ANDRESSA FERREIRA DA SILVA

PESQUISA DE Toxoplasma gondii EM TECIDOS, EMBRIES E SMEN DE OVINOS

Niteri

2013

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE VETERINRIA PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM MEDICINA VETERINRIA (CLNICA E REPRODUO ANIMAL)

2

ANDRESSA FERREIRA DA SILVA

PESQUISA DE Toxoplasma gondii EM TECIDOS, EMBRIES E SMEN DE OVINOS

Tese apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Medicina Veterinria da Universidade Federal Fluminense, como requisito para a obteno do Grau de Doutora. rea de Concentrao: Clnica e Reproduo Animal.

Orientadora: Profa. Dra. ANA MARIA REIS FERREIRA

Coorientador: Prof. Dr. FELIPE ZANDONADI BRANDO

Niteri

2013

A

3

ANDRESSA FERREIRA DA SILVA

PESQUISA DE Toxoplasma gondii EM TECIDOS, EMBRIES E SMEN DE OVINOS

Tese apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Medicina Veterinria da Universidade Federal Fluminense, como requisito para a obteno do Grau de Doutora. rea de Concentrao: Clnica e Reproduo Animal.

Aprovada em 27 de maro de 2013

BANCA EXAMINADORA

Profa. Dra. Ana Maria Reis Ferreira Orientadora - UFF

Prof. Dr. Eraldo Lourenso Zanella - UPF

Prof. Dr. Luis Fonseca Matos - UENF

Profa. Dra. Knia Balbi El-Jaick - UNIRIO

Prof. Dr. Andr Luis Rios Rodrigues - UFF

Niteri - 2013

a

4

AGRADECIMENTOS

Gostaria de agradecer inicialmente a minha orientadora Profa. Dra. Ana

Maria Reis Ferreira, por ter acreditado em mim e proporcionando esta

oportunidade. Pelo ensinamento, pacincia, confiana, amizade e apoio em

todos os momentos. Minha gratido e eterno agradecimento;

Ao Prof. Dr. Felipe Zandonadi Brando, que juntamente com a Profa. Ana

Ferreira confiou em mim. Agradeo pela orientao, incentivo e amizade;

Ao Prof. Dr. Francisco Carlos Rodrigues Oliveira, pela ajuda e colaborao

no desenvolvimento destes projetos disponibilizando o Laboratrio de

Sanidade Animal da UENF;

Ao Prof. Dr. Eraldo Lourenso Zanella, pelo apoio e amizade desde a Iniciao

Cientfica, na poca da Graduao realizada na Universidade de Passo

Fundo-RS, sempre me incentivando, me apoiando para trabalhar com

Pesquisa principalmente com tica e responsabilidade. Meu agradecimento

especial;

s Profas. Dra. Juliana da Silva Leite e Marcela Freire Vallim de Mello do

Laboratrio de Anatomia Patolgica da UFF. Agradeo pelas infinitas

correes nos artigos e leitura das lminas do exame histopatolgico;

Ao Prof. Dr. Walter Lilenbaum, pela colaborao no Projeto do captulo 1 e

auxlio financeiro junto ao Projeto Emergentes FAPERJ/2011.

A

5

Profa. Ana Beatriz Fonseca, do curso de Matemtica e Estatstica da

UFF, pela ajuda fundamental na realizao da estatstica desta tese;

Ao Prof. Luis Matos da UENF pela ajuda indispensvel na rea de

Reproduo animal;

Ao Prof. Dr. Fbio Otero Ascoli e sua equipe pelo auxlio indispensvel na

anestesia dos animais durante o experimento;

Ao Ps-Doutorando da UENF, Edwards Frazo Teixeira e a doutoranda

Amanda Lucia Jimnez Sanz, pela ajuda na realizao do teste de

aglutinao modificada e nos testes moleculares junto ao LSA-UENF;

s colegas e amigas Franciele Basso Fernandes Silva, Sabrina Silva Venturi,

Jlia Timponi pela colaborao e ajuda no desenvolvimento deste estudo;

tcnica do Laboratrio de Anatomia Patolgica da UFF, Fabiane Lopes

pela ajuda no processamento do material da tese;

Aos secretrios da Ps-Graduao em Clnica e Reproduo Animal da UFF,

Paula Neves, Jlia Gleich e Leonardo Jannuzzi;

A todos os colegas, bolsistas, estagirios e professores que contriburam de

alguma forma para realizao desta tese. Meus sinceros agradecimentos;

Ao CNPq, pelo apoio financeiro neste estudo por meio da concesso de bolsa

de doutorado, assim como a FAPERJ pelo auxlio financeiro pelo Edital

Emergentes 2011, sob coordenao da Profa. Dra. Ana Maria Reis

Ferreira.

6

Dedico esta tese doutoral os meus

familiares em especial aos meus pais Dlia

Gomes Ferreira e Pedrinho Gilmar

Silva...porque sempre acreditam em mim.

A

7

RESUMO

Para facilitar a compreenso e leitura da tese, a mesma foi divida em trs captulos, alm da fundamentao terica sobre toxoplasmose em ovinos. O primeiro captulo diz respeito ao isolamento de T. gondii em tecidos de ovinos destinados ao abate sem fiscalizao sanitria no Rio de Janeiro, determinando assim a porcentagem da infeco nos ovinos e o melhor rgo para o diagnstico molecular. Neste estudo, detectou-se um alto nvel de infeco toxoplsmica nos ovinos (64%; 16/25), portanto, a carne e as vsceras dos ovinos abatidos ilegalmente, devem ser considerados como importante fonte de infeco de T. gondii para os humanos, se consumida crua ou mal cozida. Alm disso, nenhum tecido avaliado mostrou equivalncia (P

8

ABSTRACT

To facilitate the understanding and reading of this thesis, it is divided into three chapters, along with the theoretical rationale about toxoplasmosis in sheep. The first chapter discusses the isolation of T. gondii in the tissues of sheep destined for slaughter without prior sanitary inspection in Rio de Janeiro, in order to determine the percentage of infection in the animals and the best organ for molecular diagnosis. In this study, a high level of T. gondii infection was detected in sheep (64%; 16/25); hence, the meat and offal of illegally slaughtered sheep should be considered important sources of T. gondii infection in humans if consumed raw or undercooked. Moreover, none of the evaluated tissues showed equivalence (P

9

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

APDL Animal Parasitic Diseases Laboratory

DNA cido desoxirribonucleico

EDTA cido etilenodiamino tetra-actico

Elisa Enzime Linked Immunosorbent Assay

EV Endovenosa

et al. Abreviatura da expresso latina et alii, para demais colaboradores

FSH Hormnio folculo estimulante

HD Hospedeiro definitivo

HE Hematoxilina-eosina

HI Hospedeiro intermedirio

IgG Imunoglobulina de classe G

IgM Imunoglobulina de classe M

IHC Imuno-histoqumica

IM Intramuscular

IP Intraperitonial

LH Hormnio luteinizante

A

10

LSA Laboratrio de Sanidade Animal

MAT Teste de Aglutinao Modificado Modified Agglutination Test

mL Mililitros

nPCR nested - Reao em cadeia pela polimerase

PCR Reao em cadeia da polimerase

RIFI Reao de imunofluorescncia indireta

RJ Rio de Janeiro

RS Rio Grande do Sul

SNC Sistema Nervoso Central

SC Subcutnea

UFF Universidade Federal Fluminense

UENF Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro

USDA United States Department of Agriculture

VO Via oral

g Micrograma

M Micromolar

11

LISTA DE ILUSTRAES

FUNDAMENTAO TERICA

Figura 1. Nmero de ovinos no Brasil, segundo a FAOST-2010, entre os anos

de 2000 a 2010. Fonte: FAOST, 2010. ............................................................. 25

Figura 2. Formas parasitrias do Toxoplasma gondii baseado em Quiroz, 2007.

Em A- Oocisto sem esporular; B- Oocisto esporulado; C- Pseudocisto contendo

taquizotos; D- Cisto com bradizotos ................................................................ 33

Figura 3. Ciclo biolgico de Toxoplasma gondii ................................................ 35

Figura 4. Mecanismos de transmisso do Toxoplasma gondii. Em A- Felino

ingerindo oocisto esporulado, B- Liberao dos esporozotos e entrada no

epitlio intestinal, C- Sada do oocisto do epitlio intestinal para o meio

ambiente, D-E-F- Fase de esporogonia, G-Liberao dos taquizotos pelos

pseudocistos, H- Entrada dos taquizotos na clula e I- Formao de cistos

teciduais contendo bradizotos. ......................................................................... 38

Figura 5. Perodo pr-patente do Toxoplasma gondii aps a ingesto das trs

fases infectantes (taquizotos, bradizotos e oocistos) ...................................... 39

Figura 6. Mapa do Brasil demostrando a soropositividade de Toxoplasma

gondii em ovinos nos respectivos estados ........................................................ 44

CAPTULO 1

Figura 1. Variaes de temperatura para os ciclos da PCR para amplificao do

DNA de Toxoplasma gondii, assim como para a Nested-PCR ......................... 76

Figura 2. Marcador de peso molecular segundo a Invitrogen evidenciando

bandas com 100-200-400-800-1200-2000 pares de base ................................ 78

A

12

Figura 3. Porcentagem da positividade total de Toxoplasma gondii nos tecidos

avaliados pela PCR...........................................................................................80

Figura 4. Grficos de porcentagem dos resultados da PCR para deteco de

DNA de Toxoplasma gondii em tecidos dos ovinos avaliados .......................... 82

Figura 5. Produtos da amplificao do microsatlite de Toxoplasma gondii, por

Nested-PCR com primers SAG 3, verificado por eletroforese em gel de agarose

a 2%. M) Marcador de peso molecular 100pb, C+) controle positivo da

extrao, C-) controle negativo, 1-16 amostras de tecidos. .............................. 83

Figura 6. Produtos da amplificao do microsatlite de Toxoplasma gondii, por

Nested-PCR com primers SAG 3, verificado por eletroforese em gel de agarose

a 2%. M) Marcador de peso molecular 100pb, C+) controle positivo da

extrao, C-) controle negativo, 1-16 amostras de tecidos. .............................. 84

Figura 7. Produtos da amplificao do microsatlite de Toxoplasma gondii, por

Nested-PCR com primers SAG 3, verificado por eletroforese em gel de agarose

a 2%. M) Marcador de peso molecular 100pb, C+) controle positivo da

extrao, C-) controle negativo, 1-16 amostras de tecidos. .............................. 85

Figura 8. Produtos da amplificao do microsatlite de Toxoplasma gondii, por

Nested-PCR com primers SAG 3, verificado por eletroforese em gel de agarose

a 2%. M) Marcador de peso molecular 100pb, C+) controle positivo da

extrao, 1-17 amostras de tecidos. ................................................................. 86

Figura 9. Produtos da amplificao do microsatlite de Toxoplasma gondii, por

Nested-PCR com primers SAG 3, verificado por eletroforese em gel de agarose

a 2%. M) Marcador de peso molecular 100pb, C+) controle positivo da

extrao, 1-17 amostras de tecidos. ................................................................. 86

Figura 10. Produtos da amplificao do microsatlite de Toxoplasma gondii, por

Nested-PCR com primers SAG 3, verificado por eletroforese em gel de agarose

a 2%. M) Marcador de peso molecular 100pb, C+) controle positivo da

extrao, C-) controle negativo, 1-17 amostras de tecidos, controle positivo

(amostras 12 e 16). ........................................................................................... 87

13

Figura 11. Produtos da amplificao do microsatlite de Toxoplasma gondii, por

Nested-PCR com primers SAG 3, verificado por eletroforese em gel de agarose

a 2%. M) Marcador de peso molecular 100pb, C+) controle positivo da

extrao, 1-17 amostras de tecidos. ................................................................. 88

Figura 12. Produtos da amplificao do microsatlite de Toxoplasma gondii, por

Nested-PCR com primers SAG 3, verificado por eletroforese em gel de agarose

a 2%. M) Marcador de peso molecular 100pb, C+) controle positivo da

extrao, 1-17 amostras de tecidos. ................................................................. 88

Figura 13. Produtos da amplificao do microsatlite de Toxoplasma gondii, por

Nested-PCR com primers SAG 3, verificado por eletroforese em gel de agarose

a 2%. M) Marcador de peso molecular 100pb, C+) controle positivo da

extrao, C-) controle negativo, 1-16 amostras de tecidos. .............................. 89

Figura 14. Produtos da amplificao do microsatlite de Toxoplasma gondii, por

Nested-PCR com primers SAG 3, verificado por eletroforese em gel de agarose

a 2%. M) Marcador de peso molecular 100pb, C+) controle positivo da

extrao, C-) controle negativo, 1-16 amostras de tecidos (exceto as amostras

9, 11 e 14 que so C+). ..................................................................................... 90

Figura 15. Produtos da amplificao do microsatlite de Toxoplasma gondii, por

Nested-PCR com primers SAG 3, verificado por eletroforese em gel de agarose

a 2%. M) Marcador de peso molecular 100pb, C+) controle positivo da

extrao, C-) controle negativo, 1-6 amostras de tecidos. ................................ 90

Figura 16. Grficos de equivalncia estatstica (Teste McNemar) realizada nos

diferentes tecidos de ovinos. ............................................................................. 92

CAPTULO 2

Figura 1. Esquema dos protocolos hormonais para sincronizao do estro e

superovulao em ovelhas Santa Ins usadas no experimento.....................112

Figura 2. Envase dos embries e solues utilizadas para o congelamento. . 120

Figura 3. Curva de congelao de embrio segundo o manual de instruo do

equipamento Freezer Control CL 5500 ........................................................... 121

14

Figura 4. Embries coletados das ovelhas submetidas a monta natural com

carneiro infectado naturalmente por Toxoplasma gondii. Em A, apresentando

dois blastocistos expandidos (Bx-1), blastocisto grau 1 (Bl-1) e um blastocisto

grau 2 colapsado (Bl-2). Em B, apresentando uma mrula compacta grau 1

(Mc-1), uma mrula grau 2 (Mo-2) e uma mrula grau 3 (Mo-3). .................... 127

Figura 5. Produtos de amplificao da Nested-PCR do smen dos carneiros

utilizados na monta natural das ovelhas. (MM) marcador de peso molecular,

(C+) controle positivo (taquizotos de T. gondii), (C-) controle negativo, (smen

1) smen do carneiro soronegativo para T. gondii, (smen 2) smen do

carneiro soronegativo para T. gondii, (C- reao) controle negativo da reao.

......................................................................................................................... 128

Figura 6. Produtos de amplificao da Nested-PCR dos embries coletados

das ovelhas submetidas a monta natural. (MM) marcador de peso molecular,

(C+) controle positivo (taquizotos de T. gondii), (C-) controle negativo, (1-22)

amostras dos embries. .................................................................................. 129

Figura 7. Produtos de amplificao da Nested-PCR dos leuccitos e lavado

uterino das ovelhas, com primers SAG 3, eletroforese em gel de agarose a 2%.

M) Marcador de peso molecular 100pb, +) controle positivo da extrao, 1-15

amostras..........................................................................................................130

Figura 8. Produtos de amplificao da Nested-PCR c dos leuccitos e lavado

uterino das ovelhas, com primers SAG 3, eletroforese em gel de agarose a 2%.

M) Marcador de peso molecular 100pb, +) controle positivo da extrao, 16-31

amostras. ......................................................................................................... 130

Figura 9. Produtos de amplificao da Nested-PCR dos leuccitos e lavado

uterino das ovelhas, com primers SAG 3, eletroforese em gel de agarose a 2%.

M) Marcador de peso molecular 100pb, +) controle positivo da extrao, 32-48

amostras. ......................................................................................................... 131

Figura 10. Produtos de amplificao da Nested-PCR dos leuccitos e lavado

uterino das ovelhas, com primers SAG 3, eletroforese em gel de agarose a 2%.

15

M) Marcador de peso molecular 100pb, +) controle positivo da extrao, 49-64

amostras. ......................................................................................................... 131

Figura 11. Produtos de amplificao da Nested-PCR dos leuccitos e lavado

uterino das ovelhas, com primers SAG 3, eletroforese em gel de agarose a 2%.

M) Marcador de peso molecular 100pb, +) controle positivo da extrao, 65-71

amostras. ......................................................................................................... 132

CAPTULO 3

Figura 1. Desenho experimental Etapa (A) demostrando a coleta de taquizotos

do camundongo infectado com a CEPA-RH de Toxoplasma gondii por meio do

lavado intraperitoneal, inoculao deste lavado em outros nove camundongos

e obteno dos taquizotos para quantificao e dos rgos para histopatologia

......................................................................................................................... 145

Figura 2. Desenho experimental das ETAPAS B e C demostrando a coleta de

smen de carneiro, infeco experimental do smen com taquizotos e

mtodos diagnsticos e bioensaio em camundongo ....................................... 147

Figura 3. Fotomicroscopia de cortes histolgicos de bao, pulmo e corao de

camundongo inoculado com taquizotos de Toxoplasma gondii. A- Bao com

infiltrado inflamatrio mononuclear difuso e congesto (seta) (10x), B- Bao

apresentando congesto (seta) (40x), C- Pulmo com focos de congesto

(seta) (10x), D- Pulmo com focos de congesto (seta) (40x), E- Corao com

inmeras hemcias falciformes (seta) em meio lquido eosinoflico (*) (10x), F-

Corao com inmeras hemcias falciformes (seta) em meio a lquido

eosinoflico (40x). Mtodo de colorao: Hematoxilina eosina (H&E). ............ 155

Figura 4. Fotomicroscopia de cortes histolgicos de fgado de camundongo

inoculado com taquizotos de Toxoplasma gondii. A-Fgado com inmeras

hemcias falciformes (setas) (40x), B- Fgado apresentando inmeros

taquizotos de Toxoplasma gondii (setas) (40x), C-D- Fgado com pseudocistos

de taquizotos (setas) (40x). Hematoxilina e eosina. ....................................... 156

16

Figura 5. Smen de carneiro congelado. Em A, smen de carneiro livre de

taquizotos de Toxoplasma gondii. Em B, smen de carneiro adicionado de

taquizotos de Toxoplasma gondii. .................................................................. 158

Figura 6. Reao da PCR. Da esquerda para direita observa-se, marcador de

peso molecular (MM), controle positivo (tecido de camundongo sabidamente

positivo para T. gondii), controle negativo, smen infectado com T. gondii

experimentalmente, smen livre de taquizotos, MM. ..................................... 159

Figura 7. Fotomicroscopia de cortes histolgicos de fgado e pulmo de

camundongo inoculado com taquizotos de Toxoplasma gondii. A-B- Fgado

com contendo inmeros taquizotos (setas) (40x), C- Pulmo congesto (40x),

D- Pulmo apresentando filtrado de clulas inflamatrias mononucleares focal

(seta) e congesto (*) (40x). Hematoxilina e eosina. ...................................... 161

Figura 8. Fotomicroscopia de cortes histolgicos de estmago de camundongo

inoculado com taquizotos de Toxoplasma gondii. A- Inmeros taquizotos

(setas) (10x), B- Representa a mesma imagem de A, porm com aumento

maior (40x). Hematoxilina e eosina. ................................................................ 162

17

LISTA DE QUADROS

FUNDAMENTAO TERICA

Quadro 1. Levantamento epidemiolgico de toxoplasmose ovina em algumas

regies do mundo segundo o local, frequncia, total de animais, tcnica

diagnstica, autor e ano .................................................................................... 42

Quadro 2. Levantamento epidemiolgico de toxoplasmose ovina em algumas

regies brasileiras segundo o local, frequncia, total de animais, tcnica

diagnstica, autor e ano .................................................................................... 43

CAPTULO 1

Quadro 1. Resultado do isolamento de Toxoplasma gondii pela PCR nos

tecidos de ovinos destinados ao abate clandestino no Estado do Rio de Janeiro

........................................................................................................................... 81

CAPTULO 2

Quadro 1. Legenda das amostras de sangue e lavado uterino submetidas a

Nested-PCR .................................................................................................... 133

A

18

LISTA DE TABELAS

CAPTULO 1

Tabela 1. Reagentes e volumes utilizados nas reaes da PCR para deteco

de Toxoplasma gondii ....................................................................................... 76

Tabela 2. Valores estatsticos obtidos pelo Teste McNemar com relao aos

resultados do mtodo molecular para diagnstico de Toxoplasma gondii em

ovinos nos diferentes rgos ............................................................................. 91

CAPTULO 2

Tabela 1. Ovelhas que foram submetidas monta natural por reprodutores

infectados ou no por Toxoplasma gondii de acordo com o Teste de

Aglutinao Modificado (MAT) ........................................................................ 110

Tabela 2. Pesquisa de anticorpos anti-Toxoplasma gondii em ovelhas

submetidas monta natural com smen de carneiro infectado naturalmente por

Toxoplasma gondii e no infectado (controle) ................................................. 125

A

19

SUMRIO

FUNDAMENTAO TERICA

1. INTRODUO .............................................................................................. 24

2. FUNDAMENTAO TERICA ..................................................................... 29

2.1. Histrico ...................................................................................................... 29

2.2.Taxonomia ................................................................................................... 30

2.3. Estrutura biolgica do Toxoplasma gondii .................................................. 31

2.4. Ciclo de vida e formas de transmisso do Toxoplasma gondii .................. 33

2.5. Biotcnicas da reproduo x controle de Toxoplasma gondii .................... 40

2.6. Epidemiologia de Toxoplasma gondii em ovinos ....................................... 41

2.7. Sintomatologia de Toxoplasma gondii em ovinos ...................................... 45

2.8. Mtodos de diagnstico .............................................................................. 47

2.8.1. Testes sorolgicos ................................................................................... 47

2.8.2. Hematologia e bioqumica srica ............................................................ 49

2.8.3. Diagnstico molecular ........................................................................... 50

2.8.3.1. Reproduo animal .............................................................................. 51

2.8.3.2. Toxoplasma gondii no leite de ovelhas ................................................ 54

2.8.3.3. Tecidos ovinos maternos e fetais ......................................................... 54

2.8.4. Exames Anatomo-histopatolgicos e Imuno-histoqumico ...................... 56

2.8.4.1. Macroscopia ......................................................................................... 56

2.8.4.2. Histopatologia ....................................................................................... 57

A

20

2.8.4.3. Imuno-histoqumica .............................................................................. 59

2.8.4. Prova biolgica em camundongos .......................................................... 60

2.9. Toxoplasmose em humanos ...................................................................... 61

2.10. Medidas de controle e profilaxia ............................................................... 62

CAPTULO 1

1.INTRODUO ............................................................................................... 68

2. OBJETIVOS .................................................................................................. 71

2.1. Geral ........................................................................................................... 71

3. MATERIAL E MTODO ................................................................................ 72

3.1. Locais de realizao do estudo .................................................................. 72

3.2. Animais experimentais ............................................................................... 72

3.3. Pesquisa laboratorial de Toxoplasma gondii .............................................. 73

3.3.1. Histopatologia .......................................................................................... 73

3.4.4. Reao em Cadeia da Polimerase (PCR) ............................................... 74

3.4.4.1. Extrao de DNA .................................................................................. 74

3.4.4.2. PCR ...................................................................................................... 75

3.4.4.4. Anlise do produto amplificado ............................................................ 77

3.4.4.5. Leitura da PCR ..................................................................................... 78

3.5. Anlise Estatstica ...................................................................................... 79

4. RESULTADOS .............................................................................................. 80

4.1. Avaliao molecular ................................................................................... 80

4.4. Estatstica ................................................................................................... 91

4.2. Avaliao histopatolgica ........................................................................... 93

CAPTULO 2

21

1. INTRODUO ............................................................................................ 104

2. OBJETIVOS ................................................................................................ 106

2.1. Geral ......................................................................................................... 106

2.2. Especficos ............................................................................................... 106

3. MATERIAL E MTODO .............................................................................. 107

3.1. Locais de realizao do estudo ................................................................ 107

3.2. Animais experimentais ............................................................................. 107

3.2.1. Reprodutores ovinos ............................................................................. 107

3.2.2. Ovelhas matrizes ................................................................................... 108

3.2.2.1. Manejo nutricional das ovelhas .......................................................... 108

3.2.2.2. Desenho experimental das ovelhas ................................................... 109

3.2.2.3. Resposta imune-humoral ................................................................... 110

3.2.2.4. Sincronizao do cio base e superovulao ...................................... 111

3.2.2.5. Acasalamentos pela monta natural .................................................... 113

3.2.2.6. Protocolos Anestsicos para coleta de embries ............................... 113

3.2.2.6.1. Controle da dor e medicao ps-cirrgica ..................................... 114

3.2.2.7. Coleta de embries e lavado uterino .................................................. 115

3.2.2.8. Congelao de embries .................................................................... 119

3.3. Pesquisa laboratorial de Toxoplasma gondii ............................................ 121

3.3.1. Coleta de amostras sanguneas ............................................................ 121

3.3.2. Teste de Aglutinao Modificado (MAT) ............................................... 122

3.3.3. Reao em Cadeia da Polimerase (PCR) ............................................. 122

3.4. Anlise Estatstica .................................................................................... 123

4. RESULTADOS ............................................................................................ 124

4.1. Avaliao sorolgica das ovelhas submetidas a monta natural ............... 124

22

4.2. Avaliao dos embries coletados ovelhas submetidas a monta natural 126

4.3. Avaliao Molecular ................................................................................. 127

4.3.1. Smen dos carneiros ............................................................................. 128

4.3.2. Embries ............................................................................................... 129

4.3.3. Sangue (leuccitos) e lavado uterino .................................................... 129

5. DISCUSSO ............................................................................................... 134

7. CONCLUSO .............................................................................................. 137

CAPTULO 3

1. INTRODUO .......................................................................................... 141

2. OBJETIVOS ................................................................................................ 142

2.1. Geral ......................................................................................................... 142

2.2. Especficos ............................................................................................... 142

3. MATERIAL E MTODO .............................................................................. 143

3.1. Locais e realizao do Estudo .................................................................. 143

3.2. Delineamento do estudo ........................................................................... 143

3.2.1. Etapa A - Obteno da CEPA RH- Toxoplasma gondii ......................... 144

3.2.2. Etapa B - Coleta, infeco e congelao de smen de carneiro ........... 145

3.2.3. Etapa C - Bioensaio do smen congelado ............................................ 147

3.3. Animais experimentais ............................................................................. 148

3.3.1. Reprodutor ovino ................................................................................... 148

3.3.1.1. Coleta de smen ................................................................................ 149

3.3.1.2. Inoculao experimental de taquizotos no smen ............................ 149

3.3.1.3. Congelao de smen ........................................................................ 149

3.3.2. Camundongos ....................................................................................... 150

23

3.4. Pesquisa laboratorial de Toxoplasma gondii ............................................ 151

3.4.1. Coleta de amostras sanguneas ............................................................ 151

3.4.2. Teste de Aglutinao Modificado .......................................................... 151

3.4.3. Bioensaio em camundongos ................................................................. 151

3.4.3.1 Inoculao ........................................................................................... 151

3.4.3.2. Perodo de observao e isolamento ................................................. 151

3.4.4. Reao em Cadeia da Polimerase ........................................................ 152

3.4.5. Histopatologia ........................................................................................ 153

3.5. Anlise Estatstica .................................................................................... 153

4. RESULTADOS ............................................................................................ 154

4.1. ETAPA A - Obteno da CEPA RH- Toxoplasma gondii ......................... 154

4.1.2. Histopatologia ........................................................................................ 154

4.2. ETAPA B - Coleta, infeco e congelao de smen de carneiro ........... 157

4.2.1. PCR ....................................................................................................... 158

4.3. Etapa C (Prova Biolgica do smen congelado) ...................................... 159

4.3.1. Histopatologia ........................................................................................ 160

5. DISCUSSO ............................................................................................... 163

6. CONCLUSO .............................................................................................. 167

CONSIDERAES FINAIS ............................................................................ 168

REFERNCIAS ............................................................................................... 172

FUNDAMENTAO TERICA

1. INTRODUO

No Brasil e em vrias regies do mundo a ovinocultura est em

crescente expanso, assim, a cadeia produtiva deve estar atenta cada vez

mais para os problemas sanitrios e reprodutivos que tenham efeito direto

sobre a produtividade dos rebanhos ovinos. Neste contexto, a toxoplasmose

alm de causar problemas reprodutivos como o abortamento em ovinos,

considerada uma importante zoonose.

O Brasil possui um rebanho ovino de aproximadamente 18 milhes de

animais segundo dados estatsticos emitidos pelo Sistema IBGE de

Recuperao Automtica, Diretoria de Pesquisas, Coordenao de

Agropecuria (IBGE, 2011). Estes valores estatsticos se tornam mais atrativos

quando observa-se a planilha da FAOST (Organizao das Naes Unidas

para Agricultura e Alimentao) com os dados atualizados at 2010 (Fig. 1),

sobre o rebanho mundial ovino. Segundo a FAOST, o Brasil encontra-se na 17

posio de um total de 190 pases, como um dos pases que possuem os

maiores rebanhos ovinos do mundo. Na Amrica do Sul, este ranking ainda

mais surpreendente, o Brasil est em primeiro lugar (FAOST, 2010), o que

demonstra que em relao a outros pases da Amrica do Sul o Brasil est em

liderana e crescente expanso na ovinocultura.

25

Nos ltimos 10 anos, o Brasil teve um aumento de 15% no rebanho

ovino (FAOST, 2010). Essa porcentagem representa aproximadamente 3

milhes de ovinos. Este crescente aumento, tende a trazer paralelamente o

aumento de doenas infecciosas, o que alerta a populao para o controle

destas enfermidades. o caso como, exemplo, da toxoplasmose, leptospirose,

neosporose, dentre outras (MARTINS et al., 2011; SILVA et al., 2011a,b;

SILVA et al., 2013a,b).

Figura 1. Nmero de ovinos no Brasil, segundo a FAOST-2010, entre os anos

de 2000 a 2010. Fonte: FAOST, 2010.

A toxoplasmose, assim como outras enfermidades infecciosas causam

grandes prejuzos caprino-ovinocultura e, indiretamente, sade pblica

(PINHEIRO e ALVES, 2003). A infeco toxoplsmica em ovinos conhecida

dos produtores rurais, fazendeiros, Mdicos Veterinrios e outros profissionais

da rea, por causar estes prejuzos econmicos, principalmente, por ser

26

responsvel pelo abortamento, natimortos ou nascimentos de animais

debilitados (WILLIAMS et al., 2005; BISPO et al., 2011). Alm disso, outro fator

que desperta interesse com relao a doena o potencial zoontico e, neste

caso, pelo consumo de carne ovina contaminada ou mal cozida (ESTEBAN

REDONDO et al., 1998; DUBEY et al., 2009; HALOS et al., 2010; ASGARI et

al., 2011, SILVA et al., 2013a).

No Brasil o consumo da carne ovina brasileira representa 0,6

kg/habitante/ano (FAOSTAT, 2009), valor este ainda baixo, quando comparado

com outras espcies como a bovina (38 kg/ habitante/ ano) e a suna (12 kg/

habitante/ ano) (FAOSTAT, 2009) no mesmo pas. Porm, pensando numa

perspectiva mais ampla, ainda sim, os humanos esto suscetveis a infeco

por toxoplasmose quando se alimentam de carne ovina contendo cistos de

bradizotos.

Apesar de no ser um hbito comum a ingesto de carne crua e

vsceras de ovinos, faz parte da cultura dos descendentes de rabes, de ingerir

carne crua de ovino (kibe). Neste sentido, alm do consumo do kibe, a ingesto

da carne mal passada, assim como o consumo das prprias vsceras na

famosa buchada de bode podem ser veculos de transmisso para os

humanos da T. gondii. Outra questo importante, o aumento da renda do

brasileiro, que tem levado a um aumento no consumo da carne ovina, pois o

preo mais alto quando comparado com outras carnes, sendo, considerada

uma iguaria apreciada por nichos especficos de mercado, no competindo

com a carne bovina, suna ou de frango.

27

Apesar do parasito no ser visvel macroscopicamente na inspeo, a

fiscalizao sanitria pode intervir na origem dos animais e principalmente nos

cuidados ps abate, como congelao da carne. Os ovinos destinados ao

abate sem fiscalizao sanitria, provm de propriedades que descartam estes

animais por apresentarem algum problema de sade ou reprodutivo, assim as

chances destes animais apresentarem alguma enfermidade alta.

O uso do mtodo molecular como diagnstico em tecidos de ovinos

infectados por T. gondii, vem sendo usada por diversos pesquisadores

((ESTEBAN-REDONDO e INNES, 1998; ASGARI et al., 2011). Porm, dados

referentes a ovinos destinados ao abate sem fiscalizao com o uso desta

tcnica diagnstica no Estado do RJ indita na literatura consultada. O

isolamento do agente parasitrio na carne e vsceras de ovinos destinadas ao

consumo humano, traz informaes valiosas uma vez que se trata de uma

agente zoontico.

A infeco de toxoplasmose em ovinos pode ocorrer pela via

transplacentria (da me para o feto) e/ou via horizontal - pela ingesto de

cistos teciduais contidos em tecidos de animais crus ou mal cozidos e ingesto

de gua ou alimentos contaminados com oocistos. A via de transmisso sexual

at o presente momento foi pouco estudada (LOPES et al., 2013) e os estudos

realizados trazem informaes limitadas sobre esta nova rota de infeco para

os ovinos.

Resultados quanto ao isolamento de T. gondii em amostras seminais de

ovinos, bovinos e ces sugerem a possibilidade deste coccdeo ser transmitido

28

sexualmente. Um dos primeiros artigos sobre o assunto publicado na literatura

consultada, foi em 2010 por Moraes et al., (2010b), porm com o uso de smen

fresco para a realizao da inseminao artificial. Os resultados sugerem a

possibilidade de transmisso de T. gondii pelo smen. Lopes et al., (2013)

tambm sugerem a via sexual como fonte de infeco aos ovinos em um

estudo realizado com infeco experimental por via oral e subcutnea nos

ovinos e posterior monta natural.

Dados sobre a transmisso sexual natural de T. gondii em ovinos so

escassos na literatura, assim como a sua capacidade de continuar infectante

em smen de ovinos experimentalmente contaminados aps a criopreservao

e descongelao. Neste sentido, buscou-se por meio do presente estudo

encontrar evidncias que esclaream estas dvidas a cerca do assunto.

29

2. FUNDAMENTAO TERICA 2.1. Histrico

O Toxoplasma gondii um dos parasitas mais bem estudados devido

sua importncia mdica e veterinria. At o sculo XX, quinze mil artigos

originais e 500 revises foram publicados a respeito do assunto (TENTER et

al., 2000). Desde o ano 2000 at os dias atuais (2013), mais de oito mil artigos

com os termos toxoplasma ou toxoplasmose foram indexados no PubMed,

Centro Nacional de Informao em Biotecnologia dos Estados Unidos (NCBI).

Desde a sua descoberta j se passaram mais de um sculo (DUBEY,

2008a) quando os pesquisadores Nicolle e Manceaux (1908) relataram a

presena do protozorio em tecidos de um roedor africano (Ctenodactylus

gundi), que estava sendo utilizado para pesquisa de leishmaniose.

Concomitantemente no Brasil, Alfonso Splendore (1908) detectou T. gondii em

um estudo com coelhos descrevendo as leses e os corpsculos parasitrios

encontrados, porm o pesquisador no nomeou o parasito, deixando assim o

ttulo da descoberta para Nicolle e Manceaux (1909).

Passaram-se alguns anos aps a descoberta, e no final da dcada de

30, o parasita foi isolado pela primeira vez em animais (SABIN e OLITSKY,

1937) e em humanos (WOLF et al., 1939), tratando-se ento, no somente de

um parasita que acometia animais e sim de uma zoonose de grande

importncia para sade pblica.

A

30

Aps o primeiro isolamento do parasito em animais (SABIN e OLITSKY,

1937), finalmente o T. gondii foi considerado e reconhecido mundialmente

como um importante causador de abortamentos em ovinos (HARTLEY e

MARSHALL, 1957). A partir desta data, diversos estudos vem sendo

publicados sobre o tema, ressaltando principalmente o fato de ser transmissvel

aos humanos pelo consumo de carne mal passada (VILLENA et al., 2012) e

por causar prejuzos econmicos aos produtores pelo abortamento patolgico

causado (WILLIAMS et al., 2005; MOTTA et al., 2008; BISPO et al., 2011).

2.2.Taxonomia

A classificao taxonmica do T. gondii est descrita abaixo (CURRENT

et al. 1990; LEVINE 1980; QUIROZ, 2007; DUBEY, 2010):

REINO: Protista

SUBREINO: Protozoa

FILO: Apicomplexa

CLASSE: Conoidasida

SUBCLASSE: Coccidiasina

ORDEM: Eucoccidiorida

FAMLIA: Sarcocystidae

SUBFAMLIA: Toxoplasmatinae

GNERO: Toxoplasma

ESPCIE: Toxoplasma gondii

31

2.3. Estrutura biolgica do Toxoplasma gondii

O parasito T. gondii pode ser encontrado em vrios estgios como:

taquizoto, bradizoto e esporozoto (oocisto) (VELARDE et al., 2009). O

taquizoto de T. gondii (Fig. 1), tem uma regio alongada de aproximadamente

8 m de comprimento por 2 m de largura, caracterizado por apresentar o

conide, as rptrias, os micronemas, o ncleo, o complexo de golgi, o

apicoplasto e o retculo endoplasmtico. A mitocndria nica e ramificada, e

ainda pode-se observar grnulos densos, acidocalcissomas e amilopectina

dispersos em todo o taquizoto. Por fim, nota-se uma pelcula que envolve todo

o conjunto que parte do anel polar posterior (SOUZA et al., 2010). Os

taquizotos caracterizam a infeco aguda da infeco por T. gondii, mesmo

que j se tenha instalado a resposta imune protetora (COSTA-SILVA e

CHIOCCOLA, 2010).

As funes do conide, roptrias, microporos, e micronemas no so

totalmente conhecidos, mas provavelmente est associada a penetrao e

criao da um ambiente intracelular adequado na clula hospedeira para o

parasita crescer, se desenvolver e sair da clula hospedeira (DUBEY, 2010).

Os bradizotos so parecidos com os taquizotos, contudo, so menores

e possuem um ncleo situado na parte superior, o que o diferencia dos

taquizotos que possuem um ncleo mais central. Estes, podem ser

encontrados dentro dos cistos teciduais que variam de 5-70 m de tamanho, j

32

que podem conter um a centenas de bradizotos no seu interior (VELARDE,

2009). Os bradizotos ao contrrio dos taquizotos se dividem lentamente

caracterizando uma infeco crnica da doena (QUIROZ, 2007).

O oocisto mede aproximadamente 10-12 m. No interior do oocisto

esporulado observa-se (figura 2-B) um par de esporocistos cada qual com 4

esporozotos, que se formam unicamente nos felinos (hospedeiros definitivos)

(VELARDE et al., 2009).

Figura 1. Estrutura morfolgica do taquizoto de Toxoplasma gondii

33

Figura 2. Formas parasitrias do Toxoplasma gondii baseado em Quiroz, 2007.

Em A- Oocisto sem esporular; B- Oocisto esporulado; C- Pseudocisto contendo

taquizotos; D- Cisto com bradizotos

2.4. Ciclo de vida e formas de transmisso do Toxoplasma gondii

Feldeos, no s os domsticos, mas quase todas as espcies de

feldeos (Phantera leo, Felis concolar, Oncifelis colocolo, Phantera tigres

altaica, Felis silvestres) podem eliminar oocistos de T. gondii no esporulado

(Fig. 2-A) aps ingerir qualquer dos trs estgios infecciosos de T. gondii, ou

seja, taquizotos (Fig. 1), bradizotos e oocistos (DUBEY 2010). Os oocistos de

T. gondii na forma no esporulada so eliminados pelo hospedeiro definitivo

(Fig. 2-B) no meio ambiente e estes sofrem uma alterao em sua estrutura

para tornar-se potencialmente infeccioso ao esporular aps um a cinco dias de

excreo (DUBEY, 1994; DUBEY, LINDSAY e SPEER 1998; TZANIDAKIS et

al., 2012). No meio ambiente os oocistos sobrevivem por at 18 meses

34

(LINDSAY et al., 2003) e so bastante resistentes a diversos desinfetantes e

temperaturas distintas (YILMAZ e HOPKINS, 1972; DUBEY, 2010).

Atualmente, existem trs meios principais de transmisso conhecidos

(Fig. 3) da toxoplasmose aos hospedeiros intermedirios: transplacentria

(vertical/congnita), ingesto de cistos teciduais contidos em tecidos de

animais crus ou mal cozidos e ingesto de gua ou alimentos contaminados

com oocistos (DUBEY, 1994). Dentre estas, umas das mais importantes vias

de transmisso para o ser humano a ingesto de cistos viveis presentes em

carnes de animais infectados (MOURA et al., 2004; VILLENA et al., 2012)

Sobre as vias de infeco conhecidas, vrios pesquisadores afirmam

que infeco por T. gondii geralmente acontece nos hospedeiros intermedirios

pela ingesto de alimento ou gua contaminada com oocistos eliminados por

felinos ou ingesto de carne crua ou mal passada contendo cistos teciduais

(ASGARI et al., 2011; VILLENA et al., 2012).

Estudos recentes chamam a ateno para o consumo de leite cru e no

pasteurizado de ovelhas, aps detectarem DNA de T. gondii em 7 amostras de

leite de 20 ovelhas infectadas naturalmente pelo parasito, porm os autores

no confirmam a infeco pois no avaliaram as formas infectantes do parasito

como os taquizotos e cistos contendo bradizotos (CAMOSSI et al., 2011).

A via de transmisso transplacentria do T. gondii (Fig. 5) acomete os

hospedeiros intermedirios (ovinos) ou at mesmo os hospedeiros definitivos

durante a prenhez (DUBEY, 1994). A patogenia do abortamento se desenvolve

35

quando o parasita prolifera na placenta e atinge o feto, quando no ocorre o

abortamento, leses congnitas se instalam e so consideradas irreversveis

(DUBEY, 1994).

Figura 3. Ciclo biolgico de Toxoplasma gondii

Na figura 5, esto demonstrados os mecanismos de transmisso do T.

gondii. Observa-se a ingesto do oocisto esporulado, taquizotos e/ou

36

bradizotos de T. gondii pelo felino por meio da carne mal passada (Fig. 4-A),

neste caso a ingesto do oocisto poderia ser tambm pela gua. Aps a

entrada de qualquer forma parasitria de T. gondii no organismo do HD (Fig.

5), h liberao dos esporozotos de dentro do oocisto (Fig. 4-B) e em

seguida estes penetram no epitlio intestinal e se transformam em oocistos

imaturos por meio das fases1 de esquizogonia (merogonia / assexuada) e

esporogonia (gametogonia / sexuada) (Fig. 4-C). Aps a formao do oocisto

imaturo no felino (HD), estes so eliminados pelas fezes no meio ambiente

onde por meio da fase de esporogonia, ocorre a transformao de oocisto no

esporulado para esporulado (Fig. 4-D-E-F). Os oocistos esporulados, sero

ento ingeridos pelos hospedeiros intermedirios, no caso os ovinos e nestes

animais ocorrer a liberao dos oito esporozotas no intestino delgado (Fig. 4-

G). Estes se dividem rapidamente nas clulas intestinais e linfonodos

associados e do origem aos taquizotos (Fig. 4-H). Finalmente h formao

de cistos teciduais (tecido muscular, heptico, cardaco, nervoso, dentre outros)

contendo bradizotos (Fig. 4-I) que posteriormente podero ser ingeridos por

outros animais e pessoas por meio da carne, dando seguimento ao ciclo de

infeco (DUBEY, 1994; QUIROZ, 2007).

1As duas fases (assexuada e sexuada) do Toxoplasma gondii em conjunto (chamada de ciclo

completo) ocorrem unicamente nos hospedeiros definitivo (felinos). Enquanto que nos

hospedeiros intermedirios (ovinos e outras espcies), ocorre somente a fase sexuada.

37

Os taquizotos que so as formas de proliferao rpida da infeco por

T. gondii e responsvel pela fase aguda da doena, reduzem sua velocidade

de multiplicao dentro dos cistos teciduais e portanto, passam a ser

chamados de bradizotos que caracterizam a fase crnica da infeco

(DUBEY, 1994).

O felino pode ingerir como mencionado anteriormente os trs estgios

infecciosos de T. gondii (taquizoto, bradizoto e/ou oocistos). Aps a ingesto

de qualquer uma das formas parasitrias o perodo pr-patente (tempo de

eliminao dos oocistos at a fase inicial da infeco) e a frequncia da

eliminao dos oocistos nos felinos tero uma variao de acordo com o

estgio ingerido (Fig. 5). Nota-se que quando o HD ingere bradizotos demora

um pequeno perodo em torno de 3-10 dias para ocorrer a eliminao nas

fezes, enquanto, se o felino ingerir oocistos e/ou taquizotos este perodo

aumenta para 18 dias ou mais (Fig. 5).

38

Figura 4. Mecanismos de transmisso do Toxoplasma gondii. Em A- Felino

ingerindo oocisto esporulado, B- Liberao dos esporozotos e entrada no

epitlio intestinal, C- Sada do oocisto do epitlio intestinal para o meio

ambiente, D-E-F- Fase de esporogonia, G-Liberao dos taquizotos pelos

pseudocistos, H- Entrada dos taquizotos na clula e I- Formao de cistos

teciduais contendo bradizotos.

39

Figura 5. Perodo pr-patente do Toxoplasma gondii aps a ingesto das trs

fases infectantes (taquizotos, bradizotos e oocistos)

Existe ainda, outra provvel via de infeco por T. gondii que vem sendo

estudada, trata-se da via venrea ou sexual do T. gondii. Apesar do assunto ter

sido pouco estudado, em 2010 os primeiros estudos sobre o tema em ovinos

foram publicados (MORAES et al., 2010b; MORAES et al., 2010c; LOPES

2010), porm, por meio da infeco experimental oral ou subcutnea de

reprodutores ovinos (LOPES et al., 2013) ou infeco experimental no smen

fresco (MORAES et al., 2010b; MORAES et al., 2010c).

A deteco de T. gondii no smen j foi comprovada em pesquisas

utilizando bodes (DUBEY e SHARMA 1980), bovinos (SCARPELLI et al., 2001;

40

2009), sunos (MOURA et al., 2007), carneiros (LOPES et al., 2009a) e ces

(ARANTES et al., 2009). Entretanto, todas estas espcies foram

experimentalmente infectadas com o parasito e a transmisso sexual nestes

estudos no foi comprovada.

A avaliao do smen de carneiros que apresentavam anticorpos anti-

T. gondii foi avaliado pela primeira vez em 6 carneiros considerados

soropositivos pela tcnica de imunofluorescncia indireta. Amostras seminais

destes carneiros foram coletadas para realizao de diagnostico molecular e

detectou-se DNA de T. gondii em 4/6 (66,6%) das amostras (MORAES et al.,

2010a). Apesar do smen de carneiro naturalmente infectado por

toxoplasmose ter sido avaliado, nenhum estudo foi realizado testando a via de

transmisso sexual usando estes animais.

2.5. Biotcnicas da reproduo x controle de Toxoplasma gondii

A tcnica de lavagem de embries e de ocitos bovinos segundo a

International Embryos Transfer Society (IETS) j foi utilizada para eliminao

de outros parasitos como o N. caninum (MOSKWA et al., 2008). Os autores

no detectaram o parasito pela PCR aps sucessivas lavagens (MOSKWA et

al., 2008) e sugerem a TE como forma de controle da neosporose em bovinos

(BAILLARGEON et al., 2001; LANDMANN et al., 2002). O parasito no se

adere zona pelcida aps sucessivas lavagens, o que auxilia a eliminao do

N. caninum em bovinos (BIELANSKI, et al., 2002). Esta biotcnica de lavagem

41

dos embries ainda no foi utilizada em animais infectados com T. gondii at o

presente momento, alm disso, em ovinos ela nunca foi aplicada.

Em um estudo mais recente, a presena do agente de N. caninum no

lquido folicular e uterino foi testada em bovinos que apresentavam anticorpos

anti-N. caninum (SILVA et al., 2012). Os autores relataram alta frequncia do

DNA do parasito no aspirado folicular por puno in vivo dos ovrios (12/13),

enquanto que no lavado uterino e no sangue (leuccitos) a frequncia foi

inferior, representada por (4/12) e (5/13) animais, respectivamente. Estes

dados, segundo os pesquisadores, indicam a presena do parasito no folculo

ovariano e tero de vacas soropositivas para N. caninum e sugerem o risco de

transmisso do parasito durante a coleta de embries e transferncia (SILVA et

al., 2012). Com relao ao T. gondii no existe informao na literatura

consultada sobre a informao acima citada em nenhuma espcie.

2.6. Epidemiologia de Toxoplasma gondii em ovinos

Em ovinos a infeco pelo parasito de distribuio mundial (DUBEY,

2010) com estudos de prevalncia (Quadro 1) que variaram de 3% no

Paquisto (ZAKI, 1995) at 95,7% na Turquia (MOR & ARSLAN, 2007). Tal

variabilidade est ligada a diversos fatores como: padres culturais da

populao, hbitos alimentares, idade, procedncia rural ou urbana, entre

outros (AMENDOEIRA, COSTA E SPALDING 1999).

42

Quadro 1. Levantamento epidemiolgico de toxoplasmose ovina em algumas regies do mundo segundo o local, frequncia, total de animais, tcnica diagnstica, autor e ano

Pas Prevalncia Autores Amostras % Tcnica Canad 3872 57.6 ELISA1 Waltner-toews et al., (1991) Paquisto 40 3 LAT2 Zaki (1995) Argentina 29 41.4 IFAT3 West et al., (1998) Frana 93 65.6 MAT4 Dumtre et al., (2006) Espanha 203 40.4 MAT Mainar-jaime e barbern (2007) Turquia 460 95.7 ELISA Mor e arslan (2007) Itlia 1170 28.5 ELISA Fusco et al., (2007) Mxico 351 29.1 ELISA Caballero-Ortega et al., (2008) USA 383 27,1 MAT Dubey et al., (2008b) Egito 300 43.7 MAT Shaapan et al., (2008) Finlndia 1940 24.6 DAT5 Jokelainen et al., (2010) Ir 156 21.1 MAT Raeghi et al., (2011) Ir 56 37.5 PCR6 Asgari et al., (2011) Grcia 1501 48.6 ELISA Tzanidakis et al., (2012) Etipia 1130 31.6 ELISA Gebremedhin et al., (2013) Tunsia (Norte) 166 1.8 ELISA Gharbi et al., (2013) Tunsia (Central) 184 19 ELISA Gharbi et al., (2013) Argentina 704 17.3 IFAT Hecker et al., (2013) Portugal 119 33.6 MAT Lopes et al., (2013b) Espanha 503 49.3 ELISA Garca-Bocanegra et al., (2013) Mxico 405 29.9 MAT Alvarado-Esquivel et al., (2013) Grcia 458 53.7 ELISA Anastacia et al., (2013)

LAT-teste de aglutinao em ltex, RIFI- Reao de imunofluorescncia indireta, MAT Teste de Aglutinao Modificado, PCR- Reao em Cadeia da Polimerase, DAT- Teste de Aglutinao Direta

No Brasil, anticorpos anti-T. gondii foram encontrados por meio da

sorologia em ovinos que apresentaram porcentagens variadas (Quadro 2)

desde 7% no Estado do Paran (MOURA et al., 2007) at 61% em uma

propriedade do Rio Grande do Sul (RS) (MARTINS et al, 1998). Na figura 6

esto apresentadas as regies pesquisadas at o presente momento quanto

sorologia de T. gondii em ovinos. Segundo o mapa dos estados brasileiros,

nota-se uma carncia de pesquisa sorolgica em algumas regies,

principalmente naquelas que juntas possuem 80% do efetivo ovino brasileiro,

43

representadas pelas regies do Nordeste e Sul, com aproximadamente 10 e 5

milhes ovinos, respectivamente.

Quadro 2. Levantamento epidemiolgico de toxoplasmose ovina em algumas regies brasileiras segundo o local, frequncia, total de animais, tcnica diagnstica, autor e ano

BRASIL Prevalncia

Autores Amostra % Tcnica

Rio Grande do Sul 100 39 RSF1 Larsson et al., (1980) Rio Grande do Sul 18 DAT2 Zonta et al., (1988) Paran 370 47.8 IFAT3 Freire et al., (1995) Rio Grande do Sul 144 21-61 LAT4 Martins et al., (1998) Bahia 240 18.8 LAT Gondim et al., (1999) Paran 228 51.8 IFAT Garcia et al., (1999) Pernambuco 173 35.3 IFAT Silva et al., (2003) So Paulo 200 31 ELISA Meireles et al., (2003) So Paulo 597 34.7 IFAT Figliuolo et al., (2004) Rio Grande do Sul 87 44.8 IFAT Silva e de la rue (2006) Paran 157 7 IFAT Moura et al., (2007) Paran 305 51.5 IFAT Romanelli et al., (2007) Rio Grande do Norte 102 29.41 ELISA Clementino et al., (2007) So Paulo 495 24.2 MAT Ragozo et al., (2008) Rio Grande do Norte 409 20.7 IFAT Soraes et al., (2009) Distrito Federal 1028 38.2 IFAT Ueno et al., (2009) Paran 167 25.76 ELISA Soccol et al., (2009) Rio de Janeiro 112 44.64 MAT Silva et al., (2010) Par 350 44.29 HAI5 Braga-filho et al., (2010) Minas Gerais 155 46.5 IFAT Rossi et al., (2011) Pernambuco 124 48.4 IFAT Bispo et al., (2011) Rio de Janeiro 360 38 IFAT Luciano et al., (2011) Pernambuco 95 16.9 IFAT Pereira et al., (2012) Santa Catarina 360 56.9 IFAT Sakata et al., (2012) Esprito Santo 236 38.5 HAI Tesolini et al., (2012) Rio Grande do Norte 930 22.1 ELISA Andrade et al., (2013) Sergipe 932 28.2 IFAT Mendona et al., (2013) Bahia 795 30.2 IFAT Guimares et al., (2013)

LAT-teste de aglutinao em ltex, RSF Reao de Sabin- Feldman, RIFI- Reao de imunofluorescncia indireta, DAT Teste de Hemaglutinao direta, HAI - Teste de Hemaglutinao indireta

44

Figura 6. Mapa do Brasil demostrando a soropositividade de Toxoplasma gondii em ovinos nos respectivos estados

A disparidade de resultados sorolgicos da infeco por T. gondii em

ovinos dentre diferentes regies do mesmo pas ou entre pases se deve

principalmente aos diferentes mtodos sorolgicos empregados no diagnstico,

como o MAT (RAGOZO et al., 2008; SILVA et al., 2010; RAEGHI et al., 2011),

ELISA (SOCCOL et al., 2009), RIFI (PEREIRA et al., 2012), DAT

(JOKELAINEM et al., 2010) dentre outros.

45

A presena de gatos nas fazendas ou propriedades de ovinos o outro

fator que interfere na infeco por T. gondii, pois uma importante fonte de

transmisso (MARTINS et al., 1998).

A alta porcentagem de ovinos soropositivos para T. gondii em algumas

regies, poderia ser explicada pela convivncia entre gatos, roedores e ovinos

num mesmo ambiente (SILVA et al., 2003). Os ovinos ainda possuem um

agravante pois se alimentam de pastagens e gramneas que podem estar

contaminadas por oocistos infectantes (FRENKEL et al., 1975; SILVA et al.,

2003).

A faixa etria de ovinos um fator que interfere na soropositividade para

T. gondii. Um estudo conduzido no Estado do RJ sugere que a soropositividade

aumenta com a idade dos ovinos, pois os animais adultos, passam mais tempo

em contato com as possveis vias de transmisso do T. gondii, resultando em

maior chance de se infectarem (LUCIANO et al., 2011).

2.7. Sintomatologia de Toxoplasma gondii em ovinos

A manifestao dos sinais clnicos da toxoplasmose no homem assim

como em outros animais depende, principalmente, da resposta imune do

hospedeiro infectado e da virulncia da amostra de T. gondii (AMENDOEIRA

et. al., 1999). De acordo com Millar et al., (2008) os animais de produo como

46

os ovinos so mais sensveis infeco quando comparados a outras

espcies.

Os ovinos infectados por T. gondii, so clinicamente assintomticos,

contudo, ovelhas imunocomprometidas que adquirem a infeco durante a

gestao, podem desenvolver distrbios reprodutivos. A infeco toxoplsmica

uma das principais causas de morte fetal, mumificao, natimortalidade,

abortos ou nascimentos de animais debilitados (DUBEY, 1990a). Os carneiros

que nascem de uma matriz infectada por toxoplasmose nascem fracos e

debilitados (GUTIERREZ et al., 2010).

O abortamento em ovinos, vem sendo estudado por diversos

pesquisadores e diferentes regies do mundo (VAN DEN BROM et al., 2012)

como uma das principais sintomatologias da infeco por T. gondii. Alm disso,

o abortamento a causa primria de perdas econmicas na pecuria industrial

de ovinos devido alta prevalncia da infeco pelo parasito (MORENO et al.,

2012).

Na Holanda, pesquisou-se em 282 fetos ovinos abortados a infeco

pelo agente de T. gondii como causa do abortamento e encontrou-se 48% dos

fetos o parasito. Alm disso, evidenciou-se em 12% das placentas analisadas,

placentite, indicando a causa do abortamento (VAN DEN BROM et al., 2012).

Na Espanha, 74 fetos oriundos de abortamento foram avaliados pela

histopatologia e PCR e observou-se que em pelo menos uma tcnica de

47

diagnstico a causa primria do abortamento era pela infeco por T. gondii, o

que representou 15% (11/74) (MORENO et al., 2012).

2.8. Mtodos de diagnstico

O diagnstico para T. gondii pode ser feito por meio de testes

sorolgicos, biolgicos, moleculares e mtodos histolgicos e/ou imuno-

histoqumicos, ou uma combinao destes mtodos (DUBEY, 2010).

Os mtodos de diagnstico so classificados como indiretos e diretos

com utilidade e significados variados. Os mtodos diretos tem como objetivo

demonstrar a presena do T. gondii nos tecidos, excrees ou fluidos corporais

(VELARDE et al., 2009). Enquanto que, o diagnstico indireto geralmente

estabelecido por meio da pesquisa de anticorpos anti-T. gondii no soro dos

animais (RAGOZO et al., 2008; SOCCOL et al., 2009; SILVA et al., 2010;

RAEGHI et al., 2011; PEREIRA et al., 2012). As alteraes em exames

hematolgicos e bioqumicos tambm podem mostrar evidencias de que o

animal esteja infectado por T. gondii (SILVA et al., 2011).

2.8.1. Testes sorolgicos

Para o estabelecimento de um inqurito sorolgico de T. gondii, os

testes sorolgicos so fundamentais, pois ser relatada a situao real e o

48

grau da infeco toxoplsmica dos animais estudados (THURMOND e

HIETALA, 1995; BRAGA-FILHO et al., 2010). Alm disso, variados so os

testes sorolgicos que podem ser usados, tanto para deteco de anticorpos

IgG como para IgM (RAGOZO et al., 2008; SOCCOL et al., 2009; SILVA et al.,

2010; RAEGHI et al., 2011; PEREIRA et al., 2012).

O Teste de Aglutinao Modificado (MAT) tem sido amplamente utilizado

para o diagnstico da toxoplasmose em animais e humanos, pois detecta

anticorpos IgG (DUBEY, 2008a; 2010). Na espcie ovina, o teste vem sendo

usado na Frana (DUMTRE et al., 2006), na Espanha (MAINAR-JAIME e

BARBERN 2007), no Egito (SHAAPAN et al., 2008), nos Estados Unidos

(DUBEY et al., 2008b), no Iran (RAEGUI et al., 2011), no Brasil (SILVA et al.,

2012a), dentre outros pases.

Para que o MAT possa detectar com acurcia a presena de anticorpos

anti-T. gondii em ovinos, foi estabelecido um ponto de corte ideal (cut-off ) da

titulao. De acordo com estudos prvios em ovinos a melhor titulao a 1:25

(SOUSA et al., 2009; SILVA et al., 2012a).

O Teste de aglutinao em ltex (LAT) foi descrito por Gondim et al.,

(1999), a Reao de Sabin- Feldman (RSF) por Larsson et al., (1982) e a

Reao de imunofluorescncia indireta (RIFI) por diversos autores (FREIRE et

al., 1995; SILVA et al., 2003; CAVALCANTE et al., 2004; FIGLIUOLO et al.,

2004; SILVA e DE LA RUE 2006; FARIA et al., 2007; ROMANELLI et al., 2007;

SORAES et al., 2009; UENO et al., 2009)

49

2.8.2. Hematologia e bioqumica srica

Estudos do perfil hematolgico e bioqumico de animais infectados

naturalmente ou experimentalmente so restritos a ovinos (SILVA et al.,

2011a), bovinos (OLIVEIRA et al., 2001a), coelhos (MUNHOZ et al., 2002),

ces (ABREU et al., 2001), felinos (ADVINCULA, LEWIDA e CABANACAN-

SALIBAY, 2010), humanos (TIWARII, ROLLAND e POOPLE 1982) e

marsupiais (HERMOSILLA et al., 2010).

Grupos de ovinos infectados naturalmente por T. gondii e no infectados

foram submetidos a testes de hematologia e bioqumica srica, e observou-se

que o parasitismo crnico influencia os parmetros hematolgicos e

bioqumicos destes animais infectados. Alm disso, presena de linfopenia,

neutrofilia e uma diminuio dos valores de ALT so parmetros que poderiam

ser usados para procurar por evidncias adicionais de infeco pelo T. gondii

em ovinos (SILVA et al., 2011a). Oliveira et al., (2001b) avaliaram espcies de

B. indicus, B. tauros e B. bubalis infectados experimentalmente com

toxoplasmose e observaram diminuio significativa de leuccitos em B.

bubalis e linfcitos em B. indicus (P

50

permanecendo at o final do experimento. O ALT foi semelhante, porm aps o

aumento houve diminuio em um dos grupos infectados (MUNHOZ et al.,

2002).

Caninos experimentalmente infectados por toxoplasmose tambm foram

avaliados pela hematologia. Segundo os autores as alteraes hematolgicas

observadas foram: leucocitose em um animal, leucopenia em trs animais e

linfopenia em um animal (ABREU et al., 2001). No perfil bioqumico destes

ces, a protena total, albumina e glicose foram s nicas alteradas em todos

os animais. Outros pesquisadores relataram normalidade nestes parmetros

em gatos infectados naturalmente com toxoplasmose, contudo, no hemograma

destes felinos os valores dos neutrfilos tiveram aumento significativo

(ADVINCULA et. al., 2010).

2.8.3. Diagnstico molecular

O primeiro relato da deteco do DNA de T. gondii foi realizado na

dcada de 80 (BURG et al., 1989), usando o gene B1. Tecidos como crebro,

msculo cardaco e esqueltico (ESTEBAN-REDONDO e INNES, 1998) e

sangue (SPALDING et al., 2003) podem ser utilizados para identificao do

parasito pela PCR.

Para extrao de DNA de T. gondii as amostras utilizadas para

identificao do parasito pela PCR, constam de tecido cerebral, tecido

51

muscular estriado cardaco e tecido muscular esqueltico (ESTEBAN-

REDONDO e INNES, 1998), sangue (SPALDING et al., 2003), smen (LOPES

et al., 2009, MORAES et al., 2010), tecido muscular estriado esqueltico

(MASON et al., 2010) e leite (CAMOSSI et al., 2011).

2.8.3.1. Reproduo animal

Estudos sobre a infeco de T. gondii em smen ou at mesmo testando

a via sexual de transmisso tem sido realizados desde 2009 (LOPES et al.,

2009, MORAES et al., 2010; LOPES et al., 2013).

Carneiros reprodutores (n=6) livres de doenas reprodutivas foram

testados para verificar a presena da parasitemia no smen e tecidos do

aparelho reprodutor pela PCR. Os carneiros foram divididos em dois grupos e

inoculados experimentalmente com oocistos e taquizotos de T. gondii em

diferentes concentraes (GI, 3 carneiros, 2.0x105 oocistos e GII, 3 carneiros,

1.0x106 taquizotos). O DNA de T. gondii foi amplificado com 194bp, utilizando

os primers 5_GGAACTGCATCCGTTCATGAG-3_ (B11) e

5_TCTTTAAAGCGTTCGTGGTC-3_ (B12). Toxoplasma gondii foi detectado

pela tcnica da PCR no smen dos carneiros, nos dias 11, 14, 21, 56, e 70

aps inoculao dos taquizotos e 14, 35, 42, 56 e 63 aps inoculao com

oocistos. Alm disso, foi possvel isolar o coccdeo no pool de tecidos

(testculos, epiddimo, vescula seminal e prstata) em dois dos carneiros (um

inoculado com oocisto e um com taquizoito) (LOPES, et al., 2009a).

52

Em um estudo realizado recentemente (MORAES et al., 2010b),

amostras de sangue foram coletadas de ovelhas aps a inseminao artificial

(IA) com smen de carneiro infectado experimentalmente com diferentes

concentraes de taquizotos (G1, n=15 (6.5x104), G2, n=15 (4.0x107), para

deteco de DNA de T. gondii por meio da PCR. As coletas sanguneas foram

realizadas nos dias 0, 7, 14, 21, 28, 35, 49, 63 e 123 aps a IA. Alm disso,

amostras de tecidos fetais (bao, crebro, cerebelo, cordo espinhal, corao,

diafragma, fgado e pulmo) e placenta das ovelhas, aps 150 dias de

gestao foram submetidos a extrao de DNA com o Kit (Qiagen DNeasy

Blood & Tissues Kit, Qiagen, Hilden, Germany), os primers utilizados foram

(Forward C1: 5_-TCTTTAAAGCGTTCGTGGTC-3_ Reverse N 1: 5_

GGAACTGCATCCGTTCATGAG-3) amplificando127pb. Todas as amostras

negativas e controles foram submetidos a nested-PCR, que amplificou 97 pb.

Os autores detectaram o DNA de T. gondii no sangue das ovelhas do G1 e G2,

em 14 de 15 (93.3%) aps 7 dias de infeco. Todos os rgos fetais e das

fmeas apresentaram DNA do parasito investigado. Os autores concluem que

a IA utilizando smen contaminado experimentalmente adicionado taquizotos

causa patologias reprodutivas durante as fases aguda e crnica da infeco

(MORAES et al., 2010b).

No mesmo ano (2010), os autores citados no estudo anterior (MORAES

et al., 2010c), testaram a infeco experimental via smen de T. gondii em

carneiros. As fmeas ovinas foram divididas em trs grupos e inseminadas com

smen contendo (G1 (n=15), 6.5x104 taquizotos, G2 (n=15), 4x107 taquizotos

e G3 (n=11) grupo controle, inseminado com smen livre de taquizotos. O

53

DNA de T. gondii foi detectado pela PCR seguido da PCR-nested em amostras

sanguneas nos dias 0, 7, 14, 21, 28, 49, 63 e 123 nas ovelhas aps a

inseminao artificial. O DNA de T. gondii foi detectado em 93.3% (28/30) das

ovelhas dos grupos 1 e 2, entre os dias 7 e 123 aps inseminao. No G3 no

foi detectado o DNA do parasito. Em concluso os autores sugerem a

possibilidade de infeco sexual natural em ovelhas inseminadas com smen

fresco contaminado experimentalmente com diferentes doses de taquizotos.

Moraes e colaboradores (2010c), tambm relataram a eliminao de T.

gondii no smen de carneiros naturalmente infectados pelo parasito, por meio

da PCR nested, amplificando 97pb. Os pesquisadores detectaram o DNA de T.

gondii em amostras seminais de 4/6 (66,6%) dos animais avaliados.

A avaliao do abortamento em ovinos causado pelo T. gondii foi

realizada em num total de 173 fetos ovinos abortados na Espanha. Para

deteco do parasito no crebro dos ovinos abortados utilizou-se a PCR-

nested que identificou o DNA de T. gondii em 12 fetos (7%; n=173). A tcnica

de diagnstico de acordo com os autores foi considerada de alta especificidade

e sensibilidade e concluram com os resultados que a toxoplasmose pode ser a

causa de aborto e perda neonatal em pequenos ruminantes na Espanha

(PEREIRA-BUENO et al., 2004).

54

2.8.3.2. Toxoplasma gondii no leite de ovelhas

A transmisso de T. gondii para humanos por meio da ingesto de leite

de ovelha contaminado pelo parasito j foi relatada como uma possvel via de

infeco importante (CAMOSSI et al., 2011).

Recentemente foi publicado um estudo com o leite de ovelhas infectadas

naturalmente por T. gondii. Um grupo de 20 ovelhas foram selecionadas para

pesquisa do parasito em 139 amostras de leite por meio da PCR e confirmado

pelo sequenciamento gentico. Para extrao do DNA utilizou-se um kit

comercial (PrepTM Cells e Tissue DNA, GE Healthcare) e os primers

pareados:TOX4 (CGCTGCAGGGAGGAAGACGAAAGTTG)/

TOX5 (CGCTGCAGACACAGTGCATCTGGATT). Amostras de leite positivas

para T. gondii foram detectadas em sete de 139 amostras analisadas, o que

sugere uma possvel via de transmisso para os humanos por meio do

consumo de leite cru (CAMOSSI et al., 2011).

2.8.3.3. Tecidos ovinos maternos e fetais

No Ir, amostras de crebro, lngua, fgado e tecido muscular foram

coletados de 56 ovinos e testados pela PCR para identificao de T. gondii.

Para realizao da PCR utilizou-se os primers externos GRA6-F1x (5-

ATTTGTGTTTCCGAGCAGGT-3) e GRA6-R1 (GCACCTTCGCTTGTGGTT)

amplificando 546 bp. Os primers internos foram GRA6-F1

55

(TTTCCGAGCAGGTGACCT) e GRA6-R1x (TCGCCGAAGAGTTGACATAG)

amplificando 351 bp. Na anlise pela PCR detectou-se DNA de T. gondii em 21

animais, mostrando uma alta prevalncia na regio estudada (ASGARI et al.,

2011).

Entretanto, de acordo com a literatura, as cepas de T. gondii so

geneticamente diferentes na Amrica do Sul (SILVA et al., 2011). Em

matadouros de ovinos em So Paulo, foi realizada coleta de amostras de

tecido ovino para identificao e genotipagem de T. gondii. Foram utilizados 11

marcadores genticos (SAG1, SAG2, SAG3, BTUB, GRA6, c22-8, c29-2, L358,

PK1, Apico e CS3). Dos animais soropositivos para T. gondii, 33.3% (22/66)

foram positivos pela PCR, alm disso, nove gentipos foram identificados

(SILVA et al., 2011c).

A PCR em tempo real foi utilizada para detectar DNA de T. gondii em

tecidos maternos e fetais de ovinos infectados experimentalmente pelo

parasito. Utilizou-se os primers: 5-CTGCAGGGAGGAAGACGAAAGTTG e 5-

CTGCAGACACAGTGCATCTGG ATT que amplificou 529pb. Todas amostras

avaliadas foram positivas (GUTIERREZ et al., 2010).

A tcnica de PCR foi usada para deteco de DNA de T. gondii em

cordeiros neonatos de at 4 meses, utilizando os microsatlites: B1, SAG1,

SAG2, SAG2 e SAG3. Dentre eles, a amplificao do gene B1 mostrou-se mais

sensvel que os demais, podendo ser usado para deteco do parasito em

cordeiros (MASON et al., 2010).

56

Na Frana amostras de tecidos de ovinos foram coletadas de ovinos

destinados ao abate em matadouro e submetidas ao diagnstico molecular

com cinco marcadores (TUB2, TgM-A, W35, B17 e B18) e todos exibiram a

ocorrncia do gentipo II do T. gondii (DUMETRE et al., 2006).

Alimentos a base de carne ovina foram analisados em mercados do

Reino Unido. Dos produtos alimentcios 27 amostras de um total de 71,

apresentaram o DNA de T. gondii (ASPINALL et al., 2002).

2.8.4. Exames Anatomo-histopatolgicos e Imuno-histoqumico 2.8.4.1. Macroscopia

Fetos abortados de ovinos devido a infeco por T. gondii, apresentam

leses macroscpicas classificadas como: feto de aparncia fresca, autolizado

e/ou mumificado. Leses necrticas so raras e aproximadamente em 70% dos

casos os abortamentos em ovinos ocorrem entre os 60-120 dias de gestao,

mas podendo ocorrer em qualquer momento (PEREIRA-BUENO et al., 2004).

Leses macroscpicas em feto ovino abortado em decorrncia da

infeco por T. gondii, podem ser representadas por focos plidos na superfcie

de corte do fgado, congesto com aspecto marmorizado nos pulmes, alm de

acentuada palidez no corao e grave congesto no crebro e cerebelo

(MOTTA et al., 2008).

57

A infeco toxoplsmica em ovinos, pode cursar tambm com placentite

necrtica e infeco do feto, especialmente do sistema nervoso central

(WEISMANN et al., 2003).

A idade do feto abortado pode ser mensurada pelo tamanho da cabea.

Um feto, por exemplo, que apresenta um tamanho de cabea de 4 cm de

largura tem aproximadamente 55 dias de gestao (SCHATTEN e

CONSTANTINESCU, 2007).

2.8.4.2. Histopatologia

Os cistos teciduais de T. gondii podem se desenvolver em tamanhos

variados (70-100 m) e serem visualizados em cortes histolgicos de rgos

viscerais como pulmo, fgado e rim, mas so mais facilmente encontrados no

tecido neural e muscular, incluindo crebro, olhos e msculo esqueltico e/ou

cardaco (DUBEY, 2010). Apesar dos cistos serem visualizados

microscopicamente nos tecidos de animais infectados, diversos pesquisadores

relataram a dificuldade em encontr-los por meio da histopatologia (OLIVEIRA,

COSTA e SABATINI, 2001b; MOTTA et al., 2008; SILVA et al., 2013).

Em tecidos de oito ovinos infectados experimentalmente com a cepa

GT-1 de T. gondii, observou-se aps 97-173 dias de inoculao, cistos

teciduais em 75% (6/8) dos tecidos hepticos e musculatura esqueltica e

cardaca; 62,5% (5/8) dos tecidos renais e 50% (4/8) dos tecidos cerebrais

avaliados (DUBEY, LINDSAY e SPEER, 1998). Esses dados demonstram que

58

apesar do tecido nervoso ser um tecido de escolha do parasito (DUBEY, 2010),

outros rgos tambm podem ser parasitados e at possurem maiores

chances de alojarem o parasito do que o crebro. O estudo apresentado

anteriormente demonstrou que a probabilidade de encontrar o parasito no

fgado ou no crebro, quatro vezes maior no primeiro.

No Rio Grande do Sul (RS) foram relatadas ao exame histopatolgico de

um feto ovino soropositivo para toxoplasmose, alteraes caracterizadas por

congesto grave no crebro, alm de reas de malcia com presena de

taquizotos. No pulmo, foram identificadas extensas reas de atelectasia,

pneumonia intersticial linfocitria, exsudato fibrinoso interalveolar. Congesto e

focos de necrose centrolobular foram relatados no fgado e no corao,

miocardite linfocitria focal (MOTTA et al., 2008).

Buxton (1990) relatou no crebro de ovinos gliose focal rodeada de

clulas necrticas e mineralizao, associadas com meningites e Mattos et al.,

(2009) observaram pequenas reas de infiltrado mononuclear no parnquima,

manguitos perivasculares e gliose em camundongos inoculados com cepas de

T. gondii. Pereira-Bueno et al., (2004) descreveram em fetos ovinos miocardite

no supurativa, encefalomielite no supurativa e hepatite multifocal intersticial.

No Rio de Janeiro, realizou-se um estudo com 26 ovinos soropositivos

para T. gondii destinados ao abate para consumo humano e observou-se no

exame histopatolgico dos rgos avaliados (corao, pulmo, rim, crebro,

fgado e diafragma) reas de congesto que variaram de leve a moderada,

alm de, infiltrado inflamatrio polimorfonuclear e infiltrado inflamatrio

59

mononuclear focal a multifocal. Alm disso, no foi possvel observar cistos

parasitrios de T. gondii nos tecidos avaliados (SILVA et al., 2013).

Em outras espcies, como os bovinos (Bos indicus, Bos taurus e

Bubalus bulalis) infectados experimentalmente com T. gondii leses foram

caracterizadas por esteatose e congesto heptica, congesto dos vasos

cerebrais, hiperplasia folicular e enterite crnica. Nestes cortes histolgicos,

no foram detectados cistos de T. gondii (OLIVEIRA, COSTA E SABATINI,

2001b).

Na histopatologia de coelhos infectados experimentalmente por T. gondii

observou-se degenerao vacuolar nos hepatcitos e um intenso infiltrado

inflamatrio predominantemente linfoctico, disperso por todo o parnquima em

volta dos vasos sanguneos (MUNHOZ et al., 2002). Outros autores

descreveram congesto e hepatite em ovinos (OKUDA et al., 2007; MOTTA et

al., 2008). Mattos et al., (2009) descrevem em camundongos reas de infiltrado

inflamatrio, proliferao de ductos biliares, clulas apresentando degenerao

vacuolar e necrose.

2.8.4.3. Imuno-histoqumica

A tcnica de IHC juntamente com o histrico clnico e patolgico permite

fazer um diagnstico definitivo da enfermidade na maioria dos casos estudados

(DAGLEISH, BENAVIDES e CHIANINI, 2010).

60

Ovinos infectados por T. gondii apresentam na IHC marcao para o

anticorpo anti-T. gondii em seces de fgado, corao e crebro. Nestes

rgos a marcao pode ser encontrada ao redor dos vasos sanguneos e em

alguns casos dentro deles e nas clulas parenquimatosas com formato

arredondado (SILVA et al., 2013a).

De acordo com alguns pesquisadores ao se realizar o MAT para

deteco de T. gondii em ovinos e constar que o animal tem uma titulao

>1:50, no necessrio escolher um rgo para se detectar T. gondii pela IHC,

pois a distribuio do parasito aleatria, contudo, se este animal apresentar

uma titulao 1:50, deve-se dar preferncia para o tecido cardaco para

identificao do parasito pela IHC, pois mostrou-se significativo a este rgo

(SILVA et al., 2013a).

O fgado parece ser um rgo de boa escolha para deteco de T.

gondii em ovinos pela IHC (SILVA et al., 2013a), assim como o crebro

(MOTTA et al., 2008), pulmo e corao (BENAVIDES et al., 2011).

2.8.4. Prova biolgica em camundongos

A prova biolgica em camundongos ou bioensaio, um dos principais

mtodos usados para detectar cistos de T. gondii em tecidos para confirmao

de casos suspeitos de infeco pelo parasito. considerado um teste

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diagnstico muito sensvel, porm muito oneroso, difcil e demorado (ROSA et

al., 2001; TSUTSUI et al., 2007).

2.9. Toxoplasmose em humanos

O agente de T. gondii foi isolado em humanos pela primeira vez por Wolf

et al., (1939). Desde ento, a infeco toxoplsmica foi considerada como a

mais cosmopolita de todas as zoonoses (SILVA et al, 2003) e a infeco varia

muito de regio para regio (DUBEY, 2010).

Pesquisas sobre a soropositividade de T. gondii j foi descrita em mais

de oitenta pases (DUBEY, 2010) com prevalncias que variaram de 4% na

Coreia do Sul (RYU et al, 1996) at 92% em mulheres gestantes, no Estado do

Mato Grosso na regio centro-oeste do Brasil (FIGUEIR-FILHO et al, 2005).

A maior fonte de infeco aos humanos o consumo de alimentos,

especialmente carne mal cozida de animais contendo cistos de bradizotos

(VILLENA et a., 2012). A ingesto destes cistos viveis, presentes na carne de

animais infectados, a via de transmisso mais importante para o ser humano.

Portanto, o conhecimento da ocorrncia da toxoplasmose em animais

destinados ao consumo humano de grande auxlio para a preveno dessa

zoonose (SOCCOL et al., 2009).

No Brasil, na cidade de Erechim-RS j foi citada como uma das cidades

de maior prevalncia da infeco por T. gondii em humanos (MARTINS et al.,

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1990; GLASNER et al., 1992, SILVEIRA et al., 2001). J no Paran um surto

de toxoplasmose aguda foi diagnosticado aps a ingesto de carne crua de

ovino por 17 pessoas em uma festa (BONAMETTI et al, 1997). Estes estudos

demonstram a importncia do parasito, pois a carne ovina consumida em

diversas regies do Brasil e do mundo, o que configura um risco a populao

uma vez que se trata de uma zoonose.

2.10. Medidas de controle e profilaxia

O diagnstico por meio de testes laboratoriais, quando rpido e

confivel uma medida de controle, pois confirma a infeco por toxoplasmose

no rebanho e pode ser implementado para reduzir o impacto da infeco para

proteger a viabilidade econmica dos rebanhos (GUTIRREZ et al., 2010).

Um estudo conduzido nos EUA no incio da dcada de 90 com sunos

revelou que ao afastar os felinos do contato direto com os animais diminuram

as chances de infeco por T. gondii (DUBEY et al., 1995). Neste sentido, o

controle na populao de gatos e principalmente testes sorolgicos da infeco

se faz necessria para evitar surtos de toxoplasmose transmitidos pelo contato

direto com estes animais (BENENSON et al., 1982). Melhorias nas tcnicas de

criao de ovinos, podem reduzir as vias de transmisso por T. gondii nos

rebanhos (LUCIANO, et al., 2011)

63

At o presente momento se considera nula a possibilidade de

erradicao da toxoplasmose em um hospedeiro infectado, principalmente pelo

fato do organismo ser intracelular obrigatrio e que rapidamente se encista, o

que dificulta a entrada das drogas antiparasitrias (VELARDE et al., 2009).

Existe no mercado uma vacina viva menos cistognica para ovinos que reduz

as taxas de mortalidade neonatal (BUXTON e INNES, 1995; WILKINS e

OCONNEL, 1983).

Para sade pblica o diagnstico do parasito em carnes destinadas ao

abate de suma importncia, pois o cozimento insuficiente destes alimentos

uma fonte de infeco para os humanos (DE BRITO et al., 2002). Neste

sentido, a congelao da carne em um freezer domstico por no mnimo uma

noite, antes do consumo animal e/ou humano, parece ser um mtodo fcil e

econmico para reduzir as chances de transmisso de T. gondii pela carne

(DUBEY, 2008a).

muito importante que mdicos, veterinrios e pessoas que trabalham

na rea de sade e meio ambiente colaborem para o desenvolvimento de

estratgias de controle, desenvolvendo novas terapias e vacinas eficazes para

o controle da infeco de T. gondii em animais e principalmente nos gatos

(INNES, 2010). Programas de educao e sade pblica, alm de orientaes

so fundamentais para o controle da enfermidade (FOULON, 1992).

Desinfetantes podem ser usados para a destruio de oocistos de T.

gondii, porm so poucas as opes, como o etanol + cido actico

(concentrao de 95% / 5% por 24 hs), hidrxido de amnia (5% por 30 min)

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(DUBEY, MILLER e FRENKEL, 1970). Outra maneira de destruir os oocisto o

processamento a alta presso (LINDSAY et al., 2008).

Apesar de alguns mistrios sobre a transmisso do T. gondii j terem

sido resolvidos, no se pode esquecer que a preveno da eliminao de

oocistos pelo gato de rua'' no nada fcil (DUBEY, 2009). Cabe ressaltar,

que deve ser realizada uma conscientizao por parte da populao para que

haja um controle mais eficaz da infeco por T. gondii.

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______________________CAPTULO 1___________________

Isolamento de Toxoplasma gondii em tecidos de ovinos destinados ao abate

A