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ANDREZA FABIANA BEGNAMI
Propriedades antinociceptiva, antiedematogênica
e antiulcerogênica da fração acetato de etila das
folhas de Coriandrum sativum L
Piracicaba
2018
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE PIRACICABA
Faculdade de Odontologia de Piracicaba
ANDREZA FABIANA BEGNAMI
Propriedades antinociceptiva, antiedematogênica
e antiulcerogênica da fração acetato de etila das
folhas de Coriandrum sativum L
Tese apresentada à Faculdade de Odontologia de
Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas como
parte dos requisitos exigidos para a obtenção do titulo de
Doutora em Odontologia na Área de Farmacologia,
Anestesiologia e Terapêutica.
Orientador: Prof. Dr. Francisco Carlos Groppo
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE Á VERSÃO
FINAL DA TESE DEFENDIDA PELO ALUNO
ANDREZA FABIANA BEGNAMI ORIENTADA
PELO PROF. DR.FRANCISCO CARLOS
GROPPO.
Piracicaba
2018
“ Você não sabe o quanto eu caminhei
Pra chegar até aqui
Percorri milhas e milhas antes de dormir
Eu não cochilei
Os mais belos montes escalei
Nas noites escuras de
frio chorei, ei , ei
Ei ei ei..uu
Com a fé no dia-a-dia
Encontrar solução
Encontrei a solução....”
A Estrada - Cidade Negra
AGRADECIMENTOS
À Faculdade de Odontologia da Universidade Estadual de Campinas
(FOP/UNICAMP) na pessoa de seu diretor, Prof. Dr. Guilherme Elias Pessanha
Henriques, pela grande oportunidade de realizar este trabalho. À Coordenadoria do
Pós-graduação, representada pela Profa. Dra. Cinthia Pereira Machado Tabchoury e
à equipe de professores adjuntos por viabilizarem a realização da pós-graduação.
A Dra Vera G. Rehder pela orientação inicial e a toda equipe do CPQBA
(Centro Pluridisciplinar de Pesquisa Biológica e Agrária) pelo companheirismo ao
longo dessa jornada.
À Coordenadoria do Programa de Pós-graduação em Odontologia,
representada pelo Prof. Dr. Marcelo de Castro Meneghim e à equipe de professores
adjuntos por viabilizarem a realização da pós-graduação.
Ao Prof. Dr. Francisco Carlos Groppo, onde sou muita grata pela atitude
nobre em me acolher como orientanda e acreditar em mim quando ninguém mais
acreditava nesse trabalho. Agradeço também pela orientação, paciência,
disponibilidade e apoio constante durante a pesquisa.
À minha mãe Januária Silva Bueno Begnami por ser um exemplo de mulher
em minha vida me motivando a nunca desistir de meus sonhos mesmo em situações
adversas. A meu pai José Arnaldo Begnami por me guiar sempre pelas atitudes éticas,
morais e honestas, mas acima de tudo sempre com a doçura fraternal. Ao meu irmão
Arnaldo Begnami agradeço pela serenidade, pelos conselhos e por sempre acreditar
em mim. À minha filha Natalia Begnami Muller, a razão de minha eterna luta nesse
mundo almejando sempre alcançar o melhor e me motivando a sempre buscar o meu
sonho. E ao Cristiano Rodrigo de Queiroz agradeço pelo ininterrupto apoio tanto nos
momentos de alegria quanto nas dificuldades durante essa longa jornada.
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior- Brasil (CAPES) – Código de
Financiamento 001.
RESUMO
Coriandrum sativum Linn. (Apiaceae/Umbelliferae), popularmente
conhecido como coentro, é usado tradicionalmente para tratar reumatismo, dor nas
articulações, distúrbios gastrointestinais e ansiedade. Este trabalho avaliou as
propriedades antinociceptivas, anti-edema e antiulcerogênica da fração de acetato de
etila (FAc) das folhas de C. Sativum. Atráves de metódos cromatográficos foi possivel
a separação, identificação e quatificação da Fac, a qual apresentou em sua
constituição di-hidrocoriandrina (34,5%), coriandrina (14,4%), além de vitamina E
(4,6%) e estigmasterol (7,9%). No teste de campo aberto, a FAc na dose de 30 mg/kg
(i.p.) não afetou a atividade locomotora do animal, mas as doses de 100 e 300 mg/kg
diminuiram essa atividade. O teste de contorção abdominal induzida por ácido acético
mostrou que a FAc (30,100 e 300 mg/kg, i.p.) reduziu o número de contorções
abdominais. Houve redução da dor (teste de formalina) de origem neurogênica (fase
I) e inflamatória (fase II) para as doses 30 e 100 mg/kg de FAc (i.p.). A administração
de 30 e 100 mg/kg de FAc (i.p.) reduziu significativamente o edema (teste de edema
da pata induzido por carragenina) na fase inicial (até 6 horas). O tempo de reação à
injecção de capsaicina foi significativamente diminuído pela morfina (20 mg/kg/i.p.) e
pela FAc nas concentrações (i.p.) de 30,100 e 300 mg/kg. O teste de ulcera gástrica
induzida por etanol mostrou atividade antiulcerogênica da FAc somente na maior
concentração (300 mg/kg/v.o.), sugerindo possível citoproteção para a mucosa
gástrica. Nessa dose, também apresentou atividade anti-secretora semelhante à
cimetidina (100 mg/kg/v.o.), reduzindo o volume de secreção gástrica, mas sem alterar
a concentração hidrogeniônica dessa secreção. Foi possível concluir que a FAc
apresentou propriedades antinociceptiva, anti-edema, antiulcerogênica e anti-
inflamatórias e pode ser considerada um agente fitoterápico com potencial para
aplicação em clínica.
Palavras-Chave: Coriandrum sativum. Coentro. Dor. Edema. Úlcera gástrica.
ABSTRACT
Coriandrum sativum Linn. (Apiaceae/Umbelliferae) is popularly known as
coriander and it is traditionally used to treat rheumatism, joint pain, gastrointestinal
disorders and anxiety. This study assessed antinociceptive, anti-edema and
antiulcerogenic properties of the ethyl acetate fraction (FAc) of C. sativum leaves.
Through chromatographic methods it was possible to separate, identify and quantify of
FAc, that was constituted by dihydrocoriandrin (34.5%), coriandrin (14.4%), vitamin E
(4.6%), and stigmasterol (7.9%). In the open field test, 30 mg/kg/i.p. FAc did not affect
the locomotor activity of animals, but 100 and 300 mg/kg doses decreased the activity.
The writhing test induced by acetic acid showed FAc (30,100 and 300 mg/kg, i.p.)
reducing the number of abdominal contortions. In the formalin test, both neurogenic
(phase I) and inflammatory (phase II) pain were reduced by FAc 30 and 100 mg/kg
(i.p.). These concentrations also reduced significantly the swelling (carrageenan-
induced paw edema test) in the initial phase (up to 6 hours). The time of reaction to
the capsaicin injection was significantly reduced by morphine (20 mg/kg/i.p.) and by
30,100 and 300 mg/kg/i.p. FAc. The gastric-ulcer induced by ethanol assay showed
the antiulcerogenic activity of FAc only at the highest concentration (300 mg/kg/v.o.),
suggesting a possible citoprotection of the gastric mucosa. At this dose, it also
presented anti-secretive activity, which was similar to the 100 mg/kg/v.o. cimetidine
activity, reducing the volume of gastric secretion, but without changing the
concentration in this secretion. It was possible to conclude that FAc presented
antinociceptive, antiulcerogenic, anti-inflammatory and anti-edema activities, and it
could be considered a potential phytotherapeutic agent.
Key-words: Coriandrum sativum. Coriander. Pain. Swelling. Stomach ulcer.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 12
2 REVISÃO DA LITERATURA 13
2.1 Coriandrum sativum 13
2.2 Histórico e Medicina tradicional 13
2.3 Aspecto Nutricional 16
2.4 Atividades Anti-inflamatória, Antinociceptiva e Gastroprotetora 16
2.5 Aspectos Fitoquimicos 19
2.5.1 Cumarinas e furanocumarinas lineares 19
2.5.2 Furanocumarinas e Atividades Biológicas 21
2.5.3 Sistema Nervoso Central e Atividade Antioxidante de C. sativum 23
3 PROPOSIÇÃO 25
4 MATERIAL E MÉTODOS 26
4.1 Ensaios Fitoquímicos 26
4.1.1 Solventes e Reagentes 26
4.1.2 Equipamentos 26
4.1.3 Material vegetal 26
4.1.4 Extração 27
4.2 Métodos de Separaçâo 28
4.2.1 Cromatografia em Coluna Clássica 28
4.2.2 Cromatografia Partição líquido-líquido 29
4.2.3 Cromatografia em Coluna Seca 30
4.2.4 Cromatografia em Coluna Filtrante 30
4.2.5 Cromatografia em Camada Delgada 30
4.3 Métodos de Identificação 31
4.3.1 Análise por Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas 31
4.3.2 Análise por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada a Detetor de
Arranjo de Diodo e de massas CLAE-DAD-EM
31
4.4 Ensaios Farmacológicos In Vivo 32
4.4.1 Material e Métodos 32
4.4.2 Fármacos e reagentes 32
4.4.3 Animais 32
4.4.4 Avaliação de toxicidade aguda (Screening Hipocrático) 33
4.5 Atividades Antinociceptiva e Anti-Inflamatória 34
4.5.1 Avaliação da Atividade locomotora 34
4.5.2 Teste de contorções abdominais induzidas por ácido acético 35
4.5.3 Teste de Formalina 35
4.5.4 Teste de Edema de pata induzido por carragenina 36
4.5.5 Teste de Capsaicina 36
4.6 Atividade Antiulcerogênica 36
4.6.1 Testes de lesão gástrica induzida por etanol absoluto 37
4.6.2 Estudo da participação da prostaglandina na citoproteção gástrica 38
4.6.3 Estudo da participação das substâncias sulfidrílicas não protéicas na
citoproteção gástrica
38
4.6.4 Estudo da atividade anti-secretora 39
4.7 Análise dos Dados 40
5 RESULTADOS 40
5.1 Fitoquímica 40
5.1.1 Obtenção dos Extratos ED e EE 41
5.1.2 Partição líquido- líquido 43
5.1.2.1 Fracionamento da FHA em coluna cromatográfica seca 43
5.1.2.2 Obtenção da Fração Acetato de Etila (FAc) por Cromatografia em
Coluna Filtrante
43
5.1.2.3 Análise por Cromatografia Liquida de Alta Eficiência acoplada aos
detectores de Arranjo de Diodos e Massas
44
5.2 Ensaios Farmacológicos In Vivo 47
5.2.1 Teste de toxicidade aguda (Screening Hipocrático) 47
5.2.2 Avaliação da atividade locomotora 47
5.2.3 Contorções abdominais induzidas por ácido acético 48
5.2.4 Teste de Formalina 50
5.2.5 Edema de pata induzido por carragenina 52
5.2.6 Teste de Capsaicina 53
5.3 Atividade Antiulcerogênica 54
5.3.1 Lesão Gástrica induzida por Etanol 54
5.3.2 Prostaglandina e citoproteção gástrica 55
5.3.3 Substâncias sulfidrílicas não protéicas e citoproteção gástrica 56
5.3.4 Atividade Antisecretora 57
6 DISCUSSÃO 59
7 CONCLUSÃO 68
REFERÊNCIAS 70
APÊNDICE 1 - ETAPAS DAS DIFERENTES FORMAS DE FRACIONAMENTO
DO ED
84
ANEXOS 85
Anexo 1 – Comissão de Ética no Uso de Animais 85
Anexo 2 – Comissão de Ética no Uso de Animais 86
12
1 INTRODUÇÃO
O uso medicinal de plantas tem sido relatado em registros da história da
humanidade como no Papiro de Ebers (3330-2600 a.C), uma compilação de
prescrições contemplando mais de 480 substâncias naturais (Ody, 1995). Nele se
destaca o coentro (Coriandrum sativum L.), uma planta milenar também mencionada
em escritos sânscritos e nos tratados médicos da Idade Média, para o tratamento de
diversas patologias (Pedrosa et al., 1984).
O Coriandrum sativum L. (C. sativum) pertence à família Apiaceae
(Umbelliferae), oriundo nos cerrados áridos do mediterrâneo sendo introduzido na
Europa setentrional pelo Império Romano (Laws, 2013). As folhas frescas e os frutos
secos (erroneamente denominados de sementes) são comumente utilizados na
culinária tradicional de alguns países devido seu sabor e aroma ímpar, além de ser
amplamente empregado na medicina popular como diurético, carminativo, anti-
inflamatório, antidiabético, analgésico e sedativo (Bhattachacharjee, 2001).
Estudos químicos demonstraram a presença de diversos constituintes no
C. sativum, tais como acineol, borneol, cimene, limoneno, ácido linoléico, flavonóides,
carotenos, mircene, ácido palmítico, e β-pineno, sitosterol e estigmasterol (Dias,
2011). Dentre esses estudos destacaram-se as furanocumarinas coriandrina e dihidro
coriandrina que possuem estrutura química semelhante ao psoraleno; coriandronas A
e B isoladas de extratos etereos de folhas de C. sativum (Baba et al., 1991);
coriandronas C, D e E isoladas a partir de extratos metanolicos das folhas de C.
sativum (Taniguchi et al., 1996).
A maior parte dos estudos farmacológicos sobre as diferentes propriedades
do C. sativum utilizou as sementes ou frutos secos da planta para obter os extratos
relatando a atividade anti-inflamatória, antinociceptiva e antiulcerogênica de extratos
brutos, no entanto nenhum demostrou a possível atividade simultânea das folhas de
C. sativum frente esses parâmetros.
Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar as propriedades antinociceptiva,
anti-edema e antiulcerogênica de uma fração de acetato de etila (FAc) do extrato
diclorometânico das folhas de C. sativum.
13
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Coriandrum sativum
O Coriandrum sativum Linn. pertence à família Apiaceae/Umbeliiferacea,
popularmente conhecido como coentro, é uma planta herbácea anual que alcança até
um metro de altura. Tem folhas fendidas (Figura 1A), semelhantes às da salsa, com
flores brancas e levemente rosadas, sendo que seus frutos (erroneamente
denominado de sementes) são arredondados (Figura 1B), medindo de 3 a 5 mm de
diâmetro. Apresentam coloração marrom quando maduros e exalam forte odor,
lembrando o cheiro do percevejo. Por essa razão, é denominado popularmente como
erva-de-percevejo (Bhattachacharjee, 2001).
1A
1B
Figura 1 - (1A) Foto ilustrativa da planta e (1B) frutos do Coriandrum sativum Linn
2.2 Histórico e Medicina tradicional
A partir de literatura antiga e relatos dos achados arqueobotânicos
formulou-se a hipótese de que a cultura de C. sativum originou no Oriente Médio,
região próxima ao Mediterrâneo e a partir desse ponto ocorreram várias distribuições
originando outras espécies da tribo Coriandreae, fato esse evidenciado a partir de
achados de antigas sementes localizados na caverna Nahal Hemar, em Israel em
6000 a.C (Camargo, 1976).
14
No uso cotidiano, as folhas frescas de C. sativum são utilizadas como
guarnição e enfeites de alguns pratos típicos da cozinha internacional (Leung, 1980),
muito apreciado principalmente em peixes, frutos do mar, sopas e também em
produção de vinhos devido ao aroma ímpar (Ceska et al., 1988).
Os frutos secos e moídos são empregados amplamente em cozinhas
internacionais na China, Sudeste da Ásia, Índia, América do Sul e Central, constituindo
um dos ingredientes do curry (juntamente com mais 30 especiarias) como as
sementes de gengibre, pimenta dedo de moça, canela, pimenta do reino, cardamomo,
cravo da índia, cúrcuma, entre outros (Chen et al., 2009) sendo também empregado
na produção de refrescos, tônicos, diuréticos e afrodisíacos (Mani et al., 2009).
Na medicina tradicional é descrito que a semente fresca de C. sativum deve
ser deixada de molho em vinho ou em vinagre durante uma noite, e no outro dia seca
(para a remoção dos compostos químicos responsáveis por causar tonturas) e
posteriormente mastigadas como remédio para a halitose (Diederichsen, 1996).
A apreciação do cheiro característico do C. sativum trata-se de uma
preferência cultural associada a presença de compostos aldeídico do óleo essencial
da planta verde, o qual após amadurecimento a concentração diminui ou são
eliminados passando a ser caracterizado por um fresco e sabor agradável, empregado
extensivamente em bebidas, cigarros, bolos e perfumes devido o aroma adocicado
(Rajeshwari e Andallu 2011).
Na medicina popular o C. sativum esteve presente há séculos utilizado na
dieta alimentar até como medicamento para tratamentos de várias patologias, lesões,
sendo as folhas empregadas na forma de infusão como carminativo, tratamento de
desordens intestinais, antiespasmódico, expectorante, cólicas abdominais; e
externamente na forma de pomada para tratamento de reumatismo, artrite (Leung,
1980; Ceska et al., 1988). Enquanto as decocção e tinturas das sementes são
empregadas para tratamentos de convulsão, insônia, ansiedade, problemas
gastrointestinais (Grieve, 1971) sendo também matéria-prima para preparações
laxativas (Leung, 1980).
Na medicina tradicional do Irã o suco ou chá das folhas frescas, ou o pó
das sementes moídas são utilizadas para auxiliar em desordens do Sistema Nervoso
Central (SNC) como: ansiedade, insônia, irritabilidade, depressão, sintomas de
15
excesso de nervosismo (Emamghoreishi e Heidari- Hamedani, 2006) usualmente (30
g) em uma única dose antes de dormir (Emamghoreishi et al., 2005).
Rajeshwari e Andallu (2011) mencionaram a presença de ferro, vitaminas
A e C, além da ação antibacteriana, antifúngica, antioxidante, anti-inflamatória do óleo
essencial de C. sativum, sugerindo que todos esses constituintes contribuem para
estimular e fortalecer o sistema imunológico, auxiliar na prevenção e cura de
patologias como a varíola, além de reduzir a dor e acalmar os efeitos da varíola em
pacientes.
A partir do uso milenar muitas pesquisas foram direcionadas com o objetivo
de validar cientificamente o emprego do C. sativum levando em consideração o uso
tradicional e seu potencial farmacológico. Alguns estudos foram conduzidos utilizando
sementes e folhas, em diferentes tipos de extrações originando extratos com
diferentes polaridade e atividade farmacológica, conforme Tabela 1.
Tabela 1 - Atividades farmacológicas de C. sativum nas citações na literatura
Extrato aquoso das sementes (EAS), Extrato etanolico das sementes (EES), Extrato aquoso das folhas (EAF), Extrato hidroalcoólico das sementes (EHS), Extrato metanólico das sementes (EMS), Extrato hidroalcólico das folhas (EHF), Óleo das sementes (OES), Óleo das folhas (OEF).
Atividades Amostra Partes da planta Referências
Antifúngico OEF Folhas Begnami et al., 2010
Anti-helmíntico EAS, EHS Sementes e folhas Eguale et al., 2007
Ansiolítico EAS Sementes Emamghoreishi et al., 2005
Ansiolítico EAF Folhas Latha et al., 2015
Ansiolítico EHS Sementes Mahendra e Bisht, 2011
Anti-acne, caspa EAS Sementes Sathishkumar, 2016
Anti-convulsivante EAS Sementes Emamghoreishi
e Heidari- Hamedani, 2008
Anti-enxaqueca EHS Sementes Kasmaei et al., 2016
Antihiperglicemiante EAS Sementes Gray e Flatt, 1999
Antihipertensivo/ diurético EAS Sementes Jabeen et al., 2009
Antimicrobiano OEF Folhas Matasyoh et al., 2009
Antioxidante EAF, EAS Sementes e folhas Wangensteen et al., 2004
Cardioprotetor SEM Sementes Patel et al., 2012a
Diurético EAS Sementes Aissaoui et al., 2008
Estresse Oxidativo Cerebral EHS Sementes Velaga et al., 2014
Estresse Oxidativo Cerebral EAS Sementes Anaeigoudari et al., 2016
Hipnótico EHF Folhas Rakhshandeh et al., 2012
Hipolipidêmico EAS Sementes Lal et al., 2004
Imunomodulador EAS Sementes Lee et al., 2017
Neuroprotetora para Doença de Alzheimer’s
EAS Sementes Liu et al., 2015
Sedativo/Hipnótico OES, EAS, EHS Sementes e folhas Emamghoreishi
e Heidari- Hamedani, 2006
Sedativo OEF, EHF Folhas Gastrón et al., 2016
16
2.3 Aspecto Nutricional
As propriedades funcionais do C. sativum estão diretamente relacionadas
ao seu forte potencial antioxidante, benefícios nutricionais e propriedades terapêuticas
(Rattanachaikunsopon e Phumkhachorn, 2010).
O suco das folhas frescas é recomendado para pacientes com deficiência
de vitaminas A, B, C devido a presença de minerais, proteínas, flavonoides,
glicosídeos (quercetina, isoquercetina, rutina), carotenos, fibras e carboidratos (Mani
et al., 2009) e pelo fato de possuir uma significante concentração do componente ferro
é indicado para tratamentos de anemias (Rajeshwari e Andallu, 2011).
Ao comparar a composição nutricional das sementes de C. sativum entre
as literaturas (100 gramas) verificou-se uma variação apontando valores inferiores
para o cultivo no Brasil: proteína (11,5 g), lipídeos (15,60 g), cálcio (110 mg), ferro (2
mg), fósforo (45 mg), Vitamina C (0,075 mg), tiamina (0,15 mg), riboflavina (0,28 mg),
niacina (1,6 mg); se comparados as referências de USDA (National Nutrition Data
Base) proteína (12,37 g), lipídeos (17,77 g), cálcio (709 mg), ferro (16,32 mg), fósforo
(409 mg), Vitamina C (21 mg), tiamina (0,239 mg), riboflavina (0,290 mg), niacina
(2,130 mg) (Franco, 2008; Bhat et al., 2014).
A composição e a concentração de princípios ativos, nutrientes,
macromoléculas e vitaminas, podem apresentar grande diferenças conforme origem,
espécie, variedade, controle genético, fase de desenvolvimento durante a colheita,
época da colheita e estímulos proporcionados pelo meio ambiente tais como fatores
climáticos, agentes agressores, exposição a microrganismos, insetos, poluentes, altas
temperaturas e tipo de processo pós-colheita. Todos esses fatores fornecem
propriedades sensoriais específicas ao C. sativum, como uma especiaria aromática,
interferindo diretamente no aumento ou diminuição da concentração dos seus
componentes, princípios ativos e consequentemente sobre suas propriedades
farmacológicas (Ré e Jorge, 2012).
2.4 Atividades Anti-inflamatória, Antinociceptiva e Gastroprotetora
As propriedades do C. sativum relacionadas aos processos inflamatórios
foram mencionadas por Jagtap et al. (2004) que investigaram a partir de um texto
17
originário da medicina indiana uma formulação Ayurvedica milenar composta por
Bilwa (Eagle marmeloes), Dhanyak (Coriandrum sativum), Musta (Cyperus rotundus)
e Vala (Vetiveria zinzanioids) utilizada na prática médica popular em forma de
decocção para tratamento de colites ulcerativas e doenças inflamatórias intestinais.
Os resultados obtidos comprovaram a eficácia da formulação contra doenças
inflamatórias do intestino, demonstrando que os três extratos possuem atividade
citoprotetora, antimicrobiana e anti-inflamatória, sugerindo que o mecanismo de ação
esteja relacionado à diminuição da síntese ou da liberação de mediadores
inflamatórios, corroborando com a validação da atividade anti-inflamatórias do C.
sativum.
Vedjani et al. (2006) investigaram a atividade de uma formulação
carminativa composta por três extratos (Melissa oficinalis, Mentha spicata e
Coriandrum sativum) no alívio da dor/desconforto abdominal e nas flatulências em
pacientes com síndrome inflamatória do intestino irritável (SII). Os resultados
demonstraram uma redução na gravidade e frequência das dores/desconfortos no
grupo que utilizou a formulação carminativa, sugerindo que as plantas contidas nessa
formulação possuem atividade antiespasmódica, analgésica e carminativa sendo
indicadas para tratamento da SII como coadjuvantes.
Reutere et al. (2008) também pesquisaram a atividade anti-inflamatória do
C. sativum por meio de duas preparações tópicas contendo 0,5% e 1% de óleo
essencial das sementes. O efeito das formulações sobre o eritema induzido por UV
foi mensurado por fotometria após 48 horas, e os resultados demonstraram que a
formulação contendo 0,5% de óleo essencial de C. sativum reduziu significantemente
os eritemas induzidos pela radiação UV, sugerindo o uso dessa formulação
concomitantemente na terapia medicamentosa de doenças inflamatórias da pele.
Wu et al. (2010) evidenciaram a atividade anti-inflamatória do extrato
etanólico das folhas de C. sativum frente ao teste de lipopolissacarídeos (LPS)
estimulados dos macrófagos de rato e os resultados revelaram uma significante
diminuição na produção de prostaglandinas (PGE2) e óxido nítrico (NO) devido a
inibição da expressão de COX-2 e iNOS, respectivamente, sugerindo que a atividade
inibitória de C. sativum ocorra, em partes, através da inibição desses mediadores pró-
inflamatórios.
18
Zanusso-Junior et al. (2011) relataram a atividade anti-inflamatória e
antiedematogênica do extrato hidroalcoólico das folhas de C. sativum através dos
testes de pleurisia em ratos, no entanto sem interferir na migração leucocitária.
Enquanto os testes tópicos de edema de orelha em camundongos reduziram tanto o
edema quanto a migração leucocitária. Os resultados revelaram que C. sativum possui
atividade anti-inflamatória, antiedematogênica, porém a inibição da quimiotaxia
somente foi observada por via tópica.
Abordando a atividade antiulcerogênica, Vasudevan et al. (2000)
mencionaram que o extrato aquoso de C. sativum aumenta a secreção gástrica, bem
como proporciona o aumento da secreção de ácidos durante a injúria estomacal,
sugerindo o envolvimento do mecanismo de ação colinérgico juntamente com outros
mecanismos.
Heidari et al. (2005) mencionaram que C. sativum é utilizado na medicina
popular para aliviar enxaquecas, artrite reumatoide, odontalgia, e a partir dessa
informação validaram cientificamente a ação analgésica do extrato metanólico das
sementes de C. sativum, sugerindo o envolvimento de receptores opiódes no
mecanismo de ação.
A atividade gastroprotetora de C. sativum foi descrita por Al-Moflesh et al.
(2006) utilizando extrato aquoso das sementes em modelos experimentais de lesão
gástrica induzida por etanol e determinação da atividade anti-secretora. A
identificação química evidenciou a presença de constituintes antioxidantes como
linalol, flavonóides, cumarinas, catequinas, terpenos e polifenóis, sugerindo que a
inibição da formação de úlceras possa estar relacionada a atividade antioxidante
desses compostos que atuam por sinergismo e também devida a formação de uma
camada protetora na mucosa gástrica através de uma interações hidrofóbicas, por
esses compostos.
Rajeshwari e Andallu (2011) relataram que C. sativum auxilia na secreção
de enzimas, estimulando a digestão e favorecendo movimentos peristálticos, além de
auxiliar na cicatrização de úlceras bucais devido a sua atividade antimicrobiana e
auxiliando na manutenção do hálito devido sua atividade antisséptica, destacando o
composto citronelol.
19
Zaidi et al. (2012) descrevem a significante supressão do extrato
hidroalcóolico de C. sativum frente as espécies reativas de oxigênios (ROS) das
células infectadas de Helicobacter pylori, evidenciando a propriedade citoprotetora
frente as células do epitélio gástrico devido forte atividade antioxidante.
2.5 Aspectos Fitoquímicos
2.5.1 Cumarinas e furanocumarinas lineares
As cumarinas constituem uma classe química dos metabolitos secundários
vegetais presente em diferentes partes das plantas (flores, frutos, caules) distribuídas
em diferentes famílias de Angiospermae : Apiaceae, Rutaceae, Asteaceae, Fabaceae,
Moraceae, Solanaceae, considerando um número de ocorrência (NO) maior
(Ebermann et al., 1996; Ribeiro e Kaplan, 2002), distribuída amplamente entre as
orquídeas, ervas, frutas cítricas, legumes e perfazendo parte essencial da dieta
humana há séculos ( Cai et al., 1993).
Entre as cumarinas destacam-se a furanocumarina linear ou
furoisocumarina que é um fitocomposto aromático tricíclico em que a ligação -(C2=C3)
- do grupo furano é fundida com a ligação -(C6=C7) - da porção bicíclica da cumarina
( Buckle, 2015) conforme Figura 2.
Figura 2 - Estruturas químicas do furano (A), cumarina
(B) e furanocumarina psoraleno (C)
A distribuição de furanocumarina varia muito entre as espécies de plantas,
localização geográfica e clima, sendo encontrada principalmente em frutas cítricas
como: lima, limão, laranja amarga, grapefruit, salsinha, aipo, cenoura, onde o óleo
essencial contém uma alta concentração desses compostos, os quais após
extração/destilação são removidos devido a sua baixa volatilidade (Raquet e Schrenk,
2009).
20
Em 1988, Ceska et al. isolaram a partir do extrato etanólico das sementes
de C. sativum duas isocumarinas fotoativas denominadas coriandrina (majoritária) e
di-hidrocoriandrina (menor proporção), e mencionaram a semelhança estrutural
desses compostos com o psoraleno, utilizado terapeuticamente para tratamentos de
pele, classificando-as como furoisocumarinas lineares ou furanocumarinas conforme
Figura 3.
Figura 3 - Estruturas químicas do psoraleno, coriandrina e
di-hidrocoriandrina.
Baba et al. (1991) a partir do extrato etéreo das folhas de C. sativum
descreveram o isolamento de duas furanocumarinas na forma de dímeros,
denominando-os como Coriandrona A e Coriandrona B.
Posteriormente Kraus e Ridgeway (1994) descreveram pela primeira vez a
síntese total da coriandrina elaborada em nove etapas.
Taniguchi et al. (1996) relataram a partir do extrato metanólico das folhas
de C. sativum o isolamento de três novas furanocumarinas denominando-os de
Coriandrona C, D e E. Após anos de estudos Chen et al. (2009) a partir de óleo
essencial das sementes de C. sativum isolaram e purificaram: coriandrona B,
coriandrina, dihidrocoriandrina e coriandrone A, conforme Figura 4.
21
Figura 4 - Furanocumarinas de C. sativum.
2.5.2 Furanocumarinas e Atividades Biológicas
As furanocumarinas são utilizadas desde épocas remotas para o
tratamento de doenças da pele como psoríase, hanseníase, vitiligo, micoses,
dermatite e eczemas, destacando no Egito Antigo a utilização de extrato de Ammi
Majus (Diederichsen, 1996).
Em um trabalho Ashwood-Smith et al. (1989) evidenciaram as propriedades
da furanocumarina coriandrina (isolada a partir das folhas de C. sativum) atribuindo
efeitos fotosensibilizadores letal e mutagênese frente as bactérias, superiores ao
psoraleno, 5 e 8 MOP (metoxipsoraleno). Mencionando que a faixa de espectro de
absorção da coriandrina é 276-340nm (enquanto psoroleno é 290-326nm) sendo 1,6
vezes mais bactericida que o psoraleno e 1,9 mais ativa que 8MOP.
Outro teste realizado com a coriandrina foi a reação de fotossensibilização
em peles humanas, onde não apresentou nenhuma reação tópica se comparado a
furanocumarina angelina, 8MOP, 5MOP e psoraleno, os quais apresentaram reações
de eritema. Sugerindo assim que a metabolização da coriandrina ocorra muito
22
rapidamente frente aos demais compostos, ou evidenciando a ineficácia da via tópica
devido inativação ou outros mecanismos de ação desconhecidos (Raquet e Schrenk,
2009).
Woo et al. (1983) relataram que a coriandrina foi metabolizada rapidamente
pelo fígado, sugerindo que após absorção atue diretamente com as enzimas
microssomais.
As furanocumarinas (presente na dieta cotidiana) são potentes inibidores
in vitro de monoxidase microssomal, cujo mecanismo de ação é a modulação/
inativação do citocromo P450. A coriandrina é um composto competitivo e não
competitivo frente à enzima citocromo P450 1A1 e P450 2B1,respectivamente
enquanto a di-hidrocoriandrina é apenas um inibidor competitivo. Sugerindo que a
coriandrina pode ligar-se não apenas ao substrato, mas também em um sitio adicional
e causar a inativação da atividade enzimática em maior proporção (Cai et al., 1993).
Posteriormente o mecanismo de ação da coriandrina foi elucidado por Cai
et al. (1996) que mencionaram ser metabolicamente ativada por microssomos
hepáticos, induzindo a formação de um intermediário eletrofílico (aducto) o qual se
liga covalentemente ao citocromo P450 1A1,inativando-o.
Cai et al. (1997a) descreveram a propriedade da coriandrina frente ao
bloqueio do início do tumorigênese em pele de cobaia e outros tecidos in vitro,
sugerindo que sua atividade anticarcinogênica seja devido o mecanismo de ação em
bloquear o DNA através da formação de um aducto e inibindo a iniciação do tumor,
citando também que esse mecanismo esteja interligados com a inibição do citocromo
P450s envolvido na ativação do processo tumoral (Cai et al., 1997b).
Quanto a elucidação do mecanismo de ação da coriandrina, Ashwood-
Smith et al. (1989) mencionaram que a coriandrina é muito mais potente que demais
furanocumarinas, no entanto não causou irritação cutânea, nem eritrema e formação
de bolhas durante o teste de atividade fotossensibilizante. Muitas reações de
sensibilidade cutanea estão relacionadass com a formação de ligação cruzada entre
as furanocumarinas com o DNA, no entanto, a coriandrina não apresentou esses
efeitos colaterias, sugerindo que seu mecanismo de ação não está intrinsicamente
relacionado com o entrelaçamento e ligação cruzada com o DNA, ou é relativamente
baixa a sua atividade fotossensibilizadora na pele ou ineficácia de ação cutânea
23
tópica. Sugerindo também um mecanismo de ação distinto das demais
furanocumarinas.
2.5.3 Sistema Nervoso Central e Atividade Antioxidante de C. sativum
Na medicina popular o suco de folhas frescas (30 g), o chá, ou o pó das
sementes moídas de C. sativum são recomendados em uma única dose antes de
dormir, para alivio da ansiedade, insônia e depressão evidenciando o seu uso para
desordens do SNC (Emamghoreishi et al., 2005).
Os prejuízos ocasionados pelo estresse oxidativo, seguido da elevação da
concentração de espécies reativas de oxigênio (ROS) na região cerebral contribuem
para danos oxidativos teciduais irreversíveis, desordens cérebrovascular (CVD),
deficiências neurocomportamentais, psiquiátricas e cognitivas como: depressão,
ansiedade e perda de memória (Qureshi et al., 2004; Reilly et al., 2011).
Diversos trabalhos foram publicados do C. sativum frente atuação no SNC
de maneira preventiva ao estresse oxidativo, inibindo a formação de ROS e evitando
a consequente injúrias teciduais. Emanghoreishi e Heidari-Hamedani (2008)
atribuíram atividade anticonvulsivante dos extratos hidroalcoólico, aquoso, e óleo
essencial das sementes de C. sativum, sugerindo que a forte atividade antioxidante
contribua para o mecanismo de ação. Os resultados de Anaeigoudari et al. (2016)
corroboram com essa afirmativa sugerindo que a forte atividade antioxidante do C.
sativum tenha contribuindo como pano de fundo para potencializar a atividade
anticonvulsivante.
Hosseinzadeh e Madanifard (2010) mencionaram a atividade
anticonvulsivante dos extratos aquoso e etanóico das sementes de C. sativum
diminuindo a duração das convulsões tônicas, atribuindo o mecanismo de ação aos
compostos furanocumarinas. Patel et al. (2012a) relatam que o extrato metanólico das
sementes de C. sativum possui ação cardio-protetora frente ao infarto de miocárdio,
atribuindo essa atividade a alta concentração de compostos polifenóis responsáveis
pela prevenção de danos oxidativos através da remoção efetiva de IROS.
Conforme Cioanca et al. (2014), a doença de Alzheimer (AD) é considerada
uma doença neurodegenerativa, com agressão progressiva/contínua pelo estresse
oxidativo, desencadeado o processo inflamatório, neurotoxicidade e perda neuronal,
24
contribuindo para aumento da severidade do declínio da cognição. A inalação do óleo
volátil de C. sativum pode ser considerado como coadjuvante em um processo
complementar tanto para o tratamento quanto na prevenção da condição de demência
da AD, pois o atua como neuroprotetivo devido ao bloqueio do estresse oxidativo. Liu
et al. (2016) relataram que o extrato etanólico das folhas de C. sativum tem ação
antioxidante, anti-inflamatória e neuroprotetiva para o paciente com AD, sugerindo sua
ingestão diária.
O extrato aquoso das sementes de C. sativum demonstrou efeito
ansiolítico, sedativo e relaxante muscular (Emamghoreishi et al., 2005).
Posteriormente Mahendra e Bisht (2011) elucidaram a atividade ansiolítica do extrato
hidroalcoólico das sementes de C. sativum. Enquanto Rakhshandeh et al. (2012)
mencionaram que a fração acetato de etila obtida das folhas de C. sativum possui
atividade hipnótica com o prolongamento do sono, sem causar efeitos nefrotóxicos.
Essa propriedade ansiolítica, sedativa, anticonvulsivante e depressora do C. sativum
tem sido atribuída a presença de composto polifenóis (flavonoides) e afinidade pelos
receptores benzodiazepínicos (Nassiri-Asl et al., 2010; Anaeigoudari et al., 2016). Os
resultados apresentados por Patel et al. (2013) demonstraram que o extrato
metanólico das sementes de C. sativum foi eficiente prevenindo a oxidação e
modificação de LDL devido a alta concentração de polifenóis, os quais atuam contra
os danos oxidativos, sugerindo assim que C. sativum tem potencial anti-aterogênico.
25
3 PROPOSIÇÃO
Foram objetivos do presente estudo:
Avaliar diferentes extratos e técnicas de extração objetivando o melhor
rendimento do extrato, bem como maior concentração das
furanocumarinas de interesse;
Identificar o melhor extrato purificado;
Identificar os principais compostos presentes no extrato
diclorometânico oriundo de folhas de C. sativum e da sua fração
etilacetato de etila (FAc);
Avaliar as atividades antiulcerogênica, anti-inflamatória e
antinociceptiva da FAc em modelos in vivo.
26
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Ensaios Fitoquímicos
4.1.1 Solventes e Reagentes
Foram utilizados o formaldeído da Chemco (Indústria e Comércio Ltda,
Hortolândia, SP) e o Tween 80 da Mapric (Produtos Farmacocosméticos ltda, São
Paulo, SP). Todos os demais reagentes, tais como cloreto de sódio, acetato de etila,
anidrido acético, diclorometano, ácido acético glacial, etanol, hexano, metanol e a
solução de anisaldeído (ácido acético: ácido sulfúrico: anisaldeído [50:1:0,5]) foram
obtidos da Labsynth (Produtos para Laboratórios Ltda, Diadema, SP), com grau P. A.
ou HPLC.
4.1.2 Equipamentos
Foram utilizados moinho de facas (Marconi Equipamentos para
Laboratórios Ltda, Piracicaba, SP), estufa de circulação de ar forçado (Blue M -
Thermal Product Solutions, New Columbia, Pennsylvania), dispersor mecânico (Ultra
Turrax T10,T50,basic IKA, Biovera, Rio de Janeiro, RJ), rotaevaporador (modelo 550
Fisaton, Quimis Aparelhos Cientificos, Diadema, SP), cromatógrafo a gás (HP-6890)
acoplado a detector seletivo de massa (HP-5975,Hexis Cientifica, Jundiai- SP), e
cromatógrafo líquido de alta eficiência (Sistema Alliance Waters) acoplado a detector
de arranjo de diodos (Waters 2996) e de massas (CLAE-DAD-EM- Analítica- São
Paulo- SP).
4.1.3 Material vegetal
O C. sativum foi adquirido no comércio regional (CEASA/Campinas-SP)
nas seguintes datas: 19/02/2008 (40,63 Kg), 20/01/2010 (10,44 Kg) e 07/04/2010
(34,61 Kg). A identificação botânica seguiu o sistema de classificação APGIII (2009),
sendo que o nível de espécie foi confirmado pelo taxonomista Dr. Luis Carlos
Bernacci, com base na literatura conforme Lorenzi e Matos (2002) e por comparação
com as amostras herborizadas da coleção interna Herbário do Instituto Agronômico
de Campinas- SP (IAC n° 6855,8814 e 44429).
27
4.1.4 Extração
As folhas e talos de C. sativum foram separados das raízes, secos em
estufa com circulação de ar forçado a 45°C durante três dias, submetidos à moagem
em moinho de facas, obtendo-se o material seco (Figura 5A-B).
Figura 5 - Foto ilustrativa do C. sativum fresco
adquirido no CEASA- Campinas-SP (A)
separado as folhas, talos e raízes (B)
secagem em estufa durante três dias.
O extrato de diclorometano foi preparado a partir de 1 kg de planta seca e
moída com 3,5 L de diclorometano, em dispersor mecânico durante 10 minutos, a
1600 rpm. O extrato foi filtrado em peneira metálica Granutest ABNT 70,abertura MM
0,210 e tyler 65,e o resíduo da planta re-extraído (2x) com 2,0 L de diclorometano. Os
filtrados foram agrupados, filtrados à vácuo em funil de placa porosa e secos no
rotaevaporador até remoção do solvente, originando o extrato diclorometano seco
(ED).
O resíduo da planta restante foi submetido à segunda extração sucessiva
com 2 L de EtOH (96%), utilizando-se o dispersor por 10 minutos. Após a filtração,
repetiu-se o procedimento (2x) e os extratos recolhidos foram concentrados em
evaporador rotativo até eliminação do etanol, obtendo-se o extrato etanólico seco
(EE).
28
4.2 Métodos de Separaçâo
4.2.1 Cromatografia em Coluna Clássica
A cromatografia em coluna clássica foi realizada a partir de 22 g do ED,
utilizando como suporte uma coluna de vidro de 40 cm de altura e 6 cm de diâmetro,
previamente empacotada com hexano e 66 g de silicagel 60 (Merk, 0,063-0,200mm)
como fase estacionária. Foi utilizado uma proporção de 1 parte de amostra/ 3 partes
de silicagel para a montagem da coluna (1:3).
Na fase móvel foram utilizados gradientes de hexano (1000 mL),
hexano:AcOEt (90:10 - 4000 mL), hexano: AcOEt (1:1- 3000 mL) e AcOEt (700 mL).
O gradiente de solventes foi aumentando de acordo com o perfil das frações
monitoradas por cromatografia de camada delgada (CCD). No total, trinta e seis
frações foram recolhidas, a cada 250 mL, as quais originaram 10 frações agrupadas.
As frações que apresentaram semelhança por CCD foram agrupadas, filtradas à
vácuo em funil de placa porosa e evaporadas até remoção do solvente (Figura 6).
29
Figura 6 - Fluxograma das etapas envolvidas nas diferentes formas de fracionamento do ED
e identificação de furanocumarinas.
4.2.2 Cromatografia Partição líquido-líquido
Parte do ED (10 g) foi solubilizado em 200 mL de solução EtOH:H2O (1:1),
transferido para um funil de separação, juntamente com 200 mL de hexano, submetido
à agitação vigorosa com posterior repouso até total separação visível das fases,
recolhendo-se a fase hexânica (orgânica). Repetiu-se três vezes o procedimento,
agrupou-se as fases orgânicas, obtendo-se uma fase hidroalcoólica e uma fase
hexânica, que foram secas em rotaevaporador, originando as frações: hexânica (FEH)
e hidroalcóolica (FHA).
30
4.2.3 Cromatografia em Coluna Seca
A cromatografia em coluna foi efetuada a partir de 570 mg da fração
hidroalcóolica (FHA), utilizando-se uma membrana de acetato de celulose (2 cm de
diâmetro, 35 cm de altura) como suporte, previamente empacotada com 1,7 g de
silicagel 60 (Merk, 0,063-0,200mm) como fase estacionária e acetato de etila:metanol
(95/5 v/v) para a fase móvel. Foi utilizada uma proporção de 1 parte de FHA/ 3 partes
de silicagel para a montagem da coluna seca (1:3). Após o término da elução, a coluna
cromatográfica foi cortada em sete partes, originando sete frações que foram
extraídas, filtradas e submetidas à secagem originando FHA1-2; FHA3; FHA4; FHA5;
FHA6 e FHA7.
4.2.4 Cromatografia em Coluna Filtrante
A cromatografia em coluna filtrante foi realizada a partir de 14 g de ED
utilizando como suporte um funil de placa porosa (n°3,9 cm de altura, 10 cm de
diâmetro, capacidade de 1000 mL), previamente empacotado com 42 g de sílicagel
60 umedecida com hexano, como fase estacionária. Foi utilizada uma proporção de 1
parte de ED/3 partes da silicagel para a montagem da coluna filtrante (1:3).
Para a fase móvel foram usados gradientes de hexano (500 mL); acetato
de etila (1000 mL) e acetato de etila:metanol (1:1 - 1000 mL). As frações foram
submetidas à secagem em rotaevaporador até remoção dos solventes originando as
frações hexânica (FHx), acetato de etila (FAc) e acetato de etila:metanol (FAcMe).
4.2.5 Cromatografia em Camada Delgada
As cromatografias em camada delgada (CCD) foram efetuadas utilizando
cromatofolhas de alumínio, de 20 cm x 20 cm, com fase estacionária de sílicagel 60
(F254 – Merck). Os eluentes utilizados foram Hex:AcOEt (70:30 v/v) e Hex:AcOEt (1:1
v/v). A detecção dos compostos foi realizada a partir da observação por irradiação sob
luz UV a 254 e 366 nm, com posterior pulverização com solução de anisaldeido,
seguidas de aquecimento em estufa a 100ºC durante cinco minutos.
31
4.3 Métodos de Identificação
4.3.1 Análise por Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas
As análises foram realizadas em um cromatógrafo a gás HP-6890 acoplado
a detector seletivo de massas HP-5975. Foi utilizada uma coluna capilar de sílica
fundida HP-5MS (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm) com hélio como gás de arraste (1,0
mL.min-1). As temperaturas do injetor detector foram 250°C e 300°C respectivamente,
com uma programação de temperatura para a coluna de 110°C a 280°C (5°C. min-1),
permanecendo nesta temperatura por 26 minutos. As análises de identificação foram
realizadas a partir da avaliação dos fragmentogramas dos principais picos presentes
na amostra, em comparação com os dados obtidos na biblioteca NIST do
equipamento CG-EM (HP6890/HP-5975) e posteriormente com os dados da literatura.
Para a avaliação dos resultados foi considerado cada pico cromatográfico
representado por um composto, o qual foi integrado de acordo com o seu tempo de
retenção, gerando uma percentagem relativa específica para cada composto químico.
A somatória de cada pico origina a somatória total do cromatograma, perfazendo uma
área de 100%. Assim, a percentagem relativa de cada composto é calculada em
função do número de picos detectados, em função de cada área.
4.3.2 Análise por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada a Detector
de Arranjo de Diodo e de massas CLAE-DAD-EM
As análises foram realizadas em Sistema Alliance Waters, composto por
bomba 2695,detector de arranjo de diodos 2996,injetor automático, detector de
massas 3100,forno para aquecimento de coluna e software Empower. Foi utilizada
uma coluna C-18,Symetry (100 x 2,1 mm, 3,5 µm (30°C) e como eluentes a água (A)
e metanol (B) em modo gradiente (Tabela 2), com vazão 0,25 mL/min. Foram
empregados detectores DAD (scan 200 a 400 nm, leitura a 254 nm) e MS/ESI positivo
(capilar 4kV; cone 30 V; extrator 2V; fonte 120ºC; dessolvatação 250°C; vazão do gás
de dessolvatação 400 L/h e cone 40 L/h). As amostras testadas foram preparadas em
metanol P.A. na concentração 400 µg/mL sendo injetados 10µL dessa solução.
32
Tabela 2 - Relação eluentes água (A) e metanol (B), em modo gradiente
Tempo (min) % A % B
0 50 50
40 20 80
45 20 80
55 50 50
70 50 50
4.4 Ensaios Farmacológicos In Vivo
Frente aos resultados apresentados pelas frações constituídas pelas
furanocumarinas versus o rendimento, optou-se em dar continuidade aos testes in vivo
a partir Fac e não de suas frações, considerando-se que essa técnica de extração
otimizou o tempo, atingindo melhores resultados de rendimento/ concentração de
duas furanocumarinas de interesses.
4.4.1 Material e Métodos
4.4.2 Fármacos e reagentes
Foram utilizados carbenoxolona dissódica, cimetidina, N-etilmaleimida
(NEM), cloridrato de dexametasona, indometacina, ácido acético, carragenina,
capsaicina (Sigma-Chemical Company-USA). A morfina foi adquirida da FHC (FHC
Farmacêutica, Lda., Laboratórios Basi Indústria Farmacêutica, S.A., Coimbra,
Portugal). Todas os fármacos foram solubilizados em solução salina (NaCl 0,9%),
juntamente com 0,5% de Tween 80.
4.4.3 Animais
Os animais foram obtidos do Centro de Bioterismo da UNICAMP (CEMIB)
e mantidos em câmaras com temperatura controladas (25 ± 2°C) em ciclos claro-
escuro de doze horas, com água e ração ad libidum. Foram utilizados camundongos
da linhagem Swiss, machos adultos, com a 5-8 semanas e com peso corporal variando
entre 25-30 g para os ensaios de toxicidade, atividade antinociceptiva e anti-
inflamatória. Para os testes de atividade antiulcerogênica, foram utilizados ratos da
33
linhagem Wistar, machos, adultos, com 5-8 semanas, com peso corporal variando
entre 250-350 g.
Todos os animais foram aclimatados às condições do laboratório por sete
dias, sendo agrupados ao acaso, em grupos de até 10 animais, dentro das normas de
boas práticas de manutenção e tratamento animal. Todos os experimentos foram
conduzidos com aprovação da Comissão de Ética em Experimentação Animal do IB-
UNICAMP, protocolo n°2483-1 (atividade antinociceptiva e anti-inflamatória, conforme
ANEXO I) e protocolo n°2484-1 (atividade antiulcerogênica, conforme ANEXO II).
4.4.4 Avaliação de toxicidade aguda (Screening Hipocrático)
Para a determinação do perfil de toxicidade aguda foram utilizados grupos
de três camundongos, os quais foram tratados por via intraperitoneal (i.p.) com doses
únicas de 300,500 e 1000 mg/kg do ED de C. sativum. Somente este extrato foi
utilizado, pois foi o que apresentou o maior rendimento.
Os grupos foram observados continuamente por período de 4 horas e,
então, diariamente em um intervalo de 15 dias. Foram avaliados sinais de toxicidade
geral, como os efeitos na locomoção, comportamento (agitação, atividade reduzida,
sonolência), respiração, salivação, lacrimejamento, cianose de extremidades e
mortalidade (Lapa et al., 2008).
A partir do ensaio de toxicidade aguda, foram determinadas as doses
tóxicas do ED que serviram como parâmetro para os ensaios posteriores, visando a
avaliação das atividades antinociceptiva, anti-inflamatória e antiulcerogênica in vivo.
Dentre as frações do ED, a fração acetato de etila (FAc) mostrou o maior
rendimento (61%) e a maior concentração das furanocumarinas coriandrina e di-
hidrocoriandrina, e por esse motivo os demais ensaios farmacológicos foram
conduzidos utilizando apenas essa fração (Figura 7).
34
Figura 7 - Fluxograma das etapas envolvidas nos testes in vivo da FAc obtida a partir do ED das folhas de C. sativum.
4.5 Atividades Antinociceptiva e Anti-Inflamatória
4.5.1 Avaliação da Atividade locomotora
Nesse ensaio, grupos experimentais de oito camundongos (Swiss) foram
tratados pela via intraperitoneal (i.p.) com solução de NaCl 0,89% (10 mL/kg) e com
FAc nas doses de 30,100 e 300 mg/kg. Após trinta minutos do tratamento, os animais
foram transferidos para o open-field (consiste em uma caixa plástica medindo
45x45x20 cm, com o fundo dividido em 9 áreas iguais - 15x15 cm), onde o número de
áreas cruzadas pelas 4 patas dos animais foi contado em sessões de 6 minutos e
tomadas como índice comportamental (Mattei e Carlini, 1996).
35
4.5.2 Teste de contorções abdominais induzidas por ácido acético
Grupos experimentais de seis camundongos (Swiss) foram tratados pela
via intraperitoneal (i.p.) e pela via oral (v.o), com 10 mL/kg de solução de NaCl 0,89%
(controle negativo), 20 mg/kg de Indometacina (controle positivo) e com FAc nas
doses de 10,30,100 e 300 mg/kg.
Os animais tratados pela via oral, após 60 minutos do tratamento,
receberam ácido acético a 0,8% (10 mL/kg i.p.) em solução salina, enquanto outros
grupos tratados pela via intraperitoneal receberam injeção i.p. de ácido acético a 0,8%
(10 mL/kg), 30 minutos após tratamento.
As contorções abdominais, seguidas de torções do tronco e extensão dos
membros posteriores foram contadas cumulativamente por 15 minutos, determinando
a atividade antinociceptiva por comparação com o controle negativo (Koster et al.,
1959,Vacher et al., 1964). Esse ensaio foi realizado por duas vias de administração
diferentes para comparação entre ambas (Rabelo et al., 2013).
4.5.3 Teste de Formalina
Para esse ensaio, grupos experimentais de seis camundongos (Swiss)
foram tratados pela via i.p. com 10 mL/kg de solução de NaCl 0,89% (controle
negativo), 20 mg/kg de morfina (controle positivo Fase I), 5 mg/kg de dexametasona
(controle positivo Fase II) e com FAc nas doses de 10,30 e 100 mg/kg. Após 30
minutos, foi administrada uma solução de formalina, na concentração de 2%, por via
intraplantar (20 μl/pata) na superfície ventral da pata posterior direita. Foi medido o
tempo em que os animais permaneceram lambendo as patas durante um período total
de 45 minutos, como indicativo de nocicepção. Os primeiros cinco minutos
determinam resposta à dor de origem neurogênica, enquanto dos 25-45 minutos
restantes determinam a resposta à dor de origem inflamatória (Soares et al., 2009;
Costa e Souza et al., 2010).
4.5.4 Teste de Edema de pata induzido por carragenina
Inicialmente o volume basal da pata traseira direita dos camundongos foi
avaliado em aparelho de hidropletismômetro. Grupos experimentais de oito
camundongos, foram tratados com 10 mL/kg de solução de NaCl 0,89% - pela via i.p.
36
(controle negativo), 20 mg/kg de dexametasona (controle positivo) e com FAc nas
doses de 30,100 e 300 mg/kg. Após 30 minutos, a inflamação foi induzida através da
injeção de carragenina (40 μL - diluída em solução salina na concentração de 3%) na
face ventral da pata traseira direita. A leitura do volume (edema) das patas traseiras
direitas foi realizada nos tempos 0h (basal), 2h, 4h e 6h (fase inicial) e 24h, 48h e 72h
(fase tardia), tendo como controle o volume basal antes da indução da inflamação.
Após 72 horas, os animais foram submetidos à eutanásia por deslocamento cervical
(Nunes et al., 2007).
4.5.5 Teste de Capsaicina
Grupos experimentais de seis animais (Swiss) foram tratados pela via i.p.
com 10 mL/kg de solução de NaCl 0,89% (controle negativo), 20 mg/kg de morfina
(controle positivo) e com FAc nas doses de 30,100 e 300 mg/kg. Após 30 minutos, foi
administrado solução de capsaicina (diluída em solução salina, na concentração de
1,6 µg/pata) na pata posterior direita do animal (50 μl/pata). O tempo que os animais
permaneceram lambendo as patas, durante um período de 5 minutos, foi indicativo de
nocicepção e dor de origem neurogênica (Lapa et al., 2008).
4.6 Atividade Antiulcerogênica
4.6.1 Testes de lesão gástrica induzida por etanol absoluto
Foram utilizados grupos experimentais de cinco ratos (Wistar), submetidos
a jejum de 12 horas e com livre acesso à água. Posteriormente, foram tratados por via
oral com NaCl 0,89% (10 mL/kg, controle negativo), carbenoxolona 200 mg/kg
(controle positivo) e FAc nas doses de 100,300 e 1000 mg/kg.
Após uma hora do tratamento, os animais receberam 1,0 mL de etanol
absoluto por via oral, independente do peso (Robert, 1979). Após uma hora da
administração do etanol absoluto, os animais foram anestesiados e submetidos à
eutanásia por deslocamento cervical, os estômagos foram retirados, abertos ao longo
da maior curvatura e lavados em solução NaCl 0,89% para realização da avaliação
visual das lesões produzidas e avaliação do índice de lesões ulcerativas (ILU).
37
O ILU foi calculado posteriormente por meio de somatória dos parâmetros
a seguir, de acordo com a seguinte classificação proposta por Gamberini et al., (1991):
Até 10 petéquias 1 ponto
Até 20 petéquias 2 pontos
Até 30 petéquias 3 pontos
Úlceras de até 1 mm n* x 2
Úlceras maiores que 1 mm n* x 3
Hemorragia 1 ponto
Perda de pregas 1 ponto
Perda de coloração 1 ponto
* n refere-se ao número de lesões encontradas
Para a determinação da porcentagem de inibição do ILU apresentados pelos
grupos tratados em relação ao grupo controle, foi usada a seguinte fórmula:
Inibição do ILU = Média Controle - Média tratado x 100
Média Controle
4.6.2 Estudo da participação da prostaglandina na citoproteção gástrica
Quatro grupos experimentais constituído por seis ratos (Wistar) foram
submetidos a jejum, por um período de 12 horas com livre acesso a água. Os grupos
foram distribuídos da seguinte forma:
Seis animais receberam solução de NaCl 0,89% (10 mL/kg, controle negativo).
Após 30 minutos, receberam novamente NaCl 0,89% (10 mL/kg);
Seis animais receberam indometacina (5,0 mg/kg/i.p.). Após 30 minutos,
receberam NaCl 0,89% (10 mL/kg);
Seis animais receberam solução de NaCl 0,89% (10 mL/kg, controle negativo).
Após 30 minutos, receberam FAc na dose de 300 mg/kg/i.p.;
Seis animais receberam indometacina (5,0 mg/kg/i.p.). Após 30 minutos,
receberam FAc na dose de 300 mg/kg/i.p.
Após uma hora dos tratamentos, todos os animais foram anestesiados e
eutanasiados por deslocamento cervical para retirada do estômago.
38
4.6.3 Estudo da participação das substâncias sulfidrílicas não protéicas na
citoproteção gástrica
Quatro grupos experimentais constituído por seis ratos (Wistar) foram
submetidos a jejum, por um período de 12 horas com livre acesso a água. Os grupos
foram distribuídos da seguinte forma:
Seis animais receberam solução de NaCl 0,89% (10 mL/kg, controle negativo).
Após 30 minutos, receberam novamente NaCl 0,89% (10 mL/kg);
Seis animais receberam N-etilmaleimida (alquilante de função sulfidrila), na
dose de 10 mg/ kg, por via subcutânea. Após 30 minutos, receberam NaCl
0,89% (10 mL/kg);
Seis animais receberam solução de NaCl 0,89% (10 mL/kg, controle negativo).
Após 30 minutos, receberam FAc na dose de 300 mg/kg/i.p.;
Seis animais receberam N-etilmaleimida (alquilante de função sulfidrila), na
dose de 10 mg/ kg, por via subcutânea. Após 30 minutos, receberam FAc na
dose de 300 mg/kg/i.p.
Após uma hora dos tratamentos, todos os animais foram anestesiados e
eutanasiados por deslocamento cervical para retirada do estômago.
4.6.4 Estudo da atividade anti-secretora
Três grupos experimentais de cinco ratos (Wistar) foram submetidos a
jejum, por um período de 12 horas com livre acesso a água. Os animais foram
anestesiados com pentobarbital sódico 3% para realização de tricotomia, incisão
abdominal e a ligadura do piloro. Logo após a ligadura cada grupo recebeu por via
intraduodenal os seguintes tratamentos:
Solução de NaCl 0,89% 10 mL/kg (grupo controle negativo);
Cimetidina 100 mg/kg (grupo controle positivo);
FAc 300 mg/kg.
O abdômen foi suturado e após 4 horas os animais foram anestesiados,
eutanaziados por deslocamento cervical, o abdômen foi aberto e o estômago retirado
para a determinação do volume do conteúdo estomacal, pH e concentração de íons
H+ (mEq/L/4h). A mucosa gástrica foi lavada com 2 mL de água deionizada,
39
recolhendo-se o suco gástrico e o lavado em tubos de ensaios para a centrifugação
(2500 rpm durante 10 minutos). Após a centrifugação, o volume gástrico foi
quantificado em proveta, o valor do pH foi medido por meio de pHmêtro e a acidez
total (mEq [H+]/mL/4 h) foi quantificada por titulação com NaOH 0,1 N (fator de
correção 1,087), utilizando fenolftaleína 2% como indicador ácido-base (Shay et al.,
1945; Domer, 1971).
4.7 Análise dos Dados
Os resultados foram submetidos ao teste de Bartlett para avaliar a
homogeneidade de variância e teste de Shapiro-Wilk para determinar a distribuição
dos dados.
Os dados obtidos na avaliação da atividade locomotora, nas contorções
abdominais induzidas por ácido acético, no teste da formalina e no teste de capsaicina
foram submetidos ao teste de Kruskal-Wallis, seguido do teste SNK, como post hoc.
Os resultados do edema de pata induzida por carragenina foram previamente
submetidos à prova Runs para determinar o desvio de linearidade. Em seguida, os
dados foram submetidos à análise de regressão linear.
Os resultados relativos à atividade antiulcerogênica foram submetidos à
one-way ANOVA e teste de Tukey, com correção para comparações múltiplas, exceto
para o teste da carbenoxolona, o qual foi submetido ao teste de Kruskal-Wallis e Dunn.
O nível de significância foi ajustado para 5% em todos os testes. Os
softwares GraphPad 7.0 e BioEstat 5.0 foram utilizados para analisar todos os dados.
40
5 RESULTADOS
5.1 Fitoquímica
5.1.1 Obtenção dos Extratos ED e EE
Os extratos ED e EE foram obtidos a partir de 1000 g das folhas secas e
moídas de C. sativum através de extração no sistema do tipo Ultra-Turrax, e após
secagem obteve-se 36,70 g (3,67%) e 27,30 g (2,73%), respectivamente.
A partir da avaliação dos fragmentogramas dos principais picos observados
nos cromatogramas obtidos por CG-EM dos extratos ED e EE, da comparação com
os dados obtidos da biblioteca NIST no CG-EM e dados da literatura (Ashwood-Smith
et al., 1989; Ceska et al., 1988; Hudson et al., 1993; Kraus e Ridgeway 1994) foi
possível sugerir a presença dos compostos apresentados na Tabela 3.
Tabela 3 - Compostos identificados no ED e EE a partir da análise comparativa dos
fragmentogramas e suas percentagens relativas (%).
Percentagem Relativa (%)
Compostos MM tR min ED EE
Ácido n-hexadecanóico 256 18,24 6,91 -
Palmitato de etila 284 18,80 - 1,79
di-hidrocoriandrina 232 19,53 15,64 13,36
coriandrina 230 20,04 5,37 5,04
Fitol 296 20,97 7,01 3,21
Ácido α-linolênico 278 21,84 12,58 1,45
Linoleato de etila 306 21,96 - 2,21
Estigmasterol 412 38,86 7,04 3,27
β-sitosterol 414 40,26 - 2,33
α- sitosterol 414 40,12 0,99 4,74
Massa Molecular (MM); tempo de retenção (tR).
Inicialmente o extrato diclorometânico (ED) foi obtido a partir das folhas
secas de C. sativum e os resíduos re-extraídos com etanol originando o extrato
etanólico (EE). Para o ED foi evidenciado a presença de ácidos de cadeia longa tais
como o ácido n-hexadecanóico (ácido palmítico, representando 6,91%) e o ácido 9(Z),
12(Z), 15(Z)-octadecatrienóico (ácido α-linolênico, representando 12,58%). Alguns
41
triterpenos, também foram identificados com tempo de retenção maior que 30 minutos
(tR>30 min), como o estigmasterol (7,04%) e α-sitosterol (4,74%), além da di-
hidrocoriandrina (15,64%), da coriandrina (5,37%) e do fitol (7,01%). Enquanto para o
EE foi possível sugerir a presença de ácido α-linolênico (1,45%), estigmasterol
(3,27%), β-sitosterol (2,33%), di-hidrocoriandrina (13,36%) e coriandrina (5,04%),
além do fitol (3,21%). No entanto, todos estes constituintes foram identificados em
menor proporção em comparação ao ED.
Após análise fitoquímica, se verificou que o ED tinha maior concentração
das furanocumarinas, com rendimento de 3,67%, enquanto que o EE apresentou
rendimento de 2,73% e menor proporção dos compostos de interesse. Por esse
motivo, o ED foi fracionado por métodos cromatográficos, em diferentes etapas
visando validar uma melhor técnica frente ao maior rendimento.
5.1.1.1 Fracionamento em Coluna Cromatográfica Clássica
O ED apresentou o maior rendimento e foi submetido ao fracionamento em
coluna cromatográfica clássica, com solventes de diferentes polaridades, originando
36 frações que foram agrupadas de acordo com semelhança no perfil cromatográfico
, conforme Tabela 4.
Tabela 4 - Massa das frações obtidas em coluna cromatográfica clássica do ED
Frações originais Eluente Frações agrupadas Massa (g)
F1-4 Hex 100% FAg1 0,20
F5-6 Hex : AcOEt (90:10) FAg2 2,02
F7-9 Hex : AcOEt (90:10) FAg3 5,32
F10-18 Hex : AcOEt (90:10) FAg4 1,49
F19-21 Hex : AcOEt (1:1) FAg5 0,19
F22 Hex : AcOEt (1:1) FAg6 0,13
F23-24 Hex : AcOEt (1:1) FAg7 3,10
F25-27 Hex : AcOEt (1:1) FAg8 1,12
F28-29 Hex : AcOEt (1:1) FAg9 0,97
F30-36 AcOEt 100% FAg10 1,73
42
Posteriormente as frações foram analisadas por Cromatograma em
Camada Delgada (CCD) utilizando-se como eluente hexano: AcOEt (70:30 v/v) e as
frações foram reagrupadas em 10 frações conforme a semelhança de polaridade
apresentada no perfil cromatográfico, conforme Figura 8.
Figura 8 - Perfil da CCD das frações
FAg1,FAg2,FAg3,FAg4,FAg5,FAg6,FAg
7,FAg8,FAg9 e FAg10 resultantes da
Coluna Cromatográfica Clássica do ED.
A partir da avaliação dos fragmentogramas dos principais picos observados
por cromatogafia gasosa evidenciou-se que as frações FAg7,FAg8,FAg9 e FAg10
apresentaram compostos com características de furanocumarinas, sendo submetidas
simultaneamente à análise por CG-EM para identificação dos compostos. A análise
por CG-EM sugeriu a presença da di-hidrocoriandrina nas frações FAg7 (21,64%),
FAg8 (78,84%), FAg9 (40,52%) e FAg10 (2,94%), e da coriandrina nas frações FAg7
(34,91) e FAg8 (14,65%) conforme Tabela 5.
Tabela 5 - Furanocumarinas identificadas nas frações FAg7 -FAg10 a partir da análise comparativa dos fragmentogramas e suas percentagem relativas (%).
Percentagem Relativa (%)
Compostos MM tR (min) ED FAg7 FAg8 FAg9 FAg10
di-hidrocoriandrina 232 19,52 15,66 21,64 78,84 40,52 2,94
coriandrina 230 20,05 5,37 34,91 14,65 - -
Massa Molecular (MM), tempo de retenção (tR), (%) Fração em porcentagem da área total integrada para o cromatograma
43
As frações FAg7 e FAg8 apresentaram uma maior concentração das
furanocumarinas de interesse, bem como maior rendimento. No entanto, essa técnica
de extração demonstrou-se muito onerosa e dispendiosa (36 frações).
5.1.2 Partição líquido-líquido
A partir de 10 g do ED obteve-se duas frações de diferentes polaridades
sendo 8,13 g da Fração Hexânica (FEH) e 0,89 g da Fração Hidroalcóolica (FHA), as
quais foram submetidas ao ensaio em CG-EM conforme descrito anteriormente, sendo
possível evidenciar na FHA a presença da di-hidrocoriandrina (21,64%) e coriandrina
(34,91%), enquanto na FEH essas furanocumarinas não foram identificadas. Ou seja,
a fração hexânica (FEH) apresentou um perfil de compostos de baixa polaridade
(apolar) e a fração hidroalcóolica (FHA) enriquecida nos compostos de média e alta
polaridade.
5.1.2.1 Fracionamento da FHA em coluna cromatográfica seca
Devido a presença das furanocumarinas de interesse na FHA realizou-se
um fracionamento em coluna cromatográfica seca da FHA (0,57 g) originando : FHA1-
2 (0,03 g); FHA3 (0,02 g); FHA4 (0,07 g); FHA5 (0,09 g); FHA6 (0,10 g) e FHA7 (0,25
g), as quais analisadas frente CG-EM , conforme descrito anteriormente, identificou-
se a presença das furanocumarinas nas frações FHA5 (75% de di-hidrocoriandrina e
18% coriandrina); FHA6 (44% di-hidrocoriandrina e 5% de coriandrina) e FHA7 (4%
de di-hidrocoriandrina e 1% de coriandrina). No entanto, as frações FHA5 e FHA6
apresentaram baixo rendimento e a fração FHA7 era constituída apenas por uma das
furanocumarinas de interesse para dar continuidade.
5.1.2.2 Obtenção da Fração Acetato de Etila (FAc) por Cromatografia em Coluna
Filtrante
A partir de 14g do ED foi efetuado o fracionamento em coluna
cromatográfica filtrante originando 0,41 g da Fração Hexânica (FHx 2,94%); 8,55 g
Fração Acetato de Etila (FAc 61%) e 2,86 g da Fração Acetato de Etila:Metanol
(FAcMe 20,43%).
A partir da avaliação dos fragmentogramas dos principais picos observados
por cromatografia gasosa na FAc, conforme descrito anteriormente foi possível sugerir
44
a presença dos seguintes compostos: di-hidrocoriandrina 34,52% (tR=19,32min);
coriandrina 14,39% (tR=19,83min); vitamina E 4,6% (tR=36,25min) e estigmasterol
7,85% (tR=38,58min), conforme apresentado na Figura 9, enquanto as
furanoumarinas não foram identificadas nas frações FHx e FAcMe.
Figura 9 - Perfil cromatográfico observado por CG-EM (HP-6890/ HP-
5975) da Fração Acetato de Etila (FAc) resultante do
fracionamento por Coluna Filtrante do Extrato
Diclorometânico.
Após submetida ao fracionamento em coluna cromatográfica de membrana
de celulose a FAc (0,54g) originou as seguintes frações: FAc1-2 (0,30g-55%); FAc3
(0,09g-17%); FAc4 (0,07g-13%) e FAc 5-6 (0,07g-13%), conforme Figura 9. A análise
por CG-EM das frações FAc1-2 e FAc3 evidenciou a presença de fitol (tR=20,74mim),
estigmasterol (tR=38,52mim) e vitamina E (tR=36,25mim). Por outro lado, na FAc4
foram identificadas as furanocumarinas di-hidrocoriandrina (64,85%) e coriandrina
(27%) e na FAc5 a presença apenas da di-hidrocoriandrina (34,17%).
5.1.2.3 Análise por Cromatografia Liquida de Alta Eficiência acoplada aos detectores
de Arranjo de Diodos e Massas
As condições analíticas foram baseadas no trabalho de Chen e
colaboradores (2009), que utilizaram o LC-ESI-MS para confirmação estrutural das
furanocumarinas (coriandrina e di-hidrocoriandrina) presentes no extrato das folhas
de C. sativum.
Para otimização das condições de ionização no LC-MS empregou-se o
padrão de cumarina, utilizando-se como eluente água: metanol, de modo gradiente.
Essas condições otimizadas foram empregadas na análise das amostras, juntamente
com a detecção por DAD, na faixa de 200 a 400 nm. Foram avaliados os extratos ED,
5 .0 0 1 0 .0 0 1 5 .0 0 2 0 .0 0 2 5 .0 0 3 0 .0 0 3 5 .0 0 4 0 .0 0 4 5 .0 0 5 0 .0 0 5 5 .0 0
0
5 0 0 0 0
1 0 0 0 0 0
1 5 0 0 0 0
2 0 0 0 0 0
2 5 0 0 0 0
3 0 0 0 0 0
3 5 0 0 0 0
4 0 0 0 0 0
4 5 0 0 0 0
T im e -->
A b u n d a n c e
T IC : C o e n t ro -C o l-A c O E t .D \ d a ta .m s
45
EE, FAc e FAcMe, sendo apresentados os cromatogramas (Figuras 10 e 11), os
espectros de UV (Figura 12) e os espectros de massas obtidos (Figura 13).
10ª
10B
Figura 10 - Cromatograma do ED (10A) e EE (10B) obtido por LC-DAD-EM. Condições
de análise: coluna C-18 Symetry, a 30°C, eluentes água e metanol em
gradiente, com vazão 0,25 mL/min e empregados detectores DAD (254 nm).
11ª
11B
Figura 11 - Cromatograma da FAc (11A) e FAcMe (11B) por LC-DAD-EM. Condições de
análise: coluna C-18 Symetry, a 30°C, eluentes água e metanol em gradiente,
com vazão 0,25 mL/min e empregados detectores DAD (254 nm).
Os espectros de massas de cada sinal observado nos diversos
cromatogramas indicaram a presença de coriandrina e di-hidrocoriandrina na forma
de adutos de sódio (M+Na)+ com íons de m/z 253 e 255 uma, respectivamente.
Adicionalmente, os espectros de UV característicos (Chen et al.,2009) para
estes compostos confirmaram a sua identificação no ED, sugerindo então a presença
dessas furanocumarinas (Figura 12).
4.28
14.
884
6.54
87.
658
8.75
1
AU
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
Minutes
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00
4.2
02
6.4
73
12.7
15
13.4
47
AU
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
Minutes
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00
3.6
68
4.2
85
4.8
90
6.5
56
9.9
10
15.3
13
AU
0.000
0.010
0.020
0.030
0.040
Minutes
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00
4.3
45
4.9
59
6.6
29
12.9
11
13.6
65
43.7
89
AU
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
Minutes
0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00
DB
C
A
E
46
Figura 12 - Espectros de UV (200 a 400 nm)
dos picos do cromatograma do
ED, apresentado anteriormente na
Figura 11.
Figura 13 - Espectros de massas dos picos apresentados no
cromatograma do ED.
Na Tabela 6 estão apresentados os principais compostos identificados nas
diferentes amostras avaliadas por LC-DAD-EM. Além da coriandrina e di-
hidrocoriandrina, observou-se a presença de outra substância com características das
Coriandrina
Di-hidrocoriandrina
Coriandrona A ou
B
A
B
C
D
E
A
B
C
D
E
47
furanocumarinas, com fragmentos em m/z 293 [M+H]+; 315 [M+Na] + e 607 [2M +Na]+,
sendo que este último pode ser atribuído ao dímero do composto, na forma de aduto
com o Na+.
Por meio dessas análises não foi possível atribuir a estrutura correta deste
composto, sugerindo de que esta substância pode ser tanto a Coriandrona A como a
Coriandrona B, uma vez que ambas possuem a mesma massa molecular (m/z 292) e
o mesmo espectro de UV, que estão de acordo com dados descritos na literatura por
Chen e colaboradores (2009). Sendo que para a confirmação estrutural desse
composto seria necessário o isolamento e posteriores análises espectroscópicas.
Tabela 6 - Furanocumarinas identificadas nas amostras ED, EE, FAc e FAcMe a partir da
análise comparativa com dados da literatura.
tR (min) Composto [M]+ [M +1] + [M +Na] + [2M +Na] +
4,20 – 4,28 Di-hidrocoriandrina 232 233 255 487
4,85 – 4,90 Coriandrona A ou B 292 293 315 607
6,42 – 6,65 Coriandrina 230 231 253 486
5.2 Ensaios Farmacológicos In Vivo
5.2.1 Teste de toxicidade aguda (Screening Hipocrático)
Durante as primeiras 4 horas, os animais submetidos a dose de 1000 mg/kg
apresentaram letargia e isolamento dos demais animais no grupo. Na dose de
500mg/kg apresentaram piloereção, característica de toxidade. Assim, a dose de 300
mg/kg foi selecionada como maior dose possível para dar continuidade aos ensaios
farmacológicos, pois não apresentou sinais de toxicidade.
5.2.2 Avaliação da atividade locomotora
O ensaio avaliou as atividades exploratória e locomotora do animal após
administração intraperitoneal de salina e FAc nas doses de 30,100 e 300 mg/kg/i.p.
A Figura 14 mostra que a FAc, nas concentrações de 100 mg/kg (p=0,0211)
e 300 mg/kg (p=0,0019), diminuiu o número de quadrados cruzados pelos animais
48
quando comparados com o grupo controle. No entanto, a FAc 30 mg/kg não afetou
este parâmetro em comparação com o controle (p=0,10).
Figura 14 - Número de travessias entre as áreas determinadas pelo campo-
aberto por período de 6 minutos. Linha central: mediana 1° e
3° quartis; Suíças=mínimo e máximo valor, *p ≤ 0.05 em
comparação com o grupo controle.
5.2.3 Contorções abdominais induzidas por ácido acético
Para a realização desse teste utilizou-se duas vias de administração
distintas: via intraperitoneal e via oral (Figura 15 e 16) com o objetivo de avaliar se a
via de administração interferiria na atividade da FAc frente a atividade antinociceptiva
No ensaio utilizando a via intraperitoneal, a indometacina a 20 mg/kg
(controle positivo) reduziu significativamente (p=0,0069) o número de contorções
abdominais induzidas pelo ácido acético, em relação ao grupo controle, conforme a
Figura 15.
A FAc 10 mg/kg não demonstrou atividade e não diferiu significativamente
do controle (p=0,69). No entanto, a FAc, nas concentrações 30 mg/kg (p=0,0056), 100
mg/kg (p=0,0208) e 300 mg/kg (p<0,0001), induziu um menor número de contorções
abdominais quando comparada ao controle.
C o n t r o l e 3 0 1 0 0 3 0 0
0
5 0
1 0 0
1 5 0
Nú
me
ro
de
tra
ve
ss
ias
F A c ( e m m g / k g )
*
*
49
Figura 15 - Contorções abdominais induzidas por ácido acético em
camundongos previamente tratados (30 minutos)
intraperitonealmente com salina (10 mL/kg), indometacina (20
mg/kg) e doses de FAc. Linha central: mediana 1° e 3° quartis;
Suíças= valores mínimo e máximo valor. * - p ≤ 0.05 em
comparação com o grupo controle.
A indometacina reduziu significativamente o número de contorções
abdominais induzido pelo ácido acético, quando comparada à FAc na dose de 10
mg/kg (p=0,0301). Entretanto, não houve diferenças entre os tratamentos para as
doses de FAc de 30 mg/kg (p=0,9562), 100 mg/kg (p=0,6408) e 300 mg/kg (p=0,1742).
Por outro lado, a administração por via oral da FAc em diferentes
concentrações não foi capaz de reduzir as contorções abdominais (p=0,8101) quando
comparadas com o grupo de controle (salina), conforme Figura 16.
C o n t r o le I n d o 1 0 3 0 1 0 0 3 0 0
0
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*
*
*
50
Figura 16 - Contorções abdominais induzidas por ácido acético em
camundongos previamente tratados (60 minutos) por via oral
com salina (10 mL/kg) e doses de FAc. Linha central: mediana
1° e 3° quartis; Suíças = valores mínimo e máximo.
5.2.4 Teste de Formalina
A injeção intraplantar de formalina na pata posterior do camundongo,
produziu intensa resposta nociceptiva em duas fases distintas. A Fase I,
compreendendo entre 0 a 5 minutos, evidencia a dor neurogênica e a Fase II, entre
25 a 45 minutos, evidenciando a dor inflamatória (Figuras 17 e 18).
Na Fase I, morfina a 20 mg/kg (p=0,0035), FAc 30 mg/kg (p=0,0406) e FAc
100 mg/kg (p=0,0038) foram capazes de reduzir a dor neurogênica em comparação
com o grupo de controle. Contudo, a dexametasona (p=0,0902) e a FAc 10 mg/kg
(p=0,1401) não mostraram diferenças significativas com o grupo de controle (Figura
17).
Na Fase I, FAc 30 mg/kg, FAc 100 mg/kg e a morfina não apresentaram
diferenças entre si. Também não foram observadas diferenças significativas (p>0,05)
entre as concentrações de FAc utilizadas. No entanto, a FAc nas concentrações de
C o n t r o le 1 0 3 0 1 0 0 3 0 0
0
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F A c ( p . o . , e m m g / k g )
51
30 mg/kg e 100 mg/kg diferiram do grupo controle, indicando efetividade independente
da dose contra a dor neurogênica.
Figura 17 - Tempo de reação na Fase I, frente a resposta da dor neurogênica
induzida pela aplicação intraplantar de formalina na pata posterior
de camundongos previamente tratados (60min) via i.p. com salina
(10 mL/kg – controle), morfina 20 mg/kg, dexametasona 5 mg/kg
e FAc. Linha central: mediana 1° e 3° quartis; Suíças= valores
mínimo e máximo. * - p ≤ 0.05 em comparação com o grupo
controle.
Os resultados da Fase II (dor inflamatória) são apresentados na Figura
18,demonstrando que o tempo de reação à injeção de formalina foi significativamente
diminuído pela morfina (p=0,0315), dexametasona (p=0,0214), FAc 30 mg/kg
(p=0,0023) e FAc 100 mg/kg (p=0,0046) quando comparado com o grupo de controle.
Apenas a FAc 10 mg/kg (p=0,12) não foi capaz de diminuir a dor
inflamatória. Não foram observadas diferenças significativas (p>0,05) entre as
concentrações de FAc. Na Fase II, não foram observadas diferenças significativas
entre as concentrações de FAc 30 mg/kg, FAc 100 mg/kg, morfina e dexametasona,
indicando efetividade contra a dor inflamatória. Evidenciando, assim, que a FAc tem
atividade em ambas as fases, similar a morfina e dexametasona, atuando tanto na dor
de origem neurogênica, quanto de origem inflamatória.
C o n t r o l e M o r f i n a D e x a 1 0 3 0 1 0 0
0
5 0
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F A c ( e m m g / k g )
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52
Figura 18 - Tempo de reação na Fase II, frente a resposta da dor inflamatória
induzida pela aplicação intraplantar de formalina na pata posterior
de camundongos previamente tratados (60min) via i.p. com salina
(10 mL/kg - Controle), morfina 20 mg/kg, dexametasona 5 mg/kg
e FAc. Linha central: mediana 1° e 3° quartis; Suíças = valores
mínimo e máximo. * - p ≤ 0.05 em comparação com o grupo
controle.
5.2.5 Edema de pata induzido por carragenina
A regressão linear (Figura 19) mostrou que a dexametasona foi capaz de
reduzir significativamente (p<0,0001) as fases inicial e tardia do edema induzido pela
carragenina. A FAc nas concentrações 30 mg/kg (p<0,0001), 100 mg/kg (p<0,0001) e
300 mg/kg (p<0,0001) induziu significativamente menos edema do que o controle ao
longo de todos os períodos na fase inicial do edema.
No entanto, na fase tardia não houve diferenças estatisticamente
significantes entre o controle e FAC 30 mg/kg (p=0,7487), FAc 100mg/kg (p=0,0704)
e FAc 300mg/kg (p=0,7933) indicando que o efeito anti-edema ocorre apenas na fase
inicial, conforme Figura 19.
C o n t r o l e M o r f i n a D e x a 1 0 3 0 1 0 0
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53
Figura 19 - Tempo de reação (média ± erro padrão) frente a resposta da variação de
volume de patas de camundongos, em modelo de inflamação induzido por
injeção intraplantar de carragenina na pata posterior previamente tratados
(30min) via i.p. com salina (10 mL/kg - controle), dexametasona 5 mg/kg
e FAc.
5.2.6 Teste de Capsaicina
A Figura 20 demonstra o efeito da FAc sobre a atividade nociceptiva
periférica induzida pela capsaicina, via sistema vanilóide (Santos e Calixto, 1997).
O tempo de reação à injecção de capsaicina foi significativamente
diminuído pela morfina 20 mg/kg (p<0,0001), FAc 30 mg/kg (p=0,0034), FAc 100
mg/kg (p=0,0123) e FAc 300 mg/kg (p=0,0371) quando comparado com o grupo de
controle. Não foram observadas diferenças significativas (p>0,05) entre as
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F a s e in i c ia l F a s e t a r d ia
54
concentrações de FAc, evidenciando um efeito independente da dose empregada,
conforme Figura 20.
Figura 20 - Tempo de resposta da dor neurogênica frente a aplicação intraplantar
de capsaicina na pata posterior de camundongos previamente tratados
(60min) via i.p. com na pata posterior previamente tratados (60min) via
i.p. com salina (10 mL/kg (controle), morfina (20 mg/kg) e FAc. Linha
central: mediana 1° e 3° quartis; Suíças = valores mínimo e máximo. * -
p ≤ 0.05 em comparação com o grupo controle.
5.3 Atividade Antiulcerogênica
5.3.1 Lesão Gástrica induzida por Etanol
Os resultados relativos ao índice de lesões ulcerativas estão apresentados
na Figura 21. A FAc na dose de 1000 mg/kg mostrou efeitos tóxicos, tais como
defecação e micção constantes, piloereção e letargia (Ullman-Cullere e Foltz, 1999) e
por esse motivo essa dose foi desconsiderada nos estudos subsequentes. Como a
dose de 100mg/kg mostrou pouco eficácia, também não foi utilizada. Como observado
anteriormente, a dose de 300 mg/kg foi selecionada, pois não apresentou sinais de
toxicidade.
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*
55
Figura 21 - Efeito sobre o índice de lesões ulcerativas - ILU (média ± desvio padrão)
da administração por via oral da carbenoxolona 200 mg/kg (CBX) e da
FAc 300 mg/kg em modelo de indução de úlcera por etanol, em ratos.
Letras distintas representam diferenças estatisticamente significantes
entre os grupos.
A Figura acima mostra o efeito citoprotetor da carbenoxolona (p<0.0001) e
da FAc (p=0,0037), as quais mostraram ILU significativamente menor do que o
controle. Não houve diferenças estatisticamente significantes entre a FAc e
carbenoxolona (p=0,3034).
5.3.2 Prostaglandina e citoproteção gástrica
Nesse modelo, as úlceras são induzidas pela inibição da síntese de
prostaglandinas. A indometacina é administrada (5 mg/kg, i.p.). previamente e a úlcera
é induzida por etanol absoluto. A inibição do ILU é apresentada na Figura 22.
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56
Figura 22 - ILU (média±DP) em função dos tratamentos com Fac 300 mg/kg
e indometacina (Indo). Letras distintas representam diferenças
estatisticamente significantes entre os grupos.
A indometacina produziu maior (p<0,0001) ILU quando comparada aos
demais grupos. A FAc reduziu significativamente o índice quando comparada ao
controle (p<0,0001) e indometacina (p<0,0001). Quando associada à FAc, a
indometacina não foi capaz de aumentar significativamente (p=0,1001) o ILU,
demostrando que a Fac foi capaz de proteger a mucosa.
5.3.3 Substâncias sulfidrílicas não protéicas e citoproteção gástrica
Nesse modelo, a úlcera é induzida por etanol absoluto, com administração
prévia de N-etilmaleimida (NEM). As percentagens de inibição de ILU estão
apresentados na Figura 23.
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57
Figura 23 - ILU (média±DP) em função dos tratamentos com Fac 300 mg/kg e NEM.
Letras distintas representam diferenças estatisticamente significantes
entre os grupos.
A Figura acima revela que a N-etilmaleimida (NEM) induziu
significativamente maior (p=0,0108) ILU do que o controle e que a FAc (p=0,0003). A
FAc não foi capaz de proteger efetivamente (p=0,3987) os animais dos efeitos da
NEM. Quando utilizada sozinha, a FAc reduziu (p=0,0018) o ILU em comparação ao
controle.
5.3.4 Atividade Antisecretora
Os resultados do modelo de ligadura do piloro evidenciaram que tanto a
FAc (p=0,0371) quanto a cimetidina (p=0,0339) reduziram o volume de secreção
gástrica quando comparadas ao controle, não havendo diferenças estatisticamente
significantes (p=0,9653) entre elas. A FAc não diminuiu (p=0,8602) a concentração de
prótons quando comparada ao controle, sendo que a cimetidina produziu menor
concentração de prótons tanto em relação ao controle (p=0,0074) quanto à FAc
(p=0,0050). O pH foi aumentado pela cimetidina tanto em relação ao controle
(p<0,0001) quanto à FAc (p=0,0002), não havendo diferenças estatisticamente
C o n t r o l e N E M F A c F A c
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c
b
58
significantes (p=0,6252) entre a FAc e o controle conforme apresentados na Figura
24.
Figura 24 - Efeito da administração oral da FAc e cimetidina sobre o volume da
secreção ácida gástrica (A), concentração de prótons (B) e pH (C), em
modelo de ligadura de piloro em ratos.
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59
6 DISCUSSÃO
O rendimento obtido com as folhas de C. sativum (3,67%) foi muito maior
do que o rendimento habitual obtido com óleos essenciais (Laribi et al., 2015). Os
dados provenientes da cromatografia gasosa foram comparados com resultados
descritos em banco de dados da biblioteca NIST e da literatura (Ceska et al., 1988;
Kraus e Ridgeway 1994; Hudson et al., 1993). Alguns constituintes, incluindo duas
furanocumarinas, foram identificados e sua presença está em acordo com outros
estudos Hudson et al., 1993; Kraus e Ridgeway 1994 e Taniguchi et al., 1991).
Os estudos fitoquímicos prévios, observando extratos a partir das folhas,
mencionam o isolamento de furanocumarinas tais como a coriandrina, di-
hidrocoriandrina e as coriandronas A, B, C, D e E (Ceska et al., 1988; Ashwood-Smith
et al., 1989; Baba et al., 1991; Taniguchi et al., 1991; Hudson et al., 1993; Kraus e
Ridgeway 1994). No presente estudo, as análises em cromatografia gasosa indicaram
a presença da coriandrina e di-hidrocoriandrina nos extratos ED e EE, confirmando
estes relatos prévios.
A identificação e a confirmação estrutural da coriandrina e da di-
hidrocoriandrina nos extratos (ED, EE, FAc e FAcMe) das folhas de C. sativum no
presente estudo foi baseada no estudo de Chen et al. (2009), os quais utilizaram o
LC-ESI-MS. Tendo mostrado os compostos de maior interesse e exibido o melhor
desempenho de extração, a FAc foi utilizada para observar as atividades
antinociceptiva, antiulcerogênica e anti-inflamatória no presente estudo.
Apesar da extensa informação sobre a composição química dos vários
tipos de extratos de C. sativum, existem poucos estudos relacionando a eficácia
terapêutica dos extratos com seus constituintes isolados. De fato, estudos sobre a
atividade farmacológica de isolados de C. sativum são escassos na literatura. O
Linalol, um monoterpeno geralmente relacionado como o componente mais
abundante em óleos essenciais, é um dos mais estudados. Esta substância tem uma
variada gama de efeitos farmacológicos, tais como atividade antioxidante,
anticancerígena, neuroprotetora (atividade indireta), ansiolítica, analgésica e anti-
inflamatória, entre outras. O ácido ascórbico, taninos, alcaloides e esteroides foram
sugeridos como compostos-chave para a atividade terapêutica e profilática contra o
câncer de extrato (acetato de etila) de coentro (Calaresi et al., 2000). A coriandrina
mostrou atividade antiviral contra alguns vírus envelopados (Hudson et al., 1993). As
60
cumarinas, especialmente as furanocumarinas, foram capazes de inibir bactérias e
fungos, tendo também atividade anti-alérgica, anti-inflamatória (inibição da
prostaglandina E) e imunossupressão (Gomes et al., 2010).
Diferentes modelos em animais foram utilizados no presente estudo.
Apesar do potencial para sofrimento, os ensaios invasivos são os classicamente
usados para estudar as propriedades anti-inflamatórias e antinociceptiva de diversos
agentes (Prut e Belzung, 2003; Kumazawa, 1996). Além disso, os resultados destes
testes fornecem uma base sólida para comparar os resultados com outros estudos.
Inicialmente, o teste de screening hipocrático foi utilizado para definir a
toxicidade do ED, extrato que originou a FAc. Foram observados diversos parâmetros
tais como a coordenação motora, estado de consciência/disposição, tônus muscular,
reflexos e atividades sobre o SNC (excitação ou depressão), avaliando a presença de
ataxia, hipotonia, ptose, salivação, micção, diarreia, tremores, convulsão (Mattei e
Carlini, 1996). As doses de ED em tratamento único de 300,500 e 1000 mg/kg foram
utilizadas via i.p., sendo os animais observados 4h após administração e diariamente
durante 14 dias, para verificar a ocorrência de sinais de toxicidade. A dose de 500
mg/kg causou piloereção e de 1000 mg/kg causou letargia e isolamento. Embora
esses sinais não evidenciem grave toxicidade, a maior dose utilizada foi fixada em 300
mg/kg.
Patel et al. (2012b) não relataram sinais de toxicidade (salivação,
convulsão, diarreia, letargia ou sonolência) de extrato hidrometanólico de sementes
de C. sativum, nas doses de 1000,2000 e 5000 mg/kg mesmo após algumas horas da
administração por via oral. Também não relataram nenhuma letalidade ou
anormalidade, sugerindo que uma dose de até 3000 mg/kg seria segura para
consumo. Da mesma forma, Taherian et al. (2012) mencionam que o extrato aquoso
das sementes de C. sativum, nas doses de 125,250,500 e 1000 mg/kg (via i.p), não
causou mortalidade ou sinais de toxicidade. Provavelmente, as diferenças de
toxicidade observadas entre os estudos se devam às diferentes polaridades dos
extratos, da parte da planta utilizada e das vias de administração.
O teste de atividade locomotora além de minimamente invasivo, é
importante para observar distúrbios não específicos da atividade locomotora em
animais. Estes distúrbios são geralmente associados com excitação ou depressão dos
61
neurônios do sistema nervoso central (SNC), aumentando ou diminuindo o
metabolismo cerebral (Anaya-Eugenio et al., 2016).
No presente estudo, a FAc nas maiores concentrações utilizadas (100 ou
300 mg/kg/i.p.) claramente deprimiu o SNC dos ratos. Portanto, essas doses maiores
poderiam em tese interferir com a atividade antinociceptiva direta. De fato, três
estudos prévios mostraram o efeito ansiolítico potencial do C. sativum. Latha et al.
(2015) relataram que o extrato aquoso das folhas de C. sativum nas doses de
50,100,200 mg/kg/i.p. apresentou atividade ansiolítica, sem sinais toxicidade. Tanto
Emamghoreishi et al. (2005), testando o extrato aquoso a 100 e 500 mg/kg, quanto
Mahendra e Bisht (2011), testando o hidroalcoólico das sementes a 100 e 200 mg/kg,
também observaram o efeito ansiolítico.
Embora Emamghoreishi et al. (2005) tenham sugerido os flavonoides e o
linalol como os principais responsáveis pelo efeito ansiolítico observado com o
composto bioativo, eles não testaram a eficácia das substâncias isoladas. Estes
autores sugeriram que a dose efetiva e segura para um ser humano adulto (de até 75
kg) seria de 7,5 g de extrato seco da semente de C. sativum. Isso corresponderia a
uma infusão de aproximadamente 20 g do extrato em 100 mL de água, corroborando
com a quantidade de coentro utilizada empiricamente na medicina tradicional. Na
medicina tradicional, as sementes de C. sativum são empiricamente empregadas em
diferentes formas e dosagens. As sementes em pó ou extrato seco são usadas de 2
a 5 g/dia e o chá de 4 a 8 g/100 mL (podendo chegar até 30g). O chá é recomendado
para insônia e ansiedade e deve ser ingerido diariamente em dose única.
O ensaio de contorção abdominal tem sido usado para avaliar propriedades
analgésicas e anti-inflamatórias de muitas substâncias (Santos et al., 2005). A
intensidade da resposta depende de vários determinantes da nocicepção, tais como
as cininas, acetilcolina, substância P e prostaglandinas. O ácido acético induz
indiretamente a liberação desses mediadores, promovendo a estimulação dos
neurônios nociceptivos. Este modelo tem sido útil para estudar a atividade
farmacológica de substâncias com diferentes mecanismos de ação, tais como a
aspirina, os antagonistas dos receptores de cininas e os opióides (Florentino et al.,
2016). Permite a avaliação da atividade antinociceptiva causada pela dor neurogênica
e inflamatória. A transmissão da dor inflamatória envolve principalmente receptores
polimodais em torno de pequenos vasos que sinalizam ao SNC por meio de fibras tipo
62
C sensoriais aferentes, entrando no corno dorsal. Apesar da boa sensibilidade do
ensaio, este mostra uma especificidade questionável e erro potencial de interpretação
dos resultados devido a estímulos não-específicos na nocicepção. Outros modelos
nociceptivos têm sido utilizados para evitar esse problema (Wheeler-Aceto et al.,
1990).
No presente estudo, este foi o primeiro teste de triagem nas propriedades
antinociceptiva da FAc, a qual foi testada por via oral e intraperitoneal. As diferenças
entre os resultados obtidos usando essas vias revelaram algumas das características
farmacocinéticas da FAc, sugerindo que a ingestão de espécies de C. sativum, como
fonte de alimentação, não produz atividades antinociceptiva ou anti-inflamatória
consistentes. Assim, FAc foi administrada apenas por via intraperitoneal nos demais
ensaios no presente estudo.
No presente estudo, as maiores concentrações da FAc reduziram o tempo
de reação em ambas as fases do teste de formalina. A injeção intraplantar de formalina
estimula as fibras nervosas nociceptoras aferentes produzindo dor intensa, revelada
pelo ato de lamber, morder ou agitar vigorosamente a pata (Tjolsen et al., 1992). Este
teste é um modelo de nocicepção bifásico útil para distinguir a propriedade anti-
neurogênica (fase I) e as propriedades anti-inflamatórias (fase II) de uma substância
desconhecida (Santos et al., 1997).
A Fase I inicia imediatamente após a injeção da formalina e se estende
durante os primeiros cinco minutos, ocorrendo a dor aguda neurogênica. Esta é
mediada pela liberação da substância P e glutamato no SNC e é induzida pela
ativação direta de terminais nervosos nociceptivos e pela participação de mediadores
periféricos como a substância P, bradicinina, histamina e serotonina. Essa fase é
sensível a fármacos que interagem com o sistema opióde, sendo inibida por agonistas
opióides como a morfina (Hunskaar et al., 1985; Hunskaar e Hole 1987).
Já a dor inflamatória ocorre na fase II e é mediada por uma combinação de
estímulos periféricos (liberação de histamina, serotonina, bradicinina e
prostaglandinas) e pela sensibilização da medula espinhal (Szallasi et al., 1993).
Aparece entre 25 e 45 minutos após injeção da formalina esta fase é sensível aos
anti-inflamatórios esferoidais, AINES e aos analgésicos opióides de ação central
(Hunskaar e Hole 1987; Marinho et al., 2011).
63
A injeção de formalina também provoca um aumento significativo nos níveis
de outros mediadores relacionados à dor neurogênica (aminoácidos e cininas) e à
inflamação (prostaglandinas e leucotrienos) na medula espinhal (Pinto et al., 2015).
Como observado no presente estudo, a primeira e a segunda fase foram inibidas pelo
opióide, mas o anti-inflamatório utilizado apenas inibiu a segunda fase (Singh et
al.,2015). De fato, a indometacina e outros anti-inflamatórios não-esteroides não são
verdadeiramente eficazes para inibir o edema induzido pela formalina, o qual ocorre
após a segunda fase (Szallasi et al., 1993). A inflamação sozinha parece insuficiente
para provocar a segunda fase. Leveduras e carragenina são considerados estímulos
inflamatórios que induzem grande grau de inflamação, produzindo comportamentos
de dor em ratos (Bingham et al., 2005).
Alguns processos bioquímicos na medula espinhal são importantes para o
desenvolvimento da dor na segunda fase, pois foi demonstrado que a injeção de
anestésicos locais após a primeira fase seria capaz de impedir a segunda fase
(Szallasi et al., 1993). No entanto, quando a naloxona foi usada para reverter o
bloqueio da primeira fase induzido por opiáceos, a segunda fase também não ocorreu.
Na verdade, o comportamento de dor induzido pela formalina somente é abolido
quando os anestésicos locais são utilizados em ambas as fases. Claramente, tanto os
processos na medula espinhal envolvidos na primeira fase, quanto as alterações
inflamatórias da segunda fase são necessários para os comportamentos de dor
observados na segunda fase (Szallasi et al., 1993). Assim, a FAc no presente estudo
exibiu uma atividade similar aos opiáceos, inibindo ambas as fases do processo.
O modelo de edema nas patas traseiras induzido pela capsaicina e
carragenina foram feitos para observar as ações seletivas da FAc na dor neurogênica
e inflamatória, respectivamente. Este sistema de dor está envolvido na sensibilização
de diversos transtornos e é considerado um alvo importante para o controle da dor
(Pelissier et al., 2002). A capsaicina é o componente principal responsável pelos
efeitos irritantes e inflamatórios das pimentas do gênero Capsicum, pela ativação o
potencial transiente do receptor vaniloide tipo 1 ou canal TRPV1 e pela indução da
liberação de neuropeptideos (substância P, taquiquinina, serotonina e histamina). O
TRPV1 é expresso em nociceptores, media a dor neurogênica crônica/aguda e é um
alvo importante em estudos de dor. Assim, os agentes que bloqueiam este receptor
podem ser úteis para o tratamento da dor (Lopes et al., 2014). O edema ocorre devido
64
ao aumento da vasodilatação, do fluxo sanguíneo e da permeabilidade dos vasos
sanguíneos. Os glicocorticoides e as drogas anti-histaminergicas podem diminuir
efetivamente os efeitos da capsaicina (Boakye et al., 2016).
Alguns AINEs também têm demonstrado eficácia. A administração
intraperitoneal de diclofenaco a 25 mg/kg, 30 min antes da injecção de capsaicina,
diminui marcadamente os efeitos da injeção capsaicina (Zuntini-Viscardi et al., 2017).
No entanto, a administração oral de celecoxibe (dose única de 10 mg/kg)
ou rofecoxib (10 mg/kg duas vezes ao dia, por 5 dias) não teve efeito sobre a
frequência de retirada da pata, 30 min após a injeção de capsaicina, quando medidos
por filamentos de Von Frey (Chen et al., 2016).
Opioides exercem efeitos antinociceptivos pronunciados, particularmente
em tecidos inflamados, desde que os receptores opióides estejam presentes nos
terminais nervosos sensoriais periféricos, sendo excitados durante a inflamação. A
administração local de morfina inibe os efeitos da capsaicina e, no presente estudo,
seu efeito típico foi demostrado (Pelissier et al., 2002).
Assim, baseado nos resultados do presente estudo, sugere-se que a FAc
tem um efeito analgésico central, provavelmente inibindo receptores TRPV1.
O ensaio do edema induzido por carragenina foi usado no presente estudo
para observar a possível atividade da FAc contra mediadores pró-inflamatórios. Este
modelo também tem duas fases distintas: uma fase inicial que começa imediatamente
após a injeção de carragenina e tem duração de aproximadamente 6 h e uma fase
posterior, a qual começa 6 horas após a injeção de carragenina e termina 72 h após
a sua injeção. O pico de inflamação é observado entre 48 e 72 h (Lopes et al., 2014;
Nunes et al., 2007). Neste ensaio, o edema é mediado principalmente pela histamina,
pela serotonina e pelo aumento da síntese de prostaglandinas na fase inicial (entre 1
h e 2 h após a injeção). A liberação direta de prostaglandinas pelos tecidos
danificados, junto com a bradicinina, leucotrienos, células polimorfonucleares e pelas
prostaglandinas produzidas por macrófagos são responsáveis pela fase posterior do
edema (Boakye et al., 2016).
No presente estudo, como esperado, a dexametasona reduziu as fases
inicial e tardia do edema induzido pela carragenina. A FAc induziu significativamente
menor edema do que o controle durante todo o experimento. No entanto, não foram
65
observadas diferenças entre a FAc e o controle durante a fase posterior, indicando
que o efeito da fração só foi importante durante a fase inicial, considerando o modelo
proposto aqui (dose única da FAc). Assim, a atividade anti-inflamatória exibida pela
FAc poderia ser devida à inibição da síntese ou liberação de mediadores infamatórios
ou até mesmo pela a inibição direta de mediadores da inflamação induzida pela
carragenina.
Um estudo prévio demonstrou a atividade anti-inflamatória potencial do C.
sativum (Wu et al., 2010). Os autores mostraram a inibição in vitro de mediadores pró-
inflamatórios (PGE2 e óxido nítrico) produzidos por macrófagos. As atividades anti-
inflamatória e antinoceptiva de muitas plantas foram atribuídas aos flavonoides,
terpenos e esteroides (Santos et al., 2005). A composição essencial da FAc
(sesquiterpenos, furanocumarinas e esteroides) poderia explicar as atividades
farmacológicas observadas no presente estudo.
Segundo Carvalho (2006) a úlcera gástrica e a inflamação têm em comum
o estresse oxidativo, o qual é gerado pela atividade aumentada de células fagocitárias,
entre outros fatores. Assim, é possível que plantas que exibem propriedades anti-
inflamatórias poderiam apresentar atividade contra úlcera gástrica. De fato, muitos
novos agentes antiúlcera foram propostos a partir de fontes naturais utilizados na
medicina popular tais como o gengibre (Zingiber officinale), a gabiroba
(Campomanesia xanthocarpa) e a espinheira santa (Maytenus ilicifolia), resultando
em diversos compostos isolados.
A atividade antiulcerogênica da FAc foi monitorada utilizando a indução de
lesões gástricas por etanol, o qual é um conhecido agente irritante da mucosa gástrica
(Pacheco et al., 2006). As lesões gástricas induzidas por esse agente envolvem a
depressão dos mecanismos de defesa gástrica, assim como a redução da produção
do muco, do fluxo sanguíneo da mucosa gástrica, da secreção de bicarbonato, da
glutationa endógena e das prostaglandinas (Silvério et al., 2008). Também causa o
aumento da liberação de histamina, influxo de cálcio, produção de leucotrienos,
liberação de endotelinas e degranulação de mastócitos (Samonina et al., 2004), além
de espécies reativas de oxigênio e de um aumento de mediadores inflamatórios
expressos pelo aumento de IL-β e TNF-β, ocasionada pela peroxidação lipídica
(Miyahara et al., 2011).
66
O resultado da utilização do etanol é o aparecimento de lesões necróticas
na mucosa gástrica e o aumento da quantidade de ácido clorídrico, o qual acelera e
agrava o processo. As ulcerações não são inibidas por substâncias que interferem na
secreção de ácido (cimetidina), mas são inibidas por agentes que aumentam os
fatores de defesa da mucosa, tais como as prostaglandinas (Donatini et al., 2009). A
carbenoxolona sódica (utilizada como controle positivo nesse ensaio) causa aumento
dos níveis de prostaglandinas na mucosa gástrica, o que consequentemente promove
um aumento na produção de bicarbonato e muco garantindo uma maior proteção
contra ataques ácidos e outros agentes agressores (Foneska e Kaunitz, 2010).
Donatini et al. (2009) observaram que o Syzygium jambos apresentou um
excelente efeito preventivo de lesões gástricas, sendo que o mecanismo sugerido foi
a produção de fatores citoprotetores, devido a sua intensa atividade antioxidante. Leite
et al. (2005) também observaram um forte potencial antioxidante para a Momordica
charantia, associado à presença de compostos esteroides identificados em suas
folhas. Com efeito, Dias et al. (2009) observaram que compostos antioxidantes seriam
potentes agentes antiulcerogênicos, especialmente aqueles que teriam compostos
fenólicos, flavonoides, α-tocoferol. Na composição da FAc foi identificada a presença
desses compostos, o que poderia explicar a sua atividade antioxidante e citoprotetora.
Obviamente a atividade anti-inflamatória da FAc também pode ter
participação efetiva na sua atividade antiulcerogênica, estimulando a secreção de
bicarbonato e muco, auxiliando na manutenção do fluxo sanguíneo da mucosa e na
regulação da renovação e proteção das células da mucosa (Schubert, 2000).
Entretanto, os resultados do ensaio com a indometacina sugerem que o mecanismo
de ação antiulcerogênica da FAc não estaria relacionado com o aumento da síntese
de prostaglandinas ou da redução da sua degradação.
O segundo mecanismo avaliado neste estudo foi a participação dos grupos
sulfidrilas não-proteicos, principalmente a glutationa, encontrados em quantidades
elevadas na mucosa gástrica. Esses grupos atuam contra o efeito de espécies
reativas de oxigênio (ROS) sobre a mucosa gástrica (Popovic, 2009). O trato
gastrointestinal tem a capacidade de produzir grandes quantidades de ROS pelas
oxidases de mucosa, tais como a xantina oxidase, mieloperoxidase (MPO) e NADPH
oxidase, encontrada em leucócitos residentes (macrófagos, neutrófilos e eosinófilos)
da lâmina própria (Grisham e Granger, 1988). Diversos fatores podem acarretar o
67
aumento da produção de ROS. Entre eles, se destacam o processo inflamatório e o
consequente recrutamento de neutrófilos por citocinas pró-inflamatórias (IL-1 e IL-6)
e TNF-α (Dong e Kaunitz, 2006).
O envolvimento de ROS na patogênese das úlceras gástricas está
relacionado com o desequilíbrio entre a liberação de espécies reativas de oxigênio e
a capacidade de ação dos sistemas de defesa biológico antioxidante, promovendo o
estresse oxidativo. Esse quadro fisiológico reduz ainda mais o nível de antioxidantes
endógenos, resultando em uma mucosa gástrica mais vulnerável a danos, com células
parcialmente danificadas, levando a necrose, apoptose e formação de ulcerações da
mucosa gástrica decorrente do estresse oxidativo, provocado pelas ROS podendo
levar até a formação de processos tumorais (Bandyopadhyay et al., 2001).
No modelo experimental utilizado, os animais foram previamente tratados
com um agente alquilante das substâncias sulfidrílicas, a N-etilmaleimida (NEM), o
qual provoca a inativação das sulfidrilas e consequentemente à perda da capacidade
antioxidante (Arrieta, 2003). Os resultados demonstraram que a FAc mostrou uma
redução da sua atividade antiulcerogênica quando associada ao NEM, sugerindo que
o mecanismo de ação da FAc poderia ter relação com as substâncias sulfidrílicas. Al-
Mofleh et al. (2006) também observaram aumento dos níveis de substâncias
sulfidrílicas não protéicas, após pré-tratamento com suspensão aquosa das sementes
de C. sativum a 500 mg/kg.
A atividade antissecretória da FAc foi avaliada pelo modelo de ligadura do
piloro, desenvolvido por Shay et al. (1945). Este modelo induz a hipersecreção do
ácido gástrico por reflexo vagal, estimulado pela ligadura das fibras sensitivas da
parede gástrica, aumentando o tono muscular e a liberação de secreção ácida gástrica
(Lapa et al., 2008). Nesse modelo, após o tratamento intraduodenal com a FAc, a
concentração de íons H+ e o pH mantiveram-se inalterados.
Assim, a atividade antiulcerogênica observada para a FAc poderia estar
relacionada com a citoproteção, particularemente interferindo com substâncias
sulfidrílicas não-proteicas, e atividade anti-secretora, mas não com a sua interferência
no pH ou na concentração de íons H+.
68
7 CONCLUSÃO
Os resultados obtidos nos experimentos ao longo desse trabalho permitem
concluir que:
A FAc obtida a partir do ED apresentou melhor rendimento e maior rendimento,
sendo constituída pelas furanocumarinas di-hidrocoriandrina (34,52%),
coriandrina (14,39%), vitamina E (4,6%) e estigmasterol (7,85%).
A FAc foi submetida a testes in vivo, e apresentou atividades anti-inflamatória,
antinociceptiva e antiulcerogênica.
Frente às atividades farmacológicas obtidas nesse estudo, o C. sativum L. é
uma planta medicinal promissora para o desenvolvimento de futuros
fitoterápicos.
69
REFERÊNCIAS1
Aissaouri A, El-Hilaly J, Israili ZH, Lyoussi B. Acute diuretic effect of continuous
intravenous infusion of na aqueous extract of Coriandrum sativum L. in anesthetized
rats. J Ethnopharmacol. 2008 Jan;115(1):89-95.
Al-Mofleh IA, Alhaider AA, Mossa JS, Al-Sohaibani MO, Rafatullah S, Qureshi S.
Protection of gastric mucosal damage by Coriandrum sativum L. pretreatment in Wistar
albino rats. Environ Toxicol Pharmacol. 2006 Jul;22(1):64-9.
Anaeigoudari A, Hosseini M, Karami R, Vafaee F, Mohammadpour T, Ghorbani A, et
al. The effect of different fractions of Coriandrum sativum on pentylenetetrazole-
induced seizure and brain tissues oxidative damage in rats. Avicenna J Phytomed.
2016 Mar/Apr;6(2):223-35.
Anaya-Eugenio GD, Rivero-Cruz I, Bye R, Linares E, Mata R. Antinociceptive activity
of the essential oil from Artemisia ludoviciana. J Ethnopharmacol. 2016 Feb;179:403-
11.
APG (Angiosperm Phylogeny Group) III. An update of the Angiosperm Phylogeny
Group classification for the orders and families of flowering plants: APG III. Bot J Linn
Soc. 2009 Oct;161(2):105-21.
Arrieta J, Benitez J, Flores E, Castilho C, Nacarrete A. Purification of gastroprotective
triterpenoids from the stem bark of Amphipterugium adstringens; role of
prostaglandins, sulfhydruls, nitric oxide and capsaicin-sensive neurons. Planta Med.
2003 Oct;69(10):905-9.
Ashwood-Smith MJ, Warrington PJ, Jenkins M, Ceska O, Romaniuk PJ.
Photobiological properties of a novel, naturally occurring furoisocoumarin, coriandrin.
Photochem Photobiol. 1989 Dec;50(6):745-51.
1 De acordo com as normas da UNICAMP/FOP, baseadas na padronização do International Committee of Medical Journal Editors – Vancouver Group. Abreviatura dos periódicos em conformidade com o PubMed.
70
Baba K, Xiao YQ, Taniguchi M, Ohishi H, Kozawa M. Isocoumarins from Coriandrum
sativum. J Photochem Photobiol A Chem. 1991;30(12):4143-6.
Bandyopadhyay D, Biswas K, Bhattacharyya M, Reiter RJ, Banerjee RK. Gastric
toxicity and mucosal ulceration induced by oxygen-derived reactive species: protection
by melatonin. Curr Mol Med. 2001Sept;1(4):501-13.
Begnami AF, Duarte MCT, Furletti VF, Rehder VLG. Antimicrobial potential of
Coriandrum sativum L. against different Candida species: in vitro. Food Chem.
2010;118(1):74-7.
Bhat S, Kaushal P, Kaur M, Sharma HK. Coriander (Coriandrum sativum L.):
Processing, nutritional and functional aspects. African J Plant Sci. 2014 Jan;8(1):25-
33.
Bhattachacharjee SK. Handbook of medicinal plants. Jaipur: Pointer Publishers; 2001.
Bingham B, Beswick PJ, Bountra C, Brown T, Campbell IB, Chessell IP, et al. The
cyclooxygenase-2 inhibitor GW406381X [2-(4-ethoxyphenyl)-3-[4-(methylsulfonyl)
phenyl]-pyrazolo[1,5-b]pyridazine] is effective in animal models of neuropathic pain
and central sensitization. J Pharmacol Exp Ther. 2005 Mar;312(3):1161-9.
Boakye YD, Agyare C, Abotsi WK, Ayande PG, Ossei PP. Anti-inflammatory activity of
aqueous leaf extract of Phyllanthus muellerianus (Kuntze) exell. And its major
constituent, geraniin. J Ethnopharmacol. 2016 Jul;187:17-27.
Buckle J. Clinical aromatherapy: essential oils in healthcare. 3. ed. Edinburgh:
Churchill Livingstone Elsevier; 2015, p.37-72.
Cai Y, Baer-Dubouska W, Ashwood-Smith MJ, Ceska O, Tachibana S, Digiovanni J.
Mechanism-based inactivation of hepatic ethoxyresorufin O-dealkylation activity by
naturally occurring coumarins. Chem Res Toxicol . 1996 Jun;9(4):729-36.
71
Cai Y, Bannetti D, Nair RV, Ceska O, Ashwood-Smith MJ, Digiovanni J. Inhibition and
activation of murine hepatic ethoxy-and pentoxyresorufin O-dealkylase by naturally
occurring coumarins. Chem Res Toxicol. 1993 Nov/Dec;6(6):872-9.
Cai Y, Dubowshi A, Ashwood-Smith MJ, Digiovanni J. Inhibitory effects of naturally
occurring coumarins on the metabolic activation of benzo [a] pyrene and 7,12-
dimethylbenz [a] anthracene in cultured mouse keratinocytes. Carcinogenesis.
1997a;18(1):215-22.
Cai Y, Kleiner H, Johnston D, Dubowshi A, Bostic S, Ivie W, et al. Effect of naturally
occurring coumarins on the formation of epidermal DNA adducts and skin tumors
induced by benzo [a] pyrene and 7,12-dimethylbenz [a] anthracene in SENCAR mice.
Carcinogenesis. 1997b;18(8):1521-7.
Calaresi P, Centonze D, Gubellini P, Pisani A, Bernardi G. Acetylcholine-mediated
modulation of striatal function. Trends Neurosci. 2000 Mar;23(3):120-6.
Camargo MTLA. Medicina popular: cadernos de folclore, n. 8. São Paulo: Ed. Gráfica
Evoluarte; 1976.
Carvalho JE. Atividade antiulcerogênica e anticâncer de produtos naturais e de
síntese. Multiciência (UNICAMP). 2006;7:1-18.
Ceska O, Chaudhary SK, Warrington P, Ashwood-Smith MJ, Bushnell GW, Poulton
GA. Coriandrin, a novel highly photoactive compound isolated from Coriandrum
sativum. Phytochemistry. 1988;27(7):2083-7.
Chen H, Pu J, Liu D, Yu W, Shao Y, Yang G, et al. Anti-inflammatory and
antinociceptive properties of flavonoids from the fruits of black mulberry (Morus nigra
L.). PLoS One. 2016 Apr;11(4):e0153080. doi: 10.1371/journal.pone.0153080
Chen Q, Yao S, Huang X, Luo J, Wang J, Kong L. Supercritical fluid extraction of
Coriandrum sativum and subsequent separation of isocoumarins by high-speed
counter-current chromatography. Food Chem. 2009 Dec;117(3):504-8.
72
Cionca O, Hritcu L, Mihasan M, Trifan A, Hancianu M. Inhalation of coriander volatile
oil increased anxiolytic –antidepressant- like behaviors and decreased oxidative status
in beta-amyloid (1-42) rat model of Alzheimer’s disease. Physiol Behav. 2014
May;131:68-74.
Costa-e-Sousa RH, Silveira JWS, Cortes WS, Monteath S, Echevarria A, Maciel MAM,
et al. Avaliação da atividade antinociceptiva do extrato hidroalcoólico das folhas e
galhos de Croton sacaquinha (Euphorbiaceae). Rev Cien Vida. 2010;30(1):12-32.
Dias LFT, Melo ES, Hernandes LS, Bacchi EM. Atividades antiulcera e antioxidante
Baccharis trimera (Less). Rev Bras Farmacogn. 2009 jan/mar; 19(1B):309-14.
Diederichsen A. Coriander (Coriandrum sativum L.) Promoting the conservation and
use of underutilized and neglected crops. Institute of Plant Genetic C. sativum and
Crop Plant Research. Gaterslebem: International Plant Genetic Resources Institute,
Rome; 1996.
Domer JE. Monosaccharide and chitin content of cell walls of Histoplasma
capsulatum and Blastomyces dermatitidis. J Bacteriol. 1971 Sept;107(3):870-7.
Donatini RS, Ishikawa T, Barros SBM, Bacchi EM. Atividade antiúlcera e antioxidante
do extrato de folhas de Syzygium jambos (L.) Alston (Myrtaceae). Rev Bras
Farmacogn. 2009;19(1A):89-94.
Dong MH, Kaunitz JD. Gastroduodenal mucosal defense. Curr Opin
Gastroenterol. 2006 Nov;22(6):599-606.
Ebermann R, Kreitner M, Kubin A. Natural products derived from plants as potential
drugs for the photodynamic destruction of tumor cells. J Photochem Photobiol B. 1996
Nov;36(2):95-7.
Eguale T, Tilahun G, Debella A, Feleke A, Makonnen E. In vitro and in vivo anthelmintic
of crude extracts of Coriandrum sativum against Haemonchus contortus. J
Ethnopharmacol. 2007 Apr;110(3):428-33.
73
Emamghoreishi M, Heidari-Hamedani G. Sedative-hypnotic activity of extracts and
essential oil of coriander seeds. Iran J Med Sci. 2006; 31(1):22-7.
Emamghoreishi M, Khasaki M, Aazam MF. Coriandrum sativum: evaluation of its
anxiolytic effect in the elevated plus-maze. J Ethnoparmacol. 2005 Jan;96(3):365-70.
Emanghoreishi M, Heidari-Hamedani GH. Effect of extract and essential oil of
Coriandrum sativum seed against pentylenetrazole- induced seizure. Pharm Sci. 2008
Fall;7(3):1-10.
Florentino IF, Silva DP, Galdino PM, Lino RC, Martins JL, Silva DM, et al.
Antinociceptive and anti-inflammatory effects of Memora nodosa and allantoin in mice.
J Ethnopharmacol. 2016 Jun;186:298-304.
Foneska D, Kaunitz JD. Gastroduodenal mucosal defense. Curr Opin Gastroenterol.
2010;26(2):604-10.
Franco, G. Tabela de composição química dos alimentos. 9. ed. São Paulo: Atheneu;
2008.
Gamberini MT, Skarupa LA, Souccar C, Lapa AJ. Inhibition of gastric secretion by a
water extract from Baccharis triptera, Mart. Mem Inst Oswaldo Cruz. 1991;86 Suppl
2:137-9.
Gastón MS, Cid MP, Vazquez AM, Decarlini MF, Demmel GI, Rossi L, et al. Sedative
effect of central administration of Coriandrum sativum essential oil and its major
component linalool in neonatal chicks. Pharm Biol. 2016 Oct;54(10):1954-61.
Gomes NM, Rezende CM, Fontes SP, Matheus ME, Pinto AC, Fernandes PD.
Characterization of the antinociceptive and anti-inflammatory activities of fractions
obtained from Copaifera multijuga Hayne. J Ethnopharmacol. 2010 Mar;128(1):177-
83.
74
Gray AM, Flatt PR. Insulin-releasing and insulin-like activity of traditional anti-diabetic
plant Coriandrum sativum. Br J Nutr. 1999 Mar;81(3):203-9.
Grieve, M. A modern herbal. Mineonla: Dover Publ.; 1971.
Grisham MB, Granger DN. Neutrophil-mediated mucosal injury role of reactive oxigen
metabolites. Dig Dis Sci. 1988;33(3):6-15.
Heidari M, Aghili M, Soltaninezhad E. Evaluation of anti-inflammatory and analgesic
effects of Coriandrum sativum extract in mice. J Qazvin Univ of Med Sci. 2005;33:1-3.
Hosseinzadeh H, Madanifard M. Anticonvulsant effects of Coriandrum sativum L. seed
extracts in mice. Arch Iran Med. 2000;3:81-4.
Hudson JB, Graham EA, Harris L, Ashwood-Smith MJ. The unusual UVA-dependent
antiviral properties of the furoisocoumarin, coriandrin. Photochem Photobiol. 1993
Mar;57(3):491-6.
Hunskaar S, Fasmer OB, Hole K. Formalin test in mice, a useful technique for
evaluating mild analgesic. J Neurosci Methods. 1985 Jun;14(1):69-73.
Hunskaar S, Hole K. The formalin test in mice: dissociation between inflammation and
non-inflammation pain. Pain. 1987 Jul;30(1):103-14.
Jabeen Q, Bashir S. Lyoussi B, Gilani AH. Coriander fruit exhibits gut modulatory,
blood pressure lowering and diuretic activites. J Ethnopharmacol. 2009
Feb;122(1):123-30.
Jagtap AG, Shirke SS, Phadke AS. Effect os polyherbal formulation on experimental
models of inflammatory bowel diseases. J Ethnopharmacol. 2004 Feb;90(2/3):195-
204.
75
Kasmaei HD, Ghorbanifar Z, Zayeri F, Minaei B, Kamali SH, Rezaeizadeh H, et al.
Effects of Coriandrum sativum syrup on migraine: a randomized, triple-blind, placebo-
controlled trial. Iran Red Crescent Med J. 2016;18(1):1-7.
Koster R, Anderson M, Beer EJ. Acetic acid for analgesic screening. Fed Proceding.
1959;18:412-20.
Kraus GA, Ridgeway J. Total synthesis of coriandrin. J Org Chem. 1994;59(17):4735-
7.
Kumazawa T. The polymodal receptor: bio-warning and defense system. Prog Brain
Res. 1996;113:3-18.
Lal AAS, Kumar T, Murthy PB, Pillai KS. Hypolipidemic effect os Coriandrum sativum
L. in triton-induced hyperlipidemic rats. Indian J Exp Biol. 2004 Sept;42(9):909-12.
Lapa AJ, Souccar C, Lima-Landman MTR, Castro MAS, Lima TCM. Métodos de
avaliação da atividade farmacológica de plantas medicinais. 5. ed. Porto Alegre:
Sociedade Brasileira de Plantas Medicinais; 2008.
Laribi B, Kouki K, M'Hamdi M, Bettaieb T. Coriander (Coriandrum sativum L.) and its
bioactive constituents. Fitoterapia. 2015 Jun;103:9-26.
Latha K, Rammoham B, Sunanda BPV, Maheswar MS. Evaluation of anxiolytic activity
of aqueous extract of Coriandrum sativum in mice: a preliminary experimental study.
Pharmacognosy Res. 2015 Jun;7(Suppl 1):47-51.
Laws, B. 50 plantas que mudaram o rumo da História. Rio de Janeiro: Sextante; 2013.
Lee JS, Kim MJ, Park SH, Lee SB, Wang T, Jung US, et al. Effects of dietary mixture
of garlic (Allium sativum) coriander (Coriandrum sativum) and probiotic on immune
responses an caecal counts in young laying hens. J Anim Physiol Anim Nutr (Berl).
2017 Oct;101(5):e122-32. doi: 10.1111/jpn.12573
76
Leite KL, Nunes-Pinheiro DC, Campello CC. Efeito gastroprotetor do extrato hexânico
de partes aéreas de Momordica charantia. Ciên Anim. 2005;15(1):15-20.
Leung AY. Encyclopedia of common natural ingredients used in food, drugs and
cosmetic. New York: John Wiley and Sons Inc.; 1980.
Liu QF, Jeong H, Lee JH, Hong YK, Oh Y, Kim YM, et al. Coriandrum sativum
Suppresses Aβ42-Induced ROS Increases, Glial Cell Proliferation, and ERK
Activation. Am J Chin Med. 2016;44(7):1325-47.
Liu QF, Lee JH, Kim YM, Lee S, Hong YK, Hwang S. In vivo screening of traditional
medicinal plants for neuroprotective activity against Aβ42 cytotoxicity by using
drosophila models of Alzheimer’s disease. Biol Pharm Bull. 2015;38(12):1891-901.
Lopes LC, Carvalho JE, Kakimore M, Vendramini-Costa DB, Medeiros MA, Spindola
HM, et al. Pharmacological characterization of Solanum cernuum Vell.: 31-
norcycloartanones with analgesic and anti-inflammatory properties.
Inflammopharmacology. 2014 Jun;22(3):179-85.
Lorenzi H, Matos FJA. Plantas medicinais no Brasil: nativas e exóticas. Editora
Plantarum, Nova Odessa -SP. 2002, 544p.
Mahendra P, Bisht S. Anti-anxiety activity of Coriandrum sativum assessed using
different experimental anxiety models. Indian J Pharmacol. 2011;43(5):547-77.
Mani V, Parle M, Ramasamy K, Majeed ABA. Reversal of memory deficits by
Coriandrum sativum leaves in mice. J Sci Food Agric. 2011 Jan;91(1):186-92.
Marinho DG, Alviano DS, Matheus ME, Alviano CS, Fernandes PD. The latex obtained
from Hancornia speciosa possesse anti-inflammatory activity. J Ethnopharmacol. 2011
May;135(2):530-7.
77
Matasyoh JC, Maiyo ZC, Ngure RM, Chepkorir R. Chemical composition and
antimicrobial activity of the essential oil of Coriandrum sativum. Food Chem.
2009;113(2):526-9.
Mattei R, Carlini EA. A comparative study of the anorectic and behavioral effects of
fenproporex on male and female rats. Braz J Med Biol Res. 1996a Aug;29(8):1025-30.
Mattei R, Carlini EA. Mazindol: anorectic an behavioral effects in female rats. Arch Int
Pharmacodyn Ther. 1996b Nov/Dec;330(3):279-87.
Miyahara MRM, Imamura PM, Freitas JC, Leonor SJ, Baffa O, Kinoshita A, et al. Anti-
oxidative and anti-ulcerogenic activity of Ipomoea imperati. Rev Bras Farmacogn.
2011;2 (6):978-85.
Nassiri-Asl M, Mortazari SR, Samiee-Rad F, Zangivand AA, Safdari F, Saroukhani S,
et al. The effects of rutin on the development of pentylenetetrazole kindling and
memory retrieval in rats. Epilepsy Behav. 2010 May;18(1/2):50-3.
Nunes FPB, Sampaio SC, Santoro ML, Sousa e Silva MCC. Long-lasting anti-
inflammatory properties of Crotalus durissus terrificus snake venom in mice. Toxicon.
2007 Jun;49(8):1090-8.
Ody P. Las plantas medicinales. 3. ed. Londres: Dorling Kindersley; 1995.
Pacheco MTB, Bighetti E, Antonio M, Carvalho JE, Rosaneli CF, Sgarbieri V. Efeito de
um hidrolisado de proteínas de soro de leite e seus peptídeos na proteção de lesões
ulcerativas da mucosa gástrica de ratos. Rev Nutr Campinas. 2006;19(1):47-55.
Patel D, Desai S, Gajaria T, Devkar R, Ramachandran AV. Coriandrum sativum L.
seeds extract mitigates lipotoxicity in raw 264.7 cells and prevents atherogenic
changes in rats. EXCLI J. 2013 Apr;12:313-34.
78
Patel DK, Desai SN, Gandhi HP, Devkar RV, Ramachandron AV. Cardio protective
effect of Coriandrum sativum L. on isoproterenol induced myocardial necrosis in rats.
Food Chem Toxicol. 2012a Sept; 50(9):3120-5.
Patel D, Desai S, Devkar R, Ramachandran AV. Acute and sub-chronic toxicological
evaluation of hydro-methanolic extract of Coriandrum sativum L. seeds. EXCLI J.
2012b Aug;11:566-75.
Pedrosa FF, Negreiros MZ, Nogueira ICC. Aspectos gerais da cultura do coentro. Inf
Agropecu. 1984;10(120):75-8.
Pelissier T, Pajot J, Dallel R. The orofacial capsaicin test in rats: effects of diferente
capsaicin concentrations and morphine. Pain. 2002 Mar;96(1/2):81-7,
Pinto NC, Machado DC, Silva JM, Conegundes JL, Gualberto AC, Gameiro J, et al.
Pereskia aculeata Miller leaves present in vivo topical anti-inflammatory activity in
models of acute and chronic dermatites. J Ethnopharmacol. 2015 Sept;173:330-7.
Popovic M, Janicijevic-Hudomal S, Kaurinovic B, Rasic J, Trivic S. Antioxidant effects
of some drugs one ethanol-induced ulcers. Molecules. 2009 Feb;14(2):816-26.
Prut L, Belzung C. The open field as a paradigm to measure the effects of drugs on
anxiety-like behaviors: a review. Eur J Pharmacol. 2003 Feb;463(1/3):3-33.
Qureshi GA, Bai GS, Sarwar M, Parvez SH. Neurotoxicity, oxidative stress and
cerebrovascular disorders. Neurotoxicology. 2004 Jan;25(1/2):121-38.
Rabelo AS, Oliveira ID, Guimarães AG, Quintans JS, Prata AP, Gelain DP, et al.
Antinociceptive, anti-inflammatory and antioxidant activities of aqueous extract from
Remirea maritima (Cyperaceae). J Ethnopharmacol. 2013 Jan;145(1):11-7.
Rakhshandeh H, Sadeghnia HR, Ghorbani A. Sleep-prolonging effect of Coriandrum
sativum hydroalcoholic extract in mice. Nat Prod Res. 2012;26(22):2095-8.
79
Raquet N, Schrenk D. Relative photomutagenicity of furocoumarin and limettin in the
hypoxanthine phosphoribosyl transferase assay in v79 cells. Chem Res Toxicol. 2009
Sept;22(9):1639-47.
Rattanachaikunsopon P, Phumkhachorn P. Potential of coriander (Coriandrum
sativum) oil as a natural antimicrobial compound in controlling Campylobacter jejuni in
raw meat. Biosci Biotechnol Biochem. 2010;74(1):31-5.
Rayeshwari V, Andallu B. Medicinal benefits of coriander. Spatulla DD. 2011;1(1):51-
8.
Ré D, Jorge N. Especiarias como antioxidantes naturais: aplicações em alimentos e
implicações na saúde. Rev Bras Plantas Med. 2012;14(2): 389-99.
Reilly C, Agnew R, Neville BG. Depression and anxiety in childhood epilepsy: a review.
Seizure. 2011 Oct;20(8):589-97.
Reuter J, Huyke C, Casetti F, Theek C, Frank U, Augustin M, et al. Anti-inflammatory
potential of a lipolotion containing coriader oil in the ultraviolet erythema test. J Dtsch
Dermatol Ges. 2008 Oct;6(10):847-51.
Ribeiro CVC, Kaplan MA. Tendências evolutivas de famílias produtoras de cumarinas
em angiospermas. Quim Nova. 2002;25(4):533-8.
Robert A. Cytoprotection by prostaglandins. Gastroenterol. 1979 Oct;77(4 Pt 1):761-
7.
Samonina GE, Kopylova GN, Lukjanzeva GV, Zhuykova SE, Smirnova EA, German
SV, et al. Antiulcer effects of amylin: a review. Pathophysiol. 2004 Jul;11(1):1-6.
Santos ARS, Calixto JB. Ruthenium red and capsazepine antinociceptive effect in
formalin and capsaicin models of pain in mice. Neurosci Lett. 1997 Oct;235(1/2):73-6.
80
Santos ARS, Gadotti VM, Oliveira GL, Tibola D, Paszuck AP, Neto A, et al.
Mechanisms involved in the antinociception caused by agmatine in mice.
Neuropharmacology. 2005 Jun;48(7):1021-34.
Sathishkumar P, Preethi J, Vijayan R, Mohd YA, Ameen F, Suresh S, et al. Anti-acne,
anti-dandruff and anti-breast cancer efficacy of green synthesized silver nanoparticles
using Coriandrum sativum leaf extract. J Photochem Photobiol B. 2016 Oct;163:69-76.
Schubert ML. Gatric secretion. Curr Opin Gastroenterol. 2000;24(6):659-64.
Shay H, Komarov AS, Fels SS, Meranze D, Gruenstein M, Siplet H. A simple method
for the uniform production of gastric ulceration in the rat. Gastroenterol. 1945;5:43-61.
Silvério MS, Souza OV, Del-Vechio-Vieira G, Miranda MA, Matheus FC, Kaplan MAC.
Propriedades farmacológicas do extrato etanólico de Eremanthus erythropappus (DC)
McLeisch (Asteraceae). Rev Bras Farmacogn. 2008;18(3):430-5.
Singh P, Kaur J, Singh S, Bhatti R. Triblock conjugates: identification of a highly potent
anti-inflammatory agent. J Med Chem. 2015 Aug;58(15):5989-6001.
Soares CC, Marque TM, Rigolin GG, Neis E, Friaça AMV, Silva AS, et al. Atividade
analgésica do extrato da Pectis jangadensis (S. Moore). Rev Bras Farmacogn.
2009;19(1A):77-81.
Szallasi A, Goso C, Blumberg PM, Manzini S. Competitive inhibition by capsazepine
of [3H]resiniferatoxin binding to central (spinal cord and dorsal root ganglia) and
peripheral (urinary bladder and airways) vanilloid (capsaicin) receptors in the rat. J
Pharmacol Exp Ther. 1993 Nov;267(2):728-33.
Taniguchi M, Yanai M, Xiao YQ, Kido T, Baba K. Three isocoumarins from Coriandrum
sativum. Phytochemistry. 1996 Jun;42(3):843-6.
Tjolsen A, Berge OG, Hunskaar S, Rosland JH, Hole DK. The formalin test: an
evaluation of the method. Pain. 1992 Oct;51(1):5-17.
81
Vacher PJ, Duchene-Marullaz OJ, Barbot PA. A propes de quelquer produits usuels
compararaison de deux methodes detude dês analgésiques. Med Exp. 1964;11:51-8.
Vasudevan K, Vembar S, Veeraraghavan K, Haranath PSRK. Influence of gastric
perfusion of aqueous spice extracts on acid secretion in anesthetized albino rats.
Indian J Gastroenterol. 2000 Apr/Jun;19(2);50-5.
Vedjani R, Shalmani HRM, Fattahi MM, Sajed-Nia F, Abdollahi M, Zali MR, et al. The
efficacy na Herbal Medicine, Carmint, on the relief of abdominal pain and bloating in
patients with irritable bowel syndrome: a pilot study. Dig Dis Sci. 2006 Aug;51(8):1501-
7.
Velaga MK, Yallapragada PR, Williams D, Rajanna S, Bettaiya R. Hydroalcoholic seed
extract of Coriandrum sativum (Coriander) alleviates lead-induced oxidative stress in
different regions of rat brain. Biol Trace Elem Res. 2014 Jun;15 (1/3):351-63.
Wangensteen H, Samuelsen AB, Malterud KE. Antioxidant activity in extracts from
coriander. Food Chem. 2004 Nov;88(2):293-7.
Wheeler-Aceto H, Porreca F, Cowan A. The rat paw formalin test: comparison of
noxious agents. Pain. 1990 Feb;40(2):229-38.
Woo WS, Skin KH, Lee CK. Effect of naturally occurring coumarins on the activity of
drug metabolizing enzyme. Biochem Pharmacol. 1983 Jun;32(11):1800-3.
Wu TT, Tsai CW, Yao HT, Lii CK, Chen HW, Wu YL, et al. Supressive effects of
extracts from the aerial part of Coriandrum sativum L. on LPS-induced inflammatory
responses in murine RAW 264.7 macrophages. J Sci Food Agric. 2010
Aug;90(11):1846-54.
Zanusso-Junior G, Melo JO, Romero AI, Dantas JA, Caparroz-Assef SM, Bersani-
Amado CA, et al. Avaliação da atividade anti-inflamatória do coentro (Coriandrum
sativum L.) em roedores. Rev Bras Plantas Med. 2011;13(1):17-23.
82
Zaidi SF, Muhammad JS, Shhryar S, Usmanghani K, Gilani AH, Jafri W, et al. Anti-
inflammatory cytoprotective effects of selected Pakistani medicinal plants in
Helicobacter pylori-infected gastric epitelial cells. J Ethnopharmacol. 2012
May;141(1):403-10.
Zuntini-Viscardi D, Arrigo JD, Correia CA, Kassuya CA, Cardoso CA, Maldonade IR,
et al. Seed and peel essential oils obtained from Campomanesia adamantium fruit
inhibit inflammatory and pain parameters in rodents, PLoS One. 2017
Feb;12(2):e0157107. doi: 10.1371/journal.pone.0157107
83
APÊNDICE 1 - ETAPAS DAS DIFERENTES FORMAS DE FRACIONAMENTO DO ED
Figura 25 - Etapas envolvidas nas diferentes formas de fracionamento do ED
visando maior rendimento para isolamento das furanocumarinas.
ED 36,7g
FAc* 0,54g
F 1-2 0,03g
F 3 0,02g
F 4 0,07g
F 5* 0,09g
F 6* 0,10g
36 Frações
Solventes de Diferentes Polaridades
Partição Líquido-líquido 10,0g
Coluna cromatográfica Clássica 22,0g
FAg 7* 3,10g
FAg 8* 1,12g
FAg. 9 0,97g
FAg 10 1,73g
FEH 8,13g
FHA* 0,89g
Folhas Secas e Moídas 1.000g
Análise CG - EM
Análise CG - EM
F 7* 0,25g
FHA 5* 0,09g
FHA 6* 0,10g
FHA 7* 0,25g
Análise CG - EM
FHx 0,41g
FAc 8,55g
FAcME 2,86g
FAc 1-2 0,30g
FAc 3 0,09g
FAc 4* 0,07g
FAc 5-6*
0,07g
Presença
furanocumarinas
Presença furanocumarina * Baixo rendimento
Análise CG - EM
Extração Etanol (96%)
Resíduo
EE 27,3g
Extração com DCM Ultra-Turrax
Presença furanocumarina * Baixo rendimento
Presença furanocumarina *
Coluna cromatográfica Filtrante 14,0g
Método oneroso
84
ANEXOS
Anexo 1 – Comissão de Ética no Uso de Animais
85
Anexo 2 – Comissão de Ética no Uso de Animais