períodos trans e pós-

operatórios em cães submetidos à CEC, destacam-se hipotermia, hipóxia,

hipoventilação e depressão cardiovascular (CAYWOOD, 1996). Já Yoshida et al. em

1984, afirmam que a CEC pode ser responsável por anormalidades nos movimentos

27

do septo no período pós-operatório. A hipotermia foi indicada como a causa mais

frequente de bradicardia, podendo promover a ocorrência de fibrilação atrial durante

a anestesia (MAGILLIGAN, 1985).

Existem publicações que indicam a utilização da hipotermina durante a

execução da CEC (LEW et al., 1997; KANEMOTO et al., 2010). Por outro lado, em

um estudo comparativo entre hipotermia e normotermia em CEC foi postulado que a

normotermia é mais indicada para intervenções cirúrgicas a céu aberto de curta

duração, enquanto que a hipotermia é mais indicada para cirurgias a céu aberto de

maior duração. Entretanto, conclui que se o circuito de CEC puder ser aperfeiçoado

para uso em pequenos animais, a CEC normotérmica pode eventualmente promover

menor injúria ao paciente, tornando-se um procedimento de escolha (SHIBAZAKI et

al., 1999).

Com relação à canulação arterial, um estudo sobre circulação cruzada em

cães procedeu ao acesso das artérias ilíaca externa (doador) e aorta (receptor) com

êxito (HUNT; PEARSON; BELLENGER, 1993). Por outro lado, existem publicações

que referem uma possível fragilidade da artéria aorta em cães, fato este relacionado

a complicações decorrentes da canulação do referido vaso sanguíneo (KLEMENT et

al., 1987a; ORTON, 1994; GRIFFITHS, 2010; PELOSI et al., 2013).

Assim, os pesquisadores recomendam para a canulação arterial a artéria

axilar (HEDAYATI et al., 2004), artéria femoral esquerda (DALLAN et al., 1987;

(PETERS et al., 1997; BEHR et al., 2007; GRIFFITHS, 2010; PELOSI et al., 2013).

ou artéria carótida esquerda (KANEMOTO et al., 2010; UECHI, 2012; FUJIWARA et

al., 2012; GRIFFITHS, 2010; PELOSI et al., 2013).

Em publicação recente foi mencionada a necessidade de realização de

um estudo para se comprovar de fato a exequibilidade da canulação da aorta em

cães para instituição da CEC (PELOSI et al., 2013).

Com relação ao perfusato (volume necessário para preencher todo o

circuito de CEC impedindo a entrada de ar no leito vascular do paciente no momento

da perfusão), pode-se utilizar o cristaloide ou o sanguíneo (KWASNICKA, 2003). Há

relatos em medicina veterinária de que o uso do perfusato sanguíneo não promoveu

nenhum efeito colateral, auxiliando a atenuar a diminuição no hematócrito

(KANEMOTO et al., 2010). Entretanto, a literatura veterinária sugere que o perfusato

cristalóide é usado mais frequentemente em relação ao sanguíneo (PELOSI et al.,

2013).

28

Poucos são os casos em que se realizou cirurgia cardíaca com o coração

em movimento (BEHR et al., 2007; SODA et al., 2009), pois há um grande risco da

ocorrência de embolia, o que seria fatal para o paciente. O uso de cardioplegia tem

como finalidade além da parada do coração, para que o cirurgião possa realizar o

procedimento, a proteção do miocárdio durante o período de isquemia

(KWASNICKA, 2003).

O uso de soluções cardioprotetoras promove um maior grau de

complexidade ao procedimento, e isso reflete diretamente no planejamento

estratégico durante a cirurgia (PELOSI et al., 2013). A cardioplegia promove uma

despolarização na membrana celular, evitando a condução do potencial de ação e

resultando em parada cardíaca diastólica (CHAMBERS; FALLOUH, 2010).

Atualmente, estudos tem sido conduzidos no intuito de desenvolver novos

mecanismos terapêuticos para proteção do miocárdio contra a lesão por isquemia-

reperfusão (SLUIJTER et al., 2014).

O anticoagulante usado durante a CEC é a heparina administrada por via

intravenosa (IV). Ao término da CEC, o fármaco utilizado para reverter o efeito

anticoagulante é a protamina. Na literatura veterinária as doses utilizadas são

bastante variáveis (HUNT; PEARSON; BELLENGER, 1993; LEW et al., 1997;

KWASNICKA, 2003; FREITAS, 2004; BEHR et al., 2007; SODA et al., 2009;

GRIFFITHS, 2010; KANEMOTO et al., 2010; PELOSI et al., 2013).

Apesar das intercorrências relacionadas com a instituição da CEC, alguns

estudos apontam a técnica de circulação extracorpórea como técnica viável de ser

aplicada em medicina veterinária (KLEMENT et al., 1987a; ORTON, 1994; ORTON

et al., 2001; BROURMAN, 2003; KWASNICKA, 2003; FREITAS, 2004; BEHR et al.,

2007; SEREDA et al., 2009; SODA et al., 2009; TANAKA et al., 2009; KANEMOTO

et al., 2010; GRIFFITHS, 2010; UECHI et al., 2011; FUJIWARA et al., 2012; UECHI,

2012; UECHI et al., 2012; MIZUNO; MIZUKOSHI; UECHI, 2013)

Brourman (2003) descreve, em seu estudo referente à utilização da CEC

em seis felinos, sucesso, indicando ser possível realizar perfusão nesta espécie

durante 90 minutos. Outros pesquisadores relataram êxito na correção cirúrgica de

defeito de septo atrial em um animal da mesma espécie (UECHI et al., 2011).

Para uma melhor compreensão da fisiopatologia destes processos, e

objetivando-se solucionar, amenizar e até mesmo prevenir as alterações decorrentes

da CEC, existem muitos temas que necessitam ser pesquisados. Neste contexto,

29

destaca-se o estudo das junções intercelulares do tipo gap, as quais são compostas

de uma família de proteínas chamadas conexinas.

Junções intercelulares são estruturas especializadas que se encontram

na membrana plasmática das células que compõem os tecidos de um organismo

vivo e são classificadas de acordo com a principal função que desempenham

(ALBERTS et al., 1994). As junções de ancoramento promovem a adesão de uma

célula à outra ou a elementos da matriz celular enquanto que as junções de oclusão

restringem a passagem de substâncias pelo espaço entre as células. Já as junções

comunicantes do tipo gap (GJIC), promovem a comunicação entre as células

(YAMASAKI, 1990; YAMASAKI; NAUS, 1996).

As GJIC estão presentes nos tecidos multicelulares de diversas espécies

animais. Constituem exceções as células sanguíneas, musculares esqueléticas e

nervosas. (YAMASAKI; NAUS, 1999). Quando observadas por microscopia

eletrônica, as junções gap apresentam estrutura pentalaminar característica,

constituindo verdadeiras placas juncionais nesta região (KOVAL, 2006).

No final da década de 1970, foi proposto um modelo de organização da

placa juncional desenvolvido a partir de estudos de microscopia eletrônica e de

difração de raios-X de junções gap de fígado de camundongos (Figura 1). Segundo

o referido modelo, cada placa é constituída por vários canais intercelulares formados

pela associação, face a face, de estruturas hexaméricas de 7 nm de diâmetro

denominadas conexons. Cada conexon é composto por seis subunidades de

proteínas transmembranas, conhecidas como conexinas (Cxs) e que oligomerizadas

formam um poro central hidrofílico com cerca de 2nm de diâmetro (MAKOWSKI et

al., 1977) O tamanho e o número de placas juncionais variam de acordo com o tipo

celular e dependem frequentemente do estado de atividade dos tecidos (UNWIN;

ZAMPIGHI, 1980; BEYER, 1993; VELDEN et al., 2002; KREUZBERG; WILLECKE;

BUKAUSKAS, 2006; GOODENOUGH; PAUL, 2009; CARETTE et al., 2014;

LAMBIASE; TINKER, 2014).

As conexinas são filogeneticamente conservadas (GOODENOUGH et al.,

1996), classificadas de acordo com seus pesos moleculares e estão inseridas na

membrana plasmática (YAMASAKI; NAUS, 1996; VELDEN et al., 2002;

KREUZBERG; WILLECKE; BUKAUSKAS, 2006; GOODENOUGH; PAUL, 2009;

CARETTE et al., 2014; LAMBIASE; TINKER, 2014). A associação de dois conexons

forma um canal intercelular que conecta o citoplasma de duas células adjacentes,

30

permitindo a passagem direta de moléculas com peso molecular inferior a 1kDa,

incluindo precursores metabólicos, nutrientes e fatores de sinalização celular, tais

como trifosfato de inositol (IP3), monofosfato de adenosina cíclico (cAMP),

monofosfato de guanosina cíclico (cGMP) e íons, enquanto que moléculas maiores,

como proteínas, polissacáridos e lipídeos complexos ficam retidos no interior do

citoplasma (CARETTE et al., 2014).

Figura 1- Modelo de organização da placa juncional desenvolvido a partir de estudos de microscopia eletrônica e de difração de raios-X de junções comunicantes do tipo gap de fígado de camundongos

Fonte: (MAKOWWSKI et al., 1977. Adaptado por SANTOS, A. L. S., 2014) Legenda: Em detalhe: Cx: uma conexina (indicada na figura pelo quadrilátero vermelho). Cada

conexon (círculo azul) é composto por seis subunidades de conexinas, as quais oligomerizadas formam um poro central hidrofílico com cerca de 2nm de diâmetro (círculo amarelo) e que está associado a outro conexon na membrana adjacente (quadrilátero verde). A associação de dois conexons forma um canal intercelular que interliga diretamente o citoplasma de duas células adjacentes (célula 1 e célula 2) e permite a passagem direta de moléculas com peso molecular de até 1kDa (representada pela linha em marrom com setas em sentidos opostos).

31

Tal comunicação é reconhecida como essencial em diversas funções

fisiológicas e fisiopatológicas, tais como crescimento celular, proliferação e

diferenciação, homeostase do tecido, cicatrização de feridas, entre outras (EVANS;

MARTIN, 2002).

A nomenclatura utilizada atualmente refere-se ao tamanho da proteína

predita a partir da sequência do cDNA considerado (em kDa) precedida do termo

genérico Cx (BEYER et al., 1987; BEYER, 1993). Em 1991, Bennett et al.

propuseram que os genes das conexinas originaram-se de uma sequência, ainda

indeterminada, que poderia ter sofrido ao menos uma duplicação no início ou

imediatamente antes da evolução dos vertebrados, originando as subclasses α, β, γ.

Dessa forma, divide-se as conexinas em três subclasses, de acordo com a estrutura

do gene que as codificam (Figura 2).

Com o advento do sequenciamento genômico, 21 conexinas já foram

identificadas em mamíferos (GOODENOUGH; PAUL, 2009). Sabe-se que a família

das Cxs compreende 20 membros no camundongo e 21 membros no genoma

humano (SÖHL; WILLECKE, 2004).

Figura 2 - Família multigênica das conexinas derivadas de um provável ancestral comum

Fonte: (MESNIL; YAMASAKI, 1990) Legenda: Em detalhe: as conexinas são divididas em três subclasses (α, β e γ) de acordo com a

estrutura do gene que as codificam.

32

As conexinas são proteínas transmembranas não glicosiladas de massa

molecular aparentemente variando de 21 a 70 kDa. Suas estruturas moleculares

foram determinadas por técnicas bioquímicas realizadas a partir de frações

subcelulares ricas em junções gap. (GOODENOUGH; STOECKENIUS, 1972;

NICHOLSON et al., 1981; BEYER et al, 1987; GOODENOUGH; PAUL, 2009).

Compartilhando uma homologia comum, as Cxs são constituídas por

quatro domínios hidrofóbicos muito conservados representando cada um deles, um

segmento de membrana: M1, M2, M3 e M4, duas alças extracelulares E1 e E2 de

cerca de 20 a 30 aminoácidos, contendo cada uma três resíduos de cisteínas

invariáveis em uma sequência conservada, as extremidades amino-terminal

(aproximadamente 20 aminoácidos) e carboxi-terminal bem como as hélices que

ligam M1 a M3 (aproximadamente 40 a 60 aminoácidos), as quais são

citoplasmáticas (Figura 3).

Figura 1 - Esquerma relativo à topologia membranal de uma conexina

Fonte: (BEYER, 1993) Legenda: Em detalhe: as regiões referentes à membrana, domínio extracelular, citoplasma, porção

amino-terminal (H2N), porção carboxi-terminal (COOH), os domínios transmembrana (M1, M2, M3 e M4) e as alças extracelulares representam as sequências mais conservadas entre as diferentes conexinas. Cada alça extracelular contém três cisteínas (C) - indicadas em vermelho - que são conservadas em todas as conexinas. O domínio M3 (verde claro) tem uma característica anfipática que está diretamente relacionado com o movimento de fechamento do gap. Já os domínios citoplasmáticos (azul) correspondem às porções única em cada conexina, sendo portanto, específicas.

33

Dependendo da oligomerização das conexinas, um conexon pode ser

composto por um único tipo de conexina (homomérico) ou por diferentes tipos de

conexinas (heteromérico). Enquanto que o alinhamento de dois conexons idênticos

promove a formação de um canal intercelular homotípico, o alinhamento de dois

conexons diferentes leva à formação de um canal heterotípico. Esta diversidade tem

relevância uma vez que canais intercelulares compostos de diferentes Cxs têm

diferentes propriedades fisiológicas, incluindo estado de condutância único ou

múltiplo (GOODENOUGH; PAUL, 2009).

As conexinas são essenciais para a propagação do impulso elétrico pelo

coração e determinantes para a velocidade de condução. Sua disfunção constitui um

importante fator na gênese do ritmo cardíaco anormal, além de ser extremamente

relevante na patogênese de uma grande variedade de doenças cardíacas (JANSEN

et al., 2010; LAMBIASE; TINKER, 2014). Os miócitos cardíacos dos mamíferos

estão entre as células mais fortemente interligadas na natureza, presumivelmente

refletindo a evolução de amplas conexões intercelulares de baixa resistência para

garantir a eficiente e segura ativação elétrica do coração (SAFFITZ, 2006). No

miocárdio, as Cxs estão envolvidas na propagação do potencial de ação para

promover a contração de milhões de células em alguns décimos de segundo

(GOLDBERG et al., 2003; LIN et al., 2007).

No coração de mamíferos já foram identificadas as seguintes conexinas:

Cx26, Cx30.2, Cx31.9, Cx37, Cx40, Cx43, Cx45, Cx46 e Cx50 (VELDEN et al.,

2002; SÖHL; WILLECKE, 2004; SAFFITZ, 2006; JANSEN et al., 2010; LAMBIASE;

TINKER, 2014).

A propagação do estímulo em diferentes partes do coração é determinada

pela geometria do tecido, excitabilidade das células, e extensão de Cxs. Como

apresentado na Figura 4, o padrão de expressão das Cxs se modifica ao longo do

percurso em que o feixe de Hiss se ramifica em ramos direito e esquerdo e fibras de

Purkinje. A Cx40 é expressa ao longo desta via, ao passo que a expressão de

Cx30.2 e Cx45 diminui gradualmente. Já a Cx43 parece ser expressa nas fibras de

Purkinje. A partir das fibras de Purkinje, o estímulo é transferido para os miócitos do

músculo ventricular presumivelmente por meio de canais intercelulares homotípicos

de Cx43 (KREUZBERG; WILLECKE; BUKAUSKAS, 2006).

34

Figura 2 - Esquema do coração humano ilustrando a propagação do impulso e os padrões de expressão das conexinas de acordo com a região.

Fonte: (KREUZBERG; WILLECKE; BUKAUSKAS; 2006. Tradução: SANTOS, A. L. S., 2014) Legenda: Em detalhe, indica-se na figura as diferentes regiões do coração e suas respectivas

velocidades de condução (expressas em m/s) e as conexinas (Cx) expressas. SA node: Nó sinusal. Atria: Átrios. AV node: Nó átrio-ventricular. AV bundle: Feixe de His. Bundle branches: Ramos do feixe de Hiss. Purkinge fibers: Fibras de Purkinge. Working myocardium: Músculo ventricular.

A conexina 43 (Cx43) destaca-se como a principal isoforma presente no

miocárdio, e está diretamente envolvida no controle da homeostasia tecidual,

crescimento, proliferação celular, diferenciação e apoptose (JANSEN et al., 2010;

CARETTE et al., 2014; LAMBIASE; TINKER, 2014). A meia vida da Cx43 varia entre

duas a cinco horas e dessa forma a comunicação intercelular depende de muitos

fatores de controle sobre a dinâmica de síntese e degradação destas proteínas

(OLORIS, 2005).

Novas oportunidades para o estudo, investigação e compreensão destas

Cxs foram possíveis devido à utilização de camundongos transgênicos, ou seja,

animais knockout para determinada conexina (SEVERS et al., 2003).

35

O estudo de animais knockout para a Cx43 demonstrou que embora a

ausência da referida conexina fosse compatível com a vida, os animais vinham a

óbito após o nascimento (REAUME et al., 1995). Posteriormente, em 2001, Gutstein

et al. fizeram importantes descobertas ao observar a redução na velocidade de

condução ventricular bem como o desenvolvimento letal de arritmia ventricular aos

dois meses de idade, indicando que esta conexina é essencial para a função de

maturação do ventrículo. Camundongos knockout para a Cx45 resultaram em morte

embrionária ao décimo dia, demonstrando assim que a expressão dessa conexina é

vital para o desenvolvimento (TAMADDON et al., 2000). Já os animais knockout para

a Cx40, entretanto, são compatíveis com a vida, uma vez que a habilidade residual

do sistema Hiss-Purkinje em suportar a condução na ausência da Cx40 é atribuída à

presença da Cx45, cuja distribuição se dá do início ao fim do sistema (COOPEN et

al., 1999).

Embora não existam estudos em animais da espécie canina que

relacionam diretamente os efeitos da CEC na expressão da Cx43 no miocárdio,

outras publicações demonstram que a Cx43 presente no tecido muscular cardíaco

pode sofrer alterações significativas. Yeh et al. (2002) investigaram a expressão nas

conexinas de cardiomiócitos durante a instituição da CEC, ou seja, antes da

restauração da perfusão espontânea. Avaliando amostras do átrio direito de 21

pacientes humanos submetidos à CEC ele concluiu que a expressão das Cxs

diminuiu durante a circulação extracorpórea. Em estudo semelhante em 16

pacientes humanos submetidos à cirurgia cardíaca, avaliou-se a expressão das

Cx40 e Cx43 em amostras de átrio direito em dois momentos distintos, quais sejam

após o início e imediatamente após o término da CEC. Os resultados indicaram que

a CEC apresenta uma significativa influência sobre a expressão da Cx43

(PAVLOVIC et al., 2006).

Outras publicações relacionado a expressão das Cxs nas doenças

cardíacas foram conduzidas. Biópsias de tecido correspondente à região ventricular

esquerda de pacientes portadores de cardiomiopatia dilatada indicaram uma

diminuição da expressão da Cx43 associada a uma grade perda da Cx na região de

disco intercalado. Na presença de cardiomiopatia hipertrófica pode ocorrer aumento

ou redução na expressão da Cx43 (FONTES et al., 2012).

Mais especificamente na espécie canina, em pacientes portadores de

cardiomiopatia dilatada verificou-se diminuição da expressão da Cx43 e com relação

36

à distribuição da Cx houve lateralização (AKAR et al., 2004; AKAR et al., 2007).

Outros pesquisadores avaliaram a cardiomiopatia isquêmica em cães e também

identificaram diminuição da expressão da Cx43 (LUKE; SAFFITZ, 1991; HUANG;

SANDUSKY; ZIPES, 1999). Em estudo semelhante, determinou-se que após uma

hora de isquemia, a expressão da Cx43 encontra-se reduzida nas áreas

correspondentes ao disco intercalar (HUANG; SANDUSKY; ZIPES, 1999).

Em publicação recente foi postulado que as Cxs são capazes de controlar

a apoptose celular por meio de três diferentes processos. Primeiro, mediando a

transferência de sinais apoptóticos entre os canais intercelulares de células

adjacentes. A segunda função é mediada pela membrana plasmática e/ou

hemicanais mitocondriais. Já o terceiro processo, mais recentemente caracterizado,

diz respeito a própria Cx. As conexinas são capazes de controlar a via apoptótica

direta e principalmente quanto associada à localização nuclear de uma proteína

aberrante, ou por meio de interações com fatores de regulação da apoptose

(CARETTE et al., 2014). Outro importante avanço no estudo das Cxs foi a

comprovação de que a introdução de Cx43, em mioblastos humanos, utilizando um

vetor não-viral altamente seguro teve um efeito positivo sobre a função do coração

pós-infarto (KOLANOWSKI et al., 2014). Outra pesquisa recente discorre sobre o

efeito epigenético na disfunção e regeneração cardíaca (CHATURVEDI; TYAGI,

2014).

Em face da importância ímpar atribuída à comunicação intercelular na

modulação dos processos patológicos e uma vez que inexistem estudos na literatura

perquirida especificando o efeito da circulação extracorpórea na expressão da Cx43

no miocárdio de cães, aventou-se a hipótese do estudo da referida proteína como

escopo desta tese. O conhecimento mais amplo em relação às funções destas

proteínas durante a instituição da CEC poderá auxiliar na elucidação das alterações

no ritmo cardíaco observadas após a aplicação da mesma.

37

3 OBJETIVO GERAL

O presente trabalho teve como objetivo verificar a possibilidade da

execução da técnica de circulação extracorpórea em cães no modo aorto-bicaval,

por um período de 60 minutos seguida de 30 minutos de restauração da perfusão

espontânea, realizar análise histopatológica dos fragmentos de tecido muscular

cardíaco, avaliar a localização, a expressão da conexina 43 e a expressão de Gja1

(gene da Cx43) no miocárdio dos animais submetidos à referida técnica cirúrgica.

3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Verificar a viabilidade da instalação do circuito de circulação extracorpórea no

modo aorto-bicaval, por um período de 60 minutos seguida de restauração da

perfusão espontânea durante 30 minutos

Realizar avaliação histopatológica dos fragmentos do tecido muscular

cardíaco

Localizar e marcar a conexina 43 por imunofluorescência no miocárdio

Quantificar a expressão da conexina 43 pela técnica de western blot

Quantificar a expressão de Gja1 (gene da conexina 43) pela técnica de RT-

PCR em tempo real

38

4 MATERIAL E MÉTODO

Foram utilizados 15 cães, adultos, machos e fêmeas, com idades entre 1

e 3 anos, pesando entre 10 e 15 quilogramas. Os procedimentos cirúrgicos foram

realizados junto ao centro cirúrgico do Laboratório de Cirurgia Cardiotorácica do

Departamento de Cirurgia (VCI) da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia

da Universidade de São Paulo (FMVZ-USP). Os animais foram submetidos a

exames físico, hematológico e bioquímico previamente à realização do presente

estudo, previamente aprovado pela CEUA da FMVZ-USP sob nº 1814/2009.

4.1 PRODECIMENTO ANESTÉSICO

Após a avaliação pré-anestésica, os animais foram pré-medicados com

cloridrato de tramadol na dose de 2 mg/Kg por via intramuscular. Decorridos 20

minutos, durante a preparação do cão na sala de pré-operatório, foram puncionadas

as duas veias cefálicas utilizando-se cateter 20G para permitir a administração de

fluidoterapia e fármacos no período perioperatório.

A indução anestésica foi efetuada por meio da administração de cetamina

associada ao midazolam nas doses de 5 mg/Kg e 0,5 mg/Kg, respectivamente, pela

via intravenosa e, então, procedeu-se a intubação orotraqueal dos animais com

sonda de diâmetro apropriado à traqueia.

A manutenção anestésica foi realizada pelo fornecimento de sevofluorano na

concentração aproximada de 2,1V% conferida por meio de analisador de gases a fim

de manter os animais entre o 2º e 3o plano de anestesia do 3º estagio de Guedel

para a realização do procedimento cirúrgico e instalação da circulação

extracorpórea. Foi estabelecida a ventilação controlada no modo pressão controlada

com pressão e frequência respiratória requeridas para manutenção da EtCO2 entre

35 e 45 mmHg.

A analgesia complementar foi realizada no período transoperatório, antes do

início do procedimento cirúrgico, com administração de bolus seguido de infusão

39

contínua de citrato de fentanil, na dose de 0,3 mcg/Kg/min utilizando-se bomba de

infusão para seringas. A paralisia muscular foi obtida com a administração de

brometo de pancurônio na dose de 0,06 mg/Kg por via intravenosa. A reversão do

bloqueio neuromuscular, ao final do procedimento, ocorreu com a administração de

neostigmine na dose de 0,05 mg/kg, por via intravenosa associado a sulfato de

atropina na dose de 0,05 mg/kg.

Na artéria femoral direita foi introduzido cateter intravenoso 22G por meio de

punção direta permitindo a coleta de sangue para mensuração de parâmetros de

hemogasometria e mensuração da pressão arterial por meio de monitor

multiparamétrico.

Uma vez que os animais se encontravam em plano de anestesia, realizou-se

a introdução através da veia jugular direita de um cateter de artéria pulmonar 7,5F

acoplado ao monitor de débito cardíaco. Para isso, os animais foram posicionados

em decúbito dorsal e procedeu-se a introdução do mesmo. O cateter foi preenchido

com solução salina previamente heparinizada, sendo o transdutor de pressão

posicionado ao nível da linha axilar média e zerado à pressão atmosférica. Após

observação da curva característica de átrio direito, procedeu-se a insuflação do

balão com 1,5 mL de ar, continuando a introdução do cateter no ventrículo direito e

artéria pulmonar. O cateter foi fixado quando observou-se o “achatamento da curva”

e, portanto a pressão de oclusão da artéria pulmonar foi considerada.

No decorrer da intervenção operatória foi realizada infusão de fluido do

tipo Ringer com lactato na dose de 5 mL/kg/hora e, no desmame da circulação

extracorpórea, de acordo com a necessidade, de dopamina na dose de 5 a 10

mcg/Kg/min quando a pressão arterial sistólica ou média apresentassem valor

inferior a 90 mmHg ou 60 mmHg, respectivamente. A dopamina era iniciada na dose

mais baixa com incrementos de 2,5 mcg/Kg/min a cada 10 minutos em animais sem

resposta.

Os parâmetros referentes à pressão arterial foram acompanhados por

meio de monitor computadorizado, bem como a temperatura, o número de

movimentos respiratórios e o padrão eletrocardiográfico. Também foram realizados

testes para se determinar os níveis séricos de eletrólitos (Na+, K+ e Ca2+ ionizado),

pH, bicarbonato e gases sanguíneos em aparelho de gasometria e tempo de

coagulação ativada.

40

4.2 PROCEDIMENTO CIRÚRGICO

Os animais foram distribuídos aleatoriamente em três grupos de cinco

cães, em cada um deles, a fim de coleta de materiais para análise antes e após a

CEC, com ou sem perfusão posterior a esta, conforme descrito ao final do capítulo.

No período correspondente a 24 horas antes do procedimento cirúrgico foi realizada

raspagem dos pelos da parede torácica, membros torácicos e face medial de

membros pélvicos. Antes da intervenção cirúrgica, os animais foram submetidos a

jejum hídrico e alimentar de seis e 12 horas, respectivamente.

Os animais foram posicionados em decúbito látero-lateral esquerdo e

após a indução anestésica e intubação orotraqueal procedeu-se à colocação da

placa do eletrocautério na região do gradil costal esquerdo. Após a antissepsia e

colocação dos campos, o acesso cirúrgico à cavidade torácica foi realizado por meio

de toracotomia intercostal direita convencional ao nível do 4º espaço intercostal

(sempre considerando o mínimo uso do eletrocautério e trauma tecidual) com a

dissecção dos planos musculares até a exposição da pleura. Após a incisão desta,

foi visibilizado o coração, procedendo-se, então, a abertura longitudinal do

pericárdio, ventralmente ao nervo frênico, e posterior confecção de berço pericárdico

com fio de algodão 2-0 (Figura 5).

Figura 3 - Imagem fotográfica do acesso cirúrgico ao nível do 4º espaço intercostal direito

Fonte: (SANTOS, A. L. S., 2013) Legenda: Acesso cirúrgico. 5A: em detalhe, região de pulmão direito (P) e região do coração (C).

5B: Ao se rebater o lobo caudal do pulmão direito (P), previamente à abertura longitudinal do pericárdio, foi possível a visualização da veia cava cranial (VCCr), nervo frênico (NFr) e do coração (C).

41

O circuito de CEC foi instalado no modo aorto-bicaval. A canulação

aórtica foi realizada com cânula arterial de tamanho 10 ou 12, com sutura em bolsa

de tabaco com fio polipropilene 4.0 ou 5.0, cânula esta que trouxe sangue oxigenado

da máquina de circulação extracorpórea de volta ao sistema arterial do animal. As

veias cava cranial e caudal foram canuladas com sutura em bolsa de polipropilene

4.0 ou 5.0, visando a prepará-las para receber cânula de drenagem de tamanho ¼

de polegada para a máquina de CEC (KWASNICKA, 2003) (Figura 6).

Figura 4 - Imagem fotográfica referente à sutura em bolsa de tabaco dom fio polipropilene 4.0 ou 5.0 realizada na artéria aorta e na veia cava cranial

Fonte: (SANTOS, A. L. S., 2013) Legenda: As setas amarelas indicam a delimitação da sutura em bolsa de polipropilene 4.0 ou 5.0

na artéria aorta (Ao) enquanto que as setas brancas indicam a delimitação da sutura em bolsa de polipropilene na veia cava cranial (VCCr). É possível visualizar parte do pulmão direito (P). Nota-se que embora nesta imagem não tenha sido identificada a veia cava caudal, a bolsa de polipropilene foi feita do mesmo modo como descrito para a VCCr.

Previamente à realização das canulações, tanto a cânula arterial quanto

as cânulas venosas foram referenciadas com fio algodão visando ao posicionamento

preciso nos vasos no momento da fixação, sendo para a artéria aorta nunca superior

a 10mm (Figuras 7 e 8).

O anticoagulante utilizado foi a heparina sódica na dose de 200UI/kg

(meia dose) com posterior determinação de dose adicional, sendo administrado

diretamente em uma das veias cefálicas já previamente com cateter, de forma a se

manter o tempo de coagulação ativado acima de 480 segundos (KWASNICKA,

2003).

42

Figura 5 - Imagens fotográficas referente à cânula arterial sendo referenciada com fio algodão

Fonte: (SANTOS, A. L. S., 2013) Legenda: Cânula arterial sendo referenciada: 7A: início do nó (ponto de referência) com fio

algodão. 7B: correto posicionamento do nó na ponteira da cânula. 7C: término do referenciamento. As setas indicam o local em que foi realizado o ponto de referência na cânula arterial.

Figura 6 - Imagens fotográficas referente à cânula venosa sendo referenciada com fio algodão

Fonte: (SANTOS, A. L. S., 2013) Legenda: Cânula venosa sendo referenciada: 8A: início do nó (ponto de referência) com fio

algodão e correto posicionamento na ponteira da cânula. 8B: término do referenciamento. As setas indicam o local em que foi realizado o ponto de referência na cânula venosa.

Após a heparinização do animal procedeu-se à introdução e fixação da

cânula arterial na artéria aorta (Figuras 9 e 10).

43

Figura 7 - Imagem fotográfica referente à canulação arterial imediatamente antes da incisão da artéria aorta com bisturi para posterior introdução da cânula arterial

Fonte: (SANTOS, A. L. S., 2013) Legenda: As setas indicam a delimitação da sutura em bolsa de polipropilene na artéria aorta (Ao),

local em que foi realizada a incisão (perpendicular ao vaso), seguida da introdução da cânula arterial até o ponto em que a mesma foi referenciada com fio algodão.

Figura 8 - Imagem fotográfica referente à canulação arterial seguida de fixação

Fonte: (SANTOS, A. L. S., 2013) Legenda: As setas amarelas indicam o local em que foi realizada a incisão com bisturi e posterior

introdução da cânula arterial (ca) na artéria aorta (Ao). 10A: imediatamente após a introdução da cânula no vaso (até o ponto de referenciamento). 10B: início da fixação da cânula. 10C: término da fixação da cânula com fio de polipropilene 4.0 ou 5.0 (seta azul). Nota-se no corpo e extremidade distal da cânula a presença de sangue e ar uma vez que o tubo (linha arterial) ainda não havia sido conectado à cânula. Posteriormente o ar foi retirado para se evitar a entrada do mesmo no leito vascular do animal.

44

Após a canulação da artéria aorta o cirurgião conectou a linha arterial à

cânula arterial, manobra esta realizada em conjunto com o perfusionista, de modo a

impedir a entrada de ar no leito vascular. Neste momento, o perfusionista manteve

pressão positiva na linha arterial (KWASNICKA, 2003).

Conforme mencionado anteriormente, uma vez que o circuito de CEC foi

instalado no modo aorto-bicaval, para a canulação das veias cavas cranial e caudal

foram utilizadas duas cânulas venosas. Após a canulação das cavas, o cirurgião

cortou o tubo da linha das cavas no comprimento necessário para ficar o mais justo

possível e procedeu à conexão da linha venosa às cânulas (KWASNICKA, 2003).

A figura 11 indica o início da canulação venosa (introdução e fixação da

cânula venosa na veia cava cranial) enquanto que a figura 12 apresenta a artéria

aorta e as veias cavas cranial e caudal canuladas. Neste momento as cânulas já

estavam conectas às suas respectivas linhas e o sistema já estava pronto para a

entrada em CEC.

Figura 9 - Imagem fotográfica referente à canulação da veia cava cranial imediatamente após a introdução da cânula venosa e antes da fixação da cânula com fio de polipropilene 4.0 ou 5.0. Em ca de cânula arterial proveniente da artéria aorta

Fonte: (SANTOS, A. L. S., 2013) Legenda: As setas brancas indicam a delimitação da sutura em bolsa de polipropilene 4.0 ou 5.0

na veia cava cranial (VCCr), local em que foi realizada a incisão com bisturi, seguida da introdução da cânula venosa (cv) até o ponto em que a mesma foi referenciada com fio algodão (seta azul). É possível ver na imagem a cânula arterial (ca) já canulada e fixada.

45

Figura 10 - Imagem fotográfica referente à canulação da artéria aorta e das veias cavas cranial e caudal e fixação com fio de polipropilene 4.0 ou 5.0

Fonte: (SANTOS, A. L. S., 2013) Legenda: Em detalhe, artéria aorta (Ao), veia cava cranial (VCCr), veia cava caudal (VCCd),

coração (C). Tanto a cânula arterial (ca) quanto as cânulas venosas (cv) foram fixadas com fio de polipropilene 4.0 ou 5.0. Os lobos pulmonares foram afastados cuidadosamente com o auxílio de gaze para a realização da imagem fotográfica.

A CEC foi realizada por meio de um aparelho do tipo roller pump com

oxigenador de membranas2 (Figura 13).

Figura 11 - Imagem fotográfica referente à máquina de CEC Modelo ECO 01 - Braile Biomédica

Fonte: (SANTOS, A. L. S., 2013) Legenda: Em detalhe, montagem e preparo da máquina de CEC.

2 Modelo ECO 01 - Braile Biomédica

®

46

O circuito da máquina de CEC foi preenchido com fluido do tipo ringer

com lactato. O fluxo inicial da bomba foi de 150 a 180mL/kg/minuto, ajustado, a

seguir, de modo a manter a pressão arterial média acima de 60mmHg, com os

animais mantidos, sempre que possível, em normotermia (38ºC) (KWASNICKA,

2003).

Objetivando a proteção miocárdica, realizou-se o clampeamento aórtico e

a solução cardioplégica cristalóide resfriada foi administrada por via anterógrada,

mediante a introdução de um cateter na raiz da aorta, para a infusão da solução. A

dose de indução foi de 20 mL/kg e posteriormente a cardioplegia foi repetida em

intervalos de 20 minutos, na dose de manutenção de 10 mL/kg.

Após 60 minutos de duração do procedimento de CEC, esta foi

interrompida. O volume residual existente no reservatório venoso da bomba de

circulação extracorpórea foi reinfundido no animal conforme se observava

hipotensão por baixa volemia. Após 30 minutos do desmame da circulação

extracorpórea, de acordo com princípios éticos e de bem estar animal a anestesia foi

aprofundada e imediatamente foi administrado cloreto de potássio intravenoso para

a eutanásia dos animais, não retornando os mesmos ao estado de consciência.

Após biópsia do tecido muscular cardíaco, o fragmento coletado foi

devidamente identificado de acordo com a região do coração (atrial, ventricular ou

septo) e o respectivo animal e grupo. Parte dos fragmentos coletados foi colocada

em solução de fixação em formalina a 10%, por 24 horas. Em seguida, os

fragmentos foram incluídos em parafina para a realização de análise histopatológica

e de imunofluorescência.

Para realização da análise por western blot e RT-PCR em tempo real, a

outra parte dos fragmentos coletados foi inserida no interior de tubos de

microcentrifuga de 1,5mL (devidamente identificados) e em seguida imediatamente

imersa em nitrogênio líquido para posterior acondicionamento em freezer a -80ºC.

Tal procedimento de coleta é fundamental para a manutenção tanto das proteínas

quanto do RNA presentes no tecido.

47

4.3 MOMENTOS DA AVALIAÇÃO DOS PARÂMETROS

As avaliações propostas foram feitas em três diferentes momentos:

Momento 0 (T0): no início da circulação extracorpórea, definido como

controle - GRUPO C

Momento 1 (T1): após 60 minutos de duração do procedimento de

circulação extracorpórea - GRUPO CEC-1

Momento 2 (T2): após 60 minutos de duração do procedimento de

circulação extracorpórea seguidos de 30 minutos de

restauração da perfusão espontânea - GRUPO CEC-2

4.4 AVALIAÇÃO DOS PARÂMETROS

As técnicas de biologia molecular (imunofluorescência, western blot e RT-

PCR em tempo real) utilizadas para o estudo da imuno-localização, quantificação e

expressão da Cx43 no miocárdio foram desenvolvidas junto ao Laboratório de

Oncologia Experimental do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina

Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, sob responsabilidade da

Profª Drª Maria Lúcia Zaidan Dagli.

48

4.4.1 Histopatologia do tecido muscular cardíaco

Os fragmentos de tecido muscular cardíaco foram coletados nos

momentos da avaliação dos parâmetros indicados anteriormente no ítem 4.3, sendo

então colocados em recipientes individualizados contendo solução de fixação em

formalina a 10%, por 24 horas (todos os recipientes foram identificados de acordo

com a respectiva região a ser analisada).

Em seguida, procedeu-se ao processamento de inclusão em parafina, e

após o corte, confecção de lâminas histológicas e coloração de Hematoxilina e

Eosina (H&E).

As lâminas foram observadas ao microscópio óptico3 e analisadas por

médico veterinário experiente em patologia animal. Com o objetivo de se evitar viés

nesta avaliação histopatológica, um único profissional analisou individualmente

todas as lâminas, anotando a presença ou ausência de alterações e/ou lesões. O

referido profissional não foi informado sobre o grupo ao qual o animal pertencia,

tendo conhecimento apenas da identificação do animal e a região a qual

correspondia o fragmento do tecido muscular cardíaco utilizado para a confecção da

lâmina histológica (átrios direito ou esquerdo, ventrículos direito ou esquerdo e

septo).

Para documentação da análise histopatológica, procedeu-se à realização

de fotomicrografias.

As lesões nos vasos sanguíneos foram classificadas segundo a sua

importância em:

- discreta 01 a 30% da extensão total do corte transversal apresentava lesões

- moderada 30 a 70% da extensão total do corte transversal apresentava lesões

- intensa 70 a 100 % da extensão total do corte transversal apresentava

lesões

3 Nikon E-800

49

4.4.2 Imunofluorescência para a conexina 43

Os fragmentos de tecido muscular cardíaco foram coletados nos

momentos da avaliação dos parâmetros indicados anteriormente no ítem 4.3, sendo

então colocados em recipientes individualizados contendo solução de fixação em

formalina a 10%, por 24 horas (todos os recipientes foram identificados de acordo

com a respectiva região a ser analisada). Seguiu-se então com o processamento de

inclusão em parafina, e após o corte, confecção de lâminas silanizadas.

Inicialmente as seções foram desparafinizadas em xilol e hidratadas em

diferentes concentrações de etanol, quais sejam absoluto, 95% e 70% e em seguida

água destilada.

O desmascaramento antigênico foi realizado em tampão Tris-EDTA (pH

9,0) durante 20 minutos em forno de microondas na potência máxima, observando-

se a cada cinco minutos a eventual diminuição da solução por evaporação e, neste

caso, completando-se para o volume inicial. Após o completo resfriamento em

temperatura ambiente, as lâminas foram lavadas em solução de PBS 1X (acrescido

de 500 µl de tween 20) durante cinco minutos, por três vezes.

O bloqueio de reações inespecíficas foi realizado em solução de skin milk

5% durante uma hora. Em seguida, procedeu-se à incubação das lâminas com o

anticorpo primário.

Para a marcação da Cx43 foi utilizado o anticorpo primário4 Rabbit anti-

Connexin 43 diluído em PBS (concentração 1:500), sendo as lâminas incubadas em

câmara úmida, durante uma noite, a 4ºC (100 a 200 µl por lâmina).

Pela manhã, as lâminas foram lavadas em PBS 1X (acrescido de 500 µl

de tween 20) durante cinco minutos, por três vezes e em seguida incubadas com

anticorpo secundário5 policlonal Swine anti-Rabbit diluído em PBS (concentração

1:200), durante uma hora.

Após lavagem das lâminas em solução de PBS 1X (acrescido de 500 µl

de tween 20) durante cinco minutos, por três vezes, seguiu-se à incubação com

iodeto de propídeo diluído em PBS (concentração 1:1000) durante dez minutos em

4 Sigma

®

5 Dako

®

50

câmara escura, para marcação nuclear (100 a 200 µl por lâmina). Em seguida,

realizou-se novamente a lavagem das lâminas em solução de PBS 1X (acrescido de

500 µl de tween 20) durante cinco minutos, por três vezes.

As lâminas foram montadas com 10 µl por lâmina de Vectashield6 e

lamínula. Para se evitar o esgotamento da fluorescência, as lâminas foram vedadas

com esmalte e armazenadas no escuro e na geladeira.

Por fim, as lâminas foram analisadas e fotografadas em microscópio7

equipado com sistema de fluorescência e fotomicrografia.

4.4.3 Western blot para a conexina 43

A técnica de western blot consiste em um método para a detecção da

proteína de interesse baseado em extração, eletroforese, transferência e

identificação por meio de anticorpos específicos e sistema de revelação.

Inicialmente foi realizado a extração de proteínas. Os fragmentos de

tecido muscular cardíaco correspondentes às amostras dos animais, previamente

armazenados em freezer à -80C, foram separados em tubos de vidro estéreis e

autoclavados, devidamente identificados de acordo com o animal e a região do

coração correspondente à amostra de tecido. Adicionou-se 400 µL da solução 2x

Sample Buffer e inibidor de protease em cada tubo. Em seguida os tubos foram

colocados no gelo.

Colocou-se uma amostra de 50 mg de tecido muscular cardíaco em cada

tubo correspondente, não ultrapassando este peso. O tecido foi triturado com

sonicador8 na pulsação máxima, evitando que ocorresse aquecimento. Em seguida,

adicionou-se 400 µL de 1x working solution em cada amostra triturada, submetendo-

as novamente ao sonicador. Com o objetivo de se evitar contaminações, foram

utilizadas sondas individuais para cada amostra.

6 Vector Laboratories

7 Nikon E-800

8 TissueRuptor - Qiagen

®

51

Após a sonicação, os conteúdos referentes às amostras trituradas foram

transferidos para tubos9 de microcentrifuga de 1,5 mL devidamente identificados e

mantidos no gelo. As amostras foram centrifugadas durante 15 minutos, a 13.000

rpm e 4ºC. Por fim, os sobrenadantes foram transferidos para outros tubos de

microcentrifuga de 1,5 mL, devidamente identificados, e armazenados no freezer à

-80ºC.

Para a quantificação de proteínas, as amostras foram previamente

descongeladas sobre o gelo. Em seguida, procedeu-se a padronização da curva de

albumina, utilizando um tubo de microcentrifuga com 100 µl de albumina

previamente diluída acrescido de 900 µl de água destilada em tudo de

microcentrifuga de 1,5 ml, sendo mantido no gelo. As proteínas foram diluídas em

tubos de microcentrifuga de 0,2 mL, sendo 5 µl de cada amostra acrescidos de 95 µl

de água destilada (1:20) e mantidas no gelo. Foi realizada também a diluição de

1mL de Bradford em 4 ml de água destilada (1:5), sendo mantido no gelo.

Em seguida, colocou-se 990 µl de Bradford diluído (1:5) em todos os

tubos de vidro e acrescentou-se 10 µl de amostra de proteína diluída (1:20). As

amostras foram homogeneizadas cuidadosamente, evitando-se a formação de

bolhas.

A leitura (quantificação) foi realizada no espectrofotômetro10 a 595 nm,

utilizando-se uma cubeta de quartzo. A primeira etapa constituiu na realização da

curva de padronização com a albumina. Após higienização da cubeta com álcool,

procedeu-se à quantificação das amostras, anotando-se o valor da absorbância,

respectivamente para cada amostra. Por fim, determinaram-se os valores da diluição

de cada amostra, em µg/µl.

Antes de se proceder à corrida, as proteínas foram inicialmente diluídas

utilizando-se loading buffer (azul de bromofenol) e working solution. Posteriormente,

foram submetidas à desnaturação proteica, durante 10 minutos à 95ºC, no

termociclador11.

9 Eppendorf

®

10 BioPhotometer - Eppendorf

®

11 Mastercycler gradient - Eppendorf

®

52

Após a desnaturação, as proteínas submetidas à eletroforese num gel de

poliacrilamida (4 x 12% Bis Tris Plus)12 em recipiente de corrida13, contendo tampão

de corrida, num campo elétrico de 165 V, durante uma hora (Figura 14).

Figura 12 - Imagem fotográfica referente à eletroforese em gel das proteínas

Fonte: (SANTOS, A. L. S., 2013) Legenda: A imagem refere-se à eletroforese num gel em recipiente de corrida Bolt Mini Gel Tank -

Life Technologies®, contendo tampão de corrida. As setas indicam a posição do

marcador de peso molecular em ambos os géis.

O marcador de peso molecular (MPM) utilizado foi o Plus2 Prestained

Standard14 (1X). O referido gel possuía 15 poços, sendo que o primeiro foi utilizado

para o MPM e os demais para as amostras referente aos grupos Controle, CEC-1 e

CEC-2.

O mesmo padrão foi mantido para todas as eletroforeses que foram

realizadas (Figura 15).

12

Bolt®

13 Bolt Mini Gel Tank - Life Technologies

®

14 See Blue

®

53

Figura 13 - Esquema indicando a colocação das amostras nos poços do gel Bolt®

Fonte: (SANTOS, A. L. S., 2014) Legenda: No primeiro poço à esquerda foi colocado o marcador de peso molecular (MPM). Em

seguida, amostras dos respectivos grupos (Controle, CEC-1 e CEC-2)

Enquanto ocorria a eletroforese em gel foi preparada a transferência das

proteínas para membrana adsorvente, a qual foi realizada em aparelho específico15.

Para tanto, preparou-se duas cubas com água deionizada (MiliQ), uma cuba com

TTBS 1 e uma cuba com corante Comassie Blue.

Finalizada a eletroforese, o sistema foi desmontado e os géis foram

colocados em uma das cubas contendo água deionizada. A membrana16 foi

encaixada no interior da superfície de transferência e em seguida colocou-se os géis

sobre a membrana cuidadosamente para se evitar a formação de bolhas.

Posteriormente, o papel filtro17 foi umedecido na outra cuba contendo água

deionizada e após remoção do excesso de água, o mesmo foi colocado sobre os

géis. Por fim colocou-se a outra membrana18. Finalizada a montagem, o aparelho foi

ligado em corrente elétrica por um período correspondente a sete minutos.

Após a transferência o sistema foi desmontado, os géis foram colocados

na cuba contendo Comassie Blue e as membranas mergulhadas na cuba contendo

TTBS.

Em seguida, o bloqueio de reações inespecíficas nas membranas foi

realizado com solução de skin milk 5%, diluído em TTBS, durante uma hora em

temperatura ambiente e sob leve agitação. Os géis foram corados em solução de

15

iBlot DryBlotting Sustem - Invitrogen®

16 iBlot Anode Stack

17 iBlot Filter Paper

18 iBlot Cathode Stack

54

Comassie Blue durante 10 minutos sob agitação suave e constante e em seguida

descorados em solução de Destain solution por 50 minutos. Após a remoção desta

solução, os géis foram deixados em uma cuba com água destilada durante uma

noite.

Para a marcação da Cx43 foi utilizado anticorpo primário19 Rabbit anti-

Connexin 43 diluído em solução de TTBS contendo 5% de skin milk, na proporção

de 1:500. As membranas foram incubadas com o referido anticorpo durante uma

noite, a 4ºC, sob agitação suave, em recipiente vedado e refrigerado.

Pela manhã, após três lavagens seguidas com TTBS 1x as membranas

foram incubadas com anticorpo secundário20 Polyclonal Swine anti-Rabbit diluído em

PBS (concentração 1:1000), durante uma hora sob agitação suave e em

temperatura ambiente. As membranas foram submetidas a mais três lavagens

seguidas com TTBS 1x.

Para a revelação foi utilizado o Kit ECL de quimioluminescência21,

misturando na proporção (1:1) os dois reagentes de revelação em e colocando-o

sobre as membranas. Este procedimento foi realizado em câmera escura e com o

uso do programa ImageQuant.

Para normalização da técnica utilizou-se como controle endógeno a

proteína gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH). Após revelação da Cx43

as membranas foram submetidas novamente três lavagens seguidas com TTBS 1x e

em seguida, o bloqueio de reações inespecíficas nas membranas foi realizado com

solução de skin milk 5%, diluído em TTBS, durante uma hora em temperatura

ambiente e sob leve agitação.

Para a marcação do GAPDH foi utilizado anticorpo primário22 monoclonal

Mouse anti-GAPDH diluído em solução de TTBS contendo 5% de skin milk, na

proporção de 1:2000. As membranas foram incubadas com o referido anticorpo

durante uma noite, a 4ºC, sob agitação suave, em recipiente vedado e refrigerado.

Pela manhã, após três lavagens seguidas com TTBS 1x as membranas

foram incubadas com anticorpo secundário23 Polyclonal anti-Mouse diluído em PBS

(concentração 1:10.000), durante uma hora sob agitação suave e em temperatura

19

Sigma®

20 Dako

®

21 GE Healthcare

®

22 Abcam

®

23 Abcam

®

55

ambiente. Em seguida as membranas foram submetidas a mais três lavagens

seguidas com TTBS 1x.

Para a revelação também foi utilizado o Kit ECL de quimioluminescência24

conforme descrito anteriormente. Este procedimento foi realizado em câmera escura

e com o uso do programa ImageQuant.

Após a realização do western blot procedeu-se à análise densitométrica

das bandas referentes à proteína de interesse (Cx43) e das bandas correspondentes

ao GAPDH com o objetivo de se analisar a expressão relativa da Cx43. Para a

análise densitométrica utilizou-se o programa ImageJ.

As membranas secaram sobre uma folha de papel sulfite e em seguida

foram escaneadas, juntamente com os géis, para posterior documentação.

4.4.4 Determinação da expressão do mRNA correspondente ao Gja1 (gene da

conexina 43) utilizando a técnica de RT-PCR em tempo real

A expressão do mRNA foi determinada pelo método semi-quantitativo (LI;

WANG, 2000) e o RNA celular total foi isolado de amostras de miocárdio utilizando-

se o reagente Trizol.

As amostras foram retiradas do freezer -80ºC e mantidas em recipiente

contendo nitrogênio líquido para que o RNA não fosse degradado. Foi colocado 70

mg de tecido de miocárdio de cada amostra analisada em tubos de microcentrifuga

de 1,5 mL RNase free e adicionou-se 500 µl de trizol em cada tubo, triturando-se o

tecido com o sonicador25 na pulsação máxima, com o devido cuidado para evitar que

ocorresse aquecimento, e mantendo no gelo. Após a trituração foi adicionado 500 µl

de trizol até completar o volume de 1mL para cada tudo e em seguida promoveu

suave homogeneização.

As amostras foram incubadas durante cinco minutos em temperatura

ambiente. Em seguida, os tubos foram centrifugados durante cinco minutos, a

13.000 rpm a quatro graus Celsius. Enquanto ocorria a centrifugação foram

24

GE Healthcare®

25 TissueRuptor - Qiagen

®

56

identificados outros tubos de microcentrifuga de 1,5 mL RNase free e adicionou-se

100 µl de clorofórmio em cada tubo.

Terminada a centrifugação, o conteúdo dos tubos foi transferido para os

tubos contendo clorofórmio, procedeu-se à suave homogeneização e em seguida à

incubação durante dois minutos em temperatura ambiente. Centrifugou-se durante

15 minutos a 13.000 rpm a 4ºC. Em seguida, o sobrenadante foi transferido para

novos tubos de microcentrifuga de 1,5 mL RNase free, devidamente identificados,

contendo 500 µl de isopropanol gelado.

Após suave homogeneização, procedeu-se à incubação por 15 minutos

em temperatura ambiente, e em seguida à centrifugação durante 10 minutos a

13.000 rpm a 4ºC e posteriormente o sobrenadante foi desprezado. Adicionou-se

500 µl de etanol 70% tratado com DEPC gelado. Após homogeneização dos tudos,

centrifugou-se durante cinco minutos a 12.000 rpm a 4ºC. Após a centrifugação, o

sobrenadante foi desprezado. Repetiu-se o processo de adição de 500 µl de etanol

70% tratado com DEPC gelado, homogeneização e centrifugação, desprezando-se

novamente o sobrenadante. Procedeu-se então à secagem do pelet, que em

seguida foi ressuspendido em 50 µl de água ultra-pura. Cada tubo foi suavemente

homogeneizado e em seguida submetido ao banho maria, à temperatura entre 55ºC

e 65ºC, por um período de dez minutos. Em seguida as amostras foram mantidas

em freezer -80ºC.

O RNA de cada amostra foi quantificado no aparelho Nanodrop. O

TaqMan probe utilizado foi o TaqMan® Fast Advanced Master Mix26. O TaqMan

probe é marcado com um corante fluorescente reporter, FAM (6-

carboxifluoresceína), na posição 5’ final e um corante fluorescente quencher TAMRA

(6-carboxi-tetrametil-rodamina) na posição 3’ final. A especificidade do primer foi

testada sobre condições de PCR normal no próprio termociclador do TaqMan PCR

quantitativo.

As reações de transcrição reversa foram realizadas para cada amostra de

RNA em tubos de reação MicroAmp utilizando o reagente TaqMan de transcrição

reversa.

Cada tubo de reação contém 3 g de RNA total num volume de 40 l

contendo tampão TaqMan RT 1X, MgCl2 5,5 mM, 500 M de cada dNTP, 2,5 M de

26

Applied Biosystems

57

oligo-d(T)16 primers, inibidor de RNAse 0,4 U/l e 1,25 U/l de MultiScribe Reverse

Transcriptase. A reação de RT foi realizada à 25C por 10 minutos, 48C por 30

minutos e 95C por 5 minutos. A mistura de reação para a RT foi mantida à 4C para

uso imediato da amplificação do PCR, ou estocada à -20C para uso posterior.

O princípio da detecção do TaqMan em tempo real é baseado na análise

da liberação do composto fluorogênico através da ação 5’ nuclease (LIVAK et al.,

1995; GIBSON et al., 1996; HELD et al., 1996). Uma DNA polimerase termoestável,

a AmpliTaq Gold, é utilizada para a amplificação do PCR em tempo real numa placa

com 96 poços. Cada poço contém 4l de cada produto de PCR (300ng de RNA

total), Tampão A TaqMan 1X, MgCL2 5,5 mM, 200 M de dATP/dCTP/dGTP, 400 M

dUTP, 200 nM dos primers (senso e antisenso), 100 nM dos probes TaqMan,

0,01U/ml de AmpErase e 0,025 U/l da DNA polimerase AmpliTaq Gold em um

volume total de 50 l.

Cada poço foi fechado com tampas MicroAmp Optical27, seguido da

completa mistura dos reagentes. Neste estudo as condições de amplificação

utilizadas são: 2 minutos a 50C, 10 minutos a 95C e corridos em 40 ciclos por 15

segundos a 95ºC e 60C por 1 minuto. Todas as reações foram realizadas em um

Gene Amp 7000 Sequence Detection System28 para as amostras analisadas, as

quais foram corridas em duplicata, utilizando um programa de detecção Sequence

Detector V 1.6. O Rn e Ct são médias de valores obtidos em cada reação. A curva

padrão foi construída plotando os Ct vs. a concentração de cDNA. O número

absoluto de cópias dos mRNA das conexinas em cada amostra, foi calculado com

base nos seus valores de Ct. O número absoluto de cópias do mRNA das conexinas

foi normalizado ao do 18S para minimizar a variabilidade nos resultados devido a

diferenças na eficiência do RT e na integridade do RNA entre as amostras testadas.

Os resultados foram calculados de acordo com os cálculos de quantificação relativa

utilizando o 2-CT (LIVAK; SCHMITTGEN, 2001).

Para quantificação da expressão do gene da Cx43 utilizou-se o assay

cf02625164_g1 e para a normalização da reação utilizou-se o assay 18S

mm03928990_g1 como controle endógeno.

27

Applied Biosystems

28 Applied Biosystems

58

4.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os dados provenientes da análise pela técnica de western blot foram

analisados com o Software R versão 3.0.2 (The R Foundation for Statistical

Computing) com o teste estatístico de Kruskal-Wallis e pós-teste de Dunn para uma

significância de 5%.

Os dados provenientes da análise pela técnica de RT-PCR em tempo real

foram analisados com o programa MiniTab v.14 utilizando ANOVA. Diferenças

significativas foram consideradas a partir de p<0,05.

59

5 RESULTADOS

5.1 AVALIAÇÃO DA CANULAÇÃO DA AORTA E INSTALAÇÃO DO CIRCUITO DE

CEC NO MODO AORTO-BICAVAL

A canulação da aorta para instalação da linha arterial foi realizada sem

qualquer intercorrência relacionada à ruptura ou hemorragia durante a CEC.

Em relação à canulação venosa (veias cava cranial e caudal) também não

foi identificado qualquer intercorrência relacionada à ruptura ou hemorragia no local

de inserção da cânula.

Tanto a cânula arterial quanto as cânulas venosas utilizadas neste estudo

mostraram-se satisfatórias.

A documentação fotográfica foi apresentada anterioremente no ítem 4.2

PROCEDIMENTO CIRÚRGICO e descreve as etapas realizadas para a canulação,

tanto da aorta quanto das cavas cranial e caudal.

5.2 AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA DO TECIDO MUSCULAR CARDÍACO

Realizada a avaliação histopatológica do tecido muscular cardíaco, nos

animais pertencentes ao grupo Controle não foram observadas lesões nos vasos

analisados, tanto na região dos átrios, como em ventrículos ou no septo analisados.

Nos animais do Grupo CEC-1, tampouco constatou-se modificações. Contudo,

observou-se que apenas os animais do grupo CEC-2, vale dizer, aqueles

submetidos à circulação extracorpórea de 60 minutos seguida de restauração da

perfusão espontânea por 30 minutos, apresentaram lesões compatíveis com

vacuolização na túnica média de artérias de pequeno calibre do miocárdio, de grau

discreto, moderado ou intenso (Figuras 16 a 28).

60

Figura 14 - Fotomicrografia de corte histológico de tecido muscular cardíaco (átrio direito) de animal submetido a CEC por 60 minutos seguida de restauração da perfusão espontânea por 30 minutos

Fonte: (SANCHES, D. S., 2013) Figura 15 - Fotomicrografia de corte histológico de tecido muscular cardíaco (ventrículo direito) de

animal submetido a CEC por 60 minutos seguida de restauração da perfusão espontânea por 30 minutos

Fonte: (SANCHES, D. S., 2013)

61

Figura 16 - Fotomicrografia de corte histológico de tecido muscular cardíaco (átrio esquerdo) de animal submetido a CEC por 60 minutos seguida de restauração da perfusão espontânea por 30 minutos

Fonte: (SANCHES, D. S., 2013)

Figura 17 - Fotomicrografia de corte histológico de tecido muscular cardíaco (ventrículo esquerdo) de animal submetido a CEC por 60 minutos seguida de restauração da perfusão espontânea por 30 minutos

Fonte: (SANCHES, D. S., 2013)

62

Figura 18 - Fotomicrografia de corte histológico de tecido muscular cardíaco (septo) de animal submetido a CEC por 60 minutos seguida de restauração da perfusão espontânea por 30 minutos

Fonte: (SANCHES, D. S., 2013)

Figura 19 - Fotomicrografia de corte histológico de tecido muscular cardíaco de animal do grupo Controle

Fonte: (SANCHES, D. S., 2013) Legenda: A seta indica o vaso sanguíneo sem alterações e a letra L indica o lúmen do vaso.

L

63

Figura 20 - Fotomicrografia de corte histológico de tecido muscular cardíaco de animal do grupo controle

Fonte: (SANCHES, D. S., 2013) Legenda: A seta indica o vaso sanguíneo sem alterações e a letra L indica o lúmen do vaso. Figura 21 - Fotomicrografia de corte histológico de tecido muscular cardíaco de animal submetido a

CEC por 60 minutos seguida de restauração da perfusão espontânea por 30 minutos apresentando lesão (degeneração vacuolar) discreta

Fonte: (SANCHES, D. S., 2013) Legenda Considera-se discreto o aparecimento de vacúolos em 01 a 30% da extensão total do

corte histológico transversal do vaso.

L

L

64

Figura 22 - Fotomicrografia de corte histológico de tecido muscular cardíaco de animal submetido a CEC por 60 minutos seguida de restauração da perfusão espontânea por 30 minutos apresentando lesão (degeneração vacuolar) discreta

Fonte: (SANCHES, D. S., 2013) Legenda: Considera-se discreto o aparecimento de vacúolos em aproximadamente 01 a 30% da

extensão total do corte histológico transversal do vaso. Figura 23 - Fotomicrografia de corte histológico de tecido muscular cardíaco de animal submetido a

CEC por 60 minutos seguida de restauração da perfusão espontânea por 30 minutos apresentando lesão (degeneração vacuolar) moderada

Fonte: (SANCHES, D. S., 2013) Legenda: Considera-se moderado o aparecimento de vacúolos em aproximadamente 30 a 70% da

extensão total do corte histológico transversal do vaso.

65

Figura 24 - Fotomicrografia de corte histológico de tecido muscular cardíaco de animal submetido a CEC por 60 minutos seguida de restauração da perfusão espontânea por 30 minutos apresentando lesão (degeneração vacuolar) moderada

Fonte: (SANCHES, D. S., 2013) Legenda: Considera-se moderado o aparecimento de vacúolos em aproximadamente 30 a 70% da

extensão total do corte histológico transversal do vaso. Figura 25 - Fotomicrografia de corte histológico de tecido muscular cardíaco de animal submetido a

CEC por 60 minutos seguida de restauração da perfusão espontânea por 30 minutos apresentando lesão (degeneração vacuolar) intensa

Fonte: (SANCHES, D. S., 2013) Legenda: Considera-se intenso o aparecimento de vacúolos em aproximadamente 70 a 100% da

extensão total do corte histológico transversal do vaso.

66

Figura 26 - Fotomicrografia de corte histológico de tecido muscular cardíaco de animal submetido a CEC por 60 minutos seguida de restauração da perfusão espontânea por 30 minutos apresentando lesão (degeneração vacuolar) intensa

Fonte: (SANCHES, D. S., 2013) Legenda: Considera-se intenso o aparecimento de vacúolos em aproximadamente 70 a 100% da

extensão total do corte histológico transversal do vaso.

5.3 IMUNO-LOCALIZAÇÃO DA CONEXINA 43 (IMUNOFLUORESCÊNCIA)

Observou-se que no miocárdio dos animais de todos os grupos a

conexina 43 esteve presente na membrana citoplasmática, pois esta proteína é

responsável pela composição das junções intercelulares do tipo gap. A marcação

em verde corresponde à positividade para a Cx43 enquanto que os núcleos das

células apresentam-se puntiformes e marcados em vermelho pelo iodeto de

propídeo.

As fotomicrografias foram obtidas em microscópio equipado com sistema

de fluorescência29.

Mediante a análise das fotomicrografias da imunofluorescência, apesar da

29

Nikon E-800

67

marcação da Cx43 ter sido identificada em todos as regiões dos três grupos,

verificou-se aparentemente que:

no miocárdio dos animais do grupo CEC-1 houve uma marcação menos

intensa da Cx43 em relação aos animais dos grupos Controle e CEC-2,

principalmente nas regiões correspondentes aos átrios direito e esquerdo.

no miocárdio dos animais do grupo CEC-2 houve uma marcação mais intensa

em relação aos animais do grupo CEC-1, principalmente nas regiões

correspondentes aos ventrículos direito e esquerdo e septo.

a marcação da Cx43 nos animais do grupo CEC-2 nas regiões de ventrículos

direito e esquerdo foi semelhante quando comparada à marcação da Cx43

nas correspondentes regiões dos animais do grupo Controle

a marcação da Cx43 nos animais do grupo CEC-2 na região de septo foi

discretamente mais intensa quando comparada à marcação da Cx43

observada nas correspondentes regiões dos animais do grupo Controle

A seguir apresenta-se fotomicrografias referentes à imunofluorescência

da Cx43 no tecido muscular cardíaco (Figuras 29 a 39).

68

Figura 27 - Fotomicrografia referente à imunofluorescência de região de miocárdio (átrio direito) de animal do grupo Controle

Fonte: (SANTOS, A. L. S., 2014) Legenda: As marcações em verde representam a positividade para a conexina 43. Os núcleos

estão marcados pelo iodeto de propídeo. Imagem obtida em microscópio Nikon E-800, equipado com sistema de fluorescência. Objetiva 20X.

Figura 28 - Fotomicrografia referente à imunofluorescência de região de miocárdio (ventrículo direito) de animal do grupo Controle

Fonte: (SANTOS, A. L. S., 2014) Legenda: As marcações em verde representam a positividade para a conexina 43. Os núcleos

estão marcados pelo iodeto de propídeo. Imagem obtida em microscópio Nikon E-800, equipado com sistema de fluorescência. Objetiva 20X.

69

Figura 29 - Fotomicrografia referente à imunofluorescência de região de miocárdio (átrio esquerdo) de animal do grupo Controle

Fonte: (SANTOS, A. L. S., 2014) Legenda: As marcações em verde representam a positividade para a conexina 43. Os núcleos estão

marcados pelo iodeto de propídeo. Imagem obtida em microscópio Nikon E-800, equipado com sistema de fluorescência. Objetiva 20X.

Figura 30 - Fotomicrografia referente à imunofluorescência de região de miocárdio (ventrículo esquerdo) de animal do grupo Controle

Fonte: (SANTOS, A. L. S., 2014) Legenda: As marcações em verde representam a positividade para a conexina 43. Os núcleos estão

marcados pelo iodeto de propídeo. Imagem obtida em microscópio Nikon E-800, equipado com sistema de fluorescência. Objetiva 20X.

70

Figura 31 - Fotomicrografia referente à imunofluorescência de região de miocárdio (septo transverso) de animal do grupo Controle

Fonte: (SANTOS, A. L. S., 2014) Legenda: As marcações em verde representam a positividade para a conexina 43. Os núcleos

estão marcados pelo iodeto de propídeo. Imagem obtida em microscópio Nikon E-800, equipado com sistema de fluorescência. Objetiva 20X.

Figura 32 - Fotomicrografia referente à imunofluorescência de região de miocárdio (átrio direito) de animal do grupo CEC-1

Fonte: (SANTOS, A. L. S., 2014) Legenda: As marcações em verde representam a positividade para a conexina 43. Os núcleos

estão marcados pelo iodeto de propídeo. Imagem obtida em microscópio Nikon E-800, equipado com sistema de fluorescência. Objetiva 40X.

71

Figura 33 - Fotomicrografia referente à imunofluorescência de região de miocárdio (ventrículo direito) de animal do grupo CEC-1

Fonte: (SANTOS, A. L. S., 2014) Legenda: As marcações em verde representam a positividade para a conexina 43. Os núcleos

estão marcados pelo iodeto de propídeo. Imagem obtida em microscópio Nikon E-800, equipado com sistema de fluorescência. Objetiva 20X.

Figura 34 - Fotomicrografia referente à imunofluorescência de região de miocárdio (ventrículo direito) de animal do grupo CEC-2

Fonte: (SANTOS, A. L. S., 2014) Legenda: As marcações em verde representam a positividade para a conexina 43. Os núcleos

estão marcados pelo iodeto de propídeo. Imagem obtida em microscópio Nikon E-800, equipado com sistema de fluorescência. Objetiva 20X.

72

Figura 35 - Fotomicrografia referente à imunofluorescência de região de miocárdio (ventrículo esquerdo) de animal do grupo CEC-2

Fonte: (SANTOS, A. L. S., 2014) Legenda: As marcações em verde representam a positividade para a conexina 43. Os núcleos

estão marcados pelo iodeto de propídeo. Imagem obtida em microscópio Nikon E-800, equipado com sistema de fluorescência. Objetiva 20X.

Figura 36 - Fotomicrografia referente à imunofluorescência de região de miocárdio (septo transverso) de animal do grupo CEC-2

Fonte: (SANTOS, A. L. S., 2014) Legenda: As marcações em verde representam a positividade para a conexina 43. Os núcleos

estão marcados pelo iodeto de propídeo. Imagem obtida em microscópio Nikon E-800, equipado com sistema de fluorescência. Objetiva 20X.

73

Figura 37 - Fotomicrografia referente à imunofluorescência (controle negativo da reação) de região de miocárdio (ventrículo direito) de animal do grupo Controle

Fonte: (SANTOS, A. L. S., 2014) Legenda: Controle negativo da reação. Os núcleos estão marcados pelo iodeto de propídeo.

Imagem obtida em microscópio Nikon E-800, equipado com sistema de fluorescência. Objetiva 20X.

5.4 AVALIAÇÃO QUANTITATIVA DA CONEXINA 43 (WESTERN BLOT)

A Cx43 apresentou marcação em todas as regiões analisadas de todos os

grupos, quais sejam átrios direito e esquerdo, ventrículo direito e esquerdo e septo

interventricular. A marcação foi identificada de acordo com a altura correspondente

ao marcador de peso molecular utilizado nas reações.

A seguir apresenta-se a membrana identificando as bandas

correspondentes à região de septo transverso dos animais analisados, tanto para a

Cx43 quanto para o GAPDH (Figura 40).

74

Figura 38 - Esquema referente à membrana (região septo transverso) após revelação

Fonte: (SANTOS, A. L. S., 2014) Legenda: No primeiro poço à esquerda foi colocado o marcador de peso molecular (MPM). Em

seguida, amostras dos respectivos grupos (Controle, CEC-1 e CEC-2). Cx43: conexina 43. GAPDH: gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (controle endógeno).

Observou-se que houve diferença estatisticamente significante entre os

grupos no átrio esquerdo (p=0,0401) e no ventrículo direito (p=0,0459). O pós-teste

de Dunn identificou que os grupos que diferiam entre si, para ambas regiões, foram

os grupos Controles e os CEC-2 (átrio esquerdo, p= 0,0056; ventrículo direito. p=

0,0066).

Evidencia-se pelos boxplots (Figura 41) que há uma dispersão do valor

muito maior no grupo controle (diferença interquartis) do que no CEC-2, sendo que,

no átrio esquerdo os valores de CEC-2 foram muito maiores em relação ao Controle.

Já no ventrículo direito os valores de CEC-2 foram muito menores em relação ao

Controle.

75

Figura 39 - Boxplots referente à análise densitométrica da expressão da Cx43

Fonte: (SANTOS, A. L. S., 2014) Legenda: Boxplots referente à análise densitométrica da expressão da Cx43. Cada letra

corresponde às amostras de uma região do miocárdio para os diferentes grupos (Controle, CEC-1 e CEC-2). A: átrio direito, B: ventrículo direito, C: átrio esquerdo, D: ventrículo esquerdo, E: septo interventricular. Houve diferença significativa entre os grupos Controle e CEC-2 nas regiões correspondentes ao ventrículo direito e ao átrio esquerdo. NOTA: os círculos representam os outliers.

76

5.5 AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DO mRNA DA CONEXINA 43 (RT-PCR EM

TEMPO REAL)

Na análise de variância (ANOVA) os dados referentes à expressão do

mRNA correspondente ao Gja1 nas diferentes regiões do miocárdio, quais sejam

átrios direito e esquerdo, ventrículo direito e esquerdo e septo interventricular não

apresentaram diferença significativa.

A distribuição entre os grupos pode ser observada nas figuras 41 a 45.

Figura 40 - Boxplot referente à análise da expressão do gene Gja1 (Cx43) no átrio direito

Fonte: (SANTOS, A. L. S., 2014)

77

Figura 41 - Boxplot referente à análise da expressão do gene Gja1 (Cx43) no ventrículo direito

Fonte: (SANTOS, A. L. S. 2014)

Figura 42 - Boxplot referente à análise da expressão do gene Gja1 (Cx43) no átrio esquerdo

Fonte: (SANTOS, A. L. S., 2014)

78

Figura 43 - Boxplot referente à análise da expressão do gene Gja1 (Cx43) no ventrículo esquerdo

Fonte: (SANTOS, A. L. S., 2014)

Figura 44 - Boxplot referente à análise da expressão do gene Gja1 (Cx43) no septo interventricular

Fonte: (SANTOS, A. L. S., 2014)

79

6 DISCUSSÃO

Há pouco mais de seis décadas tinha início a história da cirurgia cardíaca.

Nos dias atuais, em meio à toda tecnologia presente em um mundo globalizado,

torna-se tarefa difícil imaginar que complexas técnicas cirúrgicas puderam ser

viabilizadas em espaço de tempo relativamente curto. A ousadia aceitável e

justificada em bases científicas de célebres pesquisadores visava ao

desenvolvimento de procedimentos para a cura de pacientes acometidos por

doenças cardíacas congênitas e adquiridas. Tendo em vista esta finalidade

precípua, consideramos o desenvolvimento da CEC, possibilitando as cirurgias a

céu aberto, um dos maiores avanços do século XX na área da medicina, opinião

também compartilhada por outros autores (BRAILE; GODOY, 2012; PUNJABI,

TAYLO, 2013; HESSEL, 2014).

A história da CEC originou-se na realização da pesquisa científica básica.

Foram os estudos relacionados à anatomia do sistema cardiovascular, à fisiologia

cardíaca e respiratória e à perfusão artificial que proporcionaram as bases para a

construção de um sistema de oxigenação sanguínea extracorpórea (SOUZA; ELIAS,

2006; BRAILE; GODOY, 2012; HESSEL, 2014). Neste contexto, julgamos

necessário e prudente que os projetos de pesquisa estejam fundamentados na

ciência básica, para que possam trazer contribuições relevantes à comunidade

científica e gerar aplicabilidade clínico-cirúrgica. Segundo Hessel (2014)

historicamente a CEC somente foi possível após a descoberta da heparina e da

protamina.

Anteriormente à CEC, embora alguns pesquisadores tenham concentrado

seus esforços no desenvolvimento e aperfeiçoamento da técnica de circulação

cruzada e sua aplicabilidade em cirurgias cardíacas, o uso da referida técnica em

humanos foi descontinuada pelas complicações inerentes às reações imunológicas e

também, muito provavelmente, pelo fato do procedimento ter uma potencial taxa de

mortalidade de 200% (tanto o doador quanto o paciente corriam risco de morte)

(HUNT et al., 1993; SOUZA; ELIAS, 2006). Neste contexto, concordamos com a

descontinuidade da referida técnica pelas intercorrências e principalmente pela alta

mortalidade associada a esta prática.

80

Apesar de estudo ter atestado a viabilidade da circulação cruzada para

cães (HUNT et al., 1995), em veterinária tal técnica não é aplicada rotineiramente,

pois além da possibilidade de reações imunológicas, a literatura recomenda a

instituição da CEC em detrimento da circulação cruzada.

Embora as pesquisas iniciais relacionadas à CEC e às técnicas de

cirurgias cardíacas tenham sido desenvolvidas em animais antes de sua aplicação

em medicina, a CEC na medicina veterinária ainda é utilizada de maneira

inconsistente. Verifica-se que a máquina e o todo o circuito empregado na instituição

da CEC são os mesmos utilizados na espécie humana (HOLMBERG, 1998; PELOSI

et al., 2013).

Embora tenhamos observado avanços na área da veterinária nos últimos

anos, no que concerne ao monitoramento intensivo, procedimentos anestésicos,

novas técnicas cirúrgicas, métodos de diagnósticos, exames laboratoriais e ao

desenvolvimento das especialidades, não verificamos o desenvolvimento de

equipamentos e materiais descartáveis específicos para o paciente canino e felino,

levando em consideração as particularidades destas espécies, não havendo material

espécie específico, corroborando com Kwasnika (2003), que afirmou em seu estudo

que as informações sobre a CEC são genéricas e esparsas.

A cirurgia cardiovascular em pequenos animais tem sido realizada

principalmente, em hospitais veterinários de universidades. Concordamos com

Kwasnicka (2003); Hunt (2005) e Pelosi et al. (2013) quando afirmam que tanto os

altos custos envolvidos quanto a necessidade de uma equipe altamente treinada

ainda constituem limitações ao emprego da CEC. Neste contexto, é fundamental que

a equipe tenha além do conhecimento da anatomia e fisiologia do sistema

cardiovascular, familiarização com a técnica de CEC e, é evidente, capacitação

cirúrgica.

De acordo com a casuística das doenças cardíacas congênitas

observadas por Macdonald (2006) entendemos ser fundamental a realização de

estudos direcionados ao aperfeiçoamento da máquina de CEC (partes motora e

oxigenadora), visando maior aplicabilidade da referida técnica na rotina clínica, indo

ao encontro do que fora relatado em outros estudos (GOMES, 1985; SANT’ANA;

LUCCHESE, 1994). Verificamos que a variedade no tamanho dos animais

domésticos pode dificultar a padronização das técnicas de canulação, dos

oxigenadores, volumes do perfusato e das soluções utilizadas, à semelhança do que

81

também foi observado por Kwasnicka (2003); Freitas (2004); Hunt (2005) e Pelosi et

al. (2013). Entretanto, não identificamos dificuldade na realização da canulação,

quer seja arterial ou venosa, ainda que o porte deste fosse bastante semelhante.

Além do treinamento, a composição da equipe é decisiva para o sucesso

das cirurgias cardíacas, de modo que concordamos com a afirmação de Griffiths

(2010) de que a equipe deve ser composta por cirurgião principal, cirurgião

assistente, instrumentador, enfermeiro, anestesista, perfusionista e membros da

unidade de terapia intensiva. No estudo em tela, observando-se o preceito,

utilizamos a mesma equipe cirúrgica, perfusionista e anestesista em todos os

procedimentos aplicados nos animais.

Pudemos verificar que, os cuidados observados no emprego do preparo

dos animais e dos procedimentos anestésicos, até a instituição da CEC,

apresentaram resultados positivos, em face dos resultados obtidos durante a

toracotomia intercostal, o acesso ao pericárdio, a canulação dos vasos sanguíneos.

No presente estudo, o acesso cirúrgico à cavidade torácica foi realizado

por meio de toracotomia intercostal direita (STOPIGLIA et al., 2001), considerada

preferencial em cães por promover adequada exposição cirúrgica das veias cavas

cranial e caudal, veia ázigos, aurícula direita, átrio direito, principal porção do

ventrículo direito e nervo frênico (ANDERSON, 1993; ORTON, 1994; EVANS;

DELAHUNTA, 2001). Verificamos também que este acesso possibilita adequada

exposição da artéria aorta para realização da canulação arterial.

Embora existam estudos que tenham utilizado a esternotomia mediana

(ORTON et al., 2001; HIRAO et al., 2003) à semelhança do que é feito no paciente

humano (COOLEY, 1984), optamos pela realização da toracotomia intercostal com

resultados satisfatórios.

No tocante à canulação arterial, ainda que Hunt (1993); Pearson (1993) e

Bellenger (1993) tenham indicado a aorta para canulação do cão receptor quando do

uso da circulação cruzada, alguns autores referem uma possível fragilidade da aorta

dos cães, sendo este fato relacionado a complicações decorrentes da canulação do

referido vaso sanguíneo (KLEMENT et al., 1987a; ORTON, 1994; GRIFFITHS, 2010)

e de possíveis hemorragias durante a realização da CEC (PELOSI et al., 2013).

Nossos resultados contrariam esta afirmação, uma vez que neste trabalho

procedemos à canulação da aorta para instalação da linha arterial sem qualquer

intercorrência relacionada à ruptura ou hemorragia durante a CEC. A documentação

82

fotográfica que realizamos demonstra passo a passo que a canulação aórtica bem

como a instalação da CEC no modo aorto-bicaval é realmente exequível em cães.

Uma vez que em publicação recente (PELOSI et al., 2013) indicou-se a necessidade

de se comprovar a factibilidade da canulação da aorta, nosso estudo contribuiu de

maneira decisiva para responder ao questionamento indicado pelos autores

supracitados. Por outro lado, enfatizamos que a experiência e o treinamento dos

cirurgiões são decisivos para o êxito da instalação da CEC no modo aorto-bicaval.

Outros autores, porém, recomendam para canulação arterial a artéria

axilar ou femoral esquerda ou carótida esquerda (DALLAN et al., 1987; PETERS et

al., 1997; HEDAYATI et al., 2004; BEHR et al., 2007; GRIFFITHS, 2010;

KANEMOTO et al., 2010; UECHI, 2012; FUJIWARA et al., 2012; PELOSI et al.,

2013). Face a necessidade de outras incisões cutâneas para acessar os referidos

vasos sanguíneos, acreditamos, baseado em nossos resultados, que deve-se

indicar, para cães o modo aorto-bicaval.

Em relação à canulação venosa (veias cava cranial e caudal) também não

identificamos qualquer intercorrência relacionada à ruptura ou hemorragia no local

de inserção da cânula. Tanto a cânula arterial quanto as cânulas venosas utilizadas

neste estudo mostraram-se satisfatórias. Não presenciamos a formação de êmbolos,

à semelhança do que foi relatado anteriormente por Freitas (2004).

A heparinização do paciente também foi realizada sem intercorrências.

Verificamos que a dose em literatura (tanto da heparina quanto da protamina) são

bastante variáveis (HUNT; PEARSON; BELLENGER, 1993; LEW et al., 1997;

KWASNICKA, 2003; FREITAS, 2004; BEHR et al., 2007; SODA et al., 2009;

GRIFFITHS, 2010; KANEMOTO et al., 2010; PELOSI et al., 2013). Por esse motivo,

nos valemos da utilização das doses postuladas por Kwasnicka (2003) em seu

estudo.

Concordamos com Magilligan et al. (1985), que afirmaram ser a

hipotermia uma das causas de bradicardia, podendo promover fibrilação atrial

durante a anestesia. Optou-se neste estudo pela realização dos procedimentos em

normotermia, e não observamos a ocorrência nem de bradicardia nem fibrilação

atrial.

Apesar de Kanemoto et al. (2010) relatarem o uso de perfusato sanguíneo

sem a ocorrência de efeitos colaterais, optou-se pela utilização de perfusato

cristaloide, do tipo Ringer com lactato (KWASNIKA, 2003), e não se verificou

83

inconvenientes, dado este que vai ao encontro do relatado pelos autores

(KWASNICKA, 2003; (PELOSI et al., 2013).

Apesar do grande risco associado à ocorrência de embolia, algumas

publicações (BEHR at al., 2007; SODA et al., 2009) indicam a realização de cirurgia

com o coração em movimento. Ainda que a escolha em se utilizar a cardioplegia

contribua para um maior grau de complexidade no procedimento (PELOSI et al.,

2013), observamos que sua utilização é necessária, tanto para a proteger o coração

(durante período isquêmico) quanto para promover a parada do órgão durante o ato

operatório, orientações estas também descritas em outros estudos (KWASNICKA,

2003; CHAMBERS; FALLOUH, 2010).

Com relação às complicações, Pelosi et al. (2013) afirmam que a

incidência destas está relacionada diretamente com o tempo de CEC e o

clampeamento aórtico. No presente estudo, ocorreu vacuolização em túnica média

de artérias de pequeno calibre apenas no miocárdio dos animais do grupo CEC-2,

ou seja, aqueles submetidos a 60 minutos de CEC seguida de 30 minutos de

restauração da perfusão espontânea. Uma vez que não houve indícios da existência

de outras complicações em nosso estudo, entendemos que estas vacuolizações, a

princípio caracterizadas como um processo reversível, foram em decorrência, muito

provavelmente, do período de isquemia do coração. Não encontramos na literatura

consultada estudos que relataram achados compatíveis com este tipo de lesão.

Concordamos com os autores que referem que a CEC é um procedimento

viável para pequenos animais (KLEMENT et al., 1987a; ORTON, 1994; ORTON et

al., 2001; BROURMAN, 2003; FREITAS, 2004; BEHR et al., 2007; SEREDA et al.,

2009; SODA et al., 2009; TANAKA et al., 2009; GRIFFITHS, 2010; KANEMOTO et

al., 2010; UECHI et al., 2011; FUJIWARA et al., 2012; UECHI, 2012; UECHI et al.,

2012; MIZUNO; MIZUKOSHI; UECHI, 2013). Entretanto, julgamos de suma

importância conduzir novas pesquisas que visem o desenvolvimento de mecanismos

terapêuticos para proteger o miocárdio durante o período de isquemia-reperfusão,

concordando com Sluijter et al. (2014) e, estabelecer períodos de tempo de CEC

seguros, que não promovam complicações nos sistemas corpóreos dos cães.

Neste contexto, insere-se o estudo das conexinas, proteínas essenciais

para a propagação do impulso elétrico pelo coração e determinantes para a

velocidade de condução. As Cxs estão relacionadas ao ritmo cardíaco e também

envolvidas diretamente na gênese de várias doenças cardíacas (JANSEN et al.,

84

2010) (LAMBIASE; TINKER, 2014). Dessa forma, reiteramos que a melhor

compreensão da fisiopatologia dos processos associados a estas proteínas poderá

contribuir para solucionar, amenizar ou mesmo prevenir as alterações decorrentes

da CEC.

O escopo desta tese concentrou-se em identificar o efeito da CEC na

expressão da Cx43, principal isoforma das Cxs presente no miocárdio. Sabe-se que

nas regiões do miocárdio de cães indenes há uma marcação da Cx43 mais intensa

nas regiões correspondentes aos ventrículos direito e esquerdo e septo transverso

quando comparadas aos átrios direito e esquerdo (SANTOS, 2008), relato este que

corrobora com os nossos achados relacionados à imuno-localização da referida

conexina. Segundo Severs et al. (2003) e Santos (2008) as Cxs não apresentam

uma variação randômica, sendo que no coração, as Cx40, Cx43 e Cx45 são

expressas em combinações características e quantidades relativas. Assim, em

nossa opinião, faz-se necessário o estudo das outras conexinas presentes no

coração e que são expressas juntamente com a proteína estudada por nós.

Os resultados de nosso estudo em relação à imuno-localização da Cx43

indicaram a marcação da referida conexina em todas as regiões analisadas (átrios,

ventrículos e septo transverso). Entretanto, observou-se uma marcação menos

intensa da Cx43, principalmente nas regiões correspondentes aos átrios, nos

animais submetidos a CEC sem restauração da perfusão espontânea. Este dado vai

ao encontro do observado por Yeh et al. (2002), que verificaram uma diminuição da

Cx43 acompanhada por uma redução das GJIC em cardiomiócitos presentes no

ventrículo direito de 21 pacientes submetidos à CEC. Estudo semelhante também

identificou diminuição da Cx43 atrial em 16 crianças submetidas à CEC (PAVLOVIC

et al., 2006).

Alguns autores já correlacionaram a diminuição das Cxs e a ocorrência de

fibrilação atrial (GEMEL et al., 2014) e de fibrilação ventricular (PELOSI et al., 2013).

Kato et al. (2012) comprovaram que a fibrilação atrial está associada à mudança no

número de Cxs e pode estar relacionada com a distribuição (lateralização) das Cxs.

Mediante estes dados, é bem provável que a redução da Cx43 nos átrios de cães

esteja relacionada com o desenvolvimento de complicações (fibrilação atrial) durante

a instituição da CEC.

Por outro lado, os animais submetidos a CEC por 60 minutos seguida de

restauração da perfusão espontânea por 30 minutos apresentaram uma marcação

85

mais intensa nas regiões correspondentes aos ventrículos e septo transverso,

marcação esta que no caso do septo transverso foi discretamente mais intensa em

relação aos animais do grupo controle. Segundo Kreuzberg, Willecke e Bukauskas

(2006) no coração humano, as fibras de Purkinje e o músculo ventricular expressam

mais Cx43 que os átrios. Dessa forma, o fato da Cx43 ter uma maior expressão

nestas áreas nos leva a postular que muito provavelmente a CEC não tenha

proporcionado um efeito deletério sobre estas regiões. Mister se faz, porém, avaliar

os possíveis efeitos de lesão após a CEC, quando se dá a restauração da perfusão

espontânea.

Além disso, no miocárdio canino os ventrículos e septo transverso

expressam a Cx43 mais intensamente que nos átrios (SANTOS, 2008). Ao contrário

do postulado por Yeh et al. (2002) e por Pavlovic et al. (2006), parece que a Cx43

possui uma maior expressão após a CEC seguida da restauração da perfusão

espontânea, ainda que tenhamos observado uma menor expressão nos animais

submetidos a 60 minutos de CEC sem reperfusão.

Curiosamente, ao analisarmos o resultado do western blot, verificamos

que houve uma diferença estatística significante (p<0,05) entre os grupos controle e

CEC-2 nas regiões correspondentes ao átrio esquerdo e ventrículo direito. O grupo

controle em relação ao CEC-1 não apresentou diferença significativa. Entretanto,

devido à amostragem pequena (n=5), talvez não tenha sido possível evidenciarmos

diferença entre os grupos. Nas demais regiões, embora se observe que há uma

diferença descritiva relevante entre os grupos, provavelmente, a grande dispersão

do grupo controle e o baixo número amostral podem ter sido responsáveis por não

observamos diferença estatística. Devido à escassez de dados na literatura neste

sentido, julgamos necessário novas pesquisas para elucidação de tais

questionamentos.

Não observamos diferença significativa entre as amostras das regiões

correspondentes aos átrios, ventrículos e septo transverso ao analisarmos o

resultado do RT-PCR em tempo real. Apesar de todos os cuidados terem sido

estabelecidos durante a coleta, armazenamento e processamento das amostras,

uma possível degradação pode ter ocorrido. Levantamos uma outra hipótese,

corroborando com recente publicação documentada por (CHATURVEDI; TYAGI,

2014), o efeito epigenético. Os autores referem que pode haver uma relação entre

86

disfunção e regeneração cardíaca, entretanto o mecanismo ainda permanece

desconhecido.

Segundo Severs et al. (2003), a conexina não apresenta uma variação

randômica, sendo as Cxs do coração, principalmente Cx40, Cx43 e Cx45) expressas

em combinações características e quantidades relativas.

Por sua vez, outros estudos indicaram que em pacientes portadores de

cardiomiopatia dilatada ocorre uma diminuição da expressão da Cx43 associada a

uma grade perda da Cx na região de disco intercalado. Já em relação à

cardiomiopatia hipertrófica pode ocorrer tanto aumento quanto redução na

expressão da Cx43 (FONTES et al., 2012). E na insuficiência cardíaca congestiva

humana ocorrem alterações quantitativas na expressão da conexina bem como uma

redução dos níveis ventriculares da Cx43 (SEVERS et al., 2003).

Em estudo realizado por Lin et al. (2007), verificou-se alteração na

restauração e distribuição da Cx43 após a isquemia do miocárdio em animais da

espécie canina. Outros estudos também referem a alteração da Cx43 frente a

processos isquêmicos (LUKE; SAFFITZ, 1991; HUANG; SANDUSKY; ZIPES, 1999).

Tal alteração pode ter se estabelecido nos animais que foram submetidos à CEC e

restauração da perfusão espontânea. Infelizmente, nossos resultados não nos

permitiram afirmar se a vacuolização encontrada em túnica média de artérias de

pequeno calibre do miocárdio oi devido à circulação extracorpórea ou secundária ao

processo de isquemia / restauração da perfusão espontânea após retirado o

clampeamento da aorta, ainda que tenhamos utilizado a cardioplegia.

Em 2004, Freitas avaliou cães submetidos a CEC por período de duas

horas seguida de restauração da perfusão espontânea por uma hora, ou seja, o

dobro do tempo que utilizamos em nosso estudo, e verificou indícios de

degeneração de organelas. Segundo Laird (2004), este grau de injúria celular, pode

influenciar diretamente a síntese das conexinas (LAIRD, 2004). Além disso, foi

provado recentemente que as Cxs são capazes de controlar a apoptose mediando a

transferência de sinais apoptóticos entre os canais intercelulares de células

adjacentes, mediada pela membrana plasmática e/ou hemicanais mitocondriais ou

direta e principalmente quanto associada à localização nuclear de uma proteína

aberrante, ou através de interações com fatores de regulação da apoptose

(CARETTE et al., 2014).

Com este estudo verificamos que a conexina 43 desempenha importantes

87

funções fisiológicas como crescimento celular, proliferação e diferenciação,

homeostase do tecido, cicatrização de feridas, apoptose além de estar presente em

processos fisiopatológicos. Reiteramos que ainda há muito o que se pesquisar e

descobrir sobre esta grande família das conexinas. Entendemos que se trata de um

estudo incipiente, de modo que tal linha de investigação científica deva continuar,

não apenas relacionada unicamente à conexina 43, mas também direcionada às

outras isoformas de conexinas presentes no tecido muscular cardíaco.

Esperamos que as pesquisas futuras sobre este tema tragam mais

conhecimentos não apenas no tocante à melhoria da técnica de circulação

extracorpórea, mas também para a elucidação da relação das conexinas e seu

envolvimento nas doenças cardíacas congênitas e adquiridas, para que possamos

prover avanços na cirurgia torácica e cardiovascular aos cães e gatos.

88

7 CONCLUSÃO

O presente estudo possibilitou-nos concluir que:

- a conexina 43 foi identificada nas regiões estudadas do miocárdio, quais sejam

átrios direito e esquerdo, ventrículos direito e esquerdo e septo transverso: nos

grupos Controle (C), CEC-1 e CEC-2, nos tempos avaliados, antes da CEC, 60

minutos após a CEC e com 30 minutos de perfusão espontânea após 60 minutos

de CEC

- a expressão da conexina 43 variou significativamente em CEC-2 nas regiões

correspondentes ao átrio esquerdo e ventrículo direito em relação aos animais do

grupo controle

- a expressão gênica de Gja1 não apresentou diferença significativa entre os

grupos estudados

- a circulação extracorpórea com duração de 60 minutos seguida de restauração

espontânea de 30 minutos promoveu vacuolização na túnica média de artérias de

pequeno calibre do miocárdio

- a canulação da aorta para realização de circulação extracorpórea bem como a

instalação do circuito de CEC no modo aorto-bicaval constituiu técnica exequível

para o cão e não apresentou complicações durante o período transoperatório

89

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