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Diagnóstico Molecular de Anemia Falciforme Manual da Oficina Prática de Genética, Genoma e Biotecnologia www.odnavaiaescola.org Todos os direitos reservados ao DNA Goes to School, Inc. 2004 1-Introdução à análise molecular A prática de diagnóstico de doenças genéticas através da análise de DNA tem se tornado frequente nos últimos 15 anos, graças aos avanços na pesquisa molecular. A transferência das técnicas desenvolvidas dentro do ambiente do laboratório de pesquisa para o consultório médico tem progredido substancialmente e hoje muitas doenças genéticas, tanto as hereditárias como fibrose cística, quanto as não hereditárias, como leucemia mielóide crônica , podem ser diagnósticadas através da análise molecular. O diagnóstico molecular é uma poderosa ferramenta capaz de proporcionar informações fundamentais sobre a condição do paciente e seu prognóstico, podendo também em muitos casos auxilar o médico na escolha do melhor tratamento para o paciente. Além disso, em muitos casos, o diagnóstico molecular pode indicar quais indivíduos são portadores de um determinado alelo mutante, mesmo que o indivíduo em questão não apresente qualquer sintoma. As síndromes genéticas recessivas ligadas ao cromossomo X são um bom exemplo de síndromes onde a mãe, geralmente assintomática, apresenta 50% de chance de gerar um filho homem acometido pela doença em questão. Nestes casos a análise molecular pode indicar se a mulher em questão é de fato portadora, auxiliando não somente o médico, mas também o indivíduo testado e sua família quanto aos riscos de se gerar um indivíduo afetado. Com esta informação nas mãos a família pode buscar alternativas, como por exemplo a fertilização in vitro e posterior seleção de embriões femininos, ou mesmo a realização de exames moleculares a partir de uma célula embrionária antes do implante no útero. Neste caso, deseja-se testar se o embrião possui a mutação em questão. Com o resultado, a família decide se deseja ou não dar seguimento ao processo de implantação do embrião. No entanto, é preciso mencionar que existe também muito debate em torno da questão do diagnóstico molecular de doenças genéticas hereditárias, e por diversas razões. A análise genética pode expor uma pré-condição antes dsconhecida ao indivíduo, podendo ter sérias implicações psicológicas para o mesmo. Além disso, há situações onde nem todos os indivíduos de uma mesma família têm a mesma posição em relação á análise genética e a realização do teste genético em um indivíduo pode expor todo o resto da família. Há ainda casos onde a decisão da realização de um diagnóstico genético está sob responsabilidade dos pais, e não do indivíduo em questão. A maioria das doenças genéticas hereditárias ainda não possui tratamento e por isso muitos indivíduos argumentam que não há sentido em se buscar uma informação que poderá apenas trazer danos psicológicos ao indivíduo, não sendo de nenhuma forma útil para o tratamento do paciente. Além disso, em muitos países já existe a preocupação de que este tipo de informação possa ser usada por seguradoras de saúde na hora de negar cobertura ao indivíduo sob a alegação de que se trata de condição médica pré-existente. Mas há quem diga que o diagnóstico molecular pode ajudar o indivíduo a tomar certas decisões pessoais, como constituir ou não família, ter filhos, fazer seguro de vida, etc. Este tipo de debate é especialmente visto em casos de doenças genéticas de manifestação tardia como, por exemplo, a Doença de Huntington. Conteúdo deste módulo 1-Introdução ao diagnóstico molecular 2-Anemia Falciforme 3-A molécula de hemoglobina 4-Técnicas moleculares 5-Extração de DNA de sangue 6-Reação em Cadeia da Polimerase 7-Análise com enzimas de restrição 8-Eletroforese em gel de agarose 9-Protocolo 10-Debate sobre questões éticas do diagnóstico molecular 1

Anemia e Hemoglobina Mais Detalhado

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  • Diagnstico Molecular

    de Anemia Falciforme

    Manual da Oficina Prtica de Gentica,Genoma e Biotecnologia

    www.odnavaiaescola.orgTodos os direitos reservados ao DNA Goes to School, Inc. 2004

    1-Introduo anlise molecular

    A prtica de diagnstico de doenas genticas atravs da anlisede DNA tem se tornado frequente nos ltimos 15 anos, graas aosavanos na pesquisa molecular. A transferncia das tcnicasdesenvolvidas dentro do ambiente do laboratrio de pesquisa para oconsultrio mdico tem progredido substancialmente e hoje muitasdoenas genticas, tanto as hereditrias como fibrose cstica, quantoas no hereditrias, como leucemia mielide crnica , podem serdiagnsticadas atravs da anlise molecular. O diagnstico molecular uma poderosa ferramenta capaz de proporcionar informaes

    fundamentais sobre a condio do paciente e seu prognstico, podendo tambm em muitoscasos auxilar o mdico na escolha do melhor tratamento para o paciente. Alm disso, em muitoscasos, o diagnstico molecular pode indicar quais indivduos so portadores de um determinadoalelo mutante, mesmo que o indivduo em questo no apresente qualquer sintoma. As sndromesgenticas recessivas ligadas ao cromossomo X so um bom exemplo de sndromes onde a me,geralmente assintomtica, apresenta 50% de chance de gerar um filho homem acometido peladoena em questo. Nestes casos a anlise molecular pode indicar se a mulher em questo de fato portadora, auxiliando no somente o mdico, mas tambm o indivduo testado e suafamlia quanto aos riscos de se gerar um indivduo afetado. Com esta informao nas mos afamlia pode buscar alternativas, como por exemplo a fertilizao in vitro e posterior seleo deembries femininos, ou mesmo a realizao de exames moleculares a partir de uma clulaembrionria antes do implante no tero. Neste caso, deseja-se testar se o embrio possui amutao em questo. Com o resultado, a famlia decide se deseja ou no dar seguimento aoprocesso de implantao do embrio.

    No entanto, preciso mencionar que existe tambm muito debate em torno da questo dodiagnstico molecular de doenas genticas hereditrias, e por diversas razes. A anlise genticapode expor uma pr-condio antes dsconhecida ao indivduo, podendo ter srias implicaespsicolgicas para o mesmo. Alm disso, h situaes onde nem todos os indivduos de umamesma famlia tm a mesma posio em relao anlise gentica e a realizao do testegentico em um indivduo pode expor todo o resto da famlia. H ainda casos onde a deciso darealizao de um diagnstico gentico est sob responsabilidade dos pais, e no do indivduoem questo.

    A maioria das doenas genticas hereditrias ainda no possui tratamento e por isso muitosindivduos argumentam que no h sentido em se buscar uma informao que poder apenastrazer danos psicolgicos ao indivduo, no sendo de nenhuma forma til para o tratamento dopaciente. Alm disso, em muitos pases j existe a preocupao de que este tipo de informaopossa ser usada por seguradoras de sade na hora de negar cobertura ao indivduo sob a alegaode que se trata de condio mdica pr-existente. Mas h quem diga que o diagnstico molecularpode ajudar o indivduo a tomar certas decises pessoais, como constituir ou no famlia, terfilhos, fazer seguro de vida, etc. Este tipo de debate especialmente visto em casos de doenasgenticas de manifestao tardia como, por exemplo, a Doena de Huntington.

    Contedo deste mdulo

    1-Introduo ao diagnsticomolecular2-Anemia Falciforme3-A molcula de hemoglobina4-Tcnicas moleculares5-Extrao de DNA de sangue6-Reao em Cadeia da Polimerase7-Anlise com enzimas de restrio8-Eletroforese em gel de agarose9-Protocolo10-Debate sobre questes ticas dodiagnstico molecular

    1

  • A anlise molecular pode ser realizada atravs de diferentes tcnicas, que so definidasa partir de caractersticas moleculares especficas da doena em questo tais comoocorrncia e frequncia de mutaes em determinadas populaes, localizao damutao, caractersticas especficas do gene em questo, tipo de mutao (mutaopontual, grandes delees, inseres, etc), entre outras. Nesta oficina ns realizaremos odiagnstico molecular da anemia falciforme atravs da anlise molecular de indivduosnormais, heterozigotos e homozigotos para a mutao HbS no gene da beta-globina.

    2-Anemia Falciforme

    A Anemia Falciforme faz parte de um grupo de doenas genticas recessivas hereditriaschamadas de hemoglobinopatias. As hemoglobinopatias podem consistir de variaesestruturais na hemoglobina, ou de talassemias. Estas doenas podem apresentar altaincidncia em regies endmicas de malria e so especficas de acordo com a regio epopulao em estudo. Deste modo, o conhecimento sobre a origem tnica do pacientepode ser de grande valia na anlise gentica de indivduos acometidos por algum tipo dehemoglobinopatia. Das hemoglobinopatias de variao estrutural, a de maior significadoclnico a chamada Hemoglobina S (HbS), que apresenta altas incidncias na frica, ArbiaSaudita e ndia. Devido aos grandes deslocamentos e migraes de populaes humanasnestes ltimos 500 anos, atualmente encontra-se indivduos afetados por diferentes formasde hemoglobinopatias no mundo inteiro. Nos Estados Unidos, por exemplo, 10% da populaonegra potadora do alelo HbS.

    Os indivduos portadores de dois alelos HbS (homozigotos) so acometidos de AnemiaFalciforme. A Anemia Falciforme caracterizada por anemia crnica e episdios de dorsevera. Estes sintomas so consequncia de uma alterao estrutural especfica na mleculade hemoglobina S. A hemoglobina S possu um formato de foice que impede que a mesmacircule livremente pelos capilares, podendo haver interrupo de fluxo sanguneo e mortetissular. J os indivduos heterozogitos levam uma vida normal embora suas hemcias tenhamuma meia-vida mais curta.

    Para saber maissobre doenasgenticas, visite oDolan DNALearning Centerdo Cold SpringHarbor Laboratoryna URL http://www.ygyh.org/

    2

    3-Hemoglobina

    A hemoglobina uma protenalevemente esfrica composta por quatrosubunidades: duas alfa, com 141 resduos deaminocidos cada uma, e duas beta com146 resduos. A cadeia alfa codificada pelogene alfa-globina enquanto a cadeia beta codificada pelo gene beta-globina. Ogene que codifica a cadeia beta (beta-globina) est localizado na regiocromossmica 11p15.5 enquanto que ogene que codifica a cadeia alfa (alfa-globina) est localizado na 16p13.

    Cada uma das cadeias da hemoglobinapossui em seu interior um radical heme quecontm um tomo de ferro (Fig 1). Ahemoglobina nada mais que umcarregador do tomo de ferro, que por seraltamente reativo, deve ficar fortementeligado protena quando a mesma circula

    pelo sangue. Esta ligao feita atravs do radical heme (Fig 2). graas alta reatividade doferro e grande afinidade pelo oxignio que o mesmo pode ser transportado para todos ostecidos do corpo. Deste modo, a capacidade de circulao da hemoglobina fundamentalpara que o oxignio ligado ao tomo de ferro seja levado a todas as partes do corpo,incorporando-se em vrias reaes celulares e participando da produo de energia oxidativa

    Figura 1:

    Hemoglobina com

    as quatro cadeias

    peptdicas.

  • que ocorre na mitocndria. Em ltimo caso, a capacidade de circulao da hemoglobina depende,em grande parte, de sua forma.

    A forma que uma protena adota , antes de tudo, determinada pela chamada estrutura primriada protena, que nada mais que sua sequncia de aminocidos. A partir da estrutura primria, aprotena ir se desdobrar, naturalmente, em sua forma secundria, terciria e no caso da hemoglobina,quartenria. As formas secundria e terciria dizem respeito a configurao tri-dimensional adotadapela protena enquanto a forma quartenriaa, que no est presente em todas as protenas, dizrespeito a forma como diferentes peptdeos esto arrumados na formao de um nico complexoproteco, como no caso da hemoglobina.

    O que difere a hemoglobina normal da hemoglobina S a sequncia primria de cada uma,que determinada pela sequncia de DNA. Enquanto na hemoglobina normal h o cido glutmicoocupando a sexta posio da seqncia, na hemoglobina S a valina que ocupa esta posio.Esta troca consequncia da substituio de um nico nucleotdeo na sequncia de DNA . Ao invsdo nucleotdeo adenina na posio 20 da cadeia de DNA, na sequncia anormal encontra-se onucleotdeo timina (Fig. 3). Esta simples mudana afeta a sequncia de cdons (GAG vira GTG),alterando a sequncia de aminocidos (cido glutmico vira valina alterando ento a forma tri-dimensional da protena (Fig. 4). A alterao conformacional ocorre porque o grupo radical da valinano possui carga eltrica, enquanto que o cido glutmico possui carga negativa quando numambiente de pH 7,4 (esse valor de pH o fisiolgico e nesse valor o grupo carboxila perde umhidrognio) e encontra-se na face externa da molcula. Assim a substituio do resduo de cidoglutmico por valina cria um ponto hidrofbico de ligao na superfcie externa da cadeia beta,alterando a conformao final da protena.

    A regio do cromossomo 11 onde o gene da beta globina est localizado contm vrios outrosgenes relacionados sendo a regio denominada de regio cluster da beta globina. Nesta regio hvrios polimorfismos, que podem envolver mais de um gene. Cada um dos padres de polimorfismo chamado de hapltipo e certos hapltipos so encontrados nos cromossomos que carregam ahemoglobina mutante (Hb S) e parecem estar associados com a severidade clnica da doena.

    Hapltipo e alelo podem ser vistos como termos equivalentes. No entanto, enquanto o termoalelo usado para designar uma das formas especficas de um gene especfico, o termo hapltipo usado quando se analisa um segmento de DNA que no necessariamente se limita a apenas umgene, podendo se estender por mais que um gene ou ainda ser apenas uma regio do genomaque no codifica genes.

    No homem existem 7 cadeias diferentes de hemoglobina que se associam durante odesenvolvimento para produzir 7 hemoglobinas diferentes. Cada uma dessas cadeias codificadapor um gene independente.

    Figura 2: Radical hemo com o

    tomo de ferro no centro.

    3

    Figura 3:

    Sequencias deDNA das cadeiasnormal e mutadado gene da beta-globina

  • 4-Doenas Genticas e Tcnicas Moleculares

    Vrias tcnicas j existem para a realizao do diagnstico molecular. Comodito anteriormente, a tcnica escolhida depende largamente das propriedadesmoleculares da alterao gentica. De modo geral, todas as tcnicas tm comoprincpio bsico o isolamento do gene (ou regio) do genoma onde localiza-se aalterao que se quer analisar. Para a realizao do diagnstico molecular essencialque se conhea que gene, ou genes, so responsveis pela ocorrncia da doena.Atualmente j existe um grande nmero de genes associados doenas, e com afinalizao do sequenciamento do genoma humana este nmero aumenta a cadadia. Muitas doenas genticas podem ser causadas por mais de um defeito gentico,como no caso da fibrose cstica onde mais de 500 mutaes no gene conhecidocomo CFTR j foram descritas. Neste caso o diagnstico molecular pode ser facilitadoquando se conhece a mutao especifica da famlia. Quando no se conhece amutao que se est buscando (por exemplo, uma famlia com um nico caso defibrose cstica e sem antecedentes) todo o gene CFTR deve ser investigado. Almdisso, h defeitos genticos causados pela alterao de um nico nucleotdeo(chamadas de mutao pontual), como no caso da Anemia Falciforme, e outroscausados por delees de fragmentos maiores na sequncia de DNA, como no casoda Distrofia Muscular de Duchenne. H ainda as doenas genticas causadas poruma expanso de nucleotdeos repetidos, como no caso da Doena de Huntington,Sndrome do X-frgil, Distrofia Miotnica, entre outras. As mutaes pontuais podemmuitas vezes ser detectadas atravs de enzimas de restrio, que reconhecem o localespecfico onde est a mutao. A mutao falciforme, por exemplo, pode seridentificada atravs da mudana no padro eletrofortico da hemoglobina, ouatravs da presena ou ausncia do stio de clivagem da enzima de restrio nogene da beta globina. A mutao associada anemia falciforme causada pelasubstituio de uma adenina por uma timina em uma seqncia reconhecida pelaenzima Mst II ou sua isosquimera Dde I. (veja a seguir). Nesta oficina iremos realizar odiagnstico molecular de Anemia Falciforme atravs da tcnica de PCR e posterioranlise por enzimas de restrio de DNA extrado de sangue.

    5-Extrao de DNA desangue

    O isolamento de DNA humano pode serrealizado a partir de diferentes amostras, taiscomo sangue ou smen desidratado, ossos,bulbo capilar, saliva, clulas da pele, esfregaoanal, vaginal e bucal, tecidos derivados debipsias ou cirurgias, tecidos mumificados,congelados, ou de lquido amnitico. Almdisso, possvel coletar DNA de pontas decigarro, tampa de caneta mordida, chiclete,pentes, slos, envelopes, entre outros. Estesltimos so especialmente teis na anlisemolecular forense.

    O processo de extrao de DNAcompreende basicamente trs etapas; (a)quebra da membrana celular para que oncleo seja liberado, (b) quebra da membranado ncleo para liberao do DNA (fig 4) e (c)isolamento do DNA atravs de precipitaoem soluo com lcool e sal. O sal neutraliza

    Fig 4: Em organismos eucariotos, o DNA seencontra no ncleo da clula.4

  • a carga negativa do DNA permitindo que as vrias molculas de DNA presentes nasoluo possam se agregar e formar um precipitado visvel em etanol, j que o DNA no soluvel em etanol.

    Estas etapas podem ser feitas com o uso de detergentes, temperatura, processosmecnicos ou processos enzimticos. Atualmente j existe uma gama de kits comerciaispara a extrao de DNA dos mais variados tecidos. No caso particular da extraode DNA de sangue, necessrio que todo o grupamento heme presente nas molculasde hemoglobinas sejam removidos, j que o ferro, por ser altamente reativo, intereferenas reaes enzimticas realizadas em seguida.

    6-Reao em Cadeia da Polimerase

    O princpio bsico da PCR est na capacidade de, a partir de quantidades mnimas deDNA, multiplicar uma determinada seqncia, de modo que esta se torne majoritria na amostra.Numa reao de PCR, o fragmento de DNA que desejamos multiplicar (ou amplificar) chamado de fragmento alvo ou DNA molde e constitu um pedao do gene que sepretende estudar (em nosso caso o gene da beta-globina). Alm do DNA molde htambm os oligonucleotdeos (tambm chamados de primers) que nada mais so doque pequenos fragmentos de DNA complementares s extremidades da regio que sepretende amplificar.

    A tcnica de PCR tem provocado grande impacto nas principais reas dabiotecnologia: mapeamento gnico, diagnstico molecular, clonagem, seqenciamentode DNA e deteco da expresso gnica. Atualmente, a PCR utilizada para odiagnstico de doenas genticas, bem como na deteco de material genticopresente em pequenas quantidades na amostra em anlise. Como exemplo, temos adeteco e identificao de material gentico de vrus como o HIV (vrus da AIDS) e HPV(Papiloma vrus), assim como a deteco de organismos genticamente modificadosem produtos alimentcios.

    O mtodo pelo qual a PCR funciona descrito em seguida: dois pequenosfragmentos de DNA, tipicamente de 20 pares de bases, so sintetizados em laboratrio.

    Esses so os primers, que so complementares acada uma das extremidades da seqncia deDNA de interesse, sempre na direo 5' > 3' (vejafigura 5 ). Num tubo de reao so adicionadosos primers, os nucleotdeos livres (adenina,guanina, timina e citosina), amostras de DNA quese quer analisar (DNA molde) e uma enzimaespecial resistente ao calor chamada Taq DNApolimerase, que promove a sntese de DNA. Amistura aquecida a 95C, causando aseparao das duas fitas de DNA. Em seguida, amistura esfriada at 550C ou 650C, temperaturana qual os primers se l igam s regiescomplementares das fitas de DNA que estoseparadas. Neste momento, dentro do tubo dereao, todo o DNA est na forma de fitasimples, menos as duas pequenas regies nasquais os primers de 20 pares de bases se ligaramnos dois lados da seqncia de DNA de interesse.A temperatura ento elevada a 72C, e a Taq

    5

    A tcnica dePCR foi criada em1985 pelo Dr. KaryMullis, nos EstadosUnidos. Esta tcnica uma das grandesresponsveis portodo o avano narea de biomedicinadestes ltimos 15anos.

    Kary Mullis

    Fig 5: O que define a direo de cada uma dasfitas o local de ligao entre o grupo fosfatocom o anel de desoxirribose. Se a ligao ocorreno carbono 3, dizemos que a fita est na direo3-5; se a ligao ocorre no carbono 5, dizemosque a fita est na direo 5-3.

  • DNA polimerase comea a sintetizar um novo DNA, comeando nas regies em duplafita, local onde cada um dos primers se ligou ao DNA molde. A Taq ir promover asntese de DNA somente a partir da regio em dupla fita. A sntese ocorre em uma taxade aproximadamente 20 nucleotdeos/segundo, e em cerca de 30 segundos a 1 minutouma nova cpia do fragmento que se quer analisar sintetizada. A reao agora novamente aquecida a 95C, causando uma nova separao de todo DNA em fitassimples. Ao final do primeiro ciclo h duas fitas da molcula original de DNA, mais duascpias da regio de interesse. A temperatura novamente reduzida, e agora os primersiro se ligar aos 4 stios nas novas duas cpias e tambm na molcula original de DNA.A temperatura do ciclo novamente elevada a 72C e as 4 fitas individuais so copiadasem 8.

    6

    Fig 6: Esquema da PCR.

  • 7Esses ciclos so repetidos geralmente 30 vezes, num aparelho chamadotermociclador. Ao final dos ciclos de amplificao existem, aproximadamente, 1 milhode cpias do segmento de DNA de interesse para cada molcula molde originria daamostra inicial. assim que podemos selecionar um fragmento especfico dentro detodo o genoma. Veja a figura 6 para entender melhor a tcnica de PCR.

    7-Anlise com Enzimas de RestrioEndonucleases, tambm chamadas enzimas de restrio, so protenas

    bacterianas que cortam em fragmentos a longa mol-cula linear de DNA. As enzimas derestrio so as principais ferramentas da tecnologia do DNA recombinante. Uma enzimade restrio reconhece uma seqncia especfica de nucleotdeos, como AGCT, cortandoo DNA nos locais onde esta combinao de letras ocorrer (fig 8). Essas enzimas soisoladas de bactrias e nomeadas com uma seqncia de trs ou quatro le-tras seguidaspor um nmero romano. Por exemplo, EcoRI uma enzima de restrio isolada daEscherichia coli.

    Parece peculiar que uma enzima como EcoRI possa existir. Por que uma bactria produziriauma enzima que cliva o DNA numa seqncia especfica de nucleotdeos? A funo destasenzimas, descoberta nos anos 60 e 70, a de destruir bacterifagos ou vrus que invadema bactria. Uma vez cortados, os vrus se tornam inofensivos. As bactrias se protegemde suas prprias enzimas de restrio atravs da modificao qumica de seu DNA apsa sn-tese. Esta modificao consiste na adio de um radical metil em nucleotdeosespecficos ao longo da fita de DNA. Esse processo chamado de metilao. Uma vezmetilados, os nucleotdeos esto protegidos de serem digeridos pela enzima de restrio.Sendo assim, as enzimas de restrio so capazes de distinguir o DNA exgeno (do vrus)de seu prprio DNA.

    A digesto de DNA por enzimas de restrio um processo simples. Basta colocaro DNA em contato com a enzima a uma temperatura ideal (geralmente 37C) e a enzimainicia o processo de digesto imediatamente, cortando o DNA em diversos pedacinhos.O nmero de pedacinhos produzido estabelecido pelo nmero de stios de restrio

    A primeira enzima derestrio foi isoladaem 1968 por WernerArber, Hamilton O.Smith, e DanielNathans quandotrabalhavam naJohns HopkinsUniversity, nosEstados Unidos. Em1978 os trsreceberam juntos oprmio Nobel. Parasaber mais sobre essaimportantedescoberta, visite oNobel e-museum nolinkhttp://www.nobel.se/medicine/laureates/1978/

    D. Nathans

    W. Arber

    H.O. Smith

    Fig 8 : Di f e ren tes enz imas reconhecem d i f e ren tes s t i o s de res t r i o

  • Beta-globina normal. A enzima DdeI corta a sequncia nas posies 27, 40, 62,107, 287, 488, 576

    Beta-globina mutada. A enzima DdeI corta a sequncia nas posies 27,40, 62, 107, 488, 576

    8

    reconhecido pela enzima utilizada. A enzima EcoRI, por exemplo, corta o DNA toda vezque encontra a seqncia G/AATTC, enquanto a enzima DdeI corta o DNA somente nohexanucleotdeo C/TNAG (N = a qualquer um dos quatros desoxinucleotdeos).Se umstio especfico de restrio ocorre em mais do que um local na molcula de DNA, o DNAser cortado em diferentes locais resultando em muitos fragmentos de diferentes tamanhosdependendo da localizao do stio na molcula de DNA. Ex: um polinucleotdeocontendo 4 stios resultar em 5 fragmentos de DNA. Estes diferentes fragmentos sero

  • 9O processo depolimerizao degel de agarose semelhante queleque ocorre quandofazemos gelatina.

    Diferentes tampestm sidorecomendadospara a eletroforesede DNA. Os maisusados so TAE(Tris-acetato-EDTA) eTBE (Tris-borato-EDTA). Osfragmentos de DNAmigramligeiramentediferentes nestesdois tampesdevido a diferenasna fora inica dosdois tampes.

    Gel deagarosecorado combrometo deetdio

    separados de acordo com o tamanho atravs da tcnica de eletroforese em gel de agarose(veja a seguir).

    Em seguida esto as sequncias de DNA normal e mutante do gene da beta-globina que iremos amplificar por PCR. Em azul esto os stios de restrio reconhecidospela enzima DdeI, em amarelo esto as sequncias dos primers e em vermelho onucleotdeo trocado. Repare que a presena da mutao destri um dos stios de restrio.Deste modo, a digesto com DdeI ir produzir diferentes tamanhos de fragmentos de

    restrio de acordo com a presena ou ausncia da mutao.

    8- Tcnica de eletroforese de DNA

    Os fragmentos gerados atravs da digesto por enzimas de restrio podem ser analisadosatravs da tcnica de eletroforese de agarose. Eletroforese a tcnica pela qual fragmentos deDNA de diferentes tamanhos so separados. O DNA carregado em um poo do gel (que temaspecto de gelatina) e este submetido a um campo eltrico. O DNA ir se mover na direo doplo positivo, uma vez que a molcula de DNA negativa devido presena de grupamentosde fosfato.

    Durante a corrida eletrofortica, os fragmentos de menor tamanho correm maisrapidamente que os fragmentos maiores e, deste modo, a posio relativa dos fragmentos nogel depende dos tamanhos dos mesmos. Aps a corrida eletrofortica, o gel deve ser tratadocom um corante especfico para que se possa observar os fragmentos de DNA.

    9- ProtocoloExtrao de DNALise celular

    1. Adicione 100L de sangue em um tubo de 1,5 mL contendo 300 L da soluo RBC (LysisSolution).

    2. Misture por inverso e incube por 10 minutos em temperatura ambiente. Inverta novamentepelo menos uma vez durante a incubao.

    3. Centrifugue por 20 segundos a 13000 rpm.

    4. Remova o sobrenadante com a pipeta sem pipetar o precipitado branco (leuccito)deixando um volume residual de cerca de 10 L.

    5. Agite vigorosamente no agitador de tubos (vortex) por 20 segundos para homogenizar asoluo com o extrato celular.

    6. Adicione 100 L da soluo de lise celular (Cell lysis solution) e ressuspenda pipetandopara cima e para baixo. Se houver a presena de clulas agregadas incube a 370C ata soluo se tornar homognea.

    Precipitao protica

    1- Deixe a amostra resfriar at atingir a temperatura ambiente.

    2- Adicione 34 L da soluo de precipitao (DNA Precipitation Solution) de protena aolisado celular.

    3- Agite vigorosamente no agitador de tubos (vortex) por 20 segundos para homogenizar asoluo com o extrato celular.

    4- Centrifuge a 13000 rpm por 3 minutos. As protenas precipitadas formam um precipitadoescuro. Se isso no aconteceu, repita o passo 3 e incube no gelo por 5 minutos e entorepita o passo 4.

  • 10

    Precipitao do DNA

    1- Tranfira o sobrenadante contendo o DNA (sem pipetar o precipitado de protena) paraum tubo de 1,5 mL contendo 100 L de isopropanol a 100%. Inverta o tubo gentilmente50 vezes.

    3- Centrifuge a 13000 rpm por 2 minutos, o DNA torna-se visvel como um pequeno precipitadobranco.

    4- Descarte o sobrenadante por inverso e adicione etanol 70%.

    5- Centrifuge a 13000 rpm por 2 minutos. Cuidadosamente descarte o etanol. Cuidado nessepasso porque o precipitado (DNA) por ser descartado junto com o etanol.

    6- Deixe a tampa aberta e inverta o tubo sobre um papel absorvente durante uns 15 minutosou at a completa evaporao do etanol.

    Hidratao do DNA

    1- Adicione 33 L da soluo para a hidratao do DNA (DNA Hydratation Solution).

    2- Incube a soluo a 420C por 10 minutos.

    3- Transfira a soluo contendo o DNA hidratado para o gelo.

    Reao em cadeia da polimerase (PCR)

    Protocolo para amplificao:Adicionar a um tubo de 200 mL contendo mix de PCR:22 mL de gua Milli-Q autoclavada e esperar misturar com a reao.Manter o tubo em banho de gelo e adicionar:2 mL do DNA extrado anteriormente (aprox. 100 ng).1 mL de soluo contendo 10 pmoles do Mix (oligonucleotdeo)Dar um pulso na microcentrfuga e adicionar 3mL de leo mineralColocar os tubos no termociclador e iniciar a amplificao utilizando o seguinte programa:

    Ciclo trmico para amplificaoDesnaturao inicial de 5 min a 95 0C35 ciclos de: 40 seg a 940C, 40 seg a 600C e 40 seg a 720C.

    Digesto com enzima de restrio

    1- Retire os micro tubos do PCR e mantenha-os no gelo.2- Adicione a mistura contendo o tampo da enzima, a enzima, BSA e a gua abaixo da

    camada de leo. Para isso, voc ter que introduzir a ponteira at o fim do tubo,atravessando completamente a camada de leo, antes de liberar o lquido de dentro daponteira

    25 mL de DNA amplificado (100 ng/mL) 3mL de tampo da enzima 10X 1 mL da enzima Dde I (10 U)0,3 mL de BSA 1mL de H2O Milli-Q autoclavada30mL

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    E t a p a sna preparao do gel nabandeja.

    3- Feche o tubo e misture os reagentes dando um pulso namicrocentrfuga, ou batendo o fundo do tubo sobre abancada.

    4- Coloque o tubo no banho-maria ou no termociclador a 370Ce incube por 1 hora e 30 minutos.

    5- Analise a digesto correndo todo o volume da amostra em

    gel de agarose 2,5 %.

    Eletroforese em gel de agarose e visualizao dos fragmentos deDNA

    O preparo do gel depende da concentrao desejada e do volumeda bandeja. Por exemplo, se o volume da bandeja de 100 mL e vocdeseja preparar um gel a 2.5%. Isso significa que voc ter que adicionar2.5g em 100 mL. Lembre-se de que o gel sempre deve ser preparado emtampo nunca em gua.Veja ao lado a figura mostrando as etapas napreparao do gel na bandeja.

    Por conveno, os gis so interpretados da esquerda para a direita,com os poos orientados para cima e as amostras so aplicadas no pooda esquerda para a direita. O DNA das amostras ficar separado no gel deacordo com o tamanho, sendo que os menores migraram mais enquantoque os maiores migraram menos.

    Tampo para eletroforese TAE (1X)

    TAE (Tris-acetato-EDTA). Para preparar o TAE 1X. Basta diluir a soluo tampo50X para um volume final igual a 100 mL.C1.V1=C2.V2C1 a concentrao inicial, nesse exemplo igual a 50X.V1 o volume a ser retirado da soluo inicial, nesse exemplo igual a X.C2 a concentrao desejada, nesse exemplo igual a 1X.V2 volume final desejado, nesse exemplo igual a 100.

    Substituindo na equao acima.50. V1=1. 100, portanto, V1 = 2 mL. Assim, basta pegar 2mL da soluo50X, adicionar em uma proveta e completar com gua destilada para umvolume final igual a 100 mL.

    1- Aps o tempo estabelecido remova os tubos da incubao a 370Ce mantenha-os em banho de gelo.

    2- Usando uma ponteira para cada tubo introduza a ponteira at ofinal do tubo e pipete 20 L, tomando o cuidado para no pipetar oleo.

    3- Transfira o sobrenadante para um tubo de 1,5 mL contendo 5 L docorante de aplicao. Misture as duas solues pipetando para cimae para baixo cuidadosamente.

    4- Usando uma ponteira para cada tubo aplique as amostras no gel a2,5% preparado previamente na seguinte ordem:

    Poo 1: 2 L DNA marcador;Poo 2: 20 L amostraPoo 3: 20 L amostraPoo 4: 20 L amostra

    5- Certifique-se que a amostra correr para o plo positivo (eletrodovermelho) e ligue a fonte de acordo com as instrues do instrutor.

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    6- Quando o corante azul atingir 1/3 do gel (aproximadamente 1 hora) desligue a fonte.

    Visualizao dos fragmentos de DNA:

    1- Aps desligar a fonte, retire cuidadosamente o gel da cuba e transfira-o paraum recipiente limpo com cuidado para no quebr-lo.

    2- Coloque o lado azul do papelote contendo azul de metileno voltado para aface do gel.

    3- Passe os dedos sobre o gel de modo firme, mas sem quebr-lo, vrias vezes.4- Coloque algum peso, por exemplo, um bquer vazio sobre o papelote azul.5- Aguarde 15 minutos.6- Remova o papelote azul e coloque o gel em um recipiente contendo um pouco de

    gua destilada.7- Troque a gua at que as bandas fiquem visveis.8- Registre e anlise os resultados.

    Questes:

    1- Desenhe o perfil eletrofortico visualizado no seu gel.2- Compare o tamanho dos fragmentos do gene da beta globina das amostras analisadas.2- Qual o diagnstico de cada um dos indivduos testados?

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    10-Debate sobre questes ticas do diagnstico molecular

    Sabe-se que aproximadamente 5 a 10% das mulheres afetadas por cncer de mamaapresentam a forma hereditria desta doena. J se sabe que pelo menos dois genes podemestar envolvidos neste tipo de cncer. Estas genes so BRCA 1 e BRCA 2. Mulheres com mutaesem um destes dois genes tem maiores chances de desenvolver cncer de mama em algummomento da vida. No entanto, 90% dos casos de cncer de mama so espordicos.

    No momento ainda no existe cura defeinitiva para o cncer de mama, embora aremoo do seio ou parte do mesmo, assim como tratamentos especficos podem reduzir osriscos de ocorrnciada doena. Mulheres que possuem familiares com cncer de mama ou deovrio apresentam uma maior probabilidade de terem alteraes genticas. Estas mulheres tmsido encorajadas a realizarem mamografias e o auto-exame da mama desde jovens. Muitosmdicos e cientistas acreditam que quanto mais cedo o cncer for detectado, maiores so aspossibilidades de tratamento assim como as chances de sobrevivncia do paciente. No entanto,estes procedimentos, incluindo o monitoramento por mamografias, ainda esto em discusso nacomunidade cientfica quanto eficcia em reduzir a taxa de mortalidade.

    Vrios laboratrios j realizaram o teste gentico para estes genes. O teste realizado apartir de uma amostra de sangue, podendo tambm se utilizar outras fontes de material. A principaltcnica utilizada a PCR e vrias regies destes dois genes so analisadas para possveis mutaes.O resultado geralmente leva uma ou duas semanas e mantido sob sigilo.

    Imagine agora a seguinte situao:

    Luciana e Carla so amigas de escola e se conhecem desde a infncia. Um dia, lendoo jornal local, as duas adolescentes notaram um anncio de uma clnica mdica que oferecia,de graa, o teste gentico para detecao de mutaes nos genes BRCA 1 e BRCA 2.

    Luciana ficou impressionada com o anncio e seu desejo foi o de ligar na mesma hora seoferecendo para a realizao do teste. Luciana acredita que fatalmente ter cncer de mama,assim como sua me, e a possibilidade de ela tambm transmitir esta caractersticas para seusfilhos lhe incomoda constantemente. Luciana deseja saber se possui ou no mutaes paraestes genes. A me de Luciana foi diagnosticada aos 43 anos e aps mais de um ano realizandotratamento com quimioterapia, faleceu.

    J Carla tem outra posio em relao realizao do teste. A me de Carla tambmteve cncer de mama. Felizmente o cncer no se alastrou e a me de Carla est em remissopor vrios anos. A me de Carla foi diagnosticada com 47 anos de idade.

    Carla no favorvel a realizao do teste por vrios motivos. Primeiro, ela escutou deum amigo que as pessoas que so positivas para mutaes genticas que esto associadas adoenas, como no caso dos genes BRCA 1 e BRCA 2, podem ter grande dificuldade em obterum seguro de sado em algum momento de suas vidas porque as seguradoras podem se recusara cobrir uma pessoa que elas considerem sob risco. Alm disso, a presena da mutao podeser considerada pelas seguradoras como condio pr-existente. Carla tambm no v sentidoem realizar um teste gentcio para uma doena que ainda no possui cura. Para Carla, no hmuito o que fazer com uma informao destas e deste modo o melhor no saber.

    Um outro ponto que Carla levanta que um resultado negativo de um teste genticorealizado com estes genes no significa necessariamente que a pessoa no ter cncer demama, uma vez que 90% dos casos de cncer de mama ainda so os casos espordicos queno parecem ter nenhum precedente familiar.

    J Luciana insiste que a obteno desta informao ser para ela de grande importnciaporque poder ajud-la a tomar importantes decises relacionadas casamento e procriao.Alm disso, Luciana acredita que esta informao deve ser compartilhada com o homem comquem ela venha a se casar. Para ela, no revelar tal situao para seu potencial companheiroser como guardar um segredo. Outro ponto para Luciana que se ela no tiver a mutao elaacredita que ficar mais tranquila e se sentir mais disposta e aberta a se envolver emrelacionamentos que possam resultar em compromissos mais srios. Luciana sente que tem aobrigao de checar tal possibilidade e que no faz-lo ser um ato de irresponsabilidade.

    Qual sua opinio em relao a estas questes?